BIOCHIMIE MEDICALĂ ŞI

FARMACEUTICĂ

APLICAŢII PRACTICE

PARTEA I

2

3

CUPRINS

I. Organizarea şi protecţia muncii în laboratorul de biochimie.……….…........5 II.Noţiuni de analiză chimică……………………………....................................14

II.1.Noţiunea de atom-gram, moleculă-gram, echivalent-gram……….......14 II.2. Soluţii. Modul de exprimare a concentraţiilor……………………….15 II.3. Unităţi şi moduri de exprimare în laboratorul clinic………………....17

III.Sticlăria şi aparatura de laborator……………….…………........................18 IV.Metode analitice folosite în biochimia medicală şi farmaceutică….............21

IV.1. Metode volumetrice de analiză…………….……..............................21 IV.1.1. Volumetria acido-bazică......................................................21

IV.1.2. Determinări volumetrice prin reacţii de precipitare.............36 IV.1.3. Determinări volumetrice prin reacţii de oxido-reducere......37 IV.1.4. Volumetria prin reacţii de complexare................................40 IV.2. Metode optice de analiză....................................................................41 IV.2.1. Metode spectroscopice de analiză.......................................41 IV.2.2. Metode flamfotometrice de analiză.....................................43

IV.3. Metode electrometrice……………….…………………...................45 Măsurarea pH-ului........................................................…….……..47 pH-ul izoelectric al aminoacizilor..................……………………..48

Determinarea punctului izoelectric al proteinelor............................50 IV. 4. Metode imunologice de analiză.........................................................52 Determinarea complexelor imune circulante...................................52 IV.5. Metode de separare.............................................................................54 IV.5.1. Centrifugarea.......................................................................54 IV.5.2. Ultracentrifugarea................................................................54 Viteza de sedimentarea a eritrocitelor IV.5.3. Cromatografia......................................................................56 Separarea aminoacizilor din urină prin cromatografie pe strat subţire IV.5.4. Electroforeza........................................................................57 Electroforeza în gel de agaroză Electroforeza în gel de poliacrilamidă IV.6. Teste rapide de investigare.................................................................69 V. Analiza biochimică a vitaminelor....................................................................71 V.1. Reacţii pentru carotinoide şi vitamina A..............................................71 V.2. Reacţii pentru provitaminele şi vitaminele D......................................73 V.3. Dozarea vitaminei PP...........................................................................74 V.4. Reacţii pentru identificarea şi dozarea vitaminei C.............................75 V.5. Reacţii de identificare şi dozare a vitaminei B1...................................77

4

VI. Analiza biochimică a proteinelor…….………...……………………...........79 VI.1. Reacţii de identificare a aminoacizilor………………………….......79 VI.2. Dozarea aminoacizilor prin metoda Sorensen……………………....85 VI.3. Reacţii de identificare a proteinelor ………………………………...87

VII. Analiza biochimică a glucidelor…….………...……………………............94 VII.1. Reacţii generale pentru glucide…………………………………….95 VII.2. Reacţii de diferenţiere a aldozelor şi cetozelor…………………......96 VII.3. Reacţii de diferenţiere a pentozelor de hexoze……………………..96 VII.4. Reacţii de condensare a monozaharidelor cu fenilhidrazina……….99 VII.5. Acţiunea alcaliilor asupra ozelor.............………………………....100 VII.6. Reacţii de reducere...........................................................…….…..101 VII.7. Dozarea glucidelor reducătoare – Metoda Ionescu-Matiu………..106

VIII. Analiza biochimică a enzimelor…….………...……………………........108

VIII.1. Modalităţi de exprimare şi de determinare a activităţii enzimatice...................................................................109 VIII.2. Efectul temperaturii şi a pH-ului asupra activităţii enzimatice......110

Determinarea experimentală a activităţii fosfatazei alcaline şi acide............................................................113 VIII.3. Dependenţa activităţii enzimatice de concentraţia de substrat.......117 Determinarea activităţii enzimatice a colinesterazei serice nespecifice....................................................120 Determinarea activităţii transaminazelor.......................................123 Determinarea activităţii γ-glutamiltranspeptidazei serice..............126 IX. Analiza biochimică a lipidelor………….……………..................................128

IX.1. Clasificarea lipidelor............………………………….……………128 IX.2. Reacţii de identificare a acizilor graşi……………………………...129 IX.3. Lipoproteine...................…………………………….…………..…130 IX.4. Tulburări ale metabolismului lipidic........…………….…………....134

X. Analiza acizilor nucleici………………………………………………..……141

X.1. Analiza ADN –ului celular……………………………………...….141 X.2. Izolarea acizilor nucleici…................................................................142

X.2.1. Izolarea ADN din materiale biologice…...……………….144 X.2.2. Izolarea ARN………………………………………….….150

X.3. Dozarea concentraţiei de ADN…………...………………………...150 X.4. Metoda Spirin……………………………………………………….151

Bibliografie……………………………………….………….………………….157

5

I. ORGANIZAREA ŞI PROTECŢIA MUNCII ÎN LABORATORUL DE BIOCHIMIE

Pentru ca activitatea practică să se dezvolte în condiţii optime şi de siguranţă trebuie respectate anumite reguli de ordine interioară. Activitatea care se desfăşoară în laborator prin specificul ei, pretinde o anumită disciplină, o atitudine plină de răspundere în mânuirea reactivilor şi a diferitelor materiale.

Este cunoscut faptul că în laborator, dezordinea, neatenţia, superficialitatea şi cunoaşterea insuficientă a proprietăţilor substanţelor cu care se lucrează, precum şi a aparatelor, pot atrage după sine diferite accidente. Substanţele şi reactivii folosiţi fiind în majoritatea lor toxici, au acţiune vătămătoare asupra organismului. Din această cauză, substanţele nu se vor gusta niciodată, iar vaporii sau gazele care se degajă în cursul reacţiilor se vor mirosi cu atenţie. Anumite operaţiuni asupra cărora se va atrage atenţia, vor fi făcute cu grijă, asigurându-ne de buna ei funcţionare. Lichidele inflamabile nu se vor încălzi la foc direct, ci numai pe baia de apă şi în aparate specifice acestei operaţii. Pentru reacţiile care necesită solvenţi inflamabili, vom lua măsuri ca în laborator să nu existe nici o sursă de flacără.

Dacă, din nebăgare de seamă vreun reactiv ajunge pe haine sau pe corp, se va proceda întâi la spălarea cu multă apă a locurilor atinse şi apoi se vor aplica substanţe care neutralizează acţiunea acestora. Pentru acizi vom folosi substanţe slab alcaline ca: NaHCO3 sau NH4OH diluat, iar pentru baze, acizii slabi ca: acidul boric sau acidul acetic diluat.

Eprubeta ca mijloc curent de efectuare a reacţiilor, nu se va umple mai mult de 1/3 din volumul său, iar încălzirea ei se va face cu atenţie, treptat, dinspre partea superioară a conţinutului său către cea inferioară, evitându-se astfel izbucnirea lichidului din stratul inferior prin supraîncalzire. Incălzirea se va face asigurându-se o agitare permanentă pentru o omogenizare a lichidului din eprubetă. Eprubeta nu se va îndrepta spre colegi sau spre cel ce lucrează.

La diluarea H2SO4 conc. se va ţine cont de marea lui aviditate faţă de apă. Se va adăuga acid sulfuric în portiuni mici, sub agitare continuă peste apă şi nu invers! Dacă încălzirea vasului este prea puternică ca urmare a reacţiei exoterme care are loc, se va răci vasul la exterior sub un curent de apă rece.

Fosforul alb se păstrează sub apă, metalele alcaline sub petrol, manipularea lor făcându-se cu toată atenţia. Urme din aceste substanţe lăsate din neglijenţa în contact cu aerul pot produce incendii.

Fiecare substanţă şi reactiv vor fi etichetate, iar pentru reactivii în soluţie se va preciza concentraţia lor.

La plecarea din laborator se vor controla atât becurile de gaz, cât şi robinetele de apă dacă sunt închise, iar aparatele electrice se vor scoate din priză.

În cazul în care se aprinde o substanţă, se va folosi la stingerea ei apă, numai în cazul în care aceasta este miscibilă cu apa. În celelalte cazuri se va folosi nisip, stingătorul de incendii sau se va înăbuşi flacăra prin acoperire cu o pătură.

6

Disciplina, cunoaşterea fiecarei operaţiuni de laborator care urmează a fi executată de către studenţi, sub toate aspectele ei, ne feresc de accidente. Măsuri privind manipularea şi utilizarea substanţelor chimice în laborator

La primirea şi folosirea substanţelor pentru experienţe vor fi citite cu atenţie etichetele pentru a nu se utiliza alte substanţe.

Reactivii trebuie păstraţi în recipientele şi ambalajele originale, deoarece acestea asigură condiţiile optime pentru fiecare reactiv

Manipularea acizilor concentraţi, amoniacului, bromului se va face cu precauţie

Substanţele care emit vapori sau gaze toxice se păstrează în locuri care permit evacuarea lor rapidă

Lichidele care au tendinţa să formeze peroxizi organici se păstrează departe de surse de lumină

Măsuri de igienă personală

Se interzice fumatul, consumul de alimente sau lichide Purtarea mănuşilor este obligatorie Mâinile se spală după fiecare manipulare care ar putea implica

contaminarea cu sânge, ser, plasmă sau alte produse provenite de la bolnavi, manevră urmată de dezinfecţia cu alcool peste 70%

Mâinile nu se vor şterge niciodată de halat sau îmbrăcăminte Măsuri privind manoperele uzuale

Se interzice pipetarea cu gura Pipetele vor fi manipulate cu baloane de cauciuc sau alte dispozitive

de expiraţie După folosire ustensilele de laborator nu vor fi puse pe masa de

lucru, ci în vasul cu soluţie dezinfectantă ( cloramină, amestec sulfo-cromic etc.), vas care trebuie să fie acoperit complet

Măsuri de prim ajutor

În caz de inhalare a unor vapori sau gaze toxice, pacientul trebuie scos din mediul toxic la aer curat

În caz de contact cu substanţe toxice la nivelul ochilor se practică spălarea ochilor cu apă din abundenţă, ţinând ochii larg deschişi şi mişcându-i în toate direcţiile

Orice haină contaminată cu substanţe chimice va fi îndepărtată În caz de contaminare la nivelul pielii se va practica spălarea cu apă

rece din abundenţă, evitându-se folosirea substanţelor acide sau bazice care prin reacţii exoterme pot agrava leziunile produse

În caz de ingestie a substanţelor toxice se evită administrarea oricărei substanţe

7

Important: toate persoanele care au suferit accidente trebuie transportate la spital

Factorii care influenţează rezultatele analizelor

Un examen de laborator efectuat în timpul vieţii unui individ poate da valori diferite în funcţie de starea de sănătate sau de boală a organismului.

Cu câţiva ani în urmă, problema variaţiilor fiziologice era cel mai adesea ignorată când se interpreta un examen de laborator.

Astăzi sunt studiate cu atenţie toate cauzele de fluctuaţie a rezultatelor şi se cercetează influenţa factorilor de variaţie, legaţi fie de metodă, de condiţiile de prelevare sau de diferenţele intra- şi inter-individuale.

Examenul biologic ce urmăreşte variaţiile fiziologice demonstrează faptul că acestea sunt de amplitudine mai mică decât variaţiile patologice. Ele sunt deci mai greu de evaluat şi necesită metode de analiză mai fine. Este deci necesară precizarea riguroasă a limitelor în care se încadrează populaţia sănătoasă şi stabilirea de intervale de referinţă. În aceste condiţii cunoaşterea variaţiilor biologice şi a factorilor care afectează concentraţia diverşilor componenţi ai organismului uman este indispensabilă.

Trebuie subliniat faptul că conceptul de valori de referinţă nu poate fi aplicat decât subiecţilor sănătoşi şi deci este necesar să cunoaştem biologia omului sănătos.

Pentru o interpretare mai bună a analizelor de laborator trebuie să ţinem seama de factorii care pot influenţa rezultatele analizelor.

Din punct de vedere didactic putem distinge două surse de variaţii: • variaţii analitice • variaţii biologice

Variaţii analitice

Lucrările recente ale lui Statland şi Winkel au pus în evidenţă cele două componente principale ale variabilei analitice:

- eroarea pre-instrumentală - eroarea instrumentală

Variabila analitică pre-istrumentală depinde de toate sursele de variaţii

cauzate de la recoltarea probei până la determinare, cum sunt: • pregătirea bolnavului • recoltarea probelor la care trebuie să se ţină cont de ora recoltării, de

felul sângelui (venos, arterial, capilar), de aplicarea garoului sau nu, de poziţia bolnavului, de anticoagulantul utilizat.

8

• pregătirea probei pentru analiză: în acest caz trebuie să se ţină cont de timpul de la prelevarea probei până la centrifugare şi de utilizarea sau nu a conservanţilor.

Variabila analitică instrumentală este eroarea analitică datorată metodelor de dozare. Ea poate fi separată în variaţii analitice pe termen scurt (apreciată prin repetabilitatea sau reproductibilitatea pe o zi) şi pe termen lung (apreciată prin reproductibilitatea de la o zi la alta). Variaţiile analitice de la o zi la alta sunt în general mai importante decât cele pe o zi. Când se efectuează studii pe termen lung este de preferat ca eşantioanele să se congeleze şi să fie analizate simultan în aceeaşi serie şi în aceeaşi zi.

Variaţiile analitice trebuiesc menţinute constante şi la un nivel scăzut pentru a mări certitudinea în momentul evaluării unui rezultat individual în intervalul de referinţă.

Variabila biologică intra-individuală. Această noţiune se referă la

variabilitatea datorată de-a lungul timpului individului însuşi. Ea include deci toate fenomenele de reglare, în particular toate ritmurile biologice şi în primul rând procesul de îmbătrânire. Dar acesta este dificil de izolat complet de ceilalţi factori de variaţie.

Pe plan experimental, variaţiile intra-individuale pot fi abordate prin măsurarea succesivă, în cursul timpului, a unui parametru la acelaşi individ. Alegerea intervalului de timp este foarte variabilă, în funcţie de obiectivele urmărite. Această variabilă este greu de urmărit deoarece este dificil să constrângi numeroşi subiecţi să participe la un asemenea program. Aceste studii se efectuează de obicei pe populaţii restrânse de voluntari, care trăiesc în instituţii sociale, medicale etc.

Variabila biologică inter-individuală. Această variabilă reprezintă

ansamblul variaţiilor unei populaţii. Dar o populaţie este foarte heterogenă. Dacă ţinem cont de acest lucru şi de faptul că noţiunea de omogenitate nu poate fi definită la modul absolut, ea fiind relativă, este evident că acest număr de factori pe care va fi necesar să-i controlăm este indefinit şi este practic imposibil să fie studiaţi în totalitate.

Diferitele surse de variabilitate biologică Clasificarea factorilor de variaţie biologică se efectuează cu greutate. S-a

propus clasificarea lor în variaţii intra- şi inter-individuale, în variaţii genetice şi dobândite, în variaţii datorate mediului, în variaţii datorate factorilor exogeni şi endogeni.

Dacă ţinem cont de diferenţele de concentraţie plasmatică a unor constituenţi, putem distinge două grupe de factori fiziologici:

• factori de masă: importanţa masei musculare, adipoase, hepatice, care este determinantă de exemplu pentru nivelul anumitor enzime care provin din aceste ţesuturi

9

• factori metabolici: acţionează pe substratele care suferă variaţii rapide şi sunt supuse reglării hormonale şi nervoase.

Ţinând cont de faptul că procesul de reglare intervine foarte net asupra variaţiilor fiziologice, putem distinge 3 categorii de constituenţi:

- constituenţi foarte bine reglaţi (electroliţii, albuminele), cei care nu variază decât foarte puţin

- constituenţi cu variaţii importante (de exemplu produşii finali ai catabolismului, ca ureea, uraţii sau enzimele eliberate din ţesuturi)

- constituenţi implicaţi parţial în mecanisme de sinteză (glucoza, colesterolul) care suferă variaţii medii

Deci este important să se cunoască şi mecanismele biochimice şi fiziologice care stau la baza variaţiilor biologice, ca de exemplu mecanismul de ieşire al enzimelor, timpul de înjumătăţire al diverselor substanţe, etc.

Deoarece aceşti factori sunt greu de clasificat, în continuare vom descrie factorii mai importanţi care pot influenţa rezultatele analizelor. Vârsta

Variaţiile în funcţie de vârstă sunt bine cunoscute. În primul rând trebuie să menţionăm concentraţiile hormonilor care suferă variaţii datorită creşterii, de la nou născut la copil şi la adult.

Se cunoaşte de asemenea variaţia colesterolului şi a ureei. În ultimul timp s-a constatat că şi activitatea fosfatazei alcaline variază în funcţie de vârstă. Sexul

Numeroşi constituenţi plasmatici au concentraţii diferite în funcţie de sex, enumerăm doar câţiva: hemoglobina, hematocritul, fierul, cuprul, trigliceridele, etc.

La femei amilaza, transferina au concentraţii mai crescute, pe când la bărbat activitatea fosfatazelor alcaline, a CPK, a transaminazelor, a ureei şi a uratului sunt mai crescute. Rasa

Acest capitol a suscitat mult interes, dar este din ce în ce mai greu de cercetat datorită amestecului populaţiilor. S-a constatat că la rasa neagră concentraţia plasmatică în trigliceride, potasiu şi sodiu este mai crescută decât la albi, iar concentraţia în acid uric este mult mai crescută la anumite populaţii din Oceania. Stări fiziologice deosebite: sarcină, menopauză, menstruaţie.

S-a constatat în primul rând o modificare a concentraţiei hormonale, care atrage după sine şi alte modificări. Astfel, în menopauză scade mai întâi progesteronul, apoi estrogenii şi mai târziu 17-cetosteroizii. Tot în menopauză creşte net activitatea fosfatazei alcaline, concentraţia plasmatică a calciului, colesterolului, a acidului uric.

10

În timpul menstruaţiei, pe lângă hormonii implicaţi în ciclu, apar numeroase variaţii ale aldosteronului, a acizilor aminaţi, a CPK, colesterolului şi a magneziului.

În timpul sarcinii printre variaţiile importante cauzate de această stare, pe lângă variaţiile hormonale, putem aminti scăderea albuminelor plasmatice, a calciului care este legat de acestea, a imunoglobulinelor, glucoza, acidul uric, hemoglobina şi eritrocitele,a vitaminei C. Se observă o creştere a proteinelor care transportă hormonii, a activităţii fosfatazei alcaline care creşte de două ori prin aportul fosfatazei alcaline placentare.

De asemenea creşte α-fetoproteina, α-1-antitripsina, amilaza, P-glucuronidaza, ceruloplasmina (şi cuprul), leucin-aminopeptidaza. Mai cresc: colesterolul, trigliceridele, fosfaţii şi volemia.

În sarcina gemelară α-fetoproteina este de două ori mai crescută decât în sarcina simplă. Alimentaţia

Alimentaţia poate interfera dozarea colorimetrică a anumitor constituenţi datorită conţinutului lor în diverse principii, cum sunt: pigmenţii, carotenii, antocianii.

Anumite alimente conţin serotonină, 5-hidroxi-indolacetat sau cathecolamine care pot perturba dozarea, prin metode nespecifice, a substanţelor reducătoare.

Există alimente care au efect asupra unor constituenţi biologici prin conţinutul lor crescut în anumite substanţe, cum sunt de exemplu: spanacul, măcrişul care conţin cantităţi crescute de acid oxalic şi care interferă în dozarea calciului; un exces alimentar de sfeclă provoacă hiperaldosteronism şi hipokalemie.

Cafeaua şi cofeina cresc glucoza plasmatică şi acizii graşi neesterificaţi şi scad timpul Quick.

Dar cele mai importante efecte le are un regim alimentar neechilibrat, un regim vegetarian sau hipercarnat care modifică pH-ul, inaniţia care duce la apariţia de corpi cetonici, etc. În postul alimentar prelungit, în afara creşterii corpilor cetonici plasmatici, creşte secreţia de aldosteron, a trigliceridelor, glicerolului, ureei, a acidului uric.

Ingestia de alimente provoacă variaţii dificil de controlat. Astfel la două ore după o masă completă (700 cal), la subiecţii sănătoşi se observă o creştere cu 15% a concentraţiei plasmatice a glucozei, cu 15% a fosfaţilor, cu 2% a albuminelor şi proteinelor, cu 20% a AST-ului şi 6% a ALT-ului. Colesterolul, ureea, acidul uric, sodiul, fosfataza alcalină şi LDH-ul nu suferă variaţii. Dar unele diferenţe nu se observă decât la anumite grupe de vârstă, cum este cazul trigliceridelor care după masă sunt mai crescute la persoane peste 40 de ani.

11

Efortul fizic Creşte concentraţia albuminei şi a altor enzime plasmatice. Dacă efortul este

intens pot creşte enzimele de origine celulară: LDH, aldolaza, creatinkinaza, AST, ALT şi chiar ornitin-carbamil-transferaza. Într-un efort de intensitate mică creşte uşor fosfatul şi proteinele plasmatice. Stressul

Stressul este un factor important de care trebuie să se ţină cont mai ales în momentul recoltării probelor, deoarece acesta duce la creşterea concentraţiei plasmatice a trigliceridelor, colesterolului, acidului uric, glucozei, hormonului de creştere, noradrenalinei, hormonilor tiroidieni, a acizilor neesterificaţi. Altitudinea

Albumina plasmatică scade după 6 săptămâni la o altitudine de 5400 m, la fel şi aldostenuria, efect mai pronunţat mai ales la vârstnici.

Hemoglobina, hematocritul, acidul uric, noradrenalina plasmatică cresc. De asemenea se produce o alcaloză respiratorie de efort datorată hiperventilaţiei. Absenţa gravitaţiei

Provoacă creşterea catecolaminelor, nespecific, legat de stressul pe care îl reprezintă lipsa gravitaţiei. Se modifică metabolismul fosfo-calcic, apărând osteoporoza, căreia i-au fost victime cosmonauţii americani. Ortostatismul

Proteinele serice, albuminele şi substanţele legate de proteine (colesterolul, calciul) cresc după 15 minute de stat în picioare, datorită uşoarei hipovolemii indusă de ortostatism. Aldosteronul plasmatic creşte de 5-10 ori în ortostatism faţă de poziţia culcat, la fel şi hematocritul care creşte cu 10%. În urină noradrenalina creşte de 3 ori. Ritmurile circadiene

S-a constatat faptul că activitatea plasmatică a fosfatazei alcaline scade de la 25% până la 50% dimineaţa. Concentraţia plasmatică a aldosteronului creşte de la 6 dimineaţa până la 3 după amiaza, secreţia sa fiind mai scăzută noaptea. Probabil acest efect este datorat poziţiei ortostatice. Dar pentru aldosteronemie există un ritm circadian deoarece pentru o postură neschimbată secreţia maximă se observă la ora 8 şi minima la ora 18.

Excreţia noradrenalinei este mai crescută ziua decât noaptea. Concentraţia plasmatică a fierului are un ritm circadian cu maxim după

amiaza şi minim la 4 dimineaţa. Mediul

Pesticidele, insecticidele, oxidul de carbon, vaporii de benzină, solvenţii organici, lacurile pentru păr, etc. pot da unele modificări ale examenelor de

12

laborator cel mai adesea din cauza modificărilor toxice (citopenie, anemie hemolitică, nefrotoxicitate, afecţiuni hepatice). Astfel transaminazele, colinesteraza, bilirubina sunt crescute, iar timpul Quick şi elementele figurate sunt scăzute. Frigul

La temperaturi scăzute cresc în plasmă catecholaminele, hormonii tiroidieni, hormonul de creştere şi leucocitele. Acizii aminaţi ca tirozina şi triptofanul plasmatic scad, pe când activitatea enzimatică a creatinkinazei creşte. Febra

La persoanele cu febră mare s-a observat o scădere a glucozei plasmatice şi o creştere a ureei, a uraţilor urinari şi a metabolismului bazal. Greutatea corporală

S-a constatat faptul că hemoglobina, acidul uric plasmatic, creatinina plasmatică, ALT-ul şi y-glutamil-transferaza cresc cu masa corporală. Tutunul

Pot exista diferenţe între examenele de laborator la fumători şi nefumători. Astfel, pe lângă oxihemoglobina care este crescută la fumători, mai creşte acidul ascorbic în plasmă, colesterolul, trigliceridele, glucoza plasmatică, ionul tiocian în salivă. Recent s-a demonstrat valoarea net crescută a concentraţiei de antigen carcino-embrionar la fumători faţă de nefumători (de la 3% la 19%). Medicamentele

Medicamentele pot influenţa, de asemenea examenele de laborator ele ocupând un loc important în acest domeniu. Variaţiile pe care le pot da medicamentele pot conduce la interpretarea greşită a examenelor de laborator şi la un diagnostic eronat.

Medicamentele pot influenţa analizele de laborator sub două aspecte: - un aspect pur analitic: medicamentele şi / sau metaboliţii acestora

pot perturba sau interfera dozarea unor constituenţi biologici. - un aspect biologic: ele pot provoca modificarea unui parametru biologic printr-un mecanism fiziologic, farmacologic sau toxicologic.

În analizele de laborator trebuie să se ţină cont de interferenţele analitice induse de către medicamente, ele reprezentând aproximativ 20% din totalul interferenţelor.

Astfel, ele pot da coloraţii similare cu unii constituenţi biologici, ca de exemplu salicilaţii care dau cu reactivul Folin aceeaşi coloraţie cu aceea a acidului uric.

Unele medicamente şi / sau metaboliţii acestora prezintă proprietăţi reducătoare, ca de exemplu acidul ascorbic care interferă asupra a numeroase

13

dozări a constituenţilor biologici care prezintă aceleaşi proprietăţi (glucoza, acidul uric, creatinina).

Medicamentele pot acţiona asupra enzimelor şi proteinelor inhibând activităţile şi proprietăţile caracteristice ale acestora.

Medicamentele pot forma diferite complexe cu compuşii biologici, pot prezenta fluorescenţe proprii şi pot modifica pH-ul.

Datorită acestor interferenţe analitice ale medicamentelor trebuiesc introduse metode care să ţină cont de aceşti factori.

Interferenţele biologice sunt dificil de pus în evidenţă. Totuşi înaintea introducerii unui medicament în terapeutică se fac cercetări pe animal pentru a urmări influenţa acestuia asupra constantelor biochimice, asupra funcţiei hepatice, renale, ctc.

În acest sens trebuiesc efectuate în mod obligatoriu examenele hematologice, în particular observarea elementelor figurate, determinări enzimatice, analiza urinei, clearence-ul creatininei, etc.

Dar este practic imposibil să se atribuie o variaţie a rezultatelor examenelor de laborator pentru un medicament fără să se ţină cont şi de variaţiile date de vârstă, sex, greutate corporală, etc.

Menţionăm doar câteva interferenţe biologice care pot să apară datorită medicamentelor:

- fenomenele competitive de fixare a acestora pe proteine: de exemplu fenilbutazona deplasează anticoagulantele fixate pe proteine, potenţează acţiunea lor şi diminuă timpul de protrombină (timpul Quick).

- inhibarea sintezei unor substanţe în organism: antihipertensivele diminuează sinteza catecholaminelor

- o acţiune asupra mecanismului de secreţie: pot provoca contracţia sfincterului Oddi, modifică structurile membranare ducând la eliberarea de enzime, etc.

În concluzie este necesar să se cunoască factorii de variaţie biologică a medicamentelor pentru o mai bună interpretare a examenelor de laborator.

14

II. NOŢIUNI DE ANALIZĂ CHIMICĂ

Analiza chimică constă în efectuarea unor reacţii chimice în baza cărora urmărim să precizăm natura sau cantitatea unei substanţe. Când scopul este de a determina numai natura compuşilor necunoscuţi avem de-a face cu o analiză calitativă, iar când ne interesează să precizăm şi cantitatea acestora, determinările efectuate aparţin de domeniul analizei cantitative.

Analiza calitativă prezintă importanţă în scopul evidenţirii unor compuşi care apar patologic în urină, suc gastric şi alte lichide sau materiale biologice. Din acest punct de vedere se cunoaşte valoarea pe care o are depistarea glucidelor din urină.

Analiza cantitativă se poate efectua atât la componenţii care se găsesc normal ca şi constituienţi ai unui lichid biologic (ex. Aciditatea sucului gastric), dar care datorită anumitor condiţii poate să apară crescut sau scăzut faţă de normal, ceea ce vine în sprijinul precizării diagnosticului clinic cât şi la stabilirea limitelor cantitative ale unor compuşi patologici.

II.1. Noţiunea de atom-gram, moleculă-gram, echivalent-gram Atomul-gram reprezintă cantitatea în grame dintr-un element, egală numeric cu masa atomică a elementului. De exemplu:

Cl, MA = 35,45, atom-gram =35,45 Na, MA = 23, atom-gram = 23

Echivalentul-gram reprezintă cantitatea dintr-un element, exprimată în grame, care se combină cu un atom-gram de hidrogen sau cu jumătate dintr-un atom-gram de oxigen sau care poate înlocui aceste cantităţi de hidrogen sau oxigen din combinaţiile lor. Molecula-gram (mol) reprezintă cantitatea în grame dintr-o substanţă egală cu valoarea numerică a masei moleculare a substanţei respective. De exemplu:

Molecula Masa moleculară Molecula-gram Cl2 70,914 70,914 HCl 36,465 36,465 NaOH 40,010 40,010

Este foarte important ca în calculul echivalentului să ţinem seama neapărat de reacţia chimică ce are loc, în caz contrar calcularea greşită a echivalentului-gram poate duce la erori foarte mari ale rezultatului analizei. Cantităţile de substanţă care reacţionează sau se înlocuiesc într-un proces chimic sunt echivalente între ele. Echivalentul-gram la acizi se calculează împărţind molecula-gram la numărul atomilor de hidrogen ai acidului, care participă la reacţia respectivă.

15

Exemplu: Eg HCl = 36,465/1 = 36,465 Eg H2SO4 = 98,08/ 2 = 49,04 Eg H3PO4 = 98,04/3 = 32,68

Echivalentul-gram la baze se calculează împărţind molecula-gram la numărul de grupări hidroxil care iau parte la reacţia respectivă. Exemplu:

EgNaOH = 40,005/1 = 40,005 EgCa(OH)2 = 74,1/2 = 37,05

Echivalentul gram la săruri se calculează împărţind molecula-gram la cifra care arată numărul de hidrogeni înlocuiţi de metal sau cifra obţinută prin înmulţirea valenţei maxime a ionului metalic prin numărul acestor ioni. Exemplu:

EgFeSO4.7H2O = 273,01 / 2 = 136,505 EgFe2(SO4)3 = 399,9 / 6 =66,66

Echivalentul-gram în reacţiile de oxido-reducere reprezintă cantitatea de substanţă care reacţionează cu un echivalent-gram în reacţia respectivă. Exemplu:

MnO4- în care Mn este heptavalent reacţionează diferit în funcţie de mediul

în care are loc reacţia. Astfel în mediu puternic acid (acid sulfuric) Mn+7 primeşte 5e- trecând în Mn+2 conform reacţiei:

MnO4-+ 5

e- + 8H+ Mn+2 + 4H2O

EgKMnO4 = 158,03 / 5 = 31,606 În mediu slab acid sau neutru are loc reacţia:

MnO4-+ 3

e- + 4H+ MnO2 +2H2O

EgKMnO4 = 158,03 / 3 = 52,67 În mediu puternic alcalin, permanganatul reacţionează cu un singur electron conform reacţiei:

MnO4-+ e

- MnO4

-2

EgKMnO4 = 158,03 / 1 = 158,03

II.2. Soluţii. Modul de exprimare a concentraţiilor O soluţie este un amestec omogen de două sau mai multe substanţe, una

care predomină numită dizolvant, iar cealaltă sau celelalte care se dispersează

16

omogen şi se numeşte dizolvat. Orice soluţie care urmează să fie folosită ca reactiv se prepară la balon cotat.

Exprimarea cantităţii de substanţă dizolvată într-o soluţie la un anumit volum, poartă numele de concentraţia soluţiei, care se poate exprima în diferite moduri, şi anume:

a. Concentraţia procentuală reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în grame fie la 100g soluţie, fie la 100 ml soluţie.

Exemplu: Soluţia 2% NaCl conţine: 2g NaCl şi 98g H2 O b. Concentraţia molară exprimă numărul de molecule-gram dizolvate la

1000 ml de soluţie. Exemplu: Soluţia 0,15m NaCl conţine: - 0,15 moli NaCl la 1000 ml soluţie

- 8,75 g substanţă la 1000 ml soluţie Trecerea de la concentraţia procentuală la cea molară se face multiplicând prima cu 10 şi împărţind greutatea moleculară a dizolvatului. c. Concentraţia normală exprimă numărul de echivalenţi-gram dintr-o

substanţă aflaţi în 1000ml soluţie. Trecerea de la un tip de concentraţie la alta se poate face în felul următor:

Cmoli/l = C% x 10 / Eg C% = Cnormală x Eg / 10 C% = Cnormală x molecula-gram / 10

d. Noţiunea de titru şi factor

Titrul unei soluţii reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în grame, care se găseşte dizolvată într-un ml de soluţie. Soluţia al cărui titru se cunoaşte se numeşte soluţie titrată.

Exemplu: Titrul unei soluţii soluţii exact normale de NaOH este 0,040005g NaOH.

T = 40,0005 / 1000 = 0,040005g NaOH Titrul se mai poate deduce din concentraţia molară sau normală conform relaţiei:

T = M x molecula-gram / 1000 T = N x Eg / 1000

Factorul (F) unei soluţii reprezintă raportul dintre titrul real şi titrul teoretic.

Exemplu: factorul soluţiei de NaOH cu T = 0,0380 este 0,95 deoarece:

F = 0,0380 /0,0400 = 0,95

17

Importanţa factorului constă în simplificarea operaţiunilor de calcul în titrimetrie, prin corectarea valorilor aproximative normale sau decinormale la exact normale sau decinormale. Exemplu: Pentru titrarea unei soluţii de HCL s-au consumat 7,2 ml de NaOH 0,1N având F = 1,05. Acesta este echivalent cu a folosi 7,2 x 1,05, adică 7,56 ml NAOH exact 0,1N (adică având F = 1,00).

Factorul poate avea valori supraunitare sau subunitare, dar cu cât soluţiile sunt preparate mai corect cu atât valoarea lui tinde spre 1, deci titrul real se apropie ca valoare numerică de titrul teoretic.

II.3. Unităţi şi moduri de exprimare în laboratorul clinic

Valorile diferitelor analize se raportează mai ales sub formă de mg/dl pentru sânge, lichid cefalorahidian sau de mg (g) în 24 de ore pentru eliminarea urinară. În ultimul timp se tinde însă spre un mod de exprimare uniform : mmol/l respectiv mmol eliminaţi în 24 de ore.

De un interes deosebit în clinică sunt valorile concentraţiilor principalilor ioni: Na+, K+, Ca+2, Mg+2, Cl-, HCO3

- . Exprimarea acestora se face face cel mai adesea în mEg/l. O valoare utilă este şi modul de exprimare osmoli, respectiv mosmoli. Prin osmol se înţelege presiunea osmotică generată de o soluţie 1M a unei substanţe neionizate la 00C la interfaţa unei membrane impermeabile pentru substanţa dizolvată. În cazul ionizării se va face suma totalităţii ionilor exprimaţi în moli.

Pentru enzime şi uneori pentru vitamine se utilizează nomenclatura de unitate internaţională (U.I. sau U).

Exprimarea rezultatelor obţinute în urma diferitelor măsurători se face în funcţie de gradul de sensibilitate şi precizie al instrumentelor de măsură utilizate. Un rezultat nu poate conţine mai multe cifre decât permite gradul de sensibilitate şi precizie a aparatului utilizat.

18

III. STICLĂRIA ŞI APARATURA DE LABORATOR

Cilindrii gradaţi sunt cilindri de sticlă sau plastic cu talpă sau fără talpă, având gradaţii corespunzătoare volumelor de măsurat, în general subdiviziuni ale volumului maxim ce poate fi măsurat cu cilindrul respectiv. Capacitatea cilindrilor variază de la 5 ml la câţiva litri. Ei sunt utilizaţi în general pentru transferul de lichide.

Biuretele sunt de două categorii: manuale şi automate. Biuretele automate

sunt tuburi de sticlă gradate, care au la partea inferioară un dispozitiv pentru reglarea scurgerii. Tuburile sunt calibrate pentru diferite volume: 10, 20, 50, 100 ml. Pentru analize microvolumetrice se utilizează microbiurete de 1-5 ml. Biuretele se fixează în poziţie verticală, pe stative de metal, cu ajutorul unor cleme.

Baloanele cotate sunt baloane de sticlă, având la capătul gâtului şlif şi un dop rodat, ce permite întoarcerea balonului pentru amestecarea componentelor din

19

soluţie fără pericolul ca lichidul să iasă din balon. Baloanele cotate sunt utilizate în special pentru prepararea soluţiilor, motiv pentru care este necesară o exactitate deosebită între volumul de lichid din balon şi capacitatea declarată a balonului.

Alte instrumente folosite în laboratorul de biochimie sunt: eprubetele, paharele Erlenmeyer, paharele Berzelius, balonul cu fund rotund, pipetele, etc.

Măsurarea maselor diferitelor cantităţi de substanţe se face prin operaţia de

cântărire. Aparatele folosite în acest scop se numesc balanţe. O balanţă trebuie să îndeplinească criteriile de sensibilitate, precizie şi exactitate.

Sensibilitatea unei balanţe reprezintă diferenţa cea mai mică de masă care poate fi sesizată cu ajutorul balanţei respective.

Precizia unei balanţe reprezintă măsura gradului cu care aceasta va reproduce datele obţinute la câteva cântăriri succesive ale unuia şi aceluiaşi obiect.

Exactitatea unei balanţe este dată de apropierea valorilor cântăririlor unui obiect de valoarea sa adevărată.

Balanţele pot fi împărţite în două categorii: mecanice şi electronice.

20

Pentru efectuarea reacţiilor la cald se foloseşte ca şi sursă de încălzire:

becul Bunsen, baia de apă, plita electrică.

21

IV. METODE ANALITICE FOLOSITE ÎN BIOCHIMIA MEDICALĂ ŞI FARMACEUTICĂ

Metodele analitice folosite în biochimie se clasifică în:

- metode chimice, care se bazează pe reacţii chimice - metode fizico-chimice care se bazează atât pe reacţii chimice cât şi pe

proprietîţi fizice - metode fizice care se bazează pe proprietăţi fizice.

IV.1. METODE VOLUMETRICE DE ANALIZĂ

Volumetria este o metodă de analiză prin care se determină capacitatea de

combinarea a unei substanţe cu alta prin folosirea unei soluţii cu o concentraţie bine definită, denumită soluţie titrată.

În funcţie de natura reacţiilor care stau la baza metodelor volumetrice de analiză distingem:

- volumetria acido-bazică - volumetria bazată pe reacţii de precipitare - volumetria bazată pe reacţii de oxido-reducere - volumetria bazată pe reacţii de complexare.

Pentru stabilirea punctului de echivalenţă se folosesc indicatori. Indicatorii sunt substanţe care au proprietatea de a-şi schimba culoarea în funcţie de modificarea proprietăţilor soluţiei.

