Subiecte practic microbiologie 2011

1. Efectuati si colorati un frotiu din cultura bacteriana

Prin examinarea unui frotiu ne intereseaza: celularitatea, forma

bacteriilor, tinctorialitatea. Exista 2 posibilitati de efectuare a preparatelor

microscopice: preparate proaspete native si frotiuri (preparate uscate, fixate

si colorate). Frotiurile se pot efectua din diferite produse care contin germeni

microbieni: direct dintr o cultura sau dintr un prelevat de la bolnav (puroi,

sputa, sange).

Tehnica efectuarii frotiurilor cuprinde mai multe etape:

Intinderea

Uscarea

Fixarea

Colorarea Intinderea: se face pe o lama curata pe care se pune cu ansa

bacteriologica sterilizata o picatura de ser steril; se sterilizeaza din nou ansa

si apoi se descarca cu ea o pic foarte mica din cultura de studiat. Se

omogenizeaza bine cu serul.

Se lasa sa se usuce la temperatura camerei. Dupa uscare trebuie sa

aiba aspectul unei pelicule fine.

Prin fixare se realizeaza aderarea preparatului pe suprafata lamei

pentru a nu se indeparta prin spalare, cu pastrarea structurii celulare a

microorganismelor. Celulele bacteriane fixate au o tinctorialitaet mai maro

decat celulele vii ce sunt impermeabile la coloranti. Fixarea se realizeaza

prin caldura, trecandu se lama desupra flacarii unui bec de gaz de 2-3 ori.

Colorarea poate fi:

Simplacu albastru de metilen Dublacoloratia Gram sau coloratii speciale: May-Grunwald, Giemsa, col pt capsula, spori, cili.

Coloratia cu albastru de metilen: Se acopera frotiul cu albastru de metilen 3-4 min, apoi se spala cu apa

distilata; se usuca la temp camerei sau cu hartia de filtru si se examineaza la

microscop.

Coloratia Gram:

Se face din cultura; germenii gram + apar colorati in violet, deoarece

violetul de Gentiana este retinut in interior datorita acidului muramic din

peretele bacterian. Germenii gram se coloreaza in rosu pentru ca au mai

multe structuri lipidice, iar preparatul solubilizat cu alcool si acetona pierde

violetul de Gentiana si ulterior se coloreaza in rosu cu fuxina.

Germeni gram +: coci (stafilococ, streptococ, pneumococ), bacili

(antrax, tetanic, gangrenei gazoase)

Germeni gram -: coci (meningococi, gonococi), bacili ( shigella,

salmonela, klebsiela, brucela, bordetela)

Se acopera frotiul cu violet de gentiana 1-1,5 min; se spala cu apa din

abundenta; se pune fixatorul (sol lugol) un timp dublu, se spala bine; se pune

decolorantul (sol alcool-acetona) maxim 10 min; se spala si se acopera cu

fuxina 1 min; se spala si se examineaza.

Coloratia Zeihl-Neelsen: Se utilizeaza pt evidentierea BAAR (tbc, leprae)

Frotiul se acopera cu fuxina fenicata, se lasa 10 min, se incalzeste in

flacara de 3-4 ori pana se emana vapori. Nu se fierbe. Se spala bine, se

acopera cu alcool-acid clorhidric si se lasa 1 min. Se spala si se examineaza.

Apar rosii doar BAAR. Se pune albastru de metilen pt a aparea BAAR pe un

fond albastru.

2. efectuati si colorati un frotiu din produs patologic idem 1

3. colorati prin metoda Ziehl-Nielson un frotiu din sputa Prin examinarea unui frotiu ne intereseaza: celularitatea, forma

bacteriilor, tinctorialitatea. Se practica in diagnostiul TBC. Bacilul

tuberculos este BAAR datorita peretelui celular f gros si nu permite

efectuarea unei coloratii obisnuite.

Aceasta coloratie se utilizeaza pentru evidentiarea BAAR.

Frotiul se acopera cu fuxina fenicata concentrata, se lasa 10 min; in

acest timp se incalzeste la flacara de 3-4 ori pana se emana vapori. Nu se

fierbe. Se spala bine, se acopera cu sol alcool-hcl si se lasa 1 min. Se spala,

se pune albastru de metilen 1 min, se spala. Se examineaza. BAAR apar rosii

pe un fond albastru.

