LP 5ELECTROFOREZA

ELECTROFOREZA1937 Arne Tiselius- aparat sofisticat care sa permita separarea diferitelor particule in prezenta unui camp electric

1948 Tiselius- Premiul Nobel pentru Chimie (separarea coloizilor prin metode electroforetice)

1960 Vin Thorne - electroforeza acizilor nucleici

ELECTROFOREZA

Denumirea: gr.Electron= electric, lat.Phore = purttor, evideniindu-se astfel rolul esential al campului electric

reprezint o metod de analiz i separare bazat pe migrarea particulelor solide incarcate electric dispersate ntr-un lichid sub aciunea unuicmp electric

Moleculele de ADN sunt incarcate negativ si vor migra spre polul pozitiv

ELECTROFOREZAFortele care determina mobilitatea electroforetica depind de: voltajul aplicat (65-75 V), sarcina neta a moleculelor, masa moleculara si coeficientul de frictiune- teoretic: 5 v/cm

ELECTROFOREZACuva (tanc) de electroforeza2 electrozi conectati la o sursa de curentGel de electroforeza (pentru o migrarea mai buna a moleculelor) un lichid (tampon de electroforeza)

ELECTROFOREZAGelul de electroforezaGel de agaroza (polizaharid, D-galactoza and 3,6-anhidro-L-galactopiranoza, extras din alge)Gelurile de agaroza au o concentratie de 1-5%, in functie de dimensiunea fragmentelor ce trebuie separateGelurile de agaroza permit separarea acizilor nucleici cu dimensiuni intre 100-1500 pb

ELECTROFOREZAGel de poliacrilamida: permit separarea acizilor nucleici cu dimensiuni intre 60-450 pb si a proteinelordezavantaje: neurotoxic si cancerigenGelurile de agaroza se formeaza prin incalzirea agarozei la cuptorul cu microunde timp de 3-4 minute. Aceste geluri polimerizeaza formand o retea cu ochiuri de dimensiuni variabile in functie de concentratia geluluiGelurile de poliacrilamida polimerizeaza la temperatura camerei in prezenta unor agenti de polimerizareGelurile cu concentratie mica (< 3%) separarea moleculelor cu MM mareGelurile cu concentratie mare (> 3%) separarea moleculelor cu MM mica

ELECTROFOREZAGel de agarozaGel de poliacrilamida260, 250

ELECTROFOREZATamponul de electroforezaTAE: Tris, acid acetic, EDTATBE: Tris, acid boric, EDTAAcid citricGlicinaAcid fosforicTRIS = tris(hidroximetil)aminometanPentru vizualizarea fragmentelor de acizi nucleici : - colorarea gelului: bromura de etidiu, Syber Green, EvaGreen, GelGreen, GelRed sau- Colorarea tamponului: bromura de etidiu

ELECTROFOREZA

Tipuri de electroforezaIn functie de suportul folosit:Electroforeza in solutie libera = electroforeza capilaraElectroforeza pe diferite suporturi: hartie, film, geluri

In functie de planul de electroforeza:Electroforeza orizontala acizi nucleiciElectroforeza verticala - proteine

Tipuri de electroforezaElectroforeza pentru acizi nucleici1. In gel de agaroza2. DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in gradient denaturant3. TGGE: (temperature gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in gradient de temperaturaAmbele metode sunt folosite in domeniul biomedical (mutatii) si ecologie microbiana4. PFGE (pulse field gel electophoresis): electroforeza in camp pulsatoriuGel de agaroza, dar voltajul este schimbat in 3 directii (1 catre centru gelului, 2 care actioneaza intr-un unghi de 60o)Pentru genotipare, epidemiologie moleculara

Tipuri de electroforezaDGGE

Tipuri de electroforezaElectroforeza pentru separarea proteinelorPAGE: in gel de poliacrilamidaSDS-PAGE: electroforeza in conditii denaturante- Agenti de denaturare: SDS, uree si formamida IEF (focusare izoelectrica): se realizeaza intr-un gradient de pH, fiecare proteina migrand pana atinge punctul unde pH = pI 2DGE (Two-dimensional gel electrophoresis): IEF si SDS-PAGE (pH izoelectric si MM)

Tipuri de electroforeza

Tipuri de electroforeza

Electroforeza biochimie clinicaElectroforeaza proteinelor serice: albumina, 1globuline, 2globuline, 1 globuline, 2 globuline, globulinemalnutritie, malabsorbtie, sindrom nefrotic, neoplazii, hepatita, boli autoimuneElectroforeza hemoglobinei anemieElectroforeza lipoproteinelor boli cardiovasculare