microbiologie exam

99
1. Microbiologia. Obiectul de studiu. Disciplinile microbiologice si obiectele de studiu. Etapele istorice de dezvoltare a microbiologiei. Rolul savantilor A. Leeuwenhoek, L. Pasteur, R. Koch, I.Mecinicov in dezvoltarea microbiologiei. Obiectul de studiu: 1. mi/o si activitatea lor vitala (forma, structura, metabolism, crestere si multiplicare) identificare 2. relatiile mi/o cu mediul ambiant si cu organismul-gazda Scopurile studierii mi/o: 1) patogene, oportuniste = prevenire maladii infectioase 2) utile, inofensive = productie AB, medicamente prin ADNrec (streptokinaza, insulina), alimente (unt, brinza) 3) insecticide „biologice” 4) fabricare plastic biodegradabil ??? 5) decompunere deseuri, metan Disciplini microbiologice: particularitati biologice mi/o bacteriologie virologie protozoologie micologie, etc habitat mi/o microbiologia solului ... marina ... cosmica implicatii in activitatea umana microbiologia medicala ... veterinara ... alimentara, etc Genetica microbiana Ecologia microbiana Microbiologia medicala studiaza: a) relatia mi/o-gazda umana b) capacitatile patogene mi/o c) capacitatile antiinfectioase organism uman d) metode de diagnostic etiologic al bolilor infectioase e) metode de terapie/profilaxie antimicrobiana Etape istorice in dezvoltarea microbiologiei: I. empirica (pina in sec. 15) II. morfologica (sec. 16-18) A. von Leewenhoek: 1673 – prima observare si descriere a mi/o III. fiziologica (sec. 19) L. Pasteur: prepararea vaccinurilor contra antraxului, turbarii, holerei; sustine necesitatea sterilizarii instrumentelor, bandajelor R. Koch: introducerea mediilor de cultura solide; izolare agent antrax, tbc; elaborare teorie despre rolul etiologic al mi/o in bolile infectioase (postulatele lui Koch) I. Mecinicov: argumentare rolul florei intestinale (antagonism); descoperire fagocitoza si rolul antimicrobian al inflamatiei 2. Tipurile de laboratoare microbiologice si sarcinile lor. Regimul si regulile de lucru in laboratorul microbiologic. Clasificarea laboratoarelor in functie de exigenta sigurantei antiinfectioase. 3. Notiune de microorganisme. Categoriile taxonomice, tipuri acelulare si celulare. Deosebirile dintre microorganismele procariote si eucariote. Mi/o = organisme microscopice (micro-nano- metri) + alge, protozoare, virusuri, agenti subvirali (prioni), cipuerci microscopice (fungi, micete) Clasificari mi/o: fenotipica (prima tentativa – Carl von Linne) genotipica filogenetica (bazata pe studiul fosilelor sau al HLA) Grupe taxonomice: domeniu regn increngatura clasa ordin familie gen specie Taxoni infraspecifici din cadrul speciei, care prezinta anumite diferente: biovar (activitate biochimica/fiziologica) serovar (structura Ag) patovar (grad de patogenitate) lizovar (sensibilitate la bacteriofagi) antibiovar (sensibilitate la AB) 1

Upload: analalupu

Post on 04-Jan-2016

120 views

Category:

Documents


10 download

DESCRIPTION

Examen microbiologie

TRANSCRIPT

Page 1: Microbiologie Exam

1. Microbiologia. Obiectul de studiu. Disciplinile microbiologice si obiectele de studiu. Etapele istorice de dezvoltare a microbiologiei. Rolul savantilor A. Leeuwenhoek, L. Pasteur, R. Koch, I.Mecinicov in dezvoltarea microbiologiei.Obiectul de studiu:

1. mi/o si activitatea lor vitala (forma, structura, metabolism, crestere si multiplicare) identificare2. relatiile mi/o cu mediul ambiant si cu organismul-gazda

Scopurile studierii mi/o:1) patogene, oportuniste = prevenire maladii infectioase2) utile, inofensive = productie AB, medicamente prin ADNrec (streptokinaza, insulina), alimente (unt, brinza)3) insecticide „biologice”4) fabricare plastic biodegradabil ???5) decompunere deseuri, metan

Disciplini microbiologice: particularitati biologice mi/o

bacteriologie virologie protozoologie micologie, etc

habitat mi/o microbiologia solului ... marina ... cosmica

implicatii in activitatea umana microbiologia medicala ... veterinara ... alimentara, etc

Genetica microbiana Ecologia microbiana

Microbiologia medicala studiaza:a) relatia mi/o-gazda umanab) capacitatile patogene mi/oc) capacitatile antiinfectioase organism umand) metode de diagnostic etiologic al bolilor infectioasee) metode de terapie/profilaxie antimicrobiana

Etape istorice in dezvoltarea microbiologiei:I. empirica (pina in sec. 15)

II. morfologica (sec. 16-18)A. von Leewenhoek: 1673 – prima observare si descriere a mi/o

III. fiziologica (sec. 19)L. Pasteur: prepararea vaccinurilor contra antraxului, turbarii, holerei; sustine necesitatea sterilizarii instrumentelor, bandajelorR. Koch: introducerea mediilor de cultura solide; izolare agent antrax, tbc; elaborare teorie despre rolul etiologic al mi/o in bolile infectioase (postulatele lui Koch)I. Mecinicov: argumentare rolul florei intestinale (antagonism); descoperire fagocitoza si rolul antimicrobian al inflamatiei2. Tipurile de laboratoare microbiologice si sarcinile lor. Regimul si regulile de lucru in laboratorul microbiologic. Clasificarea laboratoarelor in functie de exigenta sigurantei antiinfectioase.3. Notiune de microorganisme. Categoriile taxonomice, tipuri acelulare si celulare. Deosebirile dintre microorganismele procariote si eucariote.Mi/o = organisme microscopice (micro-nano- metri) + alge, protozoare, virusuri, agenti subvirali (prioni), cipuerci microscopice (fungi, micete)Clasificari mi/o:

fenotipica (prima tentativa – Carl von Linne) genotipica filogenetica (bazata pe studiul fosilelor sau al HLA)

Grupe taxonomice: domeniu regn increngatura clasa ordin familie gen specieTaxoni infraspecifici din cadrul speciei, care prezinta anumite diferente:

biovar (activitate biochimica/fiziologica) serovar (structura Ag) patovar (grad de patogenitate) lizovar (sensibilitate la bacteriofagi) antibiovar (sensibilitate la AB)

Rolul taxonilor infraspecifici: markeri epidemiologici!Clasificare mi/o:

forme acelulare (virusuri, viroizi, prioni) forme celulare:

bacteria = procariote, eubct1) G-2) G+3) micoplasme (lipsite de PC)

archaea = procariote, PC fara peptidoglican, habitat in conditii extremale eucarya = eucariote (fungi, protozoare)

4. Metodele microbiologice de diagnostic si esenta lor. Metoda microscopica in diagnosticul bolilor infectioase. Tipurile de microscoape, utilizarea practica, particularitatile si rolul uleiului de emersie.Metode microbiologice de diagnostic:

diagnostic direct (detectare agent patogen sau a produselor lui)1. microscopic (orientativ) prezenta bct, nr, forma, structura2. bacteriologic izolare culturi pure de bct, identificare si testare la AB3. biologic (experimental) inoculare produs patologic la animale de laborator, provocare maladie tipica4. depistare Ag mi/o in lichide biologice

1

Page 2: Microbiologie Exam

5. identificare AN mi/o prin tehnici de biologie moleculara diagnostic indirect (imunologic)

1. serodiagnostic detectare si titrare Ac specifici in serul bolnavului2. intradermoreactie introducere alergen microbian epidermal/intradermal; reactie pozitiva = aparitie eritem

hipersensibilitate specifica (intilnire repetata cu Ag)5. Morfologia bacteriilor. Grupurile morfologice de bacterii. De desenat. Caracterele tinctoriale ale bacteriilor. Colorantii de baza utilizati in microbiologie. Metodele de colorare. Aplicarea practica.Bct = mi/o, unicelular, procariot, autonomGrupe morfologice de bct:

coci:1. micro2. diplo (neisseria=bob de cafea, pneumococi=lanceolati)3. tetra4. strepto (lant) + enterococcus, lactococcus5. stafilo (gramezi)6. sarcine (pachete 8-16-32 coci)

bastonase1. bacterium – capete rotunjite, nu formeaza spori (ex. E. coli)2. bacillus – capete retezate, formeaza spori ce nu depasesc diametrul celulei (ex. B. anthracis); posibilitate formare lanturi =

streptobacili3. clostridium – capete rotunjite, formeaza spori ce depasesc diametrul celulei (ex. C. perfringens)

spiralate/incurbate1. vibrio (ex. V. cholarae)2. campylo-/helico- bacter = 2 apire. aspect de pasare in zbor (ex. C. jejuni)3. spirillum = cel. spiralate rigide4. spirochaeta = cel. spiralate flexibile, 5-25 spire (ex. Treponema, Leptospira, Borrelia)

polimorfe (Actinomyces, Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma)6. Etapele si tehnica de pregatire a frotiurilor din culturile bacteriene crescute pe medii lichide. Tehnica de pregatire a frotiurilor din biosubstrate: sputa si frotiuri amprente. Metodele de fixare.Pregatirea frotiurilor examen microscopicEtape in pregatirea frotiului:

1) etalare material microbian2) uscare3) fixare oamoara bct, mareste afinitatea pt colorant4) colorare asigura contrast intre mi/o si fundal5) examinare (microscop optic cu imersie)

Caracter tinctorial = capacitatea mi/o de a fixa colorantul7. Etapele si tehnica de pregatire a frotiurilor din culturile bacteriene crescute pe medii solide. Tehnica de pregatire a frotiurilor din biosubstrate: singe, puroi. Metodele de fixare.

8. Structura celulei bacteriene. Enumerati elementele permanente (obligatorii) si nepermanente (neobligatorii) de structura. Membrana citoplasmatica si citoplasma. Structura, compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere.Elemente permanente: PC, MCt, Ct, nucleoid, ribosomi, mezosomi G+ (E, citocromi)Elemente nepermanente: capsula, spor, flageli, fimbrii, plasmide, incluziuni celulareMCt:

mozeic fluid Singer lipsa colesterol, contin sterol-like molecules hopanoizi mai bogata in prot. decit eucariotele fctii multiple (la eucariote indeplinite de organite)

PBP – catalizare transpeptidare si sinteza PC permeaze – transport prot. sist. de secretie receptori E lant respirator

Rol MCt:1. Bariera semipermeabila, selectiva difuziune simpla, facilitata2. Permeaze transport activ3. E activitate metabolica4. Metabolism energetic5. Participa la diviziunea celulara6. Sinteza PG si fosfolipidelor7. Chemotaxis (R specifici)

Mezozomi: cresc S MCt cresc activitatea metabolica, energeticaCt:

Lipsesc organitele Prezenta: ribozomi, nucleoid, inclusiuni, plasmide pH acid

Rol Ct: sediul proceselor metabolice9. Peretele celular bacterian, functiile. Particularitatile de structura ale peretelui celular al bacteriilor gram pozitive. Coloratia Gram. Tehnica si mecanismul de colorare. Importanta practica. Exemple de bacterii gram pozitive.PC = invelis rigid ceinconjoara protoplastul; e constituit din PG.PG = mureina = heteropolimer macromolecular, format din 2 parti:

Partea glicanica (PZ) = catene liniare paralele: NAG + NAM Partea peptidica = peptide 4*aa (izoforme D si L) legate de NAM protectie de proteaze

G-: tetrapeptidele unite direct (bidimensional)

2

Page 3: Microbiologie Exam

G+: tetrapeptidele unite prin punti interpeptidice 5*Gly (tridimensional)Structuri prezente doar la procariote:

1. ac. diaminopimelic (tetrapeptid, la G+)2. izoforma D aa3. NAM

Fragmente solubile de mureina (PG) interactiune cu toll-likeR/CD14R de pe macrofage secretie citokine soc septic!Rol PC:

1. Protectie de liza osmotica2. Forma3. Factor de patogenitate (soc septic)4. Protectie contra subst. toxice (AgO, E din spatiul periplasmatic)5. Tinta de atac a unor substante: Lizozim – scindare legaturi din catena glicanica (intre NAG si NAM) AB – inhibitie proces de transpeptidare

PC G+: Componente:

PG (tridimensional) 40-80% ac. teichoici (fixati de NAG), ac. lipoteichoici (fixati de MCt) = polimeri de ribitol, glicerol-fosfat;

o sarcina electrica negativao transfer de ionio fctie Ago activare complement pe cale alternativao stimulare secretie citokineo adeziune intercelulara

prot. asociate PCo Streptococcus pyogenes = prot. Mo Staphylococcus aureus = prot. A (clumping factor), prot. fixatoare de fibronectina

Uniform Grosime 80 nm

10. Peretele celular bacterian, functiile. Particularitatile de structura ale peretelui celular al bacteriilor gram negative. Coloratia Gram. Tehnica si mecanismul de colorare. Importanta practica. Exemple de bacterii gram negative.PC G-:

Componente: PG (bidimensional) 1-10% MEx: existenta situsuri de comuniune intre MEx si MCt rol in transport

o Prot. majore: porine, receptori (pili, fagi)o Prot. minore: E de captare si transport a subst.

LP Braun = uneste Mex si PG stabilizare MEx LPZ (cel mai neobisnuit component) stabilizare MEx

o Lipid A – localizat in MEx; endotoxina (stimuleaza secretia citokinelor)o Miex PZ – transport unele subst.; AgR specificitate de geno Lant O (OZ) – sarcina negativa, impiedica fagocitoza; AgO specificitate de specie

N.B. Bct au capacitatea de a modifica structura AgO capacitate de a amagi apararea imuna Neomogen Grosime 12 nm

Spatiul periplasmatic: E si prot. fixate de MCtRol e: hidroliza, sinteza PC, detoxifiere (ex. Beta-lactamaze)

Coloratia GRAM1. Violet de gentiana Ct violeta 2. Spalare cu apa, tratare cu sol. Lugol (iodin) formare complex insolubil violet-iodin fixare colorant in celule3. Tratare cu alcool 95%

o eliminare colorant din bct G- pori mai mari in PG, continut mai mare de lipide (solubile in alcool), pH slab acido mentinere colorant in bct G+ pori mai mici, continut scazut de lipide alcoolul dehisrateaza peretele si reduce diametrul

porilor4. Recolorare cu fuxina apoasa

Rezultat: G-: rosu, G+: violetUtilizarea coloratiei Gram: Diagnostic, Sensibilitate la ABForme particulare, osmotic sensibile:

Protoplast = G+, fara PG Sferoplast = G-, MCt+MEx, partial fara PG Forme L = bct lipside de PC, din cauza AB, (i)reversibile

Mycoplasma – lipsite de PC, osmotic rezistente rezistenta marita MCt; forma pleiomorfa

11. Particularitatile de structura si compozitia chimica a peretelui celular al bacteriilor acidorezistente. Coloratia Ziehl-Neelsen. Componentele, tehnica si mecanismul de colorare. Exemple de bacterii acidorezistente. Coloratia Ziehl-Neelsen:

1. Colorare cu fuxina fenicata + incalzire lama pina la aparitia vaporilor2. Spalare cu apa, tratare cu sol. ac. sulfuric 5%3. Spalare cu apa, recolorare cu albastru de metilen

Rezultat: Acidorezistente: rosu; Acidonerezistente: albastru12. Aparatul nuclear al bacteriilor. Compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Plasmidele bacteriene, tipurile si functiile lor.Aparatul nuclear = nucleoid, ADN bicatenar circular – 1 crsADN bicatenar circular – 1 crs

3

Page 4: Microbiologie Exam

N.B. date recente ca V. cholerae contine > 1 crsN.B. date recente ca V. cholerae contine > 1 crsADN: pliat în bucle, stabilizat prin ARN şi proteine (diferite de histone). Fiecare buclă – hiperspiralizată sub acţiunea ADN-girazei şi ADN: pliat în bucle, stabilizat prin ARN şi proteine (diferite de histone). Fiecare buclă – hiperspiralizată sub acţiunea ADN-girazei şi topoizomerazei IV (se întâlnesc doar la bacterii). Pe ADN sunt fixate enzime de sinteză (ADN - , ARN – polimeraze).topoizomerazei IV (se întâlnesc doar la bacterii). Pe ADN sunt fixate enzime de sinteză (ADN - , ARN – polimeraze).Metode speciale de colorare (Feulgen): Metode speciale de colorare (Feulgen): HCl….aldehida….react. Shiff….culoare rosie ???HCl….aldehida….react. Shiff….culoare rosie ???

Plasmide: elemente genetice (ADN) extracromozomiale, capabile de replicare autonomă. Conferă bacterielemente genetice (ADN) extracromozomiale, capabile de replicare autonomă. Conferă bacterieei caractere suplimentare. Se transmit i caractere suplimentare. Se transmit celulelor-fiice la diviziunea bacteriei. Plasmidele conjugative celulelor-fiice la diviziunea bacteriei. Plasmidele conjugative F F se transmit prin conjugare. se transmit prin conjugare. EpisomEpisom - plasmida integrat - plasmida integratăă îîn cromosomn cromosomTipuri de plasmide:Tipuri de plasmide:

F – factor de fertilitate, conjugativeF – factor de fertilitate, conjugative (sinteza pililor F) (sinteza pililor F)R – rezistenţă la antibioticeR – rezistenţă la antibioticeEnt – producerea enterotoxineiEnt – producerea enterotoxineiHly – producerea hemolizineiHly – producerea hemolizineiCol – producerea de bacteriocineCol – producerea de bacteriocine

Utilizarea practică: în tehnologii de ADN-recombinantUtilizarea practică: în tehnologii de ADN-recombinant

13. Sporii bacterieni. Compozitia chimica si functiile biologice. Etapele sporogenezei. Amplasarea sporului in celula. Exemple de specii patogene sporulate, de desenat. Metodele de evidentiere a sporilor.Bacterii sporogene, G+: Bacillus, Clostridium.Bacterii sporogene, G+: Bacillus, Clostridium.F. vegetativa = activa metabolicF. vegetativa = activa metabolicSpor:Spor:

Inactiv metabolicInactiv metabolic Conţinut scăzut de apă liberăConţinut scăzut de apă liberă Conţinut mare (până la 10%) în dipicolinat de calciuConţinut mare (până la 10%) în dipicolinat de calciu Rezistent la temperaturi şi pH extreme, desicare, radiaţii, agenţi chimici şi fiziciRezistent la temperaturi şi pH extreme, desicare, radiaţii, agenţi chimici şi fizici În condiţii favorabile sporul germinează, dezvoltându-se forma vegetativă.În condiţii favorabile sporul germinează, dezvoltându-se forma vegetativă. Forma sporului (sferică, ovală) şi poziţia în celulă (centrală, subterminală, terminală) sunt caractere utile în identificarea bacteriilor.Forma sporului (sferică, ovală) şi poziţia în celulă (centrală, subterminală, terminală) sunt caractere utile în identificarea bacteriilor.