4. insamantati un produs patologic pe o placa petri cu geloza in vederea izolarii germenilor

Insamantarea si izolarea germenilor are drept scop obtinerea

unor populatii microbiene suficiente cantitativ, evitarea

contaminarii produsului cu agenti straini si izolarea fiecarei tulpini

microbiene. Se realizeaza in conditii de riguroasa sepsie; ansa

bacteriologica se sterilizeaza la becul de gaz pana la inrosire, apoi

se ia recipientul din care vom recolta produsul, se scoate dopul. Se

trece gatul recipientului prin flacara si se ia cu ansa o portiune de

inocul. Se flambeaza din nou recipientul si se inchide dopul. In

cazul tehnicii dispersiei cu ansa pe medii solide se procedeaza

astfel: cu ansa bacteriologica incarcata cu cultura sau produs

patologic se descriu pe suprafata unui mediu solid, turnat intr o

placa petri, straturi paralele de linie franta ce apar sub forma unui

poligon neinchis cu 5-6 laturi. Dupa descarcarea fiecarei laturi,

ansa se sterilizeaza prin incalzire pana la incandescenta. Se poate

realiza si cu ajutorul unui tampon incarcat cu produs patologic

(exudat faringian) care se descarca bine pe toata suprafata

placiise obtin colonii izolate, portiuni mici ce se obtin pe suprafata unei geloze. In functie de aspectul coloniei izolate se

poate preciza specia si daca este virulenta sau nu.

5. antibiograma difuzimetrica. Principiu, interpretare

Antibiograma reprezinta studiul sensibilitiatii unei tulpini

bacteriene fata de agentii antimicrobieni terapeutici. Antibiograma

este indicata in infectiile bacteriene cu tulpini care au o

sensibilitate variabila la antibiotice. Este indicata in infectiile

severe care necesita tratamente masive, in infectiile localizate cu

tendinta de colonizare pentru combaterea infectiilor din spital etc.

Nu este indicata atunci cand agentul etiologic are o sensibilitate

cunoscuta, in caz de infectie usoara cu tendinta de vindecare fie

spontana, fie in urma unui tratament standard.

Germentul testat pentru sensibilitatea la antibiotice,

incriminat in etiologia infectiei trebuie sa fie din cultura pura.

Antibiograma se realizeaza in vitro, prin urmatoarele metode:

difuzimetric si metode cantitative ce folosesc tehnica dilutiilor in

medii de cultura lichide sau solide.

Metoda difuzimetrica: sensibilitatea bacteriei la un anumit

antibiotic este apreciata dupa marimea diametrului zonei de

inhibitie a cresterii, din jurul antibioticului respectiv.

Metodele difuzimetrice constau in insamantarea bacteriilor

pe suprafata unui mediu solid pe care se vor aplica antibioticele.

Sensibilitatea bacteriei la un anumit antibiotic este apreciata dupa

marimea diametrului zonei de inhibitie a cresterii din jurul

antibioticului respectiv.

Mediul utilizat este mediul Muller-Hinton, deoarece valoarea

sa nutritiva permite cultivarea majoritatii germenilor si nu contine

inhibitori pentru substantelor antimicrobiene. Mediul trebuie turnat

gros, nu mai mic de 4 mm. Inoculul bacterian standardizat se

insamanteaza prin inundarea si scurgerea de exces si prin

insamantarea uniforma cu tamponul de vata sau pipeta Pasteur.

Dupa ce suprafata mediului s a uscat, cam dupa 20 de min, se

depun microcomprimatele cu o pensa presand usor fiecare

antibiotic pe suprafata si avand grija ca intre fiecare sa fie o

distanta de 3 cm si 1,5 cm fata de marginea placii.

In functie de germenul studiat se alege un anumit tip de

antibiotice care se testeaza. Pe fiecare microcomprimat este inscris

simbolul antibioticului respectiv si un nr.

Se lasa placile pe masa la prodifuzie 15 min. Apoi se

rastoarna placa si incubeaza la 37 de grade celsius, 18-24 de h. In

jurul fiecarui antibiotic apare o zona de inhibitie a cresterii. Citirea

se face masurand cu rigla gradata in 2-3 directii diametrul fiecarei

zone. Se recomanda replicarea coloniilor aparute in vederea

retestarii la antibiotice.

Exista tabele care se refera la numarul antibioticului, la

simbol, cantitati, rezistenta la antibiotic in functie de diametru:

rezistent, intermediar, sensibil.

Erorile pot aparea datorita: inoculului prea sarac sau prea

bogat, datorita mediului prea gros sau pastrarii necorespunzatoare

a antibioticelor, sau pot fi erori de citire.

