UNIVERSITATEA BUCUREŞTI

Analize morfologice, fiziologice şi genetice la unele tulpini de drojdii de interes

biotehnologic şi medical

Teză de doctorat

Conducător ştiinţific: Doctorand:

Prof. dr. Maria – Luiza Flonta Raluca Ghindea

2008

1. PREZENTAREA GENERALĂ A LUCRĂRII

1.1 Introducere

Denumirea de drojdie (fr. levure = lat. levere) ce denotă proprietăţile deosebite ale acestui microorganism, datează dintr-o perioadă în care natura acestor microorganisme, precum şi capacităţile lor fiziologice erau încă necunoscute, prima dovadă a existenţei acestor microorganisme fiind adusă la mijlocul secolului XVII, de către Antonie van Leenwenhock.

Evoluţia acumulării de cunoştinţe despre drojdii este asociată cu cea a societăţii umane, şi este sinonimă cu evoluţia industrială, aceste microorganisme fiind implicate în obţinerea unor alimente precum pâinea, vinul, berea etc.

Identificarea, denumirea şi încadrarea taxonomică a drojdiilor intersectează şi prezintă o importanţă deosebită pentru mai multe domenii ale ştiinţei, precum: agricultura, medicina, biotehnologia, industria alimentară, etc. În prezent sunt recunoscute aproximativ 750 de specii de drojdii, dar dintre acestea doar câteva sunt frecvent izolate. Un principal motiv îl constituie faptul că, relativ puţine habitate naturale au fost minuţios investigate privind prezenţa drojdiilor, considerându-se că doar 1% dintre speciile de drojdii existente în natură au fost descrise. Ca urmare, putem presupune că multe alte specii de drojdii „aşteaptă” să fie descoperite.

Principalele criterii tradiţionale în identificarea drojdiilor sunt cele morfologice (reproducere sexuată şi vegetativă, aspecte microscopice şi macroscopice), fiziologice (fermentaţia diferitelor zaharuri, asimilarea surselor de carbon şi azot, necesarul de vitamine, temperaturi de creştere, producerea de acid lactic etc.) precum şi biochimice (de exemplu: reacţia Diazonium blue B, capacitatea de a degrada ureea).

Se consideră insă că această taxonomie convenţională este incompletă şi poate conduce la erori, recurgându-se astfel la taxonomia moleculară ce permite o abordare filogenetică.

Tranziţia dintre identificarea fenotipică a drojdiilor către identificarea moleculară, începe prin determinarea procentului molar de guanină şi citozină a ADN nuclear. Această analiză a demonstrat că drojdiile ascomicete se înscriu într-un interval de 28-50% mol GC, în timp de bazidiomicetele împart un domeniu cuprins între 50-70% mol GC.

Necesitatea stabilirii similitudinilor dintre diverse specii de drojdii a fost ulterior rezolvată, în parte, prin studiile moleculare ce implică reasocierea ADN nuclear (procesul putând fi măsurat spectrofotometric, cu ajutorul radioizotopilor sau a altor markeri). O altă metodă folosită pentru identificarea unor specii de drojdii este reprezentată de secvenţierea domeniilor D1/D2 ADNr 26S, considerându-se că tulpinile ce prezintă un grad de 0-0,5% omologie a secvenţelor sunt conspecifice. Alături de secvenţierea diferitelor regiuni ADN, alte tehnologii moleculare des folosite în taxonomia drojdiilor sunt de exemplu: electrocariotiparea, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Randomly Amplified Polimorphic DNA), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).

Deşi, taxonomia convenţională nu poate aduce informaţii de ordin filogenetic privind microorganismele caracterizate, ea rămâne esenţială în recunoaşterea diferitelor specii, nu numai de drojdii, dar şi la alte micro şi macroorganisme. Identificarea prin tehnici de taxonomie clasică este

de asemenea importantă în studiile de microbiologie industrială. De exemplu diferenţierea între tulpinile de Saccharomyces cerevisiae şi Saccharomyces boyanus, putându-se realiza pe baza capacităţii de creştere pe mediu lipsit de vitamine.

De aceea este necesar ca atât taxonomia convenţională cât şi cea moleculară să nu fie exclusive, ci să se completeze într-un domeniu denumit taxonomie polifazică.

Studiile prezentate în această lucrare, abordează două aspecte ale implicării drojdiilor în viaţa omului. Primul dintre ele îşi propune izolarea şi identificarea polifazică a unor noi tulpini de drojdii din ecosisteme naturale precum şi testarea particularităţilor lor fiziologice, în vederea evidenţierii unui eventual potenţial biotehnologic al acestora.

Cel de-al doilea studiu realizat, urmăreşte elucidarea unor aspecte legate de morfogeneza drojdiilor, în speţă a speciei Candida parapsilosis, şi implicaţiile acestora în fenomenul de patogenitate. Obiectivul principal al experimentelor a fost constituit de identificarea unor gene implicate în tranziţia dimorfică a speciei Candida parapsilosisis, dorindu-de prin aceasta o conturare a căii de reglare a creşterii filamentoase, necunoscute până în prezent, în cazul acestei specii.