Pozitia sporului in celula: central; subterminal; terminal; terminal, cu deformarea celuleiPozitia sporului in celula: central; subterminal; terminal; terminal, cu deformarea celuleiStructura sporului:Structura sporului:

exosporexospor tunica externa = straturi proteice tunica externa = straturi proteice rezistenta la subst. chimice (ex. apa oxigenata) rezistenta la subst. chimice (ex. apa oxigenata) tunica interna ???tunica interna ??? cortex = PG cortex = PG inlaturare osmotica a apei inlaturare osmotica a apei dehidratare dehidratare PC sporalPC sporal protoplast = nucleoid + ribosomi + E de reparare ADNprotoplast = nucleoid + ribosomi + E de reparare ADN

15% masa uscata spor = dipicolinat de Ca, localizat in protoplast 15% masa uscata spor = dipicolinat de Ca, localizat in protoplast stabilizare ADN stabilizare ADNADN asociat la DNA binding proteins ADN asociat la DNA binding proteins protectie contra temperaturii inalte, radiatiilor, desicatiei protectie contra temperaturii inalte, radiatiilor, desicatiei

Stadiile sporogenezeiStadiile sporogenezei (durata 36-72 ore); stimul – carenta alimetara (durata 36-72 ore); stimul – carenta alimetaraStadiul I – se formează filamentul axial, compus din ADNStadiul I – se formează filamentul axial, compus din ADNStadiul II – divizarea asimetrică a citoplasmei printr-un sept, formarea Stadiul II – divizarea asimetrică a citoplasmei printr-un sept, formarea presporuluipresporului, care conţi, care conţinne un filament de ADN. MCt înglobează e un filament de ADN. MCt înglobează presporul.presporul.Stadiul III – înglobarea completă a presporului, care este limitat de 2 membraneStadiul III – înglobarea completă a presporului, care este limitat de 2 membraneStadiul IV – formarea Stadiul IV – formarea cortexuluicortexului de PG între cele 2 membrane de PG între cele 2 membraneStadiile V-VI – formarea Stadiile V-VI – formarea tunicii proteicetunicii proteice la exterior şi maturarea sporului. Uneori se formează un înveliş extern suplimentar - exosporiu la exterior şi maturarea sporului. Uneori se formează un înveliş extern suplimentar - exosporiuStadiul VII – sporul Stadiul VII – sporul matur matur este eliberat iar celula-mamă se dezintegrează este eliberat iar celula-mamă se dezintegrează

Germinarea sporului: activare (reversibil); germinatie; crestereEvidenţiereaEvidenţierea sporilor sporilor: colorarea după AUJESZKY: colorarea după AUJESZKY

14. Capsula bacteriilor. Compozitita chimica si functiile biologice. Metodele pozitive si negative de colorare a capsulei. Exemple de bacterii capsulate, de desenat. Capsula formata din polimeri organici sintetizati in mediul natural de existenta al bct.Se disting: Se disting:

Capsula adevăratăCapsula adevărată (peste 0,2 (peste 0,2µµm), vizibilă la microscopul opticm), vizibilă la microscopul optic MicrocapsulaMicrocapsula, detectată la microscopul electronic, detectată la microscopul electronic Capsula flexibilăCapsula flexibilă (slime, glicocalix), o reţea laxă de fibre poli (slime, glicocalix), o reţea laxă de fibre polizzaharidice, care difuzează în mediu. Nu se evidenţiază microscopicaharidice, care difuzează în mediu. Nu se evidenţiază microscopic. A. Asigură sigură

formarea biofilmelor bacteriene – ansamblu structurat de celule bacteriene înglobate întro matrice de polimeri de origine bacteriană, care formarea biofilmelor bacteriene – ansamblu structurat de celule bacteriene înglobate întro matrice de polimeri de origine bacteriană, care poate adera la suprafeţe inerte (ex.: cateter, stimulator cardiac, endoproteze, sonde de intubare, etc) sau ţesuturi vii. poate adera la suprafeţe inerte (ex.: cateter, stimulator cardiac, endoproteze, sonde de intubare, etc) sau ţesuturi vii.

Compoziţia chimicăCompoziţia chimică: apă şi substanţe organice (poli: apă şi substanţe organice (polizzaharide, mucopolizaharide, peptide) aharide, mucopolizaharide, peptide) Bacillus anthracis – Bacillus anthracis – acid glutamicacid glutamic Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae – Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae – PZPZ Streptococcus pyogenes – Streptococcus pyogenes – acid hialuronicacid hialuronic

Funcţiile capsuleiFuncţiile capsulei: : 1.1. Impiedică desicarea bacteriei ([apa] marita)Impiedică desicarea bacteriei ([apa] marita)2.2. Barieră de permeabilitate pentru substanţe toxice (Barieră de permeabilitate pentru substanţe toxice (antibioticeantibiotice, ioni metalici), ioni metalici)3.3. Barieră protectoare faţa de factori antiinfecţioşi (complement, fagocite), bacteriofagi, protozoareBarieră protectoare faţa de factori antiinfecţioşi (complement, fagocite), bacteriofagi, protozoare4.4. Rezervă nutritivăRezervă nutritivă5.5. Aderarea bacteriei la substrat – ţesuturi sau suporturi inerteAderarea bacteriei la substrat – ţesuturi sau suporturi inerte6.6. Specificitate Ag de specie sau tip (Specificitate Ag de specie sau tip (Ag KAg K))

S. pneumonia: patogenitate marita in prezenta capsuleS. pneumonia: patogenitate marita in prezenta capsule

Evidenţierea capsuleiEvidenţierea capsuleiColoraţia Burri-Hinss – Coloraţia Burri-Hinss – coloratie negativăcoloratie negativă

Pe lamă se amestecă suspensia bacteriană cu tuş de China, se etalează, se usucăPe lamă se amestecă suspensia bacteriană cu tuş de China, se etalează, se usucă Frotiul se fixează cu alcoolFrotiul se fixează cu alcoolSe colorează frotiul cu fucsinăSe colorează frotiul cu fucsină apoas apoasăă

4

Page 5: Microbiologie Exam

RezultatulRezultatul: capsula apare ca un halou incolor pe fondul negru. Citoplasma : capsula apare ca un halou incolor pe fondul negru. Citoplasma bacteriilor bacteriilor se colorează în roşu.se colorează în roşu.Coloraţia Romanovski – Giemsa (capsula se colorează în roz) – Coloraţia Romanovski – Giemsa (capsula se colorează în roz) – coloraţie pozitivăcoloraţie pozitivă

15. Flagelii. Structura si compozitia chimica. Clasificarea bacteriilor dupa amplasarea si numarul flagelilor. Metodele directe de studiere si evidentiere a flagelilor. Coloratia Loeffler. Pilii bacterieni, tipurile.Flageli = structuri filamentoase proteice.Flageli = structuri filamentoase proteice.Rol: mobilitate; Rol: mobilitate; Ag HAg HTipurile de bacterii după dispoziţia flagelilorTipurile de bacterii după dispoziţia flagelilor

monotrichemonotriche (Pseudomonas) (Pseudomonas) lofotrichelofotriche = un mănunchi de flageli la o extremitate (Spirillum) = un mănunchi de flageli la o extremitate (Spirillum) amfitricheamfitriche = câte = câte un flagel sau un flagel sau un mănunchi un mănunchi de flageli de flageli la fiecare extremitatela fiecare extremitate peritricheperitriche = flageli pe toată suprafaţa celulei (Proteus vulgaris) = flageli pe toată suprafaţa celulei (Proteus vulgaris)

La spirochete flagelii se plasează în spaţiul periplasmic – flageli interni, periplasmatici.La spirochete flagelii se plasează în spaţiul periplasmic – flageli interni, periplasmatici.Structura flagelStructura flagel

1. filament = helicoidal, alcatuit din flagelina2. cirlig de articulatie3. corp bazal

G+ inel intern (MCt) inel extern (PG)

G- disc M (Mct) disc S (spatiu periplasmatic) disc P (PG) disc LPZ (MEx)

Sinteza flagel = proprietate de autoasamblareRotire flagel E. coli = 270/sMotilitatea e determinate de chemotaxis. Bct nu allege directia de miscare, cid oar determina daca trebuie sau nu sa continuie miscarea in aceeasi directie.Evidentierea flagelilor:

microscopie electronic coloratie Loeffler (mordansarea cu tanină, săruri de aluminiu, fer, apoi colorarea cu fucsină sau albastru de metilen)(mordansarea cu tanină, săruri de aluminiu, fer, apoi colorarea cu fucsină sau albastru de metilen)

Pilii comuni (fimbriile) –Pilii comuni (fimbriile) – elemente proteice fine, rigide, scurte, pe bct G-. elemente proteice fine, rigide, scurte, pe bct G-.Structura: prot. pilina, fixate de MEx. Numărul fimbriilor per celulăStructura: prot. pilina, fixate de MEx. Numărul fimbriilor per celulă:: sute. sute.Rol pili:Rol pili:

1.1. adeziunea bacteriilor la suprafeţe inerte, la celule sau alte bacteriiadeziunea bacteriilor la suprafeţe inerte, la celule sau alte bacterii2.2. Ag FAg F

Pili conjugativiPili conjugativi – structuri capiliforme de natură proteică, prezenţi în număr de 1-10 per celulă (codificati de plasmide conjugative F). – structuri capiliforme de natură proteică, prezenţi în număr de 1-10 per celulă (codificati de plasmide conjugative F).Rol pili conjugativi:Rol pili conjugativi:

1.1. transferul de ADN prin conjugaretransferul de ADN prin conjugare2.2. R pentru unii bacteriofagiR pentru unii bacteriofagi

Evidenţierea pililorEvidenţierea pililor: microscopia electronică: microscopia electronică

16. Metodele indirecte de studiere a mobilitatii bacteriilor. Pregatirea preparatelor native. Metodele de examinare. Principiul microscopiei cu fond negru si contrast de faza. Studierea preparatelor native “picătură suspendată” sau “între lamă şi lamelă” (microscopia cu contrast de fază sau pe fond negru).Studierea preparatelor native “picătură suspendată” sau “între lamă şi lamelă” (microscopia cu contrast de fază sau pe fond negru).Însămânţarea Însămânţarea culturii bacteriene culturii bacteriene înîn medii semisolide (medii semisolide (se observse observăă turbiditate) .turbiditate) .Creşterea Creşterea culturii culturii “în văl” pe suprafaţa mediului solid.“în văl” pe suprafaţa mediului solid.

17. Granulatiile de volutina. Compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Coloratia Loeffler si Neisser. Mecanismul si tehnica de colorare. Exemple de bacterii cu granulatii de volutina. Importanta practica. Tipuri de incluziuni Ct:

glicogen sau PHB (poli-beta-hidroxibutirat) vacuole de gaz plutire (ex. cianobacterii) magnetosomi = incluziuni de Fe sub forma de magnetit --. orientare in cimpul magnetic al pamintului granule de volutina (polimetafosfat) = granule metacromatice

La tratarea cu unii coloranţi bazici granulele de volutină se colorează în altă culoare, de ex. în roşu-violet La tratarea cu unii coloranţi bazici granulele de volutină se colorează în altă culoare, de ex. în roşu-violet la colorarea la colorarea cu albastru de metilen – cu albastru de metilen – fenomenul metacromaziei.fenomenul metacromaziei.Rol granule de volutina:

1. rezerva energetic2. sursa de fosfati sinteza AN3. scadere presiune osmotic

Interesul medicalInteresul medical: la agen: la agentultul difteriei, difteriei, Corynebacterium diphtheriae,Corynebacterium diphtheriae, granulele de volutină se localizează la extremităţile celulei, iar la granulele de volutină se localizează la extremităţile celulei, iar la corynebacterii nepatogene sunt repartizate corynebacterii nepatogene sunt repartizate neuniformneuniform în citoplasmă. în citoplasmă.EvidenţiereaEvidenţierea: metoda Loeffler, metoda Neisser: metoda Loeffler, metoda Neisser

18. Morfologia si ultrastructura spirochetelor. Clasificarea. Metodele de studiere. Speciile patogene si diferenţierea lor. Sunt germeni helicoidali,mobili.au corpul compus din mai multe spire. Miscarile sunt datorate unui aparat locomotor,care consta din fibrile dispuse pe toata lungimea corpului intre perete si membrana. Peretele este elastic, format din glucide, lipide, polipeptide. Nu sunt rezistente in mediul extern. (Nu rezista la variatii de temperatura,sunt sensibile la peniciline si cefalosporine)

Familia Spirochaetaceae, cuprinde 3 genuri, toate avind importanta in patologia umana.1. Genul Treponema(se subdivid in specii patogene,si saprofite.)Cele patogene... Treponema pertenue Treponema carateum Treponema pallidum2. Genul Leptospira

5

Page 6: Microbiologie Exam

Din specii saprofite.Leptospira biflexa Din specii patogene-L.Icterohaemorrhagiae(rezervorul soarecele)

-L.grippotyphosa(rezervorul soarecele) -L.pomona(rezervorul porcul) -L.canicola(rezervorul cainele)

3. Genul BorreliaPatogenitatea.

Treponema este patogena prin multiplicarea intracelulara si prin invazivitate.Boala se numeste Sifilis. Leptospirele sunt patogene prin multiplicare.Produc boala numita Leptospiroza,care este o antropozoonoza. Borrelia sunt patogene prin multiplicare si invazivitate.Produc borrelioze,care sunt boli generalizate.

Caractere morfologice Treponema. Are 10-15 spire regulate, rigide cu capetele drepte. Intre perete si membrana are fibrile, care ii confera mobilitate,prezinta

miscari de rotatie si flexie. Se coloreaza Giemsa slab,dar se coloreaza prin impregnare argentica, coloratia Fontana-Tribondeau, germenii apar bruni pe fond bej.

Leptospira. Corpul are 10-12 sppire,nedeformabile,mici,regulate,cu capete rasucite. Aparatul locomotor este alcatuit dintr-o singura fibrila dispusa intre membrana si perete,care este foarte elastic. Se coloreaza Giemsa,dar foarte greu. Nu se coloreaza cu Gram

Borrelia. Corpul alcatuit din 5-6 spire neregulate sideformabile in cursul miscarilor,avind capete drepte.Aparatul locomotor este alcatuit dintr-un manunchi de 30 de fibrile dispuse intre membrana si pereteSe coloreaza Gram,fiind Gram-negative

19. Morfologia si ultrastructura micoplasmelor si chlamidiilor. Metodele de studiere. Speciile patogene. Micoplasmele sunt bacterii:

Delimitate numai de o membrana trilaminata si lipsite de perete celular rigid ca si de informatia genetica necesara sintezei precursorilor specifici peretelui.

Forme mici si polimorfe Se cultiva pe medii acelulare ,iar cultura este inhibata de anticorpii specifici. Se inmulteste intr.un ciclu care include alternativ,elongarea si fragmentarea unor forme filamentoase in forme cocoide si diviziunea

acestora.Se examineaza in functie de localizarea infectiei,sputa sau exudatul nazofaringian,urina,prelevate prin laparoscopia pelvina. Microscopia directa este fara valori,coloratiile uzuale nu pot depista micoplasmele din cauza dimensiunilor reduse...iar coloratia imunofluorescenta nu a dat rezultate satisfacatoare. Izolarea si identificarea. Coloratia Dienes,coloniile de micoplasme se coloreaza in violet si acoperite cu o lamele pot fie examinate cu imersie.Specii patogene. Din cele 80 de specii de Mzcoplasme,gazduite de cele mai diverse vertebrate,omul gazduieste numai 10,din care doar 3 sunt patogene. Din cele 3 specii= M. Genitalum (tractul urogenital inferior) M. hominis, M. Pneumoniae (cai respiratorii).Chlamidiile sunt minuscule bacterii cocoide, parazite energetic, total dependente de ATP-ul oferit de celula gazdă, dar capabile de biosinteze proprii. Nu cultivă pe medii artificiale. Se reproduc lntr-un ciclu complex In care identificăm: forma infectiva extracelulară, corpul elementar cu diametrul de 200—300 nm şi perete gros, endocitată decelula gazdă, unde se transformă in forma vegetativă, corpul reticulat. Acesta creşte până la 600—1000 nm in diametru şi se divide repetat, formând microcolonii (incluziuni citoplasmice) in care corpii reticulaţi se maturează in noi corpi elementari eliberaţi prin liza celulei gazdă.Microscopia este cea mai uzuală metoda de diagnostic direct al infecţiilor cu C.trackomatiSy biovarul trahomului. Se urmăreşte prezenţa incluziunilor citoplasmice prin coloraţia Giemsa, coloraţia cu iod sau coloraţia imunofluorescentă.Coloraţia Giemsa are sensibilitate bună pentru diagnosticul trahomului in faza acută şi al conjunctivitelor neonatale. Este mai puţin satisfăcătoare pentru diagnosticul trahomului In faza cronică, a conjunctivitei, uretritei şi cervicitei cu incluziuni. Nu are valoare pentru diagnosticul limfogranulomatozei veneriene şi a infecţiilor cu C. pneumoniae sau C. psittaci.Coloraţia cu soluţie Lugol este cel mai puţin sensibilă, pentru că glicogenul apare in matricea incluziunilor numai lntr-o anumită fază a ciclului evolutiv. Poate da rezultate fals pozitive din cauza prezenţei glicogenului în celulele scuamoase. Are indicaţii pentru triajul suspecţilor in zonele cu trahom endemic.Coloraţia imunofluorescentă cu anticorpi monoclonali specifici de specie este cea mai sensibilă şi specifică metodă. Depistează nu numai incluziunile citoplasmice, ci şi corpii elementari prezenţi in exsudate sau epicelular.

20. Notiuni de sterilizare, obiect steril si nesteril. Sterilizarea cu vapori fluizi si sub presiune. Obiectele si regimurile sterilizarii. Controlul eficienţei sterilizării.