6. imunograma. Principiu, interpretare.

Se mai numeste hipersensibilitate celulara sau raspun imun

mediat de celule.

7. diagnosticul bacteriologic in infectiile streptococice

Streptococii piogeni: sunt sferici, dispusi in lanturi, imobili,

nesporulati. In cultura proaspata poseda capsula.

Se recolteaza exudat naso-faringian, secretie otica, puroi,

sputa, urina, sange, secretie conjunctivala. Probele de laborator

care nu se pot insamanta in timp util se introduc in medii de

conservare si imbogatire. Examenul microscopic se efectueaza pe

frotiuri din produs patologic, coloratie Gram sau cu albastru de

metilen. Se pun in evidenta coci Gram +, asezati in lanturi mai

lungi sau mai scurte. Se cultiva pe medii de cultura imbogatite, pe

mediul geloza-sange prin tehnica poligon deschis. Se descarca

tamponul pe suprafata unui mediu geloz-sange din placa petri, apoi

diseminarea se face cu ansa. Dupa incubare la termostat 37 de

grade timp de 18-24 h se face citirea rezultatelor.

Dupa caracterele activitatii hemolitice avem: streptococ de

tip beta, alfa, alfa;sau nu produce hemoliza:gamma. Exista mai multe tipuri de colonii:

Mucoase, rotunde, regulate, cu suprafata bombata, lucioase sunt caracteristice streptococilor virulenti.

Mate, rotunde, de consistenta apoasa, regulate, cu aspect de

harta.

Colonii rotunde, mici, bombate, translucide, cu forme mai

putin virulente.

R, uscate, cu margini neregulate, cu suprf mucoasa.

Grupurile serologice A,B,C,G se identifica prin metode

biochimice, serologice, enzimatice. Testul la bacitracina se

foloseste pt A; se realizeaza inhibarea streptococilor de tip A cu

bacitracina. Antibiograma nu se realizeaza pentru grupul A,

deoarece este sensibil la penicilina. In cazul persoanelor alergice,

antibiograma se realizeaza. Identificarea serologica a grupului se

realizeaza prin reactiile de precipitare in tuburi. Extractul de

antigen care contine carbohidratul de grup, se pune in contact cu

seruri specifice de grup. Apare un inel de precipitare dupa 10-20 de

min.

Pentru identificarea tipului serologic se utilizeaza:

Reactia de aglutinare pe lama cu seruri specifice

Reactia de precipitare.

Diagnosticul imunologic: se realizeaza reactia ASLO si se

mai evidentiaza anticorpii antipolizaharid C sau M.

Diagnosticul biologic consta intr-o serie de teste cutanate

pentru decelerarea imunitatii antitoxice sau a starii de

hipersensibilitate la antigene streptococice (streptolizina O).

Streptococus pneumoniae:

Pneumococii: coci ovalari, dispusi in diplo, imobili,

nesporulati, gram +, tulpinile virulente poseda capsula.

Descompun glucoza pe cale fermentativa.

Produs patologic: sputa, aspirat bronsic, exudat faringian,

pleural, puroi, urina, sange.

Probele de laborator care nu se pot insamnta in timp util se

introduc in medii de conservare si imbogatire. Sputa in infectiile

pneumococice este visinie, puroiul este cremos, verzui.

Frotiurile se coloreaza Gram si cu albastru de metilen. La

microscop se evidentiaza coci ovalari, dispusi in diplo, imobili,

nesporulati, gram + cu aspect de vf de lance.

Daca in produs exista pneumococ se efectueaza identificarea

tipului serologic prin reactia de umflare a capsulei; se realizeaza cu

preparat proaspat ser specific si albastru de metilen. In cazul

prezentei tipului corespunzator serului imun se observa aglutinarea

germenilor si marirea in volum a capsulelorapar nijte halouri cu margini bine delimitate.

Se face insamantarea pe medii de cultura solide (geloza-

sange), imbogatite cu sange si in atmosfera de CO2; coloniile sunt

mici, sub 1 mm, transparente. Pe mediile lichide se tulbura mediul

cu formare de depozit pe mediile cu sange, coloniile sunt

inconjurate de o zona de hemoliza de tip alfa. Se poate inocula

produsul patologic la soarecii albi, care dupa 24-48 de ore fac

septicemie.

Identificarea pneumococilor se face cu teste biochimice sau

serologice:

Biloliza: pneumococul este sensibil la actiunea sarurilor

biliare si se diferentiaza de genul Viridens care ramane opalescent.

