microbiologie alimentara

76
UNIVERSITATEA TRANSILVANIA BRAŞOV FACULTATEA DE ALIMENTAŢIE ŞI TURISM LUCRĂRI PRACTICE DE MICROBIOLOGIE ALIMENTARA Dr. Puchianu Gheorghe Medic Primar Veterinar Doctor în Ştiinţe Medicale Veterinare Dr. Drăghici Emilia Medic Veterinar Cercetător Ştiinţific 2010 Condiţiile pentru funcţionarea laboratoarelor supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor 1

Upload: cristina-obada

Post on 25-Dec-2015

143 views

Category:

Documents


13 download

DESCRIPTION

Microbiologie alimentara

TRANSCRIPT

Page 1: Microbiologie Alimentara

UNIVERSITATEA TRANSILVANIA BRAŞOVFACULTATEA DE ALIMENTAŢIE ŞI TURISM

LUCRĂRI PRACTICE DE MICROBIOLOGIE ALIMENTARA

Dr. Puchianu Gheorghe Medic Primar Veterinar Doctor în Ştiinţe Medicale Veterinare

Dr. Drăghici Emilia Medic Veterinar Cercetător Ştiinţific

2010

Condiţiile pentru funcţionarea laboratoarelor supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor

Funcţionarea laboratoarelor în care se desfăşoară activităţi supuse autorizării sanitare veterinare şi/sau pentru siguranţa alimentelor este condiţionată de autorizarea acestora de către autorităţile competente. Categoriile de laboratoare supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor, sunt: laboratoarele de referinţă: pentru siguranţa alimentelor, organizate în cadrul Institutului de

Igienă şi Sănătate Publică Veterinară; alte laboratoare naţionale de referinţă desemnate prin ordin al preşedintelui Autorităţii Naţionale

Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor; laboratoare sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene, respectiv al municipiului

Bucureşti, organizate în cadrul direcţiilor sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene, respectiv a municipiului Bucureşti;

1

Page 2: Microbiologie Alimentara

laboratoare sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor organizate în cadrul unităţilor de învăţământ medical veterinar superior de stat, desemnate de autoritatea competentă să efectueze anumite analize sau examene în cadrul controlului oficial; laboratoare organizate în cadrul institutelor de cercetare de stat în care se desfăşoară activităţi

supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor; laboratoarele private sanitare veterinare şi/sau pentru siguranţa alimentelor, care

includ:laboratoare sanitare veterinare şi/sau pentru siguranţa alimentelor particulare ori organizate în unităţi private în care se desfăşoară activităţi sanitare veterinare şi/sau pentru siguranţa alimentelor;laboratoare organizate în unităţi în care se desfăşoară activităţi supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor, cunoscute sub denumirea de laboratoare uzinale; laboratoare sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor organizate în cadrul unităţilor de

învăţământ medical veterinar superior privat, desemnate de autoritatea competentă să efectueze anumite analize sau examene în cadrul controlului oficial; laboratoare organizate în cadrul institutelor de cercetare private în care se desfăşoară activităţi

supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor. Laboratoarele naţionale de referinţă sunt autorităţi centrale pentru domeniile de competenţă autorizate, iar laboratoarele sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene, respectiv al municipiului Bucureşti, sunt autorităţi judeţene în domeniu. Acestea funcţionează sub coordonarea tehnică şi operaţională a Serviciului de coordonare tehnică a institutelor de referinţă şi a laboratoarelor sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor din cadrul Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor de supraveghere şi diagnostic din structura institutelor veterinare centrale sunt autorităţi centrale pentru domeniul lor de competenţă şi funcţionează sub coordonarea tehnică, controlul şi supravegherea Serviciului de coordonare tehnică a institutelor de referinţă şi a laboratoarelor sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor din cadrul Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene, respectiv al municipiului Bucureşti, sunt autorităţi judeţene pentru domeniile lor de competenţă şi funcţionează în cadrul direcţiilor sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene şi a municipiului Bucureşti, sub coordonarea tehnică a laboratoarelor din cadrul institutelor veterinare centrale şi coordonarea operaţională prin Serviciul de coordonare tehnică a institutelor de referinţă şi a laboratoarelor sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor din cadrul Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor organizate în cadrul unităţilor de învăţământ medical veterinar superior de stat şi privat nu au statutul de autorităţi în domeniu şi funcţionează sub supravegherea tehnică a institutelor veterinare centrale. Laboratoarele organizate în cadrul institutelor de cercetare de stat şi private în care se desfăşoară activităţi supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor nu sunt autorităţi în domeniu şi funcţionează sub supravegherea tehnică a institutelor veterinare centrale. Celelalte laboratoare private în care se desfăşoară activităţi supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor nu sunt autorităţi în domeniu şi funcţionează sub supravegherea tehnică a direcţiilor sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene şi a municipiului Bucureşti, prin laboratoarele sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene, respectiv al municipiului Bucureşti. Buletinele de analiză emise de laboratoarele autorizate – Laboratoarele naţionale de Referinţă şi Laboratoarele sanitare veterinare Judeţene, precum şi cele emise de laboratoarele sanitare veterinare

2

Page 3: Microbiologie Alimentara

şi pentru siguranţa alimentelor organizate în cadrul unităţilor de învăţământ medical veterinar superior de stat şi privat autorizate au caracter oficial. Activităţile pentru care se autorizează laboratoarele în care se desfăşoară activităţi supuse autorizării sanitare veterinare şi/sau pentru siguranţa alimentelor, menţionate în domeniul siguranţei alimentare sunt următoarele: 1. laborator de microbiologia alimentelor şi a hranei pentru animale - cu profilurile: a) microbiologia produselor şi subproduselor animaliere şi de origine animală; b) microbiologia produselor de origine nonanimală; c) microbiologia hranei pentru animale şi apei; 2. laborator de analize fizico-chimice ale alimentelor şi hranei pentru animale - cu profilurile: a) analize fizico-chimice ale produselor şi subproduselor animaliere şi de origine animală; b) analize fizico-chimice ale produselor de origine nonanimală; c) analize fizico-chimice ale hranei pentru animale; 3. laborator pentru controlul radioactivităţii şi detecţia alimentelor iradiate - cu profilurile: a) controlul radioactivităţii; b) detecţia alimentelor iradiate; 4. laborator pentru controlul reziduurilor - cu profilurile: a) control reziduuri la animale vii; b) control reziduuri la produse animaliere şi de origine animală; c) control reziduuri din apă şi hrană pentru animale; d) control reziduuri la produse de origine nonanimală. Condiţii pe care trebuie să le îndeplinească un laborator

Condiţii de amplasare - trebuie să includă: referinţe generale privind distanţele, structura terenului şi nivelul apei freatice, existenţa căilor de acces adecvate, a unei suprafeţe de teren de rezervă sau tampon pentru eventuala extindere.

Amplasarea clădirilor destinate laboratoarelor se face astfel încât: distanţa faţă de clădirile învecinate şi drumurile publice să fie astfel proiectată încât să asigure respectarea prevederilor legale privind protecţia mediului, siguranţa clădirilor, sănătatea publică şi sănătatea animalelor; structura terenului şi nivelul apelor freatice să permită amplasarea construcţiei în conformitate cu reglementările în vigoare; să aibă căi de acces proprii adecvate scopului de activitate.

Condiţii pentru construcţie 1. Condiţiile pentru construcţie trebuie să includă: natura şi calitatea materialelor de construcţie, a fundaţiei, a pavimentelor, a suprafeţelor interioare, a uşilor şi ferestrelor, a acoperişului şi a echipamentelor de iluminare, ventilaţie şi protecţie antiseismică.2. Construcţia realizată trebuie să fie rezistentă, să aibă spaţiu suficient pentru desfăşurarea proceselor de lucru şi să asigure condiţiile pentru aplicarea măsurilor de igienizare, realizarea confortului termic şi condiţiile tehnice de funcţionare a echipamentelor.3. Materialele de construcţie trebuie să fie netoxice, impermeabile, netede, rezistente la uzură şi coroziune şi să se poată curăţa uşor. Nu se acceptă folosirea materialelor absorbante, poroase, greu de curăţat.4. Pavimentele şi pereţii interiori trebuie construiţi din materiale netoxice, rezistente la agenţi fizici şi chimici, impermeabile, neputrezibile şi netede, încât să permită igienizarea uşoară şi eficientă a acestora, protecţia termică şi protecţia fonică.5. Tavanele din spaţiile de lucru trebuie construite din materiale netoxice, rezistente la agenţi fizici şi chimici, impermeabile, neputrezibile şi netede, încât să permită igienizarea uşoară şi

3

Page 4: Microbiologie Alimentara

eficientă a acestora, protecţia termică şi protecţia fonică, şi să fie situate la o înălţime corespunzătoare, adecvată specificului activităţii.6. Instalaţiile electrice trebuie astfel proiectate şi instalate încât să respecte reglementările în vigoare cu privire la energia consumată, protecţia mediului, a sănătăţii publice şi sănătăţii animalelor.7. Corpurile de iluminat trebuie astfel amplasate încât să asigure iluminatul adecvat specific activităţii.8. Uşile şi ferestrele trebuie confecţionate din materiale netoxice, rezistente la agenţi fizici şi chimici, impermeabile, neputrezibile şi netede, încât să permită igienizarea uşoară şi eficientă a acestora, protecţia termică, protecţia fonică, adecvate specificului activităţii.9. Acoperişul trebuie să fie construit din materiale rezistente şi impermeabile.10. Ventilaţia se asigură în toate spaţiile de lucru şi administrative prin mijloace adecvate, prin sisteme generale şi/sau autonome de climatizare, cu excepţia spaţiilor speciale în care se realizează activităţi ce necesită presiune negativă sau alte mijloace de biosecuritate.

Condiţii privind utilităţile 1. Condiţiile privind utilităţile trebuie să includă: aprovizionarea cu apă potabilă şi utilitară, alimentarea cu energie electrică, asigurarea condiţiilor de microclimat, gestionarea şi neutralizarea deşeurilor, sistemul de canalizare, aprovizionarea cu gaze naturale, protecţia mediului şi condiţii de biosecuritate.2. Laboratorul trebuie să se aprovizioneze numai cu apă potabilă în cantităţi suficiente pentru necesităţile pe flux şi pentru procesul de igienizare. Apa potabilă trebuie să provină fie din reţeaua de aprovizionare a municipiului sau localităţii, fie din sursă proprie.3. În cazul în care unitatea/instituţia posedă staţie de clorinare proprie, se prelevă obligatoriu probe de apă din conducta de aducţie a apei, apă neclorinată şi după clorinare, pentru a se urmări eficienţa operaţiei de clorinare a apei.4. Apa potabilă trebuie distribuită în toată reţeaua sub presiune adecvată şi continuă şi în cantităţi suficiente pentru acoperirea tuturor necesităţilor de funcţionare a instituţiei.5. Trebuie să se asigure atât apă rece, cât şi apă caldă. Apa caldă este furnizată dintr-o instalaţie centrală pentru încălzirea şi distribuirea apei calde sau de la instalaţii parţiale.6. Nu se admite utilizarea apei nepotabile în procesul de igienizare a spaţiilor de lucru şi a căilor de acces.7. Conductele de apă trebuie să fie precis identificate. Trebuie să existe o delimitare separată a fluxului de apă potabilă faţă de cel de apă nepotabilă, prin sistem separat de conducte.8. În vederea prevenirii contaminării spaţiilor de lucru, conductele interioare vor fi identificate vizibil prin culori diferite, şi anume: conducte pentru apa potabilă - verde; conducte pentru apa nepotabilă - negru; conducte de canalizare - negru; conducte de încălzire - roşu; conducte de gaze naturale - galben.9. Alimentarea cu energie electrică trebuie să se realizeze din linia de joasă tensiune de 380/220 V şi sursă proprie, în caz de avarie. Pentru aparatura cu risc de electrocutare trebuie asigurată centura de împământare, în conformitate cu prevederile legale.10. Instalaţii pentru asigurarea parametrilor de microclimat în spaţiile de lucru, astfel: instalaţii de captare şi evacuare a unor factori nocivi din spaţiile de lucru; instalaţii pentru menţinerea parametrilor de temperatură în spaţiile de lucru sau în cele în care este amplasată aparatura de lucru, în special aparatura de înaltă precizie;11. Grupurile sociale trebuie dimensionate în funcţie de personalul care activează în laboratoare, dotate cu instalaţie de apă rece şi caldă, duşuri şi vestiare.

4

Page 5: Microbiologie Alimentara

12. Pentru managementul deşeurilor rezultate din activităţile ce au loc în cadrul laboratoarelor sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene trebuie să se respecte reglementările în vigoare, precum şi procedura generală internă privind gestionarea deşeurilor. Având în vedere profilul de activitate al laboratorului şi amplasamentul acestuia, materialul patologic şi deşeurile rezultate în urma activităţilor din laborator trebuie denaturate şi inactivate prin mijloace adecvate, după care acestea sunt preluate de o unitate specializată.13. Laboratorul trebuie să fie prevăzut cu o reţea de canalizare corespunzătoare, racordată la reţeaua de canalizare a localităţii/oraşului sau la un sistem propriu de evacuare.14. Apele uzate provenite din laborator trebuie tratate pentru a se preveni diseminarea oricărui factor de risc. De-a lungul părţii externe a sistemului de canalizare trebuie amplasate guri de vizitare, pentru curăţenia curentă sau pentru deblocare în caz de accidente. Acestea nu trebuie să constituie un pericol de contaminare pentru spaţiile de lucru sau pentru zonele învecinate.15. Incinta de utilitate a instituţiei trebuie să fie betonată sau asfaltată şi prevăzută cu sistem de canalizare corespunzător.16. Construcţia şi incintele trebuie să respecte condiţiile de mediu.

Examenul bacteriologicExamenul bacteriologic presupune izolarea, cultivarea si identificarea germenilor

bacterieni din diferite alimente suspecte de contaminare. Fata de examenul microscopic, care permite decelarea prezentei agentului etiologic, metodele bacteriologice complexe permit, pe lânga izolare si cercetarea diferitelor insusiri biologice care-l caracterizeaza. Faptul are o deosebita importanta si din punct de vedere epidemiologic, prin aceste examene evitindu-se, de exemplu darea in consum a unor produse animaliere care pot provoca la om infectii sau toxiinfectii, uneori cu evolutie grava. Este suficient sa se aminteasca perico lul pe care-l prezinta, mai ales carnea animalelor sacrificate de necesitate, la care intreruperea procesului patologic, prin sacrificare, face ca modificarile organoleptice si organice sa nu trezeasca suspiciune la examinare. Un examen bacteriologic insa poate pune in evidenta agentii unei salmoneloze, leptospirozei, antraxului etc. toate transmisibile la om. Examenul bacteriologic da adesea si indicii referitoare la sursa de infectie si permite deci, eliminarea ei. Tehnica îsamânţarii - ca tehnici de insamintare pot fi aplicate mai multe procedee:

a) Cu pipeta Pasteur. Se cauterizeaza suprafafa probei cu o spatula incalzita, se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambata si easi racita, o cantitate de lichid organic din profunzime si se insaminteazaintâi pe mediul lichid (bulion), iar apoi pe mediul solid (agar inclinat, agar cu singe, agar ou ser etc.). La inchiderea si deschiderea tuburilor se iau toate masurile de asigurare a sterilitatii, flambând gura lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere.

a) Cu ajutorul acului de insamintare drept. Se cauterizeaza suprafaţa produsului alimentar si se sterilizeaza acul prin incalzire la rosu (tija se trece si ea de 3 ori prin flacara), iar dupa racire se inteapa prin suprafaţa cauterizata, facând câteva miscari spre interior. Se scoate acul dinsi se face insamântarea prin clatirea acestuia in mediul lichid. Fara a se flamba, acul se introduce apoi in tubul cu mediul solid, facându-se pe suprafaţa acestuia miscari in zig-zag, incepând de la baza mediului spre partea superioara, sau se clateste acul in lichidul de conden-sare, dupa care se umecteaza intreaga suprafaţa a mediului cu acest lichid, prin inclinari repetate. Dupa fiecare proba, acul se sterilizeaza prin inrosire la flacara.

b) Cu porţiuni de aliment. Când alimentul a fost recoltat in conditii de sterilitate (mai ales in cazul animalelor mici) se poate recurge la secţionarea unor bucaţi cu ajutorul unor instrumente sterile, iar cu una din suprafeţele sectiunii se disperseaza materialul patologic pe suprafaţa uneiplaci cu mediu. In unele laboratoare aceasta tehnica este folosita aproape in exclusivitate.