Sterilizarea este distrugerea sau indepartare tuturor microorganismelor,inclusiv a sporilor.Sterilizarea prin caldura umeda,se face cu ajutorul autoclavului prin vapori sub presiune,care realizeaza 115C,la 0,5atmosfere,121C la o

atmosfera si 134c la 2 atmosfere.Autoclavul este un cazan cu pereti rezistenti in care dupa inchiderea cu un capac masiv,presat cu buloane sau sistem cabestan,vaporii de apa se

comprima la presiunea necesara sterilizarii.Autoclavele cu peretele simplu pot fi verticale si orizontale.Se sterilizeaza sticlaria pentru culturi de celule si aparatele de filtrare.Procedura Se toarne apa in cazan,pina la 2-3 cm,prin incinta de sterilizare Se aseaza pe suport obiectele de sterilizat in ambalajul lor.(flacoane,eprubete,cosuri din sirma,cutii,casolete...)cu capacele semideschise Se inchide etans capacul autoclavului Se conecteaza sursa de caldura Se deschide robinetul pentru evacuarea aerului.dupa ce aerul este complet evacuat din incinta de sterilizare... Se inchide robinetul de evacuare a aerului Cind presiunea ajunge la valoarea aleasa se regleaza sursa de caldura,pentru a mentine o presiune constanta,pe toata durata timpului de

sterilizare. Se intrerupe sursa de caldura,pentru a se raci aparatul,se deschid lent robinetul de vapori,apoi capacul. Se lasa materialele pentru uscare in autoclava deschisa

21. Notiuni de sterilizare, obiect steril si nesteril. Sterilizarea cu aer fierbinte. Obiectele si regimurile sterilizarii. Controlul eficienţei sterilizării.Sterilitate este distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor, inclusiv al sporilor.Obiect steril- obiect care a fost prelucrat special si au fost distruse sau indepartate toate microorganismele(inclusiv sporii) de pe el si la insamantare prezinta lipsa cresterii.

6

Page 7: Microbiologie Exam

Obiect nesteril- obiect care a intrat in contact cu mediul inconjurator sau cu bolnavul si care la insamantare prezita prezenta crestiiSterilizarea cu aer fierbinte(cald):Indicatii: Obiecte din sticla (eprubete, flacoane, pipete) sau din portelan (mojare, pistile), seringi Luer din sticla, instrument chirurgical, substante grase, pulberi termostabile.Se realizeaza in etuva la temperature de 160-180 grade Celsius timp de o ora. Suplimentar inca o ora in cazul ambalajelor voluminoase sau obiectelor care se incalzesc greu. Etuva e o incinta cilindrica cu pereti dubli din table termoizolati.Un thermostat care mentine temperature. Un sistem de ventilare care uniformizeaza temperature.Procedura: Obiectele sterilizarii se pun pe rafturi cu spatii intre ele pentru libera circulatie al aerului cald. Se inchide etuva. Se deschid orificiile de ventilare si se conecteaza la retea. Se marcheaza timpul de sterilizare. Obiectele se scot numai dupa racirea aparatului.Controlul eficientei sterilizarii: 3 tipuri de indicatori; fizici (manometru, termometru), chimici (floare de sulf (autoclave) se topeste la 115 grade C, acid benzoic(autoclava) se topeste la 121-122 grade C, tiouree (etuva) se topeste la 180 grade) si biologici: tuburi cu fire de bumbac cu spori, dupa sterilizare se insemanteaza.

22. Notiuni de sterilizare, aseptica si antiseptica. Metoda mecanică de sterilizare. Aplicarea practica. Tipurile de filtre. Conservantii.Asepsia inseamna manipularea la adapost de microorganism. Antisepsia inseamna distrugerea microorganismelor de pe instrumentele de manipulare.Filtrarea este trecerea unui fluid printr-un corp poros – filtru.Filtrele cu porozitati convenabilepot debarasa de microorganism fluidul filtrate, acestea fiind retinute mechanic si electrostatic in porii filtrului.Se aplica pentru sterilizarea aerului, a unor medii de cultura pentru microbe, a medicamentelor care nu suporta incalzirea.Tipuri de filtre: Clasice Din portelan, sau pamant de infuzorii cu forma unor lumanari goale pe dinauntru si inchise la un capat (bujii filtrante) placi filtrante din azbest impregnate cu caolin (filter Seitz sau sticla poroasa (filter Schott). Sau membrane filtrante din acetat de celuloza cu porozitati intre 8 si 0,025 µm. Filtrarea se face prin aspiratie sau presiune pozitiva(adaptata la o seringa). Pentru a evita colmatarea porilor suspensiile cu densitate mare a particulelor sunt prefiltrate printr-un material fibros sau granular.Conservanti (agenti chimici) Substante utilizate la pastrarea preparatelor

Substanta Domeniu de utilizare Concentratia%Fenol Seruri immune, Vaccinuri 0.3-0,5 %Mertiolat de Sodiu Seruri immune, preparate injectabile 0,004-0,02Feniol +mertiolat Seruri immune, Colire 0,2+0,005 ; 0,002+0,01Benzoat de sodium Unguente, Emulsii, Alimente 0,2-1

Conservarea prin agenti fizici: Pasteurizarea - Incalzirea la 62-85° distruge formele vegetative si nu sporii. Refrigerarea imediata la 4°C prin soc termic completeaza efectul microbicid. Refrigerarea la 4°c se foloseste pe larg.Congelarea - Efect antimicrobian minim la racirea sub punctual eutectic (-21,3°C) se evita formarea cristalelor de ghiata. Sau in azot lichid (-196°C). Liofilizarea - Desicarea se foloseste in microbiologie pentru conservarea indefinite al tulpinilor unor bacteria sporulate. Liofilizarea se foloseste pentru conservarea microorganismelor, serurilor immune si al unor reactivi biologici. In esenta e o criodesicare.

23. Metabolismul microbian. Particularităţile. Enzimele bacteriene. Clasificarea, rolul in fiziologia microbiană. Aplicarea practică in microbiologie.Metabolismul bacterian = ansamblu de reacţii biochimice care au loc în celula vie, format din cata- si ana- bolism.Particularităţile metabolismului bacterian:

1. metabolism unicelular, necompartimentat (toate procesele metabolice intr-o singură celulă)2. foarte flexibil, diverse căi metabolice (adaptare rapida la condiţiile mediului)3. foarte intens (viteza reacţiilor este mare)4. produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct în calitate de precursori pentru reacţiile anabolice (amfibolism) 5. prezenta catalizatori proteici specifici – enzime

Caracter special al E bct: active în limite largi de temperaturi (0-65°C) şi de pH (2-9) Clasificare E:

Constitutive, permanente Inductive, adaptive, se sintetizează în prezenţa substratului (ex.: lactaza) Represive, sinteza lor este inhibată de acumularea în exces a produsului reacţiei catalizate

După locul de acţiune (exoenzime, endoenzime)După tipul reacţiei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)După impactul asupra ma/o

Enzime metabolice Enzime de patogenitate (hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza)

Importanţa practică a studierii enzimelor1. Identificarea şi clasificarea bacteriilor (enzimele determină activitatea biochimică specifică a bacteriilor)2. Substrat pt unele AB3. Determinarea mecanismelor patogenezei infecţiilor (unele enzime sunt responsabile de producerea leziunilor în ţesutul gazdei)4. Aplicarea industrială a enzimelor

24. Nutriţia bacteriilor. Tipul nutriţiei si mecanismele transportului nutrienţilor in celula bacteriană. Clasificarea m/o dupa sursele de carbon. Notiune de m/o saprofite si parazite.Nutriţia – modalităţile prin care bacteriile asimilează din mediu substanţele necesare pentru metabolism. Modul (tipul) de nutriţie = absorbtiv. Nutritii se obtin prin solvire (săruri minerale, CO2, O2) sau după o digestie prealabilă (proteine, polizaharide, lipide).Digestia: G+ extracelulară; G- în spaţiul periplasmicTransportul transmembranar:

1. Difuzie simplă: O2, CO2, AG, nutrienţi liposolubili2. Difuzie facilitată (permeaze): molecule mari 3. Transport activ (proteine de transport specifice = ABCtransportori)4. Translocaţie – substratul este modificat (ex.: fosforilat) în timpul transportului membranar; necesită energie. 5. transport Fe = secretie siderofori

Excreţia metaboliţilor – difuzie, proteine de transport, liza bacterieiNecesităţile nutritive ale bacteriilor

7

Page 8: Microbiologie Exam

Necesităţi elementare, de bază: C, H, O, N în cantităţi importante, S, P, Fe, Ca, Mg, K în cantităţi mici şi urme de Co, Cu, Zn, Mo Necesităţi specifice:

bct prototrofe = capabile a-şi realiza integral sinteza metaboliţilor esenţiali bct auxotrofe - solicită suplimentar compuşi organici preformaţi (factori de creştere), care nu pot fi sintetizaţi de bacterie (ex.:

AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezenţa lor în mediul de cultură este indispensabilă creşterii acestor bacterii. Clasificarea bacteriilor după sursa de carbon

Bacterii autotrofe – utilizează CO2 ca unică sursă de carbon (nepatogene)Bacterii heterotrofe – utilizează carbonul din compuşii organici (glucide, acizi graşi, alcooli, etc)

Bacteriile care utilizează materia organică moartă sunt saprofite (reciclarea materiei organice)Bacteriile parazite (obligate, facultative) trăiesc pe contul organismelor vii, aducându-le prejudiciiBacteriile patogene reprezintă parazite care afectează grav gazda, provocând maladie sau moarte.

25. Clasificarea m/o dupa sursele de energie. Mecanismele de obtinere a energiei la bacteriile chemoorganotrofe. Clasificarea m/o dupa tipul de respiratie. Exemple.Clasificarea bacteriilor după sursa de energie

fototrofe – utilizează energia solară (fotosint) chemotrofe – folosesc energia degajată din reacţiile chimice de oxido-reducere. Ele necesită un substrat donor de hidrogen (e- şi H+) şi

un substrat acceptor de hidrogen. chemolitotrofe – donorul de H = substanţă anorganică chemoorganotrofe – donorul de H = substanţă organică (glucoza, lipide...)

Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofeMecanismele de obţinere a energiei la chemoorganotrofe în funcţie de acceptorul final de H :

Respiraţie aerobă. Acceptorul final este oxigenul gazos. Implică lanţul respirator de transport al electronilor asociat MCt. Produs final – H2O sau H2O2 .

Respiraţie anaerobă. Acceptori finali – compuşi anorganici (nitrat, sulfat, S). Transportul de electroni prin lanţul respirator. Produse finale – nitritul, amoniacul, sulfura (în prezenţa O – H2O2).

Fermentaţie. Substratul organic este metabolizat fără intervenţia unui agent oxidant extern. Constă în procese de ox-red care realizează numai o oxidare parţială a substratului, donorul şi acceptorul de H+ fiind substanţe organice. Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o moleculă mai oxidată (ex.: fermentare lactică, fermentare alcoolică, acidă mixtă, acetoinică, etc). Fermentaţia se poate desfăşura în prezenţa O2, dar fără intervenţia acestuia.

Clasificarea bacteriilor după sursele de energie şi carbon: fotoautotrofe (energie solară, CO2); fotoheterotrofe (en. sol., subst.org); chemoautotrofe; chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe).

26. Cresterea si multiplicarea bacteriilor. Fazele multiplicarii culturilor periodice (discontinue) de bacterii. Cultivarea bacteriilor si conditiile (principiile) necesare pentru cultivare. Creşterea – mărirea coordonată a masei şi volumului structurilor bacteriene ca rezultat al proceselor de sinteză.Multiplicarea – creşterea numărului de celule pe o unitate de suprafaţă sau de volum. Diviziune binară; Înmugurire (levuri, ciuperci levuriforme); Autoreproducere (virusuri); Spori (micete); Fragmentare (actinomicete)

Ciclul celular – procesele care au loc de la formarea celulei pâna la următoarea diviziune.Faza C – replicarea ADNFaza G – de latenţă, segregarea cromozomilorFaza D – de diviziune, formarea septului

Replicarea ADN depinde de masa critică a celulei, iar separarea cromozomilor şi diviziunea intervin în momentul când celula atinge o lungime – limită.Perioada dintre 2 diviziuni reprezintă timpul (perioada) de generaţie (TG). Durata TG depinde de specie şi de condiţiile de creştere (condiţii optime viteză maximă).Creşterea bacteriilor în laborator – cultivare izolareRolul izolarii bct:

1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic) 2. Testatea sensibilităţii lor faţă de AB3. Obţinere produşi de biosinteză (AB, aa), bioconversie (hormoni steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, etc), producerea

vaccinurilor, probioticelor... Pentru creştere bacteriile au nevoie de nutrienţi şi condiţii fizico-chimice adecvate. Condiţiile (principiile) de cultivare: Sursă nutritivă adecvată; Sursă de energie; Apă; Temperatura potrivită; pH adecvat; Concentraţie optimă a oxigenului şi a CO2; Presiune osmotică adecvatăTemperatura de creştereExistă temperaturi minime, maxime şi optime de dezvoltare a bacteriilor. În raport cu temperatura optimă deosebim:

psichrofile – tº optimă 10-20º C. Cresc şi la 0º C. mezofile – optimum 30-37º C (limite 15-45º C) termofile – optimum 50-60º C (până la 95º C) hipertermofile (cresc la 70–110º C)

pH neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) – pH 6-7,5 acidofile – pH 2-6 (Lactobacillus) alcalofile – pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)

Presiunea osmotică halotolerante (osmotolerante) – cresc în concentraţii reduse de NaCl (mediu izotonic cu mediul intern al gazdei) – mi/o patogene halofile – preferă concentraţii mari de NaCl (1-30%) – stafilococi, vibrioni (Vibrio parahaemolyticus)

Oxigenul strict aerobe – cresc doar în prezenţa O2. Obţin energia prin respiraţie aerobă microaerofile – necesită concentraţii reduse de O2 şi 2-10% CO2. Obţin energia prin respiraţie sau fermentaţie. Neisseria, Brucella,

Campylobacter strict anaerobe – cresc doar în absenţa O2. Obţin energia prin fermentaţie sau uneori respiraţie anaerobă. Absenţa catalazei,

superoxid dismutazei, peroxidazei. Clostridium, Bacteroides anaerobe aerotolerante – pot creşte în prezenţa O2, obţin energia prin fermentaţie, posedă peroxidază Lactobacillus, streptococi

8

Page 9: Microbiologie Exam

facultativ anaerobe – cresc în orice condiţii, obţin energia prin respiraţie sau fermentaţie 27. Mediile de cultura. Principiile de clasificare. Mediile uzuale. Componenta. Destinatia lor. Manifestarea cresterii bacteriilor in medii lichide si solide. MC = soluţii/substrate solide, asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice pt cultivarea bct. Pot fi utilizate pt: cultivarea (izolarea) bacteriilor; testarea sensibilităţii la AB; stocarea sau transportul culturilor bacreiene.Cerinţele faţă de MC:a. necesităţile nutritive şi energetice bctb. umiditate optimalăc. pH optimal (7,2-7,4) şi constant (caracter de tampon) d. potenţial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi – rH2>10)e. izotonic (0,5% NaCl)f. steril şi transparent

Clasificarea MC: După provenienţă

Empirice, naturale. Au la bază produse de origine animală sau vegetală (sânge, ser, lapte, ouă, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, peşte, levuri, etc). Compoziţia chimică precisă nu poate fi controlată.

Sintetice – includ ingrediente chimice pure, compoziţia chimică este cunoscută cu exactitate Semisintetice

După consistenţă Lichide (bulion)– utilizate pentru obţinerea biomasei bacteriene şi a produselor lor (AB, E, toxine) Solide – conţin 10-15% gelatină sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roşii, t° topire – 80-100°C, solidificare – 42°C). Placa

de geloză în cutii Petri izolarea culturilor pure; geloza înclinată (în pantă) acumularea culturilor pure. Semisolide – 0,2 – 0,5 % agar-agar. Se utilizează pentru studierea activităţii biochimice sau a mobilităţii bacteriilor.

După compoziţia chimică (complexitate) şi destinaţie Medii uzuale (universale, simple)

Apă peptonată (apă+1% peptonă+0,5% NaCl) Bulion peptonat – BP (extract apos din carne + 1% peptonă+0,5% NaCl) Geloza nutritivă (BP + 2-3% agar-agar) Gelatina nutritivă (BP + 10-15% gelatină)

Sunt utilizate pentru creşterea bacteriilor nepretenţioase la cultivareSterilizarea prin autoclavare: 120°C, 20 min

Medii complexe: elective selective:

pe mediu solid pe mediu lichid = mediu de imbogatire

diferential-diagnostice (DD) izolare cultura pura multitest, pt acumulare cultura pura si identificare preliminara identificare finala

speciale de transport

Medii elective – formate din medii simple cu adaos de componente care permit creşterea mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloză-sânge – streptococi, neisserii; ser coagulat – corinebacterii, etc)Medii selective – medii solide cu adaos de componente sau cu condiţii fizico-chimice particulare care stimulează creşterea unor specii şi inhibă creşterea altor specii (geloza salină - stafilococi, geloza alcalină - vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc) Mediile de îmbogăţire reprezintă medii selective lichide, utilizate pentru îmbogăţirea florei patogene şi inhibarea florei de asociaţie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale)

a. Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit)b. Mediul Kauffmann (mediul Muller+bilă+verde de briliant) – Salmonellac. Bulion cu selenit – Shigella, Salmonellad. Apă peptonată alcalină (pH=8) –Vibrio choleraee. Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoză+bucăţi de ficat) – pentru anaerobi

Medii diferenţial-diagnostice (DD) – permit diferenţierea speciilor bacteriene în baza activităţii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere…)Sunt construite după următoarea schemă: Bază nutritivă+substrat+indicator (la necesitate)Medii DD pentru izolarea culturii pure

Studierea proprietăţilor zaharolitice Endo (geloză+lactoză+fucsină+hiposulfit de Na)Levin (geloză+lactoză+eozină+albastru metilen)Ploskirev (geloză+lactoză+roşu neutru+săruri de acizi biliari+verde de briliant)Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roşii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin)

Studierea proprietăţilor de oxido-reducere Mediul cu sulfit de Bi – pentru Salmonella (colonii negre – reducerea sulfitului în sulfura de Bi)Mediul Klauberg (geloză-sânge cu telurit de K) –pentru Corynebacterium diphtheriae

Studierea proprietăţilor lipolitice Geloza cu gălbenuş de ou – bacteriile cu lecitinază formează un halou opac în jurul coloniei

Studierea proprietăţilor hemolitice Geloza-sânge (geloza+5-15% sânge defibrinat) – in cazul hemolizei în jurul coloniilor apare o zonă clarăMedii DD multitest pentru acumularea culturii pure şi identificare preliminară Russel –geloză+1% lactoză, 0,1% glucoză, indicatorKligler – identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)Olkeniţki – identic Kligler+1% zaharoză+ureeIndicatorul Andrede – fucsină+NaOH

9

Page 10: Microbiologie Exam

Scindarea glucidelor (acid - A, acid şi gaz - AG) duce la modificarea pH şi virajul culorii mediului din roşu în galben. În pantă se apreciază lactoza/zaharoza (oxidare), în coloană-glucoza (fermentare).