Testul sensibilitatii la optochim: pneumococii sunt f sensibili

si dau o zona mare de inhibitie.

Fermentarea inulinei: zaharul este fermentat doar de

pneumococ si se produce un viraj de culoare din albastru in galben.

Identificarea serologica se realizeaza prin reactia de

aglutinare si prin umflarea capsulei.

Streptococii sunt sensibili la penicilina, eritromicina,

tetraciclina.

7. reactia ASLO. Principiu, interpretare

Este o reactie antigen anticorp.

Anticorpii antitoxici antistreptolizina O sunt decelati pt

diagnosticul infectiilor streptococice. Streptolizina O este o enzima

produsa de streptococi, care lizeaza hematia. Majoritatea

bolnavilor prezinta o crestere a tritrului antristreptolizinei O

(ASLO), iar reactia de punere in evidenta este ASLO.

Titrurile de pana la 200 de U ASLO/ml de ser sunt

considerate normale. Valoarea crescuta a ASLO se mentine in mod

normal 3-5 sapt de la debutul infectiei streptococice. Persistenta

anticorpilor in titruri inalte timp indelungat sugereaza

hipersensibilitate la antigenele streptococice, urmata de instalarea

complicatiilor poststreptococice.

Principiul reactiei: punerea in contact a anticorpilor ASLO cu

streptolizina O duce la neutralizarea activitatii sale hemolitice. In

acest scop, intr un sir de eprubete se pun : ser de cercetat in dilutii

succesive, streptolizina O, hematii (flosite ca indicator).

Reactia negativa este data de prezenta hemolizei, indicand

absenta anticorpilor ASLO, astfel ca ciclul litic al SL O asupra

hematiilor nu este anihilata.

Reactia pozitiva este evidentiata prin absenta hemolizei si

indica prezenta anticorpilor ASLO ( se formeaza butoni de

hematii).

Ultima eprubeta unde nu apare hemoliza indica prezenta

anticorpilor ASLO. Normal trebuie sa fie mai mic de 200 U

ASLO. In practica se fac 3 determinari si se urmareste curba

anticorpilor.

Se folosesc 5 tuburi care contin: cantitate standard de

streptolizina O, hematii si dilutii din serul pacientului: 1/100,

1/250, 1/500, 1/800, 1/1250.

ASLO se foloseste pentru diagn si pentru monitorizarea

tratamentului.

8. diagnosticul de laborator in infectiile stafilococice

Diagnosticul imunologic nu este concludent, pentru ca sunt

foarte raspandite in natura. Exista 3 tulpini: stafilococul alb

(epidermis), galben si auriu. Cel care determina cele mai multe

imbolnaviri:acnee vulgara, furuncule, abcese, flegnoane, infectii

urinare, toxiinfectii alimentare etc.

Caractere generale: coci sferoizi, dispusi in gramezi

neregulate, imobili, nesporulati, gram +. Produse patologice

recoltate: puroi, sputa, exudate, urina, materii fecale, sange.

Puroiul este de consistenta groasa, de culoare aurie. Se executa

frotiuri colorate Gram sau cu albastru de metilen se observa la microscop coci grupati in ciorchini, leucocite.

Puroiul dintr o leziune inchisa se insamanteaza pe mediu de

geloza si se observa forma coloniilor, pigmentul produs si

hemoliza. Daca puroiul provine dintr o leziune deschisa se

insamanteaza pe medii hiperclorurate (7,5% NaCl) care inhiba

majoritatea bacteriilor cu exceptia stafilococilor. Se foloseste

mediul de imbogatire Chapman. Coloniile stafilococice sunt de 1-3

mm, in jurul lor aparand zone clare de hemoliza, relativ mici.

Identificarea: pe frotiu colorat gram, prin caractere de cultura

(colonii S)

Caractere biochimice:

testul coagulazei: stafilococii patogeni au proprietatea de a coagula plasma. Coagulaza poate fi libera,

recoltata pe un anticoagulant sau legata la nivelul

peretelui bacterian

testul de fermentatie a manitolului: stafilococii patogeni sunt manitolopozitivi

lizotipie

testul fosfatazei: stafilococii secreta fosfataza care scindeaza fosfatul de fenolftaleinaculoarea mediului vireaza spre roz.

Se efectueaza antibiograma, pentru testarea sensibilitatii la

agentii terapeutici.