IV.1.1. VOLUMETRIA ACIDO-BAZICĂ DOZAREA ACIZILOR TARI

Dozarea acizilor tari se bazează pe reacţia de neutralizare, care constă în

dozarea unei soluţii acide de concentraţie necunoscută cu ajutorul unei soluţii bazice de normalitate sau titru cunoscut. Pentru evidenţierea punctului de echivalenţă se va utiliza indicatorul potrivit în funcţie de specificul reacţiei.

Tehnica de lucru

Într-un pahar Erlenmeyer ce conţine 10ml soluţie acidă de concentraţie necunoscută se adaugă 1-2 picături de metiloranj. Soluţia colorată în roşu se titrează cu NaOH 0,1N până la apariţia culorii portocalii. Se notează cu N numărul de ml NaOH 0,1N folosiţi la titrare. Exemplu:

HX + NaOH = NaX + H2 O

22

MNaOH .....................................MHX N x TNaOH..................................a

a = N x TNaOH x MHX / MNaOH = g HX / probă

10ml probă.................................... a g HX 100ml soluţie.................................b

b = (10 x a) g HX%

O altă modalitate de calcul este cea în care intervine factorul soluţiei

utilizate la titrare.

1 ml NaOH 0,1N..................................MHX / 1000 x 0,1 g HX N x FNaOH.....................................................a

a = N x FNaOH x MHX /1000 x 0,1 g HX / probă

DOZAREA ACIZILOR SLABI

Pentru dozarea acizilor slabi se foloseşte tot o soluţie de NaOH 0,1N dar ca şi indicator se foloseşte fenolftaleina. În mediu acid fenolftaleina este incoloră, iar punctul de viraj corespunde coloraţiei roz. În mediu puternic alcalin fenolftaleina este roşie-violacee. DETERMINAREA REZERVEI ALCALINE

Echilibrul acido-bazic sangvin este menţinut de 3 sisteme:

- Hb.oxigenată- Hb.deoxigenată, - proteine serice şi - cuplul: Na2CO3 /NaHCO3.

În laboratorul clinic explorarea se face printr-o metodă laborioasă, care permite determinarea parametrilor principali şi a echilibrului acido – bazic. În scop orientativ, serveşte însă o metodă titrimetrică de dozare a cuplului carbonat/bicarbonat.

Dozarea cuplului carbonat/bicarbonat se face cu o soluţie de HCl 0,1 N. Într-o primă etapă se dozează carbonatul în prezenţa fenolftaleinei, după care se dozează întreaga cantitate de bicarbonat cu o soluţie de HCl 0,1 N, în prezenţa metiloranjului.

NaClNaHCOHClCONa 332

OHCONaClHClNaHCO 223

23

Tehnica de lucru Într-un pahar Erlenmeyer peste proba de analizat (10 ml) se adaugă câteva

picături de fenolftaleină. Soluţia colorată în roz- violet se titrează cu HCl 0,1 N până la roz deschis. Se notează cu V1 – ml de HCl 0,1 N utilizaţi. Se continuă apoi titrarea în prezenţă de metiloranj până la culoarea roşu – portocaliu. Se notează cu V2 - ml HCl 0,1 N utilizaţi.

V1 – ml HCl utilizaţi la dozarea CO3-2

V = V2- V1 ml HCl utilizaţi la dozarea HCO3-

Calcul

aVxf

g0084010ml1

HCl

NaHCON10HCl 3

................................

,.........................,

3NaHCOgVf0084010a ,

xml1000

gaml103NaHCOproba

..............................

.........................

lNaCO3ga100x /

bfV

g01060ml1

HCl1

CON10HCl 23

................................

,.........................,

probaCOHCl1 23

gfV010660b /,

yml1000

gbprobaml10 23CO

................................

.........................

lgb100y 23CO /

Interpretarea rezultatelor

Bicarbonatul actual are valori cuprinse între 25 – 27 mEq/l, iar valoarea carbonatului este de 1,2mEq. Rezultă ca raportul bicarbonat/carbonat este de aproximativ 20.

24

Sângele uman are în mod obişnuit un pH în jur de 7,4. Valori ale pH-ului sub 7,36 întâlnim în cazul acidozei, iar peste 7,44 în alcaloză. Ambele stări sunt periculoase şi se manifestă clinic prin semne de afectare a sistemului nervos.

Menţinerea unor limite de +/- 0,04 unităţi de pH se face prin 3 mecanisme principale :

1. capacitatea de tamponare a sistemelor fizico-chimice din plasmă şi hematii;

2. controlul respirator al eliminării CO2; 3. reglarea renală a acidifierii urinii.

Primele 2 mecanisme intervin imediat, iar cel de-al treilea după un interval de timp mai lung. Principalul sistem tampon în hematii este sistemul hemoglobină/hemoglină oxigenată, iar în plasmă sistemul carbonat/bicarbonat. Datorită pătrunderii ionului bicarbonat prin membrana hematiilor cele 2 sisteme sunt legate funcţional. În plus datorită reversibilităţii reacţiei catalizate de una din cele mai active enzime (anhidraza carbonică), excesul de acid carbonic poate fi eliminat prin respiraţie.

Alcalozele şi acidozele se împart în metabolice şi respiratorii. Acidoza respiratorie apare în condiţii de creştere a concentraţiei CO2 ca urmare a unei deficienţe respiratorii (emfizem pulmonar, obstacole pe căile respiratorii, etc.) şi se compensează prin stimularea respiraţiei. Acidoza metabolică apare ca urmare a ingestiei accidentale de soluţii acide. Se corectează în final prin eliminarea urinară sau prin neutralizarea din sucul gastric al excesului de acizi. Alcaloza respiratorie apare ca urmare a hiperventilaţiei sau a ingestiei de bicarbonat. Se corectează prin hipoventilaţie sau, în clinici, prin respirarea unui amestec bogat în CO2. Alcaloza metabolică apare ca urmare a ingestiei accidentale de soluţii sau săruri bazice sau în cazul pierderii de acizi prin vărsături. Se corectează prin mecanisme renale.

Se înţelege uşor că datorită intervenţiei sistemelor de compensare în practică se întâlnesc mai ales tipuri mixte de acidoze şi alcaloze. Deoarece sistemul carbonat/bicarbonat este primul care intervine şi se modifică relativ uşor prin respiraţie, totalitatea CO2 conţinută ca atare sau sub formă de bicarbonaţi în 100 ml plasmă exprimat ca ml CO2 la 00C şi la 1 atm, formează rezerva alcalină (55-70 ml în mod obişnuit).

anhidraza carbonicãH+ + HCO3

-CO2 + H2O

25

ECHILIBRUL ACIDOBAZIC Concentraţia ionilor de hidrogen

Reacţiile enzimatice şi implicit procesele biologice depind în mare măsură

de ionii de hidrogen (H+) din mediu. Concentraţia ionilor de hidrogen din lichidele biologice este menţinută între

35-45 nmol. Valori mai mari decât 120 nmol sau mai mici de 20 nmol sunt de obicei incompatibile cu viaţa. În trecut, [H+] a fost descris drept pH, dar acum se obişnuieşte mai mult ca rezultatele să fie prezentate în unităţile concentraţiei molare, ca nmol/l.

Relaţia între H+ şi pH

Ionii de hidrogen provin din metabolismul intermediar, în special prin oxidarea unor aminoacizi ce conţin sulf (metionină şi cisteină), din fosfolipide, fosfoproteine şi nucleoproteine. Totalul de ioni de hidrogen rezultat în fiecare zi prin metabolizarea a 100 g proteine este de 60 mEq. Dacă toată această cantitate ar urma să fie diluată în lichidul extracelular (14 litri), H+ ar ajunge la 4 mmol/l sau de 100.000 de ori mai acid decât normal ! Acest lucru nu se întâmplă însă, deoarece ionii de hidrogen produşi sunt tamponaţi şi eliminaţi din metabolismul intermediar, rezultând cca. 20000-25000 mEq CO2, care în organism se transformă rapid în acid carbonic.

Când pCO2 este 40±2 mmHg, eliminarea pulmonară a CO2 este egală cu producţia tisulară. O creştere a pCO2, asociată sau nu cu o modificare de pO2, de pH sau de concentraţie

3HCO , stimulează centrul respirator şi prin ventilaţie pCO2 este rapid readus către valoarea normală. Stimularea centrului respirator însă, poate fi produsă în anumite condiţii numai de scăderea de pH, astfel încât normalizarea acestuia din urmă se va obţine prin scăderea “compensatorie” a pCO2.

26

Sisteme tampon Sistemul tampon este alcătuit dintr-un acid slab (puţin disociat) şi o sare a

acestui acid cu un cation reactiv. Procesul de tamponare nu înseamnă şi o îndepărtare din organism a ionilor de hidrogen. Mai degrabă, el curăţă în mod provizoriu ionii de hidrogen produşi în exces, în acelaşi mod în care un burete absoarbe apa. Sistemul tampon este o rezolvare numai pe termen scurt a excesului de ioni de hidrogen. Organismul elimină ionii de hidrogen pe cale renală, digestivă, cutanată.

Principalele sisteme tampon pentru a menţine echilibrul acidobazic constant din sânge sunt:

1. Sistemul H2CO3/NaHCO3 2. Sistemul NaH2PO4/Na2HPO4 3. Sistemul hemoglobină acidă/oxihemoglobinat de K 4. Proteină acidă/proteinat de Na.

Când sistemele tampon simple ajung rapid la echilibru devenind ineficace, aşa cum este asocierea ionului de hidrogen cu anionul acidului slab, sistemul bicarbonat păstrează funcţionalitatea în continuare deoarece acidul carbonic este îndepărtat sub formă de bioxid de carbon. Limita eficacităţii sistemului bicarbonat este concentraţia iniţială de bicarbonat. Doar când tot bicarbonatul este epuizat în procesul de neutralizare a unor acizi rezultaţi în urma metabolismului îi scade capacitatea de tamponare. Evaluarea echilibrului acidobazic al pacientului se face luând în considerare sistemul bicarbonat din sânge.

Asocierea ionului de hidrogen cu bicarbonat are loc rapid, dar descompunerea acidului carbonic la bioxidul de carbon şi apă decurge foarte încet. Anhidraza carbonică din eritrocite şi rinichi accelerează reacţia. Sistemul tampon bicarbonat îndepărtează eficient ionul de hidrogen din spaţiul extracelular. Bioxidul de carbon, care se formează se elimină la nivelul alveolelor pulmonare iar apa rezultată intră în constituirea apei totale din corp. Spaţiul extracelular conţine o cantitate mare de bicarbonat, cca. 24 mmol/l. Dacă ionii de hidrogen încep să crească dintr-un oricare motiv, concentraţia de bicarbonat scade imediat ce sistemul tampon începe să funcţioneze.

Reglarea eliminărilor renale a ionilor de hidrogen

Ionii de hidrogen, tamponaţi, sunt eliminaţi din organism pe cale renală iar, bicarbonatul reabsorbit reface sistemul tampon.

La nivelul rinichilor este absorbită întreaga cantitate de ioni de bicarbonat în stările de alcaloză. Astfel CO2 ajuns odată cu sângele la rinichi, sub influenţa anhidrazei carbonice formează H2CO3, care se ionizează punând în libertate

3HCO

şi H+. Ionul 3HCO difuzează din nou în sânge, iar ionii H+ trec în lumenul tubului

contort, unde întâlnesc ionii 3HCO existenţi în urina primară, formând H2CO3. La

nivelul tubilor contorţi distali o parte din ionii H+ difuzează în lumenul tubular

27

unde înlocuiesc în molecula fosfatului disodic un ion de Na+, care va fi reabsorbit. Astfel fosfatul disodic se transformă în fosfat monosodic care se elimină prin urină (Fig. 1.).

Fig. 1. Recuperarea şi regenerarea bicarbonatului prin excreţia H+la nivelul celulelor tubilor renali

28

Măsurarea echilibrului acidobazic

Un indicator asupra echilibrului acidobazic poate fi obţinut măsurând componentele sistemului tampon bicarbonat.

În termeni chimici, sistemul tampon bicarbonat poate fi considerat în acelaşi mod ca şi oricare altă disociere chimică.

[H+]+[

3HCO ]↔[H2CO3] În baza legii maselor:

[H+]=K[H2CO3,]/ 3HCO , unde K este prima constantă de disociere a acidului

carbonic. Dar componenta acidului carbonic este raportată cu bioxidul de carbon

dizolvat. CO2 dizolvat este proporţional cu presiunea parţială CO2. Într-adevăr, legea lui Henry arată că [CO2] în soluţie = s.PCO2 unde s este solubilitatea gazelor în apă.

În consecinţă [H2CO3] poate fi înlocuit în ecuaţia de masă cu pCO2. O înţelegere a rolului sistemului tampon bicarbonat în explorarea echilibrului acidobazic poate fi realizat prin referirea la relaţia [H+] care este proporţional la o anumită pCO2/[

3HCO ] şi demonstrează că nivelul ionilor de hidrogen în sânge variază la modificarea concentraţiei de bicarbonat şi pCO2.

Dacă în rest totul rămâne constant: Adausul ionilor de hidrogen, îndepărtarea bicarbonatului sau creşterea pCO2, va

avea drept rezultat o creştere a [H+]. Îndepărtarea ionilor de hidrogen, adăugarea bicarbonatului sau scăderea pCO2

va avea ca efect scăderea [H+]. Concentraţia normală a [H+] are valoarea de 40 nmol şi este menţinută în

această limită prin funcţionarea normală a respiraţiei şi a rinichilor. Tulburări ale echilibrului acidobazic

Orice perturbare a homeostaziei ionilor de hidrogen, va afecta sistemul

tampon bicarbonat/acid carbonic. Atunci când se modifică concentraţia bicarbonaţilor apar anomalii de

cauză metabolică: - în diabetul zaharat metabolismul intermediar este perturbat. În absenţa insulinei vor fi utilizaţi acizi graşi. Ca urmare se acumulează în organism atât acid acetilacetic cât şi acid beta-hidroxibutiric care vor înlocui bicarbonaţii consumaţi în tamponarea ionilor de hidrogen disociaţi din aceşti acizi.

- pierderi de bicarbonaţi din spaţiul extracelular pot să mai apară în condiţiile existenţei unei fistule duodenale.

Anomalii de cauză respiratorie se semnalează atunci când se modifică pCO2. Alterarea funcţie respiratorii determină creşterea pCO2 în sânge iar, hiperventilaţia duce la scăderea pCO2.

29

Compensare

În dereglările de cauză metabolică a echilibrului acidobazic, mecanismele compensatorii se exercită la nivelul plămânilor afectând pCO2 care se modifică în acelaşi sens cu bicarbonatul, scăzând în acidoze şi crescând (ineficient) în alcaloze. Mecanismele de compensare respiratorie au efecte imediate.

În dereglările de cauză respiratorie, mecanismele compensatorii se realizează la nivel renal prin reglarea reabsorbţiei bicarbonaţilor. Aceste mecanisme sunt cu efecte întârziate. Astfel că dacă efortul de compensare nu readuce concentraţia ionilor de hidrogen în limite fiziologice, pCO2 şi [

3HCO ] rămân modificate. Reacţiile compensatorii pot corecta parţial sau total valorile pH, dar [

3HCO ] şi respectiv pCO2 rămân anormale până la corectarea anomaliei primare.

În funcţie de modificările suferite de pH, alcalozele şi acidozele pot fi compensate sau decompensate.

Acidozele şi alcalozele sunt termeni clinici care definesc tulburarea acidobazică primară. Ei pot fi utilizaţi chiar şi când concentraţia [H+] este în limite normale, de exemplu când anomaliile sunt total compensate. Se pot distinge:

1. Acidoze metabolice - anomalia primară este o scădere a concentraţiei de bicarbonat.

2. Alcaloza metabolică - anomalia primară este concentraţia de bicarbonat crescută.

3. Acidoza respiratorie - anomalia primară este creşterea pCO2. 4. Alcaloza respiratorie - anomalia principală este scăderea pCO2.

Acidemia şi alcalinemia se referă la concentraţia de[H+] din sânge,

reprezentând o valoare crescută sau scăzută faţă de normal. Aceşti termeni nu sunt frecvent folosiţi. Tulburări ale echilibrului acidobazic de cauză metabolică

Anomaliile de cauză metabolică a echilibrului acidobazic se oglindesc în schimbările concentraţiei de bicarbonat din spaţiul extracelular care se datorează creşterii sau scăderii concentraţiei de ioni de hidrogen. Scăderea sau creşterea bicarbonaţilor va realiza o anomalie de cauză metabolică (Fig. 2.).

Mecanismele de compensare respiratorii intră repede în acţiune, aşa că la pacienţi cu anomalii metabolice pCO2 din sânge este modificată ca urmare a hipo- sau hiperventilaţiei.

30

Fig. 2. Identificarea tulburărilor metabolice acidobazice prin urmărirea concentraţiei de

3HCO

Acidoza metabolică

Într-o acidoză metabolică principala problemă este scăderea concentraţiei de bicarbonat din spaţiul extracelular (Fig. 3.). Aceasta se datorează:

1. Cantităţii crescute de ioni de hidrogen. 2. Aport de ioni de hidrogen, sau medicamente, care sunt metabolizate la

acizi. 3. Diminuarea excreţiei de ioni de hidrogen pe cale renală. 4. Pierderea de bicarbonaţi pe cale gastrointestinală sau urinară.

31

Fig. 3. Mecanismele de compensare în tulburările metabolice primare Cauzele acidozei metabolice

1. Boli renale: ionii de hidrogen sunt reţinuţi împreună cu anionii, ca de exemplu sulfatul şi fosfatul.

2. Acidocetoza diabetică: exagerarea utilizării acizilor graşi, ca o consecinţă a lipsei de insulină, determină producţia endogenă de acid acetilacetic şi beta hidroxibutiric.

3. Acidoza lactică: aceasta rezultă dintr-o serie de cauze, în special din ţesutul anoxic. În stările acute de hipoxie, ca de exemplu insuficienţa respiratorie sau stopul cardiac, acidoza lactică apare în câteva minute punând viaţa în pericol. Poate să apară şi în boli hepatice. Prezenţa acidozei lactice poate fi evidenţiată prin măsurarea concentraţiei plasmatice a lactatului.

4. Intoxicaţii sau supradozaj medicamentos: mecanismul este comun şi constă în producţia de metaboliţi acizi - supradoză de salicilaţi, intoxicaţii cu etilen glicol.

5. Diareea cronică sau fistula intestinală 6. Acidoza tubulară renală: celulele tubulare renale sunt incapabile să

elimine ionii de hidrogen eficient şi bicarbonatul se pierde prin urină.

32

Manifestările clinice ale acidozei Răspunsul compensator la acidoza metabolică este hiperventilaţia, atunci

când creşterea [H+] serveşte drept un stimulent puternic pentru centrul respirator. Respiraţia Kussmaul este profundă, rapidă şi zgomotoasă, fiind întâlnită în

acidoze. Hiperventilaţia este răspunsul fiziologic la acidoză şi se instalează rapid. Prezenţa hiperpotasemiei, care însoţeşte acidoza poate mări riscul aritmiilor

cardiace care pot conduce la stop cardiac. Apar tulburări ale conştienţei ce pot duce la comă şi deces. Alcaloza metabolică Cauzele alcalozei

1. Pierderea de ioni de hidrogen în cursul vărsăturilor este întâlnită în cazul pacienţilor cu stenoză pilorică. Obstrucţia dintre stomac şi duoden face ca pierderile de H+ să nu fie însoţite de o pierdere de bicarbonaţi, iar dacă nu survine o eliminare rapidă a acestora la nivelul rinichilor se va instala o alcaloză metabolică (Fig. 3)

2. Administrarea terapeutică a unei cantităţi mari de bicarbonat sub formă de infuzii intravenoase sau chiar pe cale orală, poate depăşi capacitatea de eliminare renală.

3. Pierderi de potasiu. În pierderile severe de potasiu, adesea o consecinţă a terapiei cu diuretice, ionii de hidrogen sunt reţinuţi în celule pentru a înlocui lipsa ionilor de potasiu. La nivelul tubului renal sunt eliminaţi mai mulţi ioni de hidrogen decât de potasiu. Sodiul nu poate pătrunde în celule ca să înlocuiască deficitul de potasiu. În ciuda alcalozei, urina este acidă. Aceasta este aciduria paradoxală. Manifestările clinice ale alcalozei

Efectele clinice ale alcalozei includ hipoventilaţie, pierderea conştienţei şi în cele din urmă comă. Crampele musculare, tetania şi paresteziile pot fi o consecinţă a scăderii concentraţiei de calciu plasmatic, care este o consecinţă a alcalozei. Acidoza respiratorie

În tulburările echilibrului acidobazic de cauză respiratorie apar modificări

datorate pCO2 în sânge (Fig. 4.). Tulburările funcţiei respiratorii sunt în legătură cu schimbările ventilaţiei

pulmonare, sau modificările funcţiei alveolare care afectează transportul CO2 sau O2 la nivelul membranei alveolare (schimbul de gaze). În ambele cazuri pCO2 se modifică şi concentraţia de acid carbonic creşte sau scade.

Acidoza respiratorie poate să fie acută sau cronică.

33

Forma acută apare în câteva minute sau ore şi este decompensată. Mecanismele compensatorii renale care reglează reabsorbţia de bicarbonaţi sunt eficiente complet doar în 48-72 h.

Problema principală în acidoza respiratorie acută este hipoventilaţia alveolară.

Fig. 4Tulburări acidobazice respiratorii primare recunoscute

prin urmărirea pCO2

Principala manifestare clinică a acidozei respiratorii constă în alterarea stării de conştienţă, obnubilare mergând până la comă şi poate duce chiar la deces. Exemple de acidoză respiratorie acută sunt:

obstrucţia acută a căilor respiratorii bronhopneumonia. criza de astm.

Acidoza respiratorie cronică este, de obicei, o stare de lungă durată şi tulburarea este compensată pe cale renală. Problema principală şi în această situaţie este diminuarea ventilaţiei alveolare. Modificările pot fi compensate parţial sau complet. La nivelul tubilor renali excreţia ionilor de hidrogen creşte, cu generarea bicarbonaţilor. Concentraţia sanguină a [H+] are tendinţe de normalizare.

34

Fig. 5.Intervenţia mecanismelor renale

de reglare a acidozei respiratorii primare

Există un interval de câteva zile necesare de la apariţia tulburării pentru ca

rinichii să răspundă la nivelul crescut de pCO2 şi [H+] (Fig. 5.). La mulţi pacienţi cu afecţiuni respiratorii cronice, mecanismele renale compensatorii vor păstra concentraţia sanguină a [H+] aproape de normal, în ciuda micşorării ventilaţiei pulmonare. În stările stabile de bronşită cronică [H+] este în limite normale cu toate că pCO2 are valori crescute. Acest lucru este realizat numai menţinând o concentraţie de bicarbonaţi de două ori mai mare decât cea normală. pO2 este de obicei scăzută, şi scăderea se accentuează pe măsură ce afecţiunea pulmonară evoluează în timp.

Exemple de afecţiuni cronice respiratorii sunt: - emfizemul, - bronşita cronică.

Alcaloza respiratorie

Alcaloza respiratorie este mai puţin frecventă decât acidoza. Poate să apară ca urmare a unei respiraţii accelerate şi când efortul compensator renal are o eficienţă limitată.

Tratamentul are drept scop înlăturarea cauzei care a determinat hiperventilaţia cu revenirea la normal a echilibrului acidobazic. Exemple sunt:

- criza de isterie, - respiraţia asistată, - leziuni tumorale - intoxicaţii - afecţiuni cardiace etc.

Tulburări acidobazice mixte

O tulburare acidobazică este considerată mixtă când este produsă de intervenţia a cel puţin doi factori etiologici ce acţionează concomitent.

Unii bolnavi pot să aibă ambele tipuri de dezechilibre: acidoză metabolică

35

şi respiratorie, ca în bronşitele cronice cu deteriorarea funcţiei renale. Concentraţia [H+] creşte, pCO2 de asemenea, iar bicarbonaţii vor avea valori scăzute.

Tulburările care intervin pot fi convergente (aditive pe modificarea de pH) sau pot fi divergente (modifică pH în sens opus).

Poate exista o acidoză metabolică şi o alcaloză respiratorie coexistentă, cum apare în intoxicaţiile cu salicilaţi.

Alcaloza mixtă, metabolică şi respiratorie apare în unele situaţii ca de exemplu: - la bolnavii hepatici trataţi cu diuretice,

- tratament cu diuretic la un bolnav cu metastaze osoase, - ventilaţie asistată la bolnavi ce au pierdut ioni de H+ prin vărsături. Alcaloza respiratorie cu acidoză metabolică poate apare în insuficienţa

renală cu stare septică, şoc septic. Acidoza respiratorie cu alcaloză metabolică se întâlneşte într-o boală

pulmonară cronică cu hipoventilaţie alveolară căruia i s-a administrat un tratament diuretic masiv.

Explorarea echilibrului acido-bazic

Explorarea echilibrului acido-bazic se poate efectua din sângele arterial şi

venos. Recoltarea se face în seringi ce conţin heparină. Puncţia arterială este neplăcută pentru pacient, astfel că recoltarea poate fi limitată la câteva situaţii cum ar fi evaluarea pO2, dacă pacientul este respirat artificial, dacă se suspicionează o exacerbare a unei boli pulmonare cronice etc.

Determinările de pH şi de bicarbonaţi se fac cu ajutorul unor analizoare automate. Se măsoară astfel pH-ul, presiunile parţiale de oxigen şi de bioxid de carbon şi pornind de la aceşti parametri se pot calcula şi: Bazele exces care reprezintă cantitatea de acizi sau baze care ar putea restabili

echilibrul acido-bazic într-un litru de sânge la un pCO2 de 40 mmHg. Valoarea normală este între +2,3 şi -2,3 nmoli/l sau mEq/l.

Bazele tampon reprezintă suma anionilor tampon din sânge (proteine, bicarbonaţi, hemoglobină) care pot accepta H+. Valoarea normală este de 47 nmoli/l pentru un conţinut de 15 g/dl de hemoglobină.

Bicarbonatul real care reprezintă conţinutul de bicarbonat din sângele bolnavului la pCO2 existentă. Valoarea normală este între 24-27 nmoli/l.

Conţinutul total de CO2 este o sumă a bicarbonatului real adunat cu produsul între pCO2 şi factorul 0,03.

Bicarbonatul standard este conţinutul de bicarbonaţi al sângelui dacă pCO2 ar fi 40 mmHg.

pH-ul standard indică valoarea pH dacă pCO2 ar fi 40 mmHg. Dozarea concentraţiei de potasiu este de asemenea importantă în explorarea

echilibrului acido-bazic. Corectarea echilibrului acido bazic se efectuează în funcţie de etiologie şi

de mecanismul de producere a anomaliei.

36

IV.1.2. DETERMINĂRI VOLUMETRICE PRIN REACŢII DE PRECIPITARE

Reacţiile de formare de precipitate sunt numeroase şi sunt folosite pe scară

largă în titrimetrie. Din acest tip de reacţii mai des sunt folosite cele bazate pe precipitarea halogenurilor cu o soluţie de AgNO3. Acest tip de volumetrie se numeşte argentometrie.

Argentometria cuprinde metodele de dozare ale ionilor de halogen ( I-, Br-, Cl- ) şi a unor combinaţii organice, cu ajutorul unor soluţii de AgNO3 cu titru sau factor cunoscut. DOZAREA CLORURILOR ( METODA MOHR ) Principiul metodei

Clorurile sunt precipitate în mediu neutru sau slab acid sub formă de clorură de argint cu o soluţie de azotat de argint de normalitate cunoscută. Ca indicator se foloseşte cromatul de potasiu care în prezenţa unui exces de azotat de argint va da un precipitat roşu de cromat de argint (în soluţie fiind atât clorura de argint, precipitat alb, cât şi cromat de argint, precipitat roşu, va apare o nuanţă cărămizie).

Reactivi : 1. AgNO3 0,1 N 2. K2CrO4 10%

Tehnica determinării : Într-un vas Erlenmeyer se pipetează 10 ml urină şi 1 ml indicator. Se titrează

din biuretă cu o soluţie de AgNO3 0,1 N până la culoare cărămizie. Se notează cu “N“ numărul de ml de azotat de argint folosit la titrare. Calcul: concentraţia clorurilor în urină se exprimă în grame NaCl la litru.

xfN

NaClg0580N10AgNOml1

3AgNO

3

....................................

..........................,

probag0580Nfx NaClAgNO3

/,. Interpretarea rezultatelor

Valori normale: în cazul unei diete obişnuite, la subiecţii sănătoşi, cantitatea de cloruri eliminată în 24 de ore, este cuprinsă între 10-15g.

Variaţii fiziologice: după câteva zile de regim hipoclorurat, cantitatea clorurilor urinare scade la valori sub 1g/24 de ore şi invers, în cazul unui regim hiperclorurat, creşte peste valorile normale.

NaCl + AgNO3

2AgNO3 + K2CrO4

AgCl + NaNO3

Ag2CrO4 + 2KNO3

37

Valori patologice: - hiperclorurii - în cazuri de poliurie, - crize postinfecţioase - hipoclorurii apar în: - pneumonii, - formarea edemelor, - boli febrile acute, - insuficienţă cardiacă, - ocluzie intestinală, - diferite leziuni renale.

IV.1.3. DETERMINĂRI VOLUMETRICE PRIN REACŢII DE OXIDO-REDUCERE

Reacţiile de oxidoreducere constituie o sursă importantă pentru metodele de

analiza biochimică. Ca exemple de reacţii de oxido-reducere folosite în biochimie întâlnim: dozarea calciului urinar, dozarea acidului uric din urină, determinarea indicelui de iod al grăsimilor, etc.

DOZAREA CALCIULUI URINAR Principiul metodei

Calciul se precipită sub formă de oxalat de calciu cu o soluţie de oxalat de amoniu, împiedicând precipitarea Mg prin adăugarea clorurii de amoniu. Prin tratare cu acid sulfuric, oxalatul de calciu pune în libertate acidul oxalic care se tratează cu o soluţie de permanganat de potasiu, la bază stând o reacţie de oxido-reducere. Reactivi:

1. soluţie saturată de oxalat de amoniu; 2. soluţie amoniac 2% 3. soluţie de H2SO4 2N 4. soluţie de KMnO4 0,01N 5. urină.

Tehnica de lucru:

Se pipetează într-o eprubetă 2 ml urină şi se adaugă 5 ml soluţie saturată de oxalat de amoniu. Se omogenizează bine şi se lasă în repaus la temperatura camerei timp de 30 de minute. După aceasta se centrifughează şi se îndepărtează lichidul

CaCl2 + 2H4NOOC - COONH4

(COO)2Ca + H2SO4

(COOH)2 + 2KMnO4 + 3H2SO4

2NH4Cl + (COO)2Ca

CaSO4 + HOOC - COOH

2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O + 10CO2

38

clar de deasupra, iar precipitatului rămas i se adaugă 4 ml soluţie NH3 2% pentru spălare. Se centrifughează şi se repetă spălarea de 3 ori cu câte 5 ml apă distilată.

După ultima spălare, peste precipitatul rămas se adaugă 2 ml de H2SO4 2N şi se încălzeşte soluţia pe baie de apă la 800C timp de 15 minute.

Soluţia caldă se titrează cu KMnO4 0,01N până la culoarea slab roz, care trebuie să persiste minimum 1 min. În paralel se lucrează şi o probă în alb, identică cu proba de cercetat, urina fiind înlocuită cu apă distilată şi titrând tot cu o soluţie de KMnO4 0,01 N. Calcul:

xfV

g00020N010KMnOml1

4KMnO

Ca4

.........................................

,.........................,

probagVf00020x Ca /,

21 VVV V1 – ml KMnO4 utilizaţi la titrarea probei de analizat V2 - ml KmnO4 utilizaţi la titrarea probei în alb

yml100

gxml2

urina

Caproba

......................

.........................

CagV010V0002050x50y ,,.

Valorile normale ale calciului urinar sunt cuprinse între 0,14 – 0,20 g/24 de ore. Variaţii patologice :

Valori crescute apar în: - hiperparatiroidism, - osteoporoze, - metastaze osoase, - acidoze tubulare, - intoxicaţii cu vitamina D, - hipercalcemie. Valori scăzute se întâlnesc în: - insuficienţe renale avansate, - hiperparatiroidie, - sarcină, - anumite osteopatii.

DETERMINAREA INDICELUI DE IOD AL GRĂSIMILOR

Indicele de iod (Hubl) reprezintă cantitatea (în g) de iod care se adiţionează la 100 g grăsime.

39

Determinarea indicelui de iod se face lăsând să acţioneze asupra unei cantităţi de grăsime cunoscută o cantitate definită de halogen şi titrând excesul de halogen nereacţionat. Determinarea indicelui de iod cu reactivul HANUS Principiu :

Grăsimile dizolvate în cloroform sau tetraclorură de carbon adiţionează la nivelul dublelor legături a acizilor graşi, iodura de brom. Excesul de BrI în prezenţă de KI pune în libertate I2 care se titrează cu tiosulfat de sodiu. Reactivi:

1. ulei sau grăsime; 2. Reactiv Hanus (BrI) : se dizolvă 13 g iod pulverizat în puţin acid acetic

glacial, se adaugă 8 g brom şi se completează cu acid acetic glacial la 1000 ml;

3. Na2S2O3 0,1 N; 4. KI (cristale sau soluţie 10% în apă distilată); 5. Soluţie de amidon 1% în apă distilată; 6. Solvenţi organici, de ex.: cloroform;

Tehnica de lucru : Într-un vas Erlenmeyer se cântăresc aproximativ 0,15 – 1g grăsime. În cazul

uleiului se pipetează 0,1 ml şi se adaugă 5 ml cloroform şi 5 ml reactiv Hanus. Se recomandă închiderea balonului cu un dop de sticlă rodat, plută sau vată şi se lasă în repaus timp de 15 min, agitând din când în când. Se adaugă 5 ml soluţie de KI 10% şi se titrează cu tiosulfat de sodiu în prezenţa amidonului ca indicator, până la dispariţia coloraţiei albastre şi se notează numărul de ml cu “n”.

În paralel se efectuează şi o probă martor care conţine 5 ml reactiv Hannus, 5 ml soluţie KI 10% şi amidon care se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1 N până la dispariţia culorii albastre a indicatorului şi în care se notează cu “N” numărul de ml de tiosulfat utilizaţi la titrare. Calcul:

0,0127 – echivalentul în iod pentru solutia de Na2S2O3 0,1 N

g

10001270nNIndice2I

.,.

unde g reprezintă cantitatea de grăsime cântărită. În cazul uleiului care a fost măsurat cu pipeta se va face corecţia necesară

ţinând cont de densitatea uleiului.

R - CHI - CHBr - R'

I2 + KBr

2NaI + Na2S4O6

R - CH = CH - R' + BrI

BrI + KI

I2 + 2 N2S2O3

40

Interpretare : Indicele de iod oferă informaţii asupra gradului de nesaturare al acizilor

graşi respectivi din grăsime. Cu cât indicele de iod este mai mare, cu atât grăsimea conţine o proporţie mai mare de acizi graşi nesaturaţi.

IV.1.4. VOLUMETRIA PRIN REACŢII DE COMPLEXARE DOZAREA CALCIULUI CU EDTA Calciul în prezenţa de EDTA şi a murexidului ca indicator formează un complex chelat, complexonatul de calciu, colorat în violet. Iniţial murexidul fixează calciul, culoarea soluţiei devenind roz, iar la titrare cu EDTA, indicatorul este eliberat şi soluţia se colorează în violet. Reactivi: 1. EDTA 0,01 M 2. NaOH 0,1N 3. Murexid Tehnica de lucru Într-un pahar Erlenmeyer se introduc 10 ml urină deproteinizată, 10 ml NaOH 0,1 N şi câteva cristale de murexid. Soluţia colorată în roz se titrează cu EDTA 0,01 M până la virajul soluţiei de la roz la violet. Se notează cu N- numărul de ml de EDTA folosiţi la titrare.

Calcul

xfNgCa00040080M010mlEDTA1

EDTA .............................,..................,

probaCag00040080fNx EDTA /...

CH2 NCH2-COO-

CH2-COO-

Ca+2

CaCH2-COO-

CH2-COO-NCH2 CH2 N

CH2-COO-

CH2-COO

CH2-COO-

CH2-COONCH2

41

yml1000

Cagxprobaml10

...................................

...........................

probaCag040080fNx100y EDTA /,.. Interpretarea rezultatelor Cantitatea de calciu urinar eliminată în 24 de ore este cuprinsă între 0,07 – 0,3 g/24 de ore. Cantităţi crescute apar în: - hiperviatminoza D, - hiperparatiroidism, - osteoporoză - după fracturi. Cantităţi scăzute ale calciului urinar apar în: - rahitism, - hipoparatiroidism, - spasmofilie etc.

IV.2. METODE OPTICE DE ANALIZĂ IV.2.1.METODE SPECTROSCOPICE DE ANALIZĂ

Metodele spectroscopice de analiză se bazează pe determinarea şi interpretarea spectrelor de absorbţie şi de emisie. Legea absorbţiei radiaţiilor

Analiza spectroscopică care urmăreşte determinarea de concentraţii are la bază două legi fundamentale. Aceste legi se aplică în cazul modificării puterii radiante a unei radiaţii monocromatice odată cu modificarea grosimii stratului străbătut de radiaţie şi modificarea concentraţiei.

Prima din legile absorbţiei radiaţiilor este atribuită lui Bouguer-Lambert şi afirmă că pe măsură ce creşte grosimea unei probe absorbante, intensitatea radiaţiei transmise prin probă descreşte.

Dependenţa absorbţiei de concentraţie se exprimă prin legea lui Beer: coeficientul de extincţie este proporţional cu concentraţia.

Din combinarea celor două legi rezultă legea lui Bouguer-Lambert-Beer. A = a x c x b, unde:

a = absorbitivitatea c = concentraţia b = grosimea stratului A = absorbanţa

42

Absorbitivitatea reprezintă extincţia unei soluţii având concentraţia de 1gram/litru la o grosime de strat de 1 centimetru.

Măsurătorile de absorbţie de radiaţie se utilizează pentru determinări de concentraţii. Determinarea concentraţiei substanţelor pe baza absorbţiei în vizibil, în particular (reacţii de culoare) se poate practica în următoarele situaţii:

- substanţa de cercetat are o absorbţie (culoare) proprie - substanţa în urma unei sau a unor reacţii conduce la un compus care

absoarbe (colorat) - substanţa eliberează un compus care absoarbe (colorat) în urma reacţiei - substanţa de analizat interacţionând cu o substanţă absorbantă (colorată)

face să dispară din aceasta o anumită cantitate. Stabilirea spectrului de absorbţie al cianhemoglobinei Principiu

Fericianura de potasiu oxidează Fe+2 din hemoglobină la Fe+3. Aceasta face ca toate felurile de hemoglobină din sânge (exceptând verdohemoglobina) să treacă în methemoglobină, iar methemoglobina pe măsură ce se formează, se combină cu cianura de potasiu trecând în cianmethemoglobină, derivatul de hemoglobină cel mai stabil. Reactivi:

1. Reactivul Drabkin: 0,14g fosfat monopotasic, 0,2g KCN şi apă distilată ad. 1000ml (pH = 6,4). Soluţia se păstrează în flacoane de sticlă brună bine închise. Se păstrează la frigider timp de 2 luni.