Producerea H2S – înnegrirea mediului Medii DD pentru identificarea finalăŞirul pestriţ Hiss (lichid sau semisolid): tuburi ce conţin soluţii 0,5% de diferite glucide şi indicator. Aprecierea – după modificarea culorii (acid - A) şi apariţia bulelor de gaz (acid şi gaz - AG)Medii cu AA (lizină, arginină, ornitină) şi indicatoriMedii speciale – pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Lowenstein-Jensen –pentru agenţii tuberculozei, Sabouraud – fungi) Medii de transport – transportare/stocare material (prelevat). Menţine în viaţă bacteriile, fără a favoriza multiplicarea lor. Mediul cu glicerină 30%; Soluţie tampon-fosfat; Soluţie NaCl 3%; Mediul Cary-Blair; Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) – pentru anaerobi, neisserii, etc

Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mică de material ce conţine bacterii (inoculum) se întroduce într-un mediu de cultură (însămânţare, inoculare), care ulterior va fi incubat în termostat (pentru asigurarea temperaturii optime). În timpul incubării (18-24-48 ore…..) bacteriile cresc şi se divid, formând o cultură bacteriană (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu). M.tuberculosis – 3-5 săptămâniV.cholerae – 6-12 ore

Cultură pură – formată din bacterii de aceeaşi specie (indispensabilă identificării)Cultură mixtă – compusă din bacterii de specii diferiteTulpină – populaţie microbiană constituită din descendenţii unei singure izolări în cultură pură, care va fi studiată ulterior. Clonă – populaţie care rezultă din multiplicarea unei singure celule

Manifestarea creşterii şi multiplicării bacteriilor În mediu lichid

Turbiditate uniformăFormarea unei pelicule la suprafaţa mediului (vibrioni, yersinia - agentul pestei)Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe pereţi (streptococi, Bacillus anthracis)

În mediu solid – formarea coloniilorColonie – o aglomerare de bacterii care se dezvoltă dintr-o singură celulă sau un grup de celule (UFC - unitate formatoare de colonii) pe suprafaţa unui mediu solid. Fiecare specie bacteriană formează colonii specifice (caracter util în identificare).Caracteristica coloniilor

a. Dimensiuni – colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm)b. Contur (margini) – neted, ondulat, zimţat, lobat, etcc. Suprafaţă – plată, bombată, convexă, ombilicată, etcd. Formă – punctiformă, circulară, filamentoasă, neregulatăe. Culoare (pigmentaţie) – albă, galbenă, aurie, etcf. Densitate – opacă, transparentă, etcg. Consistenţă – cremoasă, untoasă, uscată, mucoidă

Tipurile de colonii: Colonii S (smouth) – rotunde, netede, umede, lucioase; Colonii R (rough) – margini neregulate, suprafaţa uscată, rugoasă

Caracterele de cultură ale bacteriilor = exigenţele nutritive (medii, temperatură, pH, aerare, etc), viteza şi manifestarea creşterii pe medii lichide şi solide

Dinamica multiplicării bacteriilor în culturiÎn funcţie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting:

Culturi discontinue Culturi continue Culturi sincrone

Culturile discontinue se obţin la cultivarea bacteriilor în volum limitat de mediu. Astfel de culturi sunt obţinute şi utilizate în laboratorul microbiologicFazele dezvoltării unei culturi discontinueI. Faza de lag – faza de adaptare la condiţiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc în dimensiuni, dar nu se divid. Durata este variabilă (2-4 ore); depinde de starea bacteriei, condiţiile mediului, etcII. Faza logaritmică – bacteriile cresc şi se divid cu viteză maximală constantă, curba evoluează exponenţial. Bacteriile sunt foarte sensibile la agenţi antimicrobieni (culturi utile pentru testarea sensibilităţii la antibiotice). Durata – 8-10 ore.III. Faza staţionară – rata celulelor care se multiplică scade treptat, numărul celulelor vii rămâne constant mai multe ore. Cauza – consumarea nutrienţilor, acumularea metaboliţilor toxici. Morfologia bacteriilor este tipică speciei, apar incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare). Sensibilitatea la agenţii antimicrobieni scade. Durata – 10-12 ore.IV. Faza de declin (letalitate) – bacteriile mor progresiv. Cultura continuă – se realizează când mediul de cultură este continuu reînnoit şi îmbogăţit cu oxigen cu evacuarea unei cantităţi de cultură. Se realizează în chemostate sau turbidostate, cultura aflându-se permanent în faza exponenţială. Se utilizează în microbiologia industrială. În intestin – culturi continue.Culturi sincrone – culturi în care bacteriile se divid în acelaşi timp. ???

28. Metoda bacteriologică in diagnosticul bolilor infecţioase. Scopul. Prelevate de la pacienţi si din mediul ambiant. Principiile de recoltare, ambalare si transportare in laborator. Pregatirea probelor pentru investigatiile de laborator.

Examenul bacteriologic constă în inocularea prelevatelor pe medii de cultură pentru izolarea culturilor pure de bacterii (tulpinilor) care vor fi ulterior identificate, testate vis-a-vis de antibiotice, eventual conservate. Examenul bacteriologic constă din câteva etape succesive, de la prelevarea (recoltarea) probelor biologice până la remiterea rezultatelorFaza pre-analitică (responsabilitatea medicului)

Prescrierea investigaţiei (în funcţie de datele examenului clinic şi paraclinic). În ordonanţă se fixează identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestările patologice, locul, data apariţiei, alte date: imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc.

Prelevarea probelor

10

Page 11: Microbiologie Exam

- Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicării sau/şi din căile de eliminare a agentului patogen)Materiale de examinat (prelevate) de la pacienţi: Secreţii rino-faringiene, Spută, Puroi, Exudate, Sânge, LCR, Urină, Mase fecale, Bioptate, Material cadavericMateriale de examinat din mediul extern: Apă, Alimente, Sol, Aer, Lavaje, VectoriModul de prelevare (recoltare)

- În recipiente sterile- Respectând regulile de autoprotecţie- La debutul bolii- Până la administrarea antibioticelor

Transportarea- Imediată sau utilizând medii de transport, cu respectarea condiţiilor speciale după necesitate- În ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)

În fişa de însoţire să fie indicată identitatea pacientului, vârsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevării, scopul investigaţiei.

29. Examenul bacteriologic. Etapele de izolare a culturilor pure de bacterii aerobe. Volumul de lucru la fiecare etapa. Principiile de identificare a culturii pure. Examenul bacteriologic = inocularea prelevatel pe MC izolare cultura pura identificare, testare sensibilitate la AB, eventual conservare.Etape examen bacteriologic:

1. Faza pre-analitică (responsabilitatea medicului)Prescrierea investigaţiei (în funcţie de datele examenului clinic şi paraclinic). În ordonanţă se fixează identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestările patologice, locul, data apariţiei, alte date: imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc.

2. Prelevarea probelor Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicării sau/şi din căile de eliminare a agentului patogen)Modul de prelevare (recoltare) :

În recipiente sterile Respectând regulile de autoprotecţie La debutul bolii Până la administrarea antibioticelor

3. Transportarea Imediată sau utilizând medii de transport, cu respectarea condiţiilor speciale după necesitate În ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)

În fişa de însoţire să fie indicată identitatea pacientului, vârsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevării, scopul investigaţiei)Materiale de examinat (prelevate) de la pacienţi: Secreţii rino-faringiene; Spută; Puroi; Exudate; Sânge; LCR; Urină; Mase fecale; Bioptate; Material cadavericMateriale de examinat din mediul extern: Apă; Alimente; Sol; Aer; Lavaje; Vectori, etcEXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURILE AEROBEPrelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) - orientare în diagnostic După necesitate, probele sunt supuse pregătirii pentru investigaţie (diluare, omogenizare, centrifugare, etc)Examinarea microscopică (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Hinss...) – prezenţa mi/o, forma, cantitatea, G+/-.I etapă – IZOLAREA CULTURILOR PURE Scopul izolării - de a obţine o cultură pură dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un produs patologic. Tehnici utilizate:

o Prin epuizarea inoculului pe suprafaţa gelozei din cutia Petri (însămânţare în striuri paralele, însămânţare în cadrane, etalarea consecutivă pe trei cutii).

o Metoda diluţiilor logaritmice a inoculului în geloză topită şi răcită la 50º C (10-1, 10-2,...), apoi turnate în cutii Petri sau eprubete.Incubare în termostat la 37º C, 18-24 h (în funcţie de TG).Metode speciale de izolare în culturi pure: bct sporulate: încălzirea prealabilă a prelevatului 80º C – 20 min; bct acido-rezistente: tratarea prealabilă cu acid a prelevatului şi neutralizarea ulterioară cu o bază; bct din asociaţii cu număr minim de mi/o patogene: îmbogăţirea prealabilă a florei patogene utilizând medii de îmbogăţire; bct cu virulenţă înaltă şi pretenţioase la cultivare: inocularea la animalele de laborator sensibile II etapă – ACUMULAREA CULTURII PUREExaminarea macroscopică a coloniilor crescute (formă, culoare, dimensiuni, etc)Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecte confirmarea purităţii culturiiRepicarea coloniilor suspecte pe geloză în pantă acumularea culturii pureTermostat, 37º C, 18-24 oreIII etapă – IDENTIFICAREA CULTURII PUREVerificarea purităţii culturii (frotiu Gram)Identificarea culturii pure constă în evidenţierea unor caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include într-o familie, gen, specie, variantăSe studiază caracterele: Morfologice; Tinctoriale; De cultură; Biochimice; Antigenice (seroidentificarea); De patogenitate; Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea); Sensibilitatea la ABIV etapă – EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA RĂSPUNSULUICompararea rezultatelor obţinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a găsi asemănări.Exemplu de răspuns: Din proba examinată a fost izolată tulpina de Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibilă la ...., rezistentă la ..... STUDIEREA ACTIVITĂŢII BIOCHIMICE A BACTERIILORActivitatea zaharolitică (şirul Hiss, coagularea laptelui, etc) Activitatea proteoliticăDegradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea laptelui, etc)Evidenţierea enzimelor specifice (urează, decarboxilaze, dezaminaze, etc) prin detectarea produsele finale ale reacţiilor: H2S, NH3, indol… o Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fer de culoare neagră în mediile multitest – Kligler, Olkeniţki, etc; plasarea unei benzi de

hârtie de filtru îmbibată cu acetat de Pb deasupra BP în care creşte cultura studiată (formarea sulfurii de Pb înnegreşte hârtia)o Depistarea indolului (produs al metabolizării triptofanului) – benzi de hârtie îmbibate cu acid oxalic. În prezenţa indolului indicatorul virează

în roz.o Depistarea amoniacului (ureaza) – hârtia de turnesol se colorează în albastru.o Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2): cultura se amestecă cu o picătură de apă oxigenată – apariţia bulelor de gazo Depistarea oxidazei (detectarea prezenţei citocromoxidazei din lanţul respirator)

11

Page 12: Microbiologie Exam

Reactiv – di (tetra)metil-parafenilen-diamină (benzi sau rondele de hârtie îmbibate cu reactiv, creioane, etc)Oxidarea reactivului – culoare violetă-neagrăOxidazo+ : Neisseria, Vibrio, PseudomonasOxidazo- : Enterobacteriaceae o Depistarea lecitinazei – mediu cu gălbenuş de ou 10% - formarea unui halou opac în jurul coloniiloro Depistarea lipazei – mediu cu Twin 80 1%– halou opac în jurul coloniilor (precipitarea acizilor graşi)o Depistarea hemolizinei – geloză-sânge 5-10% - zonă clară în jurul colonieio Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc Probele sunt incubate la 37º C, 18-24 hIdentificarea rapidăUtilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de timp, spaţiu, material)Sistemul API – o galerie din plastic formată din numeroase alveole care conţin fiecare un mediu deshidratat diferit (glucide, AA, etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie bacteriană testată şi incubate. Ulterior la necesitate se adaugă reactive pentru detectarea metaboliţilor particulari.Lectura – conform unui cod de cifre sau computerizat

30. Metodele de creare a condiţiilor de anaerobioză pentru cultivarea anaerobilor. Izolarea culturilor pure prin metoda Zeissler. Volumul de lucru la fiecare etapa. Particularitatile de identificare a culturilor pure. EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene)Condiţia principală – cultivare în absenţa oxigenului Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100º C, 20 min, răcit, acoperit cu vazelină; însămânţarea în geloză în coloană)Crearea condiţiilor de anaerobioză

Metoda fizică – utilizarea anaerostatuluiMetoda chimică – în exicator se întroduc substanţe ce fixează oxigenul (pirogalol+bază); utilizarea gas-pachetelorMetoda biologică Fortner – cultivarea concomitentă a aerobilor şi anaerobilor

Recoltarea – cu precauţie, evitând contactul cu aerul (în seringi, utilizând medii speciale)I etapă – ÎMBOGĂŢIREA ANAEROBILOR

Însămânţarea prelevatului în 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat Încălzirea unui tub la 80º C, 20 min – distrugerea florei nesporogeneIncubarea la 37º C, 24-48 h (va avea loc înmulţirea anaerobilor)

II etapă - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBIStudierea caracterelor de cultură – tulburarea mediului, descompunerea bucăţilor de ficat, etcIzolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (însămânţarea a 0,1 ml din mediul K-T pe 3 cutii cu geloză-sânge glucozată consecutiv). Incubarea în anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h

Metoda Weinberg – diluţii succesive a culturii în geloză glucozată lichefiată şi aspirarea în tuburi lungi şi înguste, închise ermetic. Incubarea în termostat, 24 hIII etapă - ACUMULAREA CULTURII PURE

Studierea macroscopică a coloniilorExaminarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecteRepicarea în mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pureIncubarea în termostat, 24 h

IV etapă - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBIVerificarea purităţii culturii pure (frotiu Gram)Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiţiilor de anaerobioză)

V etapă - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA ŞI ELIBERAREA RĂSPUNSULUI

31. Antagonismul microbian. Tipurile. Mecanismele. Metodele de studiere. Aplicarea practica. Eubioticele. Exemple. BIOTOP – spaţiu cu condiţii de viaţă particulare (conjunctiva, mucoasa intestinală, orofaringe, vagin, tegument, etc), populat şi transformat de asociaţii de fiinţe vii.MICROBIOCENOZĂ (comunitate microbiană) – asociaţii microbiene ce populează un biotop.Microorganismele prezente într-un biotop particular constituie microflora acestui habitat (m/f cutanată, intestinală, etc). Aceasta joacă un rol important în protejarea gazdei faţă de o invazie microbiană ulterioară, actionând prin următoarele mecanisme:

1. competiţia pentru aceiaşi nutrienţi; 2. competiţia pentru aceiaşi R de pe celulele gazdei;3. producţia de bacteriocine; vitamine;4. producerea de acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi; 5. stimularea continuă a sistemului imun;6. stimularea producerii unor factori imuni de protecţie (anticorpii naturali).

Între microorganismele unui biotop se pot stabili relaţii: Indiferente (neutralism) Favorabile (comensalism/satelitism, simbioză/mutualism, sinergism) Defavorabile (parazitism, antagonism) Antagonism – o specie inhibă sau omoară altă specie prin mecanisme specifice sau nespecifice

Mi/o care manifestă activitate inhibitoare – antagonist (A), mi/o care suferă – concurent (C).Antagonism nespecific:Antagonistul este mai activ, utilizând nutrienţii, oxigenul.Antagonistul produce metaboliţi toxici (acizi, indol, H2S, amoniac, peroxid, etc).Antagonism specific – antagonistul produce substanţe cu acţiune specifică asupra unui sau mai multor concurenţi (AB, bacteriocine).Efectul acţiunii unui antagonist asupra concurentului poate fi bacteriostatic sau bactericid (uneori bacteriolitic).Utilizarea practică a antagonismului microbian:

1. depistarea mi/o – producenţi de antibiotice (micete, actinomicete, bacterii)2. obţinerea produselor biologice curative de origine microbiană (probiotice, eubiotice/sinbiotice): Lactobacterina, Colibacterina,

Bifidumbacterina, Bificol, etc3. crearea biocenozelor favorabile organismului

METODELE DE STUDIU AL ANTAGONISMULUI

12

Page 13: Microbiologie Exam

În mediu solid (metoda tranşeei) – antagonistul se însămânţează în centrul cutiei, concurenţii – perpendicular. Termostat 24h. Aprecierea – după dimensiunea zonei de inhibiţie a creşterii culturii concurentului.

În mediu semisolid – I strat – antagonistul, II strat – concurentul. Termostat 24h. Aprecierea – zonă clară între straturi. Însămânţarea în mediu lichid (BP) a unui număr egal de A şi C. După 24 h de incubaţie se reînsămânţează 0,1 ml pe placa cu geloză. Se

compară numărul coloniilor de A şi C.