5

Page 6: Microbiologie Alimentara

c) Prin introducerea direct, in mediu a portiunilor de aliment. Metodase foloseste mai rar, in special cind se banuieste saracia in germeni a materialului patologic. Recoltarea si manipularea acestuia trebuie sa se faca in conditii de sterilitate perfecte.

Ca principiu general, se va evita deschiderea probelor alimentare sau secţionarea tesuturilor inainte de recoltarea materialului pentru examenul bacteriologic.

Tehnica transplantarilor. Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor germeni in stare pura, fie menţinerea lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de colectie).

Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu pipeta Pasteur sau cu ansa de insamintare. In primul caz, se recolteaza o cantitate arbitrara (câteva picaturi) din cultura veche, care apoi se insamânteaza in mediul proaspat. In cel de al doilea, se introduce ansa flambata si racita in cultura veche, dupa care se face insamântarea pe mediile proaspete (intâi in mediul lichid si apoi in mediul solid, daca este cazul).

Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa, raclând o cantitate foarte redusa de cultura, care apoi se depune pe mediile proaspete.

In timpul insamântarilor de orice natura, este necesar sa se aiba in vedere câteva reguli general valabile:- însămânţările se execută în boxe sterile sau în hote speciale care permit sterilizarea periodică şi nu permit formarea de curenţi de aer în timpul lucrului;- în timpul operaţiunilor de însămânţare se evită pe cât posibil conversaţia şi orice mişcare de prisos în jurul operatorului;- ansa cu care se execută însămânţarea nu trebuie să fie atinsă de nici un obiect nesteril (mână, halat, masă de lucru, etc.);- însămânţările se vor executa cât mai repede, cu scopul de a reduce la minim contactul materialului de însămânţat cu atmosfera ambiantă;- în timpul cât recipientele sau tuburile de cultură, sterile sau însămânţate sunt deschise, vor fi ţinute în poziţie înclinată cât mai aproape de flacără pentru a evita contaminarea cu germeni sau spori din atmosferă;- imediat după însămânţare se face notarea tuburilor cu creioane speciale fără a se omite data însămânţării.

Mediile de culture folosite pentru izolarea diferitelor tipuri de bacteriiPentru a pune un diagnostic bacteriologic corect, sigur si prompt, folosirea unor medii de

cultivare corespunzatoare este de o importanta hotărâtoare. Cunoscându-se insusirile germenilor cautati, conditiile lor optime de dezvoltare, bacteriologul trebuie sa foloseasca mediile cele mai eficiente si indicate de izolare, in funcţie de specia microorganismului in cauza.

Un mediu de cultura trebuie sa asigure substratul nutritiv pentru cresterea si multiplicarea microbilor, sa aibe un pH care sa permita desfasurarea normala a proceselor metabolice microbiene (in general 7,2—7,4), sa asigure condiţiile de aerobioza sau anaerobioza, sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alti microbi si sa fie usor de manevrat. In general, microbii patogeni se dezvolta optim la temperature corpului speciei de la care sunt izolati. Sunt insa si specii microbiene care prefera temperaturi mai joase ( ex. leptospirele se multiplica la 28—30°C).

Mediile de cultura se pot imparti in doua categorii:- medii uzuale (obişnuite) - pe care se dezvolta majoritatea germenilor patogeni. Ele pot fi: pentru bacterii aerobe; pentru bacterii anaerobe; — medii speciale, destinate izolarii, cultivarii si cercetarii insusirilor biologice ale anumitor specii de germeni. Ele mai pot fi sistematizate în medii: de izolare, de imbogatire, selective, diferentiale ;

6

Page 7: Microbiologie Alimentara

- mediile speciale de izolare - favorizeaza dezvoltarea anumitor germeni, care nu se pot cultiva de la inceput pe mediile obisnuite, ei necesitând anumite condiţii speciale sau anumiţi ,,factori de plecare".

Mediile de imbogăţire sunt folosite pentru cazurile in care in produsul patologic de examinat se bănuieste o cantitate mica de germeni patogeni si un numar mare de germeni din flora de asociaţie. Astfel de medii sint mediul Kaufmann—Muller (pentru enterobacteriaceae), mediul Chapman (pentru stafilococi patogeni).

Mediile selective favorizeaza, prin compoziţia lor chimica, dezvoltarea anumitor germeni. Astfel sint mediul Wilson—Blair si Drigalski (pentru salmonele), mediul Istrati—Meitert (pentru Escherichia, Shigella, Salmonella), mediile Czapek, Sabouraud (pentru ciuperci).

Mediile diferenţiale permit cresterea diferenţiata a unor specii microbiene sau pun in evidenţa anumite particularitati metabolice cu semnificaţie diagnostică. Ele evidenţiaza anumite procese biochimice caracteristice metabolismului anumitor specii de bacterii, permitând in acest fel identificarea lor (fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreductoare etc.). Includerea in componenţa acestor medii a unor substanţe indicatoare sau revelatoare este menita sa faca vizibil procesul respectiv. Dupa starea lor fizica mediile se pot imparti in: solide, semisolide, lichide. Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe. Exista si medii ,,sintetice" bazate pe componente cunoscute din punctul de vedere al structurii lor chimice. In comparatie cu bulionul, agarul sau alte medii ale caror componente nu sunt identificate chimic in totalitate, mediile sintetice au avantajul ca permit anumite determinari capabile sa ofere relatii asupra metabolismului bacterian (prin dozarea inainte si dupa cultivare a diferitelor componente se poate cunoaste ce anume a fost consumat in cursul multiplicarii si in ce cantitate).

Dintre cele mai frecvent folosite medii de cultura sunt :Apa peptonata - este unul din cele mai simple medii de cultura, dar care are largi utilizari, in

special când i se adauga zaharuri, in vederea determinarii spectrului zaharolitic al diferitelor specii de bacterii. Se prepara din:

- apa distilata 100,0 ml - peptona 1,0 g - NaCl 0,5 gSe ajusteaza pH-ul la 7,2—7,4, se incalzeşte 15 minute la 115°C pentru precipitare, se filtreaza

prin hârtie de filtru si se sterilizeaza din nou !a autoclav.Când se adauga zaharurile, acestea se pun in proportie de 1% in balonane separate, se

adauga albastru de bromtimol (12 ml la 1 litru de mediu) ca indicator si se sterilizeaza prin tindalizare 30 de minute, 3 zile consecutiv. Soluţia de albastru de bromtimol folosita in acest scop se prepara din: 1 g albastru de bromtimol + 25 ml NaOH n/10 + 475 ml apa distilata.

Bulionul de carne se prepara mai ales din came de bovine şi cabaline, mai rar din cea de pasare. Muschii se curaţa de aponevroze, tendoane, fascii si grasime, se taie bucati mici, sau se toaca la masina de tocat came. La 500 g tocatura, se adauga 1000 ml apa de robinet, se tine 24 de ore la rece, pentru macerare, apoi se fierbe 30 minute, se decanteaza şi se stoarce, iar lichidul obtinut se filtreaza prin mai multe straturi de tifon si se completeaza cu apa la volumul iniţial. Se incalzeste la 80—90°C si se adauga peptona 10 g si NaCl 5 g la 1000 ml lichid.

Se ajusteaza pH-ul cu o solutie de NaOH n :1 (la 7,2—7,6) prin metoda colorimetrica. Se incalzeste la autoclav la 115°C timp de 15 minute. Incalzirea in prezenta NaOH produce o precipitare abundenta, ceea ce impune o filtrare prin hirtie de filtru. Apoi se face repartizarea in tuburi, in cantitate de cca 5 ml, in sticle sau baloane, care se astupa cu dopuri de vata si se sterilizeaza 30 minute la auitoclav la 115°C.

7

Page 8: Microbiologie Alimentara

Pentru repartizare se pot folosi pipete de 25—50 ml, dar cel mai practic este sa se folosesca dispozitive speciale constând din vase cu tubulura inferioara sau pâlnii suspendate, prevazute cu un tub de cauciuc si clemă. In unele laboratoare exista dispozitive automatizate care asigura un debit constant, reglabil (aşa numitele turnătoare de medii).

Bulionul astfel preparat are un aspect asemanator cu untdelemnul si trebuie sa fie perfect limpede.

Pastrarea lui se poate face vreme indelungata in vase bine inchise, in incaperi reci si la adapost de lumina.

La ora actuala, este din ce in ce mai raspindita folosirea extractelor de carne care sint livrate in stare deshidratata, purificata si standardizata, ceea ce asigura obţinerea unor medii de o calitate superioara (extractele Merck, Oxoid etc.).

Agarul nutritiv (geloza) este un mediu solid obtinut prin adaugarea la bulionul de carne a agarului (fibre sau pulvis). Acesta nu are nici un rol nutritiv, dar determina solidificarea mediului.

La 1 litru de bulion, se calculeaza 30 g agar fibre sau 25 g agar pulvis, care se topeste apoi prin incalzire la 115°C, timp de 15 minute la autoclav. Se filtreaza prin vata, in autoclavul cu capacul deschis (pentru a evita solidificarea pe parcursul filtrarii).

Se repartizeaza in eprubete sau alte recipiente unde urmeaza a fi pastrat. Se astupa cu dopuri de vata, se sterilizeaza 20 de minute la 120°C dupa care eprubetele se pun in pziţie inclinata pentru solidificare.

Pastrarea se poate face in flacoane inchise etans pentru a evita pierderea apei, dar in general este bine sa nu se prepare sarje prea mari pentru a dispune de mediu cât mai proaspat.Examenul caracterelor culturale

Dezvoltarea germenilor bacterieni pe mediile de cultura ia aspecte diferite in functie de specia in cauza, mediul folosit si uneori condiţiile de cultivare. Pentru unele specii, o serie de caractere culturale reprezinta particularitati deosebit de pretioase pentru identificarea lor.

In mediile lichide, in aprecierea dezvoltarii bacteriilor se au in vedere turbiditatea, depozitul si formatiunile de suprafaţa.

Turbiditatea - poate fi pronuntata, discreta sau poate sa lipseasca. Depozitul - ia nastere prin depunerea la fundul tubului a germenilor care s-au

dezvoltat in mediu. El poate fi discret sau abundent, granular, vâscos sau pulverulent, omogenizabil sau neomogenizabil prin agitare, aderent sau nu la fundul tubului.

Suprafata - mediului poate oferi aspectul unei membrane de grosimi variabile, rugoasa, granulara, incretita sau neteda, sau al unui inel de grosimi variabile la suprafata lichidului.

Pe mediile solide, germenii constituie, prin multiplicare, aglomerări cunoscute sub numele de colonii, vizibile cu ochiul liber sau cu lupa. In aprecierea lor, se au in vedere: dimensiunile, forma in ansamblu, profilul, suprafata, marginile, culoarea, opacitatea, consistenta, emulsionabilitatea.

Sub aspectul dimensiunii, coloniile pot fi de talie variabila, pina la ciţiva milimetri diametru.

8

Page 9: Microbiologie Alimentara

Forma poate fi circulara, ovalara, radiata sau neregulata; Profilul (in secţiune prezumtiva) poate avea un aspect plat, convex, concav, ombilicat,

mamelonat sau papiliform; Suprafata poate fi neteda, aspra, granulara, lucioasa sau mata; Marginile pot fi uniforme, neregulate sau cu prelungiri; Culoarea coloniilor este diferita in funcţie de prezenta si natura pigmentului pe care eventual

il conţin (alb, galben, verde, rosu, portocaliu etc.); Sub raportul opacitatii, coloniile pot fi translucide sau opace, intre ele existind grade

intermediare; Consistenta este si ea variabila: untoasa, viscoasa, uleioasa, grun-joasa, friabila, filanta, ea

determinind cel mai adesea si gradul de aderenta la suprafaţa mediului. In timp ce coloniile de consistentă untoasa şi granulara se desprind cu usurinta, cele visooase adera, determinind o dificultate in desprinderea lor; Emulsionabilitatea poate fi usoara sau dificila si face ca suspensiile care se practica sa fie

omogene sau neuniforme. Citeva exemple in acest sens, pot fi edificatoare.

In medii lichide: mediul poate fi tulbure omogen (salmonele, stafilococi); mediul poate fi tulbure cu un inel pe perete la limita superioara a mediului (E. coli); mediul poate fi clar, insa la fund prezinta un depozit grunjos sau nisipos (streptococi); mediul poate fi clar, cu un depozit floconos si aderent la fundul tubului (bacilul

antraxului); mediul prezinta un val subtire la suprafaţa (vibrionul holeric);

9

Page 10: Microbiologie Alimentara

mediul prezinta o membrana uscata la suprafata (Bacillus subtilis); mediul prezinta o membrana groasa, rugoasa, plisata la suprafaţa, restul lichidului

raminând limpede (M. tuberculosis); mediul este colorat in verde-albastrui (b.piocianic). Pe medii solide: E. Coli da colonii rotunde cu margini si suprafeţe netede de 3—5 mm diametru, de

culoare alba-laptoasa, lucioase; Pasteurella da, de regula, colonii mici, abia vizibile, transparente, uneori usor albastrui,

aderente la mediu; antraxului da colonii cu suprafata aspra si cu margini avind prelungiri laterale, efilate, care

privite cu lupa, au aspectul unor ondulaţii ale firelor de par; stafilococii dau colonii rotunde, bombate, cu margini si suprafete netede, unele din ele

pigmentate in alb, auriu sau citrin; streptococii dau colonii mici bombate; b. tuberculozei umane produce colonii rugoase, uscate, cu margini neregulate.

Bacteriile anaerobe ofera şi ele aspecte variabile in functie de mediul folosit in cultivarea lor. In cazul mediilor lichide, in general, se produce o tulburare uniforma cu sau fara producţie

de gaze, vizibile sub forma unor bule fie in intimitatea lui, fie la suprafata. In cazul mediilor semisolide (geloza Veillon) se pot forma doua tipuri de colonii, in

functie de difuzibilitatea germenilor in mediu, insusire legata de prezenta mobilitatii. Bacteriile mobile ( Cl. tetani ) produc colonii pufoase de aspect sferoid , in timp ce cele imobile ( Cl. perfringens ) produc colonii de aspect lenticular, de talie variabila

Examinarea caracterelor metabolice (biochimice) ale germenilor bacterieniAu o importanţă deosebită pentru confirmarea datelor furnizate în urma examinărilor morfo –

culturale. Ele se bazează pe anumite particularităţi metabolice ale bacteriilor care sunt variabile în funcţie de specia microbiană sau chiar de tulpină şi au la bază existenţa unui echipament enzimatic diferit care le conferă capacitatea de a acţiona asupra unor substanţe conţinute în mediu sau de a elabora în cursul multiplicării lor anumite substanţe noi identificabile prin diverse reacţii chimice.

Reacţii de punere în evidenţă a capacităţii zaharolitice – fermentarea zaharurilor se datorează elaborării de către germeni a unor enzime capabile să scindeze glucidele cu formare de aldehide, acizi şi gaze (dioxid de carbon, hidrogen, metan). Ea se determină prin folosirea unor medii de cultură lichide sau solide la care se adaugă diferite zaharuri şi un indicator care să releve transformările biochimice care survin deobicei consecutive modificării pH-lui mediului.

Substanţele hidrocarbonate care se folosesc cel mai frecvent în acest scop sunt: 1. dizaharide – maltoza, lactoza, zaharoza sau sucroza;2. trizaharide – rafinoza;3. pentoze – arabinoza, xiloza, ramnoza;4. hexoze – glucoza, fructoza, manoza, galactoza;5. polizaharide – inulina, amidonul, glicogenul;6. glicozide – salicina, esculina;7. polialcoli ;8. alcooli trivalenţi (glicerina); tetravalenţi (aritrina); pentavalenţi (adonita); hexavalenţi (manita, dulcita, sorbita, inozita).