10. identificarea serologica a unei tulpini bacteriene

izolate prin hemocultura la un bolnav febril

Izolarea prin hemocultura se realizeaza astfel: se recolteaza

de 3-4 ori sange in pusee febrile, fara a se adminstra antibiotice,

folosind un sistem de circuit inchis. Apoi se insamanteaza pe

mediu lichid. Se pune la termostat si urmareste timp de 10 zile.

Daca exista inmultire microbiana, mediul devine tulbure. In acest

caz se face trecere pe mediu solid, obtinanduse culturi pure.

Tulpinile prezinta un comportament biochimic de gen

salmonella, pe mediile diferentiale multitest, vor fi obligatoriu

identificate serologic cu seruri imune de diagnostic anti

salmonella. Aceste seruri sunt:

ser anti-VI (antigen de virulenta pseudocapsular si datorita acestuia sunt invazivi)

ser polivalent O anti-salmonella

seruri de grup O, ser AO, BO, DO, EO

seruri monovalente flagelare anti H de faza specifica: a, b, c, d, i, r

seruri monovalente flagelare ani H de faza nespecifica: 1, 2, 5

Se pot face reactii de aglutinare pe lama ce pot fi executate

din cultura pura geloza inclinata, nu de pe mediu selectiv-

diferentiale.

Se fac reactii de aglutinare in tuburi. Se face intai aglutinarea

cu ser fiziologic pentru a indeparta tulpinile degradate antigenic si

avirulente de tip R. Tulpinile S ce nu aglutineaza cu ser fiziologic,

se vor testa cu serurile polivalente si anti VI.

Salmonella Typhi fara Ag de invelis VI se va aglutina cu ser

polivalent si nu aglutineaza cu serul anti VI; tulpinile cu Ag VI

partial degradat vor aglutina cu ambele seruri, iar tulpinile cu Ag

VI intact vor aglutina numia cu serul anti VI.

Dintre toate genurile de salmonella, salmonella typhi va

aglutina cu serul specific de grup DO si cu serul flagelar ani alfa.

Identificarea celorlalte serotipuri se face prin determinarea

structurii antigenice:

aglutinarea tulpinii cu ser polivalent confirma diagnostic de gen

aglutinarea cu seruri somatice de grup precizeaza sero-grupul din care face parte

aglutinarea cu serurile flagelare precizeaza apartenenta la un anumit sero-tip

deci identificarea serologica a salmonelelor vizeaza

determinarea genului, sero-grupului si sero-tipului.

11. identificarea serologica a unei tulpini bacteriene

izolate prin coprocultura de la un bolnav cu sindrom dizenteric

Germenii genului shigella produc la om dizenteria bacilara si

toxiinfectiile alimentare. Identificarea serologica a unei tulpini de

shigella vizeaza stabilirea structurii antigenice a tulpinii de bacil

difteric, izolata dintr un produs patologic si urmareste incadrarea

intr una din cele 4 subgrupe antigenice:

subgrupa A: corespunde shigellei dysenteriae, are 10 serotipuri

subgrupa B: corespunde shigellei flexneri, are 6 serotipuri principale si mai multe subserotipuri

subgrupa C: corespunde shigellei boydii, are 15 serotipuri

subgrupa D: corespunde shigellei sonnei (tip S sau R) Identificarea serologica a germenilor shigella se face prin

reactia de aglutinare pe lama utilizant seruri aglutizante

antidizenterice. Reactia se executa cu tulpini dezvoltate pe mediul

multitest TSI.

Se folosesc urm seruri aglutizante antidizenterie: seruri pt

subgrupa A, B, C, D.

Se executa aglutinarea pe lama fata de serul fiziologic in

vederea selectarii formelor S. Aceasta reprezinta martorul negativ.

Dupa aceea se face aglutinarea pe lama cu tulpini care se

cerceteaza cu serurile: serul polivalent anti flexneri, serul anti

sonnei S si R. Daca reactia este pozitiva, se mai face inca nu test de

confirmare: reactia de aglutinare in tuburi.

12. caracterizati comportamentul biochimic al unei

enterobacterii insamantate pe medii diferentiale

Familiei enterobacteriilor ii apartin grupele: escherichia,

shigella, salmonella, klebsiella, proteus, yersiniae.

Caracterele biochimice servesc la identificarea bacteriilor, in

functie de unele enzime pe care le detin. Caracterul biochimic

reprezinta comportamentul unor bacterii fata de diverse reactii

chimice aparute sau nu in metabolismul lor in functie de mediul pe

care au fost insamantate.