32. Antibioticele. Notiune. Clasificarea dupa producent, spectrul si efectul de actiune asupra celulei bacteriene. Mecanismele de actiune a antibioticelor. Exemple.ANTIBIOTICE ANTIBIOTICE (AB)(AB)– produse de origine naturală (microbiană, animală sau vegetală), derivaţi semi-sintetici sau produse sintetice care inhibă sau – produse de origine naturală (microbiană, animală sau vegetală), derivaţi semi-sintetici sau produse sintetice care inhibă sau omoară omoară selectiv selectiv unele mi/o sau/şi celule tumoraleunele mi/o sau/şi celule tumorale, f, fără a exercita ca regulă efecte toxice asupra macroorganismului. ără a exercita ca regulă efecte toxice asupra macroorganismului. Clasificarea ABClasificarea AB

După efectul asupra celuleiDupă efectul asupra celulei Bacteriostatic (tetraciclina, cloramfenicolBacteriostatic (tetraciclina, cloramfenicol……)) Bactericid (streptomicina, polimixina)Bactericid (streptomicina, polimixina) Bacteriolitic (peniciline, cefalosporine)Bacteriolitic (peniciline, cefalosporine)

După spectrul de activitateDupă spectrul de activitate spectru restrâns (îngust) de acţiune (AB anti-G+, anti-G-, anti-tuberculoase, anti-micotice, anti-tumorale)spectru restrâns (îngust) de acţiune (AB anti-G+, anti-G-, anti-tuberculoase, anti-micotice, anti-tumorale) spectru larg de acţiune (G+ şi G-)spectru larg de acţiune (G+ şi G-)

După producent (origine)După producent (origine) fungică (peniciline, cefalosporine,...)fungică (peniciline, cefalosporine,...) actinomiceta (aminoglicozide, macrolide, cloramfenicol, etc)actinomiceta (aminoglicozide, macrolide, cloramfenicol, etc) microbiană (bacitracina din microbiană (bacitracina din Bacillus subtilisBacillus subtilis, gramicidina din , gramicidina din Bacillus brevisBacillus brevis, polimixina din , polimixina din Bacillus polimyxaBacillus polimyxa)) vegetală – fitoncidele (alicina, rafanină, imanină)vegetală – fitoncidele (alicina, rafanină, imanină) animală (lizozimul – din albuş de ou, ecmolina – din oase de peşte, eritrina – din masă eritrocitară, splenocitina – din splină)animală (lizozimul – din albuş de ou, ecmolina – din oase de peşte, eritrina – din masă eritrocitară, splenocitina – din splină)

După După compocompoziţia chimică (beta-lactamice, macrolide, aminoglicozide, fenicoli, polipeptide, poliene, sulfamide, chinolone şi ziţia chimică (beta-lactamice, macrolide, aminoglicozide, fenicoli, polipeptide, poliene, sulfamide, chinolone şi fluorochinolone, nitrofurani, etc)fluorochinolone, nitrofurani, etc)

Mecanismul de acţiune al ABMecanismul de acţiune al ABoo AB cu AB cu acţiune asupra sintezei peretelui celularacţiune asupra sintezei peretelui celular (dereglarea sintezei peptidoglicanului) (dereglarea sintezei peptidoglicanului)

Beta-lactamice (peniciline, cefalosporine). Dereglează procesul de sinteză a PG, inhibând transpeptidazele (ţinta - PFP)Beta-lactamice (peniciline, cefalosporine). Dereglează procesul de sinteză a PG, inhibând transpeptidazele (ţinta - PFP)Vancomicina, teicoplanina (blochează transferul pentapeptidului din MCP spre peretele celular)Vancomicina, teicoplanina (blochează transferul pentapeptidului din MCP spre peretele celular)Bacitracina (blochează reciclarea moleculelor de transport transmembranar - bactoprenol)Bacitracina (blochează reciclarea moleculelor de transport transmembranar - bactoprenol)Fosfomicina (blochează piruviltransferaza, implicată în sinteza acidului N-acetil muramic) Fosfomicina (blochează piruviltransferaza, implicată în sinteza acidului N-acetil muramic) Efectul acestor AB este bactericid/litic, doar celulele metabolic active sunt omorâte.Efectul acestor AB este bactericid/litic, doar celulele metabolic active sunt omorâte. Nu afectea Nu afectează celulele eucariote (lipsa PG).ză celulele eucariote (lipsa PG).

oo AB cu AB cu acţiune asupra MEx şi a MCtacţiune asupra MEx şi a MCtAB polipeptidiceAB polipeptidice (polimixina, colistina). Se fixează pe membrane bacteriene (în special pe lipidul A (ME la bacterii G-), provocând dezorganizarea (polimixina, colistina). Se fixează pe membrane bacteriene (în special pe lipidul A (ME la bacterii G-), provocând dezorganizarea lor. Efect bactericid.lor. Efect bactericid.AB polieniceAB polienice (nistatina, levorina, amfotericina B, etc). Se fixează pe sterolii MCP ale micetelor, perturbând respiraţia şi dezorganizând MCP (nistatina, levorina, amfotericina B, etc). Se fixează pe sterolii MCP ale micetelor, perturbând respiraţia şi dezorganizând MCP (permeabilitate excesivă şi moartea celulei).(permeabilitate excesivă şi moartea celulei).Aceste AB acţionează şi asupra celulelor în repaos. Relativ toxice, în special nefro.Aceste AB acţionează şi asupra celulelor în repaos. Relativ toxice, în special nefro.

oo AB cu AB cu acţiune asupra ribozomiloracţiune asupra ribozomilor30S (aminoside: streptomicina, kanamicina, 30S (aminoside: streptomicina, kanamicina, gentamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina; tetracicline)tobramicina, amikacina; tetracicline)50S (cloramfenicol, triamfenicol; macrolide: eritromicina, oleandomicina; lincosamide: clindamicina, lincomicina).50S (cloramfenicol, triamfenicol; macrolide: eritromicina, oleandomicina; lincosamide: clindamicina, lincomicina).Se leagă pe receptori specifici de pe subunităţile 30S sau 50S, perturbând sinteza proteică (inhibiţia transpeptidazei, a translocaţiei peptidelor, Se leagă pe receptori specifici de pe subunităţile 30S sau 50S, perturbând sinteza proteică (inhibiţia transpeptidazei, a translocaţiei peptidelor, etc). Rezultă inhibiţia sintezei proteice sau sinteza proteinelor nefuncţionale. Efectul este bacteriostatic (aminosidele – bactericid), doar asupra etc). Rezultă inhibiţia sintezei proteice sau sinteza proteinelor nefuncţionale. Efectul este bacteriostatic (aminosidele – bactericid), doar asupra celulelor active metabolic. celulelor active metabolic.

oo AB cu AB cu acţiune asupra acizilor nucleiciacţiune asupra acizilor nucleiciRifampicinaRifampicina – inhibă ARN-polimeraza ADN-dependentă. Rezultă stoparea sintezei ARNm – inhibă ARN-polimeraza ADN-dependentă. Rezultă stoparea sintezei ARNmNovobiocina Novobiocina , , Chinolonele Chinolonele (acidul nalidixic, ciprofloxacina, ofloxacina) – blochează activitatea topo-izomerazelor, intervenind în conformaţia ADN-(acidul nalidixic, ciprofloxacina, ofloxacina) – blochează activitatea topo-izomerazelor, intervenind în conformaţia ADN-ului. Efect bactericid. ului. Efect bactericid. Sulfamidele şi trimetoprimulSulfamidele şi trimetoprimul perturbă sinteza acidului folic şi folaţilor (cofactori în sinteza AN). Activitate bacteriostatică. perturbă sinteza acidului folic şi folaţilor (cofactori în sinteza AN). Activitate bacteriostatică.Producerea AB: Producerea AB: Metoda biologică; Metoda sintetică; Metoda semi-sinteticăMetoda biologică; Metoda sintetică; Metoda semi-sinteticăEtapele metodei biologice:Etapele metodei biologice:

1.1. Cultivarea tulpinilor-producente (ex.: Cultivarea tulpinilor-producente (ex.: Penicillium notatum, Actinomyces griseum, etcPenicillium notatum, Actinomyces griseum, etc) în mediu lichid adecvat) în mediu lichid adecvat2.2. Extragerea ABExtragerea AB3.3. Purificarea şi concentrarea ABPurificarea şi concentrarea AB4.4. Controlul toxicităţiiControlul toxicităţii5.5. Determinarea activităţii ABDeterminarea activităţii AB

Activitatea AB se măsoară în unităţi de masă (g, mg, Activitatea AB se măsoară în unităţi de masă (g, mg, µµg) sau de acţiune (UA). 1 UA – cantitatea minimală de AB care inhibă creşterea unei tulpini g) sau de acţiune (UA). 1 UA – cantitatea minimală de AB care inhibă creşterea unei tulpini de referinţă în condiţii standarde. Penicilina – 1UA = 0,6 de referinţă în condiţii standarde. Penicilina – 1UA = 0,6 µµg de substanţă purăg de substanţă purăCerinţele faţă de AB: Cerinţele faţă de AB: Toxicitate selectivă; Efect terapeutic cu doze minime; Activitate de lungă durată; Spectru restrâns de acţiune; Să fie solubile Toxicitate selectivă; Efect terapeutic cu doze minime; Activitate de lungă durată; Spectru restrâns de acţiune; Să fie solubile şi absorbite uşor; Să nu provoace efecte secundare; Să nu se dezvolte rezistenţa contra AB; Să fie ieftineşi absorbite uşor; Să nu provoace efecte secundare; Să nu se dezvolte rezistenţa contra AB; Să fie ieftine

33. Rezistenţa microbilor la antibiotice, tipurile. Mecanismele rezistenţei dobindite si manifestatea ei. Combaterea rezistenţei. Cauzele: Factori genetici, proprii bacteriilor; Factori ce favorizează selecţia şi difuzarea tulpinilor bacteriene rezistente Cauzele: Factori genetici, proprii bacteriilor; Factori ce favorizează selecţia şi difuzarea tulpinilor bacteriene rezistente Tipurile de rezistenţă:Tipurile de rezistenţă:

oo Naturală, ereditară, de specie, prezentă la toţi membrii unei specii sau genNaturală, ereditară, de specie, prezentă la toţi membrii unei specii sau gen lipsa ţinteilipsa ţintei – ex.: micoplasme, micete; – ex.: micoplasme, micete; imposibilitatea de a atinge ţintaimposibilitatea de a atinge ţinta – ex.: Mycobacterium (cerurile, lipidele împiedică pătrunderea AB în citoplasmă); – ex.: Mycobacterium (cerurile, lipidele împiedică pătrunderea AB în citoplasmă); bacteriile nu efectuează procesul inhibat de ABbacteriile nu efectuează procesul inhibat de AB – ex.: acidul folic este preluat din mediu – rezistenţă la sulfamide – ex.: acidul folic este preluat din mediu – rezistenţă la sulfamide

oo Achiziţionată, dobândită, afectează tulpinile unei specii sensibile. Depinde de acţiunea de selecţie exercitată de AB utilizate în Achiziţionată, dobândită, afectează tulpinile unei specii sensibile. Depinde de acţiunea de selecţie exercitată de AB utilizate în tratament, urmată de răspândirea ei (între bacterii, tratament, urmată de răspândirea ei (între bacterii, interinteruman, transmisie de origine animală).uman, transmisie de origine animală).

Diminuarea permeabilităţii membranareDiminuarea permeabilităţii membranare Modificarea ţintei moleculareModificarea ţintei moleculare Eliminarea excesivă a AB Eliminarea excesivă a AB

13

Page 14: Microbiologie Exam

Inactivarea enzimatică a AB, care poate fi hidrolizat (penicilinază, cefalosporinază) sau modificat structural (acetilaze, Inactivarea enzimatică a AB, care poate fi hidrolizat (penicilinază, cefalosporinază) sau modificat structural (acetilaze, adenilaze, fosforilaze), etc. adenilaze, fosforilaze), etc.

Rezistenţa dobândită se poate manifesta fenotipic (bacteriile în faza de repaos, formele “L” de bacterii) sau genetic (genotipic)Rezistenţa dobândită se poate manifesta fenotipic (bacteriile în faza de repaos, formele “L” de bacterii) sau genetic (genotipic)Rezistenţa geneticăRezistenţa genetică poate fi: poate fi:CromozomialăCromozomială, determinată de mutaţii (10%), determinată de mutaţii (10%)

MecanismeMecanisme: modificarea ţintei moleculare, diminuarea permeabilităţii membranare: modificarea ţintei moleculare, diminuarea permeabilităţii membranarePlasmidicăPlasmidică, epidemică, realizată prin transfer de gene prin intermediul plasmidelor R (poate fi rezistenţă multiplă)., epidemică, realizată prin transfer de gene prin intermediul plasmidelor R (poate fi rezistenţă multiplă).

Mecanisme:Mecanisme: inactivarea enzimatică, modificarea ţintei, substituţia/supraproducţia ţintei, excreţie excesivă a AB. inactivarea enzimatică, modificarea ţintei, substituţia/supraproducţia ţintei, excreţie excesivă a AB.Prevenirea rezistenţeiPrevenirea rezistenţei

1.1. Supravegherea epidemiologică a tulpinilor rezistenteSupravegherea epidemiologică a tulpinilor rezistente2.2. Politică strictă de prescriere a ABPolitică strictă de prescriere a AB3.3. Respectarea dozelor terapeutice corecte şi a timpului de tratament necesarRespectarea dozelor terapeutice corecte şi a timpului de tratament necesar4.4. Asocierea AB cu mecanisme de acţiune diferiteAsocierea AB cu mecanisme de acţiune diferite5.5. Prescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-lactamaze, utilizând inhibitori (acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). Ex.: Prescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-lactamaze, utilizând inhibitori (acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). Ex.:

augmentina – amoxicilina+acid clavulanicaugmentina – amoxicilina+acid clavulanic6.6. Reciclarea ABReciclarea AB7.7. Producerea AB noiProducerea AB noi

Efectele negative ale antibioticoterapieiEfectele negative ale antibioticoterapiei1.1. Efect toxic (streptomicina – surditate, cloramfenicolul – toxică pentru măduva osoasă, polipeptidele – nefrotoxice, etc)Efect toxic (streptomicina – surditate, cloramfenicolul – toxică pentru măduva osoasă, polipeptidele – nefrotoxice, etc)2.2. Efect teratogenEfect teratogen3.3. Acţiune sensibilizantă (penicilina, etc)Acţiune sensibilizantă (penicilina, etc)4.4. DisbacteriozăDisbacterioză5.5. Dereglarea imunogenezeiDereglarea imunogenezei6.6. Selecţia suşelor rezistenteSelecţia suşelor rezistente

BacteriocineleBacteriocinele – substanţe proteice bactericide produse de numeroase specii bacteriene şi active asupra altor tulpini ale aceeaşi specii sau – substanţe proteice bactericide produse de numeroase specii bacteriene şi active asupra altor tulpini ale aceeaşi specii sau asupra speciilor înrudite. Producerea bacteriocinelor este determinată plasmidic (plasmide Col). asupra speciilor înrudite. Producerea bacteriocinelor este determinată plasmidic (plasmide Col). Tipuri de bacteriocine: colicine (secretate de Tipuri de bacteriocine: colicine (secretate de Escherichia coliEscherichia coli), corinecine (Corynebacterium), vibriocine (Vibrio), piocine (Pseudomonas), etc.), corinecine (Corynebacterium), vibriocine (Vibrio), piocine (Pseudomonas), etc.Studiul sensibilităţii unei tulpini la bacteriocine (Studiul sensibilităţii unei tulpini la bacteriocine (bacteriocinotipiabacteriocinotipia) se utilizează în scopuri epidemiologice.) se utilizează în scopuri epidemiologice.

34. Notiuni de tulpini bacteriene sensibile, intermediare si rezistente la antibiotice. Metodele de determinare a sensibilitătii microbilor la antibiotice: difuzimetrica (rondelelor), diluţiilor succesive. Noţiune de concentraţie minimă de inhibiţie (CMI) si concentraţie minimă bactericidă (CMB).

Sensibilitatea microbilor la ABSensibilitatea microbilor la ABÎn funcţie de rezultatele clinice, bacteriile se divizează în 3 clase: În funcţie de rezultatele clinice, bacteriile se divizează în 3 clase: sensibile la AB (S), rezistente (R) şi intermediare (I, moderat sensibile).sensibile la AB (S), rezistente (R) şi intermediare (I, moderat sensibile).

Tulpinile S – efectul terapeutic este obţinut cu doze terapeutice uzualeTulpinile S – efectul terapeutic este obţinut cu doze terapeutice uzualeTulpinile R – efectul terapeutic nu poate fi obţinut cu doze terapeuticeTulpinile R – efectul terapeutic nu poate fi obţinut cu doze terapeuticeTulpinile I – succesul terapeutic este imprevizibil. Ar fi posibil cu doze mari sau la administarea locală a AB.Tulpinile I – succesul terapeutic este imprevizibil. Ar fi posibil cu doze mari sau la administarea locală a AB.

Fiecare tulpină izolată manifestă sensibilitate particulară. Ea poate fi studiată în laborator pentru determinarea profilului de sensibilităţi al acesteiFiecare tulpină izolată manifestă sensibilitate particulară. Ea poate fi studiată în laborator pentru determinarea profilului de sensibilităţi al acestei tulpini, ceea ce constituie o tulpini, ceea ce constituie o antibiogramăantibiogramă..Testarea sensibilităţii bacteriilor la ABTestarea sensibilităţii bacteriilor la AB

oo Metoda difuzimetrică (rondelelor). Metoda difuzimetrică (rondelelor). Utilizată uzual în infecţii banale.Utilizată uzual în infecţii banale.Condiţii: mediu standard, concentraţie standardă de mi/o (10Condiţii: mediu standard, concentraţie standardă de mi/o (1055/ml), rondele/discuri (comprimate) cu % standarde de AB, condiţii standarde./ml), rondele/discuri (comprimate) cu % standarde de AB, condiţii standarde.Mediul este inoculat cu suspensia bacteriană. După uscare în termostat se aplică rondelele – 24h, 37Mediul este inoculat cu suspensia bacteriană. După uscare în termostat se aplică rondelele – 24h, 37°°C.C.LecturaLectura – diametrul zonei de inhibiţie a creşterii culturii bacteriene este comparat cu diametrele standarde pentru fiecare AB. Valori sub acest – diametrul zonei de inhibiţie a creşterii culturii bacteriene este comparat cu diametrele standarde pentru fiecare AB. Valori sub acest diametru – tulpina este R, dacă este depăşit – S.diametru – tulpina este R, dacă este depăşit – S.

oo Metoda diluţiilorMetoda diluţiilorÎntr-un şir de tuburi cu 1 ml BP se efectuează diluţia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, etc). Se adaugă în fiecare tub (cu excepţia celui Într-un şir de tuburi cu 1 ml BP se efectuează diluţia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, etc). Se adaugă în fiecare tub (cu excepţia celui martor) 0,1 ml de suspensie bacteriană 10martor) 0,1 ml de suspensie bacteriană 1055/ml. Termostat - 24h./ml. Termostat - 24h.LecturaLectura – cea mai mică doză de AB care inhibă creşterea culturii după 24h de incubare (mediu clar) constituie Concentraţia Minimă de Inhibiţie – cea mai mică doză de AB care inhibă creşterea culturii după 24h de incubare (mediu clar) constituie Concentraţia Minimă de Inhibiţie (CMI) a AB pentru tulpina testată. (CMI) a AB pentru tulpina testată. CMI măsoară efectul bacteriostatic. CMI măsoară efectul bacteriostatic. Concentraţia Minimă Bactericidă (CMB) – cantitatea minimă de AB care omoară 99,9% din inoculum după 18h de incubare. Determinarea CMB – Concentraţia Minimă Bactericidă (CMB) – cantitatea minimă de AB care omoară 99,9% din inoculum după 18h de incubare. Determinarea CMB – din ultimele tuburi fără creştere se repică 0,1 ml de mediu pe placa cu geloză. După 24h se compară numărul celulelor ce au supravieţuit cu nr din ultimele tuburi fără creştere se repică 0,1 ml de mediu pe placa cu geloză. După 24h se compară numărul celulelor ce au supravieţuit cu nr iniţial de bacterii (10iniţial de bacterii (1055/ml)./ml).Corelaţia dintre studii Corelaţia dintre studii in vitroin vitro şi rezultate şi rezultate in vivoin vivoÎn studii În studii in vitroin vitro parametrii (densitatea suspensiei bacteriene, concentraţia AB, etc) nu se modifică în timp. parametrii (densitatea suspensiei bacteriene, concentraţia AB, etc) nu se modifică în timp. In vivoIn vivo, la pacienţi, concentraţia AB , la pacienţi, concentraţia AB variază în timp şi în funcţie de ţesut. variază în timp şi în funcţie de ţesut. Pentru a stabili dacă tulpina izolată este sensibilă sau rezistentă la un AB se cere cunoaşterea Concentraţiei TerapeuticePentru a stabili dacă tulpina izolată este sensibilă sau rezistentă la un AB se cere cunoaşterea Concentraţiei Terapeutice ((CTCT) (cantitatea de AB ) (cantitatea de AB prezent în focarul infecţios în cursul tratamentului cu doze terapeutice) a fiecărui AB testat.prezent în focarul infecţios în cursul tratamentului cu doze terapeutice) a fiecărui AB testat.

