1

ELECTROFOREZA

• Definiţii• Teoria Electroforezei• Tehnici Electroforetice• Proceduri generale• Electroforeza capilara• Aplicatii

2

Electroforeza– Migrarea substanţelor incărcate electric

dizolvate într-un mediu lichid si supus unuicâmp electric

– Multe molecule biologice au grupe ionizabile deexemplu: aminoacizi, proteine, nucleotide, acizinucleici

– Sub un câmp electric particuleîncăcate migrează la anod (+) sau catod (-)

• Se poate determina marimea, forma si sarcina uneimolecule.

• Se utilizeaza diferite variante ale electroforezeipentru a determina diverse proprietati.

3

ElectroforezaElectroforeza• Definitie: Migrarea ionilor prin

atractie sau respingere intr-uncamp electric.– Separarea componentilor unui

amestec prin aplicarea unui campelectric extern

• v=EQ/f– v = viteza moleculei– E = intensitatatea campului electric– Q = sarcina moleculei– f = coeficientul de frecare

4

Electroforeza: aspecteteoretice

+

+ –

Forta electromotoare (emf)

Analitul

ntaitezaconsaFFrFdQVEQF

analitemf

drag

emf

v,cand6

5

TEORIA ELECTROFOREZEI

• Multe molecule biologice există ca:(a) anionii sau (b) cationi

• Soluţie cu pH < pI => Amfolitul are sarcina +ve

• Soluţie cu pH > pI => Amfolitul are sarcina –ve

• Într-un câmp electric: Cationii migrează la catod (-) Anionii migrează la anod (+)

6

Viteza de migrare depinde de:

• Sarcina electrică netă a moleculei• Dimensiunea si forma moleculei• Puterea câmpului electric• Proprietăţile mediului (electrolitului)• Temperatura de separare

7

CONSIDERAŢII TEHNICE

Electro-endo-osmoza / Endo-osmoza

• suport în contact cu apa = ioni hidroxil adsorbiţi =>sarcină negativă (solvatare)

• Sarcina negativă de pe suport atrage ionii pozitiviîn soluţie => potenţial Stern

• creşte distanţa de la suprafaţa încărcată negativcreşte numărul de ioni negativipotenţial zeta ()numărul eventual de ioni - = nr. ioni +

8

Endosmoza

• Mari, extrem de incarcate,proteinele pot migra intre electroziiincarcati (polarizati) diferit

+ –

+-

- - --

--

-

--

- -

9

• Când se aplică curent sistemuluisarcinile - rămân fixate pe suportnorul de ioni din soluţie se muta la electrozi foarte hidrataţiodată cu mişcarea norului ionic, solventul se mişcă de

asemenea

• Mişcarea relativă a solventului de pe suportul fix=> endosmoză

• Mişcarea apei într-o singură direcţie

• Macromolecule se deplasează în direcţia opusă fluxului deioni + hidrataţi

=> pot rămâne imobile sau să fie atrase la polul opus

10

• În acetat de celuloză şi gel de agaroză

• Reducerea endo-osmozei prin:- Eliminarea / modificarea grupurilor

incărcate de pe suport- Adăugarea de zaharoză sau sorbitol

=> creştere a osmolalitatii

11

Electroforeză Zonală

• Migraţia moleculelor încărcate• Mediu de migrare depus pe un suportMedii poroase de exemplu: acetat de celuloza sau

agarozăPot fi uscate şi reutilizate• Acelaşi pH şi domeniu de rezistenţă electrica

• Separare bazată pe mobilitate electroforetică

• Separă coloizi macromoleculari deexemplu: proteine în ser, urină, LCR, eritrocite,acizi nucleici

12

Ionoforeză

• Migrarea ionilor mici

• Sistem electrolitic discontinuu- Electrolit (L-ioni)- Electrolit (T-ioni)

• Aplicarea soluţiei la suprafaţa interfazei dintre L şi T

• Aplicarea unui câmp electric fiecare tip de ion se aranjează între ionii L şi Tzone discrete

Separarea anionilor, cationilor, acizi organici si aminici,peptide, nucleotide, nucleozide, proteine