Medii multitest:

AABTL: mediu albastru-verde, vireaza spre galben in urma fermentarii lactozei

TSI: triplu sugar

MIU: mobilitate, indol, uree; mediul este galben, vireaza spre rosu datorita producerii ureazei

Testul Simons: de la verde vireaza la albastru.

Escherichia Coli

Se insamanteaza pe AATBL si pe ADCL. Este lactozo +,

glucozo +, degajare de gaz. Nu produce hidrogen sulfurat. Pe MIU

uree -, produc indol, unele tulpini sunt mobile. Pe Simons nu

foloseste citratul de Na ca sursa de carbon.

Klebsiella

Se insamanteaza pe medii lactozate, pe care apar colonii

mucoase. Pe baza caracterelor biochimice se face diferentierea

intre specii de klebsiella:

Klebsiella pneumoniae: lactozo +, glucozo + cu producere de

gaz, foloseste citrat de Na ca sursa unica de carbon.

Klebsiella ozenae: lactozo +, glucozo + fara degajare de gaz,

foloseste citrat de Na.

Klebsiella rhinoscleromatis: lactozo -, glucozo si nu foloseste citratul de Na.

In general Klebsiella este germene lactozo + si vireaza

culoarea AABTL de la verde-albastru la galben.

Shigella

Se insamnateaza pe TSI, MIU, Simons

Este lactozo -, glucozo +, fara producere de gaz, nu

fermenteaza zaharoza si nu produce H2S.

Este uree -, nu produce indol, este imobila.

Nu foloseste citratul de Na ca sursa unica de carbon.

Salmonella

Pe mediul Willson Blair: colonii mici, negre, aderente la

mediu cu luciu si halou metalic

Pe ADCL: la 18 ore: colonii lactozo -, de talie mica si

mijlocie cu margini semitransparente care nu modifica nuanta

mediului.

Pe ADCL: la 48 de ore: colonii lactozo -, cu centrul negru

datorita prod de H2S.

Pe TSI: glucozo + cu producere de gaz, degajeaza H2S.

Pe MIU: uree -, nu produce indol si este mobila.

Yersinia

Este lactozo -, glucozo -, nu fermenteaza zaharoza, fara H2S,

sunt imobili si uree -.

Proteus

Este lactozo -, pe TSI este lactozo + si glucozo -, produce gaz

si H2S. Pe MIU este f mobil, uree +. Pe ADCL este lactozo + si

vireaza spre rosu (neg nu vireaza), produce H2S.

13. testul ELEK. Principiu, interpretare

Principiu: intr o placa petri cu geloza se face un sant central.

Se scoate geloza din santul respectiv si se toarna un strat subtire de

geloza pe fundul santului. Dupa ce s a intarit geloza in sant se pune

ser antidifteric. (antitoxic).

Pe restul placii se insamanteaza tulpinile de bacili difterici de

studiat, in striuri perpendiculare pe santul central. De asemenea se

insamanteaza si o tulpina martor sigur toxicogena. Se incubeaza

placa timp de 24 de ore la 37 de grade.

Interpretare: tulpinile de bacil difteric crescand la termostat

elibereaza toxina ce va difuza in gel, iar din santul central

anticorpii antidifterici vor difuza perpenticular. La locul de

intalnire a antigenului cu anticorpii va aparea o linie de precipitare

vizibila. Aparitia la anumite unghiuri dintre tulpina insamantata si

santul cu ser antidifteric a unei linii de precipitare arata ca tulpina

este producatoare de toxina.

14. reactia ASCOLI. Principiu, mod de lucru,

interpretare

Reacii de precipitare n inel Reacia de precipitare n inel, const n punerea n contact a

Ag i Ac astfel nct s nu se amestece; reacia care apare la

interfaa dintre Ag i Ac se concretizeaz printr-un inel de precipitare albicios. Se utilizeaz pentru identificarea originii petelor de snge (reacia Uhlenhut, n medicina legal) i pentru identificarea provenienei unor preparate pe baz de carne (n industria alimentar).