1.2. Conţinutul tezeiTeza este împărţită în 4 capitole, după cum urmează:- Capitolul 1 prezintă aspecte privind biologia şi genetica drojdiilor de interes biotehnologic şi medical, fiind detaliate informaţii legate de organizarea celulară, fiziologia, organizarea genomului, reproducerea, precum şi dimorfismul morfogenetic al drojdiilor.- Capitolul 2 este dedicat prezentării atât tehnicilor de taxonomie clasică cât şi a celor mai moderne tehnici moleculare utilizate în identificarea drojdiilor (Tehnici electroforetice speciale; aplicaţiile reacţiei PCR în identificarea microorganismelor; determinarea compoziţiei în baze azotate a ADN; Studii de omologie pe ADN mitocondrial; studii de omologie a ARNr şi a genelor corespunzătoare).- Capitolul 3 prezintă cele mai importante aplicaţii biotehnologice şi bioterapeutice ale drojdiilor, cu accent pe capacităţile xenodegradative ale drojdiilor, Implicaţiile drojdiilor în biotehnologia preparării vinurilor, Utilizarea drojdiilor drept organisme gazdă pentru producerea de proteine heterologe şi acţiunea terapeutică a drojdiilor – importanţa produselor probiotice.Capitolul 4 conţine rezultatele obţinute în urma experimentelor realizate în vederea atingerii celor 2 obiective majore ale tezei de doctorat:►identificarea polifazică şi evidenţierea potenţialului biotehnologic al unor noi tulpini de drojdii din izolate naturale;►studiul genelor implicate în reglajul dimorfismului la drojdii de interes medical.

1.3 Principalele metode utilizateTulpini de drojdii:Au fost luate in studiu şase tulpini de drojdii izolate din produse lactate şi denumite convenţional astfel : LC, CS, Ri – tulpini izolate in cadrul Laboratorului de Microbiologie, Facultatea de Biologie, Universitatea din Bucureşti; BC, BF, LF – tulpini izolate în cadrul Laboratorului de Genetica Microorganismelor şi Biotehnologie, Facultatea de Biologie, Universitatea din BucureştiCa tulpini test, de referinţă, au fost folosite :

►Tulpini din Colecţia de Microorganisme a Laboratorului de Genetica Microorganismelor şi Biotehnologie, Facultatea de Biologie, Universitatea din Bucureşti :Saccharomyces cerevisiae X208 ( tulpină de tip sălbatic); Saccharomyces cerevisiae 17/17 a his (Kil-K0)(K-R-) tulpină standard sensibilă la toxina killer; Saccharomyces cerevisiae 10701C a thr4(Kil-K1)(K+R+) tulpină standard killer; Saccharomyces cerevisiae SMR4 (Kil-K2)(K+R+) tulpină standard killer; Saccharomyces cerevisiae D649 (MATa/MATL2/mal2 trp1/TRP1 pet6/PET6 ade2/ADE2 ADE1/ade1 lys2/LYS2 HIS4/his4 LEU2/leu2 THR4/thr4; Candida parapsilosis;Rhodotorula minuta; Rhodotorula glutinis►Tulpini din Colecţia de Microorganisme a Laboratorului Kovać, Departamentul de Biochimie, Facultatea de Ştiinţele Naturii, Universitatea Comenius, BratislavaSaccharomyces cerevisiae L5366 (MATa/MAT ura3-52/ura3-52) Candida parapsilosis CBS 604 ( tulpină de tip sălbatic)►Tulpini din Colecţia de Microorganisme a Institutului de Cecetări Chimico-Farmaceutice din Bucureşti: Rhodotorula glutinis ICCF;Rhodotorula rubra ICCF

Metode de lucru:1. Izolarea, purificarea şi conservarea tulpinilor studiate

În scopul izolării tulpinilor de drojdii au fost utilizate un număr de 19 probe din produse lactate naturale ( brânză proaspătă, lapte, caş, iaurt, smântână, chişleag), provenite din diverse zone geografice ale ţării. Din totalul de 26 culturi iniţiale, un număr de 12 colonii au fost selectate pentru purificări ulterioare prin metoda dispersiei şi epuizarea ansei pe mediu YPGA. Tulpinile de drojdii astfel purificate au fost cultivate pe mediu YPGA şi conservate pe o perioada mai lunga de timp. Metodele de conservare realizate au fost: conservarea pe termen scurt – subcultura; conservul vegetativ sub ulei de parafină; crioconservarea2. Analize de identificare preliminară a tulpinilor izolate, prin teste morfo-fiziologice şi biochimice

2.1 Caracterizarea morfologicăStudiul caracterelor morfologice a presupus :2.1.1 evidenţierea unor particularităţi ale coloniilor (suprafaţa, margini, culoare, profil) obţinute în urma cultivării pe mediu solid YPGA – aspecte macroscopice.2.1.2 stabilirea caracteristicilor culturii în mediu YPG2.1.3 observarea celulelor aflate în suspensie – aspecte microscopice.

2.2 Caracterizarea fiziologică

Testarea capacităţii de a utiliza compuşi organici ca unică sursă de carbon pentru creşterea în aerobioză (teste de asimilaţie) s-a realizat prin cultivarea microorganismelor in mediu YNB (Yeast Nitrogen Base DIFCO) solid suplimentat cu diferite surse de carbon, precum: D-glucoza, D(+)-galactoza, sucroza, rafinoza, D(+)-lactoza, etc (auxanograme). Rezultatul testelor a fost apreciat in comparatie cu un martor pozitiv (YNB + glucoza) si unul negativ (YNB fara sursa de carbon), observandu-se formarea de colonii in cazul asimilatiei glucidului testat. Capacitatea de creştere la temperaturi non-permisive. Testul permite identificarea si decelarea specilor de drojdii pe baza capacitatii lor de crestere la temperaturi non-permisive (de ex. 37oC,). A

fost inregistrata, comparativ, cresterea tulpinilor studiate la o temperatura permisiva (27oC) si la 37oC si 42 oC.