13

3. TEHNICI ELECTROFORETICE

3a. Instrumente şi reactivi

• Cutii tampon cu plăci tampon => conţine soluţiatampon

• Electrozi de carbon sau platină => conectati lasursa de curent electric continuu

• Suport pentru electroforeza => cu fitil pentrucontactul cu soluţia tampon

• Capac => minimalizează evaporarea

14

3b. Surse de alimentare

• Sursă de alimentare: curent continuu între 2 electrozi

• Flux de curent => căldura produsă Creşterea vitezei de migraţie => extindereaprobe separate Formarea de curenti de convectie => amestecarea

probelor Instabilitate termică a probelor sensibile la căldură

• Evaporarea apei => concentrarea ionilor => creştevâscozitatea soluţiei tampon => scade rezistenţa

• Pentru a minimiza problemele: se utilizeză surse dealimentare cu putere constantă si mare

15

3c. Soluţii Tampon

• Pentru a transporta curentul electric aplicat şi astabiliza valoarea pH-ului

determină sarcina electrică si gradul de ionizare electrodul la care să migreze

• Forta ionică a soluţiilor tampon [ion] => norul ionic => mişcarea moleculelor

- Grosimea norului ionic => viteza de migrare =>claritatea zonelor electroforetice

• Soluţii tampon barbital şi acid triboric-EDTA

16

3d. Spoturile de proteine

• Pentru a vizualiza / localiza fracţiunileseparate de proteine

• Coloranţi: intensitatea colorarii depinde de:Tipul proteineiGradul de denaturare a proteinelor prin

agenţii de fixare

17

4. PROCEDURI GENERALE

4a. Separarea

• Plasarea materialului de suport în camera PE

• Indepărtarea excesului de soluţie tampon de pe materialulde suport

• Plasarea suportului în contact cu soluţia tampon în cameraelectrodului

• Aplicarea probei pe suport

• Separarea componentelor prin tensiune constantă saucurent constant pentru o durată de timp

18

• Îndepărtarea suportului, apoi

uscarea sau aplicarea unui fixatortratarea cu un fixator de colorarespălarea colorantului în excesuscarea (agaroză) sau adăugarea unui

agent de spălare

19

4b. Detecţie şi cuantificare

• Rapid ca:-% din fiecare fracţiune prezentă sau- concentraţia absolută

• Prin densitometrie:- Benzile electroforetice se trec printr-un

sistem optic de masurare- Absorbanţa fiecărei fracţiuni afisată pe o

diagramă

20

5. TIPURI DE ELECTROFOREZA

a. Electroforeză în gel de agarozăb. Electroforeză în acetat de

celulozăc. Electroforeză în gel de

poliacrilamidăd. Concecntrare izoelectricăe. Electroforeză bidimensională

21

22

5a. Electroforeză în gel de agaroză (AGE)

• Foloseşte agaroză ca mediu de migrare- Concentraţie scăzută => dimensiunea porilor

mare- Concentraţie mai mare=> dimensiunea porilor

mică

• Proteine serice, variante de Hb, lactat dehidrogenaza, izoenzimele CK, fracţiunile LP

• Agaroza pură=> nu are grupuri ionizabile=> nu are loc endo-osmoza

23

• Avantaje:- Afinitate scăzută pentru proteine- Prezintă fracţiunile clar după uscare- Temperatura de topire scăzută –

re-lichiefiere la 65oC

• Dezavantaje:- Slabă elasticitate- Nu este potrivită pentru un sistem cu bare

24

5b. Electroforeză în acetat de celuloză (CAE)

• anhidridă acetică + celuloză => CA

• Are 80% spaţiu aerian => se umple cu lichid atunci cândeste scufundat în tampon

• Pot fi făcute transparente pentru densitometrie

• Avantaje:- Viteza de separare- Posibilitatea de a stoca membrane transparente

• Dezavantaje:- Presoaking înainte de utilizare- Curăţare pentru efectuarea densitometriei

25

• Metoda:

- CA umedă în tampon PE- Se incarcă proba până la aproximativ o treime din

lungul benzi- CA se întinde în benzi peste un pod- Podul se plasează în camera PE =>benzile se

scufundă direct în zona-tampon- După EP, colorare, decolorare, vizualizarea

proteinelor• Pentru diagnosticul bolilor

Schimbare în profilul de proteine serice

26

5c. Electroforeză în gel de poliacrilamidă (PAGE)