Demonstrativ, n cursul lucrrilor practice, reacia de precipitare n inel (reacia Ascoli) se poate utiliza pentru identificarea prezenei antigenului crbunos (Ag obinut de la Bacillus anthracis). Istoric, soluia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. splin) recoltate de la un animal care a decedat i pentru care se suspecta c decesul a fost produs de o infecie generalizat cu Bacillus anthracis. Fragmentul de organ se mojara n soluie de clorur de sodiu steril, adugndu-se ulterior cteva picturi de acid acetic, apoi se meninea la temperatura de fierbere timp de 5-10 minute. Dup decantarea i alcalinizarea cu NaOH, urma filtrarea i rezulta soluia antigenic. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru reacie i 2 tuburi martor. n primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticrbunos i 0,5 ml soluie salin fiziologic iar n al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal i 0,5 ml soluie de antigen. n ceea ce privete tubul de reacie trebuie s pipetm nti 0,5 ml din serul anticrbunos, urmnd ca soluia de antigen (n cantitate de 0,5 ml) s fie pipetat foarte lent, eventual prin scurgere pictur cu pictur pe peretele interior al tubului, n aa fel nct cele 2 soluii s nu se amestece. n cazul reaciei pozitive (prezena Ag crbunos n soluia antigenic), dup circa 5 minute, la interfaa dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare.

15. reactia Bordet-Wasserman. Principiu, interpretare

Este o reactie de fixare a complementului ce foloseste drept

Ag cardiolipina. Acesta se foloseste in diagnosticul serologic al

sifilisului (treponema pallidum). Este o reactie semicantitativa ce

determina gradul de pozitivitate.

Principiu: este similar cu o reactie de fixare a

complementului avand 2 faze. Ag (cardiolipina) se pune in contact

cu o cantitate titrata de complement si cu ser de la bolnav inactivat

30 de min la 56 de grade. Dupa ce s au pus in contact cele 3

componente, putem avea 2 posibilitati: reactia este pozitiva, adica

in ser exista Ac si s au format complexe cardiolipina-Ac de care s a

legat complementul (complementul se leaga de Ag numai daca

acesta s a legat de Ac).

Reactia este negativa: in ser nu exista Ac, iar cardiolipina

este libera.

Peste reactia anterioara se adauga sistem hemolitic, format

dintr o suspensie de hematii ce au Ac fixati pe suprafata lor. Pentru

ca rezultatul reactiei sa fie corect trebuie ca aceasta suspensie de

hematii sa nu se autohemolizeze.

Interpretare: daca reactia este pozitiva, complementul este

legat de complexul Ag-cardiolipina si nu va liza hematiile nu se produce hemoliza.

Daca reactia este negativa, complementul este liber si va liza

hematiile se va produce hemoliza. Putem avea si o hemoliza partiala, deoarece dupa fixarea

complementului de complexul Ag-cardiolipina, poate ramane o

cantitate de complement libera care va produce hemoliza.

16. exudatul faringian. Mod de recoltare, insamnatare,

interpretare

Modul de prelevare a produselor patologice destinate

examinarii bacte-riologice conditioneaza in mod direct eficienta

etapelor ulterioare, in final, obtinerea unui rezultat fidel.

Reguli generale:

prelevarea trebuie executata de catre medic sau cadru

medical mediu, sub directa supraveghere a acestuia, in conditii

stricte de asepsie,

prelevatul sa fie obtinut direct din leziune, astfel incat

produsul patologic sa contina portiunile cele mai caracteristice ca

semnificatie etiologica,

prelevarea sa fie executata inainte de inceperea terapiei cu

antibiotice

sau la 48h de la intreruperea ei. Pe buletinul de trimitere

se va specifi-

ca tipul antibioticului si doza aplicata,

e necesar a se recolta cantitati suficiente de produs, pentru a

face

posibile toate examenele, inclusiv cele indicate ulterior,

fiecare produs trebuie recoltat in recipiente sterile, de unica

folosinta

sau recipiente de sticla sterile, fara urme de antiseptice,

- un recipient va contine un singur produs: proba unica

recoltata de la

un singur bolnav,

recipientul care contine produsul va fi etichetat: nume,

prenume pacient; pavilion, salon;

pentru fiecare proba se intocmeste Buletin de trimitere

- Buletinul de analize contine rubrica cu rezultatul

examinarii.

- recipientele in care se recolteaza produsele de examinat,

sunt:

* sterile, inchise etans,

* din material transparent( sticla, mat. plastic),

* dop, capac ce se deschid prin desurubare,

* cu sau fara medii de conservare si transport,

* pentru germeni anaerobi, conditii speciale de

recolta, cu

evitarea contactului cu aerul atmospheric.