2. Standard de cianmethemoglobină. Tehnica de lucru

În două eprubete de hemoliză se pipetează câte 5 ml reactiv Drabkin. În una din eprubete se pipetează cu o micropipetă 0,02 ml soluţie standard de hemoglobină, iar în cealaltă se pipetează 0,02 ml sânge (venos sau capilar). Se omogenizează eprubetele prin agitare, apoi după 20 de minute se citeşte extincţia probei de analizat şi a probei standard faţă de proba în alb (apă distilată) la 540 nm. Calcul:

hemoglobina/100ml ser = Ep/Es x 13 ,unde 13 = conc standardului Observaţii:

- pH-ul trebuie să fie 7,2-7,5. La pH acid, precipită proteinele, iar la pH alcalin, precipită lipidele. Valorile normale sunt:

- femei: 11 –15g/100ml ser - bărbaţi: 13-17g/100ml ser.

43

IV.2.2.METODE FLAMFOTOMETRICE DE ANALIZĂ

În contextul necesităţii determinărilor electroliţilor în mod curent, metodele chimice nu ar fi făcut faţă numărului mare de analize. Faţă de 1-2 ore cât dura o metodă chimică, flamfotometria permite determinări ce durează mai puţin de un minut şi cu precizie mult mai mare.

Principiul flamfotometriei se bazează pe capacitatea unor elemente chimice ca prin introducerea lor în flacără neluminoasă să emită lumină la o lungime de undă caracteristică atomilor respectivi. Atomii acestor elemente trec, datorită energiei termice a flăcării, într-o stare excitată, revenind spontan apoi la nivelul iniţial, fundamental, dar emiţând surplusul de energie sub formă de lumină, la o lungime de undă caracteristică, de exemplu 589 nm pentru sodiu. În anumite limite, cantitatea de lumina emisă, este proporţională cu concentraţia atomilor introduşi în flacără, cu condiţia aspirării soluţiei de analizat cu o viteză constantă. Cantitatea de lumină mai variază în funcţie de temperatura flăcării. Atât aspirarea soluţiei de analizat, cât şi debitul gazelor care întreţin flacăra trebuiesc întreţinute riguros constant.

Lungimea de undă caracteristică fiecărui element de analizat este monitorizată printr-un sistem de prisme şi filtre specific fiecărui tip de flamfotometru. Intensitatea luminii emise este măsurată printr-o fotocelulă cuplată cu un aparat adecvat de măsurat. Curentul electric obţinut va permite citirea concentraţiei elementului chimic în mv sau direct în miliechivalenţi, în funcţie de tipul aparatului. Determinările se fac intercalând obligatoriu un standard din elementul de măsurat. La calibrarea metodei, trebuie verificat domeniul liniar al relaţiei dintre intensitatea luminii emise şi concentraţia elementului în condiţiile experimentale constante de temperatură şi debit al gazelor.

Prezenţa unui element într-o cantitate mare poate interfera cu măsurarea concentraţiei altui element, cum este cazul determinării potasiului în prezenţa unor concentraţii mari de sodiu. La aparatele moderne, se minimalizează acest efect, dar oricum standardele de potasiu trebuie să conţină şi o concentraţie de sodiu cunoscută, asemănătoare aceleia obţinută prin diluarea serului: 140 mEq/l Na şi 5 mEq/l K, iar în urină 50 mEq/l pentru fiecare.

Procedeul de utilizare al flamfotometrelor este simplu şi diferă de tipul aparatului. În general, amestecul de propan şi aer produce o flacără cu o temperatură de 1900-20000C, dar cu alte gaze se obţin temperaturi mai mici insuficiente pentru măsurarea altor elemente. Indiferent de tipul aparatului, toate necesită folosirea unui standard intern. Acesta constă dintr-o concentraţie cunoscută dintr-o sare de litiu sau cesiu, care se adaugă standardelor şi martorului, tocmai în scopul evitării interferenţelor. Aparatele moderne permit determinarea simultană a sodiului, potasiului şi litiului. Toate lichidele biologice, în care se măsoară elementele anorganice sunt diluate 1:100 sau 1:200 cu apă deionizată şi cu un standard intern de litiu de 15 mEg/l. Prin flamfotometrele obişnuite se determină curent sodiul si potasiul, şi uneori calciul dacă flacăra este suficient de puternică.

44

Dozarea sodiului şi a potasiului

Pentru dozarea acestor două elemente se foloseşte astăzi fotometria de flacără, metoda fizică foarte rapidă, care nu necesită decât cantităţi foarte mici de sânge. Metodele chimice mai vechi sunt foarte laborioase, necesită cantităţi importante de sânge, motiv pentru care nu se mai folosesc astăzi. Principiu.

Proba se introduce în flacără şi pentru o temperatură constantă a flacării în anumite condiţii, intensitatea radiaţiei emise este proporţională cu concentraţia metalului în soluţie. Se determină intensitatea liniei emise, selecţionate cu ajutorul unor filtre (de interferenţă, specifice fiecărui metal). Aparatura:

- fotometrul cu flacără, - vase din material plastic pentru păstrarea soluţiilor etalon şi efectuarea

diluţiilor, - pipete, - baloane cotate sau - biurete.

Reactivi: Ca regulă generală, toţi reactivii vor fi păstraţi în flacoane de polietilenă şi nu în vase de sticlă, fiindcă silicaţii din sticlă cedează mai mult sau mai puţin ionii de sodiu şi potasiu în soluţie. La prepararea soluţiilor etalon se va folosi apă bidistilată sau tridistilată.

Soluţiile etalon se prepară din NaCl şi KCl uscate în prealabil timp de 24 de ore la 1100C într-o etuvă şi lăsate să se răcescă într-un exicator.

1. soluţie etalon NaCl: 7,35 g NaCl, 5 ml formaldehidă 40% şi apă bidistilată ad 1000 ml. Soluţia conţine 3mg Na/ml şi se diluează 1/500 la folosire.

2. Soluţie etalon KCl: 1.91g KCl, 5 ml formaldehidă 40% şi apă bidistilată ad 1000 ml. Soluţia conţine 1mg K/ml şi se diluează 1/100 în momentul folosirii. Tehnica de lucru

1. Dozarea se poate face pe ser sau plasmă. În primul caz decolarea cheagului înainte de centrifugare produce o uşoară hemoliză, ceea ce introduce o eroare importantă, având în vedere că hematiile conţin de 20 de ori mai mult K decât plasma. Dacă se lucrează pe plasmă, sângele se va recolta pe anticoagulant lipsit de Na şi K ( heparinat de litiu şi amoniu) şi se vor separa hematiile în prima oră după recoltare, altfel se obţin valori fals crescute pentru K. Practic se recoltează 5 ml sânge pe câteva picături de heparinat de litiu, eventual direct într-un tub de centrifugă.

2. Diluţiile serului sau ale plasmei variază în funcţie de aparat. Pentru fotometrul Zeiss-Jena se face o diluţie 1/100 la dozarea K şi 1/500 pentru dozarea Na. Pentru fotometrul Jouan se poate face o diluţie 1/200 pentru Na şi 1/100 pentru K. Diluţiile se aleg în funcţie de curba de etalonare utilizată (făcută cu soluţiile etalon). Se recomandă ca diluţiile să se facă cu foarte mare grijă, iar pentru măsurarea apei bidistilate se recomandă folosirea unei biurete, în acest caz eroarea de măsurare a volumului fiind constantă.

45

Practic, se poate proceda în felul următor: se pipetează 0,1 ml ser într-un flacon de material plastic şi se adaugă 9,9 ml apă bidistilată dintr-o biuretă de 10 ml. Se agită bine. Se ia 1 ml din această soluţie (1/100), se introduce în alt flacon şi se adaugă 4 ml apă bidistilată din biuretă. Se obţine astfel diluţia de 1/500.

Pentru adaptarea ultramicroanalitică se iau 50l ser şi 4,95 ml apă pentru diluţia 1/100. Din aceasta se ia 1 ml şi se adaugă 4 ml apă ( diluţia 1/500).

Procedeul de măsurare a intensităţii radiaţiei emise depinde de tipul fotometrului cu flacără care se utilizează. Valori normale : Vârsta Na (mEg/l) K (mEg/l) n.născuţi 130-139 3,5-5,1 48 ore 130-146 3,9-4,7 5 zile 135-146 3,8-5,1 Luna1 139-146 4,1-5,3 Lunile 5-7 137-155 3,8-5,3 Lunile 11-15 135-144 3,8-5,4 2-3 ani 138-145 3,5-4,7 Adulţi 135-150 3,4-5,4 Spectrofotometria de absorbţie atomică

Principiul acestui aparat este destul de asemănător cu flamfotometrul, cu deosebirea că în acest tip de aparat se măsoară lumina emisă de atomii neexcitaţi. De altfel şi în cazul flamfotometriei, în flacără erau mai mulţi atomi neexcitaţi decât cei excitaţi. În spectrofotometrele de absorbţie atomică, elementele sunt vaporizate printr-o descărcare într-un catod de heliu sau argon. Proba este aspirată în flacăra formată dintr-un amestec de aer şi acetilenă, asemănător flamfotometrului.

Acest tip de spectrofotometru permite separarea datorită construcţiei deosebite a sistemului de emisie a luminii produsă de catodul cu vaporizare (curent pulsatoriu) de cea emisă de atomii excitaţi din flacără (curent continuu). Măsurându-se lumina absorbită, se va aplica legea Lambert – Beer, astfel că se va putea etalona domeniul liniar al relaţiei concentraţie-absorbţie.

Aparatele moderne au lămpi multiple calciu-magneziu şi cupru-fier-zinc. Pentru alte elemente (Pb, Cd , Co, Mn, Ni) sunt necesare lămpi speciale.

IV.3 METODE ELECTROMETRICE

Metodele electrometrice implică măsurarea semnalelor electrice asociate cu sisteme chimice care sunt încorporate într-o celulă electrochimică. Celula constă din doi sau mai mulţi electrozi care realizează interfaţa dintre un sistem chimic şi

46

un sistem electric. Sistemul electric măsoară sau controlează parametrii electrici ca tensiunea şi curentul, caracteristici pentru un sistem chimic particular.

În laboratorul clinic, metodele electrometrice se utilizează de rutină pentru determinarea unor ioni, medicamente, hormoni, metale şi gaze.

Concepţia de acid şi bază În biochimie se foloseşte definirea acizilor şi bazelor prin capacitatea de a

ceda sau de a accepta protoni. Un acid este o substanţă capabilă să cedeze protoni iar bazele sunt substanţe capabile să accepte protoni. Această teorie este generală şi este exprimată prin concepţia acido-bazică a lui Brønsted. Când un acid Brønsted cedează un proton se formează o bază Brønsted. Acidul original şi baza rezultată formează o pereche de acid conjugat şi bază conjugată. În toate reacţiile de ionizare a unui acid sau a unei baze sunt implicate două perechi acid conjugat şi bază conjugată.

Concepţia de pH şi pOH

pH este o exprimare foarte scurtă care desemnează activitatea ionilor de hidrogen. Prin definiţie pH-ul este logaritmul negativ al activităţii ionilor de hidrogen. În mod similar se calculează logaritmul negativ al activităţii ionilor de hidroxil, exprimat sub formă de pOH.

][log][logloglog

H1H

a1apH

HH

HH

][log][logloglog

OH1OH

a1apOH

OHOH

OHOH

În soluţii apoase echilibrul de ionizare a apei este dat de ecuaţia:

1410OHH ]][[ .

De aici, dacă este cunoscută concentraţia ionilor de hidrogen se poate calcula concentraţia ionilor de hidroxil şi invers folosind relaţia dintre pH şi pOH.

HA + B-

[acid conjugat] [baza conjugata] A- + HB[baza conjugata] [acid conjugat]

47

pKOHH ]][[

Prin logaritmare:

pKOHH log]log[]log[

pKOHH log]log[]log[

pHH ]log[ pOHHO ]log[ pp pKK log

ppKpOHpH

14

p 10K 1410pK 14p log

Dacă una dintre aceste valori este cunoscută se pot calcula şi celelalte.

Măsurarea pH-ului

Determinarea pH-ului se poate realiza cu indicatori coloraţi sau cu pH-metru (determinare electrometrică).

Exemple de indicatori de pH:

Indicator Schimbarea de culoare în sensul creşterii de pH

Interval de viraj

Acid Bază Albastru de timol roşu galben 1,2 – 2,8 Roşu de Congo albastru roşu 3,0 – 5,0 Albastru de bromfenol galben albastru 3,0 – 4,6 Metiloranj roşu galben 3,1 – 4,4 Verde de bromcrezol galben albastru 3,8 – 6,3 Turnesol roşu albastru 6,0 – 8,0 Roşu de fenol galben roşu 6,8 – 8,4 Fenolftaleină incolor roşu 8,3 – 10,0 Timolftaleină incolor albastru 9,3 – 10,5 Galben de alizarină R galben roşu 10,1 – 12,1

48

Metoda de măsurare a pH-ului cu pH-metrul este mai exactă decât cea cu substanţe (hârtie) indicatoare şi se foloseşte ori de câte ori este necesară stabilirea cu exactitate a valorii pH-ului. PH-metru este un potenţiometru care măsoară potenţialul dezvoltat între un electrod de sticlă şi unul de referinţă. Instrumentele moderne fososesc electrozi combinaţi (electrodul de sticlă şi electrodul de referinţă sunt combinaţi într-un singur electrod). Înainte de a efectua o determinare, pH-metrul trebuie etalonat cu o soluţie tampon.

pH-ul izoelectric al aminoacizilor Determinarea pHi al glicocolului prin trasarea curbei de titrare Principiu

Fiecare aminoacid are cel puţin două grupări ionizabile legate la atomul de Cα: una acidă (carboxilul) şi alta bazică (gruparea amino). Pentru cazul cel mai simplu, acela al unui aminoacid monoaminomonocarboxilic, cum este glicocolul, există cele două trepte de disociere, fiecare cu pKa care pot fi scrise astfel:

][]][[log

COOHCHNH

HCOOCHNHpK

23

23a1

][]][[log

COOCHNH

HCOONCHHpK

23

22a 2

Atât pentru aminoacizi cât şi pentru marea majoritate a proteinelor există un

pH la care numărul sarcinilor pozitive este egal cu cel al sarcinilor negative. Acest pH la care sarcina netă a moleculei este zero se numeşte punct izoelectric şi se notează cu pHi. Valoarea sa se poate considera ca fiind media aritmetică a valorilor pKa pentru treptele de disociere din jurul speciei moleculare cu un număr egal de sarcini pozitive şi negative.

Modificând concentraţia protonilor prin adăugarea de acizi sau baze la soluţia unui aminoacid monoaminomonocarboxilic se poate aprecia valoarea pKa din forma curbei de neutralizare. În jurul acestei valori pH-ul variază foarte puţin faţă de echivalenţii adăugaţi, comparativ cu valorile extreme de la începutul şi sfârşitul titrării soluţiei, ceea ce se poate deduce din ecuaţia lui HENDERSON-HASSELBACH.

H3N+- CH2 - COOH H3N+- CH2 - COO- + H+

H2N - CH2 - COO- + H+H3N+- CH2 - COO-

49

][][log

ramasacidformatasarepKpH a

Reactivi: 1. Glicocol (pulbere) 2. NaOH 2N 3. H2SO4 2N

Tehnica de lucru: Se cântăresc 375 mg glicocol, se dizolvă în 50 ml apă bidistilată. Pentru a

vedea ce volume de acid (şi bază) consumă de fapt glicocolul este necesar să se titreze în prealabil 50 ml apă distilată, adică volumul de solvent utilizat. În acest scop se iau 50 ml apă distilată şi se adaugă volume cunoscute de acid sulfuric, notând pH-ul indicat de aparat pentru fiecare adăugare de acid. Menţionăm că aparatul de măsură utilizat, pH-metrul, indică pH-ul soluţiei datorită diferenţei de potenţial ce se creează între concentraţiile ionilor de H+ în interiorul electrodului de sticlă, faţă de exterior, adică faţă de soluţia de titrare.

Se reprezintă grafic pe hârtie milimetrică luând pe ordonată câte 1 mm pentru fiecare unitate de pH şi pe abscisă câte 3 cm pentru fiecare ml de H2SO4 2N.

Se procedează identic cu cei 50 ml soluţie de glicocol, notând volumele de H2SO4 consumat pentru fiecare valoare de pH. Se aleg apoi mai multe valori de pH, de preferat 10 valori, şi se notează într-un tabel ce volume corespund pentru fiecare valoare a pH, pentru apă şi soluţia de glicocol. Se notează într-o rubrică separată diferenţa în ml ce corespunde acidului sulfuric necesar strict pentru titrarea glicocolului. Cu aceste valori diferenţiale se construieşte apoi curba corectată de titrare a glicocolului indicând pe ordonată 1 cm o unitate de pH şi pe abscisă pentru 1cm, mEq acid (1 ml H2SO4 2N = 2mEg ).

Se procedează similar pentru domeniul alcalin, adăugând volume crescânde de NaOH 2N la 50 ml apă şi apoi la 50 ml soluţie ce conţine 375mg glicocol. Se construieşte curba necorectată, se fac diferenţele cu care se trasează în mod similar, curba corectată de titrare a glicocolului, reprezentând pH-ul faţă de mEq de bază adăugaţi. Se stabileşte jumătatea domeniului de inflexiune atât pe curba de titrare cu acid, cât şi pe cea de titrare cu bază. Proiecţia acestor puncte pe axa pH-ului indică cele 2 valori pKa ale glicocolului.

50

Fig. nr. 6. Curba de neutralizare a glicocolului Tabel cu 5 valori de pH pH Apă + alcool Apă Diferenţa 3,5 0,103 0,003 0,100 3,0 0,355 0,020 0,515 2,5 0,667 0,032 0,635 2,2 0,063 0,063 1,00 2,0 1,425 0,200 1,225 Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

Datorită raportului dintre grupările funcţionale libere: -COOH şi –NH2

proteinele se comportă fie ca acizi, fie ca baze. Disocierea grupărilor carboxil este cu atât mai intensă cu cât aciditatea mediului este mai redusă.

Gradul de disociere al grupărilor aminice este condiţionat de alcalinitatea mediului: cu cât concentraţia ionilor H+ este mai mică cu atât disocierea grupărilor amino este mai intensă, şi invers:

(H2N)m - R - (COOH)n (H2N)m - R - (COO-)n + nH+

51

Sarcina electrică globală a unei proteine este suma algebrică a sarcinilor pozitive şi negative şi care depinde de reacţia (pH-ul) mediului. În mediu alcalin proteina posedă o încărcare electrică negativă, iar în mediu acid o încărcare electrică pozitivă.

Pentru fiecare proteină există o concentraţie a ionilor de hidrogen la care suma algebrică a sarcinilor pozitive şi negative este egală cu zero, proteina fiind indiferentă faţă de curentul electric. Acest pH al mediului se numeşte punct izoelectric. La acest pH proteina precipită, deoarece are cea mai mică presiune osmotică şi cea mai mică solubilitate.

În consecinţă, proteinele în soluţii tampon cu pH corespunzător pHi pierd sarcinile electrice, devin neutre, nestabile şi precipită. Adausul de solvenţi organici (alcool, acetonă) favorizează precipitarea. pH-ul izoelectric reprezintă o constantă importantă deoarece fiecare proteină are un pHi caracteristic, de exemplu: hemoglobina = 6,8; caseina = 4,7 ; gelatina = 4,6. Determinarea punctului izoelectric al caseinei

Se urmăreşte precipitarea caseinei în raport de pH-ul unei serii de soluţii de acid acetic. Reactivi :

1. Soluţie de caseină 0,5%: 0,25g caseină pură se suspendă în 20 ml apă distilată, se adaugă apoi 5 ml NaOH 1N şi după neutralizare cu 5 ml acid acetic 1N se completează cu apă la 50 ml.

2. Soluţii de acid acetic: 1N, 0,1N, 0,01N. Tehnica de lucru

În 9 eprubete se prepară soluţiile indicate în tabelul de mai jos, se adaugă soluţia de caseină şi se agită. După 15 minute se notează gradul de precipitare din fiecare eprubetă. pH-ul eprubetei care prezintă precipitarea maximă corespunde punctului izoelectric al caseinei. Reactivi ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Acid acetic 0,01N 0,6 1,25 2,5 5,0 - - - - - Acid acetic 0,1N - - - - 1 2 4 8 - Acid acetic 1N - - - - - - - - 1,6 Apă distilată 8,4 7,75 6,5 4,0 8,0 7,0 5,0 1,0 7,4 Caseină 1 1 1 1 1 1 1 1 1,0 pH 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 1,5

R - NH3+ + OH-R - NH3]OH

52

IV.4. METODE IMUNOLOGICE DE ANALIZĂ

Metodele imunologice de analiză sunt metode de înaltă specificitate şi

sensibilitate care au la bază reacţia dintre antigen şi anticorp. Aceste metode sunt utilizate pentru determinarea cantitativă a unor substanţe aflate în concentraţii foarte mici în produsele biologice şi care, în plus, trebuie diferenţiate de alte substanţe cu structuri apropiate.

Antigenul este o moleculă recunoscută de limfocitul B şi împotriva căruia se dirijează producţia de anticorpi. Anticorpul este o imunoglobulină produsă de limfocitul B activat, în urma contactului cu un antigen. Determinarea complexelor imune circulante

Decelarea CI (complexe imune) diferă ca metologie în funcţie de localizarea acestora:

1. Decelarea CI tisulare (depuse). CI tisulare pot fi evidenţiate prin IFI pe secţiuni de ţesuturi, folosind seruri fluorescente anti-Ig şi anti-C, precum şi cu reactivi marcaţi cu enzime sau izotopi radioactivi.

2. Decelarea CI circulante (CIC). Complexele imune circulante, manifeste clinic prin diferite semne (urticarie, eritem nodos, arterite, glomerulonefrite, iridociclite, trombocitopenie, hemoliză, crioglobulinemie, coagulare intravasculară diseminată) se pot evidenţia in vitro prin două categorii de tehnici: tehnici independente de natura antigenului şi tehnici dependente de natura Ag.

A.Tehnicile independente de natura Ag se bazează pe (Mc Dougal, 1985 ): a. proprietăţile fizice ale CIC (tehnici de ultracentrifugare analitică,

precipitare cu polietilenglicol, precipitare crioglobuline), precipitatele obţinute fiind analizate ulterior prin tehnici de imunobiochimie ca IDRS (imunodifuzia radială simplă), dubla difuziune, imunofixarea;

b. fixarea complementului: inhibarea acţiunii hemolitice a complementului (activitatea anticomplementară a CIC), fixarea C1q pe CIC;

c. interacţiunea cu factorii reumatoizi; d. legarea de receptori celulari diverşi, receptori Fc, receptori pentru

complement, inhibarea rozetelor EAC receptori ai celulelor Raji. B. Tehnicile dependente de natura Ag (caracterizare epitopică) sunt posibile

pentru unele antigene bacteriene (streptococ), virale (Ag HBS), parazitare (schisostomiază) şi unele antigene tumorale (CEA).

Pentru standardizarea determinării CIC, se recomandă folosirea unui preparat de referinţă, internaţional sau propriu laboratorului.

Determinarea CIC se utilizeză pentru: - orientarea diagnosticului în cazul suspiciunii de boală mediată prin CIC, - pentru monitorizarea terapiei, - stabilirea prognosticului, - studierea patogenezei unor boli.

53

Utilitatea practică a determinării CIC, până în prezent, se limitează la: LES, glomerulonefrite, vasculite şi unele arterite.

Datorită heterogenităţii structurale a CIC, unele tehnici nu permit diferenţierea lor de Ig agregate.

Pentru o reală evaluare a rolului CIC în patogenia bolii, se recomandă determinarea lor prin mai multe metode şi urmărirea lor dinamică. METODA PEG

Metoda PEG foloseşte precipitarea pentru complexe imune circulante (metoda Haskova et al, modificată). Principiu

Complexele imune circulante (CIC), datorită dimensiunii lor mari, pot fi precipitate prin polimeri cu greutate moleculară mare, ca polietilenglicol (PEG), chiar la concentraţii mici ale complexelor. Materiale:

1. Tampon-borat pH 8,4; - Acid boric 0,1 M…6,18g; - Tetraborat de Na …25mM…9,53g; - Clorură de Na ….....75nM…4,38g; - Apă distilată…..................1000 ml;

Se păstrează la +40 C; 2. Soluţie Polietilenglicol (PEG6000);

- PEG6000…....................3,73g; - Tamponat borat …la 100 ml;

Se păstrează la +40C câteva luni; 3. Ser de cercetat: se poate păstra câteva zile la +40C;

Metoda de lucru. Pipetare .

Martor 2,9 ml tampon – borat; 0,1 ser de cercetat; 2,9 ml PREG sol. 3,75 g% 0,1 ml ser de cercetat . Păstrare la + 40C peste noapte .

Citire şi interpretare: Citirea se face la spectofotometru, faţă de apă, la o lungime de undă (λ) =

450 nm, în cuva de 1 cm. Calcul: ( Extincţia probei – Extincţia martor ) x 1000 . Valori normale: până la 70 unităţi densitate optică (UDO) ( Ionescu, 1986; Ţiţeica, 1984).

Pentru explicarea valorilor CIC peste limita normalului sunt de luat în consideraţie următorele:

a. fiabilitatea metodei de determinare CIC;

54

b. momentul determinării CIC în raport cu evoluţia afecţiunii: determinarea precoce poate găsi titruri crescute ale CIC înainte ca fenomenele de eliminare fiziologică a acestora din circulaţie să fie maxime;

c. intensitatea fixării tisulare şi a activităţii patologice a complexelor imune, în sensul că dozarea efectuată tardiv, la un pacient cu manifestări clinice interne, poate da o valoare normală a CIC, deoarece acestea s-au fixat deja la nivelul organului ţintă unde au amorsat procesul patologic.

IV.5. METODE DE SEPARARE IV.5.1.Centrifugarea

Centrifugarea este o operaţie care permite separarea rapidă a componentelor cu densităţi diferite aflate în amestec sub forma unei suspensii într-o fază lichidă. În funcţie de densitatea particulelor suspendate raportată la cea a fazei lichide suspensia se poate depune spontan pe fundul vasului formând un depozit numit sediment acoperit de faza lichidă numită supernatant (procesul numindu-se sedimentare), respectiv poate forma un strat de flotaţie care pluteşte deasupra fazei lichide (procesul numindu-se flotaţie). Fazele lichide pot fi îndepărtate prin aspirare sau decantare.

Centrifugarea se realizează cu ajutorul unor aparate numite centrifugi.

IV.5.2.Ultracentrifugarea Ultracentrifugarea reprezintă o separare a unor particule mici

(macromolecule, componente subcelulare, virusuri, etc.) utilizând acceleraţii de ordinul sutelor de mii de g. Ultracentrifugile sunt aparate de construcţie specială.

Pe baza vitezei de sedimentare se calculează constanta de sedimentare, care caracterizează comportamentul oricărei particule supuse ultracentrifugării. Pentru a putea compara constantele de sedimentare între ele se utilizează noţiunea de coeficient de sedimentare standard.

Viteza de sedimentare a eritrocitelor (VSE)

Determinarea VSE se bazează pe proprietatea eritrocitelor de a sedimenta in vitro într-o probă de sânge tratată în prealabil cu un anticoagulant. Material necesar:

1. Soluţie izotonică sterilă de citrat trisodic (3,8g/100ml apă distilată) 2. pipete şi stative Westergreen 3. tuburi gradate de 5 sau cel mult 10ml 4. materialul necesar pentru puncţie venoasă

55

Tehnica 1. Se repartizează câte 0,4ml soluţie izotonică de citrat trisodic în tuburi

gradate. Se pregătesc numai atâtea tuburi câte sunt necesare pentru ziua respectivă. Tuburile se ţin închise cu dopuri de cauciuc.

2. Peste soluţia de citrat trisodic se recoltează cu o seringă sau preferabil direct pe ac 1,6 ml sânge venos (până la nivelul de 2 ml). Se amestecă.

3. Se aspiră sângele citratat în pipetă Westergreen până la diviziunea 0mm. Această operaţie se execută pentru toate probele din ziua respectivă, după terminarea recoltării.

4. Se aşază pipetele Westergreen în stativ, în poziţie perfect verticală timp de o oră.

5. După o oră se face citirea. Rezultatul este reprezentat de distanţa până la care a coborât coloana de eritrocite exprimată în mm. Stabilitatea produsului este de 4-5 ore din momentul amestecării sângelui

cu soluţie de citrat trisodic. Valori normale:

- nou-născuţi 1-2mm - sugari 7-10mm - copii mici 7-11mm - bărbaţi 3-8mm - femei 6-11mm

VSE este o reacţie de disproteinemie, întrucât modificările sale sunt condiţionate de modificările cantitative ale fibrinogenului şi α-globulinelor.

Creşterea VSE se observă în: - infecţii acute şi cronice, - tumori maligne, - nefroze, - boli de colagen - unele hemopatii (în special în plasmocitom, macroglobulinemie,

leucemie acută, anemii hemolitice autoimune şi limfogranulomatoză).

- scăderea numărului de eritrocite - sarcină.

Încetinirea VSE este semnalată în: - policitemie, - unele boli de ficat de stază, prin insuficienţă cardiacă. - administrare de medicamente (corticoizi, salicilatul şi

tiosemicarbazona). Determinarea VSE ne poate furniza uneori informaţii suplimentare:

- plasma foarte deschisă la culoare indică lipsa de fier, - plasma de culoare galben-portocalie - bilirubinemie crescută, - un aspect tulbure lăptos al plasmei - o stare de hiperlipidemie - prezenţa unui strat opac albicios la partea superioară a coloanei de

eritrocite - indicaţie orientativă asupra creşterii numărului de leucocite

56

IV.5.3.Cromatografia Cromatografia este o metodă fizico-chimică modernă de separare, identificare şi determinare cantitativă a componentelor dintr-un amestec complex.

Cromatografia pe strat subţire (CSS) este o metodă care permite separarea componentelor unui amestec pe baza diferenţei lor de deplasare de-a lungul unui strat adsorbant (faza staţionară) sub acţiunea unui sistem de solvenţi (faza mobilă). Separarea aminoacizilor din urină prin cromatografie pe strat subţire

Separarea aminoacizilor din urină se face prin cromatografie pe strat subţire bidimensională, cu scopul de a diagnostica aminoaciduriile determinate de defectele enzimatice la nivelul metabolismului aminoacizilor. Reactivi

1. Faza staţionară: silicagel G depus în strat subţire pe o placă de sticlă 2. Faza mobilă:

a. prima migrare: developantul I (butanol: apă: piridină = 1:1:1) b. a doua migrare: developantul II (soluţie apoasă de fenol şi amoniac

0,5%). 3. Reactiv de culoare: soluţie acetonică de ninhidrină

Tehnica de lucru Proba de urină se pregăteşte prin trecerea unui volum de 10ml urină peste o răşină schimbătoare de ioni. Proba prelucrată anterior se aplică pe o placă cromatografică cu ajutorul unei pipete Pasteur la 0,5cm faţă de marginea plăcii. Se aplică volume mici şi după fiecare aplicare se aşteaptă evaporarea dizolvantului, astfel ca pata să nu depăşească 5mm în diametru. Se usucă 5 minute la etuvă, la 70 0C. Developarea plăcii

I. Prima migrare Se introduce placa cromatografică în camera cromatografică ce

conţine developantul I, astfel ca stratul de lichid să nu depăşească 3-4mm. Se acoperă camera şi se lasă placa până când frontul de migrare al developantului a ajuns la 0,5cm distanţă faţă de extremitatea superioară a plăcii. Se scoate placa şi se usucă timp de 5 minute la 70 0C.

II. A doua migrare Se introduce placa în camera cromatografică ce conţine

developantul II astfel ca migrarea să se facă în direcţie perpendiculară pe direcţia primei migrări. După ce developantul a migrat se scoate placa, se usucă 5 minute la 70 0C şi apoi se revelează spoturile prin pulverizarea peste placă a reactivului de culoare. Se usucă 5 minute la 700C până la apariţia spoturilor colorate.

57

Interpretarea rezultatelor Pentru interpretare se compară cromatogramele obţinute cu urina patologică cu cromatograma obţinută cu urina normală. Cromatograma obţinută cu urina normală prezintă 5 spoturi intense corespunzătoare glicocolului, serinei, alaninei, glutaminei şi histidinei. Tipul şi cantitatea aminoacizilor sunt modificate în aminoaciduriile ereditare. Există 5 categorii de aminoacidurii:

1. Aminoacidurii determinate de defecte enzimatice la nivelul metabolismului unui aminoacid.

Exemplu: fenilcetonuria, tirozinemia, urina cu miros de arţar (val, leu, ile), histidinemie, hiperprolinemie, hiperlizinemie. Denumirea bolii Enzima deficitară Aminoacizi proveniţi

din urină Fenilcetonurie Fenilalaninhidroxilaza

hepatică Fenilalanina

Tirozinemie Oxidaza acidului hidroxifenilpiruvic

Tirozina

Urina cu miros de arţar Decarboxilazele aminoacizilor ramificaţi

Valina, leucina, izoleucina

Histidinemie Histidinaza Histidina Hiperprolinemia Prolinoxidaza Prolina, hidroxiprolina Hiperlizinemie Lizin NAD- oxidoreductaza Lizina 2. Aminoacidurii determinate de boala nespecifică generalizată a tubilor renali

proximali. 3. Aminoacidurii determinate de transportul defectuos de la nivelul celulelor

jejunale şi a tubilor renali proximali. 4. Aminoacidurii determinate de producerea excesivă a unor metaboliţi

nefrotoxici (ex: galactozo-1P în galactozemie). 5. Aminoacidurii ce însoţesc bolile dobândite: necroza hepatică, distrofia

musculară, hipovitaminoza B, C, D, endocrinopatii, intoxicaţii cu metale grele şi compuşi organici.

IV.5.4.Electroforeza

Electroforeza este metoda cea mai accesibilă clinic pentru separarea macromoleculelor încărcate electric pe baza mobilităţii lor în câmp electric. În astfel de câmp, particulele încărcate pozitiv vor migra spre electrodul încărcat negativ (catod), iar cele încărcate negativ spre anod. Viteza de migrare este invers proporţională cu dimensiunea (greutatea) particulelor şi direct proportională cu sarcina lor electrică. Deci particulele cele mai uşoare şi mai puternic încărcate vor migra cel mai repede.

Utilizarea principală a electroforezei este separarea proteinelor, posibilă datorită grupărilor reziduale -COOH şi -NH2 ale aminoacizilor. Aceste grupări au

58

caracter amfoter şi pot fi încărcate electric, cu sarcini pozitive sau negative în funcţie de pH-ul tamponului folosit. La valori acide de pH, grupările carboxi (-COOH) sunt doar uşor ionizate, iar cele amino vor forma ioni -NH3

+, astfel că proteina va căpăta o sarcină pozitivă. În mediu alcalin, grupările amino vor fi uşor ionizate, iar cele -COOH vor forma ioni -COO-, conferind macromoleculei o sarcină negativă. Ţinând cont de multitudinea de grupări reziduale, cu grade diferite de afinitate pentru ionii H+ şi HO-, fiecare proteină se va încărca diferit în funcţie de pH-ul soluţiei. Punctul izoelectric corespunde unei valori de pH, caracteristic fiecărei proteine când sarcina electrică globală este zero.

Pentru proteinele plasmatice, se foloseşte o valoare pH de 8,5, păstrată constantă prin tamponul respectiv. Mai pot fi separate electroforetic lipoproteine, imunoglobuline, izoenzime şi hemoglobine.

Aparatul tipic de electroforeză este compus dintr-o cameră din material plastic (plexiglas) cu două compartimente separate în care se găseşte tamponul respectiv. În fiecare compartiment se găseşte câte un electrod din platină sau cărbune. Între cele două compartimente se găseşte suportul poros sau hârtia de filtru specială, îmbibate cu tampon. Probele se pun cu ajutorul unui aplicator, se închide ermetic şi se deschide circuitul electric permiţând migrarea o perioadă de timp în funcţie de suport. În ultimul timp s-a renunţat la hârtia de filtru (tip Whatman) din cauză că era necesară o perioadă de 16 ore pentru o migrare optimă, folosindu-se plăci prefabricate din gel de agar, amidon, poliacrilamidă. În cazul plăcilor, acestea trebuie să vină în contact cu tamponul prin aşa numitele fitile.

După încheierea timpului stabilit, se usucă rapid suportul migrat pentru a preveni difuzia, apoi se colorează cu un colorant apropiat. Ideal, colorarea fracţiunilor corespunde ca intensitate cu concentraţia fracţiunilor proteice, astfel că acestea pot fi citite cu un densitometru care este o variantă simplificată a unui spectrofotometru. Banda este mişcată cu o viteză constantă în faţa unui fascicol de lumină monocromatică, iar variaţiile absorbţiei sunt interpretate grafic pe o axă xy, obţinându-se direct fracţiunile proteice respective. Densitometrele mai noi au încorporate un integrator care măsoară suprafaţa fiecărei fracţiuni şi eliberează prin buletin direct concentraţiile fracţiunilor proteice. Desigur, în lipsa acestui densitometru se foloseşte vechea metodă de eluare.

A doua componentă a aparatului de electroforeză este sursa de curent electric continuu şi constant. În timpul electroforezei se produce căldură care scade rezistenţa electrică, determinând o migrare accelerată dacă se foloseşte un voltaj constant. Creşterea căldurii va accelera evaporarea mărind tăria ionică a tamponului. Sursa de curent este construită pentru a funcţiona la intensitate sau voltaj constant. Dacă se foloseşte varianta cu intensitate constantă, pe măsură ce migrarea decurge trebuie redus voltajul curentului.

În cazul separării izoenzimelor (creatin fosfokinazei, LDH, amilazei) după efectuarea electroforezei obişnuite, în loc de colorare, se va trata banda cu o soluţie conţinând substratul enzimei (anticorpii specifici), după care se execută reacţia de culoare specifică. Mare atenţie trebuie acordată tăriei ionice, μ, care este concentraţia însumată a ionilor tampon

59

ii ZC21 . , unde Ci este concentraţia unui ion, iar Zi, sarcina ionului.

Tăria ionică afectează norul de ioni ce înconjoară o particulă încărcată electric. Creşteri ale tăriei ionice scad mobilitatea ionilor, favorizează mărirea temperaturii, care poate denatura unele proteine termolabile.

Focalizarea izoelectrică este tot o variantă a electroforezei, în care particulele încărcate migrează pe un suport ce are un gradient continuu de pH. Proteinele individuale migrează în câmpul electric până ating o valoare pH corespunzătoare punctului izoelectric, când se opresc.

Electroforeza în gel de agaroză

Electroforeza în gel de agaroză este utilizată pentru a aprecia mărimea fragmentelor de ADN, obţinute prin digestie enzimatică sau a fragmentului obţinut prin metoda PCR. Prin această metodă se obţin fragmente de 0,1 – 2,5 kb (1 kilobază =1000 perechi de baze). Pentru fragmente mai mari, până la 10.000 kb se utilizează electroforeza în câmp pulsator.

Mobilitatea electroforetică a ADN-ului în gelul de agaroză depinde de o serie de factori.

Agaroza este un polizaharid extras din specii diferite de alge roşii. Moleculele de dizaharide polimerizate formează o reţea în care moleculele de ADN încărcate negativ, datorită resturilor fosfat, vor migra spre electrodul pozitiv (anod) în funcţie de : - porozitatea gelului ( variază în funcţie de concentraţia agarozei)

- masa moleculară a ADN - conformaţia ADN ( CCC-ADN, OC-ADN, ADN liniar ) - soluţia tampon utilizată pentru electroforeză - voltajul aplicat - prezenţa coloranţilor intercalaţi

Aceşti parametri acţionează împreună şi influenţează migrarea moleculelor de ADN în gelul de agaroză.