• Celula PE în formă tubularăSe toarnă gel de separare cu pori miciSe adaugă gel cu pori mari în partea de susSoluţie de monomer cu pori marei + proba deasupra celui

de-al doilea gel

• ElectroforezaToţi ionii proteinelor migreaza prin gelurile cu pori mariSe concentrează în gelul de separareSe separă din cauza denaturării unor proteine

• Dimensiunea medie a porilor în 7,7% din gelul desepararea PAGE este de aproximativ 5nm

Permite proteinelor serice să migreze Impiedică migrarea proteinelor mari de exemplu:

fibrinogen, 1-lipoproteine, 2-macroglobuline

27

•Avantaje:

- Termostabil, transparent, puternic, chimicinert- Gama larga de dimensiuni ale porilor- Neacoperite => nu are loc endo-osmoza

• Dezavantaje:

- Cancerigene

28

Denaturarea

• Se fierbe o proba timp de 5 minute în soluţia tampon ceconţin b-mercaptoethanol & SDS

• b-mercaptoethanol: reducere puntile disulfitice (S-S)

• SDS: se leaga puternic de proteinele şi le denaturează

• Proteine denaturate -> se rup structurile în formă detijă =>”ghem” sunt separate în funcţie de dimensiunea lor

• Utilizare:- Pentru a evalua puritatea proteinei- Pentru a determina MW proteinelor

29

• Utilizarea unor condiţii non-denaturare=> nu SDS sau -mercaptoethanol=> proteinele nu denaturează

• Separarea proteinelor se bazează pe:- Mobilităţile electroforetice diferite- Efectul de “sitare” al gelului

• Utilizare- Pentru a obţine proteine native / enzime- Pentru a studia activitatea biologică

30

5d. Concentrarea izoelectrică (isoelectrofocusing)

• Pentru a separa amfoteri (de exemplu: proteine)

• Proteinele se deplaseaza în zona în care:pH-ul mediu = pI => sarcina = 0

• pI este limitat într-un domeniul de pH îngust=>zone ascuţite pentru proteine

• Metoda:- Folosirea gelurilor orizontale pe sticlă / folii de plastic- Să introduc amfoliţii în gel => se crează gradientul de pH

31

- Se aplică o diferenţă de potenţial în gel

- Anod => zona cu pH-ului cel mai mic

- Catod => zona cu pH-ului cel mai mare

- Proteinele migraează până când se ajunge lapH = pI

- Se spală cu soluţie de fixare pentru eliminareaamfoliţilor

- Colorare, decolorare, vizualizare

32

5e. Electroforeza bidimensinală (2D) (ISO-Dalt)

• prima dimensiune utilizând IEF EP într-un mediu cu pori mariamfoliţii formează gradientul de pH

• a doua dimensiune utilizând EP-dependentă de greutateamoleculară

in poliacrilamidă liniar sau gradient

• Metoda: O'Farrell:- Folosirea β-mercaptoethanol (prima D) şi SDS (a doua D)

• Detectează proteine folosind coloranţi Coomassie,radiografie, fluorografie

• Separă 1100 de culori (autoradiografie)

33

PrinciipiilePrinciipiile electroforezeielectroforezei capilarecapilare

Cum separarea diferitilor compusifarmaceutici reprezinta o problema deactualitate, s-au pus la punct diversetehnici de a realiza acest lucru

Una dintre cele mai eficiente tehnici deseparare este electroforeza capilara(CE)

34

ElectroforezaElectroforeza capilaracapilara –– bazelebazeleinstrumentatieiinstrumentatiei

• Electroforeza ce are loc in tuburi capilarece contin un electrolit

• Fiecare tub capilar are un diametruinterior de circa 25-100 μm.

• Cand se aplica o tensiune solutiei,moleculele migreaza catre electrodul desarcina opusa

• In functie de sarcina acestora,moleculele pot migra cu viteze diferite– In final are loc separarea componentilor

35

Se utilizeaza un fotoreceptor pentru a masuraabsorbanta moleculelor in timp ce acestea migreazain solutie

Semnalul analitic este analizat de catreun computer si reprezentat grafic

36

Migrarea diferitelor specii (ionizate sau neionizate) de analiţisub influenţa fluxului electro-osmotic

37

38

InstrumenteInstrumente pentrupentru realizarearealizareaelectroforezeielectroforezei capilarecapilare

39

• O caracteristica importanta a CE estereprezentata de curgerea lichidului prin tuburilecapilare.