10

Page 11: Microbiologie Alimentara

Dintre mediile de cultură lichide cel mai frecvent se utilizează apa peptonată în care se dizolvă în proporţie de 1% substanţa hidrocarbonată ce urmează a se identifica şi o soluţie indicatoare (albastru de bromtimol, tinctură de turnesol, roşu neutru). Mediul se repartizează de preferinţă în tuburi de reacţie tip Wasermann.În mediul zaharat, însămânţarea tulpinii bacteriene de cercetat se soldează cu virarea culorii mediului în caz că s-a produs fermentarea sau cu păstrarea culorii iniţiale dacă aceasta nu s-a produs. Modificare culorii mediului are loc în timpul incubaţiei la 37C după o perioadă variabilă în funcţie de rapiditatea cu care fenomenele fermentative au loc. La unele specii aceasta se produce după câteva ore în timp ce la altele este nevoie de o incubaţie mai îndelungată de câteva zile sau chiar săptămâni.Mediile solide folisite pentru a evidenţia capacitatea fermentativă a bacteriilor au înglobate în ele zaharul respectiv şi un indicator care relevă prin virarea culorii prezenţa procesului de fermentare, astfel:

Partea dreaptă galben - glucoză pozitiv (fermentează glucoza) Roşu sau nescimbat - glucoză negativ (nu fermentează glucoza) Negru - formare de hidrogen sulfurat (H2S) Bule de gaz sau spargerea agarului - formare de gaz din glucoză

Partea înclinată Galben - lactoză şi/sau zaharoză pozitiv (unul sau ambele zaharuri sunt folosite) Roşu sau neschimbat - lactoză şi zaharoză negativ (nici un zahar nu este folosit Reacţii de punere în evidenţă a existenţei fermentilor active faţă de substanţele proteice şi aminoacizi şi existenţa unor produşi rezultaţi din dezintegrarea substanţelor proteice.Testul de hemoliză – se foloseşte pentru a determina capacitatea de a hemoliza globulele roşii aparţinând unor specii variate (cal, oaie, bovine, cobia, iepure, om). Însuşirea este prezentă numai la anumite specii bacteriene şi este de cele mai muşte ori legată de patogenitatea acestora. Capacitatea hemolizantă este prezentă în diferite grade la unele tulpini de E. coli, streptococci, stafilococi, listerii, Cl. Perfringens, etc.

Hemliza poate fi de tip alfa care se caracterizează prin producerea în dreptul şi în jurul coloniei a unei decolorări mai mult sau mai puţi întinse însoţită de o înverzire a mediului (datorită modificărilor chimice de oxidare ale hemoglobinei – effect viridans) şi beta care se caracterizează numai prin decolorarea mediului din dreptul şi din jurul coloniei şi denotă o liză totală a globulelor roşii di zona respectivă.

Tulpinile care pe medii cu sânge nu au nici un fel de acţiune asupra globulelor roşii se numesc anhemolitice sau de tip gamma şi caracterizează de regulă germenii lipsiţi de patogenitate atât în condiţii experimentale cât şi naturale.

Pentru stabilirea capacităţii hemolitice, însămânţarea se face la suprafaţă în plăci Petri pe mediu ce conţine sânge defibrinat de diferite specii în proprţie de 5%. Citirea se face după o incubaţie de 24 ore la 37CTestul indolului – indolul rezultă din dezintegrarea triptofanului.

Tehnica efectuarii frotiurilor

11

Page 12: Microbiologie Alimentara

Frotiul este un preparat expeditiv, efectuat din diferite produse patologice (organe, lichide patologice etc.), sau din culturi ale diferitilor germeni, care permite punerea in evidenta a formatiunilor celulare şi cerecetarea însuşirilor lor morfologice si tinctoriale.

Tehnica efectuarii frotiurilor diferă în funcţie de materialul din care se face şi de natura germenilor in cauză.

Din lichide frotiurile se realizeaza prin intinderea materialului respectiv intr-un strat subtire, cu ajutonil unei anse bacteriologice sau a unei lame şlefuite pe lame de microscop obişnuite. Pelicula de material patologic este recomandabil sa fie cit mai fina şi sa aibe o intindere mai redusa decat marginile lamei de microscop.

Dacă este vorba de frotiuri ce se practica din culturi, in cazul mediior lichide frotiul se face cu ansa bacteriologica, sau cu pipeta Pasteur, din mediul de cultura, iar in cazul mediilor solide se face prelevarea cu ansa bacteriologica a unei cantitati reduse de cultura care se emulsionează bine intr-o picatura de apa distilata, pusa in prealabil pe o lama de microscop bine degresata si apoi se intinde suspensia in strat subtire.

In cazul culturilor in medii solidificate in pozitie verticală (de exemplu geloza Veillon) se recurge la o pipeta Pasteur la care se adapteaza un tub de cauciuc, in asa fel ca el sa permita manipularea pipetei in profunzimea mediului sub control vizual. Materialul microbian se recolteaza prin aspirarea coloniilor izolate, care se gasesc in diferite puncte ale mediului.

Din organe, frotiul se poate realiza in mod diferit in functie de natura acestora. Cel mai frecvent se face prin aplicarea unei lame de microscop pe suprafafa de sectiune a probei de examinat, in acest fel raminind o impresiune corespunzatoare formei suprafetei atinse (metoda amprenta). Este bine ca pe aceeasi lama sa se practice mai multe amprente, pentru a se putea examina frotiurile mai subtiri ( ultimile amprente sunt intotdeauna mai fine).Se poate recurge, de asemenea, la glisarea unei portiuni de organ, tăiată geometric, pe suprafaţa unei lame de microscop, avându-se grijă de a nu se atinge marginile lamei. Si în acest caz se prefera frotiurile cit mai fine.

Uneori, frotiurile se executa prin strivirea intre doua lame (in cazul unor leziuni de tip nodular. In acest scop, se depune o formatiune nodulara suspecta pe o lama si cu o a doua se striveşte prin compresiune.

Efectuarea frotiului din organeIn cazul unor organe bogate in lichide (sânge, exsudate) frotiul se poate face prin depunerea cu

ajutorul unei anse bacteriologice sau a unei pipete Pasteur pe lama de microscop a unei cantitati reduse de material patologic si etalarea lui in strat subtire.

Frotiurile astfel obtinute se fixeaza dupa uscare la flacara şi se coloreaza. Fixarea este necesara pentru a realiza o buna aderenta a materialului patologic pe lama si implicit evitarea desprinderii de catre solutiile colorante a materialului de examinat pe de o parte si inactivarea germenilor etalati pe de alta. Fixarea se poate obtine prin mijloace termice sau chimice.

Fixarea termica presupune trecerea frotiului uscat de 3—4 ori prin flacara unui bec de gaz sau a unei lampi cu alcool, având grija ca lama sa fie orientata spre flacara cu partea opusa celei pe care s-a etalat materialul. Viteza de trecere este moderata, in asa fel ca in final temperatura lamei sa fie in jur de 60°C.

12

Page 13: Microbiologie Alimentara

Fixarea termica se poate face si prin flambare, punând pe frotiu citeva picaturi de alcool etilic, metilic sau alcool-acetona (din bateria de colorare Gram) si dindu-li-se foc imediat dupa scurgerea excesului de alcool.

Fixarea chimica se realizeaza prin folosirea unor substance fixatoare (alcool etilic, amestec de alcool etilic, eter si alcool metilic). Acestea se pun in cantitate suficienta pentru a acoperi pelicula de material de pe lama si se lasa pâna la evaporarea totala.

Trebuie mentionat ca unii coloranti (de exemplu soluţia Giemsa din metoda cu acelasi nume) au si capacitates de a fixa frotiurile, asa incit in acest caz nu mai este necesara fixarea prealabila.

Dupa fixarea si racirea frotiului urmeaza colorarea, care este bine sa se faca cât mai curând dupa efectuarea frotiurilor.

Metode de colorare şi examinarea microscopică a frotiurilorMetodele cele mai importante de colorare pentru examenul bacteriologic

Prin colorare se pot stabili unele particulariţi morfologice ale germenilor (dimensiuni, forma, afinitati tinctoriale) ca si relaţiile cu ţesuturile în care se afla, facilitindu-se in acest fel precizarea diagnosticului.

Metodele de colorare sunt diverse si se aplica in mod diferentiat, in funcţie de scopul urmarit. Exista metode care se aplica în mod curent si metode speciale, mai pretentioase si aplicate numai in anumite situatii.

Coloratia Gram se foloseste pentru diferentierea germenilor Gram pozitivi de cei Gram negativi din frotiurile efectuate din diferite tesuturi sau din culturi microbiene. Este o metoda de baza in practica bacteriologica. Ea consta in:

colorare cu solute de violet de Gentiana lo/ 0 timp de 1 minut varsarea colorantului de pe lama tratarea frotiului cu solutie Lugol timp de 2 minute decolarea cu amestec de alcool-acetona pâna cind amestecul ce se scurge de pe lama

nu mai este colorat spalare cu apa de robinet recolorare cu fucsina diluata 1/10 timp de 20—30 secunde spalare cu apa de robinet uscare examinarea la microscop.

Germenii Gram pozitivi vor aparea colorati in albastru-violet iar cei Gram negativi in rosu. Aceasta diferenta de colorare rezulta din faptul ca germenii Gram pozitivi fixeaza violetul de Gentiana in asa fel incit prin tratarea cu solutia de alcool-acetona nu se decoloreaza, in timp ce cei Gram negativi se decoloreaza si apar ca urmare colorari in rosu cu cel de al doi-lea colorant (fucsina diluata). Sporii bacterieni apar sub forma de vacuole.

Coloratia cu albastru de metilen (Loffler) - se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor intr-un material patologic, fara a-i diferentia sub raportul afinitatii lor tinctoriale.

In acest scop se acopera frotiul fixat cu o solutie de albastru de metilen 3% şi, dupa 2—5 minute, se spala cu apa, se usuca, se examineaza. Germenii vor aparea colorati in albastru, uniform. Metoda permite si observarea unor particularitati morfologice cum ar fi prezenta capsulei si sporului. Capsula se coloreaza in roz-pal, iar sporul apare sub forma unei vacuole.

13

Page 14: Microbiologie Alimentara

Coloraţia Ziehl—Neelsen - se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor acidorezistenti, care nu se coloreaza prin metodele obisnuite (mai ales micobacteriile): acoperirea frotiului, in prealabil fixat la flacara, cu soluţie de fucsina Ziehl incalzirea la flacara pâna la aparitia vaporilor si mentinerea prin incalziri repetate timp de 5—10 minute (se va avea grija ca soluţia coloranta sa nu fiarba si sa se completeze in caz că s-a evaporat de pe anumite portiuni de frotiu) varsarea colorantului decolorarea cu o solutie de acid sulfuric 1/4 sau acetic 1/3, timp de cca 2 minute spalare cu apa tratare cu alcool absolut timp de 5 minute spalare cu apa recolorare cu solutie de albastru de metilen 1% timp de 2—3minute spalare cu apa uscare si examinare cu imersie.

La examenul frotiurilor, germenii se pot prezenta coloraţi in roşu (acidorezistenti) sau in albastru (neacidorezistenti). Primii fixeaza fucsina Ziehl si nu se decoloreaza sub acţiunea acidului, in timp ce ceilalţi se decoloreaza sub influenza tratarii cu acid. Acidorezistenta rezida in structura chimica particulara a peretelui celular al germenilor, in sensul ca in cazul acidorezistenţilor acesta fiind bogat in substanţe lipoide impiedica patrunderea acidului decolorant ca dealtfel si a coloranţilor (fucsina patrunde datorita concentraţiei ridicate si a caldurii). Pentru acest motiv, germenii acidorezistenti nu sunt colorabili prin metode obisnuite.

Alte metode de colorare: Coloratia Koster - se foloseste pentru colorarea brucelelor Metoda Koslovski - se foloseste pentru colorarea brucelelor; Metoda Tribondeau—Fontana - se foloseste pentru colorarea leptospirelor Pentru colorarea capsulei bacteriene: coloraţia Giemsa, metoda de colorare negativa a capsulei cu tus de China, etc.; Pentru colorarea sporilor: Metoda Moller, Metoda Pooman, Metoda cu verde de malahit Pentru colorarea cililor - Metoda Casares—Gill

Determinarea bacteriilor din genul SalmonellaMetoda stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene din genul Salmonella în

produsele cercetate, acestea fiind un pericol pentru sănătatea consumatorului în cazul consumului de alimente contaminate.

Metoda se aplică următoarelor produse:- Lapte crud- Lapte praf- Produse lactate praf pentru copii- Produse lactate acide (iaurt, smântână fermentată, lapte bătut, kefir, sana)- Iaurt cu fructe- Smântână dulce pentru frişcă şi frişcă bătută

14

Page 15: Microbiologie Alimentara

- Brânzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (caş, telemea proaspătă)- Brânzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (caş, telemea proaspătă)- Brânză proaspătă din zer- Brânză maturată în saramură din lapte pasteurizat- Brânză maturată în saramură din lapte nepasteurizat- Brânză fermentată cu pastă tare (svaiţer), semitare (moeciu), moale (Camembert, taga, nasal)- Brânzeturi cu pastă filată (caşcavaluri), afumate şi neafumate- Brânzeturi fermentate- Unt- Margarină de consum- Margarină cu lapte- Îngheţată, torturi de îngheţată- Praf de îngheţată- Lapte concentrat cu zahăr- creme vegetală (înlocuitori de frişcă)- Carne tocată şi semipreparate din carne tocată (hamburger, pastă de mititei, cârnaţi proaspeţi etc.)- Preparate din carne sărate şi/sau afumate- Mezeluri (prospături, salamuri semiafumate)- Mâncăruri gătite congelate şi mâncăruri gătite, servite calde- Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregătite, care se consumă reci, fără altă prelucrare (piftii, pateuri din carne şi organe, biftec)- Produse crude (şniţel, caşcavaş pane)- Peşte proaspăt, decapitat şi eviscerat- Produse semiconservate (marinate reci, marinate calde nepasteurizate, marinate calde pasteurizate, produse din icre şi din lapţi)- Icre sărate- Salată de icre cu adaos de ulei- Peşte sărat- Peşte sărat cu ceapă- Peşte afumat la cald, peşte afumat la rece- Preparate culinare din peşte- Ouă umplute, salate cu maioneză- Gelatină alimentară- Prăjituri cu cremă- Torturi cu diferite creme, frişcă, fructe- Maioneză- Pulberi de maioneză (înlocuitori de maioneză)- Vegetale congelate- Vegetale deshidratate- Prafuri de budinci şi creme deshidratate, înlocuitori de frişcă- Paste făinoase (macaroane, fidea)- Paste făinoase cu umplutură (ciuperci, carne brânză)- Condimente şi amestecuri

15

Page 16: Microbiologie Alimentara

- Băuturi răcoritoare şi sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile- Pulberi pentru sucuri- Ape minerale şi carbogazoase, ghiaţă artificială- Bere nepasteurizată, filtrată şi nefiltrată- Bere pasteurizată- Făinuri alimentare altele decât făinuri pentru panificaţie (făină de orez, orezin, fosfarin)- Produse de panificaţie cu umpluturi- Derivate din cereale tratate termic (fulgi de porumb, orez, produse expandate)- Biscuiţi uscaţi şi biscuiţi glazuraţi- Biscuiţi, pateuri- Fursecuri, napolitane cu diferite creme- Cacao, pudră, ciocolată tablete, ciocolată cu adaos, bomboane fine şi extrafine de ciocolată- Ciocolată umplută cu cremă- Specialităţi din ciocolată umplute cu cremă grasă sau de tip fondant- Bomboane altele decât ciocolată- Jeleuri, rahat, gemuri, şerbeturi, dulceţuri, fructe confiate- Arome alimentare naturale sau sintetice- Emulsie pentru băuturi răcoritoare- Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne)- Oţet alimentar- Ceai (plantă)- Borş- Cafea crudă prăjită şi instant- Melanj din ouă praf- Produse din grâu germinat- Fructe de mare refrigerate- Pepsină (pulbere în maestec cu sare)- sandviciuri, mâncăruri tip fast-food.

Documente de referinţă:- ISO 17025/2001- SR EN 12824/2001- ISO 6887/96- ISO 7218

Principiul metodei:

Germenii din genul Salmonella pot fi prezenţi în număr mic şi sunt deseori însoţiţi de un număr mult mai mare de alte microorganisme din familia Enterobacteriaceae sau din alte familii. În consecinţă este necesară îmbogăţirea selectivă în plus deseori este necesară preîmbogăţirea pentru a evidenţia acei germeni Salmonella care au fost supuşi alterării.