Concentraţia agarozei În geluri cu concentraţie diferită, fragmentele de ADN liniare migrează cu viteză diferită. Pentru separarea fragmentelor mari de ADN, se utilizează agaroză de concentraţii mici (0,3-0,5 %), în timp ce pentru separarea fragnementelor de ADN mici se utilizează agaroză de concentraţii mari (0,7-1%). Gelul de agaroză de 1% oferă o rezoluţie bună pentru vizualizarea fragmentelor de ADN între 500 şi 4000 pb (perechi de baze). Concentraţia agarozei utilizată pentru separarea fragmentelor de ADN de diferite mărimi:

60

Concentraţia agarozei (%) Mărimea fragmentelor (kb) 0,3 5-60 0,5 1-30 0,7 0,8-12 1,0 0,5-10 1,2 0,4-7 1,5 0,2-3 2,0 0,1-2

Tabel după Ausubel (1987) şi Sambrook (1989)

Moleculele liniare de ADN migrează în gelul de agaroză cu o viteză invers proporţională cu logaritmul masei moleculare. Moleculele mari migrează cu viteză mai mică, comparativ cu moleculele mici. Tamponul de electroforeză Mobilitatea electroforetică a moleculelor de ADN este influenţată de compoziţia şi puterea ionică a tamponului utilizat. În absenţa ionilor (dacă tamponul este omis din gel), conductanţa electrică este minimă şi fragmentele de ADN migrează cu viteză mică în gel. Tamponul cel mai utilizat pentru electroforeza probelor de ADN este TBE (Tris–Borat–EDTA) şi TAE (Tris–Acetat–EDTA). TAE are capacitate de tamponare mai mică decât TBE. Soluţiile tampon sunt preparate sub forma unor soluţii stoc concentrate 10X sau 5X.

Câmpul electric Câmpul electric aplicat nu trebuie să depăşească 8-10 V/cm (cm = distanţa măsurată între cei doi electrozi), pentru a obţine o separare electroforetică foarte bună. La diferenţe de potenţial mici, mobilitatea electroforetică a fragmentelor de ADN este proporţională cu intensitatea câmpului electric. Colorarea gelurilor de agaroză Pentru a permite vizualizarea probelor de ADN, gelurile de agaroză se colorează cu un colorant cât mai specific. Cel mai frecvent utilizat este bromura de etidiu, un colorant fluorescent, care reduce mobilitatea electroforetică a ADN-ului cu 15%. Acest colorant se intercalează între perechile de baze azotate făcând astfel, ca ADN-ul să fie mai rigid şi mai puţin mobil. Bromura de etidiu poate fi adăugată înainte sau după terminarea electroforezei. Este mai indicat să se adauge înainte de efectuarea electroforezei, în acest caz adăugându-se în concentraţie de 0,5 µg/ml la agaroza topită şi se mixează amestecul. După efectuarea electroforezei gelul se spală cu apă înainte de examinare pentru a îndepărta excesul de bromură de etidiu. Atenţie! Bromura de etidiu este o substanţă mutagenă şi foarte toxică, prin urmare se recomandă manipularea cu atenţie a acesteia. Complexul ADN – bromură de etidiu are o fluorescenţă mai mare comparativ cu a colorantului aflat singur în soluţie. Expunerea gelurilor colorate cu bromură de etidiu în lumină UV (la 254-366 nm) permite vizualizarea benzilor de ADN.

61

Imaginea gelului poate fi fotografiată cu un aparat polaroid. Lumina UV poate afecta negativ ochii şi pielea; se recomandă protejarea acestora în timpul utilizării luminii UV. Este necesar să adaptăm condiţiile de electroforeză în funcţie de circumstanţele speciale şi particularităţile experimentale, indiferent dacă electroforeza este pe verticală sau pe orizontală. Este mai convenabilă electroforeza pe orizontală, deoarece este mai uşor de manevrat, este mai stabilă, mai ales pentru concentraţii mai mici de 0,8 % ale agarozei.

Prepararea gelului de agaroză - Se cântăreşte cantitate exactă de praf de agaroză, care se dizolvă complet în

soluţia tampon specială - Amestecul se încălzeşte la 50-60ºC (într-un cuptor cu microunde) 2-4

minute, până se obţine un gel transparent. - Se pot adăuga coloranţi pentru vizualizarea benzilor de ADN. În acest sens

se poate utiliza bromfenol sau bromură de etidiu. Dacă se utilizează bromură de etidiu, benzile de ADN pot fi vizualizate cu ajutorul unui transiluminator. Gelul astfel iluminat se poate fotografia, cu aparate polaroide echipate cu filtru roşu pentru eliminarea razelor UV.

Redăm în continuare reţeta de preparare a gelului de agaroză de diferite concentraţii: gelul se prepară într-un pahar Erlenmeyer de 500 ml.

Concentraţia gelului

0,7% 1,0% 2,0%

Agaroză 1,05 g 1,5 g 3,0 g 20X TAE 7,5 ml 7,5 ml 7,5 ml Apă distilată 142,5 ml 142,5 ml 142,5 ml EtBr(5mg/ml) 25 µl 25 µl 25 µl Volumul total 150 ml 150 ml 150 ml

- Gelul transparent obţinut se toarnă în suportul pentru turnarea gelului astfel încât gelul să aibă o grosime de 3-5 mm. În suport se introduc pieptenii (cu rol în marcarea godeurilor în gel) înainte sau după turnarea gelului şi se aşteaptă polimerizarea gelului timp de 30-40 minute. - Se păstrează o distanţă de 0,5-1,0 mm de la baza godeului până la baza suportului pentru a permite formarea unui godeu optim şi pentru a împiedica scurgerea probelor (se evită prezenţa bulelor de aer în gelul de agaroză sau între godeuri). - După polimerizare se îndepărtează pieptenii şi se umple tancul de electroforeză cu soluţie tampon TBE sau TAE în aşa fel încât să acopere gelul de agaroză (soluţia tampon cu care se umple tancul de electroforeză trebuie să fie identică cu tamponul utilizat pentru prepararea gelului). - Se aplică probele de ADN (amestecate cu gel loading buffer) în godeuri. Vârful pipetei se introduce până la baza godeului şi se evacuează lent proba

62

(atenţie ca gelul să nu fie rupt cu vârful pipetei). După ce probele au fost aplicate pe gelul de agaroză aparatul de electroforeză nu se mai mişcă pentru a preveni amestecarea probelor între ele prin ieşirea din godeuri. - Aparatul de electroforeză se închide ermetic şi se deschide circuitul electric permiţând migrarea probelor. Electroforeza se desfăşoară la 1-10 V/cm, până când colorantul are o distanţă apreciabilă de migrare; aceasta depinde de mărimea fragmentului de ADN care urmează a fi vizualizat, de concentraţia gelului de agaroză. - După încheierea timpului stabilit pentru migrare, se scoate gelul de agaroză din aparatul de electroforeză, se spală bine apoi se usucă pentru a preveni difuzia. - Rezultatele migrării se citesc la transiluminator. Viteza de migrare, mobilitatea moleculelor de ADN în gel este în funcţie de masa moleculară. Moleculele cele mai uşoare şi cel mai puternic încărcate vor migra mai repede. - Distanţa de la etalon până în vârful fiecărei benzi se măsoară, această lungime corespunzând distanţei de migrare. Distanţa de migrare se împarte la lungimea gelului, astfel se calculează mobilitatea relativă. Se construieşte o curbă de migrare care arată masa moleculară a diferitelor molecule şi care se compară cu curba de migrare standard, pe care sunt reprezentate masele moleculare.

Electroforeza în gel de agaroză face posibilă separarea unor molecule de ADN foarte apropiate între ele din punct de vedere al greutăţii moleculare.(figura 9.). Moleculele cu greutate moleculară mai mare rămân aproape de godeuri, în timp ce moleculele cu greutate moleculară mai mică migrează la distanţă mai mare de godeuri.

Fig. 7.Electroforeza în gel de agaroză

63

Fig. 8. Reprezentare schematică a etapelor electroforezei în gel de agaroză

Fig. 9. Migrarea moleculelor de ADN în gelul de agaroză.

Electroforeza în gel de poliacrilamidă

Electroforeza în gel de poliacrilamidă ( gel de PAA ) este o metodă

importantă pentru separarea şi vizualizarea acizilor nucleici. Gelul de poliacrilamidă prezintă calităţi, ca flexibilitatea, transparenţa perfectă, stabilitatea chimică la variaţii mari de pH şi temperatură, rezoluţia ridicată, pentru care este des utilizat.

64

Porozitatea gelului poate fi controlată şi variată astfel încât să se obţină o separare eficientă a fragmentelor de ADN. Separarea fragmentelor are loc în funcţie de mărimea şi încărcarea lor. Electroforeza în gel de poliacrilamidă se bazează pe copolimerizarea acrilamidei cu bisacrilamida. Polimerizarea este iniţiată de persulfatul de amoniu, iar N,N,N’,N’- tetrametilen diamina ( TEMED ) are rol de catalizator al reacţiei.

Porozitatea gelului este influenţată de puritatea acrilamidei şi bisacrilamidei, de concentraţia acrilamidei în amestecul de polimerizare, de cantitatea de persulfat de amoniu şi TEMED utilizate, de temperatura de reacţie. Concentraţia acrilamidei se alege în funcţie de mărimea fragmentelor de ADN care urmează a fi separate.

Concentraţia acrilamidei în funcţie de mărimea fragmentelor de ADN care se separă:

Concentraţia acrilamidei ( % ) ADN ( pb ) 3,5 100-1000 5 80-500 8 60-400 12 40-200 15 25-150 20 6-100

După Sambrook ( 1989 )

Colorarea gelului de poliacrilamidă - prin utilizarea bromurii de etidium: se introduce gelul de poliacrilamidă timp

de 30-45 minute la temperatura camerei într-un amestec de tampon TBE X 1 şi bromură de etidium (0,5µg/ml)

- prin metoda de colorare argentică: se bazează pe legarea ionilor de argint de perechile de baze din ADN şi reducerea acestora la argint metalic în condiţii alcaline. Preexpunerea la formamidă determină creşterea senzitivităţii, în timp ce includerea complexului argint-tiosulfat de sodiu în imaginea developată descreşte colorarea nespecifică. Utilizarea unor concentraţii ridicate de formamidă în timpul developării imaginii determină apariţia unor benzi negre cu contrast foarte bun.

Prepararea propriu-zisă a gelului de poliacrilamidă

Echipament, materiale şi reactivi: - aparat pentru turnarea gelului de PAA - plăci de sticlă pentru turnarea gelului de PAA - spaţiatoare şi piepteni - aparat de electroforeză verticală - etanol - soluţie acrilamidă/bisacrilamidă TEMED - persulfat de amoniu 10 mg/ml

65

- tampon TBE X 10 (0,89 M Tris bază, 0,89 M acid boric, 20 mM EDTA) - tampon de încărcare 6X (0,25% brom fenol blue, 0,25% xylene cyanol FF, 30%

glicerol) Prepararea gelului de PAA - se curăţă cu un detergent plăcile de sticlă între care se va turna gelul de PAA,

spaţiatoarele, pieptenii; se spală apoi cu apă distilată - se spală plăcile cu etanol 95% şi se usucă - se asamblează plăcile de sticlă pentru turnarea gelului utilizând spaţiatoarele - se asamblează aparatul pentru turnarea gelului de PAA - se adaugă 35 µl TEMED şi 80 µl persulfat de amoniu la 100 ml soluţie

acrilamidă/bisacrilamidă (acestea se prepară în funcţie de concentraţia dorită) şi se amestecă. TEMED acţionează ca şi catalizator al reacţiei de polimerizare, iar persulfatul de amoniu acţionează ca şi iniţiator al reacţiei de polimerizare.

- se aplică soluţia obţinută între plăcile de sticlă separate de spaţiatoare cu ajutorul unei seringi (este importantă turnarea continuă a gelului pentru a evita formarea bulelor de aer)

- se introduc pieptenii în gelul de PAA între cele două plăci de sticlă (dacă s-au format bule de aer acestea trebuie îndepărtate utilizând o seringă cu tampon)

- gelul de PAA polimerizează în 60 minute la temperatura camerei şi poate fi depozitat 1-2 zile la 4ºC (peste gelul de PAA se adaugă tampon TBE X 1 pentru a împiedica uscarea gelului).

Efectuarea electroforezei în gel de poliacrilamidă - se scot plăcile de sticlă care conţin gelul de PAA din dispozitivul de turnare şi

se fixează în aparatul de electroforeză - se adaugă tampon electroforeză 1X - se îndepărtează pieptenii şi se umple godeurile formate şi tancul de

electroforeză cu tampon 1X (este importantă utilizarea aceluiaşi tampon de electroforeză atât în gelul de PAA cât şi ca tampon de migrare, deoarece diferenţe mici în ceea ce priveşte puterea ionică şi pH-ul determină migrare distorsionată a fragmentelor de ADN)

- înainte de aplicarea probelor se rulează gelul de PAA la 60W timp de 30 minute pentru a echilibra gelul de PAA

- se amestecă probele cu gel loading buffer şi se aplică 3-5 µl în godeuri utilizând o seringă

- se rulează gelul la 60W până când brom fenol blue migrează afară din gel - se opreşte electroforeza şi se scoate gelul de PAA cu atenţie dintre cele două

plăci de sticlă - se colorează gelul de PAA cu bromură de etidium, etapă urmată apoi de

fotografierea gelului sau se colorează gelul de PAA prin metoda de colorare argentică, etapă urmată de uscarea gelului de PAA la 80ºC timp de o oră, între două hârtii de filtru, utilizând un aparat de uscare al gelurilor

66

Determinarea masei moleculare relative a acizilor nucleici prin metoda electroforetică

Principiul metodei: Electroforeza, după cum se cunoaşte, este influenţată de o serie de factori: pH-ul tamponului, tăria ionică, compoziţia tamponului, înălţimea coloanei de gel, lungimea plăcii de gel, temperatura de lucru, concentraţia gelului, concentraţia şi cantitatea probelor. Forţa ce se aplică unui ion este direct proporţională cu sarcina, determinată de pH-ul mediului şi de natura particulei. Echilibrul dinamic dintre forţa electrică şi forţa de reţinere, produsă de mişcarea unei particule de o anumită formă şi mărime într-un mediu suport cu o porozitate dată, exprimă mobilitatea particulei. Mărind tăria ionică, ionii tamponului vor transporta mai mult curent, ceea ce va duce la frânarea mobilităţii macromoleculei de unde şi separarea va fi mai bună, mai netă. Dintre cele mai utilizate suporturi pentru electroforeza acizilor nucleici şi a ribozomilor amintim agaroza, poliacrilamida şi amestecul de agaroză şi poliacrilamidă. Mobilitatea electroforetică în gel de agaroză, poliacrilamidă sau amestec de agaroză şi poliacrilamidă a acizilor nucleici este o funcţie lineară a logaritmului masei lor moleculare. Metoda electroforezei în gel este cea mai simplă şi economică pentru determinarea masei moleculare a acizilor nucleici. În practică această metodă are nevoie doar de markeri cu masă moleculară cunoscută. Echipament, materiale şi reactivi : - agaroză - tampon pentru electroforeză (Tris 0,01 M; acetat de sodiu 0,02 M; NaCl 0,01M;

EDTA =,001 M, pH = 7,5) - acizi nucleici cu masa moleculară cunoscută (markeri) - acizi nucleici cu masa moleculară necunoscută - aparat pentru electroforeză orizontală Mod de lucru: - Prepararea gelului de agaroză: se dizolvă prin fierbere 0,3 g agaroză în 30 ml

tampon pentru electroforeză. Soluţia obţinută se răceşte la 60C şi apoi se introduce în celula specială a aparatului. Pentru a grăbi întărirea gelului celula se va introduce în frigider la +4C.

- Aplicarea probelor: în primele godeuri - marcate cu ajutorul pieptenelor - , se aplică probele de acizi nucleici cu masa moleculară cunoscută, iar în următoarele probele de acizi nucleici cu masa moleculară necunoscută.

- În cutia aparatului de electroforeză se introduc 275 ml din soluţia tampon - Introducerea celulei în aparatul de electroforeză, după care celula se conectează

la electrozii aparatului de electroforeză cu ajutorul unor benzi de hârtie de filtru îmbibate în tamponul de electroforeză

67

- În cazul tamponului cu care se lucrează, migrarea acizilor nucleici se va face la 150 volţi şi aproximativ la 7-8 mA timp de 2 ore.

- Punerea în evidenţă a acizilor nucleici se poate face prin mai multe mijloace. - Cea mai sensibilă metodă constă în imersia gelului timp de 15 minute într-

o soluţie de bromură de etidiu (0,5 g/ml), după care se examinează gelul în lumina ultravioletă produsă de o lampă specială.

- A doua metodă mai puţin sensibilă este colorarea cu albastru de toluidină, în acest caz gelul se imersează 30 de minute într-o baie de 0,2% albastru de toluidină. Excesul de colorant se îndepărtează prin spălare cu apă. - Evaluarea masei moleculare:

O dată localizate benzile acizilor nucleici se vor măsura distanţele migrate (de la start), de către moleculele cu masă moleculară cunoscută (markeri) şi de către moleculele cu masă moleculară necunoscută. Se reprezintă grafic logaritmul masei moleculare în funcţie de mobilitatea acizilor nucleici de referinţă (markeri), iar din acest grafic se va determina masa moleculară a unui acid nucleic necunoscut.

Identificarea ADN plasmidial aflat în diferite conformaţii moleculare prin metoda electroforezei în gel de agaroză

Principiul metodei: Plasmidele sunt elemente genetice extranucleare şi extracromozomiale, prezente atât în celula procariotă cât şi în cea eucariotă. Ele se utilizează mai ales ca vectori de clonare. Moleculele de ADN plasmidial aflate în conformaţie moleculară de tip I sau de cerc covalent închis (CCI) au o activitate electroforetică mai mare decât cele aflate în conformaţie liniară, de tip III sau de cerc deschis (CD), de tip II. Prin urmare mobilitatea moleculelor în funcţie de conformaţia moleculară variază în ordinea:

CCI > liniar > CD.

Fig. 10. Diferite conformaţii de ADN plasmidial: a. tipul CCI b. tipul CD

c. tipul liniar

68

Echipament, materiale şi reactivi: 1. ADN plasmidial extras prin tehnicile descrise în lucrările anterioare 2. Aparat de electroforeză, cu celulă orizontală sau verticală. 3. Agaroză 4. Tampon de migrare: Tris 89 mM, EDTA 2,4 mM, H3BO3 89 mM, pH=8 5. Soluţie de bromură de etidiu 0,5 mg/ml Prepararea gelului de agaroză: Se cântăreşte agaroza pentru a obţine 30 ml soluţie de 0,6 %. Agaroza se introduce într-un pahar Erlenmeyer şi se adaugă 30 ml soluţie tampon. Amestecul se încălzeşte pe baia de apă până se topeşte agaroza. Soluţia se răceşte la 45-50ºC şi se introduce într-o celulă specială având dimensiunile de 120 x 80 x 2,5 mm. Pentru o bună gelificare, celula conţinând soluţia de agaroză se lasă la 4ºC timp de 30 de minute. Migrarea electroforetică: ADN plasmidial se introduce într-un godeu de gel, în celelalte godeuri se pun probe de ADN cu conformaţie moleculară cunoscută. Se porneşte circuitul electric la 8V/cm (cm = distanţa măsurată între cei doi electrozi) şi se lasă probele să migreze timp de 2 ore. Examinarea ADN După terminarea electroforezei gelul se introduce în soluţia de bromură de etidiu, timp de 15 minute. După acest timp probele se examinează în lumină ultravioletă, folosind filtre adecvate (fig.11.). ADN apare sub forma unui spot colorat în roşu, datorită complexului ce se realizează între ADN şi bromura de etidiu. Se măsoară distanţa de la start până la diferitele molecule, astfel determinând masele moleculare ale diferitelor molecule de ADN.

a. b. c. Fig. 11. Electroforeză în gel de agaroză pentru identificarea difiretelor conformaţii

de ADN plasmidial a. tipul CCI monocatenar; b. tipul CCI bicatenar; c. ADN cromozomial

69

IV.6. TESTE RAPIDE DE INVESTIGARE

Una din importantele achiziţii ale metodologiei moderne în chimia clinică este introducerea, dezvoltarea şi aplicarea pe scară largă a testelor rapide, denumite Schnell-Testen, screening - test, teste express, bed-side tests, side-room tests, such-testen şi a procedeelor simplificate, cu valoare orientativă în abateri de la normal a compoziţiei biologice curent explorate în sânge, urină, LCR.

Creşterea în fiecare an a numărului de analize solicitate în practica medicală a impus ca o necesitate actuală degrevarea laboratorului de chimie clinică de balastul analizelor, prin introducerea acestor teste rapide.

Testul rapid este o investigaţie de chimie clinică care furnizează rezultate calitative sau semicantitative, într-un timp scurt şi un mod foarte simplu, folosindu-se reactivi gata pregătiţi impreganţi pe hârtii sub formă de stixuri, tablete sau pulberi de testare.

Majoritatea testelor se bazează pe câteva principii simple, în toate cazurile reactivii fiind conţinuţi în stare solidă şi uscată.

Principalele variante se bazează pe folosirea de benzi de hârtie impregnate cu reactivi, tablete sau comprimate de substanţe reactive, pulberi uscate din substanţe reactive, hârtii reactive.

Aceste forme se găsesc în comerţ sub denumiri diferite în funcţie de firma care le livrează şi de componentul sau reacţia cărora li se adresează. Avantajele testelor rapide

Prin introducerea testelor rapide şi a procedeelor simplificate se realizează câteva avantaje care trebuie subliniate în mod special:

• Se poate efectua investigarea orientativă în condiţii de dotare redusă, fără aparatură (în mediu rural, puncte sanitare, serviciu de urgenţă).

• Simplificarea şi înlăturarea efectuării unor analize inutile, a unor analize laborioase.

• Scurtarea timpului de lucru cu reducerea consumurilor specifice de reactivi.

• Pot fi executate în majoritatea lor fără pregătire de specialitate.

Testele rapide pe care nu este înregistrată data de expirare nu trebuie să fie acceptate. Se recomandă în mod special respectarea condiţiilor de manipulare şi conservare indicate de instrucţiunile care însoţesc testele rapide. Modul de utilizare a testelor rapide

După cum am văzut, principalele variante se bazează pe folosirea de: • Benzi de hârtie impregnate cu reactivi, cele mai multe sub formă

de vergeluţe (stixuri sau stripsuri) din material plastic care prezintă la un capăt hârtia impregnată cu reactivi. Stixurile pot să fie monoreactive sau polireactive.

• Tablete sau comprimate de substanţe reactive • Hârtii reactive

70

Expunerea fiecărui test în parte se face după un plan unitar valabil pentru utilizarea stripsurilor sau tabletelor în general menţionând la fiecare test în parte ceea ce are în particular.

Schema de expunere cuprinde: principiul, tehnica sau modul de folosire, sensibilitatea, specificitatea, stabilitatea şi observaţii când este cazul. Ca aspecte comune trebuie subliniate recomandările pentru manevrarea testelor, şi anume:

• se previne a nu se atinge cu mâna aria reactivă a stixului. • în cazul tabletelor, acestea se apucă cu pensa pentru a fi scoase

din conţinător. Ca mod de utilizare, comun pentru toate stripsurile, se introduce capătul

reactiv al stixului pentru scurt timp (1-2 secunde) în vasul de analizat; dacă se prelungeşte timpul de imersare componentele reactive se pot pierde prin dizolvare şi reacţia apare fals negativă. Se scoate apoi stripsul şi se presează capătul imersat de peretele vasului conţinător. Manevra este absolut necesară, în special la testele bazate pe reacţii în care intervine oxigenul, pentru a nu fi împiedicat accesul oxigenului atmosferic cerut pentru oxidare, cum este cazul testelor pentru detectarea glicozuriei prin reacţia enzimatică. Citirea se face după 1 minut, comparându-se aria de testare cu scala de evaluare de pe flacon.

În cazul tabletelor sau comprimatelor reactive, se picură 5 picături de lichid biologic de analizat în eprubeta de testare (uscată). Se clăteşte pipeta cu apă distilată şi apoi se picură 10 picături de apă distilată. Se introduce o tabletă reactivă care se dizolvă. Se agită tubul uşor şi se compară culoarea conţinutului cu scala intensităţilor de culoare.

71

V. ANALIZA BIOCHIMICĂ A VITAMINELOR

Pentru analiza vitaminelor se pot aplica metode fizico-chimice şi biologice. Cele biologice au avantajul specificităţii, dar sunt mai greu de efectuat (necesită animale de experienţă, culturi de microorganisme şi un timp mai îndelungat), de aceea se aplică, cel puţin orientativ, metodele fizico-chimice care corespund analizei preparatelor farmaceutice, alimentelor şi lichidelor biologice.

V.1. REACŢII PENTRU CAROTINOIDE ŞI VITAMINELE A Identificarea carotenoidelor şi vitaminelor A cu SbCl3 Reacţia CARR-PRICE Principiu

Se cunosc reacţii comune datorate catenei polienice care în prezenţă de fenoli, acizi minerali sau organici, a clorurilor acide generează compuşi coloraţi. Cea mai uzuală este reacţia de culoare cu SbCl3 ( reacţia Carr-Price). Reactivi:

1.Soluţie uleioasă de vitamina A sau ulei de peşte; 2.Soluţie cloroformică saturată de SbCl3; 30g clorură de stibiu se agită timp

de 2 ore cu 70 ml cloroform într-o sticlă cu dop rodat. Reactivul se poate folosi timp de o săptămână. Tehnica de lucru

Într-o eprubetă peste 4-5 picături de soluţie de analizat (vitamina A sau ulei de peşte) se adaugă 1ml soluţie cloroformică de clorură de stibiu şi se observă apariţia unei coloraţii albastre. Observaţii

1. Mulţi compuşi prezenţi în grăsimile naturale (de ex. Acizii graşi polinesaturaţi) interferează cu vitamina A şi falsifică rezultatele, de aceea se recomandă eliminarea lor prin saponificare .În acest scop se fierbe produsul de analizat cu KOH, soluţie alcoolică sau apoasă, după caz şi se extrage cu eter care ulterior se evaporă şi reziduul se reia cu cloroform ( soluţiile pure sau farmaceutice nu necesită aceste operaţii).

2. Reacţia este dată şi de către produşii de oxidare ai clorofilei, iar vitamina D dă o reacţie cu o culoare diferită.

3. Urmele de apă transformă triclorura de stibiu în oxiclorură care nu reacţionează cu vitamina A şi de aceea este absolut necesar să se lucreze în eprubete uscate şi cu reactivi lipsiţi de apă sau să se adauge câteva picături de anhidridă acetică.

4. Reacţia se pretează determinării cantitative a vitaminei A, prin măsurarea intensităţii albastre la 620 nm. Pentru această determinare s-au construit

72

colorimetre speciale Lovibond, etalonate pentru culoarea albastră şi care au condus la stabilirea unităţilor Lovibond sau unităţi albastre. Identificarea vitaminei A cu acid tricloracetic

Se pipetează într-o eprubetă 4-5 picături soluţie uleioasă de vitamina A şi se adaugă 1 ml soluţie cloroformică de acid tricloracetic (30 g acid tricloracetic dizolvat în 100 ml cloroform); apare imediat o culoare galbenă care trece în albastru.

Dozarea vitaminei A Principiu

Molecula vitaminei A se oxidează cu dicromat de potasiu în mediu acid şi se dozează excesul de dicromat spectrofotometric.

Reactivi: 1. Soluţie de vitamina A de dozat; 2. Soluţie de dicromat de potasiu 0,01N; 3. HCl conc; 4. KI 10%; 5. Tiosulfat de sodiu 0,01N; 6. Amidon (indicator);

Tehnica de lucru Într-un balon prevăzut cu refrigerent ascendent se introduc 0,1 ml soluţie de

vitamina A, 14 ml apă, 40 ml dicromat şi 2 ml HCl conc. şi se fierbe amestecul timp de o oră. După răcire se iau în 4 baloane Erlenmeyer câte 14 ml, din soluţia din balon, care se vor titra. În fiecare balon se adaugă 5 ml KI 10% şi se titrează cu tiosulfat de sodiu în prezenţă de amidon ca indicator. Calcul

Vit.A (mg/100ml) = (10-N) x 0,00008 x 1,0316 x 4000 x 1,001 Unde: 1,001 – factor de corecţie N – numărul de ml tiosulfat folosit la titrare Vit.A (mg/100ml) = (10-N) x 0,33

Cunoscând că o unitate internaţională de vitamina A este echivalentă cu

0,344g acetat de vitamina A sau 0,3g vitamina A alcool pură, valoarea găsită în mg se poate exprima în U.I.

73

V.2. REACŢII PENTRU PROVITAMINELE ŞI VITAMINELE D Reacţia Liebermann-Burchard Principiu

Soluţia cloroformică de vit.D în prezenţa anhidridei acetice şi a acidului sulfuric concentrat dă naştere unei culori, care virează de la roz-violaceu la albastru şi apoi la verde. Reactivi:

1. Soluţie cloroformică de provitamina D sau de vitamina D: 0,5 g la 100 ml; 2. Anhidridă acetică; 3. Acid sulfuric concentrat

Tehnica de lucru La 1 ml soluţie de vitamina sau provitamina D se adaugă 1 ml anhidridă

acetică şi 5 picături de acid sulfuric; se observă o coloraţie roşie care trece în final în verde.

Reacţia nu este specifică, deoarece este dată şi de compuşii sterolici. Reacţia cu anilina HCl

Vitaminele din grupul D, în prezenţa anilinei şi a HCl dau o coloraţie roşie. Într-o eprubetă se ia 1 ml soluţie de vitamina D sau ulei de peşte şi se adaugă câteva picături de soluţie anilină-HCl (părţi egale de anilină şi HCl) şi se observă apariţia unei coloraţii roşii. Reacţia CARR-PRICE

1ml soluţie cloroformică de vitamina D 0,5% se tratează cu 4 ml soluţie cloroformică de clorură de stibiu şi se obţine o culoare galben-portocalie, diferită de culoarea albastră pe care o dă vitamina A în aceleaşi condiţii. Identificarea vitaminelor D cu aldehide aromatice

Vitaminele D în prezenţa aldehidelor aromatice (vanilina, furfurol, aldehida anisdinică) şi în prezenţa acidului percloric dă compuşi coloraţi. Reacţia efectuată în condiţii bine specificate permite şi determinarea cantitativă a vitaminelor D. Reactivi:

1. Soluţie de vit.D în benzen 2. Soluţie de aldehidă aromatică 0,1 g% în benzen 3. Acid acetic glacial 4. Reactiv percloric: 2 ml aldehidă acetică, 2,5 ml acid acetic glacial şi 0,5

ml soluţie 70% de acid percloric se încălzesc la 95-1000C timp de ½ oră.

74

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se pipetează 1 ml soluţie benzenică de vitamina D şi 1 ml

soluţie aromatică în benzen şi se încălzesc la fierbere în baie de apă. Se adaugă 2 picături reactiv percloric şi se fierbe încă 1 minut, apoi se lasă să se răcească la temperatura camerei. La soluţia tulbure verde se adaugă 1,5 ml acid acetic glacial şi se urmăreşte culoarea formată.

Diferenţierea între vitaminele D2 şi D3

Vitaminele D2 şi D3 dau culori diferite cu acidul sulfuric concentrat. În două eprubete se iau câte 1ml soluţie alcoolică 0,1% de vitamina D2 şi,

respectiv soluţie alcoolică 0,1% vitamina D3 şi apoi se adaugă în fiecare eprubetă câte 2 picături apă, după care se adaugă cu precauţie pe pereţii eprubetei câte 1 ml acid sulfuric concentrat. La zona de contact apare o culoare portocalie ce trece în roşu pentru vitamina D2, în timp ce vitamina D3 dă o coloraţie galbenă.

V.3. DOZAREA VITAMINEI PP

Vitamina PP se precipită în mediu neutru cu o soluţie de sulfat de cupru, iar excesul se determină iodometric. Reactivi:

1. Soluţie vit.PP: 0,5-1 g la 100 ml 2. Soluţie fenolftaleină 1 g la 100 ml alcool 3. Soluţie NaOH 0,1N 4. Soluţie CuSO4 1 g la 100 ml apă distilată 5. Soluţie HCl 10 g % 6. Soluţie KI 10 g% 7. Soluţie tiosulfat de sodiu 0,01N 8. Soluţie amidon 1 g la 100 ml apă distilată

Tehnica de lucru

Se pipetează într-o eprubetă 2,5 ml soluţie de vitamina PP de dozat şi în altă eprubetă (martor) 2,5 ml apă. În fiecare eprubetă se adaugă NaOH 0,1N, cu picătura, până la virajul indicatorului fenolftaleină în roz-pal şi apoi câte 2 ml soluţie de sulfat de cupru 1%. După 30 de minute de repaus se filtrează prin filtru de hârtie, spălând de 2-3 ori fiecare eprubetă cu câte 2 ml apă şi adunând filtratele

N

OCu

O O

N

O

precipitat albastru

75

în 2 flacoane Erlenmeyer. În fiecare se adaugă 1 ml HCl 10% şi 2 ml KI 10%. Iodul eliberat se titrează cu tiosulfat 0,01 N, în prezenţă de amidon până la incolor. Calcul

N – ml folosiţi la titrarea martorului n – ml folosiţi la titrarea probei cu vit.PP

Vit.PP (g/100ml) = (N-n) x 0,002462 x 40

V.4. REACŢII PENTRU IDENTIFICAREA ŞI DOZAREA VITAMINEI C

Identificarea vitaminei C cu azotat de argint

Într-o eprubetă la 1 ml sol.0,5% de acid ascorbic se adaugă 0,5 ml acid azotic 10% şi 0,3 ml azotat de argint 2%, observându-se apariţia unui precipitat cenuşiu (Ag metalic).

Identificarea vitaminei C cu nitroprusiat de sodiu

1 ml sol.5% de vit.C se tratează cu 4 picături de nitroprusiat şi 3 picături de NaOH 10%, observându-se apariţia unei coloraţii galben-verzui, care la adăugare de acid acetic 10% trece în albastru-violet. Dozarea vitaminei C prin metoda iodometrică

Reacţiile folosite uzual în scopul evidenţierii şi dozării vitaminei C se bazează pe proprietăţile sale reducătoare. Acidul ascorbic are proprietatea de a reduce soluţia de iod 0,01N. Această metodă de dozare a vitaminei C serveşte la dozarea vitaminei din preparatele farmaceutice şi din extractele vegetale. Reactivi:

1. Soluţie de vitamina C 2. Soluţie de iod 0,01 N 3. Soluţie amidon

Tehnica de lucru Într-un balon Erlenmeyer se iau 10 ml soluţie de vitamina C şi se titrează cu

iod în prezenţă de amidon, până la persistenţa culorii albastre. Se notează cu N – numărul de ml de iod folosiţi la titrare. Calcul

Vit.C (mg/100ml) = N x 0,88 x 10

76

Dozarea vitaminei C din sânge şi urină prin metoda ROE şi Kuether Principiu

Acidul ascorbic este oxidat în prealabil la acid dehidroascorbic cu ajutorul noritului (cărbune animal activat). Acidul dehidroascorbic reacţionează cu 2,4-dinitrofenilhidrazina în prezenţa acidului sulfuric formând un compus colorat. Reactivi:

1. Norit: 100g norit se suspendă în 500ml HCl 10% se încălzeşte la fierbere şi se filtrează la vid. Sedimentul se reia cu 50ml apă distilată şi se filtrează din nou. Operaţia de spălare se repetă până când filtratul dă o reacţie negativă sau foarte slabă pentru ionul Fe (III). Se usucă 24 de ore la 110-1120 C.

2. Soluţie de acid tricloracetic 7%, ATA. 3. Soluţie etalon de acid ascorbic: 100mg acid ascorbic se dizolvă în 100ml

ATA 7% 4. Soluţie tiouree 5,5% în amestec hidroalcoolic (alcool : apă, 1:1) 5. Soluţie 2,4-dinitrofenilhidrazină 2% în acid sulfuric 9N 6. Acid sulfuric 9N

Tehnica de lucru La 1,5 ml sânge recoltat pe oxalat se adaugă 6ml ATA şi un vârf de spatulă de norit. Se agită şi după 10 minute se filtrează. Urina se diluează cu ATA în proporţie de 1:10. La 0,5ml urină se adaugă 9,5ml ATA şi un vîrf de spatulă de norit, se agită şi se filtrează după 10 minute. Proba etalon se obţine tratând 0,5ml soluţie etalon (reactivul 3) cu 9,5ml ATA şi un vârf de spatulă de norit. Se agită şi se filtrează după 10 minute. Filtratul conţine 50 μg acid ascorbic pe ml. În continuare se pregătesc 4 eprubete astfel: Reactivi (ml) E1 E2 E3 M Filtrat sanguin 2 - - - Filtrat de urină - 2 - - Filtrat din soluţia etalon - - 1 - ATA - - 1 2 Tiouree 2 picături 2 picături 2 picături 2 picături DNFH 0,5 0,5 0,5 0,5 Eprubetele se ţin 2 ½ ore la 37 0C şi apoi se plasează într-o baie de gheaţă H 2SO4 85% 2,5 2,5 2,5 2,5 După 20 de minute se citesc extincţiile primelor 3 eprubete faţă de martor. Calcul Ascorbemia (mg%) = 12,5 x E1 / E3 Ascorburia (mg%) = 500 x E2 / E3.

77

V. 5. REACŢII DE IDENTIFICARE ŞI DOZARE A VITAMINEI B1 Identificarea vitaminei B1 sub formă de tiocrom Identificarea vitaminei B1 se bazează pe oxidarea tiaminei sub acţiunea hexacianoferatului (III) de potasiu în mediu alcalin, la tiocrom, compus ce prezintă o fluorescenţă albastră.

H3C

N

N

N

SNH2

CH3

CH2CH2OH

+

N

N

N

SN

CH3

CH2CH2OH

H3C

K3[Fe(CN)6]

tiamina tiocrom Reactivi:

1. soluţie de tiamină 1% 2. hexacianoferat de potasiu 5% 3. NaOH 10% 4. HCl 10% 5. alcool butilic sau amilic

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se tratează 1 ml soluţie vitamină B1 cu 0,5ml NaOH şi 0,5ml hexacianoferat de potasiu. Se adaugă apoi 1ml butanol şi se agită puternic. În stratul alcoolic apare o fluorescenţă albastră care dispare prin acidulare şi reapare la alcalinizare. Dozarea vitaminei B1 prin diazotare

Metoda se bazează pe reacţia de diazotare-cuplare pe care vitamina B1 o dă cu acidul diazo-benzensulfonic, cu formarea unui compus colorimetrabil. Adausul de aldehidă formică sau alcool butilic stabilizează culoarea, în timp ce substanţele reducătoare (cisteina, ionii de cupru, mercur, argint) deranjează reacţia. Reactivi:

1. Soluţie de vitamină B1 2. Soluţie etalon de vitamină B1 : 0,2mg/ml 3. Reactivul diazobenzensulfonic:

Soluţia A: 0,45g acid sulfanilic se tratează cu 4,5ml HCl concentrat şi aproximativ 40ml apă distilată. Se încălzeşte pe baie de apă până la dizolvare, iar după răcire se aduce la un volum de 50ml.

Soluţia B: se prepară extemporaneu prin dizolvarea a 0,9g NaNO2 în 20ml apă distilată.

78

Soluţia C: se prepară extemporaneu la gheaţă. Se iau 3ml din soluţia A şi 3ml din soluţia B. După 5 minute se completează cu apă la 100ml.