TRANSPORTUL PROBELOR

catre laboratorul de microbiologie se efectueaza in cel mai

scurt timp posibil de la momentul recoltei,

- se efectueaza in recipiente sterile,

insotite de buletine de analiza corect completate,

Lcr si hemoculturile se transporta imediat, la temperatura

corpului,constituind urgente majore,

in suspiciune de flora anaeroba, produsul se transporta in

seringa, cu evitarea contactului cu aerul atmospheric, in cel mai

scurt timp,se folosesc la nevoie medii de conservare si transport:

Stuart, Amies, Cary- Blair.

se efectueaza doar de catre persoane instruite in acest scop,

timpul maxim admis de la recoltarea produsului este de 1 ora,

dupa care, rezultatul este compromis.

Exsudatele si transsudatele seroaselor (lichide pleurale, peritoneale, articulare):

recoltarea se efectueaza prin punctie cu seringa, in conditii

riguroase de asepsie,

necesari 10- 15 ml, in cazul lichidelor pleurale si peritoneale

si 4- 5 ml pentru cele articulare,

pentru suspiciunea etiologiei cu flora anaeroba, produsul

patologic ramane in seringa impins pana la ambou, fara contact cu

aerul atmosferic, inchis ermetic,

este total contraindicata recoltarea florei anaerobe cu

tamponul.

Exsudatul naso- faringian: dimineata pe nemancate (in absenta unui gargarism cu

antiseptice),

sau, cel putin dupa 4 ore de la ingerarea de alimente,

persoana, pe scaun, in pozitie sezanda, cu capul aplecat pe

spate, cu fata indreptata spre o sursa de lumina puternica,

se deschide gura la maximum, se apasa limba, se vizualizeaza

peretele posterior al faringelui, amigdalele, pilierii si valul paltin,

recoltarea se efectueaza cu tampoane de vata sterile,

insistandu- se asupra zonelor cu eritem, punctelor de puroi,

secretiei mucopurulente, pseudomembranelor,

se recolteaza cel putin 2 tampoane (frotiu Gram pentru

diagnosticul asocierii anaerobe fuso- spirilare, Angina Plaut-

Vincent)),

in caz de suspiciune de difterie, se recolteaza 3 tampoane

faringiene si 2 tampoane nazale,

daca leziunea este profunda, in fosele nazale, recoltarea

secretiilor este efectuata de catre specialist ORL, prin rinoscopie

anterioara, cu speculul nasal,

este indicat ca pe buletinul de trimitere sa se specifice

examenul solicitat,

17. urocultura. Mod de lucru, insamnatare, interpretare

in prealabil se face o toaleta a organelor genitale exterioare,

cu apa si sapun, stergerea cu tampon de vata imbibat in solutie

salina sterila,

prelevarea se face din jet mijlociu, direct in vas steril, cu

gatul larg,

volumul necesar unei examinari uzuale este de 10- 15 ml.

in prezenta unei simptomatologii caracteristice, se recolteaza

1- 2 urini la interval de 24 ore,

la bolnavi asimptomatici sunt necesare 2-3 probe de urina

repetate,

numai obtinerea aceluiasi rezultat de mai multe ori are

semnificatie etiologica.

in infectia gonococica recoltarea urinei se face in aceleasi

conditii, cu mentiunea ca se retine primul jet de urina,

urocultura in leptospiroza: se recolteaza urina dupa prima

saptamana de boala, in conditii aseptice, dupa o administrare timp

de 24- 48 ore de regim alimentar alcalinizant, urocultura in

tuberculoza renala: prelevatul de electie il constituie urina recoltata

dimineata, din jetul mijlociu, timp de 3 zile consecutiv.

Pana la obtinerea celei de a 3- a probe, urina se pastreaza la

frigider.

18. coprocultura. Mod de lucru, insamantare,

interpretare

recoltarea materiilor fecale se realizeaza in recipiente

speciale (copro-

recoltoare) din material plastic transparent, sterile, cu capac

etans,

indepartat prin desurubare,

produsul care permite cele mai multe izolari este scaunul

emis spontan, proaspat,

la bolnavii cu scaune diareice, in perioada de stare, se

recolteaza cu lopetica recoltorului portiuni de scun cu mucus,

sange, sau esantioane din 2- 3 locuri diferite,

la bolnavii cronici, purtatori, persoane nespitalizate, scaunul

va fi provocat prin purgativ salin ( sulfat de Na si Mg),

pentru controlul purtatorilor de bacilli tifici, prelevarea se

face timp de 3 zile consecutiv, dupa administrare unica de

purgativ,

in cazul purtatorilor cronici de bacilli dizenterici, se folosesc

sonde Nelaton nr. 16- 18,

conservare in mediu Cary- Blair sau transport imediat,