Tulpini Sensibile – CMI/CT Tulpini Sensibile – CMI/CT <<1, ex.: 2/8, 2/16 - efect terapeutic posibil cu doze uzuale1, ex.: 2/8, 2/16 - efect terapeutic posibil cu doze uzualeTulpini Rezistente – CMI/CTTulpini Rezistente – CMI/CT>>1, ex.: 8/2, efect terapeutic imposibil1, ex.: 8/2, efect terapeutic imposibilTulpini Intermediare – CMI/CT=1, efect terapeutic imprevizibil. Pot fi utilizate doze maxime de AB sau administrarea lor localăTulpini Intermediare – CMI/CT=1, efect terapeutic imprevizibil. Pot fi utilizate doze maxime de AB sau administrarea lor locală

Testarea CMI / CMB este indicată în tratamentul infecţiilor grave : meningite, septicemii, endocardite, infecţii cronice sau la persoane cu Testarea CMI / CMB este indicată în tratamentul infecţiilor grave : meningite, septicemii, endocardite, infecţii cronice sau la persoane cu imunosupresie.imunosupresie.Monitorizatea (supravegherea) tratamentului cu AB. Verificarea eficacităţii antibioterapiei.Monitorizatea (supravegherea) tratamentului cu AB. Verificarea eficacităţii antibioterapiei.

1.1. Determinarea concentraţiilor umorale sau tisulare ale ABDeterminarea concentraţiilor umorale sau tisulare ale ABIndicaţii: Indicaţii: Utilizarea unui AB toxic; În caz când bolnavul suferă de deficienţe metabolice sau excretoare (renale, hepatice)Utilizarea unui AB toxic; În caz când bolnavul suferă de deficienţe metabolice sau excretoare (renale, hepatice)Se compară concentraţiile obţinute cu CMI a antibioticului testat (sau cu CT).Se compară concentraţiile obţinute cu CMI a antibioticului testat (sau cu CT).

2.2. Studiul activităţii inhibitorii a lichidelor biologice (NEI)Studiul activităţii inhibitorii a lichidelor biologice (NEI)Indicaţii: infecţii grave care nu răspund rapid la tratament.Indicaţii: infecţii grave care nu răspund rapid la tratament.Efectuarea: la diluţii duble (1/2, ¼...) aEfectuarea: la diluţii duble (1/2, ¼...) alele lichidului examinat (ser, LCR, urină) se adaugă suspensia bacteriană (din tulpina izolată de la bolnav). lichidului examinat (ser, LCR, urină) se adaugă suspensia bacteriană (din tulpina izolată de la bolnav). Lectura: după 24h de incubaţie la 37Lectura: după 24h de incubaţie la 37°° C se apreciază diluţia maximă cu efect bacteriostatic/cid. C se apreciază diluţia maximă cu efect bacteriostatic/cid. NEI ≥1:8NEI ≥1:8 reflectă eficienţa reflectă eficienţa antibioticoterapieiantibioticoterapiei

14

Page 15: Microbiologie Exam

35. Bacteriofagul. Natura. Caracterele morfobiologice. Profagul. Lizogenia. Aplicarea practica a bacteriofagului. BBacterioacterioffagagii == virus virusuriuri ce ce infectinfecteazează bacteriă bacteriileile. Para. Parazziţiţii intracelular intracelularii obligator obligatoriiii aiai bct bct.. TTooaate bacterite bacteriilile pe poot t fifi infect infectatate dee de c căătretre bacterio bacterioffagagii. . In majoritatea cazurilorIn majoritatea cazurilor, un , un ffag ag anumeanume infecte infecteazază ă doardoar celule celulelele un unuiui s singuringur gen, gen, uunenei anumitei anumite spec speciiii sausau a a uneuneii tulpini -tulpini - specificitspecificitatateeaa ffagagului ului preprezzenţenţaa R pt R pt aacecestst ffag la suag la supprraafaţfaţaa bct bct-gazd-gazdă.ă.

StructurStructuraa bacteriofaguluibacteriofaguluiSStructurtructuraa fagilor corespundefagilor corespunde reg regulilor ulilor generalegenerale ce se refer ce se referăă la la structur structuraa virus virusurilorurilor. .

1.1. AAcid nucleicid nucleicc ((ADN ADN sausau ARN ARN, , mai frecvent dublmai frecvent dubluuccatenaratenar).).2.2. InveliInveliş proteiş proteicc == capsidăcapsidă prote proteccţţie aie a materi materiaalluluiului geneti geneticc. Poseda R la suprafaţă . Poseda R la suprafaţă infecţi infecţiaa gazdeigazdei. . CapsidaCapsida est estee constitu constituitită dă dinin

susubbunităţunităţii protei proteicece, , capsomerecapsomere, aran, aranjatejate simetric simetric îîntr-ontr-o ordine distinctordine distinctăă, conferind forma fagului, conferind forma fagului. . 3.3. UniiUnii ffagagii pot pot conţineconţine şşii enzenziimeme ((ex.: ex.: lizozim, neuraminidaza)lizozim, neuraminidaza). .

EExistă 3 forme morxistă 3 forme morffologiologicce e principale principale de de ffagagii:: Fag iFag icosaedricosaedricc:: formă s formă sfferiericcă, 20 feţă, 20 feţee tri triuungngiiulareulare, 30 muchii , 30 muchii şşi 12 vi 12 vâârfuri (simetrie cubicrfuri (simetrie cubică a capsidei). ă a capsidei). Fag ciFag cilindrilindric:c: bastonabastonaşşee protei proteicce forme formateate dindin caps capsomeromere, ase, asaamblmblateate î într-ontr-o structură tubulară (simetrie helicoidală a capsidei). structură tubulară (simetrie helicoidală a capsidei). Fag cFag complex:omplex: constitu constituitit d dinin capcap icosaedri icosaedricc ataş ataşatat lla a o o coadcoadă helicoidalăă helicoidală. . Coada Coada estestee formatformată ă dindin d douaoua tub tuburiuri concentri concentricce, un tub intern rigid -e, un tub intern rigid -

canalcanalulul axial axial, , carecare est estee inconjurat de inconjurat de teaca coziiteaca cozii, un man, un manşşon on contractil. contractil. Gulerul Gulerul cozii cozii (colul) (colul) se aflse aflăă la jonc la joncţţiunea capului cu coada. Liunea capului cu coada. La partea parteaa distală distală aa cozii se aflcozii se aflăă o o plaplaccă hexagonală, ă hexagonală, plaplacaca ba bazzalăală, , la fiecare apex fiind ancoratela fiecare apex fiind ancorate ccââte un te un croşetcroşet ş şii o o fibrăfibră. . EleEle repre reprezzentă sentă siistemstemulul de de fixafixarere aa ffagaguluiului pe pe bacteri bacteriaa recept receptoaoare şre şii contribu contribuiie e lla injecţia injecţiaa materi materiaalluluiului geneti geneticc î înn celulă. celulă.

Nu toNu toţţi fagii au o astfel dei fagii au o astfel de mor morffologie. ologie. Unii au Unii au coadcoadă lă luungngaa ş şii non non--contractilcontractilaa, , alalţţii ii - - coada scoada scurtă, sacurtă, sau u farăfară coad coadă. ă. EExistă şxistă şii ffagagii filament filamentooşşii..Interacţiunea dintre bacterioInteracţiunea dintre bacterioffag şi celula-gazdăag şi celula-gazdăBacteriofBacteriofagagiiii există î există în staren stare de de virionvirionii extracelular extracelularii, i, iar laar la infect infectareaarea une uneii bacteri bacteriii eiei potpot duceduce lla da douaoua t tiippuriuri d de e infecţiinfecţiii::

•• IInfecţinfecţiee l liititiccăă ffagagiiii virulenţ virulenţii. . LLa fina fineleele c ciiclcluluiului de multiplica de multiplicarere bacteri bacteriaa infect infectatată este lizată ă este lizată eeliberânliberândd ffagagii nou-formatiii nou-formati. . •• IInfectinfectiee nelitica saunelitica sau l lizizogenăogenă ffagagiiii temper temperaaţţi (moderai (moderaţţi)i). . Ei Ei infecteinfecteazază bacteriă bacteriilile e ffăărrăă a le a le ddisistrutrugge.e.

INFECTIINFECTIAA L LIITITICCĂĂ (c (ciiclclulul biologi biologicc alal ffagaguluiului virulent) virulent)AdsorbAdsorbţţiaia.. ciocnire int ciocnire intââmplmplăătoaretoare ffagagulul se fixe se fixeazază ă prin prin intermediintermediulul plă plăciicii ba bazzale (ale (la inceput prinla inceput prin fibre fibrele salele sale, ap, apoioi prin croprin croşşeteete) d) dee un R specifi un R specificc de pe PC de pe PC bacteribacteriaann (uneori flageli sau pili) (uneori flageli sau pili). . PenetraPenetrarearea.. fixare ireversibilfixare ireversibilăă a f a fagaguluiului pepe PC PC acţiacţiuunnee E E ( (ex. lex. lizizozoziimm)) perforare PC perforare PC contracţi contracţiee manmanşşonon apro apropipiere ere capcap de pla de placaca ba bazzală ală canalcanalulul axialaxial penetre penetreazază MCt ă MCt AADN DN ffagiagicc est estee inject injectatat inin bacterie. bacterie.ExpresExpresiaia genom genomuluiului viral (biosinteza componentelor fagice, maturizarea) viral (biosinteza componentelor fagice, maturizarea). penetra. penetrarere AADN viral îDN viral înn bacterie bacterie ((fag vegetativfag vegetativ) ) timp de timp de aproximativaproximativ 12 minute virion 12 minute virionulul nu este depistat nu este depistat îînn bacteri bacteriaa infect infectatată = ă = ffaazaza d de e eclipsăeclipsă. . Ea Ea coincidcoincidee cucu s siintentezaza enz enziimemelorlor virale virale carecare vor asigura vor asigura ulteriorulterior::

replicareplicarearea AADN DN ffagiagicc;; ssiintentezaza proteine proteinelorlor ffagiagicece;; aassaamblamblarreeaa acestoracestor element elementee..

AsAsaamblamblarreeaa ffagagilorilor. . sinteza compusinteza compuşşi capsida i capsida şşi AN i AN îîn cantitn cantităţăţi suficiente i suficiente asamblarea spontan asamblarea spontanăă a particulelor noi de fagi, prin incorporarea a particulelor noi de fagi, prin incorporarea acidului acidului nucleinucleicc î în capsidn capsidă.ă.ElEliberaiberarearea. . MMajoritateaajoritatea f fagagiilor, lor, dupdupă maturiă maturizarezare, s, suunt nt eeliberliberaaţţii î în urman urma l lizizeeii p peerreteluietelui bacteri bacteriaan cu enzime ale bacteriofaguluin cu enzime ale bacteriofaguluiTiTimpmpulul didintre infectintre infectiee ş şii eeliberaliberarere (ciclul de reproducere) (ciclul de reproducere) estestee d de e 20-60 minute 20-60 minute lla 37°C, a 37°C, ffagagiiii s suunt nt eeliberliberaaţţii î în n vavalluuriri de 50-1000 de 50-1000 ffagagii p peer celulă. r celulă. INFECTIINFECTIAA NON L NON LIITITICCĂ Ă SAUSAU L LIZIZOGENĂ : OGENĂ : FFAGAGIIII TEMPER TEMPERAAŢŢIIFFagagiiii temper temperaaţţii (moderaţi) (moderaţi) atunci candatunci cand infecte infecteazază ă oo bacterie p bacterie poott::

1.1. sau inducesau induce un c un ciiclcluu complet de multiplica complet de multiplicare, ce duce re, ce duce la la llizaiza bacterie bacterieii, , 2.2. sau,sau, mai frecvent, mai frecvent, dupdupă injectă injectareaarea AADNDN-ului-ului, , ssăă integreintegreze aze acecestst AADN îDN înn cromo cromozzomomulul bacteri bacteriaan prin recombinare specificăn prin recombinare specifică, , formâformândnd

un un proproffagag (lizogenizare) (lizogenizare)3.3. sausau sa ramsa ramâânnăă îînn Ct su Ct subb formă de formă de plasmidăplasmidă. .

In ultimele douIn ultimele douăă cazuri cazuri bacteribacteriaa n nuu m moaoarre e şşii,, multiplimultipliccânându-sedu-se, repli, repliccă genomă genomulul viral viral concomitent cuconcomitent cu propr propriul siul săăuu genom: bacteri genom: bacteriaa (cultura) (cultura) estestee numitnumită ă llizizogenăogenă.. Ea Ea posedă şposedă şii transm transmiittee descend descendeenţnţilorilor capacitateacapacitatea de de a a produproducce e fafaggii în absenţ în absenţaa infecţi infecţieiei. . ProprietăţProprietăţileile culturilorculturilor l lizizogeneogeneInducInducţţia ciclului liticia ciclului litic. Profagul p. Profagul păăstreazstreazăă virulen virulenţţa potena potenţţialialăă. Me. Menţinţinneerearea ststăării derii de l lizizogenogenieie impli impliccă ă ss ii ntente zaza un un uiui repres repres oo r proteir protei cc , cod, cod ificat dificat d e e ff agag . . DDispariţiispariţiaa lui duce la lui duce la inducţiinducţiaa ciciclcluluiului l liititic.c. IInducţinducţiaa se se ppoaoattee declandeclanşşaa spontan spontan la un numar limitat de celule sau la un numar limitat de celule sau p poaoattee fifi provo provocatcată ă lala majoritmajoritateaatea celule celulelorlor, , dede ex ex.., , la acla acţţiuneaiunea unor mutageniunor mutageni, c, caa ra razelezele ultraviolet ultravioletee sausau mitom mitomiicincinaa C. C. SiSistemstemulul SOS activ SOS activatat prot. prot. RecA RecA scindeazascindeaza repres represoorrulul protei proteicc alal ffagagului ului expresiexpresiaa c ciiclcluluiului l liititicc. . Pentru aPentru aceaceastasta pro proffagagul trebuie sa fieul trebuie sa fie exciexcizatzat - - operaţioperaţiee inversă integră inversă integrăriirii. . EExcixcizziiaa est estee efectu efectuatată ă dede ccăătretre protein proteinaa xisxis, cod, codificatificată ă dde e ffag. ag. UrmeazUrmeazăă replicarea g replicarea genomenomuluiului, , sinteza sinteza componcomponenenttelorelor ffagaguluiului ş şii ffagagiiii as asaamblmblaaţţii s suunt nt eeliberliberaaţţii pr prinin l lizaiza celule celulei (i (prpr oo ff agag ulul - - genă potenţigenă potenţi aa ll letal letal ă!ă! ))..În timpul replicării fagului moderat fragmente de ADN bacterian pot fi întroduse din eroare în particulele virale. Aceşti fagi pot în continuare În timpul replicării fagului moderat fragmente de ADN bacterian pot fi întroduse din eroare în particulele virale. Aceşti fagi pot în continuare întroduce în cromosomul altor bacterii ADN bacterian capturat = proces de transfer genetic = întroduce în cromosomul altor bacterii ADN bacterian capturat = proces de transfer genetic = transducţietransducţie. Natura genelor bacteriene transferate . Natura genelor bacteriene transferate poate fi diferită: gene din apropierea locului de inserţie a fagului poate fi diferită: gene din apropierea locului de inserţie a fagului (transducţie specifică)(transducţie specifică) sau fragmente de ADN bacterian întroduse din întâmplare sau fragmente de ADN bacterian întroduse din întâmplare în capsida fagului în capsida fagului (transducţie generalizată)(transducţie generalizată)IImunitmunitateate contr contraa su supraprainfectiinfectieiei. B. Bacteriacteriileile l lizizogene sogene suunt nt imune imune lala ffagagulul virulent omolog profagului gvirulent omolog profagului găăzduitzduit. . AcAceestst ffag sag se e aaddsosoaarbe, injecterbe, injecteazaaza AADNDNulul, , dardar ffăărrăă a se replica sau provoca liza a se replica sau provoca liza..Conversie fagicConversie fagică ă (modificarea fenotipului celulei cauzată de genele profagului)(modificarea fenotipului celulei cauzată de genele profagului).. BBacteriacteriileile infect infectateate cucu un un ffag pag poot pret prezzententaa uneleunele caractere absente caractere absente lala celule celulelele n neeinfectinfectatate. e. CConversionversiee ffagagicicăă cau cauzatzată ă de:de:

1.1. expresiexpresiaa unorunor gene gene aleale ffagaguluiului de cde căătretre celule celule2.2. inactivainactivarearea unorunor gene cromo gene cromozzomomaleale la la integraintegrarearea prprooffagaguluiului. .

