TEMA :

DIAGNOSTICUL SEROLOGIC IN SIFILIS

INDRUMATOR: Dr. RAMONA MIHAELA STOICESCU

STUDENT : TURLICA( DRAGOMIR) MIRELA

ANUL : II

GRUPA : 14

DIAGNOSTICUL SEROLOGIC IN SIFILIS

Diagnosticul serologic in sifilis se poate realize prin doua tipuri de teste :

I. Teste serologice non-treponemice( teste nespecifice) ;

II. Teste treponemice ( teste specific)

Teste serologice non-treponemice

In cazul acestor teste , antigenul folosit este cardiolipina ,lipid extras din cordul bovin ,asemanator structural cu antigenele treponemice. Aceste antigene reactioneaza cu anticorpii de tip IgM si IgA , anticorpi prezenti in serul pacientului la 2-3 saptamani de la infectie.

Din categoria testelor nespecifice fac parte :

1. Veneral Disease Research Laboratory(VDRL);

2. Rapid Plasma Reagin (RPR);

3. Reactii de fixare a complementului (RFC) . Reactia Bordet-Wasserman .

1. VDRL este un test de floculare, netreponemic ,care se bazeaza pe faptul ca particulele antigenice raman dispersate in serul normal ,dar formeaza grunji vizibili atunci cand se combina cu reaginele.Rezultatul se citeste prin transluminare pe fond negru ,cu ajutorul unei lupe . Rezultatul este negativ daca lichidul nu prezinta flocoane si este asemanator martorului negativ si martorului Ag.rezultatul este pozitiv cand se vad flocoane , in lichi clar.

Este un test de screening , rapid si simplu de facut. Rezultatul negativ nu elimina diagnosticul de sifilis ;pacientul se poate afla in perioada de incubatie sau in faza de sifilis latent. Din acest motiv se recomanda efectuarea unor teste specifice.

2. RPR este de asemeni un test nespecific. Se folosesc placute de carton plastifiat ,de unica utilizare.Se utilizeaza obligatoriu un ser de control pozitiv si un ser de control negativ ,cele doua seruri si reactivii , in momentul testului fiind la temperature camerei.In fiecare cerculet se pipeteaza cu varfuri separate cate 50µl ser : ser control pozitiv ,ser contol negative si ser de cercetat.Fiecare ser se disperseaza pe intreaga suprafata a cerculetului.

Suspensia antigenic se omogenizeaza prin agitare 10-15 secunde a sticlutei dispenser. Cu sticluta in pozitie verticala se depune cate o picatura de antigen ,peste ser , in fiecare cerculet. Se agita prin

miscari rotative ,cu rotorul automat sau manual ,timp de 8 minute, citirea realizandu-se dupa oprirea rotatiei.

Rezultatul pozitiv este reprezentat de prezenta aglutinarii in orice grad.Lipsa aglutinarii presupune un rezultat negativ.

Atat VDRL cat si RPR pot da rezultate fals positive in boli virale , parazitare (malaria) ,lepra , sarcina , hepatite cornice , neoplasme in stadiu avansat . Pot da rezultate fals negative la 40% din cazuri in sifilis primar si 25% din cazuri in sifilisul secundar.

3. Reactia de fixare a complementului, este un test care permite evidentierea “ in vitro “ a prezentei anticorpilor ,si se bazeaza pe proprietatea sistemului C’ de a se fix ape complexul imun Ag-Ac . Odata activat complementul , daca sistemul Ag-Ac este hemolitic ,produce liza hematiilor. In prima faza a reactiei se introduce serul de cercetat iar daca acest ser contine Ac specifici fata de Ag cunoscut se va forma complexul Ag-Ac ,urmat de fixarea C’, si nu va mai fi disponibil pentru a se fix ape sistemul hemolitic indicator. Daca serul de cercetat nu contine Ac specifici fata de Ag cunoscut , nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac in prima etapa . Dupa introducerea in reactive a sistemului hemolitic indicator , hematiile si Ac-antihematie se vor cupla ,vor forma un complex imun ,iar C’ liber se va fixa de acesta .Dupa fixare va urma activarea C’ si respective liza hematiilor , hemoliza putand fi examinata cu ochiul liber.Testul este negativ atunci cand lichidul din tub are un aspect rosu , limpede, inseamna ca nu exista Ac. Testul este pozitiv atunci cand in tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliza ,hematiile se depun formand un buton in partea inferioara a tubului(in serul de cercetat exista Ac).Pentru a stabili diagnosticul final , este necesar sa fie confirmata prin reactii specifice.

Este o metoda mai laborioasa si se prefera testele de aglutinare pentru rapiditatea tehnicii.

