Endonucleazele de restrictie sunt enzime care recunosc secvenţe de nucelotide specifice din ADN dublu catenar şi sunt un instrument major al biotehnologiştilor.

Electroforeza este o metoda fizico-chimica de analiza ce permite separarea proteinelor pe baza diferentelor intre vitezele de deplasare intr-un camp electric aplicat mediului respectiv. Ca urmare a caracaterului lor amfoter, proteinele poseda o sarcina electrica ce depinde de natura moleculei, pH si de compozitia mediului. Moleculele incarcate electric, aflate in solutie si supuse actiunii unui camp electric, vor migra catre electrodul de polaritate opusa.

Agaroză Albumina serică bovină (BSA, 10mg/ml) Ditiothreitol, 20x (DTD, 20mm) Baloane Erlenmezer (250ml) Bromură de etidiu (10mg/ml, ) Mănuşi Gheaţă Laboratorul de bandă

Marcatori de mărime Hindill, de concerntrare furnizate de fabricant (~0,5/~g/ml)

Tuburi de microcentrifugă (0,5ml) Micropipetor şi sfaturi Pipeta pasteur Probe de reacţie PCR Folie de plastic Film polaroid (tip 667) pRY121 plasmidă de ADN de la maxi-

prep pRY121 plasmidă de ADN de la mini-prep

Electroforeza fragmentelor deADN este o metoda analiticafolosita pentru separareaacestor fragmente in functie demarimea lor In solutie libera, la pH neutrusau alcalin, acizii nucleici nu potfi separati Pentru separarea lor se sefolosesc matrici de gel deagaroza sau poliacrilamida

Gelurile de agaroza suntfolosite pentru separareaacizilor nucleici cu mase mari,in timp ce diferentiereamoleculelor de acizi nucleici cumase moleculare mici se face ingeluri de poliacrilamida Un camp electric determinamigrarea lor prin gel Datorita numarului mare deresturi fosfat, acizii nucleici au oputernica incarcatura negativa,migrand in campul electric spreanod

Fragmentele se separa

sub forma unor benzielectroforetice Mobilitatea unuifragment de ADN esteinvers proportionala

cumasa moleculara, fiindde asemeneainfluentata de o seriede factori

In conditii ideale, viteza de migrare a fragmentelor este direct proportionala cu tensiunea aplicata

Vascozitatea gelului sepoate reduce in

momentulcresterii temperaturii

ceeace produce distorsiuni aleprocesului de migrare

Tampoanele deelectroforeza au rolul de amentine un pH si o putereionica constante, la valorioptime pentru separare Agentii denaturanti(ureea,formamida, formaldehida)indeplinesc functia decombatere a fenomenelorde agregare si adsorbtie amoleculelor de acizi nucleicipe matricea de gel, dar sifunctia de inlaturare adiferentelor conformationale

Dupa ce separatia estecompleta, fragmentele

ADNavand lungimi diferite

suntadesea vizualizate prinutilizarea unui colorantfluorescent precum

bromurade etidiu Marimea fragmentelor

este exprimata in:”nucleotide”,perechi de baze” sau “kb”-pentru o mie de perechi de baze

Determinarea marimii fragmentelor se face uzual prin compararea cu “DNA-ladders” ce contin fragmente liniare de ADN, de lungimi cunoscute

Electroforeza acizilor nucleicieste o etapa obligatorie in oriceprotocol de analiza a acizilornucleici Prin ea se realizeaza:separarea fragmentelor ADNrezultate in urma digestiei cuenzime de restrictie; verficareaamplificarii PCR; identificareasi/sau determinareasemicantitativa a fragmentelorADN rezultate in urmaamplificarii PCR; detectia sideterminarea semicantitativa aADN-ului genomic obtinut inurma extractiei din tesuturi

Analizele ADN si ARN auasadar roluri cruciale indetectarea mutatiilor, indiagnosticarea bolilor

genetice,a cancerelor, in diagnosticulmicrobiologic Dar si in cadrul testelor

depaternitate si de identificare

apersoanelor In determinarea profiluluigenetic al bolilor In teste de filogenie Toate aceste analize

cuprind in mod obligatoriu si etapa de

electroforeza

De aici sesizam cu

usurinta importantafunctie a utilizariitehnologiei ADN inprognosticare,diagnosticare,monitorizare si

terapie

Tehnologia ADN dispune de un larg spectru de aplicabilitate, in cele mai diverse si complexe domenii ale medicinii, atat in cercetarea fundamentala ce ne ofera permanent noi date si informatii, cat si in cercetarea aplicativa ce

ofera noi solutii terapeutice