De De ex ex.., , tulpiniletulpinile de de Corynebacterium diphtheriaeCorynebacterium diphtheriae carecare provo provoacacă diă diffteriteriaa s suunt lnt lizizogeniogenizatezate dede un un anumitanumit t tiip de p de ffagagii carecare code codeazaaza ş şii exprimă exprimă oo toxină toxină puteputernicrnică; toxina eritrogenă a ă; toxina eritrogenă a Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes, etc , etc CCulturulturaa ş şii titra titrarearea bacteriofbacteriofagagilorilor. . EEfefeccttulul ffagagilorilor virulenţ virulenţii aasusupprraa cultur culturilorilor bacteriene bacterieneBacteriofagii sunt cultivaBacteriofagii sunt cultivaţţi i îîn laborator n laborator îîn mediu de culturn mediu de culturăă lichid sau solid lichid sau solid în prezenţa bacteriilor omologe în prezenţa bacteriilor omologe. . Cultivarea în mediu lichid:Cultivarea în mediu lichid: Bacteriile sensibile Bacteriile sensibile şşi fagii se i fagii se îîntroduc ntroduc îîntr-un bulion nutritiv (ntr-un bulion nutritiv (nr fagi < nr bctnr fagi < nr bct). Amestecul este incubat pentru a permite bacteriilor s). Amestecul este incubat pentru a permite bacteriilor săă se se multiplice multiplice şşi de a fi infectate de ci de a fi infectate de căătre fagi tre fagi num număărul fagilor crerul fagilor creşşte mai rapid decte mai rapid decâât cel al bacteriilor pt cel al bacteriilor pâânnăă la un punct critic c la un punct critic câând numnd număărul fagilor rul fagilor prezenprezenţţi este suficient pentru a infecta toate bacteriile culturii. i este suficient pentru a infecta toate bacteriile culturii. Toate celulele bacteriene sunt lizate Toate celulele bacteriene sunt lizate îîn acelan acelaşşi timp, ce duce la dii timp, ce duce la dispariţispariţia completa completăă a a turbiditturbidităţăţii culturii (clarificarea mediului).ii culturii (clarificarea mediului).Cultivarea fagilor în mediu solid:Cultivarea fagilor în mediu solid: A Amestecul bacterii-fagi poate fi admestecul bacterii-fagi poate fi adăăugat ugat la geloza topită şi răcită la 45la geloza topită şi răcită la 45°° C C şşi apoi turnat i apoi turnat îîn cutia Petri. Bacteriile n cutia Petri. Bacteriile cresccresc, se multiplică, formând o peliculă fină, iar, se multiplică, formând o peliculă fină, iar fagii continu fagii continuăă s săă infecteze provoc infecteze provocâând liza confluentnd liza confluentăă a culturii bacteriene. a culturii bacteriene. Aceste “colonii” de fagi Aceste “colonii” de fagi

15

Page 16: Microbiologie Exam

se manifestă sub forma unor pete sterile (plaje). Numărul plajelor indică numărul fagilor infecţioşi în prelevat (fiecare colonie se formează pe se manifestă sub forma unor pete sterile (plaje). Numărul plajelor indică numărul fagilor infecţioşi în prelevat (fiecare colonie se formează pe contul multiplicării unui virion fagic).contul multiplicării unui virion fagic).BacteBacteriofagii pot fi intâlniţi în diferite prelevate umane sau din mediul extern. riofagii pot fi intâlniţi în diferite prelevate umane sau din mediul extern. Fagii indică prezenţa bacteriilor sensibile.Fagii indică prezenţa bacteriilor sensibile.IZOLAREA BACTERIOFAGILORIZOLAREA BACTERIOFAGILORPrelevate: apă, sol, materii fecale, puroi, etcPrelevate: apă, sol, materii fecale, puroi, etcIzolarea directăIzolarea directă – filtrarea prelevatelor prin filtre bacteriene, ultracentrifugare. – filtrarea prelevatelor prin filtre bacteriene, ultracentrifugare.Izolare prin metoda de îmbogăţire fără însămânţareIzolare prin metoda de îmbogăţire fără însămânţare – materialul de examinat se inoculează într-un mediu nutritiv lichid (pentru multiplicare – materialul de examinat se inoculează într-un mediu nutritiv lichid (pentru multiplicare bacteriile omologe fagului căutat). Peste 10 ore de incubare la 37bacteriile omologe fagului căutat). Peste 10 ore de incubare la 37°° C bulionul este supus filtrării. In filtrat s-au acumulat fagii care s-au inmulţit C bulionul este supus filtrării. In filtrat s-au acumulat fagii care s-au inmulţit pe contul bacteriilor omologe din prelevat. pe contul bacteriilor omologe din prelevat. Izolare prin metoda de îmbogăţire cu însămânţareIzolare prin metoda de îmbogăţire cu însămânţare – inocularea prelevatului într-o suspensie bacteriană omologă fagului căutat. Cultura – inocularea prelevatului într-o suspensie bacteriană omologă fagului căutat. Cultura bacteriană asigură îmbogăţirea fagilor. Peste 10 ore de incubare la 37bacteriană asigură îmbogăţirea fagilor. Peste 10 ore de incubare la 37°° C bulionul este supus filtrării. C bulionul este supus filtrării. INDICAREA BACTERIOFAGILORINDICAREA BACTERIOFAGILORMetoda OTTOMetoda OTTO. Pe placa de geloză din cutia Petri se însămânţează în gazon suspensia de bacterii omologe fagului. În continuare se aplică o . Pe placa de geloză din cutia Petri se însămânţează în gazon suspensia de bacterii omologe fagului. În continuare se aplică o picătură de filtrat care conţine fag (cutia poate fi înclinată ca picătura să se prelingă). Cutia se incubează la 37picătură de filtrat care conţine fag (cutia poate fi înclinată ca picătura să se prelingă). Cutia se incubează la 37°° C timp de 24 ore. C timp de 24 ore. ApreciereaAprecierea: dacă în filtrat se aflau fagi omologi culturii bacteriene, în locul aplicării filtratului se observă o zonă de liză (colonie negativă de fag). : dacă în filtrat se aflau fagi omologi culturii bacteriene, în locul aplicării filtratului se observă o zonă de liză (colonie negativă de fag). Metoda FURT. Metoda FURT. Filtratul ce conţine fagi se amestecă cu geloză topită şi se toarnă în cutia Petri. Suprafaţa cutiei se împarte în 4 sectoare. În fiecare Filtratul ce conţine fagi se amestecă cu geloză topită şi se toarnă în cutia Petri. Suprafaţa cutiei se împarte în 4 sectoare. În fiecare sector se însămânţează în striuri culturi cunoscute de diferite bacterii. Incubare la 37sector se însămânţează în striuri culturi cunoscute de diferite bacterii. Incubare la 37°°C 24 ore.C 24 ore.ApreciereaAprecierea: lipsa creşterii bacteriilor într-un sector indică prezenţa fagului omolog.: lipsa creşterii bacteriilor într-un sector indică prezenţa fagului omolog.Metoda FISHERMetoda FISHERSimilară cu metoda Furt, doar că suprafaţa cutiei se împarte în 10 cadrane, astfel pot fi însămânţate 10 culturi bacteriene şi pot fi indicaţi Similară cu metoda Furt, doar că suprafaţa cutiei se împarte în 10 cadrane, astfel pot fi însămânţate 10 culturi bacteriene şi pot fi indicaţi concomitent mai mulţi fagi. concomitent mai mulţi fagi.

TITRAREA BACTERIOFAGILORTITRAREA BACTERIOFAGILOREste utilizată pentru determinarea numărului de fagi virulenţi în prelevat sau cultură.Este utilizată pentru determinarea numărului de fagi virulenţi în prelevat sau cultură.Metodele de titrare a bacteriofagului Metodele de titrare a bacteriofagului Titrarea bacteriofagului în mediu lichid (metoda Appelman)Titrarea bacteriofagului în mediu lichid (metoda Appelman)Titrarea bacteriofagului în mediu solid (metoda Gratia)Titrarea bacteriofagului în mediu solid (metoda Gratia)APPELMAN – la diluţii logaritmice a culturii de fag (10APPELMAN – la diluţii logaritmice a culturii de fag (10-1-1.....10.....10-10-10) în bulion peptonat se adaugă suspensie bacteriană omologă fagului examinat. ) în bulion peptonat se adaugă suspensie bacteriană omologă fagului examinat. După 24 ore de incubare la 37După 24 ore de incubare la 37°° C se apreciază C se apreciază titrul faguluititrul fagului: : dildiluuţia maximă a fagului care încă mai provoacă liza bacteriilor (mediu clar).ţia maximă a fagului care încă mai provoacă liza bacteriilor (mediu clar).GRATIA.GRATIA. După diluţia logaritmică a fagului şi adăugarea culturii bacterieneDupă diluţia logaritmică a fagului şi adăugarea culturii bacteriene, , conţinutul fiecărui tub se amestecă cu geloză topită şi amestecul se conţinutul fiecărui tub se amestecă cu geloză topită şi amestecul se toarnă în cutii Petritoarnă în cutii Petri. . După 24 ore de incubare la 37După 24 ore de incubare la 37°°C se numără plajele formate (coloniile negative de fagi).C se numără plajele formate (coloniile negative de fagi). Numărul plajelor corespunde cu nr de Numărul plajelor corespunde cu nr de fagi virulenţi din materialul de examinat. fagi virulenţi din materialul de examinat. APLICAREA PRACTICĂ A FAGILORAPLICAREA PRACTICĂ A FAGILORÎn domeniul În domeniul terapeuticterapeuticTratamentul şi profilaxia maladiilor infecţioaseTratamentul şi profilaxia maladiilor infecţioaseÎn domeniul În domeniul diagnosticdiagnosticFago-identificareaFago-identificarea – identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt, etc) – identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt, etc)LizotipizareaLizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenţierea unor tulpini din cadrul aceleeaşi specii (subdivizarea speciei în lizotipuri/fagovaruri). Este (fagotipajul). Permite diferenţierea unor tulpini din cadrul aceleeaşi specii (subdivizarea speciei în lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de utilizat pentru tulpini de Staphylococcus aureus,Staphylococcus aureus, SalmonellaSalmonella Typhi, ş.a. Typhi, ş.a.Lizotipul reprezintă un marker epidemiologic.Lizotipul reprezintă un marker epidemiologic.Fagii reprezintă un model de studiu pentru geneticieni, fagii temperaţi se utilizează în ingineria genetică (ei pot asigura transferul de Fagii reprezintă un model de studiu pentru geneticieni, fagii temperaţi se utilizează în ingineria genetică (ei pot asigura transferul de material genetic prin transducţie).material genetic prin transducţie).

36. Virusurile. Natura. Particularităţile biologice. Principiile de clasificare. Forma si dimensiunile virusurilor. Metodele de studiu.Virusuri = gene vagabonde = particule infectioase autonome, caracterizate prin :

1. Reprezintă structuri acelulare cu potenţial infecţios2. Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm)3. Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de AN (ADN sau ARN)4. Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind paraziţi obligaţi intracelulari5. Nu cresc şi nu se divid, se reproduc în celule vii 6. Nu cultivă pe medii artificiale, numai pe celule vii7. Rezistenţă naturală la antibiotice

myxovirusuri : AN + capsida = nucleocapsida; reovirusuri : ARN dublu catenarRol capsida: protecţia AN, rol antigenic, adeziuneVirusurile cu supercapsida realizeaza absorbtia prin intermediul ei utilizarea detergentilor pt inlaturararea supercapsidei inlaturare virulenta.CLASIFICAREA VIRUSURILORDupă tipul AN (cu genom ARN/ADN)După dimensiuni (mici – 20-50 nm, medii – 50-150 nm, mari – peste 150 nm)După tipul de simetrie a capsidei (helicoidală, cubică, mixtă) După gazdă (om, animal, insectă, bacterie)După sensibilitatea în mediul extern, etcVirusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, PoxviridaeVirusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, RetroviridaeVirusuri ARN- : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, FiloviridaeVirusuri ARNd.c. : Reoviridae

Virion – unitate structurală infecţioasă a virusului Viroid – ARNm.c., circular, asociat cu boli la plantePrion – proteină termostabilă infecţioasă, cauzează la om boala Kuru, Creutzfeldt-Jacob, sindromul Gerstmann-Straussler, scrapie la oi

COMPOZIŢIA CHIMICĂ ŞI STRUCTURA VIRIONULUIVirusurile simple – AN şi înveliş proteic – capsida (nucleocapsidă)Virusurile complexe – nucleocapsidă şi un înveliş extern, lipoglicoproteic (supercapsidă, peplos)

AN – ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, linear, circular sau fragmentat.ARN monocatenar : ARN+ (catenă cu sens, ARNm) sau ARN- (catenă fără sens)Funcţia AN – asigurarea replicării şi expresia genomului pentru sinteza proteicăCapsida – formată din unităţi proteice, capsomere, aranjate simetric.

16

Page 17: Microbiologie Exam

Simetrie helicoidală – capsomerele se fixează pe catena de AN, formă de bastonaşSimetrie cubică (icosaedrică) – capsomerele se aranjează în jurul AN, formând un icosaedru (poliedru regulat cu 20 feţe triungiulare şi 12 vârfuri), eikos=20Simetrie mixtă (bacteriofagii, poxvirusurile)

Funcţia – protecţia AN, rol antigenic, adeziuneSupercapsida – structură glucido-lipido-proteică, derivată din membrana celulei gazdă (lipidele din membrana celulară, glicoproteinele proprii)Funcţie – protecţie, antigene de suprafaţă, adeziuneUnele virusuri conţin enzime – polimeraze, transcriptaze, etc. Acţiunea factorilor fizici, chimici. Virusurile sunt foarte sensibile la căldură, desicare, UV. Detergenţii şi solvenţii inactivează virusurile cu supercapsidă. Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80 C

REPRODUCEREA VIRUSURILORI ADSORBŢIA virusului la celula-gazdă prin intermediul receptorilor specifici (tropism)II PENETRAREA în celulă: Pinocitoză (viropexis); Fuziunea membranelor; Translocare; Injectarea AN în citoplasmăIII DECAPSIDAREA (enzime celulare)IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor şi replicarea AN)Are loc în citoplasmă (virusuri cu ARN) sau nucleul celulei (virusuri cu ADN)Biosinteza virusurilor ADN: ADNdc transcrierea ARNm, translaţia (precoce, tardivă), replicarea, sinteza proteicăBiosinteza virusurilor ARN: ARN+ translaţie, replicare, sinteza proteică; ARN- transcriere, ARNm, translaţie, replicare, sinteza proteică;

Retrovirusuri (ARN+) transcriere, ADN-, ADNdc, transcriere, ARNm, replicare, translaţie, sinteza pr. (sau integrare în cromosom)V. MORFOGENEZA (asamblarea) virionilorProteinele capsidale participă la formarea nucleocapsidei (nucleu,citoplasmă), glicoproteinele sunt inserate în MCP, substituind proteinele

celulare. Contribuie la apariţia incluziunilor sau a corpusculilor elementari.VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, înmugurire, exocitoză) Interferenţa virală – fenomen în care, consecutiv infecţiei unei celule cu 2 virusuri, multiplicarea unuia este inhibată (virus interferat / virus

interferent)

37. Virusurile simple si complexe. Structura virionului. Etapele de interactiune a virionului cu celula gazda. RELAŢII VIRUS-CELULA GAZDĂInfecţie virală productivă, citocidăVirusul este infecţios iar celula permisivă. La nivelul ma/o corespunde infecţiilor acute, aparente sau inaparente (gripă, rujeolă)Infecţii virale persistenteCelulele infectate supravieţuiesc cu producerea permanentă sau intermitentă a virusului.Infecţii abortive cu virioni defectivi – infecţia nu se exprimă, are loc transformarea celulelor prin proteine virale. Ele devin ţintă pentru efectorii imunităţii (macrofage, T-limfocite) în cursul unor infecţii cronice (PESS post-rujeolică)Infecţii integrate (virusuri ADN sau copii ADN ale Retrovirusurilor)Transformarea malignă a celulei gazdă Manifestarea infecţiei după o perioadă de incubaţie îndelungată cu expresia integrală a genomului viral (HIV-SIDA) – infecţii lenteReactivări ocazionale, repetate ale infecţiei cu exprimarea integrală a informaţiei genetice virale (infecţia herpetică) – infecţii latenteInfecţii cronice – perioade de remisie şi acutizare, virusul este prezent permanent, chiar în absenţa simptomelor (hepatita virală B)

38. Culturile celulare. Tipurile. Izolarea virusurilor pe culturi de celule. Metodele de indicare si identificare a virusului izolat. Virusurile sunt cultivate pentru: Stabilirea diagnosticului etiologic; Testarea infecţiozităţii virusurilor; Testarea preparatelor antivirale; Producerea vaccinurilorSISTEME DE CULTIVARE: Culturi de celule; Ou embrionat de găină; Animale de laboratorAnimalele de laborator se utilizează limitat (receptivitate selectivă, preexistenţa infecţiilor, cost avansat). Se recurge numai când nu există alte posibilităţi (VHB, HIV, Coxsackie, etc). Constituie modele de cercetare sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate curent – şoriceii albi nou-născuţi, dar pot fi utilizaţi şobolani, cobai, maimuţe, etc. Regulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din infecţiile bacteriene. Oul embrionat de găină (5-13 zile) reprezintă un mediu de celule nediferenţiate, cu multiplicare activă, steril şi lipsit de mijloace de apărare antiinfecţioasă. Se utilizează în prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)Iniţial se verifică viabilitatea embrionului la ovoscop în camera obscură.Prelevatul se inoculează steril cu seringa în cavitatea amniotică sau alantoideană, sau pe membrana chorioalantoideană (utilizând metoda deschisă sau închisă). Orificiul se parafinează şi se incubează la 35-37 C timp de 48-72 ore Culturile de celule. Celulele provenite din ţesuturi adulte sau embrionare, normale sau tumorale, plasate într-un mediu adecvat (nutrienţi, pH, t) rămân viabile şi se multiplică. Pentru cultivarea virusurilor se utilizează culturile în monostrat celular.Tipurile de culturi de celule:Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt obţinute din ţesuturi adulte sau embrionare de origine animală sau umană. Suportă 4-6 pasaje (subcultivări)Culturi diploide. Obţinute din ţesut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaţii Linii continui de celule. Obţinute din ţesut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat.Obţinera culturilor de celule primar tripsinizate:Prelevarea ţesutului (ex.: rinichi de maimuţă)Fragmentarea şi spălarea cu sol fiziologicăDezagregarea tisulară cu enzime proteoliticeSepararea celulelor prin centrifugareDozarea suspensiei 105 – 106 celule/ml Întroducerea celulelor în mediu nutritiv şi repartizarea în recipiente sterileIncubarea până la formarea monostratului celular (inhibiţie de contact)Monostratul poate fi infectat cu virus sau serveşte drept sursă de celule pentru o nouă cultivare (pasaj)

Mediile de cultură pentru culturi de celule conţin AA, Vit, factori de creştere, săruri minerale (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbumină, etc), roşu fenol pentru monitorizarea pH (virează în galben în mediu acid)Mediile de creştere sunt îmbogăţite cu ser sangvin (uman, animal) – pentru cultivarea CCMediile de întreţinere se utilizează pentru menţinerea monostratului în procesul reproducerii virale. Nu conţin ser. CC reprezintă sistemul virus-gazdă predilect în virologia clinică şi cercetare.