Aparatură şi sticlărie folosită- Termostat 35oC; 37o +

-0,5oC; 42oC – aparat electric pentru dezvoltarea microbiană

16

Page 17: Microbiologie Alimentara

- Etuvă 160 – 180oC - asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă, porţelan, hârtie, vată, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute- Autoclav - realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute- Lampă U.V. - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru- Balanţă analitică - balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura camerei- Sterilizator electric pentru instrumente- Stomacher 1000 ml, pungi de material plastic pentru stomacher, turmix tip Atomix de înaltă turaţie (15-20.000 7/min), cu cupe sterilizabile- Baie de apă reglabilă la temperatură 35oC sau 37oC, 45oC, 55oC şi 70oC- Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm- Pipete gradate sterile de 1 ml+

- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml

- Aparat pentru sterilizare uscată sau umedă ISO 7218- Etuvă ventilată prin convecţie reglabilă la 37oC şi la 55oC- pH metru cu compensare de temperatură cu exactitate 0,1 unităţi de pH la 25o C- Anse bacteriologice cu bucla cu diam de 3 mm din platină-iridiu sau nichel-crom- Eprubete de 16 x 160 mm sterile- Flacoane pentru medii de cultură- Eprubete cu diam de 8/160 mm- Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml- Mojar cu pistil, sterile- Eprubete gradate- Baloane erlenmayer cu capacitatea de 90, 150 şi 250 ml

Eşantionarea - este important ca laboratorul să primească un eşantion cu adevărat reprezentativ, nealterat sau modificat în timpul transportului sau depozitării în corelaţie cu standardul internaţional specific al produsului.Reguli de procedură

- Modul de analiză, acceptare şi înregistrare a comenzilor – eşantioanele trebuie să fie etichetateşi iar procesul verbal de prelevare probe să conţină următoarele date:produsul recoltat, examenul cerut, locul prelevării, ziua şi data prelevării, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevării, cine a prelevat proba.- Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlării) să fie steril. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180 oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute.- Pregătirea eşantionului pentru analiză. Eşantionul se pregăteşte conform standardului internaţional specific al produsului respective: lapte materie primă şi produse lactate – se cântăresc 25 g eşantion într-un balon Erlenmayer steril peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire (APT), lapte praf, zer dulce şi lactoză – se cântăresc 25 g eşantion într-un balon erlenmayer steril peste care se adaugă 225 g mediu de preîmbogăţire, brânza şi brânza topită – se cântăresc 25 g probă într-un mojar steril, se mojarează, se transferă într-un balon steril, peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire, untul – se cântăresc 25 g eşantion într-un balon erlenmayer steril, se încălzeşte într-o baie de apă la 45 oC peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire. Alimentul cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi

17

Page 18: Microbiologie Alimentara

mici înainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc în mojar 25 g. Se mojarează, se transferă într-un balon erlenmayer steril peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire (ATP)

Acţiuni şi/sau măsuri preventiveProtecţia personalului

- Obligatorie purtarea halatului- Folosirea lampei de U.V. (înainte şi după însămânţare)- Folosirea hotei de însămânţare- Pipetele sunt prevăzute cu dop de vată nehidrofilă pentru a preveni aspirarea accidentală a eşantionului- Flambarea ansei se face întâi la baza flăcării şi apoi la vârf pentru a împiedica râspăndirea germenilor- Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante

Protecţia mijloacelor de încercare şi/sau măsurare- Sticlăria sterilă se păstrează în dulapuri speciale- Sticlăria sterilă se foloseşte maxim 6 zile- Executarea periodică a serviciilor de întreţinere şi curăţire zilnică a aparaturii- Verificarea şi înregistrarea temperaturii din încăperea de lucru

Modul de lucru Pregătirea eşantionului pentru analiză - se efectuează conform standardului internaţional

pentru produsul de analizat. Însămânţare şi incubare

1. Faza de preîmbogăţire neselectivă. Se cântăresc 25 g produs într-un balon erlenmayer steril peste care se adugă 225 ml mediu APT .

Se incubează la temperatura de 35o 37oC timp de 16-20 h. 2. Faza de îmbogăţire selectivăDin cultura obţinută conform 10.3.1. se trec 0,1 ml în 10 ml mediu RV şi 10 ml într-un flacon ce

conţine 100 ml mediu SC. Se incubează cele două medii însămânţate după cum urmează:.a) mediul RV însămânţat la temperatura de 42oC timp de 24 hb) mediul SC însămânţat la temperatura de 35o 37oC (conform acordului)timp de 48 h

3. Izolare şi identificare. Din cultura obţinută în mediu RV după 24 h de incubare cu o ansă bacteriologică se însămânţează

suprafaţa primului mediu de însămânţare selectivă (ARFVB) în cutii Petri sterile. Se procedează la fel cu cel de-al doilea mediu de izolare selectivă (AMC) folosindu-se o altă prelevare cu ansa bacteriologică şi cutii Petri sterile de dimensiuni adecvate.Se incubează cele două medii selective însămânţate la temperatur de 35o 37oC timp de 24 h.

Din cultura obţinută în mediu SC, după 48 h incubare se repetă operaţiunile descrise mai sus.După 24 h incubare în ambele situaţii se examinează cutiile pentru a cerceta prezenţa coloniilor caracteristic de Salmonella.

InterpretareColoniile caracteristice de Salmonella dezvoltate pe mediu ARFVB provoacă virarea culorii

mediului de la roz la roşu. Dacă dezvoltarea este slabă sau nu se evidenţiază coloniile caracteristice de

18

Page 19: Microbiologie Alimentara

Salmonella cutiile Petri însămânţate se incubează în continuare la temperatura de 35o 37oC (conform acordului) timp de 18-24 h.Se reexaminează cutiile Petri pentru a cerceta prezenţa coloniilor caracteristice de Salmonella.

Test de confirmare

Pentru confirmare, din fiecare cutie Petri din fiecare din cele două medii selective se recoltează câte 5 colonii considerate caracteristice sau suspecte. Dacă se găseşte o cutie cu mai puţin de 5 colonii caracteristice sau suspecte, se reţin toate coloniile caracteristice sau suspecte.Se striază coloniile selecţionate pe suprafaţa agarului nutritiv din cutii Petri în prealabil uscate astfel încât să se obţină o dezvoltare de colonii bine izolate. Se incubează cutiile astfel însămânţate la temperatura de 35o 37oC, timp de 18-24 h. Pentru conformările biochimice şi serologice se utilizează culturi pure.

Confirmări biochimiceCu ajutorul ansei efilate se însămânţează mediile indicate de la până la cu fiecare din culturile

obţinute din coloniile reţinute1. Agar TSI Se însămânţează coloana agarului TSI prin striere, iar panta prin trasare. Se

incubează la temperatura de 35o 37oC timp de 24 h. Se interpretează modificările care se produc în mediu în modul următor:

Baza mediului – galbenă – glucoză pozitiv (fermentarea glucozei)- roşie sau nemodificată – glucoză negativ (lipsa fermentării glucozei)- neagră – formare de hidrogen sulfurat- bule de gaz sau fisuri-formare de gaz din glucoză

Panta mediului – galbenă – lactoză şi/sau zaharoză pozitiv- roşie sau nemodificată lactoză şi zaharoză negativ (neutilizarea lactozei şi a

zaharozeiCulturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roşie) cu formare de gaz şi a unei

baze acide (galbenă) cu formarea (90% din cazuri) hidrogenului sulfurat (înnegrirea agarului. Atunci când se izolează o Salmonella lactoză pozitiv panta agarului TSI este galbenă, În consecinţă o confirmare preliminară a culturilor de Salmonella nu trebuie să se bazeze doar pe rezultatele obţinute pe agarul TSI.

2. Agar cu uree. Se însămânţează panta agarului în striuri. Se incubează la 35o sau 37oC (conform acordului) timp

de 24 h şi se examinează din când în când. În cazul reacţiei pozitive descompunerea ureei produce degajarea amoniacului, făcând să vireze roşu de fenol la roz apoi la roşu închis Reacţia este deseori vizibilă după 2 până la 4 h.

3. Mediu pentru decarboxilarea L-lizineiSe însămânţează mediul lichid sub suprafaţă. Se incubează la 35o sau 37oC timp de 24 h. O

culoare violet apărută după incubare indică o reacţie pozitivă. O culoare galbenă indică o reacţie negativă.

4. Evidenţierea betagalactozidazeiSe dispersează o ansă din colonia suspectă într-o eprubetă ce conţine 0,25 ml soluţie salină, se

adaugă o picătură de toluen şi se agită eprubeta. Se introduce eprubeta în baie de apă reglată la 35 o sau 37oC (conform acordului) şi se lasă să stea câteva minute. Se adaugă 0,25 ml Reactiv pentru evidenţierea betagalactozidazei şi se amestecă. Se reintroduc eprubetele în baia de apă la 35 o sau 37oC (conform

19

Page 20: Microbiologie Alimentara

acordului) şi se lasă 24 examinându-le din timp în timp. O culoare galbenă indică o reacţie pozitivă, deseori reacţia este vizibilă în 20 minute. În cazul folosirii discurilor de hârtie gata preparate se respectă instrucţiunile fabricantului.

5. Mediu pentru reacţia VPSe dispersează o ansă din colonia suspectă într-o eprubetă conţinând 0,2 ml VP, se incubează la

35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. După incubare se adaugă 2 picături din soluţia de creatină, 3 picături din soluţia alcoolică de l-naftol şi apoi 2 picături din soluţia de hidroxid de potasiu agitând după adăugarea fiecărui reactiv. Formarea unei coloraţii roz până la roşu aprins într-un interval de 15 minute indică o reacţie pozitivă

6. Mediu pentru evidenţierea indolului Se însămânţează o eprubetă ce conţine 5 ml mediu triptonă-triptofan cu colonia suspectă Se incubează la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. După incubare se adaugă 1 ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel roşu indică o reacţie pozitivă. Formarea unui inel galben brun indică o reacţie negativă.

Tabelul 1

Test1) Reacţie pozitivă sau negativă

Procentajul însămânţărilor de Salmonella care prezintă reacţia2)

Glucoză,TSI (formare de acid)Glucoză, TSI (formare de gaz)Lactoză, TSI Zaharoză, TSIHidrigen Sulfurat, TSIDescompunerea ureeiDecarboxilarea lizineiEvidenţierea betagalactozidazeiReacţia Voges ProstkauerEvidenţierea Indolului

pozitiv +pozitiv +negativ –negativ –pozitiv +negativ –pozitiv +negativ –negativ –negativ -

10099,93)

99,24)

99,591,699,094,65)

98,54)

10098,9

2) – Aceste procentaje indică doar faptul că toate speciile de Salmonella nu dau reacţii pozitive sau negative. Acest procentaj poate varia de la o ţară la alta şi de la un produs la altul3) – Salmonella typhi este anaerogenă (nu produce gaze în anaerobioză)4) – Germeni Salmonella din subgenul 3(arizona) dau reacţie lactoză pozitiv sau negativ, dar sunt betagalactozidază pozitiv. Germenii Salmonella din subgenul 2 dau reacţie lactoză negativ, dar dau reacţia betagalactozidază pozitiv. Pentru studiul speciilor poate fi utilă efectuarea unor teste biochimice suplimentare.5) – Salmonella paratyphi A este negativ

Confirmare serologică

Cercetarea prezenţei antigenelor O Vi sau H de Salmonella se efectuează prin aglutinare pe lamă cu seruri adecvate din colonii pure şi după eliminarea tulpinilor autoaglutinabile.

20

Page 21: Microbiologie Alimentara

Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Se depune pe o lamă de sticlă curată o picătură de soluţie salină, se dispersează în această picătură o fracţiune din colonia de testat aşa fel încât să se obţină o suspensie omogenă şi tulbure prin mişcarea lamei timp de 30-60 secunde. Dacă bacteriile se adună în grămezi, tulpina este considerată autoaglutinabilă şi nu mai trebuie supusă examinărilor ulterioare. Examinarea se face cu ajutorul unei lupe pe fond negru

Evidenţierea antigenelor O. Dintr-o colonie pură cunoscută ca neaglutinabilă se procedează ca mai sus, dar în locul soluţiei saline se foloseşte o picătură de antiser O. Dacă se produce aglutinarea reacţia este considerată pozitivă. Se utilizează serurile poli şi monovalente unul după altul.

Evidenţierea antigenelor Vi. Se procedează ca mai sus utilizând o picătură de antiser Vi. Dacă se produce aglutinarea reacţia este pozitivă.

Evidenţierea antigenelor H. Se însămânţează un agar nutritiv semisolid cu o colinie pură neautoaglutinabilă, se incubează la 35o 37oC timp de 24 h, se utilizează această cultură pentru examenul antigenelor H procedâmd ca mai sus, dar folosind o picătură antiser H.Dacă se produce aglutinarea reacţia este considerată pozitivă.

Interpretarea reacţiilor biochimice şi serologice

Tabelul prezintă interpretrarea testelor de confirmare pe colonii selecţionate.

Reacţii biochimice Autoaglutinare Reacţii serologice Interpretare

tipice

tipice

tipicelipsa reacţiilor tipice

lipsa reacţiilor tipice

nu

nu

danu

nu

antigene O, Vi sau H pozitive

toate reacţiile negative

neefectuateantigene O,Vi sau H

pozitivetoate reacţiile

negative

tulpini considerate ca fiind Salmonella

ar putea fi Salmonella

nu sunt considerate ca fiind Salmonella

Confirmare definitivă

Tulpinile considerate ca fiind Salmonella sau că ar putea fi Salmonella (a se vedea tabelul 2) se trimit la Institurul de Igienă şi Sănătate Publică Veterinară pentru identificarea germenilor din genul Salmonella, pentru determinarea definitivă a serotipului. Această expediere trebuie însoţită de toate informaţiile disponibile referitoare la tulpină (tulpini).

Exprimarea rezultatelorÎn funcţie de rezultatele interpretării se indică prezenţa sau absenţa germenilor din genul

Salmonella în x grame de probă de analizat.

LIMITELE DE ÎNCREDRE PENTRU ESTIMĂRI DE NUMERE MICI

21

Page 22: Microbiologie Alimentara

Număr de microorganisme Limite de încredere la nivelul de 95%

Inferioară Superioară1 <1 2

2 <1 4

3 <1 5

4 1 6

5 2 9

6 2 10

7 2 12

8 3 13

9 4 14

10 4 16

11 5 18

12 6 19

13 7 20

14 7 21

15 8 23

Diagrama modului de lucru

22

Apa peptonata – tamponata la temperature camerei

Incubare (9,2) timp de 18 h +/- 2 h la 370 C +/- 10 C

0,1 ml cultura+

10 ml bullion RVSIncubare timp de 24 h +/- 3 h la

41,50 C +/- 10 C

1 ml cultura+

10ml bullion MKTTNnIncubare timp de 24 h +/- 3 h la

370 C

Prei

mbo

gatir

eIm

boga

tire

se

lecti

va

se

Page 23: Microbiologie Alimentara

DETERMINAREANUMĂRULUI TOTALDE GERMENI AEROBI DIN PRODUSELE ALIMENTARE (NTG)

Stabileşte prezenţa sau absenţa de microorganisme aerobe în produsele alimentare cercetate prin metoda numărării coloniilor la temperatura de 30o C. în vederea stopării vinderii produsului, acestea fiind un pericol pentru sănătatea consumatorului în caz de contaminare.