Tete serologice specifice

Se folosesc ca teste de confirmare a RPR sau VDRL pozitive ,si utilizeaza ca antigen ,extras din trponemele patogene. Sunt teste specific ,dar mai putin sensibile ,respective se pozitiveaza mai tarziu in cursul evolutiei infectiei decat testele nespecifice.Testele utilizate in diagnosticul sunt:

1. Imunofluorescenta indirecta ;

2. TPHA( Treponema Pallidum Haemagglutination Reaction );

3. ELISA ( Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay );

4. TIT( testul de imobilizare al treponemelor).

1. Imunofluorescenta indirectaeste o metoda care presupune realizarea unui frotiu pornind de la Ag cunoscut.Sectiunile tisulare sau preparatele celulare se trateaza cu serul de cercetat ,iar dupa spalare Ac legati specific de Ag celulare se evidentiaza prin tratarea cu serul imun anti-Ig marcata cu flurocromi. Rezulta un coplex format din trei elemente : Ag celular + Ac specific + anti-Ig conjugate.In prima etapa are loc reactia dintre Ag si Ac specific nemarcat. Legarea lor specifica este vizualizata prin intermediul unei Ig conjugate , care are activitate de Ac fata de Ac specific din serul de cercetat . In aceasta reactive , Ac nemarcat are rolul unui reactant dublu : este Ac deoarece se combina specific cu Ag , dar are si rolul de Ag in raport cu cel de-al doilea Ac marcat cu fluoresceina.

Este o reactie foarte specifica si sensibila , fiind primul test care se pozitiveaza in sifilisul primar.

2. TPHA reprezinta reactia de hemaglutinare treponemica .Eritrocitele sunt tratate sa adsoarba pe suprafata lor treponemele. In contact cu serul pacientului ce poseda anticorpi antitreponemici , apare reactia de aglutinare a hematiilor.Reactia poate fi efectuata calitativ si cantitativ .in cazul testului calitativ se foloseste un sir de patru godeuri .Se utilizeaza obligatoriu un ser de control pozitiv si un ser de control negative. In cazul testelor cantitative pentru fiecare ser testat se foloseste un sir de opt godeuri , realizandu-se dilutii binare ultima fiind de 1:80. Rezultatul pozitiv , indica prezenta anticorpilor specifici antitreponemici , semnificand o infectie actuala sau in antecedente ( anticorpii antitreponemici pot ramane prezenti cativa anis au chiar toata viata chiar daca infectia a fost tratata , semn al trecerii prin boala ) .

Rezultatul negative indica absenta anticorpilor , semnificatii fiind , in functie de VDRL , fie absenta infectiei , fie o infectie foarte recenta.

Tehnica TPHA poate da reactii incrucisate cu alte forme de infectii cu treponeme si reactii fals positive cu probele pacientilor cu mononucleoza infectioasa , lepra sau maladii autoimune.

3. Tehnica ELISA este o reactie imunoenzimatica de detectie a anticorpilor specifici in serul pacientului. Este un test cu elemente marcate , care determina Ac sau Ag prin reactia specifica Ag-Ac; prezenta complexelor Ag-ac poate fi vizualizata si masurata , deoarece unul dintre reactivi este conjugat cu o enzima , iar dupa adaugarea in mediul de reactie a unui substrat

cromogen specific enzimei marker , densitatea optica a mediului de reactive se va modifica , iar valoarea densitatii optice se poate masura spectrofotometric .

Metoda imunoenzimatica necesita un suport solid , pe care unul dintre componentii imuni este adsorbit . Imunoadsorbtia permite fixarea ulterioara a reactivilor din faza lichida care urmeaza a fi identificati sau dozati . Unul dintre reactivi , conjugatul , este cuplat cu o enzima . Etapa finala este reactia enzimatica in cursul careia ,actiunea enzimei asupra substratului este relevata printr-o modificare de culoare.

Testul ELISA utilizeaza microplaci cu godeuri , tapetate cu antigenul sau anticorpii corespunzatori in faza solida .Formarea complexelor Ag-Ac se face pe principiul sandwich si anume, antigenele sau anticorpii fixate pe suportul solid sunt detectati de anticorpii sau antigenele complementare , marcate cu ajutorul unor enzyme. Cand este adaugat substratul enzimatic , prezenta complexelor Ag-Ac este decelata prin aparitia unui produs final colorat.

4. TIT sau testul Nelson este un test care evidentiaza imobilizinele. Se efectueaza utilizand o suspensie de treponeme patogene vii din tulpina Nichols care se pun in contact cu serul de cercetat. Se efectueaza un preparat native care se examineaza la microscopul cu fond intunecat.Treponemele apar stralucitoare si mobile. Daca isi incetinesc miscarile si devin imobile inseamna ca serul pacientului contine imobilizine si reactia este pozitiva .

Este testul standard , insa este dificil de efectuat.

Bibliografie

1. Stoicescu Ramona Mihaela , Notiuni de microbiologie medicala si farmaceutica , editura Universitara “ Carol Davila “ , Bucuresti , 2009

2. Sacarea Toma Felicia , Bacteriologie Medicala , University Press , Tirgu Mures , 2006

3. Braga V. , Badea V. , Botnarciuc M. ,Stoicescu R. , Voineagu L. , Barbu A ., Parazitologie si virusologie medicala , curs, Ovidius University press, Constanta , 2003;

4. Bara Constantin , Esential de imunologie , All medical , Bucuresti 2002;

5. http:// www. microumftgm.ro/