4. Soluţie alcalină: 100ml NaOH 1N se amestecă cu 100ml NaHCO3 5,76g%. 5. Formol.

Tehnica de lucru Se pregătesc 3 eprubete conform tabelului următor: Reactivi (ml) P S M Soluţie de vitamină B1 0,5 - - Soluţie etalon de vitamină B1 - 0,5 - Apă bidistilată - - 0,5 Reactiv C 3 3 3 Soluţie alcalină 7 7 7 Formol 0,2 0,2 0,2 După o oră de repaus se citesc extincţiile probei de dozat şi a standardului faţă de martor la 530nm. Calcul vitamină B1 (ml/100ml) = Ep / Es x 20

79

VI. ANALIZA BIOCHIMICA A PROTEINELOR

Proteinele sunt componente fundamentale ale materiei vii. Ele pot fi clasificate după produşii rezultaţi în urma procesului de hidroliză în: a. Holoproteine care dau prin hidroliză numai aminoacizi:

1. Fibrilare: colagen, elastină, keratine, etc. 2. Globulare: albumine, globuline, etc.

b. Heteroproteine care prin hidroliză dau pe lângă aminoacizi şi componente neproteice (prostetice), de ex. nucleoproteide, mucoproteide, fosfoproteide, cromoproteide, metaloproteide, lipoproteide.

Aminoacizii constituie unitatea de bază care intră în structura tuturor proteinelor. Identificarea proteinelor şi respectiv a aminoacizilor se bazează pe următoarele tipuri de reacţii:

- reacţii generale datorate grupărilor funcţionale ale aminoacizilor: carboxil şi amino.

- reacţii datorate radicalilor din molecula aminoacizilor şi care sunt, de obicei specifice pentru aminoacizii care au radical diferit.

VI.1. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR

REACŢIA NINHIDRINEI

Reacţia ninhidrinei constituie o reacţie de grup pentru compuşii cu grupări aminice libere (culoare albastră) şi proteine (culoare violetă). Prin încălzirea soluţiei unui aminoacid în prezenţa ninhidrinei are loc iniţial o dezaminare oxidativă şi o decarboxilare a aminoacidului. Se formează astfel o aldehidă, NH3 şi CO2. Ninhidrina este redusă la hidridantină şi în etapa următoare are loc condensarea unei molecule de ninhidrină cu hidridantină şi NH3, cu formarea unui complex albastru–violet.

Reacţia are o mare sensibilitate, de aceea poate fi utilizată la evidenţierea aminoacizilor separaţi prin cromatografie, evidenţierea eliminării urinare crescute a aminoacizilor, dozarea proteinelor pe baza intensităţii culorii formate sau a măsurării CO2 obţinut în reacţie.

+ R - CH - COO-

NH3+

O

O

OH

OH OH

H

O

O

+ R - CH = O + CO2 + NH3

O

O

H

OHOH

OH

O

O

+ NH3 +

O

O

O

HO

N

80

REACŢIA CU IONII DE CUPRU (Cu+2) ÎN MEDIU ALCALIN Aminoacizii formează cu Cu+2 în mediu alcalin un complex colorat în

albastru.

Tehnica de lucru Peste soluţia unui aminoacid se adaugă NaOH pentru alcalinizare, după care

se adaugă o soluţie de CuSO4. Se observă apariţia unei coloraţii albastre. Această reacţie este utilizată şi la dozarea spectrofotometrică a unui aminoacid. DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI UNEI SOLUŢII DE AMINOACID

Aminoacizii formează cu ionii de cupru bivalenţi, în mediu alcalin un complex chelat albastru care prezintă maxim de extincţie la o lungime de undă de 620 nm. Reactivi :

1. Soluţie de aminoacid de concentraţie necunoscută; 2. Soluţie standard de alanină ( 40 nM ); 3. Suspensie Cu3(PO4)2.

Tehnica de lucru Deoarece reactivul de culoare este el însuşi colorat este necesară prepararea

unui martor. Conversia extincţiei în concentraţie se va face pe seama unei curbe de etalonare efectuate cu o soluţie standard de alanină.

Reactivi 1 2 3 4 5 P M Soluţie de aminoacid

- - - - - 5 -

Soluţie standard de alanină

1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml - -

Apă distilată 4 ml 3 ml 2 ml 1 ml - - 5 ml Concentraţia în mM alanină

8 16 24 32 40 ? 0

Se agită eprubetele şi după 5 minute se centrifughează 5 minute la 4000

rpm. Se citesc extincţiile la 620 nm în cuva de 1 cm. Extincţia probei se va converti în concentraţie prin interpolare grafică.

Această metodă se poate folosi la urmărirea vitezei de hidroliză a unei proteine sau gradului de conversie a unui aminoacid.

2 R - CH - NH2 + Cu+2COOH

R - CHCOO

NH2

CuH2N

OOC

HC - R

81

REACŢIA XANTOPROTEICĂ Această reacţie este specifică pentru aminoacizii aromatici, cum ar fi:

tirozina, fenilalanina şi triptofanul. Proteinele care conţin aminoacizi aromatici dau în prezenţa HNO3 şi

alcalinizare ulterioară o culoare galbenă portocalie, datorită formării de nitroderivaţi. Reactivi :

1. Soluţie proteică diluată; 2. HNO3 conc. 3. NH4OH conc.

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se iau 2 – 3 ml soluţie proteică la care se adaugă aproximativ

1 ml HNO3 conc. Se constată apariţia unui precipitat alb. Se fierbe 1 – 2 minute, se răceşte şi se adaugă NH4OH (2ml) până la apariţia unui precipitat galben portocaliu. REACŢIA MILLON – este specifică pentru tirozină. În prezenţa reactivului Millon (azotat şi azotit de mercur în mediu de HNO3), soluţia de tirozină dă prin încălzire o culoare roşie. Proteinele dau în aceste condiţii un precipitat alb, care prin încălzire uşoară (600C) devine roz.

Reactivi:

1. Soluţie de tirozină 1 g% sau soluţie apoasă de proteine; 2. Reactiv Millon (5g Hg + 10ml HNO3 + 30 ml apă distilată).

HO CH2 - CH - COOH

NH2

2HNO3

2H2O

O2N

O2NNH2

CH2 - CH - COOHHO

HO CH2 - CH - COOH

NH2react ivMillon

NH2

CH2 - CH - COOHHO

ON

NH2

CH2 - CH - COOH OHg

NH2

CH2 - CH - COOH O

HO - N

82

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se iau 2 ml soluţie proteică şi se adaugă 0,5 ml reactiv

Millon. Se observă apariţia unui precipitat alb. Se încălzeşte eprubeta la 50 – 600C după care precipitatul devine roz. REACŢIA ADAMKIEWICZ-HOPKINS este specifică pentru triptofan. Proteinele conţinând triptofan reacţionează cu acidul glioxilic în mediu de H2SO4 conc. şi formează o culoare violetă. Reacţia are aplicabilitate la evidenţierea triptofanului din lichidul cefalo-rahidian. Reactivi :

1. Soluţie proteică concentrată 2. Acid acetic glacial 3. H2SO4 conc.

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se iau 1 – 2 ml soluţie proteică concentrată, se adaugă 0,5 ml

acid acetic glacial şi se lasă să se prelingă pe pereţii eprubetei 0,5 – 1 ml H2SO4 conc. La limita de separare apare un inel violaceu. REACŢIA SAKAGUCHI – este specifică pentru arginină. Arginina datorita restului guanidinic reacţionează cu alfa-naftolul în prezenţa hipobromitului de sodiu şi formează o coloraţie roşie.

N

- CH2 - CH - COOH

NH2

H

+ OHC - COOHH2OCO2

NN

CH2CH2

H2N - CH CH - NH2

HOOC COOH

H H

HN = C - NH2

NH

(CH2)3CHNH2

COOH

+ 2

OH

NaOBr

COOH

CHNH2

(CH2)3

NH

HN = C - N

O

OBr

83

Reactivi: 1. Soluţie proteică diluată; 2. Soluţie de hipobromit de sodiu (1 ml NaOH 33% + 2 picături de brom); 3. Soluţie alfa-naftol 0,1 N; 4. NaOH 10%

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se ia 1 ml soluţie proteică diluată, se alcalinizează cu 1 ml

NaOH 10%, apoi se adaugă 1 ml alfa-naftol şi hipobromit de sodiu, picătură cu picătură, până la apariţia unei coloraţii vişinii, care indică prezenţa argininei sau a compuşilor cu grupări guanidinice. La încălzire culoarea dispare. REACŢIA ERLICH-PAULI – este specifică pentru histidină.

Histidina şi tirozina în prezenţa acidului diazobenzensulfonic dau o coloraţie roşie-portocalie. Reacţia este dată şi de fenoli şi amine.

Reactivi :

1. Soluţie proteică diluată; 2. Acid sulfanilic (5 g la 1000 ml apă distilată); 3. Na2CO3 5 g%; 4. NaNO2 2-3 g%.

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se tratează 1 ml acid sulfanilic cu 2 ml NaNO2 pentru a

forma acid diazobenzensulfonic. Se adaugă 1 ml soluţie proteică diluată şi 3-4 ml Na2CO3. Se obţine o culoare portocalie care se intensifică la încălzire. REACŢII SPECIFICE AMINOACIZILOR CU SULF. Aminoacizii cu sulf din proteine, prin încălzire cu hidroxizi alcalini formează sulfura de sodiu, care în prezenţa sărurilor de plumb formează un precipitat negru de sulfură de plumb.

N

NH

NH2

CH2 - CH - COOH+ 2[N +N SO3H + N2CO3

CH2 - CH - COOHNH2

H

N

NNaO3S N = N N = N SO3Na

CH2SHCH - NH2 + 2NaOH

COOH COOH

CH - NH2 + Na2S + H2OCH2OH

Na2S + Pb(OOCCH3)2 PbS + 2CH3COOH

84

Reactivi : 1. Soluţie proteică concentrată; 2. NaOH 10%; 3. (CH3-COO)2Pb soluţie saturată.

Tehnica de lucru. Într-o eprubetă se iau 3 ml soluţie proteică concentrată şi acelaşi volum de

NaOH 10%. După o fierbere de 3 – 5 minute se adaugă acetat de plumb şi se fierb din nou. Se obţine un precipitat de sulfură de plumb de culoare neagră.

Aminoacizii care conţin în moleculă grupări SH se pot doza spectrofotometric cu acid 5,5’ ditio-bis-2-nitrobenzoic (DTNB). Cisteina datorită grupei SH pe care o conţine, reacţionează cu DTNB-ul, formând un produs colorat în galben care se determină spectrofotometric la 412 nm. Reactivi :

1. Soluţie cisteină hidrocloridică 0,2 mM în tampon fosfat 0,05 M, pH=7,4; 2. Soluţie DTNB ( 0,0149 g DTNB se dizolvă în 130 ml tampon fosfat

0,05 M pH=7,4 şi se completează la 250 ml cu etanol 95% ); 3. Tampon fosfat 0,05 M, pH=7,4; 4. Soluţie proteică de analizat sau ser sanguin.

Tehnica de lucru Se pregătesc o serie de eprubete conform tabelului :

Reactivi (ml) 1 2 3 4 5 6 7 Cisteină 0,2 mN 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 - - Proteină - - - - - 0,1 - Tampon fosfat 0,9 0.8 0,7 0,6 0,5 0,9 1,0 DTNB 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Se lasă 15 minute, apoi se citesc extincţiile la spectrofotometru faţă de proba

7 (martor), la 412 nm.

O2N

O2N

HOOC

HOOC

S

S

+ HS - CH2 - CH - COOH

NH2

NH2

S - S - CH2 - CH - COOH

HOOC

O2N

HOOC

O2N SH

85

VI.2. DOZAREA AMINOACIZILOR PRIN METODA SŐRENSEN Principiu

Într-o primă etapă aminoacidul formează cu formaldehida un produs ce are gruparea aminică blocată. Aminoacidul rămâne doar cu gruparea carboxil liberă, care conferă caracterul acid. Astfel în a doua etapă gruparea carboxil poate fi neutralizată cu NaOH în prezenţa fenolftaleinei.

Reactivi :

1. Soluţie de aminoacid de concentraţie necunoscută 2. Soluţie aldehidă formică 10% neutralizată cu NaOH în prezenţa

fenolftaleinei; 3. HCl 1%; 4. NaOH 0,1N;

Tehnica de lucru a) Pregătirea martorului;

Deoarece aminoacizii formolizaţi sunt acizi slabi, sărurile lor cu hidroxizii alcalini hidrolizând puternic, pentru a putea fi dozaţi se împiedică hidroliza prin titrare la un pH alcalin (9-9,5). Din această cauză este necesară pregătirea unui martor şi supratitrarea probei până la culoarea martorului. Astfel, într-un pahar Erlenmeyer se fierb 20 ml apă distilată, se adaugă 10 ml aldehidă formică neutralizată, 10 picături fenolftaleină şi 0,4 ml NaOH 0,1 N, măsuraţi cu biureta. Se obţine o culoare violetă. b) Dozarea solutiei de aminoacid

Într-un pahar Erlenmeyer se pipetează 10 ml soluţie de aminoacid, se adaugă NaOH 0,1 N ( sau HCl 1%) până se obţine o culoare slab roz. Se adaugă 10 ml aldehidă formică neutralizată şi se titrează cu NaOH 0,1 N până când se obţine intensitatea de culoarea martorului. Se notează cu N – numărul de mililitri de NaOH utilizaţi la titrare.

Calcul. C – concentraţia aminoacidului exprimată în mg glicocol/l soluţie 7,5 –echivalentul glicocolului

0,4 – reprezintă ml NaOH 0,1 N adăugaţi martorului şi respectiv mililitri NaOH 0,1 N cu care s-a supratitrat proba.

solutieml1000glicocolmg10

10005740Nc /.,).,(

R - CH - COOH + O = CH2

NH2

R - CH - COOH + H2O

N = CH2

N = CH2

R - CH - COOH + NaOH

N = CH2

R - CH - COONa + H2O

86

Această metodă se utilizează la dozarea aminoacizilor din urină, când în probă se pipetează 10 ml urină în locul soluţiei de aminoacid, iar restul reactivilor se adaugă după reţeta de mai sus.

Pentru calculul aminoacizilor prezenţi în proba de urină se foloseşte următoarea formulă de calcul:

N amoniacal = ( N-0,4 ) x 0,0014 x 100g/1000 ml

unde: N – ml NaOH 0,1 N cu care s-a supratitrat proba prin aducere la intensitatea de culoare a martorului

0,0014 – echivalentul azotului Interpretarea rezultatelor

În mod normal cantitatea de aminoacid eliminat în 24 de ore, variază între 50-500 mg azot, ceea ce reprezintă aproximativ 2 g acizi aminaţi liberi sau legaţi. Aproximativ 70% din această valoare este reprezentată de taurină, glicocol, histidină, metilhistidină şi variază cu regimul alimentar şi vârsta.

Variaţii patologice se înregistrează în afecţiuni hepatice, diabet grav, acidoză, cancer. GOODWIN a pus la punct o metodă mai nouă de determinare a aminoacizilor, fiind utilizată la dozarea acestora din plasmă şi urină. Metoda constă în reacţia aminoacizilor cu 2,4 – dinitrofluorbenzen, mai exact în reacţia grupării aminice a aminoacidului în mediu alcalin cu 2,4-dinitrofluorbenzen.

Reactivi :

1. Indicator: 100 mg fenolftaleină se dizolvă în 100 ml etanol. 2. NaOH 200 mmol/l 3. Reactiv 2,4–dinitrofluorbenzen. Se dizolvă 650 l reactiv în 50 ml

acetonă. Se poate păstra 2 luni la 40C. 4. Na2B4O7 132 mmol/l (50 g Na2B4O7x 10 H2O se dizolvă într-un litru apă).

Se prepară înainte de utilizare. 5. Soluţie de 2,4–dinitrofluorbenzen de lucru. Înainte de utilizare se prepară

o soluţie de 2,4–dinitrofluorbenzen prin diluarea soluţiei stoc. Astfel un volum din soluţia stoc se diluează cu 9 volume de tetraborat de sodiu.

6. HCl în dioxan. 2 ml acid clorhidric concentrat se diluează cu 100 ml dioxan.

NO2

F

NO2

+ H2N - CH - RCOOH

O2N NH - CH - R

COOH

NO2

87

7. Soluţie standard stoc de aminoacid 20 mmol/l. Se dizolvă 1,471 g acid glutamic şi 0,751 g glicină în 100 ml apă, la care se adaugă 2 g benzoat de sodiu şi 700 ml HCl 1 mol/l, apoi aducem cu apă distilată la 1 litru.

8. Soluţie standard de aminoacid de lucru. Se diluează 1, 2, respectiv 4 ml din soluţia standard stoc de aminoacid la 10 ml cu apă rezultând soluţii ce conţin 2, 4, respectiv 8 mmol aminoacid/l.

Tehnica de lucru Într-un pahar de 100 ml se măsoară 1 ml urină (din urină colectată în 24 de

ore) şi se adaugă 10 – 15 ml apă. Se adaugă 2–4 picături indicator şi NaOH până când soluţia devine roz. Se fierbe uşor timp de 15 minute adăugând din nou picături de NaOH în acest timp, până ce soluţia colorată în roz nu se mai decolorează. Dacă este necesar se adaugă apă pentru prevenirea evaporării la sec.

Se iau 3 eprubete în care se pipetează următorii reactivi: - În eprubeta ce constituie proba se adaugă 1 ml urină diluată şi 1 ml

DNFB de lucru. - În a doua eprubetă ce constituie martor de urină se pipetează 1 ml

urină diluată şi 1 ml tetraborat, - În a treia eprubetă ce va conţine reactivul martor se pipetează 1 ml

apă şi 1 ml DNFB de lucru. Eprubetele se incubează 15 minute la 700C, apoi se lasă să stea 5-10 minute

la temperatura camerei, după care se adaugă 5 ml dioxan în HCl. Se citeşte extincţia probei, a urinei martor şi a reactivului martor la 420 nm

faţă de o soluţie ce conţine 1 ml apă şi 5 ml dioxan în HCl. Pentru pregătirea standardului tratăm 1 ml din fiecare din cele 3 diluţii ale soluţiei standard de aminoacid în aceleaşi condiţii ca şi urina, după care se citeşte extincţia. Calcul

Azot aminoacidic urinar (mmol/24h) =

Ep/Es x 20 (40 sau 80) x factorul de diluţie/1000.volumul urinei din 24h (ml)

VI.3. REACŢII DE IDENTIFICARE A PROTEINELOR

Proteinele se identifică prin reacţii de culoare şi reacţii de precipitare.

Reacţiile de culoare, de identificare a proteinelor se suprapun cu reacţiile de identificare ale aminoacizilor. Pe lângă reacţiile de identificare descrise la aminoacizi, amintim reacţia biuretului şi reacţia cu -naftochinona. Reacţia biuretului

Această reacţie permite identificarea proteinelor, respectiv a compuşilor care conţin în structura lor cel puţin două legături peptidice (-CO-NH-). Denumirea de reacţia biuretului se datoreşte faptului că biuretul, compus obţinut din 2 molecule de uree, prin eliminarea unei molecule de amoniac, la încălzire, şi care conţine gruparea –CO-NH- repetată de două ori, dă reacţie pozitivă.

88

Culoarea albastră este proprie reactivului (amestec de CuSO4 şi NaOH) şi se reţin ca pozitive doar reacţiile de culoare roz sau violetă. Astfel, biuretul dă o culoare roz şi cu exces de CuSO4, o culoare violet – roşietică cu peptidele şi o culoare violet – albastră cu proteinele.

Mecanismul reacţiei se poate explica prin formarea complecşilor de tip chelaţi, complecşi ce se formează atunci când un ion metalic se combină cu un donor de electroni, cu formarea de valenţe coordinative. În complexul format de către biuret, peptide sau proteine cele 4 molecule de apă legate normal de ionul Cu+2, sunt eliminate şi înlocuite cu grupările amino.

Reactivi : 1. Soluţie proteică diluată 2. Uree cristalizată 3. Soluţie CuSO4 1g% 4. Soluţie NaOH 10%

R2

C-ONaR1

O

R3

CH-COONa

R2

NaO-CR1

O

NaOOC

R3-CH

CuC

N

N

N

N C

proteinat de cupru Tehnica de lucru

Reacţia se efectuează comparativ pe 3 probe: soluţie proteică, biuret şi un martor.

Într-o eprubetă uscată se iau aproximativ 0,2 g de uree şi se încălzesc până la topirea cristalelor, cu emanare de amoniac, ceea ce denotă transformarea ureei în

4NaOHCu(OH)2

R3

OH R2

OHR1

H2

2

2

R3H O

R2 HO

R1

H2

NN

N COOH

NN

N COOH

89

biuret. Masa obţinută se dizolvă în 1- 2 ml apă şi se adaugă acelaşi volum de NaOH 10 % şi 2-3 picături de CuSO4. Apare o coloraţie roz-violacee.

În altă eprubetă se iau 1-2 ml soluţie proteică diluată, acelaşi volum de NaOH 10 % şi 2-3 picături de CuSO4, apare o culoare violetă.

În eprubeta martor se iau 1-2 ml apă, acelaşi volum de NaOH 10 % şi 2-3 picături de CuSO4, apare o culoare albastră dată de Cu(OH)2.

Reacţia are o sensibilitate de 1:10000 şi este mult aplicată pentru dozarea proteinelor prin metoda Gornall.

Reactia cu beta-naftochinona

Aminoacizii, peptidele şi proteinele cu grupări alfa-aminice libere se condensează în mediu alcalin cu formarea unei coloraţii roşii sau roşie-brună.

Cu ajutorul acestei metode se determină totalitatea grupărilor α-aminice

libere sau azotul α-aminic al serului, care este un indicator pentru cantitatea aminoacizilor liberi, şi pe de altă parte, în cursul hidrolizei proteinelor, raportul: N α-aminoacidic/N total constituie un criteriu de apreciere a gradului de hidroliză. Reactivi:

1. Soluţie de aminoacizi, de peptonă şi soluţie proteică diluată; 2. Soluţie carbonat de sodiu 2%; 3. Soluţie β-naftochinonsulfonat 10g%.

Tehnica de lucru Se iau în eprubete diferite câte 1 ml soluţie de aminoacid, peptonă şi soluţie

proteică diluată şi în fiecare se adaugă câte 1 ml soluţie carbonat de sodiu şi, apoi cu picătura reactivul β-naftochinonă. După scurt timp se observă în toate eprubetele apariţia unei coloraţii roşii sau roşie-brună cu nuanţe şi intensităţi diferite, după concentraţia grupărilor α-aminice libere. REACŢII DE PRECIPITARE ALE PROTEINELOR

Proteinele, datorită structurii lor pot fi separate, identificate şi dozate prin intermediul reacţiilor de precipitare. În funcţie de natura şi concentraţia agenţilor de precipitare se pot realiza precipitări reversibile şi ireversibile.

2 + HC - NH2

R

COO-

OO

OOH

N - CH - COO-

R

+

OHOH

90

I. Reacţii de precipitare reversibile

1. Precipitarea proteinelor cu săruri (salefierea) Sub influenţa unor săruri ale metalelor uşoare ca: sulfat de amoniu, sodiu,

magneziu, clorură de sodiu se produce deshidratarea particulelor proteice care precipită reversibil, deoarece proteinele se solubilizează din nou prin diluare sau prin îndepărtarea sărurilor precipitante prin dializă. Metoda este aplicată la fracţionarea proteinelor (separarea globulinelor de albumine; globulinele precipită la semisaturare cu sulfat de amoniu, iar albuminele numai la saturare). Reactivi :

1. Soluţie proteică diluată; 2. Soluţie saturată de sulfat de amoniu; 3. Sulfat de amoniu cristalizat; 4. Clorură de sodiu cristalizată; 5. Sulfat de sodiu cristalizat.

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se pipetează 2 ml soluţie proteică diluată şi se tratează cu un

volum egal de soluţie saturată de sulfat de amoniu. Se obţine astfel o soluţie semisaturată de sulfat de amoniu, în care, după câtva timp precipită globulinele. Se filtrează şi peste soluţia obţinută se adaugă cristale fine de sulfat de amoniu până la saturare, se observă formarea precipitatului de albumină.

Metoda serveşte la separarea albuminelor de globuline din ser. Într-o serie de alte eprubete se tratează 2 ml soluţie proteică diluată cu

NaCl, MgSO4 şi Na2SO4, până la saturare, când precipită o parte din proteine, se filtrează şi se acidulează soluţia cu acid acetic. Se observă apariţia unui nou precipitat: albuminele. 2. Precipitarea cu alcool

Reacţiile se bazează pe proprietatea proteinelor de a deveni insolubile în prezenţa unor solvenţi organici. Unii din agenţii precipitanţi (alcool, acetonă) fixează apa din molecula proteinelor a căror radicali lipsiţi de apă floculează. Concentraţia optimă în alcool, pH-ul, temperatura de precipitare constituie parametrii care variază de la o proteină la alta. Precipitarea proteinelor cu alcool se foloseşte la separarea proteinelor din ser. Reactivi :

1. Soluţie proteică; 2. Alcool de 950

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se iau 2 ml soluţie proteică, 2 ml alcool şi se agită puternic.

După câtva timp va apare un precipitat fin de proteină. Adăugând peste precipitat 10 ml apă, acesta se redizolvă, prin diluarea alcoolului.

91

II. Reacţii de precipitare ireversibile 1. Precipitarea proteinelor cu săruri ale metalelor grele

Prin acţiunea sărurilor metalelor grele (Pb, Cu, Hg, Ag), proteinele precipită ireversibil, ele nu se redizolvă nici prin diluarea soluţiilor, nici prin dializă, deşi prin aceste operaţii se înlătură sărurile precipitante. Această metodă se aplică la deproteinizarea lichidelor biologice. Reactivi :

1. Soluţie proteică diluată; 2. Soluţie Pb(CH3-COO)2 0,5%; 3. Soluţie CuSO4 1g%; 4. Soluţie AgNO3 3g%.

Tehnica de lucru În 3 eprubete se pipetează câte 1 ml soluţie proteică şi se adaugă în prima

soluţia de acetat de plumb, în a doua soluţia de sulfat de cupru şi în a treia soluţia de azotat de argint. În toate eprubetele se observă apariţia unui precipitat. 2. Precipitarea proteinelor cu reactivii alcaloizilor

În această categorie de agenţi de precipitare se includ reactivii care precipită alcaloizii în mediu acid, dintre care cei mai importanţi sunt: taninul, acidul picric, hexacianoferatul de potasiu. Reactivi :

1. Soluţie proteică diluată; 2. Acid acetic 1g% şi 10g%; 3. Soluţie apoasă saturată de tanin; 4. Soluţie apoasă saturată de acid picric; 5. Soluţie de hexacianoferat (II) de potasiu 10g%.

Tehnica de lucru În 3 eprubete se iau câte 2-3 ml soluţie proteică. În prima se adaugă 1-2 ml

acid acetic 1g% şi 1-2 ml tanin, în a doua se adaugă 1-2 ml acid acetic 1% şi 1 ml soluţie de acid picric, iar în a treia 1 ml acid acetic 10% şi câteva picături de ferocianură de potasiu. În toate eprubetele se observă apariţia unui precipitat. 3. Precipitarea proteinelor cu acizii minerali

În prezenţa acizilor minerali, ca de exemplu acidul tricloracetic, acidul sulfosalicilic, amestecul de acid citric-picric (reactivul Essbach) sunt frecvent utilizaţi pentru precipitarea proteinelor din lichidele biologice. a) Precipitarea proteinelor cu acidul tricloracetic

Precipitarea proteinelor cu acidul tricloracetic este frecvent folosită în laboratorul clinic pentru deproteinizarea serului sau a sângelui. Reactivi :

1. Soluţie proteică diluată; 2. Soluţie acid tricloracetic 5-20g%;

92

Tehnica de lucru Peste 2-3 ml soluţie proteică se adaugă 0,5 – 1 ml soluţie acid tricloracetic

cu apariţia unui precipitat alb abundent. b) Precipitarea proteinelor cu acid sulfosalicilic

Această metodă este una din cele mai utilizate reacţii pentru depistarea proteinelor din urină. Se presupune că acidul sulfosalicilic reacţionează cu ambele grupări acide formând compuşi de tipul următor:

Reactivi : 1. Soluţie proteică diluată; 2. Soluţie acid sulfosalicilic 15-20 g la 100 ml apă bidistilată;

Tehnica de lucru Se iau într-o eprubetă 1-2 ml soluţie proteică peste care se adaugă cu

picătura aproximativ 0,5 ml soluţie de acid sulfosalicilic. Apare un precipitat alb, sub forma unui nor, care permite urmărirea mersului picăturii de reactiv. Această metodă are o mare sensibilitate, fapt care o recomandă la analiza urinii. 5. Precipitarea proteinelor prin încălzire

Majoritatea proteinelor prin încălzire la diferite temperaturi coagulează şi se produce o precipitare ireversibilă. Precipitarea este maximă la punctul izoelectric al proteinei, şi, în consecinţă, la acest tip de precipitare un rol deosebit îl are pHi. Prezenţa diferitelor săruri favorizează de asemenea precipitarea. Reactivi :

1. Soluţie proteică diluată; 2. Soluţie acid acetic 1% si 10%; 3. Soluţie NaCl saturată; 4. Soluţie NaOH 10%.

Tehnica de lucru În 5 eprubete se iau câte 2 ml soluţie proteică.

- În prima nu se adaugă nici un reactiv, ci se încălzeşte direct în flacară. Se observă apariţia unui precipitat.

+........-O3S +........-O3S

+........-O3S

COO-........+sau

lant proteic (LP) LPLP

OH

93

- În a doua eprubetă se adaugă 1-2 picături acid acetic 1% şi se încălzeşte. Precipitarea este mai rapidă şi mai completă, deoarece pH-ul soluţiei este mai aproape de pHi al proteinei.

- În a treia eprubetă se adaugă 0,5 ml acid acetic 10%. Precipitatul ce apare este mai puţin abundent faţă de cel din eprubeta a doua, sau chiar inexistent, datorită depăşirii pHi al proteinei.

- În a patra eprubetă se adaugă 0,5 ml acid acetic 10% si 0,5 ml soluţie NaCl saturată. La încălzire apare un precipitat, favorizat de NaCl.

- În a cincea eprubetă se adaugă 0,5 ml soluţie NaOH 10%. Se observă că proteina nu precipită nici la încălzire, mediul fiind prea alcalin.

94

VII. ANALIZA BIOCHIMICĂ A GLUCIDELOR

Ozele sunt compuşi aldehidici sau cetonici, ce conţin una sau mai multe funcţiuni alcoolice.

Exemplu:

CH3OH-(CHOH)n-CH=O – aldoză CH3OH-(CHOH)n –CO-CH2OH – cetoză

După numărul atomilor de carbon din moleculă distingem: trioze (3C),

tetroze (4C), etc. Numeroşii izomeri se datorează prezenţei în moleculă a atomilor de carbon

asimetrici, existând astfel forme dextrogire (D) şi levogire (L). Funcţiunea aldehidică sau cetonică poate să formeze cu o funcţiune alcoolică un semiacetal, rezultând astfel configuraţia ciclică de furan sau piran, în funcţie de gruparea –OH, care participă la formarea semiacetalului.

Identificarea şi dozarea glucidelor se bazează pe reacţiile grupelor

funcţionale (carbonil şi alcoolice), pe interacţiile dintre acestea şi pe unele caracteristici ale moleculei întregi. Astfel glucidele pot să dea următoarele tipuri de reacţii: de culoare, de condensare, epimerizare şi reducere.

Sub acţiunea acizilor minerali concentraţi (la cald), prin pierderea a 3 molecule de apă, pentozele se transformă în furfural, metilpentozele în metilfurfural, hexozele în oximetilfurfural. Polizaharidele şi dizaharidele suferă o hidroliză prealabilă la monozaharide, care se comportă în continuare, ca şi monozaharidele.

Compuşii furfuralici formaţi se condensează cu diferiţi polifenoli cu formarea unor produşi coloraţi, care permit identificarea şi/sau diferenţierea glucidelor.

O OCH2OHHOH2C

CH2OH

OHOHHO

OH

HOOH OH

OH

95

VII.1. REACŢII GENERALE PENTRU GLUCIDE Reacţia PODOBEV – MOLISCH – UDRANSKY

Glucidele de interes biologic dau în prezenţă de H2SO4 concentrat derivaţi furfuralici, care se condensează cu α-naftolul cu formarea unor compuşi coloraţi în violet. Reactivi :

1. Glucoză 1%, zaharoză 1% , etc. 2. Soluţie de α-naftol în alcool etilic (proaspăt preparată). 3. H2SO4 concentrat

Tehnica de lucru Se iau într-o eprubetă 2-3 picături soluţie de glucoză 1%, se adaugă 5

picături soluţie de α-naftol şi se agită conţinutul eprubetei. Se toarnă încet, cu atenţie, pe peretele interior al eprubetei aproximativ 1 ml H2SO4 conc. La nivelul de separare a celor două lichide se formează un inel violet, ceea ce denotă o reacţie pozitivă (+). Observaţii :

Reacţia este dată şi de produşii care conţin în moleculă lor oze, cum sunt de ex. nucleoproteidele, mucoproteidele, etc.

Inelul de culoare violetă (caracteristic) poate fi însoţit sau să fie substituit cu inele de culori diferite, de ex.:

- inel verde, cauzat de acţiunea acidului asupra α-naftolului; - inel alb, în cazul prezenţei proteinelor care precipită în mediu acid; - inel roşu, datorat unor substanţe organice cu alte structuri.

HOHC - CHOH

R - HC CH - CHO

OHHO

H2SO4

-3H2O OR CHO

+ 2

OH

-H2O

OH OH

CH

O

R

O

C

OHOH

R

ox

96

VII.2. REACŢII DE DIFERENŢIERE A ALDOZELOR ŞI CETOZELOR Reacţia cu rezorcină (Reactia SELIVANOFF)

Zaharurile în prezenţa HCl dil. 1:1 dau compuşi furfuralici, care prin condensare cu rezorcină, formează compuşi de tipul trifenilmetanilor, coloraţi în roşu. Reacţia este mai rapidă în cazul cetozelor, comparativ cu aldozele, fapt ce permite diferenţierea lor. Reacţiile care au loc sunt următoarele: Reactivi :

1. Reactiv Selivanoff: se dizolvă 0,1g rezorcină în 100 ml HCl dil.1:1 cu apă distilată;

2. Fructoză 1% sau zaharoză 1%; 3. Glucoză 1%, arabinoză 1%.

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se pun 2 picături soluţie de glucoză 1% şi în alta 2 picături

soluţie de fructoză sau zaharoză. Se adaugă în ambele eprubete câte 2 ml reactiv Selivanoff şi se aşează într-o baie de apă la 30-600C timp de 15 minute sau se încălzeşte uşor direct în flacară.

În eprubeta cu aldoză apare o coloraţie slab roz, galbenă sau soluţia rămâne incoloră, în timp ce în eprubeta cu cetoză se produce o coloraţie roşie. Reacţia este pozitivă cu cetozele: de culoare roşie şi este negativă cu aldozele: incoloră sau culori slabe.

VII.3. REACŢII DE DIFERENŢIERE A PENTOZELOR DE HEXOZE

Reacţia cu orcina (Reacţia BIAL)

Pentozele în prezenţa acizilor concentraţi se transformă în furfural care în prezenţa orcinei (metil-rezorcină) formează produşi de condensare coloraţi în

ALDOZA R CH=OO

HO OH+ 2

-H2O

OR O

OH

OH O

OH

RO

O

97

violet. În aceleaşi condiţii, hexozele dau produşi de culoare nediferenţiată, portocalie-brună. Reacţiile care au loc sunt următoarele: Reactivi :

1. Reactiv Bial: 1 g orcină în 1000 ml HCl; 2. Soluţii de arabinoză 1%, riboză 1% ,etc. 3. Soluţii de glucoză 1%, galactoză 1%, fructoză 1%, etc.

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se iau 5 picături soluţie pentoză şi în alta 5 picături soluţie de

hexoză şi se adaugă în ambele câte 3 ml reactiv Bial. Eprubetele se ţin pe baie de apă în fierbere sau se încălzesc uşor în flacără.

În eprubeta cu pentoză se obţine o culoare violetă (reacţie pozitivă), iar în eprubeta cu hexoză se obţine o culoare nedefinită, portocalie-brună (reacţie negativă). Reacţia BIAL modificată

Datorită faptului că reactivul Bial nu se păstrează decât cel mult o săptămână, se foloseşte reactivul Bial modificat, care are o mai bună conservabilitate (6 luni). În cazul reactivului Bial modificat orcina este dizolvată în alcool etilic şi se adaugă şi FeCl3. Reactivi :

1. Reactiv Bial modificat: se dizolvă 6 g orcină în 200 ml alcool etilic şi se adaugă 2 ml FeCl3 1%;

2. Soluţii de pentoze si hexoze 1-2 %; 3. HCl concentrat.

Tehnica de lucru Se iau într-o eprubetă 2 ml soluţie de pentoză şi în alta 2 ml soluţie de

hexoză. În ambele se adaugă câte 10 picături reactiv Bial modificat şi câte 2 ml HCl

PENTOZÃHEXOZÃ

HCl (conc)

OR CHO + 2

CH3

OHHO

CHRO

HO

HO

CH3

CH3

HO

HO

98

concentrat. Eprubetele se agită, se acoperă cu un dop de vată şi se ţin 10 minute în baia de apă, care fierbe.

Reacţia este pozitivă cu pentozele, obţinându-se o coloraţie albastră-verde. Reacţia TOLLENS pentru pentoze

Pentozele în prezenţa acizilor concentraţi se transformă în furfural, care în prezenţa fluoroglucinei (1,3,5 – trihidroxibenzen) sau a pirogalolului (1,2,3-trihidroxibenzen) formează compuşi coloraţi în roşu-vişiniu. Reactivi :

1. Reactiv TOLLENS: soluţie de fluoroglucină 2% în alcool 86o; 2. Soluţii de pentoze şi hexoze 1-2 %; 3. HCl concentrat.

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se iau 2 ml soluţie pentoză şi în alta 2 ml hexoză. În ambele

eprubete se adaugă câte 3 picături reactiv Tollens, 2 ml HCl conc. şi se încălzesc până la fierbere.

Reacţia este pozitivă pentru pentoze, care dau o coloraţie roz care trece în roşu- vişiniu. Reacţia aldopentozelor cu benzidina

Aldopentozele formează cu benzidina în mediu de acid acetic glacial o coloraţie roz. Cetopentozele şi hexozele nu dau această reacţie. Reactivi :

1. Soluţie de benzidină pură: 4p. benzidină în 100p. acid acetic glacial; 2. Soluţii 2% de oze: aldopentoze (riboză), hexoze (glucoză, fructoză).

Tehnica de lucru La 0,5 ml reactiv se adaugă o picătură din soluţia de oză. Eprubeta

conţinând acest amestec se fierbe 3-4 min. şi apoi se răceşte. Aldopentozele libere dau o coloraţie de la roz la roşu, în timp ce hexozele şi

cetopentozele nu dau reacţia.