Capacitatea de degradare a ureei S-au folosit culturi de drojdii de 48 ore pe mediu YPGA. Din aceste culturi s-a însămânţat pe mediu uree-agar Christensen, tuburile fiind apoi incubate la temperatura optimă de creştere (28C) iar culturile au fost examinate la intervale de 48 ore, 72 ore si 144 ore. Hidroliza ureei a fost indicată de modificarea culorii indicatorului roşu fenol care a virat prin alcalinizarea mediului de la galben la roz-purpuriu.Testarea capacitatii de crestere pe medii cu concentratii inalte de zahar

Tulpinile studiate sunt insamantate in paralel pe mediu YPGA suplimentat cu 50% glucoza si pe mediu YPGA suplimentat cu 60% glucoza. Aprecierea rezultatelor se face dupa 30 de zile de incubare la 28C, comparativ cu un martor pozitiv ( tulpina insamantata pe mediu YPGA cu compozitie standard). Testarea capacităţii de a utiliza semianaerob diferite surse de carbon

Testarea capacităţii de fermentaţie s-a realizat prin tehnica Durham, tulpinile fiind cultivate pe medii cu extract de drojdie YE, incluzând ca sursă de carbon D-glucoza, D-galactoza, maltoza, sucroza, D(+)-trehaloza, melibioza, lactoza, D(+)-celobioza, rafinoza.

2.3 Caracterizarea biochimicăTestul Diazonium blue B (DBB)

Tulpinile studiate au fost cultivate în mediu YPG timp de 19h la 28 C cu agitare magnetică (150 rpm). Din culturile astfel obţinute s-a realizat însămânţare prin lutare pe plăci Petri cu mediu YM. Acestea au fost incubate timp de 12 zile la temperatura optimă de dezvoltare (28C). Ulterior temperatura de incubare a fost modificată la 55C pe o durată de 4 ore. Plăcile Petri au fost apoi inundate cu agent DBB rece (0C) urmărindu-se reacţia pozitivă a tulpinilor testate.

Studiul statistic al rezultatelorRealizarea analizei fenetice

Rezultatele testelor microbiologice clasice au fost utilizate drept variabile in analiza statistica. Metoda statistica aplicata a fost UPGA ( Unweighted pair group average method ), frecvent utilizata in taxonomia numerica. UPGA este o metoda din categoria cluster analysis ( Three clustering), categorie in care distanta ( gradul de deosebire) dintre doua grupuri este determinata prin intermediul distantei medii dintre toate perechile de obiecte apartinand celor doua grupuri.

Datele caracteristice unei probe de identificat sunt comparate cu cele preexistente intr-o baza de referinte. Fiecare trasatura caracteristica este asimilata cu o variabila, posibilele ei forme fiind considerate stari ( de exemplu pentru variabila “capacitatea de a fermenta glucoza, starile posibile sunt “negativ” respectiv “pozitiv” )

3. Analize de taxonomie moleculară

3.1 Izolarea şi purificarea ADN cromozomal In vederea izolarii ADN cromosomal din celule de drojdii s-a realizat o adaptare a tehnicii de

izolare a ADN cromosomal [Ausubel,1995], prin experimentarea conditiilor de liza a peretelui celular si de deproteinizare a lizatului celular. Astfel, protoplastii au fost obtinuti prin tratament cu - mercaptoetanol si liticaza 3 mg/ml la diferite concentratii finale, probele fiind supuse unui soc termic. Indepartarea membranelor celulare s-a realizat prin tratament cu SDS 10% dferit in functie de tulpinile luate in lucru.. Deproteinizarea s-a realizat prin incubare cu proteinaza K, tratament

KCl 2,5 M si apoi cu amestec cloroform:alcool isoamilic 24:1; Precipitarea ADN cromosomal s-a realizat prin adaugarea de izopropanol iar proba a fost resuspendata in solutie Tris 10mM EDTA 1mM. Probele au fost stocate la 4C.► Verificarea puritatii si integritatii ADN

Inainte de a folosi ADN-ul extras si purificat pentru diverse manipulari moleculare, este necesar sa se verifice puritatea si integritatea lui. In functie de valorile A260 si A280 se poate stabili gradul de contaminare proteica, iar gradul de contaminare cu polizaharide se determina in functie de valoarea raportului A260/A230 ►Verificarea electroforetica a ADN

Prin electroforeza in gel de agaroza in placa orizontala in sistem submers s-a verificat gradul de fragmentare a acestor molecule si gradul de contaminare cu ARN. S-a folosit agaroza SIGMA dizolvata in tampon TBE 1X, intr-o concentratie de 0,8%.