Metoda se aplică următoarelor produse:- Lapte crud- Lapte pentru consum, Lapte UHT- Lapte praf- Produse lactate praf pentru copii- Smântână dulce pentru frişcă şi frişcă bătută- Lapte concentrat cu zahăr- Carne zvântată, refrigerată, congelată şi organe de pasăre- Mâncăruri gătite congelate şi mâncăruri gătite, servite calde- Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregătite, care se consumă reci, fără altă prelucrare

(piftii, pateuri din carne şi organe, biftec)- Peşte proaspăt, decapitat şi eviscerat- Prăjituri cu cremă- Maioneză- Prafuri de budinci şi creme deshidratate, înlocuitori de frişcă- Băuturi răcoritoare şi sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile

23

Mediu XLD si al doilea agar la alegere Incubare timp de 24 h +/- 3 h la 370 C +/- 10 C

De pe fiecare placa se testeaza o colonie caracteristica . Daca rezultatul e negativ se testeaza alte 4 colonii

Agar nutritiveIncubare timp de 24 h +/- 3 h la 370 C +/- 10 C

Confirmare biochimica Confirmare serologica

Exprimare rezultate

Izol

are

Confi

rmar

e

Page 24: Microbiologie Alimentara

- Pulberi pentru sucuri- Făinuri alimentare altele decât făinuri pentru panificaţie (făină de orez, orezin, fosfarin)- Specialităţi din ciocolată umplute cu cremă grasă sau de tip fondant- Specialităţi din ciocolată umplute cu cremă grasă sau de tip fondant- Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne)- Ceai (plantă)- Melanj din ouă praf- Produse din grâu germinat- Fructe de mare refrigerate- sandviciuri, mâncăruri tip fast-food- furaje pentru animale STAS-uri folosite pentru produsele enumerate mai sus sunt următoarele:

- ISO 17025/2001- SR ISO 4833/91 - ISO 707- ISO 8261 (pentru lapte şi produse lactate)- ISO 7218/85- STAS 2356 – 1982 (pentru produse carnate)- SR ISO 6887/96- STAS 11499 – 1981 (pentru produse zaharoase)- SR ISO 8924 – 1995 (pentru recipiente închise)

Principiul metodei -însămânţarea în profunzime a unui mediu solid turnat în două cutii Petri cu o cantitate determinată de eşantion pentru analiză dacă produsul care se examinează este lichid sau cu o cantitate determinată de suspensie mamă în cazul altor produse. În aceleaşi condiţii se face însămânţarea diluţiilor decimale din eşantionul de analizat sau suspensia mamă (iniţială).

Însămânţarea se face prin înglobare în mediul de cultură solid fie a unei cantităţi cunoscute din proba de lucru reprezentată prin gram sau a unei serii de diluţii decimale în cutii Petri prin încorporare după solidificarea mediului.

Incubarea cutiilor Petri se realizează timp de 72 de ore la temperatura de 30oC, în condiţii de aerobioză

Aparatură şi sticlărie Termostat 30o +

-0,5oC – aparat electric pentru dezvoltarea microbiană Etuvă 160 – 180oC - asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă, porţelan, hârtie, vată, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute Autoclav - realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lampă U.V. - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru Balanţă analitică - balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumente Baie de apă reglabilă la 45oC Cutii Petri sterile din sticlă cu diametrul de 90-100 mm

24

Page 25: Microbiologie Alimentara

Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +

- 0,2 ml Pipete cu scurgere totală de 1 ml Baghete de sticlă sterile pH metro cu compensare de temperatură cu exactitate 0,1 unităţi de pH la 25o C Baloane cu capacitatea de 150 mlpână la 500 ml pentru sterilizarea şi păstrarea mediilor de cultură Mojar cu pistil, sterile Material curent în laboratorul de microbilogie Aparat de numărare a coloniilor cu sistem de iluminare

Eşantionarea - trebuie să se efectueze conform standardului internaţional specific al produsului respectivSe prepară atâtea diluţii de lucru încât într-o cutie Petri să se obţină cel mult 300 de colonii.

Pentru a se evita lezarea microorganismelor datorită schimbărilor bruşte de temperatură, soluţia de diluare trebuie să albă aproximativ aceeaşi temperatură cu proba, dacă nu există alte prescripţii.

Reguli de procedură Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlării) să fie steril. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180 oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. Pregătirea materialului de sterilizat: spălarea şi sterilizarea sticlăriei se face respectând următoarele reguli: Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de apă, după care spălarea cu apă distilată; Punerea de dopuri de vată cu tifon, învelirea cu hârtie a gâtului eprubetelor sau baloanelor; Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC Pregătirea eşantionului pentru analiză - Se prepară atâtea diluţii de lucru încât într-o cutie Petri să se obţină cel mult 300 de colonii. Pentru a se evita lezarea microorganismelor datorită schimbărilor bruşte de temperatură, soluţia de diluare trebuie să albă aproximativ aceeaşi temperatură cu proba, dacă nu există alte prescripţii.1. Lapte şi produse lactate – se agită energic eşantionul de analizat pentru a asigura o repartizare uniformă a microorganismelor răsturnând rapid de 25 de ori recipientul cu eşantion. Trebuie evitată formarea spumei iar cea formată trebuie dispersată. Intervalul dintre omogenizarea eşantionului şi prelevarea probei necesare analizei nu trebuie să depăşească 3 minute.2. Lapte praf, zer dulce – se amestecă direct conţinutul recipientului închis, prin agitări şi răsturnări repetate..Se cântăresc 10 g eşantion într-un vas de sticlă şi se răstoarnă praful în sticlă cu soluţia de diluare (90 ml de soluţie adecvată la 45+

-1oC în baie de apă). Se menţin flacoanele în baia de apă timp de 5 minute agitând din când în când. Se obţine astfel o diluţie de 10-1.3. Alimentul cu consistenţă semisolidă se omogenizează ca atare . Alimentul cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi mici după care se mojarează. Din proba de analizat se introduc în mojar 1g/10g + cantitatea egală de nisip steril. Se triturează adăugându-se treptat lichid de diluţie de 9 ori mai mare decât eşantionul.

Modul de lucru Pregătirea eşantionului pentru analiză şi a diluţiei iniţiale

Cu o nouă pipetă sterilă se introduce 1 ml din soluţia iniţială într-o eprubetă care conţine 9 ml de soluţie diluare sterilă. Pipeta se schimbă pentru fiecare diluţie.

25

Page 26: Microbiologie Alimentara

Diluţii decimale următoare - prin operaţia de diluţie în tuburile cu diluţii se vor obţine cantităţile de probă ilustrate în tabel, din care reiese că între două diluţii consecutive, diferenţa de concentraţie este de 10 ori (diluţii decimale):Nr. tub 1 2 3 4

Diluţia 1/10 x) 1/100 1/1000 1/10000

Cantitate (g)sau volum (ml)

0,1 0,01 0,001 0,0001

Sau Sau Sau Sau

Din proba iniţială pe ml diluţie xx)

10-1 10-2 10-3 10-4

x) în cazul produselor solide sau semi-solide această diluţie se află în recipientul omogenizatorului sau în mojar;

xx) în cazul însămânţării a 1 ml produse lichide sau 1 g produse solide sau semi-solide (10 ml diluţie 10-1) această cantitate se notează cu 10-0.

Însămânţare şi incubare1. Se iau două cutii Petri în care se introduce cu o pipetă sterilă câte 1 ml eşantion de analizat dacă produsul este lichid sau câte 1 ml din diluţie iniţială a produselor solide şi semi-solide. Pe fiecare cutie se notează numărul probei, diluţia şi data.Se iau alte două cutii Petri sterile. Cu o nouă pipetă sterilă se introduce în fiecare cutie câte 1 ml din prima diluţie decimală a eşantionului de analizat (10 -1), dacă produsul este lichid sau câte 1 ml din prima diluţie decimală a suspensiei iniţiale (10 -2) în cazul altor produse. Se repetă aceste operaţii cu diluţiile următoare folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare diluţie decimală.2. Se toarnă în fiecare cutie Petri în care s-a depus inoculul cca 15 ml mediu agar nutritiv sau geloză albă la 45+

-1oC. Timpul care se scurge între sfârşitul preparării diluţiei iniţiale (sau a diluţiei 10 -1 în cazul unui produs lichid) şi momentul în care diluţiile vin în contact cu mediul de cultură nu trebuie să depăşească 15 minute. Se amestecă cu grijă inoculul cu mediul de cultură şi se lasă să se solidifice punând cutiile Petri pe o suprafaţă rece şi orizontală.3. După solidificarea completă şi numai în cazul în care se bănuieşte că eşantionul de analizat conţine microorganisme ale căror colonii ar putea invada suprafaţa mediilor, se toarnă pe suprafaţa mediului însămânţat 4 ml geloză albă la 45oC. Se lasă să se solidifice aşa cum s-a descris mai sus. Această operaţie, dacă a fost efectuată trebuie menţionată în buletinul de analiză.4. Se incubează cutiile Petri cu capacul în jos. Nu trebuie puse mai mult de 6 cutii una peste alta. Incubarea se face la 30+

-1oC timp de 72+-2 de ore.

Interpretarea

După expirarea perioadei de incubare specificată la punctul 10.4.4. se procedează la numărarea coloniilor din fiecare cutie Petri care conţine cel mult 300 de colonii.

Calculul

Se reţin cutiile care conţin de la 15 la 300 de colonii la nivelul a două diluţii succesive. Exprimarea rezultatelor

26

Page 27: Microbiologie Alimentara

Pentru numărătoare se utilizează cutiile ce conţin cel mult 300 de colonii şi cel puţin 15 colonii. Numărul de microorganisme pe ml sau gram de produs, N, se calculează, ca medie ponderată cu următoarea formulă:

S CN = ------------------------

(n1 + 0,1 n2) x dunde; S C – suma coloniilor numărate în toate cutiile reţinute

n1 – numărul cutiilor reţinute la prima diluţien2 - numărul cutiilor reţinute la adoua diluţied – factorul de diluţie corespunzător primei diluţii

Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative. Ca rezultat se ia numărul de microorganisme pe ml sau pe gram de eşantion exprimat printr-un număr cuprins între 1,0 şi 9,9 x 10 x

unde x este puterea atribuită lui 10.

Exemplu: O numărătoare de microorganisme obţinute la 30oC a dat următoarele rezultate.

- la prima diluţie reţinută 10-2: 168 şi 215 colonii- la a doua diluţie reţinută 10-3: 14 şi 25 de colonii

S C 168 + 215 + 14+ 25 422N = ----------------------------------= _________________ =________=19.162 (n1 + 0,1 n2 + 0,01 n3) x d [2+(0,1x2)+(0,01x 2)]x10-2 0,022

Se rotunjeşte la două cifre semnificative adică 19.000 sau 1,9 x 10 -4 microorganisme pe ml sau pe gram de produs.

Estimarea numerelor mici - dacă cele două cutii la nivelul eşantionului de analizat (produse lichide) sau al diluţiei iniţiale (alte produse) conţin mai puţin de 15 colonii se face media aritmetică, ,m, a coloniilor numărate în cele două cutii. Rezultatul se dă sub forma:

- număr de microorganisme estimat pe ml NE = m(produse lichide)

- număr de microorganisme estimat pe gram: NE = m x d-1 (alte produse), în care d este factorul de diluţie al diluţiei iniţiale.

Nici o colonie - dacă cele două cutii corespunzătoare eşantionului de analizat (produse lichide) sau diluţiei iniţiale (alte produse) nu conţin nici o colonie rezultatul se dă sub forma: mai mic decât limita minimă admisă, raportându-ne la prevederile legislaţiei în vigoare ( ex. Pentru laptele materie primă Directiva UE nr. 92/46 prevede limita de 100.000 UFC – unităţi formatoare de colonii)

Fidelitate - din considerente de ordin exclusiv statistic, în 95% din cazuri limitele de încredre ale acestei metode variază de la 12% la 37%. În practică se pot costata variaţii şi mai mari mai ales între rezultatele obţinute de microbiologi diferiţi-Limitele de încredere pentru estimările de numere mici de microorganisme sunt indicate în

tabelul A1.

LIMITELE DE ÎNCREDRE PENTRU ESTIMĂRI DE NUMERE MICI

27

Page 28: Microbiologie Alimentara

Număr de microorganisme Limite de încredere la nivelul de 95%Inferioară Superioară

1 <1 22 <1 43 <1 54 1 65 2 96 2 107 2 128 3 139 4 1410 4 1611 5 1812 6 1913 7 2014 7 2115 8 23

DETERMINAREA STAFILOCOCULUI (AUREUS) COAGULAZĂ POZITIV DIN PRODUSELE ALIMENTARE

Metoda stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene stafilococ (aureus) coagulază pozitiv în produsele alimentare cercetate.

Metoda se aplică următoarelor produse:- Lapte crud- Lapte praf- Produse lactate praf pentru copii- Produse lactate acide (iaurt, smântână fermentată, lapte bătut, kefir, sana)- Iaurt cu fructe- Smântână dulce pentru frişcă şi frişcă bătută- Brânzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (caş, telemea proaspătă)- Brânzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (caş, telemea proaspătă)- Brânză proaspătă din zer- Brânză maturată în saramură din lapte pasteurizat- Brânză maturată în saramură din lapte nepasteurizat- Brânză fermentată cu pastă tare (svaiţer), semitare (moeciu), moale (Camembert, taga, nasal)- Brânzeturi cu pastă filată (caşcavaluri), afumate şi neafumate- Brânzeturi fermentate- Unt- Margarină de consum- Margarină cu lapte- Îngheţată, torturi de îngheţată

28

Page 29: Microbiologie Alimentara

- Praf de îngheţată- Lapte concentrat cu zahăr- creme vegetală (înlocuitori de frişcă)- Carne tocată şi semipreparate din carne tocată (hamburger, pastă de mititei, cârnaţi proaspeţi etc.)- Preparate din carne sărate şi/sau afumate- Mezeluri (prospături, salamuri semiafumate)- Mâncăruri gătite congelate şi mâncăruri gătite, servite calde- Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregătite, care se consumă reci, fără altă prelucrare (piftii, pateuri din carne şi organe, biftec)- Produse crude (şniţel, caşcavaş pane)- Peşte proaspăt, decapitat şi eviscerat- Produse semiconservate (marinate reci, marinate calde nepasteurizate, marinate calde pasteurizate, produse din icre şi din lapţi)- Icre sărate- Salată de icre cu adaos de ulei- Peşte sărat- Peşte sărat cu ceapă- Peşte afumat la cald, peşte afumat la rece- Preparate culinare din peşte- Ouă umplute, salate cu maioneză- Gelatină alimentară- Prăjituri cu cremă- Torturi cu diferite creme, frişcă, fructe- Maioneză- Pulberi de maioneză (înlocuitori de maioneză)- Vegetale congelate- Vegetale deshidratate- Prafuri de budinci şi creme deshidratate, înlocuitori de frişcă- Paste făinoase (macaroane, fidea)- Paste făinoase cu umplutură (ciuperci, carne brânză)- Condimente şi amestecuri- Băuturi răcoritoare şi sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile- Pulberi pentru sucuri- Ape minerale şi carbogazoase, ghiaţă artificială- Bere nepasteurizată, filtrată şi nefiltrată- Bere pasteurizată- Făinuri alimentare altele decât făinuri pentru panificaţie (făină de orez, orezin, fosfarin)- Produse de panificaţie cu umpluturi- Derivate din cereale tratate termic (fulgi de porumb, orez, produse expandate)- Biscuiţi uscaţi şi biscuiţi glazuraţi- Biscuiţi, pateuri- Fursecuri, napolitane cu diferite creme- Cacao, pudră, ciocolată tablete, ciocolată cu adaos, bomboane fine şi extrafine de ciocolată

29

Page 30: Microbiologie Alimentara

- Ciocolată umplută cu cremă- Specialităţi din ciocolată umplute cu cremă grasă sau de tip fondant- Bomboane altele decât ciocolată- Jeleuri, rahat, gemuri, şerbeturi, dulceţuri, fructe confiate- Arome alimentare naturale sau sintetice- Emulsie pentru băuturi răcoritoare- Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne)- Oţet alimentar- Ceai (plantă)- Borş- Cafea crudă prăjită şi instant- Melanj din ouă praf- Produse din grâu germinat- Fructe de mare refrigerate- Pepsină (pulbere în maestec cu sare)- sandviciuri, mâncăruri tip fast-food

Documente de referinţă STAS-uri folosite pentru produsele enumerate la punctul anterior sunt următoarele:

- ISO 17025/2001- ISO 5541/1 – 1986 (pentru produse lactate şi derivate)- STAS 6349/4 – 1980 (pentru produse lactate)- ISO 707- ISO 8261 (pentru lapte şi produse lactate)- ISO 4832 – 1992 (pentru produse carnate)- STAS 2356 – 1982 (pentru produse carnate)- SR ISO 6887/96- STAS 11499 – 1981 (pentru produse zaharoase)- SR ISO 8924 – 1995 (pentru recipiente închise)

Principiul metodei Însămânţare în suprafaţa unui mediu selectiv solid, turnat în două serii de plăci Petri cu o cantitate determinată din eşantionul de analizat dacă produsul este lichid sau din suspensia mamă în cazul altor produse. În aceleaşi condiţii se însămânţează şi diluţiile decimale obţinute din eşantionul de analizat sau din suspensia mamă în prealabil însămânţate într-un mediu de îmbogăţire (chapman lichid); Incubarea acestor plăci timp de 24 - 48 de h la 35oC sau 37oC; Calculul numărului de stafilococcus aureus pe ml sau pe gram de eşantion pornind de la numărul de colonii caracteristice şi/sau necaracteristice care se obţin în plăcile alese, la nivelurile de diluţie care dau rezultate semnificative şi care se confirmă prin proba coagulazei.