PENTOZÃ 2CH=O

O+ H2N NH2

-2H2O N=HCO

CH=N O

99

VII.4. REACŢII DE CONDENSARE A MONOZAHARIDELOR CU FENILHIDRAZINA

Zaharurile reacţionează în mediu acid cu fenilhidrazina cu formarea

produşilor de reacţie: fenilhidrazone şi osazone. Fenilhidrazonele se obţin prin tratarea zaharurilor la rece şi în raport molecular de 1:1 cu fenilhidrazină, iar osazonele prin tratarea zaharurilor la cald şi cu exces de fenilhidrazină. Reacţia se petrece în 3 etape succesive:

1. condensarea unei molecule de fenilhidrazină cu funcţia carbonilică (aldehidă sau cetonă) a glucidelor, cu formarea fenilhidrazonei;

2. o reacţie de oxido-reducere: fenilhidrazona formată în prima etapă reacţionează cu o nouă moleculă de fenilhidrazină, care se reduce la anilină şi amoniac, concomitent cu oxidarea unei grupări alcool (din vecinătatea C la care s-a legat fenilhidrazina) cu apariţia unei noi grupări carbonilice: la C2 în cazul aldozei (iniţiale) şi la C1 pentru cetoze;

3. în această etapă reacţionează o nouă moleculă de fenilhidrazină cu funcţia carbonil nou formată cu producerea osazonelor.

Fenilhidrazonele sunt specifice pentru diferitele oze. Osazonele sunt identice pentru ozele epimere (care diferă numai la grupările de la C1 şi C3, de exemplu: glucoza, fructoza) şi diferite pentru zaharurile neepimere şi permit astfel, pe baza proprietăţilor lor caracteristice (forma cristalelor, punct de topire, solubilitate), diferenţierea zaharurilor (de ex: diferenţierea glucozei faţă de galactoză). Tehnica de lucru

Într-o eprubetă peste 2 ml soluţie de glucoză se adaugă 2 ml soluţie de 2,4- dinitrofenilhidrazină în H2SO4. Soluţia se încălzeşte uşor până la apariţia precipitatului roşu de 2,4-dinitrofenilhidrazonă.

Reacţia cu fenilhidrazină permite determinarea glucozei, în soluţie pură, până la diluţia de 0,01g% şi prezintă un interes deosebit, fiind utilă în clinică pentru

CHO

H - C - OH

HO - C - H

CH2OH

C6H5-NH-NH2

H - C - OH

H - C - OH

C6H5-NH2 + NH3

C6H5-NH-NH2

-H2O

H - C - OH

H - C - OH

CH2OH

HO - C - H

H - C - OH

CH=N-HN-C6H5CH=N-HN-C6H5

C = O

HO - C - H

CH2OH

H - C - OH

H - C - OH

-H2O

C6H5-NH-NH2

H - C - OH

H - C - OH

CH2OH

HO - C - H

C = N-HN-C6H5

CH=N-HN-C6H5

NNH

N

HOH2C-(CHOH)3

HN-C6H5

osazonã(formulã chelaticã)

100

diferenţierea glicozuriei (diabet zaharat) de lactozuriile fiziologice, care apar la unele femei, în ultimele luni de graviditate şi în perioada alăptării.

VII.5. ACŢIUNEA ALCALIILOR ASUPRA OZELOR

În prezenţa hidroxizilor diluaţi se produce o epimerizare a ozelor cu formarea, în cazul glucozei, a unui amestec în echilibru, între glucoză-manoză-fructoză şi o formă intermediară “en-diol“:

Procesul de epimerizare continuă de-a lungul lanţului de atomi de carbon, formându-se 2,3–endiol, 3,4-endiol, etc. La cald se formează caramelul, un produs cu miros caracteristic, nedefinit chimic.

Reacţia de evidenţiere a en-diolilor este cunoscută sub denumirea de reacţia MOORE. Reactivi:

1. Soluţie de glucoză 1%; 2. NaOH 0,1N şi 10%; 3. HCl 0,1 N, cu adaus de 1 ml FeCl3 10%.

Tehnica de lucru

a) Dacă se urmăreşte numai evidenţierea caramelului se tratează 5 ml soluţie glucoză 1% cu 2 ml NaOH 10% şi se încălzeşte la fierbere. Soluţia devine galbenă şi culoarea virează spre brun, concomitent cu apariţia unui miros de caramel, care se accentuează prin acidularea soluţiei. Dacă acidularea se face cu H2SO4 este necesară o răcire prealabilă a eprubetei.

b) Dacă se urmăreşte evidenţierea compuşilor cu grupare en-diol se iau într-o eprubetă 2 ml soluţie glucoză 1% şi exact 5 ml NaOH 0,1 N. Se fierbe şi se obţine o culoare galbenă datorită caramelului. Se răceşte soluţia şi se adaugă exact 5 ml HCl 0,1 N (care conţine FeCl3). În cazul prezenţei formei “en-diol“ se observă o coloraţie violetă (reacţie pozitivă), care nu apare cu soluţia de glucoză, ca atare (care nu a fost încălzită cu baze).

H - C - OH C - OHH - C = O H - C - OH H - C = O

HO - C - H

CH2OH

C = O

endiol Aldoza ID-glucoza (63,5%)

aldoza IID-manoza (2,5%)

cetozafructoza (21%)

101

VII.6. REACŢII DE REDUCERE

Gruparea carbonil din structura glucidelor le imprimă un caracter reducător ce se manifestă, de exemplu, în mediu alcalin şi la cald asupra ionilor metalici: Cu+2, Ag+, Hg+2, Bi+3,Se+4 sau asupra unor compuşi organici, de exemplu cei care îşi schimbă culoarea prin oxido-reducere: acid picric-acid picramic, albastru de metilen-leucoderivat. Concomitent gruparea aldehidică a ozei se oxidează la acid aldonic, ceea ce relevă că se desfăşoară reacţii de oxido-reducere. În realitate, adesea, glucidele în mediu alcalin se transformă în compuşi puternic reducători, care participă şi ei în reacţiile de reducere. a) Reacţii de reducere ale Cu+2

Soluţiile cu sulfat de cupru în mediu alcalin produc precipitatul de Cu(OH)2, dar care deranjează reacţia cu glucidele. De aceea pentru evitarea precipitării Cu(OH)2 se adaugă diferiţi compuşi, în special polialcooli sau hidroxi-acizi, care formează complecşi coloidali solubili cu ionul de Cu+2

, ca de exemplu: - reacţia Fehling: complexul Na-K-tartrat, - reacţia Benedict: complexul Na-citrat, - reacţia Cole: complexul cu glicerina.

Utilizarea Na2CO3 prezintă unele avantaje faţă de NaOH: stabilitatea mai mare a reactivilor şi o mai mică interferare cu alţi compuşi reducători, care reacţionează similar cu glucidele în mediile cu baze, ca de exemplu: acid uric, creatinină, cloroform. Totuşi valoarea ansamblului reacţiilor de reducere este limitată de realitatea că ele sunt relativ nonspecifice deoarece asemănător cu glucidele reacţionează şi derivaţii acestora, de exemplu: glucuronidele de tip ester (formate cu metaboliţii medicamentelor), acizii uronici liberi. 1. Reacţia TROMMER

Ionul de Cu+2 este redus de către gruparea carbonilică a glucidelor, în mediu alcalin şi la cald, la ion cupros ( Cu+), respectiv la Cu2O. Particulele de Cu2O, în absenţa coloizilor protectori, se depun ca un sediment roşu. Concomitent se produce oxidarea funcţiei aldehidice la carboxil (de la glucoză la acid gluconic). Reactivi:

1. Soluţie de CuSO4 10%; 2. Soluţie de NaOH 10%;

CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4

CuOH

H2OO

RCHO

RCOOHCu

OH

OHOH

Cu

CuOH

OHCu - OH

Cu - OHH2O

Cu

Cu O

102

3. Soluţii de glucide reducătoare 1%: glucoză, galactoză; 4. Soluţii de glucide nereducătoare 1%: zaharoză.

Tehnica de lucru Se iau în 2 eprubete câte 2 ml soluţie de zahăr reducător (glucoză) şi

respectiv nereducător (zaharoză), se adaugă câte 5 picături de CuSO4 10% şi 5 picături de NaOH 10%. Ambele eprubete se încălzesc la partea superioară a lichidului.

Se observă că în eprubeta cu zahăr reducător apare un precipitat galben, care devine roşu, Cu2O, care denotă o reacţie pozitivă, în timp ce în eprubetă cu zaharoză reacţia este negativă. 2. Reacţia FEHLING

Reacţia este similară cu reacţia Trommer, doar că în acest caz se procedează la solubilizarea Cu(OH)2 prin tratarea cu tartrat dublu de sodiu şi potasiu (sarea Seignette), care intră în compoziţia reactivului Fehling II. În urma amestecării celor doi reactivi Fehling se formează între Cu+2 şi sarea Seignette un complex cu structură de chelat care favorizează dizolvarea Cu(OH)2. Reactivi:

1. Soluţie de zaharuri reducătoare 1%: glucoză, galactoză. 2. Soluţie de zahăr nereducător 1%: zaharoză. 3. Reactiv Fehling I : 35 g CuSO4.5H2O

5 ml H2SO4 conc. 200 ml apă distilată.

După dizolvare se completează cu apă distilată la 1000 ml. 4. Reactiv Fehling II : NaOH 3g la 100 -300ml

Sare Seignette -150 ml Apă distilată la -1000 ml. Tehnica de lucru

Se iau în două eprubete câte 2 ml reactiv Fehling I şi 2 ml reactiv Fehling II şi se încălzeşte la fierbere 2 minute. În prima eprubetă se adaugă 5 ml zahăr reducător şi se încălzeşte 1 minut direct în flacără. Se observă schimbarea culorii şi apariţia unui precipitat. Se repetă reacţia cu a doua eprubetă la care se adugă 5 ml zahăr nereducător. După încălzire în flacără nu se observă schimbări semnificative.

La prima încălzire, amestecul de reactiv Fehling I şi II trebuie să-şi păstreze culoarea albastră.

Cea de-a doua încălzire serveşte reacţiei de oxido-reducere, când culoarea albastră a soluţiei dispare şi se produce un precipitat de culoare galbenă sau roşie, care indică prezenţa zaharului reducător: reacţie pozitivă (+). 3. Reacţia BENEDICT

Reacţia este similară cu reacţia Trommer şi cu reacţia Fehling, doar că pentru solubilizarea precipitatului de Cu(OH)2 se foloseşte citratul.

103

Reactivi : 1. Reactiv Benedict: 173g citrat de sodiu.2H2O

100g Na2CO3 anhidru 800 ml apă distilată

Se dizolvă prin încălzire, se filtrează şi se aduce la 850 ml. Separat se dizolvă 17,3g CuSO4 pur, cristalizat, în 100-150 ml apă distilată şi se adaugă, sub agitare în porţiuni mici la soluţia precedentă şi se completează cu apă distilată la volumul final de 1000 ml. Reactivul se poate păstra un timp destul de lung; 2. Glucoză 5%; 3. Zaharoză 5%.

Tehnica de lucru

În 2 eprubete se iau câte 5 ml reactiv Benedict. În prima se adaugă 0,5 ml glucoză, iar în a doua aceeaşi cantitate de zaharoză. Se fierb ambele eprubete direct la flacără timp de 2 minute şi se răcesc. În prima eprubetă se va forma un precipitat roşu, reacţie pozitivă, iar în a doua nu se produc modificări semnificative, reacţie negativă.

După culoarea obţinută se poate aprecia, cu aproximaţie concentraţia glucozei şi anume:

- opalescenţă cu nuanţă verde -sub 0,1g% glucoză - turbulenţă puternică de culoare galben-verde -0,2-0,3g% glucoză - precipitat galben-portocaliu -aprox.0,5g% glucoză - precipitat roşu -peste 1g% glucoză

Prezenţa unor compuşi de tipul creatininei, cloroformului, acidului uric, nu

interferează cu reactivul Benedict, spre deosebire de reactivul Fehling, cu care interferează. 4. Reacţia COLE

Reacţia decurge similar cu reacţiile anterioare, cu deosebirea că se foloseşte glicerina ca agent de dizolvare a Cu2O. Reactivi :

1. Na2CO3 anhidru; 2. Glicerină; 3. CuSO4; 4. Soluţii de glucide 1g% şi 0,1g%.

Tehnica de lucru La 5 ml soluţie de glucide se adaugă un vârf de cuţit de Na2CO3 anhidru, 3

picături glicerină şi 2 picături CuSO4 1%. Se agită bine şi se fierbe 1 minut. În cazul probei pozitive, Cu2O format rămâne în soluţie sub formă hidratată

coloidală de CuOH de culoare galbenă. Se consideră că testul Cole este cel mai

104

sensibil dintre reacţiile de reducere şi permite diferenţierea glucidelor de compuşii cu grupare aldehidică liberă sau cu funcţie en-diol. b) Reacţii de reducere ale ionului Ag+ Reacţia TOLLENS

Glucidele reducătoare transformă Ag+ la Ag0 care se depune pe pereţii eprubetei sub formă de argint metalic fin (oglinda de argint). Concomitent gruparea aldehidică din molecula glucidelor reducătoare, este oxidată la acidul corespunzător. Reactivi :

1. Soluţie de AgNO3 2% în apă bidistilată; 2. Soluţie de amoniac diluat 5%; 3. Soluţie glucoză 2%.

Tehnica de lucru Într-o eprubetă foarte curată se pipetează, în ordine: 5ml AgNO3 2% şi apoi

soluţia de amoniac, picătură cu picătură, până la apariţia şi apoi dizolvarea precipitatului care se formează, evitându-se excesul. Se adaugă 3 ml soluţie glucoză, se agită şi se lasă pe baie de apă la 600C timp de 15 minute şi se observă formarea “oglinzii de argint “. c) Reacţii de reducere ale ionului Bi+3 Reacţia NYLANDER

Reacţia se bazează pe reducerea azotatului de bismut (III) (subnitrat de bismut) în mediu alcalin la Bi, în prezenţa glucidelor reducătoare care se oxidează la acizii corespunzători. Reactivi:

1. Reactiv Nylander: se dizolvă 2 g nitrat bazic de bismut (III) şi 4g tartrat dublu de sodiu şi potasiu în 100 ml NaOH 10%. Se încălzeşte pe baie de apă la fierbere, se răceşte şi se aduce cu apă la 1000 ml;

2. Glucoză 2%;

2AgNO3 + 2NH4OH

2AgOH + 4NH4OH

2[Ag(NH3)2]+OH- + R-CHO

2AgOH + 2NH4NO3

2[Ag(NH3)2]+OH- + 4H2O

2Ag + 4NH3 + H2O + R-COOH

Bi(OH)2NO3 + NaOH

2Bi(OH)3 + 3R-CHO

Bi(OH)3 + NaNO3

2Bi + 3H2O + 3R-COOH

105

Tehnica de lucru Într-o eprubetă se iau 2 ml soluţie de glucoză 2% şi 0,5 ml reactiv Nylander

şi se încălzeşte direct în flacără, timp de câteva minute. Reacţia este pozitivă când se obţine un precipitat de culoare neagră (Bi metalic) şi este sensibilă chiar la cantităţi foarte mici de oze. d) Reducerea unor compuşi organici 1. Reducerea acidului picric Glucidele reducătoare, în mediu alcalin şi la cald, reduc acidul picric de culoare galbenă la acid picramic de culoare roşie-portocalie, simultan cu oxidarea grupării aldehidice a ozei la gruparea acidă. Reactivi :

1. Soluţie de acid picric; 2. Soluţie de glucoză; 3. NaOH 10%.

Tehnica de lucru Se iau într-o eprubetă 2 ml soluţie de acid picric, 1 ml soluţie de glucoză şi 1

ml NaOH 10% şi se fierbe. Reacţia este pozitivă când apare o culoare portocalie la încălzire. Persistenţa

reacţiei negative este indicată printr-o culoare galbenă. Reacţia poate servi şi la dozarea glucozei din lichidele biologice, ex. reacţia Seifert-Crecelius. 2.Reducerea albastrului de metilen

Glucidele reducătoare reduc albastrul de metilen la un leucoderivat (derivat fără culoare). În prezenţa oxigenului din aer are loc o reoxidare şi recolorare, proces similar cu acţiunea unor dehidrogenaze, când albastrul de metilen serveşte ca transportor de H de la un donor de H (glucoză) pe un acceptor de H (în experienţa de faţă, oxigenul), cu diferenţa că albastrul de metilen este autooxidabil, adică reacţionează direct cu O2 din aer, ceea ce nu se întâmplă de obicei cu dehidrogenazele.

OHO2N

NO2

NO23RCHO

3H2O+ 2H2O + 3R-COOH

NH2

NO2

O2NOH

106

Reactivi :

1. Soluţie de albastru de metilen 0,1 % în apă 2. Soluţie glucoză 1%; 3. NaOH 2N.

Tehnica de lucru Se iau într-o eprubetă 5 ml apă, 10 picături soluţie de albastru de metilen şi 2

picături de NaOH 2N şi se încălzeşte. Se adaugă câteva picături de glucoză 1%, treptat, până se obţine decolorarea probei, în timpul încălzirii de câteva secunde la fierbere.

După câteva minute de repaus se agită şi se observă recolorarea albastrului de metilen, datorită efectului oxigenului din aer. Dacă eprubeta nu se agită, recolorarea apare mai încet, de la suprafaţa eprubetei spre interior.

VII.7. DOZAREA GLUCIDELOR REDUCĂTOARE

Metoda IONESCU-MATIU

Glucidele reduc la cald şi în mediu alcalin, fericianura de K (hexacianoferat III de potasiu). Când întreaga cantitate de fericianură a fost complet redusă, primele picături de glucoză în exces intră în reacţie cu acidul picric (folosit ca indicator) şi culoarea soluţiei virează de la galben spre roşu-portocaliu. Recativi :

1. Soluţia de fericianură: 46g hexacianoferat (III) de potasiu şi 46g NaOH se dizolvă în apă distilată şi se completează cu apă distilată la 1000 ml. Se păstrează la frigider.

2. Soluţie saturată de acid picric (aprox.1,2 %). Se obţine prin dizolvarea a 1,3g de acid picric în 100 ml apă distilată la fierbere.

3. Soluţie de glucoză 0,5 % şi o soluţie de glucoză de concentraţie necunoscută.

R - CH=O R - COOH

(H3C)2N+N(CH3)2 (H3C)2N N(CH3)2

H2O 1/2O2

S

N

S

NH

107

Tehnica de lucru a) Determinarea factorului reactivului

Într-un balon termorezistent se pipetează exact 10 ml soluţie fericianură şi se adaugă 10 picături soluţie de acid picric şi 20 ml apă distilată. Se încălzeşte la fierbere şi se titrează din biuretă cu soluţia de glucoză 0,5%, menţinând tot timpul soluţia în fierbere, până la virajul culorii de la galben spre roşu-portocaliu, notând cu N – ml glucoză utilizaţi.

1000N5f

b) Determinarea concentraţiei unei soluţii necunoscute de glucoză

Se lucrează exact ca la punctul a), cu singura deosebire că se titrează din biuretă cu soluţia de glucoză de concentraţie necunoscută. Se notează numărul de ml glucoză utilizaţi cu N’.

Calcul:

')/( Nf1000glucoza lg

Metoda are aplicaţie în biochimia clinică la dozarea glucozei din urină.

108

VIII. ANALIZA BIOCHIMICĂ A ENZIMELOR

Enzimele sau biocatalizatorii sunt substanţe de natură proteică care au rolul

de a cataliza procesele biochimice ce se desfăşoară în organism. Principiile generale şi procedeele de preparare a enzimelor în forma pură

sunt cele valabile pentru proteine. Se alege o sursă bogată în enzima care ne interesează şi se aplică tehnicile cele mai adecvate, exploatând diferenţele între proprietăţile enzimei şi ale tuturor celorlalţi componenţi prezenţi, între care pot fi zeci sau sute de alte proteine. De regulă este necesară o succesiune de etape care să conducă în final la un preparat de puritate avansată, cu un bun randament. Urmărirea purificării progresive pe parcursul diferitelor faze este condiţionată de aplicarea unei metode sensibile şi specifice de măsurare cantitativă a activităţii enzimei respective.

Prima operaţie este eliberarea enzimei în formă solubilă din celula intactă. Tehnica de degradare a membranelor celulare (prin mijloace mecanice, tratament de congelare-decongelare, sonicare, liză cu enzime adăugate sau detergenţi) şi vehiculul se aleg în funcţie de natura şi localizarea enzimei. Extractul astfel obţinut este supus apoi fracţionării, care constituie purificarea propriu-zisă, realizată prin îndepărtarea diferiţilor contaminanţi micro- şi macromoleculari şi ionici. În acest scop sunt aplicate o serie de operaţii bazate pe: -dimensiunile moleculare: dializa, ultrafiltrarea, centrifugarea de zonă, gel filtrarea; -solubilitate: precipitări cu săruri neutre, cu solvenţi organici, precipitarea la pHi,

tratament termic; -încărcare electrică: electroforeza, cromatografia pe schimbători de ioni; -adsorbţia selectivă: pe coloane de silicagel; -afinitatea biologică pentru un ligand specific: cromatografia de afinitate.

În prezent există procedee standard care aplică iniţial tehnicile bazate pe dimensiunile moleculare şi solubilitate şi apoi separări cromatografice. În final, este adesea posibil să se cristalizeze enzima purificată. Pentru o anumită enzimă, secvenţa etapelor de purificare se determină experimental, prin analogie cu metodele folosite la proteine similare.

Fracţionarea este controlată prin testarea activităţii, enzima fiind considerată pură când se ajunge la o activitate specifică maximă şi constantă. Puritatea este confirmată de omogenitatea preparatului, stabilitatea prin criterii fizico-chimice valabile şi pentru alte proteine ca: electroforeza pe gel de poliacrilamidă, analiza de sedimentare la ultracentrifugare, gel-filtrarea.

109

VIII.1. MODALITĂŢI DE EXPRIMARE ŞI DE DETERMINARE A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

În condiţii optime viteza unei reacţii depinde direct proporţional de

cantitatea enzimei care o catalizează. Măsurând viteza reacţiei, cantitatea de substrat ce se transformă per unitate de timp, obţinem o valoare proporţională cu concentraţia enzimei. Un asemenea mod de dozare este mult mai comod, (adesea singurul posibil) decât dozarea cantităţii absolute. Enzimele fiind proteine nu pot fi deosebite una de alta prin reacţii generale, de exemplu reacţia biuretului.

După modul de exprimare a cantităţii substratului şi respectiv a unităţii de timp la care se raportează, exprimarea activităţii se face în:

- UI, o unitate internatională de activitate enzimatică fiind cantitatea de enzimă care transformă 1 mol substrat (10-6moli) în timp de 1 minut, la 250C, în condiţii optime de reacţie.

- Pentru enzimele din preparate biologice sau enzime pure, activitatea se raportează la mg proteină şi se notează cu Act. Specifică.

Activitatea specifică = UI / mg proteină = moli substrat transformat /min./mg.prot.

- Dacă se cunoaşte GM a enzimei, activitatea enzimatică se poate exprima în activitate molară sau moleculară sau TN (număr de turnover) = număr de molecule de substrat transformate de o moleculă de enzimă, respectiv de un mol de centru activ (dacă enzima are mai mulţi centri activi) pe minut.

- Activitatea enzimatică se poate exprima şi în moli de substrat transformaţi de enzimă pe secundă, katal (Kat), Kat (moli/sec) sau nKat ( nmoli/sec). Pentru determinarea experimentală a activităţii enzimatice e necesară

respectarea următoarelor condiţii: - menţinerea constantă şi optimă a pH-ului şi temperaturii mediului de

reacţie; - substratul să fie în concentraţie saturantă, pentru ca viteza de reacţie să nu

depindă de concentraţia de substrat (V = Vmax); -să fie prezenţi în mediul de reacţie coenzime şi metale necesare activităţii

enzimatice, în concentraţii saturante ca să nu fie factori limitanţi de viteză.

În aceste condiţii activitatea enzimatică şi viteza reacţiei enzimatice depind numai de concentraţia de enzimă şi ca atare se poate determina cantitativ.

Pentru determinarea experimentală a activităţii enzimatice se utilizează metodele colorimetrice, care prezintă avantajul de a fi simple, rapide şi precise. În principiu se urmăreşte variaţia extincţiei în timp (E/min), care conform legii lui Lambert-Beer este proporţională cu C/min, deci tocmai cu activitatea enzimatică.

cdE

110

sdEc min/min/

Unde: = coeficientul mM de extincţie.

Pentru a putea urmări o reacţie enzimatică prin variaţia E/min este necesar ca substratul sau produsul de reacţie să fie colorat sau să absoarbă în UV.

VIII.2. EFECTUL TEMPERATURII ŞI A pH-ULUI ASUPRA ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Viteza reacţiilor enzimatice creşte cu temperatura între anumite limite, în

care enzima este stabilă. Există o valoare numită temperatură optimă pentru care creşterea este maximă, peste care însă intervine procesul de denaturare termică a enzimei, cu reducerea vitezei. Determinarea activităţii enzimatice în raport cu temperatura permite cunoaşterea temperaturii optime, a stabilităţii termice (temperatura de denaturare) cât şi evaluarea energiei de activare din reacţia dată. Ultimul parametru rezultă din relaţia lui Arhenius.

RTE a

AeK

, unde:

A = constantă, numită factor exponenţial; e = baza logaritmului natural; E = energie de activare; R = constanta generală a gazelor; T = temperatura absolută.

Practic, se măsoară viteza de reacţie la diferite temperaturi, iar datele obţinute sunt reprezentate grafic, folosind o formă lineară a ecuaţiei lui Arhenius, obţinută prin logaritmare:

T1

R32EAK .,

.loglog , unde:

-2,3 – factor care reprezintă trecerea de la logaritmii naturali la cei zecimali În ceea ce priveşte pH-ul, se ştie că există o valoare sau un domeniu

restrâns de valori în care viteza unei reacţii enzimatice este maximă, definită ca pH optim. În afara acestei zone, activitatea enzimatică scade datorită apariţiei unor specii ionizate aparţinând enzimei sau substratului. De regulă, extremele de pH inactivează enzimele prin denaturare.

Măsurarea activităţii unei enzime în funcţie de anumite valori ale pH-ului permite stabilirea pH-ului optim.

Preincubând cantităţi egale de enzimă la diferite valori de pH şi determinând apoi viteza de reacţie la pH-ul optim se pot aprecia limitele între care enzima este stabilă, respectiv domeniul de pH în care este denaturată.

111

Efectul temperaturii şi a pH-ului asupra activităţii catalazei din cartofi

1. Prepararea extractului vegetal: Materiale necesare:

1. cartofi; 2. CaCO3 pulbere.

Tehnica de lucru: 50 g cartofi curăţaţi şi mărunţiţi prin radere se mojarează cu 25 g CaCO3.

Amestecul se suspendă în apa distilată, la un volum final de 250 ml şi se supune agitării timp de ½ oră. Rezidiul vegetal şi CaCO3 se elimină filtrând printr-o pânză de nylon pe care s-a depus un strat de vată şi filtratul obţinut se centrifughează la 4000 r.p.m. timp de 10-15 min. Rezultă un supernatant limpede de culoare brun-închis, care se colectează din toate tuburile de centrifugare şi se amestecă. 2. Testarea activităţii catalazice: Principiu:

Catalaza descompune H2O2 conform reacţiei:

Activitatea enzimei se apreciază indirect, prin dozarea iodometrică a excesului de H2O2 rămas după acţiunea catalazei. Reactivi:

1. H2O2 0,5N; 2. H2SO4 5%; 3. Molibdat de amoniu 1%; 4. Tiosulfat de sodiu 0,1 N; 5. Soluţie amidon (indicator).

Tehnica de lucru : În două pahare Erlenmeyer se pipetează 2 ml şi respectiv 10 ml extract

conţinând catalază (obţinută din cartofi) şi câte 10 ml apă oxigenată 0,5N. După exact 10 minute de repaus la temperatura camerei, timp în care acţionează asupra substratului, se opreşte reacţia enzimatică pipetând în fiecare flacon câte 10 ml H2SO4 şi apă, în ordine 10 ml KI şi 2-3 picături de molibdat de amoniu. Se agită şi după 2-3 minute se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1N până la apariţia unei culori galben deschis, când se adaugă câteva picături de indicator (amidon) şi se continuă titrarea până la dispariţia culorii albastre.

Se constată că, cu cât activitatea enzimei este mai mare, cu atât numărul de ml de tiosulfat de sodiu folosiţi la titrare va fi mai mic.

2H2O2 2H2O + O2catalaza

112

3. Influenţa temperaturii Tehnica de lucru:

Se iau 5 flacoane Erlenmeyer (numerotate de la 1 la 5) şi în fiecare se introduce volumul de extract convenabil (2 ml) şi diferenţa până la 10 ml se completează cu apă distilată:

- flaconul nr.1 se menţine la temperatura camerei, - flaconul nr.2 se ţine la 400C (termostat sau în baie de apă) timp de 10 minute;

- flaconul nr.3 se ţine la 600C; - flaconul nr.4 se fierbe câteva minute, - flaconul nr.5 se ţine într-un cristalizor cu gheaţă (la 00C) timp de 10 minute.

- în al 6-lea flacon se pipetează numai 10 ml apă distilată (martor). După răcirea flacoanelor 2, 3 şi 4 la temperatura camerei, se introduc în

toate 6 flacoanele câte 10 ml H2O2 0,5N şi se lasă în repaus la temperatura camerei exact 10 minute.

După acest interval de timp se pipetează în fiecare flacon câte 10 ml H2SO4 şi apoi, în ordine 10 ml KI şi 2-3 picături molibdat. Se agită şi după 2-3 minute se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1N până la apariţia unei culori galben deschis, când se adaugă câteva picături de amidon şi se continuă titrarea până la apariţia culorii albastre.

Se notează cu N – nr. de ml folosiţi la titrarea martorului şi cu n1 până la n5 ml folosiţi la titrarea celor 5 probe.

Activitatea enzimatică pentru fiecare caz în parte se exprimă prin cantitatea de H2O2 consumată, rezultată din diferenţa N-n1, N-n2, etc.

Se reprezintă grafic, luând pe abscisă t0C şi pe ordonată activitatea enzimatică (în ml tiosulfat de sodiu rezultaţi prin diferenţa N-n1…,N-n5).

Curba obţinută relevă dependenţa activităţii catalazei din cartof de variaţia temperaturii. 4. Influenţa pH-ului asupra activităţii enzimatice Reactivi:

1. Tampon citrat 50 mM cu pH = 4-6; Soluţia A: 2,1g acid citric monohidratat se dizolvă în 100 ml apă; Soluţia B: 2,49g citrat trisodic cu 2 moli apă se dizolvă în apă

distilată lipsită de CO, la un volum final de 100 ml; Pentru a obţine cele 3 soluţii se procedează astfel:

- pentru pH = 4 - 33 ml sol. A + 17 ml sol. B + apă dist. până la 50 ml; - pentru pH = 5 - 20,5 ml sol. A + 29,5 ml sol .B + apă dist. până la 50 ml; - pentru pH = 6 - 9,5 ml sol. A + 41,5 ml sol. B + apă dist. până la 50 ml. 2. Tampon Tris 50mM pH = 7,2-9

Soluţia A: 4,84g Tris (hidroximetil-amino-metan) se dizolvă în 200 ml apă

Soluţia B: HCl 0,2 M;

113

Se fac următoarele amestecuri: -pt. pH = 7,2 -50ml sol. A + 44,2 ml sol. B + apă distilată până la 200 ml; -pt. pH = 8,0 -50ml sol. A + 26,8 ml sol. B + apă distiltată până la 200 ml; -pt. pH = 9,0 -50ml sol. A + 5 ml Sol. B + apă distilată până la 200 ml.

3. H2O2 0,5 N; 4. Molibdat de amoniu 1g%; 5. Tiosulfat de sodiu 0,1 N; 6. Soluţie amidon (indicator);

Observaţie: Tampoanele pot fi înlocuite cu tampoane fosfat de concentraţii 50 mM şi pH între 5,0 şi 8,2. Tehnica de lucru

În 6 flacoane Erlenmeyer se ia câte un volum de extract determinat prin testarea făcută la punctul II. La aceasta se adaugă un volum de 4 ori mai mare dintr-o anumită soluţie tampon astfel încât să avem în cele 6 flacoane o zonă de pH cuprinsă între 4,0 şi 9,0. În continuare se pipetează în fiecare câte 10 ml H2O2 şi se lasă în repaus exact 10 minute la temperatura camerei, după care se efectuează determinările ca la punctul II.

Notând cu p1-p6 numărul de ml de tiosulfat folosiţi la titrarea celor 6 probe, calculul şi reprezentarea grafică se va face ca la punctul III, folosind acelaşi martor, notat cu N. Prin urmare, se fac diferenţele N-p1,….N-p6 şi se reprezintă grafic, notând în abscisă variabila de pH.

Determinarea experimentală a activităţii fosfatazei alcaline şi acide

Activitatea enzimatică este dependentă de pH-ul mediului în care îşi desfăşoară activitatea. Dacă se reprezintă grafic variaţia activităţii enzimatice în funcţie de pH se obţine o curbă în clopot cu un maxim caracteristic pentru fiecare enzimă, care reprezintă pH-ul optim. Sub sau peste pH-ul optim activitatea enzimelor scade mult, cunoaşterea pH-ului optim fiind aşadar obligatorie atunci când se măsoară activitatea unei enzime.

Un exemplu interesant în acest sens îl oferă fosfatazele, enzime din clasa hidrolazelor, subclasa esteraze. Fosfatazele sunt fosfomonoesteraze care catalizează reacţii de tipul:

Se cunosc fosfataze care diferă prin pH-ul optim de acţiune: - fosfataza alcalină cu pH optim de 10,45; - fosfataza acidă cu pH optim de 4,8.

Pentru determinarea diferenţiată a activităţii acestor două enzime trebuie să se lucreze la pH-ul optim respectiv.

R - OPO3H2 + H2O R - OH + H3PO4

114

Determinarea fosfatazei alcaline serice constituie un test curent în laboratorul clinic. Valorile normale sunt cuprinse la adult între 20-40 U/l, iar la copil ceva mai mari; între 38-138 U/l.

Determinarea are valoare diagnostică în: - afecţiuni hepatice ca: hepatita colestatică, icterul mecanic şi tumori

hepatice. - afecţiuni osoase ca: sarcom osos sau metastaze tumorale osoase; - rahitism, când se înregistrează creşterea enzimei în ser mult peste

valoarea normală. Fosfataza acidă serică are valoarea normală până la 11 U/l şi creşte mult în

cancerul de prostată, când prezintă valoare diagnostică. Principiul dozării

Determinarea activităţii celor două enzime în laborator se bazează pe proprietatea lor de a hidroliza esterii fosforici. Ca substrat se utilizează un produs artificial: esterul acidului fosforic cu p-nitrofenolul (p-nitrofenilfosfatul). Acest ester incolor este hidrolizat de o enzimă cu punerea în libertate a p-nitrofenolului, colorat în galben în mediu alcalin.

Se urmăreşte variaţia activităţii fosfatazelor serice la diferite pH-uri şi se reprezintă grafic activitatea enzimatică în funcţie de pH. Reactivi:

1. Soluţie de substrat în tampoane de diferite pH-uri; 2. Ser; 3. NaOH 0,02 N.

Tehnica de lucru Se pregăteşte o serie de 12 eprubete în care se pipetează următorii reactivi:

Epr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PH 3,5 4.0 4,5 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 10,5 11,0 - Apă dist. - - - - - - - - - - - 1,0 Tampon 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 - Ser 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Se incubează 20 min. la temperatura camerei, după care se adaugă:

pOH 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Se citeşte extincţia la 405 nm şi se calculează activitatea enzimatică în U/l.

O2N OPO3H2 + H2O OH + H3PO4O2N

115

Se reprezintă grafic U/l în funcţie de pH. Maximele de activitate reprezintă activitatea fosfatazică a serului respectiv. Rezultatele se interpretează comparându-le cu valorile normale.

E243sernm

ElU nm405 ,min//

Determinarea fosfatazei alcaline (FA)

Prin denumirea de fosfatază alcalină sunt cuprinse un grup de enzime (fosfataze), care transferă o grupare fosfat de la un ester fosforic formându-se un alcool şi un al doilea ester fosforic. Activitatea optimă a acestor fosfataze este în jurul valorii de pH=10 şi necesită Mg+2 şi Zn+2 pentru stabilitate şi activitate maximă. Inhibitorii naturali par să fie Ca+2 şi fosfaţi anorganici. Majoritatea tampoanelor folosite cresc mult viteza de reacţie a FA, acţionând ca acceptor de grupări fosfat printr-o reacţie de transfosforilare. Necunoscându-se substratul natural, pentru măsurarea activităţii FA s-a folosit glicerofosfatul de sodiu, care a fost abandonat datorită vitezei mici de reacţie. Acum se foloseşte p-nitrofenilfosfat sau -naftol monofosfat.

Nu se pot folosi decât serul sau plasma heparinizată, deoarece alţi coagulanţi inhibă FA prin complexarea magneziului. Nivelul activităţii FA reflectă schimbări mai ales intervenite în ficat şi oase, deşi concentraţii mari ale enzimei se găsesc şi în alte organe. În general, activitatea FA creşte între 1-4 ori în boli de ficat (hepatită, colestază).

Creşteri mai mari de 5 ori indică osteomalacie, ajungând ca în boala Paget sau în cancer cu metastaze osoase să fie de 15-20 de ori mai mari.

Scăderi ale activităţii FA se întâlnesc în cretinism, hipofosfatasemie, scorbut.

Determinarea activităţii FA se face în prezent cu truse kit, care au la bază metoda colorimetrică cu p-nitrofenilfosfat. Principiu Se măsoară colorimetric cantitatea de p-nitrofenol rezultată prin acţiunea enzimei asupra p-nitrofenilfosfatului utilizat ca substrat, conform reacţiei : Reactivi :

1. Soluţie tampon-substrat cu pH=10,5: tampon glicocol 0,05M, MgCl2 0,0005M, p-nitrofenilfosfat 0,0055M. Se dizolvă 375 mg glicocol, 10 mg MgCl2.6H2O şi 165 mg p-nitrofenilfosfat sare de sodiu în 42 ml NaOH 0,1N;

2. NaOH 0,02N; 3. Soluţie p-nitrofenol 5.10-5M. Se dizolvă 695 mg p-nitrofenol în 1000 ml

NaOH 0,02N.10 ml, din această soluţie se diluează cu NaOH 0,02N la 1000 ml.

O2N OPO3H2 + H2O OH + H3PO4O2N

116

Tehnica determinării

În 2 eprubete se pipetează următorii reactivi:

Reactivi Probă Martor Soluţie tampon-substrat 0,2 ml 0,2 ml Ser proaspăt 0,1 ml -

Se agită şi se incubează 30 de minute la 370C, după care se adaugă următorii reactivi: NaOH 0,02N 2,5 ml 2,5 ml Ser - 0,1 ml

Se citeşte Ep faţă de martor la 405 nm, în cuve de 1 cm. Calcul:

Activitatea fosfatazei alcaline se obţine din tabelul alăturat sau din următoarea formulă de calcul:

nm405E200mlmU / E405nm mU E405nm mU E405nm mU 0,050 10 0,280 56 0,540 108 0,060 12 0,300 60 0,560 112 0.070 14 0,320 64 0,580 116 0,080 16 0,340 68 0,600 120 0,090 18 0,360 72 0,620 124 0,100 20 0,380 76 0,640 128 0,120 24 0,400 80 0,660 132 0,140 28 0,420 84 0,680 136 0,160 32 0,440 88 0,700 140 0,180 36 0,460 92 0,720 144 0,200 40 0,480 96 0,740 148 0,220 44 0,500 100 0,760 152 0,240 48 0,520 104 0,780 156 0,260 52

Dacă E405nm depăşeşte valoarea de 0,780 se lucrează cu ser diluat în

proporţie de 1:10. Valori normale:

- adult: 20-40 mU/ml; - copil: 38-138 mU/ml.