3.2 Determinarea procentului molar de guanină şi citozină(% mol GC)Etapele determinarii % mol GC ale unei probe de ADN au fost urmatoarele: - izolarea ADN

conform protocolului descris mai sus, finalizat cu resuspendarea extractului de ADN in SSC (0,1X) ; - citirea valorilor absorbantei la lungimea de unda de 260nm in timpul denaturarii termice a ADN, la fiecare 2C pe un interval de temperatură de 20-100 C; - valorile absorbantelor si ale temperaturii de denaturare au fost inregistrate automat intr-un grafic; - punctul de mijloc al curbei a fost considerat a fi Tm si a fost corelat cu procentul de GC, conform urmatoarelor relatii:

%mol GC = 2.08 xTm – 106.4 [Owen R., 1985]%mol GC =2,44x (Tm-53.9) [Franck K., 1971]

3.3 Analiza electrocariotipurilor► Electrocariotipare prin tehnica FIGE

Electroforeza in camp electric inversat s-a realizat cu ajutorul unui dizpozitiv conceput in laborator, utilizand agaroza 0,9% (Agarose for Pulsed Field Electrophoresis Running Gel) preparata in tampon TBE 0,5 X cu un voltaj de 2V/cm. Parametrii electroforezei au fost stabiliti in raport cu dimensiunea preconizata a cromozomilor ce urmau a fi separati si au fost programati cu ajutorul unui computer astfel:-Timpul initial de migrare inainte ( Fwi = 10 sec)-Timpul final de migrare inainte ( Fwf = 500 sec)- Pauza pentru directia inainte (Pfw = 1/10 Fwi)- Timpul de migrare invers ( Rv = 1/3 Fwi)- Pauza pentru directia invers (Prv = 1/10 Rv)- Timpul total de migrare = 48 ore

3.4 Izolarea plasmidei 2 m In vederea izolarii ADN plasmidial 2 m, s-a realizat cultivarea in mediu YPG lichid, cu agitare magnetica si incubarea timp de 18 ore la 28C. Din suspensia celulara 1.5 ml au fost centrifugati 6 minute la 7000 rpm. Sedimentul celular obtinut a fost resuspendat prin barbotari succesive in 1 ml solutie TE-1 si 20 l -mercaptoetanol; 30 min 37C. Dupa indepartarea mercaptoetanolului prin centrifugare 6 minute la 6500 rpm, sedimentul a fost reluat in solutie CFEM si lyticaza intr-o concentratie finala de 3mg/ml, urmata de incubare 60 min la 37 C. Protoplastii astfel obtinuti au fost sedimentati prin centrifugare 6 minute la 6500 rpm, iar sedimentul rezultat a fost resuspendat in solutie TEG (15 min. la –20C) Liza celulara s-a realizat prin adaugarea de solutie II cu pH 12,5, agitarea tubului prin inversare si incubare pe gheata timp de 15 minute. Renaturarea ADN

2m s-a realizat prin adaugarea a 300 l solutie III cu pH 4,8, amestecarea prin inversarea usoara a tubului si incubare timp de 15 minute pe gheata.

După o centrifugare 12 minute la 12000 rpm deproteinizarea se realizeaza chimic, prin adaugarea unui amestec cloroform: alcool isoamilic ( 24:1 v/v ) si agitare 10 minute la temperatura camerei; 8min.7000 rpm. Precipitarea ADN 2m s-a realizat prin adaugarea a 0,6 - 1 volum alcool etilic 100% rece, agitare usoara prin inversarea tubului si incubare 15 minute pe gheata;15 min. 15000 rpm. Sedimentul a fost resuspendat in solutie TE cu pH 8,0 si incubat la 4 C.

3.5 Analize de restricţie pe ADN mitocondrialDigestia enzimatica a ADN mitocondrial extras s-a realizat utilizand endonucleazele de

restrictie EcoRV, HindIII, Bgl II, PvuII, AluI, HaeIII, Sau 3A, EcoRI, Hinf I, Pst I. Volumul final al amestecului de reacţie a fost de 20 l, şi a cuprins 2U enzimatice.Timpul de incubare a fost de 3h la 37C.

3.6 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)Reacţia de amplificare a ADN genomic izolat din tulpinile studiate, s-a realizat cu ajutorul

primerului OPA18 (BIOSEARCH) 50nM, cu secvenţa 5’-AGGTGACCGT- 3’.

3.7 ITS –PCR şi analize de restricţie a ampliconilor obţinuţi (ARDRA)ADN genomic izolat în etapa precedentă a fost utilizat ulterior şi în reacţia de amplificare

selectivă prin reacţie PCR.Pentru amplificarea regiunii 5.8S – ITS a ADNr au fost folosiţi primerii ITS1 şi ITS4, ce

permit obţinerea unor ampliconi ce cuprind ambele regiunui ITS .ITS1 – 5’ - TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’ITS4 – 5’ - TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’

3.8 Amplificarea şi secvenţierea domeniului D1/D2 ADNr 26S.Reactia de polimerizare s-a realizat utilizand: primerii specifici NL1, NL4 (10M) pentru amplificarea domeniilor D1/D2 din ADNr 26SNL1 (Invitrogen) - 5’GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG 3’NL 4 (Invitrogen) – 5’ GGT CCG TGT TTC AAG ACG G 3’În vederea realizării reacţiei de secvenţiere, într-o primă etapă s-a realizat purificarea

ampliconilor cu ajutorul unui kit specializat denumit QIAquick PCR Purification Kit, kit ce permite purificarea moleculelor de ADN dublucatenare şi monocatenare din reacţii PCR sau alte reacţii enzimatice. Produsul PCR obtinut conform datelor descrise anterior a fost supus analizei de secventiere, utilizand aceeasi pereche de primeri oligonucleotidici NL1 si NL4.4. Evidenţierea potenţialului biotehnologic al tulpinilor studiate

4.1 Testarea activităţii antimicrobiene Evidenţierea caracterului killer

S-a urmărit testarea caracterului killer al tulpinilor izolate faţă de o tulpină standard sensibilă la toxina killer: Saccharomyces cerevisiae 17/17 precum şi faţă de tulpinile Candida albicans ATCC1073 şi Candida parapsilosis CBS604. Drept martor pozitiv a fost folosită tulpina standard killer Saccharomyces cerevisiae SMR4.