SOLUŢII DE DILUARE ŞI MEDII DE CULTURĂSoluţii de diluare de utilizare generală

Soluţie salină sterilă

30

Page 31: Microbiologie Alimentara

Soluţii de utilizare specialăbulion hipersalin cu manită şi indicator (chapman lichid)agar hipersalin cu manită şi indicator (chapman solid)plasmă citratată de om sau de iepurebulion de inimă de creier

Repartizarea, sterilizarea şi păstrarea soluţiilor de diluareSe repartizează soluţiile de diluare pentru diluţiile iniţiale în flacoane sau sticle iar pentru diluţiie următoare în eprubete sau sticle. Cantităţile trebuie astfel repartizate, astfel încât după sterilizare fiecare flacon sau sticlă să conţină 90 ml soluţie de diluare sau un multiplu de 9 ml. Eprubetele, flacoanele sau sticlele trebuie închise cu dopuri. Sterilizarea trebuie făcută în autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dacă soluţiile de diluare nu sunt folosite imediat, ele trebuie păstrate la întuneric între 0-5oC maxim o lună pentru evitarea oricărei modificări a volumului sau compoziţiei lor.

Medii de culturăBulion hipersalin cu manită şi indicator (chapman lichid)Agar hipersalin cu manită şi indicator (chapman solid)Plasmă citratată de om sau de iepureBulion de inimă de creier Aparatură şi sticlărie pentru sterilizarea cu căldură uscată sau cu căldură umedă (ISO 7218)

Termostat 35oC; 37o +-0,5oC – aparat electric pentru dezvoltarea microbiană

Etuvă 160 – 180oC - asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă, porţelan, hârtie, vată, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute Autoclav - realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lampă U.V. - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru Balanţă analitică - balanţă electronică cureglare automată funcţie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumente Baie de apă reglabilă sau echipament similar reglabil la 45+

-0,5oC Baie de apă reglabilă sau echipament similar reglabil la 50+

-0,5oC Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+

- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml

Baghete de etalare din sticlă (tip crosă de hochei) cu diametrul de 3,5 ml şi lungimea de 20 cm îndoite în unghi drept la cca 3 cm de una din extremităţi, extremităţile tăiate trebuie să fie rotunjite la cald, sterile. pH metru cu compensare de temperatură cu exactitate 0,1 unităţi de pH la 25o C Eprubete de 18/180 mm şi flacoane pentru cultură cu capacitatea de 125-300 ml pentru sterilizarea şi păstrarea mediilor de cultură Eprubete cu diametrul de 10 ml x 75 ml necesare pentru determinarea coagulazei Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml Mojar cu pistil, steril Perle de sticlă cu diametrul de cca 6 mm

31

Page 32: Microbiologie Alimentara

Flacoane cu capacitatea de 90, 150 şi 250 ml Pipete etalonate special pentru uz bacteriologic cu capacitate nominală de 1 ml cu diviziuni de 0,1 ml şi al căror orificiu de scurgere are un diametru de 2-3 ml Etuvă sau incubator ventilat (ă) (care permite uscarea mediului gelozat turnat în plăci) reglabil(ă) la 50+

-1oC

EŞANTIONARE Eşantionarea se efectuează conform standardului specific al produsului de analizat. Dacă nu există standard specific se recomandă ca părţile interesate să se pună de acord asupra acestui subiect.

Eşantioanele sunt etichetate, cuprinzănd: produsul recoltat, examenul cerut, locul prelevării, ziua şi data prelevării, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevării, cine a prelevat.

Eşantionul se pregăteşte conform standardului internaţional specific al produsului respective: Lapte crud şi produse lactate – se agită energic eşantionul de analizat pentru a asigura o repartizare uniformă a microorganismelor răsturnând rapid de 25 de ori recipientul cu eşantion. Trebuie evitată formarea spumei iar cea formată trebuie dispersată. Intervalul dintre omogenizarea eşantionului şi prelevarea probei necesare analizei nu trebuie să depăşească 3 minute; Lapte praf, zer dulce şi lactoză – se amestecă direct conţinutul recipientului închis, prin agitări şi răsturnări repetate..Se cântăresc 10 g eşantion într-un vas de sticlă şi se răstoarnă praful în sticla cu soluţia de diluare (90 ml de soluţie adecvată la 45+

-1oC în baie de apă). Se menţin flacoanele în baia de apă timp de 5 minute agitând din când în când. Se obţine astfel o diluţie de 10-1; Brânza şi brânza topită – se folosesc 10 g probă într-o capsulă cu o cantitate mică de soluţie de diluare şi se omogenizează cu pistilul. Se adaugă restul de diluare până la întregul volum de 90 ml soluţie de diluare. Se obţine astfel diluţia 10-1; Untul – se pune recipientul cu eşantion într-o baie de apă la 45oC. Se agită pentru a uşura topirea şi se menţine până la topirea completă. Se agită şi cu o pipetă încălzită la cca 45 oC se introduc 10 ml într-un flacon care conţine 90 ml soluţie de diluţie. Se agită de fiecare dată înaintea transferului următor. Se obţine diluţie de 10-1. Pentru obţinerea diluţiilor se poate lucra alternativ numai cu fază apoasă; Alimentele cu consistenţă semisolidă se omogenizează ca atare; Alimentele cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi mici înainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc în mojar 1g/10g + cantitatea egală de nisip steril. Se triturează adăugându-se treptat lichid de diluţie de 9 ori mai mare decât eşantionul.

Acţiuni şi/sau măsuri preventivePentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit

(recipiente, instrumente, sticlării) să fie steril. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute.

Pregătirea materialului de sterilizat:- Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de apă, după care spălarea cu apă distilată;- Punerea de dopuri de vată cu tifon, învelirea cu hârtie a gâtului eprubetelor sau baloanelor;- Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC.

32

Page 33: Microbiologie Alimentara

Protecţia personalului: Obligatorie purtarea halatului, Folosirea lampei de U.V. (înainte şi după însămânţare), Folosirea hotei de însămânţareMetodologia de lucru

Însămânţare şi incubareDin produsul omogenizat şi din fiecare diluţie se însămânţează câte 1 ml în câte o eprubetă cu 10

ml chapman lichid.În cazul celorlalte produse din suspensia mamă se însămânţează câte 10 ml în câte o eprubetă cu 10 ml chapman lichid.

Se incubează eprubetele însămânţate cu mediu de îmbogăţire timp de 24 – 48 h la temperatura de 35o 37oC.

Din fiecare eprubetă în care au apărut semne de dezvoltare microbienă prin virarea culorii mediului de îmbogăţire se fac treceri pe suprafaţa unui mediu selectiv (chapman solid) turnat în plăci Petri sterile prin strierea cu ajutorul unei anse de însămânţare.

Plăcile Petri astfel însămânţate se incubează la 35o 37oC timp de 24 – 48 h. Interpretarea

Se controlează plăcile Petri însămânţate şi din cele unde s-au dezvoltat colonii caracteristice şi/sau necaracteristice, se reţin plăcile care conţin între 15 şi 150 colonii caracteristice şi/sau necaracteristice. Din fiecare placă Petri se aleg pentru confirmare câte 5 colonii caracteristice şi/sau necaracteristice după caz.

Test de confirmare (proba coagulazei)Cu ajutorul unei anse bacteriologice sterile se prelevează o parte din fiecare colonie selecţionată

şi se însămânţează într-o eprubetă cu bulion de inimă creier. Se incubează la 35o sau 37oC timp de 20 – 24 h. Se adaugă în mod steril câte 0,1 ml din fiecare cultură la câte 0,3 ml plasmă de iepure în eprubete sterile cu diametru de 10 x 75 ml şi se incubează la 35o sau 37oC. Se examinează coagularea plasmei după 4 – 6 h.

Se consideră că reacţia coagulazei este pozitivă când coagulul ocupă mai mult de trei pătrimi din volumul ocupat iniţial de lichid.

Pentru control se adaugă 0,1 ml bulion de inimă creier steril la cantitatea recomandată de plasmă de iepure (0,3ml) şi se incubează fără însămânţare.

Pentru ca reacţia să fie valabilă plasma din eprubeta martor nu trebuie să prezinte semne de coagulare.

CalcululDacă cel puţin 80% din coloniile selecţionate sunt coagulază pozitiv se ia ca număr de

stafilococcus (aureus) numărul prezumtiv dat de numărătoarea făcută conform punctului 10.5.În toate celelalte cazuri numărul se calculează pornind de la numărul de stafilococcus aureus

prezumtiv (punctul 10.5.) care sunt coagulază pozitiv (punctul 10.6.).Cutiile care conţin între 15 şi 150 colonii caracteristice şi/sau necaracteristice pentru două diluţii

consecutive numărul de stafilococcus aureus pentru fiecare diluţie se calculează aşa cum se indică la punctul 10.7.1. şi 10.7.2. şi se face media aritmetică a celor două valori obţinute exceptănd cazul când raportul dintre valoarea cea mai mare şi valoarea cea mai mică este peste 2; în acest caz se reţine ca rezultat valoarea cea mai mică.

EXPRIMAREA REZULTATELOR

33

Page 34: Microbiologie Alimentara

Cu rezultatele obţinute în cele două serii de cutii sau cu cele două diluţii consecutive se calculează numărul mediu de stafilococcus aureus.Se adună mediile de stafilococcus aureus obţinute din coloniile caracteristice şi/sau necaracteristice, luând în considerare pentru fiecare factorul de diluţie.

Nu se reţin decât două cifre semnificative procedând după cum urmează:- dacă numărul este mai mic de 100 se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu de 5- dacă numărul este mai mare de 100 şi se termină cu 5, se rotunjeşte la cel mai apropiat

multiplu de 20- dacă numărul este mai mare de 100 şi nu se termină cu 5, se rotunjeşte la cel mai

apropiat multiplu 10Pentru a se obţine numărul de stafilococcus aureus pe gram de produs după caz se multiplică

această valoare cu inversul volumului inoculului şi apoi cu inversul ratei de diluţie a eşantionului de analizat

Rezultatul se exprimă printr-un număr cuprins între 1,0 şi 9,9 multiplicat cu 10n, unde n este puterea corespunzătoare.

Pentru estimarea numerelor mici se face o medie din numărul coloniilor confirmate caracteristice şi necaracteristice şi se rotunjeşte la numărul întreg următor cel mai apropiat.

Dacă pentru cutiile însămânţate cu eşantion de analizat ( produs lichid) sau suspensie mamă (alte produse) numărul mediu al coloniilor confirmate calculat conform punctului 11.1. este mai mic de 15 rezultatul se dă sub forma

a) pentru prdusele lichide- mai puţin de 15 x ne Stafilococcus aureus pe ml, unde ne este inversul volumului de

inocul:

ne = ______1_______ : Volum de inocul

b) pentru celelalte produse:- mai puţin de 15 x Ne Stafilococcus aureus pe gram unde

Ne= _____1_______ x ____________1___________ Volum de inocul diluţia eşantionului de analizat

c) pentru estimarea numerelor mici în produsele lichide:m x ne Stafilococcus aureus pe ml unde m este numărul de colonii confirmate

d) pentru estimarea numerelor mici în celelalte produse:m x Ne Stafilococcus aureus pe gram unde m este numărul mediu de colonii comfirmate.

34

Page 35: Microbiologie Alimentara

DETERMINAREA LISTERIEI MONOCYTOGENES DIN PRODUSELE ALIMENTARE

Metoda stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene cu L. monocytogenes în produsele alimentare.Metoda se aplică următoarelor produse:

- Lapte pentru consum- Lapte praf- Produse lactate praf pentru copii- Smântână dulce pentru frişcă şi frişcă bătută- Brânzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (caş, telemea proaspătă)- Brânzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (caş, telemea proaspătă)- Brânză proaspătă din zer- Brânză maturată în saramură din lapte pasteurizat- Brânză maturată în saramură din lapte nepasteurizat- Brânză fermentată cu pastă tare (svaiţer), semitare (moeciu), moale (Camembert, taga, nasal)- Brânzeturi cu pastă filată (caşcavaluri), afumate şi neafumate- Brânzeturi fermentate- Margarină cu lapte- Lapte concentrat cu zahăr- creme vegetală (înlocuitori de frişcă)- Carne tocată şi semipreparate din carne tocată (hamburger, pastă de mititei, cârnaţi proaspeţi etc.)- Preparate din carne sărate şi/sau afumate- Mezeluri (prospături, salamuri semiafumate)- Mâncăruri gătite congelate şi mâncăruri gătite, servite calde- Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregătite, care se consumă reci, fără altă prelucrare (piftii, pateuri din carne şi organe, biftec)- Produse crude (şniţel, caşcavaş pane)- Prăjituri cu cremă- Torturi cu diferite creme, frişcă, fructe- Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne)- Fructe de mare refrigerate- Pepsină (pulbere în maestec cu sare)- sandviciuri, mâncăruri tip fast-food

Listeria moncytogenes– este bacterie gram pozitivă cu formă de bastonaş scurt nesporogenă cu mobilitate prin rostogolire la 25oC betahemolitică şi care dă testul camp pozitiv pentru S. aureus pe agarul cu sânge de oaie, catalază pozitiv, oxidază pozitiv,ER/VP pozitivă, bilă-esculină pozitivă, fermentează glocuza şi rahnoza, nu fermentează xiloza şi manita, nu reduce nitratul..

Documente de referinţă STAS-uri folosite pentru produsele enumerate la punctul anterior sunt următoarele:

- ISO17025/2001- ISO 5541/1 – 1986 (pentru produse lactate şi derivate)

35

Page 36: Microbiologie Alimentara

- STAS 6349/4 – 1980 (pentru produse lactate)- ISO 707- ISO 8261 (pentru lapte şi produse lactate)- ISO 4832 – 1992 (pentru produse carnate)- STAS 2356 – 1982 (pentru produse carnate)- SR ISO 6887/96- STAS 11499 – 1981 (pentru produse zaharoase)- SR ISO 8924 – 1995 (pentru recipiente închise)-

Principiul metodeiÎnsămânţarea unei cantităţi de eşantion determinată – 25 ml (produs) – 25 g (alte produse)

Identificarea L.monocytogenes necesită patru faze succesive de lucru. Izolarea L. monocytogenes din produsele alimentare este destul de dificilă din cauza microorganismelor competitive prezente în număr mare. Faza de preîmbogăţire selectivă - Însămânţarea unei cantităţi din eşantion pe un mediu lichid de preîmbogăţire şi incubarea acestuia la temperatura de 35oC timp de 48 h.(mediu demifraser). Faza de izolare selectivă - Din mediu de preîmbogăţire se striază pe două medii solide selective (agar Oxford şi agar Palcam, turnat în plăci Petri sterile) se incubează la 35oC timp de 24 – 48 h. Faza de îmbogăţire selectivă - Din cultura cu mediu demifraser se inoculează 0,1 ml în 10 ml mediu lichid fraser. Tuburile inoculate se incubează la 35oC timp de 48 h. Faza de izolare selectivă - Din cultura pe mediu fraser cu ansa bacteriologică se însămânţează pe două medii de izolare selectivă (agar Oxford şi agar Palcam) turnate în plăci Petri sterile, se incubează la 35oC timp de 24 - 48 h.