117

VIII.3. DEPENDENŢA ACTIVITĂŢII ENZIMATICE DE CONCENTRAŢIA DE SUBSTRAT

Determinarea experimentală a KM şi KI pentru colinesteraza nespecifică

Pentru un număr mare de enzime numite michaeliene dependenţa activităţii enzimatice de concentraţia de substrat se poate reda matematic prin ecuaţia:

MKSSVV

][

][max

ecuaţia Michaelis–Menten a cărei reprezentare grafică este o hiperbolă, unde:

V = viteza reacţiei enzimatice (activitate enzimatică); Vmax = viteza maximă la concentraţie infinită de substrat; [S] = concentraţia de substrat; KM = constanta lui Michaelis-Menten, indică afinitatea enzimei pentru

substratul respectiv şi este acea concentraţie de substrat pentru care V=Vmax/2. Cu cât KM este mai mic cu atât afinitatea enzimei pentru substratul respectiv este mai mare şi invers. KM reprezintă deci o constantă importantă ce caracterizează cinetic o enzimă. Cunoaşterea KM a unei enzime pentru diferite substrate este obligatorie pentru determinarea activităţii enzimatice şi pentru a cunoaşte comportarea enzimei faţă de diferite substrate sau inhibitori.

În cazul în care pe lângă substratul respectiv în reacţie mai intervine un inhibitor, ecuaţia lui Michaelis-Menten devine: - în cazul inhibiţiei competitive :

'max ][

][MKS

SVV

Unde: KM’ este un KM aparent, mai mare decât KM cu factorul (1+ [I]/KI )

iMM K

I1KK ]['

- în cazul inhibiţiei necompetitive:

MKSSVV

][

]['max unde:

iKI1

VV

][max'

max

[I] = concentraţia de inhibitor Ki = constanta de inhibiţie

118

Deci în cazul inhibiţiei competitive constanta cinetică care se modifică este KM, iar în inhibiţia necompetitivă Vmax.

Ki este o constantă cinetică la fel de importantă ca şi KM, cunoaşterea ei permiţând stabilirea eficacităţii diferiţilor inhibitori, inhibitori care au astfel o largă utilizare în medicină ca agenţi chimioterapeutici.

Experimental, determinarea KM se face prin măsurarea vitezei de reacţie (exprimat în unităţi de activitate enzimatică) la diferite concentraţii de substrat. Rezultatele obţinute se reprezintă grafic cu ajutorul formei liniare a ecuaţiei Michaelis-Menten.Una din posibilităţile de linearizare a ecuaţiei Michaelis-Menten este dată de Linewear-Burk prin răsturnarea ecuaţiei (1) şi rearanjarea termenilor:

]S[1x

VK

V!

V1

max

M

max

Dacă se reprezintă grafic 1/V în funcţie de 1/[S] se obţine o dreaptă (I) (Fig.

12) a cărei pantă este KM/Vmax, intersecţia dreptei cu abscisa este –1/KM, iar cu ordonata 1/Vmax. Se poate calcula deci KM şi Vmax.

Determinarea experimentală a Ki pentru ambele tipuri de inhibiţie, se realizează astfel: se lucrează în condiţii identice cu cele de mai sus urmărind variaţia vitezei de reacţie la concentraţie constantă de inhibitor şi concentraţii variabile de substrat. Se reprezintă grafic apoi 1/V în funcţie de 1/[S] şi se calculează de pe grafic KM

’, respectiv Vmax’. Datele obţinute se introduc în ecuaţia

(3), respectiv (4) şi se calculează Ki. Tehnica de lucru Reactivi :

1. Tampon fosfat pH=7,8; 2. Acetiltiocolină 1mM; 3. Benzoilcolină 1mM; 4. NaF 10mM; 5. Ser dil.1/10; 6. DTNB = reactiv de culoare.

Se determină concomitent KM, colinesteraza (ChE) serică pentru acetiltiocolină ca substrat, (principiul determinării fiind dat la determinarea activităţii ChE serice) şi Ki pentru benzoilcolină (inhibitor competitiv prin analogie structurală) şi pentru NaF inhibitor necompetitiv, astfel:

119

Figura nr. 12. Diagrama reacţiilor care se desfăşoară în prezenţă de inhibitor în comparaţie cu reacţia fără inhibitor

Se pregătesc trei serii de eprubete a câte şase eprubete fiecare conform

tabelului: - seria I conţine cantităţi variabile de substrat, tampon fosfat pentru a menţine pH-ul constant şi o cantitate fixă de ser.

- seria II şi III conţin în plus o cantitate fixă de inhibitor. Seria I – fără inhibitor

Reactivi 1 2 3 4 5 M Tampon fosfat 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 1,8 Acetiltiocolină 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 - Ser 1/10 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Incubare 10 minute la temperatura camerei. DTNF 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Se citesc E405nm şi se trec în tabelul cu rezultate. Seria II - inhibitor competitiv / seria III - inhibitor necompetitiv. Reactivi 1 2 3 4 5 M Tampon fosfat 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 1,8 Acetiltiocolină 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 - Benzoilcolină 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 - Seria II- benzoilcolină

0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 -

Seria III – NaF 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 - Ser 1/10 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Incubare 10 minute la temperatura camerei DTNB 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

)KI

[I]1 +(KM

Vmax

Vmax

KMpantafara inhibitor =

pantainhibitor =fara inhibitor

inhibit ia incompet it iva

inhibit ia necompetit iva

inhibitia competit iva

1v0

1[S]

120

Se citesc E405nm şi se trec în tabelul cu rezultate. Calcule:

Concentraţia de substrat/probă se dă în tabelul de rezultate, iar viteza se calculează conform formulei:

nm405nm405 E51

0204

61310E

serdilmM

EmlmoliV ,.

.,.

..min/min//

Rezultatele obţinute se introduc în tabelul de rezultate:

Nr. eprub.

S 1/S Fără inhibitor E405 V 1/V

Inh. competitiv E405 V 1/V

Inh. necompetitiv E504 V 1/V

1 0,1 10 2 0,2 5 3 0,3 3,3 4 0,4 2,5 5 0,5 1,65

Se reprezintă grafic 1/V în funcţie de 1/S pentru cele trei serii de rezultate (Vezi Fig.12), obţinând trei drepte:

Din: - I se calculează Km şi Vmax; - II - Km

’ - III - Vmax

’. Pentru calcularea KI rezultatele se introduc în relaţia:

IMM K

I1KK' sau: IM

MKI1

KK ]['

Unde: [I] = 0,1 ( inh. competitivă), respectiv [I] = 1mM (inh. necompetitivă).

II

KI1

V

Vsau

KI1

VV ][

}[ 'max

maxmax'max

Determinarea activităţii enzimatice a colinesterazei serice nespecifice

Colinesterazele sunt enzime din clasa hidrolazelor, subclasa esteraze. După mecanismul de acţiune sunt serin-hidrolaze.

Se cunosc două enzime:

121

- Acetilcolinesteraza, cu o specificitate strict pentru acetilcolină, este prezentă în diferite ţesuturi, mai cu seamă în eritrocite şi creier şi are un rol major în transmiterea influxului nervos. Prezenţa în eritrocite şi în alte ţesuturi este legată de rolul enzimei în permeabilitatea celulară.

- Acilcolinacilhidrolaza sau colinesteraza nespecifică (pseudocolin-esteraza) hidrolizează nespecific esterii de colină:

Dozarea acestei enzime în ser (valoare normală: 3-8 U/ml ser) are valoare diagnostică în laboratorul clinic:

- este un indicator preţios în depistarea intoxicaţiilor cu organofosforice când activitatea enzimei scade până la 10% din valoarea normală;

- în insuficienţa hepatică (ciroză), este de asemenea scăzută datorită capacităţii reduse de biosinteză proteică a ficatului. Principiul determinării

Pentru vizualizarea produşilor de reacţie se utilizează un analog de substrat: butiriltiocolina (un atom de O este înlocuit cu S) care prin hidroliză enzimatică în prezenţa de ChE pune în libertate tiocolina; aceasta formează cu DTNB ( reactiv de culoare pentru grupările SH) un compus colorat, cu maxim de absorbţie la 412 nm (mM = 13,6 ).

(CH3)3N+- CH2 - CH2 - O - OC - CH3AcChE

(CH3)3N+- CH2 - CH2 - OH + CH3COOH

(CH3)3N+- CH2 - CH2 - OH + R - COOHChE(CH3)3N+- CH2 - CH2 - O - OC - R

(CH3)3N+- CH2 - CH2 - S - OC - (CH2)2 - CH3ChE

(CH3)3N+- CH2 - CH2 - SH + HOOC - (CH2)2 - CH3

(CH3)3N+- CH2 - CH2 - SH + S

COOH

NO2

NO2

COOH

S

O2N

HOOC

NO2

COOH

S - CH2 - CH2 -+N(CH3)3 + HS

122

Reactivi : 1. Soluţie substrat: butiriltiocolină 10mM în tampon fosfat 20mM pH =7,8; 2. Ser dil.1/100; 3. Reactiv de culoare: DTNB 0,2mM în tampon fosfat 20mM pH = 7 şi

etanol 1/1. Tehnica de lucru :

În 2 eprubete se pipetează următorii reactivi:

Reactivi P M Soluţie substrat 0,2 0,2 Ser diluat 1/100 0,2 - Se incubează 10 minute Reactiv de culoare 2,0 2,0 Apă distilată - 0,2

Se citeşte E412nm probei faţă de martor.

Calcul:

nm412nm412

nm412

E882

2400x136

E

seruluidilEEsermsubstratmolisermlUI

,

.min/min///

Pentru determinarea activităţii specifice se dozează şi proteina din serul

respectiv, prin metoda Gornall, astfel: Tehnica de lucru :

În două eprubete se pipetează următorii reactivi:

Reactivi P M Ser diluat 1/100 1,0 - Apă distilată - 1,0 Reactiv Gornall 4,0 4,0

După 15 minute se citeşte extincţia probei la 540 nm faţă de martor.

Calcul:

AE100sermlprotmg 540 ./. A = inversul coeficientului de pantă stabilit la curba de dozare a

proteinelor.

ECA

123

Activitatea specifică a ChE serice va fi egală cu:

sermlprotmgsermlUI

/./

Determinarea activităţii transaminazelor

Transaminazele sunt enzime care catalizează reacţii de transaminare. Reacţiile de transaminare decurg după un mecanism numit: ping - pong. Acest tip de mecanism cinetic se caracterizează prin aceea că unul dintre substrate se leagă de enzimă, căreia îi produce o modificare chimică prin transferul unei grupe aminice, iar produsul realizat din transferul acestui substrat este îndepărtat. Urmează apoi legarea celui de al doilea substrat pe enzimă, substrat care acceptă gruparea funcţională de la enzimă formând al doilea produs care este şi el eliberat. Modificarea chimică este de fapt suportată de către coenzimă având loc o tranziţie reversibilă între PALPO şi piridoxamin fosfat. În reacţiile de transaminare are loc transferul unei grupări aminice donor pe un -cetoacid acceptor. Determinarea activităţii GPT

Transaminaza glutamico-piruvică ( GPT ) catalizează reacţia:

Pentru a doza GPT, se lasă să reacţioneze serul de analizat asupra -cetoglutaratului şi alaninei în soluţie tampon. Cantitatea de piruvat se măsoară fotometric, sub formă de 2,4 – dinitrofenilhidrazonă. Reactivi:

1. Soluţie tampon-substrat (tampon fosfat 100mM pH=7,4; D-L alanina 200mM; acid -cetoglutaric 2 mM);

2. Reactiv de culoare: 2,4-dinitrofenilhidrazină 1mM; 3. Soluţie NaOH 0,4N.

Tehnica determinarii:

În două eprubete se pipetează următorii reactivi:

H3C - CH - COOH + HOOC - CH2 - CH2 - C - COOHGPT

NH2 O

O NH2

H3C - C - COOH + HOOC - CH2 - CH2 - CH - COOH

124

Reactivi (ml) P M Soluţie tampon-substrat 0,5 0,5 Ser proaspăt nehemolizat 0,1 - Apă distilată - 0,1 Se agită şi se incubează 30 de minute la 37oC, apoi se adaugă: Reactiv de culoare 0,5 0,5 Se agită şi se lasă la temp. camerei 20 de minute, după care se adaugă: NaOH 0,4N 5,0 5,0

Se agită şi după 5 minute se citeşte extincţia probei faţă de martor (la 540

nm), în cuvă de 1 cm. Dacă extincţia depăşeşte valoarea de 0,375 se diluează serul 1:10 şi se repetă

determinarea în condiţiile de mai sus.

Corespondenţa între valoarea E546nm şi activitatea enzimatică (mU) este dată în tabelul următor:

E546nm mU/ml E546nm MU/ml 0,025 2 0,200 29 0,050 5 0,225 34 0,075 9 0,250 39 0,100 12 0,275 45 0,125 16 0,300 52 0,125 16 0,300 52 0,175 24 0,350 68 0,375 77

Valorile normale în ser sunt până la 12mU/ml ser.

Determinarea activităţii GOT

Transaminaza glutamico-oxalacetică (GOT) catalizează transferul grupării

amino de la acidul L-aspartic la acidul -cetoglutaric, rezultând acid L-glutamic şi acid oxalilacetic.

Reacţiile care au loc sunt următoarele:

HOOC - CH2 - CH - COOH + HOOC - CH2 - CH2 - C - COOHNH2 O

GOT

O NH2

HOOC - CH2 - C - COOH + HOOC - CH2 - CH2 - CH - COOH

OHOOC - CH2 - C - COOH CH3 - C - COOH + CO2

O

125

Pentru a doza GOT se lasă să reacţioneze serul de analizat asupra -cetoglutaratului şi aspartatului în soluţia tampon.

Piruvatul rezultat în urma reacţiilor de mai sus, reacţionează cu 2,4-dinitrofenilhidrazină în mediu alcalin şi formează 2,4-dinitrofenilhidrazonă de culoare roşie, care se măsoară fotometric la 546 nm. Reactivi:

1. Soluţie tampon-substrat pH 7,4; 2. Reactiv de culoare: 2,4-dinitrofenilhidrazină 1mM; 3. Soluţie NaOH 0,4N.

Tehnica determinării:

În două eprubete se pipetează următorii reactivi: Reactivi (ml) M P Soluţie tampon-substrat 0,5 0,5 Ser proaspăt nehemolizat

0,1 -

Apă distilată - 0,1 Se agită şi se incubează 30 de minute la 37oC, apoi se adaugă: Reactiv de culoare 0,5 0,5 Se agită şi se lasă la temp. camerei 20 de minute, după care se adaugă: NaOH 0,4N 5 5

Se agită eprubetele iar după 5 minute se citeşte extincţia probei faţă de

martor la 546 nm în cuva de 1 cm. Dacă extincţia depăşeşte valoarea de 0,260 se diluează serul 1:10 şi se repetă

determinarea în condiţiile de mai sus.

Corespondenţa între valoarea E546nm şi activitatea enzimatică (mU) este redată în tabelul următor:

E546nm mU/ml E546nm mU/ml 0,020 4 0,160 34 0,040 8 0,180 40 0,060 11 0,200 48 0,080 16 0,220 57 0,100 19 0,240 67 0,120 24 0,260 80 0,140 28

Dacă citirile nu se pot executa la 546 nm se face o curbă de etalonare a piruvatului.

Valorile normale în ser sunt de până la 12mU/ml.

126

Interpretarea rezultatelor GOT: - Creşteri marcate (de 10-100 ori faţă de valorile normale) se observă în:

- infarctul miocardic, - hepatită virală acută, - necroză toxică a ficatului.

- Creşteri moderate se observă în: - evoluţia hepatitelor cronice, - ictere mecanice, - mononucleoză infecţioasă, - anemii hemolitice severe.

GPT: - Creşteri marcate (de aproape 100 ori faţă de valorile normale) apar în:

- hepatita virală acută - necroza toxică a ficatului.

- Creşteri moderate apar în: - hepatita cronică şi ciroze, - ficatul de stază cardiacă şi - mononucleoza infecţioasă. Raportul GOT/GPT se numeşte coeficient DE RITTIS = 1,33 la subiecţii

normali. Acest raport: - scade în leziunile inflamatorii ale ficatului, datorită creşterii

marcante a GPT. - leziunile necrotice duc la creşterea GOT, iar raportul GOT/GPT

creşte. - hemoliza duce la creşteri ale GOT-ului.

Determinarea activităţii γ-glutamiltranspeptidazei serice Principiu:

-Glutamiltranspeptidaza (-GT) catalizează transferul acidului glutamic de pe un donor (-glutamil-p-nitroanilidă), pe un acceptor (glicilglicină). In urma reacţiei se formează p-nitroanilină, colorată în galben (mM = 9,9). Reactivi:

1. Substrat în Tris –HCl; 2. Ser de analizat; 3. Acid acetic 1N.

127

Tehnica de lucru:

Pentru fiecare determinare se pregătesc 2 eprubete în care se pipetează: Reactivi (ml) M P Substrat Tris în HCl 0,30 0,30 Ser - 0,02 Se incubează la 25oC timp de 20 de minute, apoi se adaugă: Acid acetic 1N 1,50 1,50 Ser 0,02 -

Se citeşte extincţia probei faţă de martor la 405 nm după 30 de minute de la

adăugarea ultimului reactiv. Calcul:

1 UI este cantitatea de enzimă care catalizează transferul a 1 mol de acid glutamic de pe un donor pe acceptor la temperatura de 250 C în timp de 1 minut.Activitatea enzimei serice se exprimă în U/L.

Activitatea -GT ( U/L ) = 460 x E405/20 minute Interpretarea rezultatelor

Valori normale: 6 - 28 U/L la bărbaţi; 4 - 18 U/L la femei.

Testul -GT este folosit în diagnosticul suferinţelor hepatice, fiind mult mai sensibil decât fosfataza alcalină pentru depistarea formelor de colestază şi este singurul test enzimatic pentru decelarea hepatopatiilor alcoolice.

Valori crescute se întâlnesc şi în: - hepatite cronice, - neoplasm primitiv sau metastazic al ficatului, - insuficienţă cardiacă cu stază hepatică sau - leziuni pancreatice - administrare de barbiturice - la alcoolici.

O2N NH - C = O + CH2 - COOH

(CH2)2

CH - NH2

COOH

NH - C = O

CH2 - NH

O2N NH2 + CH2 - COOH

NH - C = O

CH2 - NH

(CH2)2

CH - NH2

COOH

C = O

128

IX. ANALIZA BIOCHIMICĂ A LIPIDELOR

Lipidele sunt compuşi organici care intră în constituţia tuturor organismelor vii şi care au o caracteristică comună, aceea de a fi insolubile în apă, dar uşor solubile în solvenţi organici. Din punct de vedere chimic, lipidele sunt esteri ai unor polialcooli cu acizii graşi superiori. Ele constituie o clasă heterogenă de substanţe organice, iar gruparea lor în aceeaşi clasă de substanţe se face numai pe baza proprietăţilor lor fizice de solubilitate.

IX.1.CLASIFICAREA LIPIDELOR A. Din punct de vedere structural lipidele se împart în:

I. Lipide simple : - esteri ai acizilor graşi cu glicerina (triacilgliceroli) - esteri ai acizilor graşi cu alcooli superiori

monocarboxilici (ceruri) II. Lipide complexe: - glicerofosfolipide: esteri ai glicerinei cu acizi graşi,

compuşi azotaţi şi un rest de acid fosforic - sfingolipide: conţin un alcool (sfingozina), acizi

graşi, compuşi azotaţi şi un rest de acid fosforic Exemple: - fosfolipide - glicolipide - sulfatide - aminolipide - lipoproteine

III. Derivaţi ai lipidelor sunt compuşi rezultaţi prin hidroliza lipidelor simple şi complexe.

Exemple: - acizii graşi: - saturaţi - nesaturaţi - glicerina - steroizi - aldehide grase - corpi cetonici

B. Din punct de vedere funcţional lipidele se împart în :

I. Lipide de rezervă. Acestea sunt localizate în ţesutul adipos şi sunt constituite în special din trigliceride de provenienţă exogenă (alimentară) II. Lipidele citoplasmatice sunt lipide complexe care alcătuiesc elementul constant care variază numai în funcţie de natura ţesutului.

129

IX.2.REACŢII DE IDENTIFICARE A ACIZILOR GRAŞI Grăsimile neutre supuse acţiunii hidrolitice ale alcalilor, acizilor minerali sau enzimelor lipolitice se scindează în glicerol şi acizi graşi conform reacţiei:

CH2 OCO

CH OCO

CH2 OCO

R

R

R

+

3 H2OCH

CH2

OH

CH2 OH

OH

+3 R COOH

Identificarea acizilor graşi prin saponificare

Grăsimile se hidrolizează sub acţiunea NaOH în glicerol şi săpunul de sodiu al acidului gras respectiv. Reactivi:

1. NaOH 2. alcool de 96% 3. acid acetic glacial 4. soluţie de clorură de bariu 10% 5. soluţie saturată de clorură de sodiu 6. grăsime: untdelemn

Mod de lucru Într-o eprubetă se introduc câteva picături de ulei (3-4 picături), se adaugă 1-2 bucăţi NaOH şi 5 ml alcool. Amestecul se încălzeşte pe baia de apă şi după cca 10 minute se observă cum grăsimea dispare deoarece se formează săpunul de sodiu solubil în alcool.

Eprubeta se umple cu apă distilată şi se observă apariţia unei slabe opalescenţe datorită soluţiei coloidale de săpun. Conţinutul eprubetei se împarte în 3 şi se fac următoarele reacţii:

1. În prima eprubetă se încearcă punerea în libertate a acizilor graşi din sarea lor prin adăugare de acid acetic până la reacţie acidă (se va încerca cu hârtie indicator). Acizii graşi eliberaţi fiind insolubili se va obţine un precipitat abundent.

R COONa + H3C COOH R COOH + H3C COONa

2. În a doua eprubetă se adaugă câteva picături dintr-o soluţie de clorură de

bariu. În urma unei reacţii de înlocuire se formează un precipitat bogat de săpun de bariu insolubil.

2 R COONa + BaCl2 (R COO)2Ba

+ 2 NaCl

130

3. În ultima eprubetă se face flocularea săpunului coloidal prin adăugarea unui exces de soluţie saturată de clorură de sodiu.

Identificarea acizilor graşi nesaturaţi Identificarea acizilor graşi nesaturaţi din compoziţia grăsimilor se bazează pe proprietatea lor de a adiţiona iod la dubla legătură pe care o conţin.

H3C (CH2)n CH CH (CH2)n COOH + I2 H3C (CH2)n CH CH (CH2)n COOH

I I Reactivi: 1. untdelemn

2. tinctură de iod 3. soluţie de amidon

Mod de lucru La cca 5 ml ulei se adaugă câteva picături de soluţie de iod. Se agită bine până când mediul capătă o culoare roşie. Prin încălzirea uşoară a amestecului se observă dispariţia culorii roşii. Dacă soluţia se răceşte şi se încearcă prezenţa iodului cu câteva picături de soluţie de amidon, se constată că nu se obţine culoarea albastră pe care o dă iodul cu amidonul ceea ce denotă lipsa iodului liber. Iodul adăugat se fixează la dubla legătură formând un derivat diiodurat al grăsimii cercetate.

IX.3.LIPOPROTEINELE Există şase clase de lipoproteine divizate în funcţie de dimensiune şi

conţinutul de lipide. Densitatea acestor lipoproteine şi viteza de sedimentare la ultracentrifugă este invers proporţională cu conţinutul lor de lipide.

Clase de lipoproteine

Lipoproteinele Dimensiuni [nm]

Compoziţia Proteine Colesterol

liber Ester de

colesterol Trigliceride Fosfolipide Locul de

Formare Chilomicroni 75-1000 2 2 3 90 3 Intestin Chilomicroni

Rest 30-80 ... ... ... ... ... Capilare

Lipoproteine cu densitate foarte

scăzută VLDL

30-80 8 4 16 55 17 Ficat şi intestin

Lipoproteine cu densitate

intermediară IDL

25-40 10 5 25 40 20 VLDL

Lipoproteine cu densitate scăzută

LDL

20 20 7 46 6 21 IDL

Lipoproteine cu densitate mare

HDL

7.5-10 50 4 16 5 25 Ficat şi intestin

131

În general, lipoproteinele au o formă sferică şi conţin un miez hidrofob bogat în trigliceride şi esteri de colesterol, înconjurat de fosfolipide şi proteine care reprezintă gruparea hidrofilă (Fig. 13.).

Fig. 13. Structura LDL, receptorul LDL şi legarea LDL de ApoB100

Componentele proteice a lipoproteinelor sunt denumite apoproteine. Principalele apoproteine sunt: Apo E, Apo C, şi Apo B.

Apoproteine Apoproteine Locul de sinteză Funcţia

A-I Intestine, ficat activează LCAT AII Intestine, ficat B100 Ficat transportă trigliceride şi colesterol se leagă de LDL B48 Intestine transportă trigliceride C-I Ficat activează LCAT C-II Ficat activează lipoproteinlipaza C-III Ficat inhibă lipoproteinlipaza E ficat, intestin,

macrofage se leagă de receptorul LDL şi probabil şi de alt receptor al ficatului

Există două forme de Apo B: una cu greutate moleculară relativ joasă Apo B48, care este caracteristică

sistemului exogen şi care transportă lipidele exogene ingerate Apo B100 cu greutate moleculară mai mare care este caracteristică sistemului

endogen.

Chilomicronii sunt proveniţi din lipidele alimentare şi absorbiţi în mucoasa intestinală. Complexele lipoproteice mari intră în circulaţie prin canalele limfatice. După mâncare, sunt multe astfel de particule în sânge, care determină aspectul lăptos al plasmei (hiperlipemia postprandială).

132

Chilomicronii sunt îndepărtaţi din circulaţie sub acţiunea lipoproteinlipazei, care este localizată la nivelul endoteliilor vasculare, în special al capilarelor. Enzima catalizează scindarea trigliceridelor din chilomicroni la acizi graşi liberi şi glicerol. Acizii graşi liberi intră după aceea în celulele adipoase şi se reesterifică, restul rămaşi în circulaţie se fixează de albumină. Lipoproteinlipaza, care necesită prezenţa heparinei ca şi cofactor, îndepărtează de asemenea trigliceridele din lipoproteinele cu densitate foarte joasă (VLDL).

Chilomicronii şi VLDL conţin Apo C, complex de proteine care îi desparte în capilare. O componentă a complexului, apolipoproteina C-II, activează lipoprotein lipaza.

Chilomicronii din care s-au îndepărtat trigliceridele rămân în circulaţie ca şi lipoproteine bogate în colesterol, denumiţi rest de chilomicroni, care au un diametru de 30-80 nm. Ei sunt transportaţi la ficat, unde se leagă de receptorii restului de chilomicroni şi LDL. Ei sunt îndată internalizaţi prin intermediul unor receptori specializaţi printr-un proces de endocitoză şi degradaţi în lizozomi.

Chilomicronii şi resturile lor constituie un sistem de transport pentru lipidele exogene ingerate.

Există de asemenea un sistem endogen format din VLDL, lipoproteine cu densitate intermediară (IDL), lipoproteine cu densitate joasă (LDL) şi lipoproteine cu densitate mare (HDL), care transportă trigliceridele şi colesterolul în tot corpul.

VLDL se formează în ficat şi transportă trigliceridele formate din acizii graşi şi hidraţii de carbon din ficat la ţesuturile extrahepatice. După ce trigliceridele sunt în mare măsură îndepărtate cu ajutorul lipoproteinlipazei, VLDL devin IDL.

IDL îndepărtează fosfolipidele şi prin acţiunea enzimei plasmatice lecitin-colesterol aciltransferază (LCAT), captează esterii de colesterol formaţi din colesterol în HDL. O parte de IDL este preluată de ficat. IDL rămas după aceea mai pierde trigliceride şi proteine, probabil în sinusoidele ficatului şi devine LDL. În timpul acestor transformări pierd Apo E, dar Apo B100 rămân.

LDL furnizează colesterol la ţesuturi. Colesterolul este un constituent al membranelor celulare şi este utilizat de celulele glandulare pentru a sintetiza hormoni steroizi.

În ficat şi în cele mai multe ţesuturi extrahepatice, LDL este captat de un receptor prin intermediul endocitozei. Receptorii recunosc componenta Apo B100 a LDL. Ei de asemenea leagă şi Apo E, dar nu leagă Apo B48 (Fig. 14.).

133

Fig.14. Metabolismul lipoproteinelor

Receptorul LDL

Receptorul uman pentru LDL este unul din clasa de receptori care s-au specializat pentru de transportul macromoleculelor în celule prin endocitoză. Este un complex molecular mare format dintr-un rest de aminoacid cu cisteină în poziţia 292 care leagă LDL.

Particulele lipoproteice captate de receptori pătrund împreună cu aceştia în interiorul celulei formând microvezicule numite endozomi. Prin acidifierea endozomilor receptorul se desface din complexul cu particula lipoproteică şi este readus la suprafaţa celulei.

În cazul receptorului LDL, dar nu şi a receptorului restului de chilomicroni, are loc eliberarea receptorilor LDL, care se reciclează la membrana celulară (Fig. 15.). Endozomii după aceea se contopesc cu lizozomii, unde colesterolul (format din esterii de colesterol sub acţiunea lipazei acide din lizozomi) devine disponibil pentru nevoile celulei.

Colesterolul în celule inhibă sinteza intracelulară de colesterol prin inhibarea HMG-CoA reductazei, stimulează esterificarea colesterolului eliberat în exces şi inhibă sinteză de noi receptori LDL. Cu ajutorul acestor mecanisme se realizează controlul cantităţii de colesterol din celulă.

LDL sunt preluaţi de macrofage cu afinitate redusă şi încă multe alte celule. În plus, macrofagele preiau LDL modificat prin oxidare. Oxidarea poate avea loc în macrofag.

134

Fig. 15. Calea receptorului LDL

Antioxidanţii administraţi experimental la animale, ca de exemplu vitamina

E, pot încetini evoluţia aterosclerozei. Receptorul LDL de pe macrofage şi de pe celulele asemănătoare se numeşte receptorul epurator „scavenger”. El este diferit de receptorul de pe alte celule şi are o afinitate mai mare pentru LDL modificat. Când macrofagele devin supraîncărcate cu LDL oxidat, se transformă în „celule spumoase” care se întâlnesc în leziunile iniţiale ale aterosclerozei.

În starea staţionară, mişcarea colesterolului în şi din celulă este echilibrată. HDL - aceste lipoproteine sunt sintetizate în ficat şi intestin. A fost

identificat un receptor separat de HDL. Se găseşte în primul rând în glandele endocrine care secretă hormoni steroizi şi în ficat. Sistemul HDL transferă colesterolul la ficat, care apoi este excretat în bilă. Astfel scade colesterolul din plasmă.

Apo E este sintetizată în celulele din creier, splină, plămâni, glandele suprarenale, ovare, rinichi şi ficat. Concentraţia ei creşte în leziunile nervoase, unde pare să joace un rol în regenerarea ţesutului nervos.

Gena apolipoproteinei E este prezentă la populaţia generală în trei alele: Apo-2, Apo-3, şi Apo-4. Apo-4 este mai puţin comună decât Apo-2 şi Apo-3 dar este bine reprezentată la pacienţii cu boala Alzheimer şi predispune la această boală.

IX.4. TULBURĂRI ALE METABOLISMULUI LIPIDIC Atât hiper- cât şi hipolipoproteinemiile pot avea un caracter primar sau

secundar unor diverse îmbolnăviri. Până în prezent nu există o clasificare satisfăcătoare. Nici clasificarea

genetică, nu s-a dovedit a fi bună, datorită mutaţiilor genetice. De exemplu, hipercolesterolemia familială cu xantelasmă, xantoame tendinoase, hipercolesterolemia severă şi ateroscleroza coronariană precoce, se pot datora uneia

135

dintre cele 150 mutaţii ale genei receptorului LDL. Hipercolesterolemia familială care prezintă durere recurentă abdominală şi pancreatită poate fi rezultatul unei mutaţii genetice a lipoproteinlipazei sau a apo C-II.

O clasificare simplificată se face în primare (familiale) şi secundare (câştigate).

Tulburări cu caracter primar

Clasificarea propusă de Fredrickson sau OMS este cea mai acceptată pentru hiperlipemiile primare (Fig. 16.) şi se bazează pe evaluarea creşterii unei anumite fracţiuni electroforetice a lipoproteinelor serice.

Tipul Normal Tipul I Tipul II-a Tipul II-b Tipul III Tipul IV Tipul V Plasmă

(12 h la +4°C)

Lipoproteine N ↑Chilomicroni ↑LDL ↑LDL ↑VLDL

↑IDL ↑VLDL ↑ Chilomicroni ↑VLDL

Colesterol total

N N sau ↑ ↑ ↑ ↑ N sau ↑ N sau ↑

Trigliceride N ↑↑ N ↑ ↑ ↑ ↑↑ LDL

colesterol N N sau ↓ ↑ ↑ N sau ↓ N N

HDL colesterol

N N sau ↓ N sau ↓ N sau ↓ N sau ↓ N sau ↓ N sau ↓

Fig. 16. Clasificarea Fredrickson al dislipidemiilor

Cele şase clase de hiperlipoproteinemii definite în clasificarea Fredrickson

nu sunt la fel de frecvente. Tipurile I şi V sunt rare, în timp ce tipurile IIa, IIb şi IV frecvente. Tipul III de hiperlipoproteinemie cunoscută şi ca disbetalipoproteinemie familială, este de frecvenţă medie, 1/5.000. Hiperlipoproteinemii

Tipul I sau hiperchilomicronemia este o boală rar întâlnită şi are un

caracter autozomal recesiv. Se caracterizează prin creşterea excesivă a trigliceridelor serice (1.000

mg/dl) în timp ce colesterolul poate varia în limite normale. Electroforeza lipoproteinelor serice evidenţiază creşterea chilomicronilor.

Caracteristică este smântânirea plasmei la +4°C.

136

Modificările se datoresc deficitului genetic de lipoproteinlipază sau unui deficit de apo C-II.

La aceşti subiecţi se constată hepatomegalie, pancreatită acută, dureri abdominale şi apariţia pe tegumente a xantoamelor eruptive.

Tipul II sau hipercolesterolemia familială se caracterizează prin creşterea

izolată a colesterolului din LDL şi implicit a betalipoproteinelor. Transmiterea se face printr-un mecanism autozomal dominant, iar homozigoţii prezintă creşteri mari ale colesterolemiei cu valori de peste 600 mg/dl.

Se diferenţiază două subtipuri: - subtipul II-a sau hiperbetalipoproteinemia pură şi - subtipul II-b, în care alături de hiperbetalipoproteinemie se

constată şi o creştere a fracţiunii prebeta şi a trigliceridelor. Dezvoltarea leziunilor aterosclerotice asociate cu fenomene clinice severe

merg până la infarct miocardic, care survine de multe ori înainte de 20 de ani. Totodată se produc infiltraţii cu colesterol în piele şi tendoane constituind aşa zisele xantoame tendinoase, xantelasma şi xantoame tuberoase pe genunchi, fese şi coate. Mecanismul de producere constă într-un deficit sever al receptorilor pentru LDL.

Tipul III sau disbetalipoproteinemia care se caracterizează prin creşterea

concomitentă a trigliceridelor şi colesterolului datorită nivelului anormal crescut de lipoproteine cu densitate foarte joasă care au o mobilitate electroforetică anormală şi cărora li s-a atribuit termenul de beta-VLDL. Aspectul electroforezei este de bandă beta lată, în care izolată prin ultracentrifugare, raportul colesterol/trigliceride este mai mare ca 0,30, la subiecţii normali acest raport fiind sub 0,25.

Anomalia se transmite autozomal recesiv. Bolnavii prezintă risc crescut pentru apariţia precoce a manifestărilor

clinice ale aterosclerozei. Ei sunt supraponderali, hiperuricemici şi prezintă o toleranţă scăzută la testul de încărcare cu glucoză. Xantoamele tuberoeruptive şi palmare sunt frecvente.

Tipul IV este o anomalie cu caracter autosomal dominant ce se

caracterizează prin creşterea lipoproteinelor cu densitate foarte joasă (prebeta). Colesterolul este normal sau uşor crescut, în timp ce trigliceridele cresc mult.

Subiecţii prezintă xantoame eruptive, iar ateroscleroza şi infarctul miocardic survin frecvent.

Tipul V se caracterizează prin creşterea fracţiunii prebeta (VLDL) şi a

trigliceridelor, precum şi a chilomicronilor. Manifestările clinice sunt uneori asemănătoare celor din tipul I, iar ateroscleroza nu este frecventă.

Hipolipemii primare

Sunt cauzate de un deficit genetic în procesul de sinteză al lipoproteinelor.

137

Abetalipoproteinemia este o afecţiune genetică autosomal recesivă. Anomalia este determinată de un deficit în procesul de sinteză a apoproteinei B. Se constată lipsa totală a betalipoproteinelor, prebetalipoproteinelor, şi a chilomicronilor şi o scădere a fracţiunilor alfa 1.

Boala se asociază cu: - tulburări în absorbţia lipidelor care se elimină prin scaun, - modificări de formă ale eritrocitelor care au un aspect crenelat (acantocitoză). - tulburări nervoase care se caracterizează prin ataxie cu demielinizarea cordoanelor posterioare şi laterale.

Hipobetalipoproteinemia sau boala Tangier este o boală genetică cu

transmitere autosomal dominantă şi constă în reducerea vitezei de sinteză a lipoproteinelor beta. Nivelurile LDL şi VLDL sunt de aproximativ 50% din cele normale, colesterolemia oscilează între 55-146 mg/100 ml.

Manifestările clinice semnalate la subiecţii cu abetalipoproteinemie lipsesc. Hipoalfalipoproteinemia se caracterizează prin reducerea nivelului de

HDL şi o structură anormală. Transmiterea bolii este autosomal dominantă. Valoarea colesterolului este sub 100 mg/100 ml, trigliceridele sunt uşor

crescute. Bolnavii au hepatosplenomegalie şi adenopatii. Există şi un anumit grad de opacifiere a corneei.

Deficitul familial de lecitin-colesterol aciltransferază (LCAT) - boala

este caracterizată de insuficienta sinteză a enzimei LCAT care catalizează reacţia de esterificare a colesterolului prin transferul unui acid gras nesaturat de pe molecula de lecitină.

Se transmite autosomal recesiv. Colesterolul are valori cuprinse între 300-600 mg/100 ml.

Manifestările clinice se datorează proteinuriei, anemiei şi poate evolua spre insuficienţă renală.

Tulburări cu caracter secundar

Hiperlipemii secundare

Survin în situaţii extrem de variate cum sunt: diabetul zaharat, alcoolismul, insuficienţa renală cronică, hipotiroidism, gută, tratament cu estrogeni, boala Addison etc.

În cazul diabetului zaharat se produce o mobilizare exagerată a acizilor graşi liberi din ţesutul adipos care împreună cu reducerea activităţii lipoproteinlipazei duce la hipertrigliceridemie.

În majoritatea cazurilor de sindrom nefrotic se constată o creştere a

138

colesterolului şi a trigliceridelor. Pierderile urinare de proteine reprezintă un stimul important pentru sinteza hepatică de proteine şi lipoproteine. Remisiunea sindromului nefrotic sau corectarea hipoalbuminemiei duce la normalizarea spectrului lipidic demonstrându-se astfel caracterul secundar al hiperlipidemiei nefroticilor.