4.2 Determinarea capacităţii de creştere pe substrat lipidicTestarea activitatii lipolitice

Evidenţierea activităţii lipolitice a tulpinilor studiate s-a realizat pe medii specifice suplimentate cu 0,05% Tween 80. Pornind de la compozitia standard a mediului s-au realizat si alte

variante de mediu prin modificarea concentratiei de Tween 80 ( 0.1%, 0.8% sau 1% Tween 80) sau a clorurii de calciu (0.04%)

5. Studiul genelor implicate în reglajul dimorfismului la drojdii de interes medical Studiul a fost realizat în colaborare cu Laboratorul Kovać, Departamentul de Biochimie,

Facultatea de Ştiinţele Naturii, Universitatea Comenius, Bratislava, în cadrul unei burse FEMS cu titlul “Molecular genetic dissection of morphogenesis of the pathogenic yeast Candida parapsilosis”

Tehnica folosită a fost tehnica PHD, realizându-se supraexprimarea genelor tulpinii Candida parapsilosis CBS604, în celule diploide de Saccharomyces cerevisiae L5366. Etapele realizării acestui obiectiv au fost:

- Transformarea chimică a celulelor de drojdie- Izolarea ADN total din celulele de drojdie transformate- Electrotransformarea celulelor de drojdie- Izolarea vectorului YEplac 195 din celule bacteriene de Escherichia coli- Identificarea genei implicate în morfogeneză, prin analize de secveţiere- Analize de restricţie a vectorului YEplac 195- Retransformarea celulelor de Saccharomyces cerevisiae L5366

1.4 Rezultate şi discuţiiEtapa preliminară de izolare a microorganismelor din produse lactate, a condus la izolarea

unui număr de 26 de tulpini de drojdii, ce au fost apoi crioconservate. Studiile ulterioare au implicat 6 dintre aceste tulpini, urmărindu-se caracterizarea lor morfologică, fiziologică şi genetică, în vederea unei încadrări taxonomice cât mai precise.

Rezultatele studiilor de taxonomie convenţională au condus la încadrarea taxonomică preliminară a tulpinilor LF în specia Trichosporon beigelii, tulpinile BC şi LC în specia Candida parapsilosis, CS în specia Kluyveromyces marxianus, iar tulpinile Ri şi BF în specia Saccharomyces cerevisiae. Analiza statistică a datelor obţinute, a confirmat această încadrare taxonomică, indicând însă în cazul tulpinilor BC şi LC un grad mic de divergenţă faţă de specia Candida parapsilosis.

Tree Diagram for 11 Cases

Unweighted pair-group average

Squared Euclidean distances

Link

age

Dis

tanc

e

0

1

2

3

4

5

6

7

8

S.C.107 R-BF

S.C.105 S.C.108

S.C.104 S.C.110

S.C.102 S.C.106

S.C.103 S.C.109

S.C.101

Tree Diagram for 10 Cases

Unweighted pair-group average

Squared Euclidean distances

Link

age

Dis

tanc

e

0

1

2

3

4

5

6

K_MARX35K_MARX41

K_MARX39K_MARX40

K_MARX36K_MARX42

R-CSK_MARX37

K_MARX38K_MARX34

Fig.1 Rezultatul analizei fenetice aplicate izolatelor naturale BF şi CS

Analizele moleculare realizate, au condus la următoarele concluzii :Protocolul optimizat pentru izolarea şi purificarea moleculelor de ADN cromozomal

poate fi utilizat cu succes, conducând la obţinerea unor extracte ADN optime din punct de vedere al concentraţiei şi purităţii.

Fig.2Electroforeza în gel de agaroză a probelor de ADN cromozomal

(Godeuri 1: CS; 2 : LF; 3: BC; 4:Ri; 5:LC; 6: BF )

Fig.3 Spectrul de absorbţie al ADN cromozomal izolat din tulpina BC

Valorile %molGC obţinute pentru tulpinile BC, LC, CS, LF, Ri au fost comparate cu cele descrise în literatura de specialitate pentru speciile Candida parapsilosis, Kluyveromyces marxianus, Trichosporon beigelii, respectiv Saccharomyces cerevisiae, observându-se că valorile obţinute pentru tulpinile studiate se înscriu în limitele descrise pentru speciile de referinţă.

Tab. 17 Valorile % mol GC pentru tulpinile BC, LC, LF, BF

Tulpina Tm Mol %GC

(formula lui

Owen)

Mol %GC(formula lui

Frank)

BC70,4 40,03 40.26

LC70.7 40.65 40.99

CS71,0 41,28 41.72

LF81,4 62,91 67.1

BF71.1 41.48 41.96

Fig.4 Curba de shift hipercromic pentru tulpina LC

Analiza electrocariotipurilor obţinute prin tehnica FIGE, a arătat numeroase similitudini între tulpinile BC, LC şi C. parapsilosis sugerând în continuare apartenenţa tulpinilor din izolate naturale la specia respectivă.

Au fost abordate ulterior analize moleculare ce au implicat moleculele de ADN extracromozomal.

Acest studiu a indicat, pentru toate tulpinile studiate, absenţa plasmidelor 2m/2m-like în celulele de drojdie. Acest rezultat este în concordanţă cu datele existente în literatură, referitoare la profilul plasmidial al speciilor C. parapsilosis, K. marxianus şi T. beigelii, întărind ipoteza apartenenţei tulpinilor BC, LC, CS, respectiv LF la aceste specii. S-a considerat faptul că absenţa plasmidei 2 m în cazul tulpinilor BF şi Ri nu exclude încadrarea taxonomică a acestora în specia S. cerevisiae, fiind cunoscut faptul că prezenţa acestei plasmide este tulpină specifică, regăsindu-se numai în anumite tulpini de S. cerevisiae.