Soluţii de utilizare specială şi medii de cultură folosite Soluţii de utilizare specialăagar moaleperoxid de hidrogen 3%sol. 1% dihidroclorură de tetrametilenparafenilendiamină – benzi livrate de Cantacuzinomediu cu glucoză, manită, xiloză şi rhamnozămediu Klarc – MR/VPmediu cu bilă esculinăreactiv Griessmediu pentru testul camp Medii de culturăBulion demifraser (mediu de bază + supliment)Bulion fraser (mediu de bază + supliment)Agar oxford. (mediu de bază + supliment)Agar palcam (mediu de bază + supliment)

Sterilizarea mediilor de cultură trebuie făcută în autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dacă mediile de cultură nu sunt folosite imediat, ele

36

Page 37: Microbiologie Alimentara

trebuie păstrate la întuneric între 0-5oC maxim 7 zile pentru evitarea oricărei modificări a volumului sau compoziţiei lor.

Echipamente de încercare şi mijloace de măsurare utilizate Termostat 35o +

-0,5oC (LP 116 / 3622) – aparat electric pentru dezvoltarea microbiană Etuvă 160 – 180oC (SP 125G 0220/90 /3620) asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de

sticlă, porţelan, hârtie, vată, instrumente metalic la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute Autoclav (17148 / 3802) - realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru:

medii de cultură, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute

Lampă - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru

Balanţă analitică - balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumentar Baie de apă reglabilă la temperatură mai mare de 100oC sau reglabilă la 45oC Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+

- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml

pH metru - cu compensare de temperatură cu exactitate 0,1 unităţi de pH la 25o C Flacoane cu capacitatea de 250 ml pentru sterilizarea şi păstrarea mediilor de cultură Eprubete de 16 x 160 mm sterile Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml Mojar cu pistil, sterile

Pentru a obţine o cultură pură de germeni de L. monocytogenes este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlării) să fie steril. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute.

Pregătirea materialului de sterilizat:spălarea şi sterilizarea sticlăriei - Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de apă, după care spălarea cu apă distilată- Punerea de dopuri de vată cu tifon, învelirea cu hârtie a gâtului eprubetelor sau baloanelor- Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC

Eşantionare - eşantioanele sunt etichetate, cuprinzând: produsul recoltat, examenul cerut; locul prelevării; ziua şi data prelevării; data de valabilitate; sigiliul; martorii prelevării; cine a prelevat.

Lapte şi produse lactate – se agită energic eşantionul de analizat pentru a asigura o repartizare uniformă a microorganismelor răsturnând rapid de 25 de ori recipientul cu eşantion. Trebuie evitată formarea spumei iar cea formată trebuie dispersată. Intervalul dintre omogenizarea eşantionului şi prelevarea probei necesare analizei nu trebuie să depăşească 3 minute. Lapte praf, zer dulce – se amestecă direct conţinutul recipientului închis, prin agitări şi răsturnări repetate. Se cântăresc 25 g eşantion într-un vas de sticlă şi se răstoarnă praful în flaconul cu mediu de preîmbogăţire Se menţin flacoanele în baia de apă timp de 5 minute agitând din când în când. Brânza şi brânza topită – se folosesc 25 g probă într-un mojar cu pistil steril. Se transferă proba într-un flacon steril peste care se adaugă mediu de preîmbogăţire lichid Omogenizare prin mojarare

37

Page 38: Microbiologie Alimentara

Alimentul cu consistenţă semisolidă se omogenizează ca atare.Alimentul cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi mici înainte de mojarare. Din proba de

analizat se introduc în mojar 25g/10g + cantitatea egală de nisip steril. Se triturează, se transferă într-un flacon steril peste care se adaugă mediu de preîmbogăţire.

Acţiuni şi/sau măsuri preventive Protecţia personalului- Obligatorie purtarea halatului- Folosirea lampei de U.V. (înainte şi după însămânţare)- Folosirea hotei de însămânţare- Pipetele sunt prevăzute cu dop de vată nehidrofilă pentru a preveni aspirarea accidentală a eşantionului- Flambarea ansei se face întâi la baza flăcării şi apoi la vârf pentru a împiedica râspăndirea germenilor- Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante Protecţia mijloacelor de încercare şi/sau măsurare- Sticlăria sterilă se păstrează în dulapuri speciale- Sticlăria sterilă se foloseşte maxim 6 zile- Executarea periodică a serviciilor de întreţinere şi curăţire zilnică a aparaturii- Verificarea şi înregistrarea temperaturii din încăperea de lucru Verificarea stării de funcţionare şi confirmarea metrologică a mijloacelor de măsurare- Verificarea de două ori pe zi a temperaturii termostatelor- Teste privind efectuarea corectă a sterilizării:fizico-chimicemicrobiologice (stearotest şi test Subtilis)- Controlul indirect al sterilizării – controlul sterilităţii materialelor de laborator- Termostatarea 24-48 ore a mediilor de cultură gata pregătite- Tulpinile de referinţă pentru medii de cultură din ziua respectivă

Modul de lucru Pregătirea eşantionului pentru analiză

.Cu instrumente sterile, se recoltează 25 ml din eşantion în cazul produselor lichide şi 25 g din eşantionele semisolide şi solide în mojare cu pistil sterile, se triturează, după care se introduc în flacoane sterile

Însămânţare şi incubare.

1. Cu instrumente sterile, se recoltează 25 ml într-un flacon steril peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire în cazul eşantionului lichid şi 25 g din eşantioanele semisolide şi solide în mojare cu pistil sterile, se triturează, după care se introduc în flacoane sterile peste care se adaugă 225 ml nediu de preîmbogăţire (demifraser).Se termostatează la 35oC timp de 24 h.2. Din cultura obţinută la punctul 10.4.1. se striază cu o ansă bacteriologică sterilă, pe medii selective agar Oxford şi Palcam turnate în cutii Petri sterile. Se incubează timp 48 h la temperatura de 35oC.3. Din cultura obţinută la punctul 10.4.1. se inoculează 0,1 ml în 10 ml mediu de îmbogăţire Fraser, se incubează la 35oC timp de 48 h.

38

Page 39: Microbiologie Alimentara

4. Din cultura obţinută la 10.4.3. se striază cu o ansă bacteriologică sterilă pe medii selective agar Oxford şi Palcam, se incubează la 35oC timp de 48 h.

Interpretarea - După incubare, cutiile Petri însămânţate la punctul 10.4.4.,se examinează şi se reţin cele în care s-au dezvoltat colonii suspecte de L. monocytogenes. Test de confirmare - Culturile obţinute pe suprafaţa agarului Oxford şi Palcam(Se reţin 5 colonii specifice sau suspecte), suspecte ca fiind L.monocytogenes, se transplantează pe bulion şi agar nutritiv, se incubează la 35oC timp de 24 h după care se supun următoarelor teste:1. Mobilitate - Examen microscopic- între lamă şi lamelă; Examen cultural în agar moale (dezvoltare sub formă de umbrelă la 25oC)2. Reacţia catalazei - O ansă de cultură se introduce într-o picătură de peroxid de hidrogen 3% depusă pe o lamă de sticlă. Apariţia imediată a bulelor de gaze se interpretează ca reacţie pozitivă şi este specifică pentru L. monocytogenes.3. Testul hemolizei - Pe agar cu sânge se striază o ansă bacteriologică din cultura obţinută la punctul 10.6., se incubează la 35oC timp de 24 h. După care se examinează placa Petri observându-se hemoliză beta.4. Fermentarea hidraţilor de carbon (glucoză, manită, xiloză şi rhamnoză) - În eprubetele cu zaharurile mai sus menţionate, cu o pipetă sterilă se introduc câte 0,1 ml din cultura obţinută în bulion nutritiv. Se termostatează la 35oC timp de 24 h după care examinează. Reacţia este pozitivă la glucoză şi rhamnoză; reacţia este negativă la manită şi xiloză.5. Reacţia MR/VP- se foloseşte mediu Clarc şi reacţia este pozitivă6. Reacţia reducerii nitratului în nitrit –negativă7. Testul CAMP - Pe suprafaţa agarului cu sânge de oaie turnat în cutii Petri se striază în linie dreaptă pe tot diametrul cutiei cultură de 24 h de Stafilococcus aureus şi R.eqvila distanţă de 3-4 cm una de alta şi pe cât se paote linii paralele. Tulpinile de testat se striază pe suprafaţa agarului perpendicular pe primele două strii în aşa fel ca striile culturilor de testat să se oprească la 2-3 mm de acestea. Răspunsul caracteristic pentru fiecare specie este pozitiv la Stafilocococus aureus şi pozitiv sau negativ la R.eqvi, după incubare de 24 h la 35oC

Exprimarea rezultatelor

Testul biochimic L. monocytogenes

L. ivanovii

L. innocua

L. welshimerii

L. seeligeri

L. grayi

L.murrayi

Producerea de acid din:

D-glucoză + + + + + + +

D-xiloză - + - + + - -

D-manitol - - - - - + +

D-rhamnoză + - V V - - V

maltoză + + + + + + +

39

Page 40: Microbiologie Alimentara

Ptoducere de : catalază + + + + + + +

H2S/TSI - - - - - - -

H2S/benzi de acetat de plumb

- - - - - + +

betahemoliză + + - - + - -

Hidroliza esculinei + + + + + + +

Hidroliza hipuratului + + + + + - -

Hidroliza ureei - - - - - - -

Reducerea nitraţilot - - - - - - +

Reacţia Voges-Prostkauer + + + + + + +

Reacţia Roşului de metil + + + + + + +

CAMP-S.aureus + - - - + - -

CAMP-R.eqvi +/- + - - - - -

În funcţie de rezultatele interpretării se indică prezenţa sau absenţa germenilor din genul Listeria monocytogenes în x grame de probă de analizat.

Repetabilitate

Diferenţa absolută dintre două rezultate ale analizelor individuale, obţinute cu ajutorul aceleeaşi metode, pe un material identic supus analizei, în acelaşi laborator, de către acelaşi operator, utilizând aceeaşi aparatură, într-un scurt interval de timp nu trebuie să depăşească 30% din rezultatul cel mai mic.

***) Când condiţiile de repetabilitate nu sunt îndeplinite în 5% sau mai mult din cazuri, se recomandă a se căuta sursele posibile de eroare. A se vedea în ISO 5725, definiţia repetabilităţii.

SCHEMA MODULUI DE LUCRU

Probă de analizat, 25g+

mediu de îmbogăţire primară (DEMIFRASER), 225mlincubare la 30oC timp de 24+

-2 h

0,1ml cultură în 10 ml FRASER striere pe agar OXFORD

40

Page 41: Microbiologie Alimentara

striere pe agar PALCAM

incubare la 35o – 37oC timp de 48+-2 h

striere pe agar OXFORDstriere pe agar PALCAM

confirmare

DETECTAREA SPECIILOR TERMOTOLERANTE DE CAMPYLOBACTER

Bacteriile din genul Campylobacter sunt microorganisme care formează colonii tipice pe mediile solide, selective la 42oC, dintr-o cantitate dată de produs şi care manifestă caracteristicile de mobilitate şi proprietăţile biochimice specifice.

Procedura stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene din genul Campylobacter în produsele cercetate. Metoda se aplică următoarelor produse:

- Lapte crud- Carne de pasăre

Documente de referinţă:- SR ISO 10272/2000- ISO 707- SR ISO 6887/96

Principiul metodei: Pentru detectarea speciilor termotolerante de Campylobacter se cer următoarele faze: Îmbogăţire în mediu lichid - însămanţarea probei luate în lucru în mediu lichid (bulion Preston) şi incubare la 42oC timp de 18 h. Izolare şi identificare - din culturile obţinute se face însămanţarea mediului selectiv solid (Agar Karmali) şi incubare la 42oC timp de 24-72 h. Confirmare - efectuare de teste biochimice şi serologice adecvate.Soluţii de diluare şi medii de cultură folosite: Soluţii de utilizare specială: Bulion Brucella; Agar Columbia cu sange; Agar TSI. Medii de cultură - Bulion Preston; Agar Karmali.

Sterilizarea trebuie făcută în autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dacă soluţiile de diluare nu sunt folosite imediat, ele trebuie păstrate la întuneric între 0-5oC maxim 7 zile pentru evitarea oricărei modificări a volumului sau compoziţiei lor.

Echipamente de încercare şi mijloace de măsurare Termostat - reglabil la 42oC

41

Page 42: Microbiologie Alimentara

Etuvă 160 – 180oC - asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă, porţelan, hârtie, vată, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute Autoclav - realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lampă U.V. - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru Balanţă analitică - balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumente Ansă buclată din paltină-iridiu sau nichel-crom cu diametrul de 3 mm Pipete gradate sterile cu scurgere totală de 1 ml, de 10 ml şi pipete Pasteur Lupă cu putere de mărire de 3x pH metru cu compensare de temperatură cu exactitate 0,1 unităţi de pH la 25o C Microscop Recipiente în principal eprubete de 16 mm x 160 mm şi de 9 mm x 180 mm, eprubete pentru hemoliză de 13 mm x 75 mm, sticle cu capace metalice netoxice şi/sau flacoane prevăzute cu dopuri de bumbac, care să permită circulaţia gazelor pentru a se realiza atmosfera microaerobă necesară. Cutii petri de sticlă sau de material plastic cu diametrul de 90 mm şi 100 mm Mojar cu pistil, sterile

Eeşantionare - este important ca laboratorul să primească un eşantion cu adevărat reprezentativReguli de procedură pentru determinarea germenilor din genul campylobacter

Modul de analiză, acceptare şi înregistrare a comenzilor este conform Manualului de Calitate LM – 02Eşantioanele sunt etichetate, cuprinzănd; produsul recoltat, examenul cerut, locul prelevării, zua

şi data prelevării, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevării, cine a prelevat.Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit

(recipiente, instrumente, sticlării) să fie steril. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute.

Pregătirea materialului de sterilizat:- Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de apă, după care spălarea cu apă distilată- Punerea de dopuri de vată cu tifon, împachetarea cu hârtie a gâtului eprubetelor sau baloanelor- Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC

Omogenizare prin mojarare - alimentul cu consistenţă lichidă se omogenizează ca atare.Alimentul cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi mici înainte de mojarare. Din proba de

analizat se introduc în mojar 1g/10g + cantitatea egală de nisip steril. Se triturează adăugându-se treptat lichid de diluţie de 9 ori mai mare decât eşantionul.

Acţiuni şi/sau măsuri preventive Protecţia personalului

- Obligatorie purtarea halatului- Folosirea lampei de U.V. (înainte şi după însămânţare)- Folosirea hotei de însămânţare- Pipetele sunt prevăzute cu dop de vată nehidrofilă pentru a preveni aspirarea accidentală a eşantionului

42

Page 43: Microbiologie Alimentara

- Flambarea ansei se face întâi la baza flăcării şi apoi la vârf pentru a împiedica râspăndirea germenilor- Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante- Protecţia mijloacelor de încercare şi/sau măsurare- Sticlăria sterilă se păstrează în dulapuri speciale- Sticlăria sterilă se foloseşte maxim 6 zile- Executarea periodică a serviciilor de întreţinere şi curăţire zilnică a aparaturii- Verificarea şi înregistrarea temperaturii din încăperea de lucru

DIAGRAMA MODULUI DE LUCRU

Probă de testatx g sau x ml

9 x bulion Preston

îmbogăţire Incubare în atmosferămicroaerobă, la 42oCtimp de 18 h

striere agar KarmaliIncubare în atmosferă microaerobă,la 42oC timp de 24 h.........72 h(pană la 5 zile dacă este necesar)5 colonii caracteristiceteste suplimentareexprimare rezultate

Factorii care influenţează fidelitatea metodei sunt următorii:- Tipul de aparatură pentru omogenizare- Durata omogenizării- Mediu lichid de îmbogăţire

Pregătirea eşantionului pentru analiză

Se efectuează conform standardului internaţional pentru produsul de analizat. Dacă nu există standard internaţional de produs se recomandă ca părţile interesate să se pună de acord asupra subiectului.

1. Însănanţare şi incubare2. Faza de îmbogăţire

43

Page 44: Microbiologie Alimentara

Pentru a prepara suspensia iniţială se adaugă o porţiune din eşantionul de examinat (masă sau volum) în 9 ml mediu de îmbogăţire, bulion Preston pentru a obţine un raport de 1/10 (masă/volum sau volum/volum) între produsul de examinat şi mediu.