• Acest fenomen poarta numele de electro-osmoza

““CurgereaCurgerea”” electroelectro--osmoticaosmotica

40

ProfilulProfilul dede curgerecurgere al electroal electro--osmozeiosmozei• O alta caracteristica importanta a “curgerii” electro-

osmotice este profilul plan de curgere al acesteia,spre deosebire de cel parabolic, realizat de opompa peristaltica

• Profilul acestei curgeri este plan datorita forteiuniform distribuite de-a lungul tubului capilar, cepune in miscare particulele, ceea ce inseamna canu vom avea caderi de presiune, iar viteza decurgere va fi aceeasi pe toata lungimea tubului.

• Profilul plan al EOF(electro-osmosis flow) esteimportant deoarece permite separari foarteeficiente.

41

42

ElectroferogramaElectroferograma• Datele furnizate de CE sunt

prezentate sub forma uneielectroforegrame aceasta fiindsimilara cu cromatograma.

• Electroforegrama reprezinta ungrafic al timpului de migrare infunctie de raspunsuldetectorului.

• Raspunsul detectoruluidepinde de obicei deconcentratie, cum ar fiaborbanta UV-vizibil saufluorescenta.

43

EchipamentEchipament• Tub capilar

• De lungime variabile, ingeneral intre 25-50 cm

• Diametrul mic al tubului sigrosimea silicei joaca un rolimportant

– Folosind tuburi cudiametre mici si peretigrosi se previne aparitiaincalzirii de tip Joule,datorate voltajului.

44

• Detector– Absorbanta UV/Vizibil– Fluorescenta– Radiometric (pentru substante radioactive)– Spectrometru de masa

45

AplicatiiAplicatii

• Analiza carbohidratilor• Analiza anionilor

anorganici• Identificarea de ADN• Identificarea proteinelor

• Avantaje• Metoda rapida• Probe mici• Metoda relativ ieftina• Aparatura automatizata

• Dezavantaje• Nu se pot identifica specii

neutre• Aparitia efectului Joule

46

1. CE se bazeaza pe principiile separarii electroforetice.2. Viteza de migrare a speciilor este determinata de

sarcina acestora dar si de marimea lor.3. Particulele mici cu sarcina ridicata vor migra mai

repede decat cele mari si cu sarcina scazuta.4. Curgerea fluidului este cauzata de EOF.5. Viteaza EOF poate fi ajustata prin modificarea pH-ului

solutiei.6. Profilul de curgere al EOF este plan, ceea ce

reprezinta eficiente ridicate de separare/identificare.7. Datele sunt reprezentate grafice sub forma unei

electroforoegrame.

47

Separarea proteinelorplasmatice

• Electroforeza– Amidon gel, agar gel, acetat celuloza,

PAGE, EC

48

Optimizarea electroforezei

• Separarile electroforeticeoptimizate trebuie sa fie echilibrateintre valorile vitezei si rezolutiei– Voltajul ridicat mareste viteza, dar

temperatura cauzeaza evaporarea sipoate denatura proteinele

– Rezistenta ionica ridicata maresteconductivitatea, dar imbunatatesteefectele endo-osmotice

49

Electroforeza proteineiserice

+ -

Albumin 1 2

50

O proteina in solutie care are un pH inferior punctului sauizoelectric se va comporta ca o baza si va accepta protoni de hidrogen.Proteina va deveni astfel incarcata pozitiv.In mediu acid:

O proteina in solutie care are un PH superior punctului sauizoelectric se va comporta ca un acid si va ceda protoni de hidrogen.Proteina va deveni astfel incarcata negativ.In mediu bazic:

Prin electroforeza serului uman se obtin astfel sase fractiiproteice: albumina, alfa1, alfa 2, beta 1 si 2 si gama globuline.Se realizeaza astfel o migrare reprezentata grafic(electroforegrama).