Hiperlipidemia din alcoolism se caracterizează prin creşterea trigliceridelor care se explică prin creşterea mobilizării acizilor graşi liberi şi încetinirea oxidării acizilor graşi.

Caracteristica hiperlipidemiei din hipotiroidism este creşterea colesterolului şi în special a LDL-colesterolului. Hipolipemii secundare

Pot fi consecinţa unei sinteze deficitare de lipoproteine sau a unui catabolism exagerat al acestora.

Hipolipemii fiziologice prezintă nou-născuţii în cursul primei săptămâni de viaţă pentru ca apoi la aproximativ 4 luni să se stabilească la valorile întâlnite la copii între 1-16 ani.

Hipolipemii patologice se întâlnesc în: - denutriţie,

- anemiile acute, - cursul reacţiei de fază acută, - sindroamele de malabsorbţie, - insuficienţa hepatică avansată. - hipertiroidismul sever evoluează cu o scădere a colesterolului şi a

beta lipoproteinelor. Ateroscleroza

Din punct de vedere biochimic ateroscleroza se caracterizează prin depunerea de esteri de colesterol şi de alte lipide în ţesutul conjunctiv al pereţilor arteriali.

S-a arătat că ateroscleroza predispune la infarct miocardic, accidente vasculare cerebrale, sindrom de ischemie periferică, etc.

Printre factorii incriminaţi se numără supraalimentaţia şi, în special, alimentaţia mai bogată în grăsimi de origine animală, stări de încordare psihică şi sedentarismul.

Studii clinice şi de laborator au arătat că leziunile aterosclerotice survin frecvent în diabetul zaharat, nefroze şi hipotiroidism, afecţiuni în care nivelul colesterolului seric este ridicat.

Dezvoltarea leziunilor aterosclerotice este rezultanta unor interacţiuni complexe între lipoproteinele plasmatice şi diversele componente ale peretelui

139

arterial. Fenomenele implicate în aterogeneză sunt: 1. Acumularea intra şi extracelulară de material lipidic, mai ales colesterol,

în prezenţă de apoB100 care se fixează cu mare afinitate în peretele arterial. Există dovezi că macrofagele captează mai ales particulele de LDL modificate (peroxidate, glicozilate, malonilate) relativ bogate în apoB100.

2. Migrarea unor monocite din sângele circulant sau macrofage din peretele arterial în care pătrund fie prin diapedeză, fie la nivelul leziunilor şi formează celulele spumoase. Macrofagele sau monocitele încărcate cu LDL îşi reduc mobilitatea şi rămân blocate în peretele arterial ca macrofag rezistent care continuă să înglobeze LDL oxidate şi apoi să se transforme în celule spumoase.

3. LDL oxidate şi macrofagele încărcate cu aceste particule exercită un efect nociv având ca urmare proliferarea celulelor musculare din peretele arterial.

4. Consecinţa acestui proces este îngroşarea plăcii ateromatoase şi implicit îngustarea lumenului vascular. Celulele musculare proliferate dobândesc proprietăţi secretorii cu formare de fibre de colagen, elastină şi proteoglicani. Se formează o capsulă fibroasă ce include un material cremos gălbui format din celule spumoase, detritusuri celulare şi material lipidic extracelular.

5. În condiţiile în care se perforează capsula fibroasă se ulcerează placa ateromatoasă, conţinutul acesteia, care conţine şi un bogat factor tisular, activând coagularea.

6. În contact cu peretele vascular şi cu elementele sângelui circulant determină complicaţii trombotice.

Este important de subliniat pentru patologia clinică că deşi, proliferarea celulelor musculare netede şi formarea ţesutului fibros îngustează lumenul vascular, totuşi contribuie la integritatea plăcii. Acest proces determină formarea unei plăci ateromatoase stabile care pe plan clinic corespunde unei afecţiuni relativ benigne. Cu toate acestea, unele plăci ateromatoase cu o capsulă fibroasă subţire se pot fisura uşor şi pot duce la formarea de trombi, şi implicit, la sindroame coronariene acute precum angină instabilă, infarct miocardic şi moarte subită.

Tromboza constituie prin urmare cel mai important eveniment în evoluţia naturală a plăcii ateromatoase. Tromboza oclusivă a arterei produce o complicaţie majoră a aterosclerozei. Acest lucru depinde şi de o eventuală predispoziţie la tromboză a pacientului, determinată de o hiperreactivitate a plăcuţelor şi de o hipercoagulabilitate şi/sau de o insuficienţă a sistemului fibrinolitic. Tratamentul hiperlipemiilor

Dezvoltarea unei hiperlipemii depinde de factorii genetici şi de obiceiurile

alimentare şi de viaţă, profilaxia putând fi considerată ca o problemă de educaţie sanitară.

140

Tratamentul constă în: 1. Regim igieno-dietetic care va fi adaptat după tipul de hiperlipemie:

- în caz de hipercolesterolemie se vor exclude alimentele bogate în colesterol.

- în hipertrigliceridemia endogenă (tipul III, IV, V) se recomandă reducerea hidraţilor de carbon.

Este deosebit de utilă şi cultura fizică medicală. Se aplică în centre specializate sub control medical strict în funcţie de anomalia lipidică.

2. Medicaţie cu efect hipolipemiant care să aibă efecte secundare minime, să reducă nivelul colesterolului, fosfolipidelor, trigliceridelor şi betalipoproteinelor

- exemplu: Clofibrat, Cuemid, Questran, Lovastatin, Simvastatin etc.

141

X. ANALIZA ACIZILOR NUCLEICI Acizii nucleici sunt molecule informaţionale cu rol în stocarea, transmiterea şi exprimarea mesajului genetic. Ei reprezintă cele mai importante molecule din celulă, asigurând prin ADN banca de date şi centrul de coordonare al celulei, iar prin ARN punerea în aplicare a comenzilor date de ADN-ul nuclear. Din punct de vedere chimic acizii nucleici sunt catene polinucleotidice cu masă moleculară mare, în care unităţile de bază, nucleotidele, sunt legate între ele prin legături 3 ‘,5 ’ –fosfodiesterice. O nucleotidă are în compoziţie:

- o bază azotată (purinică sau pirimidinică) - o pentoză - o moleculă de acid fosforic

X.1.ANALIZA ADN-ULUI CELULAR

Determinarea ciclului ADN-ului celular. Determinarea fazei ciclului

ADN-ului celular în diferite condiţii experimentale aduce informaţii majore despre capacitatea de multiplicare a celulei şi influenţa asupra acestei funcţii a diverselor preparate farmacologice.

Monitorizarea procesului de activare sau determinarea degradării ADN în cadrul apoptozei celulare este posibilă cu ajutorul analizelor de citometrie de flux.

Majoritatea celulelor neactivate sunt diploide, în timp ce iniţierea procesului de proliferare şi trecerea celulei de la G0 la M este însoţită de modificarea nivelului de ploidie.

Iodura de propidiu este o substanţă fluorescentă care absoarbe lumina la 488 nm şi emite la 560- 600nm. Ea se ataşează la ADN-ul şi ARN-ul celular dublu catenar şi emite o undă de lumină proporţională cu cantitatea de material genetic la care se leagă. Eliminarea ARN-ului prin utilizarea ARN-azei permite analiza doar a ADN-ului celular. Fluorocromul poate pătrunde intracelular numai dacă membrana celulară este degradată, membranele celulare intacte nepermiţând intrarea lui în celulă. Principiul metodei.

În cadrul activării lor, celulele pot trece din faza G0 spre G1, S, G2 şi, în final, la faza M, prin modificarea cantităţii de ADN pe care o deţine. Colorarea ADN-ului celular cu o substanţă fluorescentă şi determinarea intensităţii fluorescenţei acesteia furnizează informaţii despre faza ciclului de diviziune în care se află fiecare celulă dintr-o suspensie. Materiale necesare.

- Suspensie de celule, - iodură de propidiu, - Triton X-100, - TFS, - EDTA,

142

- metanol, - ribonuclează (RNA-ază), - sticlărie de laborator, - centrifugă, - tuburi de plastic 12 x 75 mm (Falcon 2054) cu capac, - vortex, - citometru de flux etc.

Tehnică de lucru. Se pregăteşte soluţia de colorare (care constă din 10 mg de iodură de

propidiu, 0,1 ml Triton X-100, 3,7 mg de EDTA şi 90 ml de TFS ), soluţia de ARN-ază (10 mg de ARN-ază în 5 ml TFS) şi o baie de gheaţă pe care se vor lucra probele.

Suspensia de celule se ajustează la 1 x 10 celule/ml în TFS rece, se porţionează câte 1 ml în fiecare tub de analiză şi se centrifughează timp de 10 min la 200xg, după care tuburile se ţin pe gheaţă. Peste sedimentul de celule se adaugă metanol în picături, la rece, până la volumul de 2 ml/tub, în acelaşi timp agitând probele la vortex. Tuburile se incubează pe gheaţă timp de 30 de min, apoi se centrifughează timp de 5 min la 300xg. La sedimentul de celule din fiecare tub se adaugă fie 500μl de TFS, care conţine iodură de propidiu ( PI ) 100μl /ml, fie acelaşi volum din soluţia de colorare (alegerea depinde de tipul de celule investigate) şi 500μl din soluţia de ARN–ază în TFS (concentraţie finală 100 unităţi/ml).

Probele se agită cu ajutorul unui vortex, se incubează pentru 30 min. la temperatura camerei, apoi se analizează la un citometru de flux. Aparatul este calibrat cu o suspensie de microsfere de polistiren fluorescente cu diametrul de 10μm în vederea stabilirii unor standarde dimensionale. Sunt măsurate simultan mărimea şi granularitatea celulelor pentru a exclude din analiză debriurile celulare, iar fluorescenţa se citeşte la lungimea de undă trecută prin filtrul 578/28 nm.

X.2. IZOLAREA ACIZILOR NUCLEICI Acizii nucleici (ADN şi ARN) sunt macromolecule formate prin policondensarea nucleotidelor. Un nucleotid este format prin legarea unei baze purinice sau pirimidinice de o pentoză fosforilată în poziţia 5’. Astfel fiecare lanţ polinucleotidic are un capăt 5’ şi unul 3’ . Bazele purinice din ADN sunt adenina (A) şi guanina (G), iar cele pirimidinice timina (T) şi citozina (C). Bazele purinice din ARN sunt adenina (A) şi guanina (G), iar cele pirimidinice uracilul (U) şi citozina (C). Nucleotidele se leagă prin legături fosfodiesterice. Acizii nucleici se găsesc peste tot în lumea vie: virusuri, procariote şi eucariote. Spre deosebire de organismele cu organizare celulară, virusurile conţin un singur tip de acid nucleic, fiind clasificate în ADN-virusuri şi ARN-virusuri. Diferitele vieţuitoare conţin molecule de ADN de lungimi diferite şi cu succesiuni

143

de nucleotide specifice care codifică lanţurile polipeptidice din organismul respectiv, precum şi secvenţele de control necesare. Moleculele ADN sunt cel mai adesea formate din două lanţuri polinucleotidice antiparalele, capetele 5’ şi 3’ fiind orientate invers în cele două lanţuri. Se formează astfel o dublă spirală cu bazele orientate în interior unde formează perechi complementare, prin legături de hidrogen, A-T (două legături de hidrogen) şi G-C (trei legături de hidrogen). Moleculele de ARN sunt cel mai adesea monocatenare, alcătuite dintr-un singur lanţ polinucleotidic.

Fig. 17. Structura ADN dublu catenar; după J.D.Watson şi colab. (1992)

Sunt mai multe tipuri de ADN dublu helix descrise de J. Watson şi F. Crick

( premiul Nobel în 1963 ) şi apoi de alţii ( A. Wang, A. Rich ), cel mai frecvent întâlnit fiind aşa numita formă B cu 10 nucleotide pe tură, orientate perpendicular pe axul lung al moleculei. Pasul helixului este de 3,4 nm şi diametrul de 2,0 nm. Împerecherea bazelor, pe baza complementarităţii, constituie aspectul principal pe care se bazează metodele de identificare a secvenţelor de ADN. În ultimele decenii au fost precizate numeroase aspecte cu importanţă teoretică şi practică deosebită pentru toate disciplinele biologice. Se poate afirma

144

totuşi că indiferent de aspectul studiat prima condiţie rămâne izolarea în stare pură şi cu structura intactă, nedenaturată a tipului de acid nucleic care urmează a fi analizat din punct de vedere al proprietăţilor fizice, chimice sau biologice. Principii de izolare ale ADN

1. Eliberarea conţinutului intracelular. Acest proces se poate face în diferite moduri depinzând de proba din care vrem să izolăm ADN :

- mecanic prin omogenizare urmată de liză cu un detergent - prin mojarare cu oxid de aluminiu a probelor îngheţate în azot lichid - prin ultrasunete sau liză cu enzime specifice (lizozim pentru bacterii) 2. Precipitarea proteinelor într-un mediu care inhibă ADN hidrolazele: sunt

folosite diferite amestecuri de solvenţi organici după adăugarea unui agent care desprinde proteinele asociate din cromatină. De exemplu se folosesc concentraţii mari de NaCl, iar ca amestec denaturant fenolul simplu sau în amestec cu cloroform.

3. Purificarea avansată prin adăugarea de proteaze şi ribonucleaze pentru a hidroliza ARN

4. Recoltarea prin centrifugare a stratului care conţine ADN dizolvat 5. Precipitarea selectivă a ADN cu etanol la rece ( sau alt alcool ) 6. Recoltarea ADN prin răsucirea pe o baghetă sau prin centrifugare

X.2.1. IZOLAREA ADN DIN MATERIALE BIOLOGICE Principiu: Primul pas pentru succesul unei metode de biologie moleculară îl reprezintă izolarea ADN din celule. Oricare ar fi materialul utilizat, acesta trebuie să fie proaspăt sau congelat înainte de utilizare pentru a împiedica degradarea ADN-ului de către enzimele prezente în extractul celular. Celulele trebuie distruse pentru a elibera componentele sale. Eliberarea conţinutului intracelular se poate face în diferite moduri depinzând de proba din care vrem să izolăm ADN. Urmează precipitarea proteinelor, iar apoi purificarea avansată prin adăugarea de proteaze şi ribonucleaze, urmată de recoltarea prin centrifugare a stratului care conţine ADN dizolvat.

Metoda de izolare a ADN din timus de viţel Timusul reprezintă un organ deosebit de bogat în celule şi cu puţină substanţă fundamentală, de aceea este materialul preferat pentru extracţia ADN-ului, în cazul în care nu urmărim scopuri speciale. Metoda se poate aplica şi altor ţesuturi dar randamentul va fi mai mic.

145

Echipament, materiale şi reactivi:

1. Omogenizator 2. Baie de apă termostatată 3. Centrifugă cu răcire, cu tuburi de sticlă de 100 ml.

4. Agitator mecanic 5. Timus de viţel congelat la -20ºC 6. Soluţie NaCl 0,15 M; citrat de Na 0,01 M; pH=7 7. Soluţie citrat de Na 0,15 M; pH=7 8. Soluţie SDS 20% (dodecilsulfat de sodiu) 9. Amestec fenol saturat cu apă: cloroform: alcool amilic în raport 7:

3,5: 1 10. Etanol absolut 11. Cristale NaCl 12. Tampon Tris-KCl-citrat ( Tris 0,015 M; KCl 0,15 M; citrat de K

0,015 M; EDTA 0,002 M) pH=7 Metoda de lucru: Un fragment de aproximativ 15g timus congelat este tăiat în felii cu ajutorul unui bisturiu. Fragmentele se plasează într-un pahar Berzelius ce conţine 50 ml soluţie NaCl-citrat. Prin cântărirea înainte şi după adăugarea feliilor de timus se poate calcula prin diferenţă cantitatea exactă de ţesut luat în lucru. Se omogenizează conţinutul cu ajutorul omogenizatorului menţinând temperatura în jur de 2ºC plasând paharul într-o baie de gheaţă. Omogenatul este centrifugat la 5000g timp de 15 minute. Se recoltează sedimentul reprezentat prin cromatină. Cromatina se resuspendă în 50 ml soluţie NaCl-citrat şi se omogenizează din nou, iar apoi se sedimentează ca mai sus. Ciclul omogenizare - centrifugare se repetă încă odată. Sedimentul final se dizolvă în 90 ml citrat 0,15 M pH=7 şi se adaugă 8 ml soluţie SDS. Se încălzeşte soluţia la 55ºC timp de 15 minute agitând conţinutul cu o baghetă şi apoi se adaugă 8 g NaCl cristale. Se încălzeşte din nou soluţia la 55ºC timp de 10 minute. Soluţia devenită foarte vâscoasă se răceşte într-o baie de gheaţă şi se adaugă 100 ml amestec fenol: cloroform: alcool amilic. Se agită puternic amestecul cu ajutorul agitatorului până când se obţine o emulsie (timp de 30 minute). Emulsia se centrifughează în tuburi de sticlă la 4000 g timp de 15 minute. După centrifugare în tuburile de centrifugă se vor observa trei straturi:

- un strat superior apos, care conţine ADN, în cea mai mare parte purificat - un strat intermediar de culoare albă opacă - un strat inferior, care conţine solvenţii organici

Se recoltează stratul apos într-un pahar Berzelius de 400 ml. Îndepărtarea urmelor de proteine şi ARN poate fi făcută prin repetarea tratamentului cu solvenţi organici de câteva ori. Pentru scopul lucrării puritatea atinsă este suficientă.

146

Se adaugă 100 ml citrat de sodiu 0,15 M pH=7 şi apoi, agitând continuu cu o baghetă, 100 ml etanol 95%. Se observă formarea unui precipitat gelatinos care treptat se organizează sub formă de fibre lungi. Prin învârtirea baghetei de sticlă fibrele se înfăşoară pe ea. Bagheta cu ADN se presează de pereţii vasului, apoi se spală în etanol 95% prin agitare până când lichidele de spălare rămân perfect transparente. Precipitatul de ADN se scoate de pe baghetă cu ajutorul unei lame şi se dizolvă în 50 ml tampon Tris, KCl, citrat de Na, pH=7. Sub această formă probele se pot păstra în frigider câteva zile.

Metoda de izolare a ADN din ţesuturi prin precipitare cu etanol Echipament, materiale şi reactivi:

1. Centrifugă 2. Baie de apă termostatată 3. Sol. tampon (EDTA 20 mM; Tris-HCl 20 mM; NaCl 300 mM; SDS 0,4 %)

13. Proteinaza K (concentraţia 10mg/ml) 14. Acetat de K 5M 15. Etanol 100 % 16. Apă ultrapură

Mod de lucru:

Bucăţi de ţesut se pun în 270 µl soluţie tampon specific pentru proteinaze, peste care se adaugă 30 µl proteinază K. Amestecul se ţine la 56ºC cel puţin 3 ore, dar de obicei se lasă peste noapte la 37ºC.

În ziua următoare, peste cei 300 µl soluţie se adaugă 60 µl acetat de K 5M, cu care se ţine la gheaţă 30 de minute. În acest timp proteinele vor precipita.

Se face o centrifugare 10 minute la 10000g (13000 rotaţii/minut), după care se recoltează cu grijă supernatantul, care conţine ADN şi se transferă într-o altă eprubetă. Peste supernatant se adaugă 700-750 µl etanol absolut. Se agită bine şi în câteva minute are loc precipitarea ADN-ului.

Eprubetele se centrifughează din nou 10 minute în acelaşi condiţii, ADN precipitat rămâne la fund, iar supernatantul se aruncă.

Se lasă eprubetele 10 minute cu capac deschis pentru evaporarea etanolului. După aceea se adaugă 30 µl apă ultrapură şi se lasă la 65ºC timp de 15 minute, timp în care ADN-ul se resuspendă. Lichidul obţinut conţine ADN, care poate fi folosit pentru analize prin tehnica PCR.

Dacă se doreşte separarea ARN-ului din soluţia de acizi nucleici, se tratează soluţia obţinută cu ADN-aze pancreatice, pentru a elimina ADN-ul. Dacă se doreşte separarea ADN-ului, se tratează soluţia cu ARN-aze.

147

Pentru a nu permite degradarea ADN-ului în timpul manipulării de către nucleaze, se adaugă în soluţie şi agenţi chelaţi (ex. EDTA), substanţe care sechestrează ionii de Ca+2 (cu rol important în activitatea nucleazelor).

Cu ajutorul acestei metode se poate extrage ADN-ul şi din preparate fixate, incluse în parafină, secţiuni colorate cu hematoxină-eozină, specimene muzeale etc.

Metoda de izolare a ADN din sânge

Echipament, materiale şi reactivi: 1. Sânge recoltat pe un anticoagulant 2. Soluţii tampon: TKM 1, TKM 2 3. Soluţie tampon Tris HCl + EDTA 4. Detergent Igepal şi SDS (dodecilsulfat de sodiu) 5. Etanol 70% 6. Etanol absolut 7. Centrifugă 8. Centrifugă cu răcire 9. Cuve de centrifugă 10. Tuburi Eppendorf 11. Baie de apă 55ºC

Mod de lucru:

Pentru izolarea ADN se utilizează sânge recoltat pe un anticoagulant (minim 5ml/probă). Probele de sânge se introduc în eprubete cu dop (etichetate), peste care se adaugă 5ml soluţie tampon (TKM1) şi 130 µl detergent Igepal pentru lizarea membranelor celulare. Se agită câteva minute eprubetele, după care se centrifughează 10 min. (2200 tur./min. ). Precipitatul leucocitar se depune la fund (are culoare roşie deschisă ), iar supernatantul se aruncă. Peste precipitatul leucocitar rămas pe fundul eprubetei se mai adaugă 5ml.tampon (TKM1) şi se centrifughează încă 10min. (2200tur./min.). Supernatantul se aruncă, iar pe fundul eprubetei apare o pată albă (leucocitele). Peste leucocite se pun 800 µl tampon (TKM2), se agită cu vârful pipetei, se absoarbe şi se introduce în tuburi Eppendorf. În tuburi se mai pun câte 50 µl SDS (dodecilsulfat de sodiu) cu rol în distrugerea proteinelor celulare. Tuburile se incubează 10 min. în baie de apă la 55ºC. După incubare se adaugă 300 µl NaCl (6 M), cu care se centrifughează 5 minute la 4ºC, pentru a evita supraîncălzirea probelor, la 12000 rot./min. Pregătim eprubete mici cu aprox. 2 ml etanol 100%. După centrifugare, conţinutul tuburilor se introduce în eprubetele cu etanol, pentru precipitare. Peste câteva secunde în eprubete apare ADN-ul.

148

Peleta de ADN se ia cu vârful pipetei, se introduce în tuburi Eppendorf (noi), peste care se adaugă etanol 70% ( 1 ml ). Tuburile se centrifughează 5 min.(12000 rot./min. la 4ºC). După centrifugare ADN-ul ia forma unor ghemuri mici alb-transparente. Etanolul se aruncă (se absoarbe cu pipeta sau se aşteaptă până se evaporă), tuburile rămânând deschise 30 min. pentru evaporarea totală a etanolului. Peste probele de ADN se adaugă un tampon (Tris HCl + EDTA) 250 µl. Probele etichetate se pun la congelator, unde se pot păstra timp îndelungat (chiar şi ani de zile).

Metoda rapidă de izolare a ADN din sânge Echipament, material şi reactivi: 1. Microcentrifugă 2. Tuburi de centrifugă de 1,5 ml 3. Sânge integral 4. Tampon fosfat steril: (PBS 1X; în 1l: 8g NaCl; 0,2g KCl; 1,44g Na2HPO4 ; 0,24g

KH2PO4 ; pH =7,4; se autoclavează) 5. NaOH 0,1 M Mod de lucru: Se transferă 30 µl sânge integral într-un tub de 1,5ml şi se ajustează volumul la 100 µl cu tampon PBS. Se adaugă 100 µl NaOH 0,1M, se închide capacul şi se fierbe timp de 5 minute. Se centrifughează amestecul la 13000 rot/min. timp de 5 minute. Se transferă supernatantul într-un tub curat şi se utilizează 1-10 µl în reacţia PCR.

X.2.2. IZOLAREA ARN ARN-ul (acidul ribonucleic) este o macromoleculă biologică, de mai multe tipuri, fiecare tip îndeplinind funcţii diferite:

- ARN-ul mesager (ARNm), reprezintă 1-5% din cantitatea de ARN celular total, rezultă prin transcrierea ADN-ului, servind ca eşantion pentru sinteza proteinelor. Sinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor alcătuiţi la rândul lor din ARN ribozomal (ARNr) şi proteine ribozomale.

- ARN-ul ribozomal (ARNr), reprezintă 80-85% din cantitatea de ARN celular total, intră în structura ribozomilor şi a riboproteinelor implicate în procesarea ARN

- ARN de transfer (ARNt), reprezintă 15-20% din cantitatea de ARN celular total, are rol în transportul aminoacizilor la ribozomi, adică la locul sintezei proteinelor.

149

Multe virusuri conţin ARN în loc de ADN – ribovirusuri – , iar diferitele specii de ARN denumite ribozime catalizează reacţii enzimatice asemănător enzimelor. Mamiferele conţin în celulele lor 10-30 µg ARN total. Majoritatea ARN-ului este ARNt şi ARNr. Într-o singură celulă mamiferă se găsesc aproximativ 360000 molecule de ARNm, 1-5%, cantitatea acestuia depinzând de tipul de celulă şi de starea fiziologică. Proporţia de ARN total în nucleu este 14%, iar raportul ADN:ARN în nucleu este de 2:1. Comparativ cu ADN-ul, ARN-ul este mai puţin stabil. Aceasta se datorează în mare parte ribonucleazelor (RN-aze) care distrug moleculele de ARN. RN-azele sunt foarte stabile, nu necesită cofactori, acţionează în cantităţi mici şi sunt dificil de inactivat. Contaminarea cu RN-aze apare ca urmare a contactului cu pielea umană sau cu particulele de praf. Prin urmare izolarea şi analiza ARN necesită tehnici speciale (utilizarea mănuşilor când se lucrează cu reactivii şi probele de ARN, schimbarea mănuşilor cât mai frecvent şi ţinerea închisă a tuburilor cât mai mult timp posibil, păstrarea probelor de ARN în gheaţă când se utilizează pentru diferite aplicaţii, utilizarea tuburilor din polipropilen sterile, care sunt tuburi RNase-free, etc.). Există un număr mare de metode utilizate pentru izolarea ARN, necesare pentru revers transcriere. Metodele standard includ liza celulelor şi extracţia ARN prin precipitare cu etanol. Aceste proceduri de extracţie presupun şi o etapă în care se utilizează fenol şi nu sunt indicate atunci când se lucrează cu un număr mare de probe. Pentru analize de rutină se utilizează sângele ca material de izolare ARN. Sângele conţine însă o serie de enzime inhibitoare care pot să interfere cu tehnicile care utilizează ARN. Izolarea ARN din sânge impune metode care să asigure obţinerea ARN de calitate ridicată şi fără enzime inhibitoare.

Hematiile (eritrocitele, globulele roşii) nu prezintă nucleu şi nu sunt importante în izolarea ARN, ele nici nu sintetizează, nici nu conţin ARN.

Sursa de ARN o reprezintă leucocitele (celulele albe) deoarece ele sunt nucleate şi conţin ARN. Deoarece sângele conţine de 1000 de ori mai multe eritrocite decât leucocite, îndepărtarea eritrocitelor simplifică tehnicile de izolare a ARN. Izolarea ARN se realizează prin liza selectivă a eritrocitelor, prin centrifugarea în gradient de densitate, utilizând Ficolul. Deoarece virusurile au ARN-ul mono sau dublu catenar, particulele virale trebuie mai întâi concentrate prin ultracentrifugare, ultrafiltrare sau precipitare. Următorul pas al procedurii îl reprezintă separarea ARN din amestecul cu celelalte componente: proteine, lipide, carbohidraţi. Îndepărtarea ADN-ului în timpul preparării ARN se realizează prin tratarea amestecului cu DN-aze care nu au activitate RN-azică. Contaminarea cu proteine poate fi prevenită prin digestia cu o enzimă proteolitică, proteinaza K. Această etapă se aplică dacă este necesară în toate protocoalele de purificare a acizilor nucleici.

150

X.3. DOZAREA CONCENTRAŢIEI DE ADN Pentru dozarea concentraţiei ADN izolat din diferite materiale biologice, este necesară calibrarea reacţiei de culoare. Calibrarea reacţiei de culoare se realizează cu patru eprubete. Se pipetează în fiecare conform tabelului:

Reactivi(ml) 1 2 3 4 Standard AND 1mg/ml

0,0 0,2 0,5 1

Apă distilată

3 2,8 2,5 2

Reactiv difenilamină

6 6 6 6

Se încălzesc eprubetele într-o baie de apă la 100ºC, timp de 10 minute.

Eprubetele se scot din baie şi se răcesc la temperatura camerei. Se citeşte extincţia conţinutului eprubetelor 2, 3 şi 4 faţă de cel al eprubetei 1 (martor), la 260 nm. Se reprezintă grafic curba de calibrare obţinută sau se calculează factorul de pantă făcând raportul între suma concentraţiilor ( 0,2+ 0,5+ 1 ) şi suma extincţiilor ( E2 + E3 + E4 ).

Dozarea concentraţiei ADN în preparatul final se face similar pipetând în patru eprubete după cum urmează:

Reactivi(ml) 1 2 3 4 Preparat ADN 0,0 0,2 0,5 1 Apă distilată

3 2,8 2,5 2

Reactiv difenilamină

6 6 6 6

La fel ca mai sus se încălzeşte conţinutul eprubetelor în baie de apă la 100ºC timp de 10 minute şi apoi se citesc extincţiile la 260 nm faţă de conţinutul eprubetei 1 (martor). Eprubeta 1 se poate omite dacă o avem pe cea de la calibrare. Extincţiile găsite se înmulţesc cu factorul de pantă, aflând astfel mg ADN / probă. Pentru a calcula mg ADN/ ml preparat se înmulţeşte valoarea găsită cu diluţia - pentru E2 cu 5, - pentru E3 cu 2, - pentru E4 cu 1.

151

Demonstrarea denaturării termice a ADN şi a “curbelor de topire” Aşa cum se cunoaşte, prin încălzire, cele două lanţuri ale moleculei de ADN se desprind unul de altul, datorită ruperii legăturilor de hidrogen. Acest lucru se poate urmări prin scăderea vâscozităţii soluţiei (lanţurile se înghemuiesc ) sau prin creşterea extincţiei la 260 nm, bazele azotate fiind expuse direct razelor UV. Înregistrarea grafică a variaţiei acestor parametri ne dă de obicei o curbă sigmoidală a cărei alură furnizează informaţii asupra conţinutului în baze şi a gradului de împerechere. Cu cât tranziţia este mai bruscă cu atât împerecherea este mai bună, respectiv cu cât curba este deplasată mai spre dreapta cu atât mai multe perechi G – C conţine ADN-ul. Pentru demonstrarea acestui fenomen se plasează în fiecare din cinci eprubete câte 5 ml soluţie ADN preparat în lucrările anterioare. Eprubetele se astupă cu dopuri de cauciuc pentru a evita evaporarea şi se plasează la diferite temperaturi: 0ºC, 25ºC, 65ºC, 80ºC, 90ºC. Se lasă fiecare eprubetă la temperatura indicată o oră. Apoi se răcesc brusc toate la temperatura camerei. Dacă se lucrează destul de repede lanţurile nu au timp să se reasocieze. Pentru măsurarea vâscozităţii se notează timpul necesar scurgerii între două repere ale unei pipete cu vârful efilat. Timpul necesar este proporţional cu vâscozitatea. Reprezentând grafic variaţia vâscozităţii (pe ordonată) faţă de temperatură (pe abscisă) se obţine o curbă de topire din care se poate calcula valoarea Tm= temperatura la care lanţurile sunt pe jumătate desperecheate.

X.4. METODA SPIRIN

Pentru determinarea cantitativă a acizilor nucleici în diferite ţesuturi se poate utiliza metoda Spirin. Principiul metodei: Acizii nucleici sunt extraşi din materialul biologic prin tratarea acestuia la cald cu soluţii de acid percloric. Hidroliza acizilor nucleici cu formare de fragmente solubile este completă şi extragerea lor din ţesut este cantitativă şi se realizează concomitent. În alte metode, cum este metoda Schmidt-Thannhausser şi Webb, determinarea cantitativă a acizilor nucleici se efectuează după hidroliza preparatelor obţinute prin prelucrarea prealabilă a ţesuturilor. Hidroliza alcalină sau acidă este absolut necesară, deoarece preparatele nehidrolizate ale acizilor nucleici, la lungimi de undă corespunzătoare regiunii ultraviolete a spectrului, au densităţi optice diferite, în funcţie de starea de agregare a preparatului şi de pH-ul soluţiei. Prepararea acizilor nucleici din materialul de analizat prin tratarea acestuia cu acid tricloracetic în scopul îndepărtării componenţilor tisulari acidosolubili este incomodă, în cazul dozării acestora prin spectrofotometria în ultraviolet, datorită

152

faptului că acidul tricloracetic are o absorbţie maximă în ultraviolet, în regiunea 240-300 nm. Absorbţia maximă pentru preparatele de ADN este la 268 nm, iar pentru ARN la 260 nm, adică în aceeaşi regiune care este caracteristică şi pentru acidul tricloracetic. Eliminarea acestui inconvenient se poate realiza dacă acidul tricloracetic este înlocuit în procedura de preparare a acizilor nucleici, cu acidul percloric. Folosirea acidului percloric (HClO4) a permis perfecţionarea metodei de determinare a acizilor nucleici. Echipament, materiale şi reactivi:

1. Centrifugă ( 5000-6000 rot/min. ) 2. Tuburi de centrifugă (20 ml. ) 3. Baie de apă 4. Spectrofotometru în ultraviolet 5. Probe de ţesut 6. Acid percloric ( HClO4 ) 0,5 N

Mod de lucru: În mai multe tuburi de centrifugă, cu o capacitate de 20 ml, se introduc 5-10 ml acid percloric, soluţie 0,5 N şi probe de ţesut a căror greutate variază între 5 şi 500 mg (în funcţie de cantitatea de acizi nucleici din ţesuturile analizate). După agitare prudentă, probele sunt introduse într-o baie de apă în clocot (100ºC), unde sunt ţinute timp de 20 de minute. Ulterior, probele sunt răcite într-un curent de apă de robinet, centrifugate la 5000-6000 rot/min., timp de 10 minute. Supernatantul este utilizat pentru citirea probelor la spectrofotometru. Densitatea optică totală a hidrolizatului, care conţine atât ARN cât şi ADN, este în funcţie de concentraţia componentelor rezultate după hidroliza acizilor şi de raportul cantitativ dintre cei doi acizi nucleici. Dacă cantitatea totală a acizilor nucleici în probele hidrolizate este mare, depăşind o concentraţie optimă pentru citirea spectrofotometrică, atunci probele sunt diluate cu o soluţie de acid percloric 0,5 N. Citirea probelor se realizează la două lungimi de undă diferite: 270 nm şi 290 nm, folosindu-se cuve de cuarţ de 10 mm grosime, lampa de hidrogen (pentru spectrofotometru), iar ca probă martor soluţii de acid percloric 0,5N. Diferenţa dintre valorile extincţiei citite pentru aceeaşi probă la cele două lungimi de undă şi divizată cu indicele de 0,19 indică concentraţia fosforului nucleic într-un ml soluţie (exprimată în mg.). Indicele 0,19 reprezintă extincţia specifică, este identic atât pentru ADN cât şi penrtu ARN şi a fost găsit experimental de către Spirin, care a utilizat soluţii standard ale celor doi acizi, în care concentraţia fosforului nucleic a fost de 1mg fosfor într-un ml de soluţie, la grosimea stratului de 10 mm.

153

Formula utilizată pentru calcul este : D 270 –D 290 Cg (P-AN) = , unde: 0,19

- Cg (P-AN) = conc. fosforului nucleic, exprimată în g - 0,19 = indicele extincţiei - D 270 = densitatea optică a hidrolizatului la 270 nm - D 290 = densitatea hidrolizatului ARN+ADN la 290 nm Metoda Spirin poate fi utilizată cu succes şi în cazurile când în obiectul

cercetat este prezent un singur acid nucleic, numai ARN sau exclusiv ADN, utilizându-se însă coeficienţii medii de transformare 10,5 (pentru ARN) şi 10,1 (pentru ADN), care rezultă din faptul că în ARN conţinutul procentual al fosforului reprezintă 9,5%, iar în preparatele cu ADN 9,9%. Controlul determinărilor se realizează citind extincţia probelor şi la 260 nm. Extincţia la această lungime de undă este, de regulă, aceeaşi sau se încadrează în limita de +15%. Dacă densitatea optică depăşeşte valoarea de 15% se recomandă tratarea hidrolizatului la rece, cu soluţii de acid percloric 0,2 N pentru eliminarea impurităţilor de altă natură. Metoda este rapidă, comodă, exactă şi se pretează la analiza în serie a probelor obţinute din diferite surse. În cazuri extrem de rare, când compoziţia nucleotidică a preparatelor este neobişnuită, de exemplu, în cazul acizilor nucleici obţinuţi pe calea sintezei de laborator, erorile metodei cresc simţitor influenţând negativ rezultatele experimentale.

154

Bibliografie 1. Mitrea N., Margină D., Arsene A., Grădinaru D., Burta C., Biochimie –

Vitaminele în procesele metabolice, Ed. Didactică şi Pedagogică Bucureşti, 2008

2. Barrett A.J., Cantor C. R., Enzyme nomenclature, Academic Press, 1992 2. Cristea-Popa E., Popescu A., Truţia E., Dinu V., Tratat de Biochimie

Medicală, Ed. Medicală-Bucureşti, 1991. 3. Felszeghy E., Abraham A., Biochimie, Ed. Didactică şi Pedagogică

Bucureşti, 1972 4. Lehninger A.L. Biochimie, Ed.Tehnică Bucureşti, 1987 5. Gilău D., Antonescu A., Dobjanschi L., Gilău R.D., Gilău L., Compendiu

de Biochimie medicală, Ed. Imprimeriei de Vest Oradea, 2002. 6. Gilău L. Proinov I., Biochimie, Ed. Universităţii din Oradea, 1999 7. Mihele D., Biochimie clinică, Ed.Medicală Bucureşti, 2001. 8. Thierry Grisar, Elements de biochimie humaine normale et pathologique,

partium I, Les Editions de l’Univerite de Liege, 2004 9. Ţărmure Cornelia, Biochimie structurală şi metabolică vol.I, Ed.Dacia

Cluj-Napoca, 1996 10. Vrana K.E., Biochemistry, Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia,1999. 11. Mody Eugen, Funduc I., Alexandrescu R., Dobreanu M., Biochimie clinică,

Editura All Educational, Timişoara, 2000 12. Dobjanschi Luciana, Antonescu A., Bogdan N., Codreanu I., Gilău D.,

Mureşan M., Gilău L., Lucrări practice de biochimie, Editura Imprimeriei de Vest, Oradea, 2001

13. Mihele Denisa, Biochimie clinică – metode de laborator, Editura Medicală, Bucureşti, 2000

14. Bettelheim F., Landesberg J., Laboratory Experiments for general, organic&Biochemistry, Saunders Golden Sunburst Series, 1997

15. Pallag Anamaria, Mraz Camelia, Jebeleanu Gheorghe, Patologie moleculară experimentală, Editura Universităţii din Oradea, 2004