Suspensia obţinută, se incubează la 42oC, într-o atmosferă microaerobă timp de 18 h.3. Izolare şi Identificare

Din cultura obţinută prin îmbogăţire în bulion Preston, după 18 h incubare, cu o ansă bacteriologică se însămanţează, prin striere suprafaţa agarului Karmali, din două cutii Petri. Cutiile Petri însămanţate, se incubează în atmosferă microaerobă la 42oC timp de 24 h, 48 h sau chiar 3 pană la 5 zile, după care se examinează cutiile Petri în vederea detectării prezenţei coloniilor tipice de Campylobacter termotolerant.

4. InterpretarePe mediul agar Karmali coloniile tipice sunt plate asemănătoare unor picături alungite.

5. Test de confirmareAlegerea coloniilor pentru confirmarePentru confirmare se aleg, din toate cutiile Petri inoculate cate 5 colonii tipice şi/sau

suspecte.Dacă într-o cutie Petri sunt mai puţin de 5 colonii tipice şi/sau suspecte, se iau toate pentru confirmare.

Examinarea caracterelor morfologice şi de mobilitateo Din fiecare cutie Petri se utilizează cate o colonie perfect izolată pentru realizarea unui frotiu

colorat Gram.o Se ia o colonie din cele 5 alese şi se omogenizează într-un 1 ml bulion Brucella.

o Se examinează la microscop morfologia şi mobilitatea fiecărei colonii selectate.

o Pentru examinările ulterioare, se reţin suspensiile în care se evidenţiază bacili Gram negativi,

curbaţi cu o mişcare în spirală, de tirbuşon, caracteristică.Studiu morfologicDin suspensiile selectate se fac strieri cu ansa pe agar Columbia cu sange pentru a obţine colonii

bine izolate. Cutiile Petri inoculate se incubează în atmosferă microaerobă, la 42oC, timp de 24 h şi se utilizează pentru testele biochimice, culturile pure.

Creştere la 25oCDin cutiile Petri cu agar Columbia cu sange se ia cate o colonie şi se descarcă într-un tub de

bulion Brucella, se incubează la 25oC, în atmosferă microaerobă timp de două pană la cinci zile.După incubare se examinează prezenţa sau absenţa creşterii.

Confirmări biochimiceo Detectarea oxidazei

Cu o ansă bacteriologică sau cu o baghetă de sticlă se ia o porţiune dintr-o colonie bine izolată, din fiecare cutie Petri şi se descarcă pe o hartie de filtru îmbibată cu reactiv pentru oxidază. Apariţia în 10 sec a unei culori mov, violet sau albastru închis indică o reacţie pozitivă. Cand se utilizează chituri de testare provenite din comerţ, se respectă instrucţiunile producătorului.

Pentru confirmarea rezultatelor pozitive sau negative se utilizează tulpini martor.o Agar TSI

Din fiecare colonie selectată se face inocularea agarului cu ansa. Se înţeapă cu ansa, partea dreptă a agarului, pe toată lungimea sa, apoi se descarcă, prin striere, pe partea înclinată a acestuia.

Se incubează în atmosferă microaerobă la 42oC, timp de 24 h şi chiar 5 zile, dacă este necesar.44

Page 45: Microbiologie Alimentara

Interpretarea reacţiilor se face în felul următor:

Partea dreaptăgalben - glucoză pozitiv (fermentează glucoza)Roşu sau nescimbat - glucoză negativ (nu fermentează glucoza)Negru - formare de hidrogen sulfurat (H2S)Bule de gaz sau spargerea agarului - formare de gaz din glucoză

Partea înclinatăGalben - lactoză şi/sau zaharoză pozitiv (unul sau ambele

zaharuri sunt folosite)Roşu sau neschimbat lactoză şi zaharoză negativ (nici un zahar nu este

folosito Detectarea catalazei

Din culturile obţinute pe agar TSI se omogenizează cu ansa, într-o picătură de soluţie de peroxid de hidrogen depusă pe o lamă microscopică în stare curată.

Apariţia în 30 sec., a bulelor de gaz indică reacţie pozitivă.o Detectarea sensibilităţii la acid nalidixic şi cefalotină

Se inoculează cu ansa, coloniile selectate, în bulion Brucella, pană cand se realizează o suspensie cu densitatea de 0,5 pe scara Mac-Farland.

Suspensia realizată se diluează 1 : 10 cu bulion Brucella.Se inundă cu suspensia diluată suprafaţa agarului Mueller-Hinton cu 5% sange dintr-o cutie Petri. Se lasă în contact 5 min, după care se înlătură suspensia în exces. Se usucă suprafaţa mediului din cutii, prin menţinere în etuvă, la 37oC, timp de 24 h.Pe suprafaţa

agarului uscat se aplică un disc cu acid nalidixic şi un altul cu cefalotină. Se incubează într-o atmosferă microaerobă la 37oC timp de 24 h.Interpretarea creşterii bacteriene se face în felul următor;-creştere realizată în contact cu discul se consideră rezistenţă;-prezenţa unei zone de o anumită mărime, unde se observă inhibarea creşterii, se consideră

sensibilitate.

o Detectarea hidrolizei hipuratului

Coloniile selectate de pe agar Columbia cu sange se inoculează cu o ansă într-un tub Waserman (de hemoliză) 0,4 ml soluţie de hipurat de sodiu.

Se agită tubul uşor şi se incubează într-o baie de apă la 37oC timp de 24 h.Se adaugă foarte uşor 0,2 ml soluţie de ninhidrină pe suprafaţa soluţiei de hipurat de sodiu. Nu se

agită. Se incubează în baie de apă la 37oC timp de 10 min.Reacţia este pozitivă atunci cand apare culoarea violet închis.Culoarea violet deschis sau lipsa modificării culorii indică reacţie negativă. Eexprimarea rezultatelor - în funcţie de rezultatele interpretării se indică prezenţa sau absenţa

germenilor din genul Campylobacter termotolerant în x grame de probă de analizat

45

Page 46: Microbiologie Alimentara

DETERMINARE DE ESCHERICHIA

COLI O157 H7 DIN CARNEA DE BOVINĂ

Scop - Procedura stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene coliforme în produsele cercetate.

Această procedură cuprinde directive generale pentru determinarea numărului de unităţi formatoare de colonii (UFC) de microorganisme prin metoda numărării coloniilor la 30o C. Metoda se aplică următoarelor produse:

- Carne de vită şi produse din carne care conţin carne de vită Documente de referinţă

STAS-uri folosite pentru produsele enumerate la punctul anterior sunt următoarele:- ISO17025/2001- SR ISO 16654/99- ISO 707- ISO 4832 – 1992 (pentru produse carnate)- STAS 2356 – 1982 (pentru produse carnate)- SR ISO 6887/96

Simboluri şi prescurtări- BBLV +n – Bulion EC cu novobiocină- MCS – Agar MacConkey cu sorbitol- Apă peptonată cu sorbitol- ABT sorbitol

Principiul metodei Însămânţarea a unei cantităţi de 25 g de produs în 225 ml bulion EC cu novobiocină. Incubare la 35oC timp de 24 h. Din cultura cu bulion de îmbogăţire se efectuează diluţii decimale de la 10 -1 până la 10-5.Din

ultimele două diluţii se striază cu ansa bacteriologică pe suprafaţa unui mediu selectiv (agar Mac Conkey cu sorbitol) turnat în plăci Petri sterile.Incubare la 35oC timp de 24 h.

Identificare. 5 colonii cu aspect caracteristic din fiecare probă, dezvoltate pe suprafaţa agarului MacConkey se însămânţează fiecare colonie în următoarele medii:

- Bulion nutritiv- Bulion EC în eprubete cu tub de fermentaţie- Apă peptonată cu sorbitol şi ABT cu sorbitol- Apă peptonată cu celobioză şi ABT celobioză- Agar nutritiv înclinat- Agar TSI- Agar cu lizină şi fier (LIA)- Agar cu citrat (SIMON)- Agar nutritiv moale în coloană sau SIM- Agar Levine

46

Page 47: Microbiologie Alimentara

Incubare la 35oC timp de 24 h.Citirea rezultatelor la testele executate.

Executarea reacţiei betagalactozidazei cu cultura dezvoltată pe agarul înclinat.Executarea reacţiei de seroaglutinare pe lamă cu cultura dezvoltată pe suprafaţa agarului înclnat cu serul anti O157 şi separat cu serul anti H7. Stimularea mobilităţii în cazul seroaglutinării negative cu antiserul H7.

Soluţii de utilizare specială- Bulion nutritiv- Bulion EC în eprubete cu tub de fermentaţie- Apă peptonată cu sorbitol şi ABT cu sorbitol- Apă peptonată cu celobioză şi ABT celobioză- Agar nutritiv înclinat- Agar TSI- Agar cu lizină şi fier (LIA)- Agar cu citrat (SIMON)- Agar nutritiv moale în coloană sau SIM- Agar Levine- Ser aglutinant O157 - Ser aglutinat H7

Repartizarea, sterilizarea şi păstrarea soluţiilor de diluare şi mediilor de culturăSe repartizează soluţiile de diluare pentru diluţiile iniţiale în flacoane sau sticle iar pentru diluţiie următoare în eprubete sau sticle. Cantităţile trebuie astfel repartizate astfel încât după sterilizare fiecare flecon sau sticlă să conţină 90 ml soluţie de diluare sau un multiplu de 9 ml. Eprubetele, flacoanele sau sticlele trebuie închise cu dopuri. Sterilizarea trebuie făcută în autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dacă soluţiile de diluare nu sunt folosite imediat, ele trebuie păstrate la întuneric între 0-5oC maxim o lună pentru evitarea oricărei modificări a volumului sau compoziţiei lor. Medii de cultură

o Bulion EC modificat cu novobiocină

o Agar MacConkey cu sorbitol (BCIG)

o Agar Levine

o Agar cu sorbitol roşu de fenol şi 4-metylunbelliferyl-beta-de-glucuronoid(PRS

MUG) Echipamente de încercare şi mijloace de măsurareo Termostat 30o +

-0,5oC – aparat electric pentru dezvoltarea microbiană

o Etuvă 160 – 180oC - asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă, porţelan, hârtie,

vată, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minuteo Autoclav - realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură,

produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minuteo Lampă U.V. - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor

de lucru

47

Page 48: Microbiologie Alimentara

o Balanţă analitică - balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura camerei

o Stomacher - dispozitiv de mărunţire, tocare şi omogenizare

o Baie de apă reglabilă la temperatură mai mare de 100oC sau reglabilă la 45oC

o Cutii Petri sterile cu diametrul de 100x15 mm;150x15 mm; 60x15 mm

o Pipete automate cu vârfuri de plastic sterile pentru o singură folosire, calibrate pentru a repartiza 100

microlitrio Anse bacteriologice din nichel-crom

o pH metru cu compensare de temperatură cu exactitate 0,1 unităţi de pH la 25o C

o Alte materiale ce se folosesc curent în laboratoarele de microbiologie (lame microscopice de sticlă,

eprubete şi pipete gradate de diferite capacităţi, etc)o Pungi de plastic sterile pentru stomacher sau baloane erlenmayer cu gura largă de 300 sau 500ml

o Tuburi Durham cu dimensiuni corespunzătoare pentru utilizare în eprubete de 16 x 160 mm

o Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml

o Mojar cu pistil, sterile

Eşantioanele sunt etichetate, cuprinzănd; produsul recoltat, examenul cerut , locul prelevării, ziua şi data prelevării, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevării, cine a prelevat

Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlării) să fie steril. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute.

Pregătirea materialului de sterilizat:- Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de apă, după

care spălarea cu apă distilată- Punerea de dopuri de vată cu tifon, învelirea cu hârtie a gâtului eprubetelor sau

baloanelor- Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC

Pregătirea eşantionului pentru analiză

Eşantionul se pregăteşte conform standardului internaţional specific al produsului respectivPentru a se evita lezarea microorganismelor datorită schimbărilor bruşte de temperatură, mediu de îmbogăţire selectivă trebuie să aibă aproximativ aceeaşi temperatură cu proba, dacă nu există alte prescripţii.

Protecţia personalului- Obligatorie purtarea halatului- Folosirea lampei de U.V. (înainte şi după însămânţare)- Folosirea hotei de însămânţare- Pipetele sunt prevăzute cu dop de vată nehidrofilă pentru a preveni aspirarea accidentală a eşantionului- Flambarea ansei se face întâi la baza flăcării şi apoi la vârf pentru a împiedica râspăndirea germenilor- Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante

48

Page 49: Microbiologie Alimentara

Modul de lucruo Însămânţare şi incubare

1. Îmbogăţire selectivă. - Se cântăreşte 25g din eşantion, se mărunţeşte şi se omogenizează cu ajutorul stomacherului peste care se adaugă 225 ml bulion m EC + n. Se incubează la 35oC timp de 24 h.2. Obţinerea de colonii izolate: Din cultura obţinută se fac diluţii în ser fiziologic: de la 10 -1 până la 10-5. Din ultimele două diluţii se striază câte 0,1 ml pe suprafaţa agarului MacConkey cu sorbitol (BCIG) turnat în plăci Petri sterile. Se incubează la 35oC timp de 24 h3. Din plăcile cu BCIG se iau 5 colonii suspecte (colonii albe) ca fiind colonii de E. coli O 157H7 şi se striază pe suprafaţa mediului PRS-MUG turnat în plăci Petri sterile, se incubează plăcile timp 24 h la temperatura de 35oC.4. Identificare. Cele 5 colonii cu aspect caracteristic din fiecare placă Petri se însămânţează fiecare pe următoarele medii:bulion nutritiv-indol pozitiv; bulion EC în eprubete cu tub de fermentaţie-dezvoltare de gaze; apă peptonată cu sorbitol şi ABT-sorbitol negativ; apă peptonată cu celobioză şi ABT-celobioză negativ; agar nutritiv înclinat-R.beta-galactoxidază pozitivă; agar TSI-galben H2 S-negativ; agar cu lizină şi fier (LIA)-lizin decarboxilază pozitiv; agar cu citrat (SIMON)-negativ; agar nutritiv moale în coloană sau SIM-mobilitate pozitivă; agar Levine-colinii caracteristice5. Incubare la 35oC timp de 24 h.6. Citirea rezultatelor; executarea reacţiei beta galactozidazei cu cultura dezvoltată pe agarul înclinat; executarea reacţiilor de seroaglutinare pe lamă cu cultura dezvoltată pe suprafaţa agarului înclinat şi serul anti O157 şi separat cu serul anti H7. Stimularea mobilităţii în cazul seroaglutinării negative cu antiserul H7.7. Interpretarea - Răspunsul caracteristic la testele biochimice şi seroaglutinarea pozitivă cu antiserurile O157 H7 demonstrează prezenţa E. coli O157 H7 în 25 g produs examinat. În cazul că toate testele sunt caracteristice pentru E. coli O157 H7 , iar seroaglutinarea cu serul H7 este negativă şi după operaţiunea de stimulare a mobilităţii se va concluziona că în 25 g produs s-a decelat prezanţa E. coli O157 imobilă.

Exprimarea rezultatelor - În funcţie de rezultatele interpretării se indică prezenţa sau absenţa a Escherichiei coli O157 H7 în x grame de probă de analizat.

Repetabilitate - Diferenţa absolută dintre două rezultate ale analizelor individuale, obţinute cu ajutorul aceleeaşi metode, pe un material identic supus analizei, în acelaşi laborator, de către acelaşi operator, utilizând aceeaşi aparatură, într-un scurt interval de timp nu trebuie să depăşească 30% din rezultatul cel mai mic. Când condiţiile de repetabilitate nu sunt îndeplinite în 5% sau mai mult din cazuri, se recomandă a se căuta sursele posibile de eroare. A se vedea în ISO 5725, definiţia repetabilităţii.

Testul Mediul folosit Reacţia caracteristică pentru E. coli O157 H7

Caracterul coloniilor pe:

EMB (Levine) colonii de mărime medie, violet-maronii cu luciu metalic

Folosirea citratului Agar cu citrat (Simons) negativă

Aspectul pe: Agar TSI coloană şi pantă galbene, H2S-negativ

49

Page 50: Microbiologie Alimentara

Lizin decarboxilază LIA sau Moeller pozitivă

Fermentarea celobiozei Apă triptonată + celobioză

negativă

Producerea de beta-galacto-xidază

Agar înclinat + BCIG negativă

50