PRINCIPIUL CHIMIC

51

Albumina

• Este proteina preponderenta dinplasma (aproximativ jumatate dintotalul de proteine)– sintetizata in ficat– t½=15-19 zile

• Functii principale– Mentinerea echilibrului fluidelor– Transportator– Activitate antioxidanta– Tampon

52

Pre-albumina

• Tirotoxina – proteina (o formaincipienta a albuminei), denumita deasemenea si transtiretina sau TBPA– De asemenea complexe cu retinol-

proteina (RBP)• Numai proteina care migreaza

anodal la albumina• Markerul sensibil al starii nutritionale

este de numai 2 zile

53

1-Antitripsina

• Este un inhibitor proteic care leagasi inactiveaza tripsina

• Deficienta este asociata cu:– Emfizem pulmonar– Ciroza

• SPE este numai un test descreening pentru deficienta de AAT.

54

Alte 1 proteine

• 1-acid glicoproteic (orosomucoid)– Functia biologica este necunoscuta

• 1-Fetoproteina (AFP)– Este proteina fetala principala,

utilizata in detectia anomaliilor fetale(defecte ale tubului neural)

55

2-Macroglobulina

• Cea mai mare non-imunoglobulinadin plasma

• Inhibitor proteic• Increased in nephrotic syndrome

(size)• Dimensiune crescut in sindromul

nefrotic• Deficienta genetica este complet

necunoscuta.

56

(2) Ceruloplasmina

• Transportul proteinei cuprice• Participa la reactiile redox in plasma• Nivelurile Cu fluctueaza cu o

varietate de stari fiziologice, darmasurarea se realizeaza pentrudepistarea bolii Wilson– Cu din plasma este scazut datorita

inhibarii (bio)sintezelor.

57

(2) Haptoglobina• Se leaga si se pastreaza numai

hemoglobina nu si mioglobina.– Complexul are de asemenea

activitate peroxidazica si poate fiimplicata in raspunsul inflamatoriu

• Bolile hemolitice pot diminuanivelurile Hp

58

() Transferina

• Transport proteina ferica si deasemenea leaga cuprul

• Transferina este crescuta in anemiedeficitara de fier, in sarcina siterapie cu estrogen

• Este crescuta in inflamatii,malignitate sau boli ale ficatului.

59

2-Microglobulina

• Proteina mica (MW=11.8K)• BMG este filtrata in glomerule, dar

este reabsorbita in tubii renali.• Nivelurile BMG urinara sunt o

masura a sensibilitatii functionariitubilor renal

• Nivel crescut in cedarea renala

60

() Complementulproteinelor

• C3 si C4 migreaza in regiunea .• Complementul proteinelor este

scazut in deficientele genetice sicrescut in inflamatii.

61

-Regiune

• Include imunoglobuline (IgG, IgA,IgM) si proteina C-reactiva

• Singurul pic ascutit indica oparaproteina asociata cu ogammopatie monoclonala (mielomamultipla)

• CRP este cel mai sensibil indicatoral fazei acute de reactie– Inflamatie, trauma, infectie, etc.

62

Reactivii Fazei Acute

• Alti ACP’s includ: 1-acid glicoproteina,haptoglobina si ceruloplasmina

X u

pper

lim

it of

nor

mal

1

5

10

Ziua1 2 3 4 5

C-proteina reactiva

1-Antitripsina C3

63

SPE Normal

Albumin 1 2

64

Model de raspuns imediat

Albumin 1 2

Scaderea in albuminaCresterea in APR haptoglobinei

65

Model de raspuns intarziat

Albumin 1 2

A scazut albuminaA crescut haptoglobinaAu crescut gamma globulinele

66

Hipogammaglobulinemia

Albumin 1 2

Au scazut gamma globulinele

67

Sindromul nefrotic

Albumin 1 2

A scazut albuminaA crescut 2-macroglobulinaAu scazut gamma globulinele

68

Ciroza hepatica

Albumin 1 2

A scazut albumina (sinteza)Au crescut gamma globulinele(Gammopatie policlonala)

“- bridging”

69

Gammopatie monoclonala

Albumin 1 2

A scazut albuminaVarful ascutit in regiunea gamma

70

Enteropatia pierderii deproteina

Albumin 1 2

A scazut albuminaAu scazut gamma globulineleA crescut 2-macroglobulina