Fig.5 Electroforeza în gel de agaroză a ADN plasmidial izolat din (A)1- Saccharomyces cerevisiae D649, 2-BF, 3-Ri ; (B)1-Saccharomyces cerevisiae D649,

2- LC; 3-CS; 4-LF; (C)1- Saccharomyces cerevisiae D649; 2- BC; 3-Ri

În ceea ce priveşte reacţiile de digestie enzimatică a ADN mitocondrial, analiza profilurilor de restricţie obţinute în urma reacţiilor de digestie enzimatică cu endonucleazele EcoRV si BglII au arătat că tulpinile LC si BC sunt similare între ele, dar diferite de tulpina de referinţă Candida parapsilosis CBS 604

Dimensiunile estimate ale fragmentelor de restricţie obţinute pentru cele două tulpini LC si BC au fost comparate de asemenea şi cu cele corespunzătoare fragmentelor de restricţie ale ADN mitocondrial de la C. orthopsilosis şi C. metapsilosis, fragmente înscrise într-o bază de date pusă la punct în laboratorul gazdă.

S-a observat astfel că tulpinile LC şi BC prezintă de asemenea diferenţe semnificative în ceea ce priveşte profilurile de restricţie a ADN mitocondrial şi faţă de tulpinile şi C. orthopsilosis, C. metapsilosis .

Pentru confirmarea rezultatelor obţinute, analizele de restricţie au continuat prin digestia enzimatică a extractelor de ADN mitocondrial cu endonucleazele Hinf I şi Alu I. Profilurile de restricţie obţinute în cazul tulpinii C. parapsilosis CBS604 sunt identice celor descrise în literatura de specialitate ceea ce dovedeşte acurateţea rezultatelor obţinute în urma acestei analize moleculare.

În urma acestor reacţii, a fost confirmat faptul că tulpinile BC si LC sunt similare intre ele, dar diferite faţă de tulpinile de referinţă C. parapsilosis, C. orthopsilosis (C. parapsilosis Grupul II) şi C. metapsilosis (C. parapsilosis Grupul III).

Aceste rezultate au fost completate prin abordarea unei noi tehnici de taxonomie moleculară bazată pe amplificarea unor secvenţe randomice din ADN genomic.

În cazul tulpinilor studiate, într-o etapă premergătoare amplificării, s-a realizat izolarea ADN genomic din tulpinile luate în studiu, acesta arătând un grad ridicat de integritate şi puritate a probelor (lipsa contaminării cu ARN).

1 2 3 4 5 6 7

Fig.6 Electroforeza în gel de agaroză a probelor de ADN genomic(Godeuri 1: c. parapsilosis; 2: BC; 3: LC; 4: CS; 5: LF; 6: Ri; 7: BF)

Ulterior, acesta a fost utilizat în reacţii de amplificare cu ajutorul unui primer randomic – OPA 18 ce prezintă specificitate pentru genul Candida, fiind cunoscut faptul că, în reacţia RAPD alegerea unui primer nepotrivit cu ADN-ul sursă, poate duce la lipsa produşilor de reacţie sau la apariţia unor benzi slabe, greu de interpretat.

Similitudinile dintre profilurile RAPD obţinut pentru tulpinile BC şi LC indică apartenenţa lor la aceeaşi specie, diferită însă de C. parapsilosis.

Pentru identificarea tulpinilor luate în lucru, utilizând aceleaşi probe de ADN genomic, a fost realizată amplificarea regiunii ITS1-5.8 S-ITS2, alegând drept primeri perechea - ITS1/ITS4.

Dimensiunea ampliconilor obţinuţi în urma acestei reacţii, corespunde datelor descrise în literatură, pentru speciile de referinţă Candida parapsilosis, Kluyveromyces marxianus, respectiv Trichosporon beigelii.

Tab. 2 Dimensiunea ampliconilor ITS1-ITS2 şi a fragmentelor de restricţie obţinute în cazul tulpinilor C.parapsilosis CBS 604, BC şi LC

Tulpina Dimensiunea ampliconului

(bp)

Numărul situsurilor de restricţie şi dimensiunea (bp) fragmentelor de restricţie obţinute cu endonucleaza

CfoI Hinf I Hae III Hpa II

C.parapsilosis CBS604

520/550 1 300;240 1 290;260 1 ~100;400 560

BC 520-550 2 210; 170; 80

2 240; 150; 150

1 ~100;400 1 2x260

LC 520-550 2 210; 170; 80

2 240; 150; 150

1 ~100;400 1 2x260

Tab. 3 Dimensiunea ampliconilor ITS1-5,8S-ITS2 şi a fragmentelor de restricţie obţinute în cazul tulpinii CS

Tulpina Dimensiunea ampliconului

(bp)

Numărul situsurilor de restricţie şi dimensiunea (bp) fragmentelor de restricţie obţinute cu endonucleaza

CfoI Hinf I Dde I

CS 740 3 285;190;165;90 3 240; 185; 120; 80

1 140; ~ 600

În vederea identificării precise a tulpinilor BC şi LC ce s-au dovedit a fi similare, dar diferite de tulpina de referinţă considerată a fi C. parapsilosis, s-a recurs la secvenţierea parţială a ADNr 26S. Este unanim recunoscut faptul că, secvenţa regiunii D1/D2 ADN 26S r, are un rol important în taxonomia drojdiilor, secvenţele corespunzătoare multor specii de drojdii fiind deja determinate şi înscrise în bazele de date.

În urma reacţiei PCR au fost obţinuţi, pentru fiecare din tulpinile luate în lucru, ampliconi D1/D2 ADNr26S cu dimensiunea de aproximativ 600 bp, rezultatul confirmând datele de literatură

Analiza acestei secvenţe s-a dovedit a fi, şi în acest caz, o metodă rapidă şi acurată de identificarea a drojdiilor, tulpinile BC şi LC fiind inacadrate taxonomic drept Issatchenkia orientalis.

Deşi în studiul nostru, această tehnică s-a dovedit a furniza cele mai precise rezultate, considerăm că încadrarea polifazică a microorganismelor poate fi cea mai bună abordare ce conduce la o identificare adecvată a acestora.

În urma analizelor morfo-fiziologice, şi de nivel molecular, considerăm oportună încadrarea taxonomică cu mare probabilitate a tulpinilor CS, LF, BF şi Ri, în speciile K. marxianus, T. beigelii respectiv, S. cerevisiae. De asemenea semnalăm identificarea de înaltă acurateţe a două dintre tulpinile din izolate naturale, BC şi LC în specia I. orientalis.

În vederea evidenţierii fenotipului killer cunoscut ca fiind caracteristic numai unui număr redus de specii, într-o primă etapă s-a realizat testarea potenţialului killer al tulpinilor studiate folosind drept tulpină standard sensibilă la toxina killer, tulpina S. cerevisiae 17/17.

Rezultatele au fost interpretate comparativ cu cele obţinute în cazul tulpinii martor S. cerevisiae SRM 4- tulpină standard producătoare de toxină killer (martor pozitiv).

Fig. 7 Evidenţierea caracterului killer al tulpinilor studiate faţă de tulpina standardsensibilă S. cerevisiae 17/17:

(A) tulpina Ri; (B)tulpina LC; (C) tulpina CS(D) tulpina BF; (E) tulpina BC; (F) tulpina LF; (G) tulpina S. cerevisiae SMR4

Cu ajutorul unui stereomicroscop 2X, au putut fi puse în evidenţă zonele de inhibiţie (colorate în albastru deschis) formate în jurul tulpinilor studiate. S-a observat faptul că, toate tulpinile luate în lucru au manifestat fenotip killer faţă de tulpina sensibilă S. cerevisiae 17/17, o zonă de inhibiţie mai redusă remarcându-se doar în cazul tulpinii BF.

Rezultatele obţinute ulterior, au arătat de asemenea că, tulpina Candida albicans ATCC10231 este sensibilă la toxina killer produsă de tulpinile LF şi CS, în timp ce tulpinile BC, CS, LC, LF şi S. cerevisiae SMR4 manifestă fenotip killer faţă de tulpina Candida parapsilosis CBS 604

Experimentele următoare, au urmărit testarea activităţii lipolitice a tulpinilor nou izolate precum şi optimizarea unor condiţii de mediu pentru cultivarea microorganismelor, în scopul creşterii producţiei de lipaze. Activitatea lipolitică, pe toate substraturile testate, a fost apreciată prin observarea zonelor de opacitate formate în jurul tulpinilor studiate. Prezenţa acestor zone de

precipitare se datorează formării sărurilor de calciu, insolubile, ale acizilor graşi eliberaţi prin hidroliza Tween 80 ( ester al acidului oleic).

Rezultatele au fost interpretate comparativ cu cele obţinute pentru tulpinile C. tropicalis, C. guilliermondii, C. parapsilosis CBS604 şi C. albicans ATCC10231- tulpini considerate potenţial producătoare de lipaze

În scopul unei mai bune caracterizări a activităţii lipolitice, în cazul tulpinilor din izolate naturale (BC, LC, CS, BF, Ri, LF) a fost utilizat şi un mediu conţinând 1% Tween 20.

Tab.4 Activitatea lipolitică a tulpinilor studiate pe diverse medii de creştere

TulpinaMediul standard de creştere suplimentat cu

0.5%Tween80

0.5%Tween80

0.04% CaCl2

0.1%Tween80

0.8%Tween80

1% Tween80

Candida tropicalis

++ + + + ++

Candida guilliermondii

+ + ++ ++ -

Candida parapsilosis CBS604

+ + ++ ++ -

Candida albicans ATCC10231

+++ +++ +++ +++ +++

BC + - - - -LC - - - - -CS - - - - -BF - - - - -Ri - - - - -LF + + + + ++

Tab.5 Activitatea lipolitică a tulpinilor studiate pe mediu suplimentat cu 1% Tween20

Mediul standard de

creştere suplimentat cu

Tulpini

BC LC CS BF Ri LF

1% Tween 20 - - - - - +++

Fig.8 Zone de precipitare în jurul tulpinii C. albicans ATCC10231 pe mediu

cu 0.5% Tween80 – (A) după 4 zile (B) după 8 zile de incubare

În ceea ce priveşte optimizarea condiţiilor de creştere în prezenţa substratului lipidic, studiul realizat a urmărit să evidenţieze: 1.capacitatea de creştere a tulpinilor studiate, pe mediu YNB suplimentat cu diferite substraturi: Tween80, Tween20, Triton X-100, precum şi - 2.influenţa variaţiei substratului asupra creşterii celulare

Profilurile curbelor de creştere obţinute pentru tulpina C. albicans ATCC10231, sunt similare celor descrise în literatura de specialitate, confirmând astfel acurateţea metodei alese.

Fig.9 Influenta variatiei substratului asupra cresterii celularein cazul tulpinii Candida albicans ATCC10231

Dintre toate tulpinile aparţinând genului Candida tulpina C. parapsilosis CBS 604 a înregistrat cea mai importantă creştere utilizând drept substrat Tween20. În ceea ce priveşte tulpinile nou izolate, cel mai spectaculos caz a fost cel al tulpinii LF, ce a prezentat încă din primele 24h, capacitate de creştere preferenţială pe mediu YNB suplimentat cu Tween 20. Aceste date confirmă rezultatele anterioare ce au evidenţiat capacitatea degradativă a acestei tulpini în prezenţa substratului lipidic Tween20.

Variind concentraţia substratului testat, exceptând C. parapsilosis CBS604, tulpina LF prezintă rata cea mai mare de creştere în prezenţa substratului lipidic fie el Tween20 sau Tween80, fapt ce indică această tulpină ca având capacităţi degradative deosebite.

S-a stabilit astfel că unele dintre tulpinile testate prezintă unele particularităţi fiziologice ce le indică drept potenţiale candidate pentru utilizarea lor ca tulpini cu aplicabilitate probiotică, urmând a fi realizate şi alte studii care să întărească această ipoteză

Într-un studiu final, fost urmărit un alt aspect al implicării drojdiilor în viaţa omului, cel al patogenităţii. Scopul experimentelor realizate, l-a constituit identificarea unor gene implicate în

morfogeneză la specia C. parapsilosis , cunoscută ca fiind a doua specie patogenă pentru om, după C. albicans.

Parcurgând tehnica “PHD screen”, într-o primă etapă a fost realizată transformarea chimică a celulelor de drojdii cu vectorul YEplac195 în care se afla construită biblioteca de gene a tulpinii C. parapsilosis CBS 604.

În total, în urma transformării celulelor de S. cerevisiae L5366 cu vectorul YEplac195 şi testarea acestora pentru formarea de pseudohife, pe mediu SLAD – sărac în sursă de azot, au fost analizate microscopic un număr de 4 000 de clone. Acestea reprezintă aproximativ 5% din biblioteca de gene de la C. parapsilosis CBS604 construită în vectorul Yeplac 195. Dintre acestea, 100 de clone au format pseudohife pe mediu sărac în sursă de azot. Prin retestare pe mediu SLAD, numai un număr de 22 de clone au prezentat fenotip stabil

Într-o etapă ulterioară s-a realizat izolarea de ADN total, din toţi cei 22 de transformanţi.Acesta a fost utilizat apoi, în experimentele de electroporare a celulelor competente de

Escherichia coli. Transformanţii bacterieni astfel obţinuţi, au fost însămânţaţi pe mediu LB cu ampicilină, realizându-se astfel selecţia clonelor ce au primit gena de rezistenţă la ampicilină de la nivelul vectorului YEplac195.

S-a realizat apoi izolarea ADN plasmidial din celulele bacteriene electrotransformate, iar integritatea moleculelor de ADN plasmidial obţinut a fost verificată electroforetic, folosind ca marker de greutate moleculară vectorul Yeplac 195

Din analiza gelului de electroforeză s-a putut observa prezenţa, în cazul unora dintre transformanţi, a unor molecule de ADN plasmidial de dimensiuni comparabile cu cele ale vectorului YEplac195 lipsit de insert. Astfel de molecule au fost omise din experimentele ulterioare de retransformare a celulelor de S. cerevisiae L5366. In urma retransformării celulelor de S. cerevisiae L5366 cu molecule de ADN plasmidial, s-a observat faptul ca doar unul dintre transformanţi (notat T46) a prezentat stabilitate fenotipica (formare de pseudohife) pe mediu selectiv SLAD.

Ulterior ADN plasmidial izolat din transformantul T46, a fost investigat prin analize de restricţie ce au condus la estimarea dimensiunii insertului la 3 kb, precum şi prin analize de secvenţiere.

În urma comparării secvenţei obţinute în bazele de date, cu ajutorul programului BLAST, a

fost observat un grad înalt de omologie (81.62%) cu gena WAP1 de la C. albicans. Această genă

denumită CpWAP1, codifică pentru o proteină de suprafaţă celulară localizată la nivelul

pseudohifelor.

1.5 Concluzii► În urma analizelor morfo-fiziologice, şi de nivel molecular, considerăm oportună

încadrarea taxonomică cu mare probabilitate a tulpinilor studiate, după cum urmează: CS - Kluyveromyces marxianus, LF – Trichosporon beigelii respectiv; BF şi Ri - S. cerevisiae. De asemenea semnalăm identificarea de înaltă acurateţe a două dintre tulpinile din izolate naturale, BC şi LC în specia Issatchenkia orientalis.

► Tulpinile studiate, dintre care s-au remarcat LF şi CS, prezintă unele particularităţi fiziologice ce le indică drept potenţiale candidate pentru utilizarea lor ca tulpini cu aplicabilitate probiotică, urmând a fi realizate şi alte studii care să întărească această ipoteză

► In ceea ce priveste morfogeneza speciei Candida parapsilosis, studiul realizat reprezintă o premieră, gena CpWAP1, fiind prima genă izolată şi caracterizată ca fiind implicată în tranziţia de la forma unicelulară la cea filamentoasă, în cazul speciei C.parapsilosis.