17

Page 18: Microbiologie Exam

Inocularea CC; Se aleg tuburi cu monostrat bine format; Se înlătură mediul de creştere, se spală cu sol. Hanks Se inoculează 0,1 – 0,2 ml de prelevat; Peste 30-60 min în tuburi se toarnă câte ; 1 ml mediu de întreţinereSe întroduc în termostat la t adecvată 3-4 zile

39. Izolarea virusurilor in ou embrionar de gaina. Metodele de infectare. Indicarea si identificarea virusului izolat. Oul embrionat de găină (5-13 zile) reprezintă un mediu de celule nediferenţiate, cu multiplicare activă, steril şi lipsit de mijloace de apărare antiinfecţioasă. Se utilizează în prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)- Iniţial se verifică viabilitatea embrionului la ovoscop în camera obscură. - Prelevatul se inoculează steril cu seringa în cavitatea amniotică sau alantoideană, sau pe membrana chorioalantoideană (utilizând metoda

deschisă sau închisă). - Orificiul se parafinează şi se incubează la 35-37°C timp de 48-72 ore Indicarea virusului în oul embrionat de găinăOuăle se răcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricţie maximă, apoi aseptic se taie coaja, se recoltează lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA şi embrionul se întroduc în cutii Petri sterile. Se observă:

1. Moartea embrionului2. Apariţia modificărilor (hemoragii, pustule) pe MCA3. Acumularea de HA în lichide

40. Metoda virusologica in diagnosticul virozelor. Materiale de examinat (prelevate) de la bolnav. Regulile de recoltare, ambalare si conditiile de transportare in laborator. Pregatirea pobelor pentru examinare in metoda virusologica. Etapele si esenta lor.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL VIROZELORIndicaţii: Boli cu măsuri terapeutice sau profilactice speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc)Elucidarea etiologiei virale a unor izbucniri epidemice (meningite, gastro-enterite, pneumonii, etc)Supravegherea epidemiologicăPrelevate: LCR, sânge, exsudate, secreţii nazale, rino-faringiene, mase fecale, urină, vezicule şi ulceraţii cutaneo-mucoase, bioptate, etc.Eficacitatea diagnosticului este condiţionată de:Alegerea corectă a prelevatelor, calitatea lor şi transportarea în laboratorExaminarea precoce (la debutul bolii)Transportarea rapidă a probelor sau utilizarea mediului de transport Respectarea regulilor de autoprotecţie şi de protecţie a anturajului la recoltare, transportare şi examinarea probelorMETODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELORMETODE DIRECTEExamenul virusoscopic (evidenţierea directă a virionului sau a componentelor lui în prelevate)Examenul virusologic (izolarea şi identificarea virusului)Detectarea Ag virale în prelevatIdentificarea genomului viral (hibridizarea AN, amplificarea genică – PCR)METODE INDIRECTESerodiagnosticul (creşterea de cel puţin 4 ori a titrului Ac în dinamică)EXAMENUL VIRUSOSCOPICMicroscopia optică – depistarea în prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii Guarnieri în variolă, Babeş-Negri în rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Se prepară frotiuri sau frotiuri-amprente colorate Romanovschi-Giemsa sau cu fluorocrom Microscopia electronicăImunoelectronomicroscopia – mai sensibilă, mai specifică. Se examinează complexele imune virus – AcImunofluorescenţa (directă şi indirectă) – utilizată în diagnosticul rapid al virozelor EXAMENUL VIRUSOLOGICPrelucrarea prealabilă a prelevatelor:Omogenizarea (după necesitate) Înlăturarea elementelor celulare, inclusiv bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare)Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea creşterii bacteriilor şi fungilor contaminanţi (penicilină - 500 UA/ml, streptomicină – 500 UA/ml, nistatină - 20 UA/ml)Etapele diagnosticului virusologic: Izolarea virusului; Evidenţierea (indicarea) reproducerii virale; Identificarea virusuluiIzolarea virusului se realizează prin inocularea cu material de examinat a animalelor de laborator, embrionilor de găină sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de cultivare se efectuează în funcţie de particularităţile biologice ale agentului etiologic probabil şi posibilităţile laboratorului.INDICAREA VIRUSULUIÎn culturi de celuleECP – modificări degenerative şi distrugere celulară, rezultat al multiplicării virale (rotunjire sau retracţie celulară, citoliză, apariţia vacuolelor sau granulelor în citoplasmă, picnoza nucleului, fuziunea membranelor, etc). ECP poate fi studiat la microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu hematoxilin-eozină, Giemsa, fluorocrom. Incluziuni viraleReprezintă acumulări paracristaline de virioni sau de componente virale în aria de replicare şi asamblare a virusurilor (citoplasmă, nucleu). Coloraţia Giemsa, hem-eozină, fluorocrom. Localizarea, forma şi afinitatea tinctorială (bazofile, acidofile) sunt particularităţi diagnostice pentru unele viroze.Interferenţa Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determină fenomenul de interferenţă. Pentru detectarea V.rubeolei se infectează CC cu virus citopatogen. Lipsa multiplicării acestui virus confirmă prezenţa V.rubeolei. Hemadsorbţia (RHAd) – pentru virusuri cu HA. Unele virusuri posedă în componenţa capsidei, în special supercapsidei, glicoproteine care pot adera la suprafaţa hematiilor – HA. În timpul eliberării din celulă prin înmugurire a acestor virusuri, HA lor se află deja înserate în MCP la nivelul mugurelui. Dacă la aceasta etapă în recipientul cu monostrat celular se adaugă suspensie de hematii şi se menţine 15-20 min la t caracteristică fiecărui virus, la microscop pot fi urmărite hematiile fixate la suprafaţa celulelor infectate (RHAd).Hemaglutinarea (RHA) Pentru virusurile cu HA acumulate în mediul de întreţinere. În acest caz mediul de întreţinere aglutinează eritrocitele unor specii de mamifere sau păsări.Formarea plajelor Reprezintă focare de celule alterate în monostratul celular acoperit cu agar. Numărarea plajelor permite cuantificarea virusului infectant.Proba culorii Metabolismul celular neafectat – virajul culorii mediului din roşu în galben (pH acid). Metabolismul celular inhibat – culoarea mediului nu se modifică

18

Page 19: Microbiologie Exam

Indicarea virusului în oul embrionat de găinăOuăle se răcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricţie maximă, apoi aseptic se taie coaja, se recoltează lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA şi embrionul se întroduc în cutii Petri sterile. Se observă: Moartea embrionului; Apariţia modificărilor (hemoragii, pustule) pe MCA; Acumularea de HA în lichide; Indicarea virusului pe animale de laborator; Boala manifestă a animalului, decesUrmărirea virusului în organele-ţintă: Hemaglutinare; Infecţiozitatea omogenatelor; Examene histopatologice (leziuni inflamatorii, degenerare, incluzii virale specifice: corp. Babeş-Negri în neuronii infectaţi cu V.rabic, etc) Identificarea virusurilor; Determinarea genului, speciei şi serotipului de virus prin stabilirea structurii antigenice. Se efectuează cu ajutorul serurilor imune specifice antivirale în diferite reacţii serologice: RN; RIHA/RIHAd; RFC; RIF; RIE (ELISA) ; ARI, etcDETECTAREA AG VIRALE ÎN PRELEVATEAvantaje: simplitatea şi rapiditatea examenului, nu necesită menţinerea infecţiozităţii virusuluiDezavantaje: sensibilitate direct proporţională cu cantitatea virusului din prelevatSe utilizează Ac policlonali de origine umană (seruri imune) sau Ac monoclonali (de origine murină)Reacţii: RHAI, RLA, RIF, RIE, Western-blot, ARI, etc.IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL (punerea în evidenţă a AN virali din prelevate în cursul infecţiilor virale acute sau cronice şi monitorizarea tratamentului). Pot fi examinate toate ţesuturile şi lichidele biologice. Hibridizarea acizilor nucleici fără amplificare. Hibridizarea după amplificare (PCR şi variantele ei)DIAGNOSTICUL SEROLOGICEsenţa: depistarea Ac sintetizaţi de gazdă în răspuns la o infecţie virală.După o primo-infecţie are loc inducerea formării Ac, iar după o reinfecţie sau reactivare titrul Ac creşte în dinamică. În serodiagnosticul virozelor este obligator de a examina 2 probe de ser de la bolnav : prima prelevată la debutul bolii, al doilea prelevat peste 15 zile. Ac sunt depistaţi în ser, uneori în LCR, exsudate, lichid articular, etc. Pentru depistarea Ac se utilizează Ag virale de referinţă (suspensie virală inactivată, proteine virale native sau recombinante, oligopeptide sintetice).Tehnici utilizate: RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, ARI, AIE (ELISA), etc. Semnificaţie diagnostică prezintă trecerea titrului de Ac de la 0 la pozitiv (seroconversie, primo-infecţie) sau creşterea titrului Ac de cel puţin 4 ori în cursul infecţiei. Ambele seruri vor fi testate în aceeaşi zi, prin tehnici identice şi în acelaşi laborator.

41. Rolul microorganismului in procesul infectios. Notiune de mi/o patogene. Patogenitatea si virulenta mi/o. Unitatile de virulenta. Utilizarea practica a atenuarii dirijate a virulentei.INFECŢIA – totalitatea proceselor biologice care se produc în ma/o în urma penetrării mi/o patogene sau pINFECŢIA – totalitatea proceselor biologice care se produc în ma/o în urma penetrării mi/o patogene sau potenotenţţial ial ppatogene (PP)atogene (PP). . PROCESUL INFECŢIOS – interacţiunea dintre mi/o şi ma/o în diverse condiţii ale mediului ambiant. Manifestarea lui poate fi PROCESUL INFECŢIOS – interacţiunea dintre mi/o şi ma/o în diverse condiţii ale mediului ambiant. Manifestarea lui poate fi inaparentăinaparentă / / asimptomaticăasimptomatică (stare de portaj sănătos, eliminarea rapidă a mi/o) sau (stare de portaj sănătos, eliminarea rapidă a mi/o) sau simptomaticăsimptomatică..MALADIA INFECŢIOASĂ – manifestarea supremă a procesului infecţios MALADIA INFECŢIOASĂ – manifestarea supremă a procesului infecţios diferite simptome diferite simptome efectele metaboliţilor microbieni (toxine, enzimeefectele metaboliţilor microbieni (toxine, enzime, , etcetc) sau de reacţia imună a gazdei la prezenţa bacteriei. ) sau de reacţia imună a gazdei la prezenţa bacteriei. Particularităţile bolii infecţioaseParticularităţile bolii infecţioase

1.1. provocata de agenţi patogeni provocata de agenţi patogeni 2.2. Contagiozitate (capacitatea de a se transmite de la o sursă la Contagiozitate (capacitatea de a se transmite de la o sursă la o o persoană receptivă)persoană receptivă)3.3. Specificitate (un agent provoacă o infecţie, ex.: Specificitate (un agent provoacă o infecţie, ex.: Clostridium tetaniClostridium tetani este agentul tetanosului, etc.) este agentul tetanosului, etc.)4.4. Evoluţie clinică Evoluţie clinică stadială; stadială; Imunitate la reinfecţieImunitate la reinfecţie (durată variabilă)(durată variabilă)5.5. Apariţia maladiei depinde de multipli factori, în special de Apariţia maladiei depinde de multipli factori, în special de capacitatea agentului cauzal de a provoca maladiacapacitatea agentului cauzal de a provoca maladia şi de şi de gradul de rezistenţă agradul de rezistenţă all

gazdeigazdei la această invazie la această invazieROLUL MICROORGANISMULUI ÎN PROCESUL INFECŢIOS. PATOGENITATEA ŞI VIRULENŢAROLUL MICROORGANISMULUI ÎN PROCESUL INFECŢIOS. PATOGENITATEA ŞI VIRULENŢARelaţiile dintre mi/o şi ma/o gazdă: Relaţiile dintre mi/o şi ma/o gazdă: ComensalismComensalism (flora bucală, intestinală, etc); (flora bucală, intestinală, etc); Parazitism Parazitism (prezenţa mi/o este nocivă pentru ma/o). Orice (prezenţa mi/o este nocivă pentru ma/o). Orice mi/o “parazit” capabil să provoace o infecţie (condiţii adecvate) este considerat mi/o “parazit” capabil să provoace o infecţie (condiţii adecvate) este considerat patogen. patogen. Există 2 tipuri de mi/o patogene:Există 2 tipuri de mi/o patogene:

Obligat (cert) patogeneObligat (cert) patogene, care infectează persoane imunocompetente cu doze mici , care infectează persoane imunocompetente cu doze mici Potenţial patogenePotenţial patogene (oportuniste), care pot cauza infecţie numai cu doze mari sau la persoane imunocompromise (deseori fac parte din flora (oportuniste), care pot cauza infecţie numai cu doze mari sau la persoane imunocompromise (deseori fac parte din flora normală a organismului)normală a organismului)

Mi/o patogene pot fi găzduite uneori fără a provoca maladia, astfel de persoane sunt numite Mi/o patogene pot fi găzduite uneori fără a provoca maladia, astfel de persoane sunt numite purtători purtători sănătoşi de germeni.sănătoşi de germeni.Microorganismele patogene se caracterizează prin:Microorganismele patogene se caracterizează prin:

PatogenitatePatogenitate – capacitatea unei bacterii de a declanşa infecţia. Este – capacitatea unei bacterii de a declanşa infecţia. Este un un caracter de speciecaracter de specie determinat genetic (cromozom, plasmide, determinat genetic (cromozom, plasmide, bacteriofagi). În cadrul unei specii patogene pot exista tulpini cu manifestare variată a patogenităţii – de la absenţa totală până la foarte bacteriofagi). În cadrul unei specii patogene pot exista tulpini cu manifestare variată a patogenităţii – de la absenţa totală până la foarte înaltă.înaltă.

VirulenţăVirulenţă – gradul de patogenitate a – gradul de patogenitate all unei unei tulpinitulpini (măsură cantitativă a patogenităţii). Se apreciază prin infectarea animalelor de laborator (măsură cantitativă a patogenităţii). Se apreciază prin infectarea animalelor de laborator cu cantităţi diferite de mi/o.cu cantităţi diferite de mi/o.

Unităţile de virulenţă:Unităţile de virulenţă:DLM – numărul de bacterii necesar pentru a ucide 80% DLM – numărul de bacterii necesar pentru a ucide 80% din din animaleanimalelele infectate infectateDLDL50 50 – 50% letalitate– 50% letalitateDCL – 100% letalitateDCL – 100% letalitateDIDI5050/DI/DI – provoacă boala la 50% – provoacă boala la 50% / 80% / 80% animale animale

Modificarea virulenţei:Modificarea virulenţei:AmplificareaAmplificarea prin transfer prin transfer şi recombinare genetică, condiţii optime pentru creştereşi recombinare genetică, condiţii optime pentru creştereReducereaReducerea (atenuarea) prin menţinerea bacteriilor în condiţii nefavorabile (t, factori chimici, etc) (atenuarea) prin menţinerea bacteriilor în condiţii nefavorabile (t, factori chimici, etc), muta, mutaţiiţii

42. Caracteristica mi/o patogene. Factorii de patogenitate. Clasificarea. Rolul factorilor de patogenitate de structura si al enzimelor de patogenitate in evolutia infectiei.Bacteria patogenă trebuie:Bacteria patogenă trebuie:

1.1. Să fie capabilă de a se Să fie capabilă de a se transmitetransmite între gazde între gazde2.2. Să Să penetrezepenetreze în organismul-gazdă în organismul-gazdă3.3. Să se Să se răspândeascărăspândească prin organism prin organism4.4. Să se Să se multiplice şi să persistemultiplice şi să persiste (evitând sau distrugând sistemul imun al gazdei) (evitând sau distrugând sistemul imun al gazdei)5.5. Să Să producă leziuniproducă leziuni

Aceste capacităţi sunt asAceste capacităţi sunt asiigurate de gurate de factorii de patogenitate.factorii de patogenitate.Factorii de patogenitate ai bacteriilorFactorii de patogenitate ai bacteriilorFactori structurali (somatici)Factori structurali (somatici)

AdezineAdezine - fimbriile, glicocalixul, proteine de adeziune ale peretelui celular. Asigură aderarea bacteriilor la receptorii de pe suprafaţa - fimbriile, glicocalixul, proteine de adeziune ale peretelui celular. Asigură aderarea bacteriilor la receptorii de pe suprafaţa celulelor-ţintă sau la proteine matriciale extracelulare celulelor-ţintă sau la proteine matriciale extracelulare (colagen, fibronectină, laminină, elastină, etc) (colagen, fibronectină, laminină, elastină, etc)

19

Page 20: Microbiologie Exam

Proteine ale sistemelor de secreţieProteine ale sistemelor de secreţie (tipuri I-IV) (tipuri I-IV) CapsulaCapsula – antifagocitar, anti-complement – antifagocitar, anti-complement Ag KAg K Antigenul OAntigenul O - antifagocitar - antifagocitar PeptidoglicanulPeptidoglicanul (adeziune, agresie tisulară) (adeziune, agresie tisulară) Acizii teichoici/lipoteichoiciAcizii teichoici/lipoteichoici (adeziune, toxicitate) (adeziune, toxicitate) Proteina AProteina A la stafilococi la stafilococi (acţiune antifagocitară prin fixarea Fc a IgG) (acţiune antifagocitară prin fixarea Fc a IgG) Proteina MProteina M la streptococi la streptococi (adeziune, antifagocitar) (adeziune, antifagocitar)

Enzime de patogenitate Enzime de patogenitate (responsabile de persistenţă, diseminare şi producerea leziunilor)(responsabile de persistenţă, diseminare şi producerea leziunilor) PlasmocoagulazaPlasmocoagulaza ( (formarea trombilor septici-formarea trombilor septici-efect antifagocitar, efect antifagocitar, propagarepropagare îîn organism)n organism) FibrinolizinaFibrinolizina (eliberarea bacteriilor din trombi) (eliberarea bacteriilor din trombi) HialuronidazaHialuronidaza (di (diseminarseminare, e, leziunileziuni tisular tisularee)) ColagenazaColagenaza (identic) (identic) Neuraminidaza (lichefierea mucusului)Neuraminidaza (lichefierea mucusului) Proteaze (ex.: distrugerea Ig A secretorii)Proteaze (ex.: distrugerea Ig A secretorii) DezaminazeDezaminaze Decarboxilaze Decarboxilaze Fosfataze, etc Fosfataze, etc

Toxine bacteriene Toxine bacteriene (responsabile de leziuni): (responsabile de leziuni): ExotoxineExotoxine (proteice, secretate în mediul extracelular); (proteice, secretate în mediul extracelular); EndotoxineEndotoxine (LPZ, legate de celula bacteriană) (LPZ, legate de celula bacteriană)Moduline şi invazine: Moduline şi invazine: Injectate la suprafaţa sau direct în interiorul celulei-ţintă; Induc penetrarea (internalizarea) şi propagarea bacteriană. Se Injectate la suprafaţa sau direct în interiorul celulei-ţintă; Induc penetrarea (internalizarea) şi propagarea bacteriană. Se întâlnesc la Yersinia, Shigella, Salmonella, Escherichiaîntâlnesc la Yersinia, Shigella, Salmonella, EscherichiaAlţi factori ce asigură persistenţa mi/o: Variaţii antigenice; Mimicria antigenicăAlţi factori ce asigură persistenţa mi/o: Variaţii antigenice; Mimicria antigenică

43. Toxinele microbiene. Tipurile de toxine si caracteristica lor. Rolul in patogeneza infectiei. Caracteristica exotoxinelorCaracteristica exotoxinelor::

Proteine produse de bacterii G+/G-Proteine produse de bacterii G+/G- Pot fi secretate în mediul extern, eliberate în spaţiul periplasmic sau fixate pe suprafaţa celuleiPot fi secretate în mediul extern, eliberate în spaţiul periplasmic sau fixate pe suprafaţa celulei Termolabile (excepţie – enterotoxina stafilococică şi TSTermolabile (excepţie – enterotoxina stafilococică şi TS (toxina termostabilă) a (toxina termostabilă) a E. coliE. coli)) Hidrosolubile şi acţionează la distanţăHidrosolubile şi acţionează la distanţă Efectul se instalează după o perioadă de incubaţieEfectul se instalează după o perioadă de incubaţie Manifestă tropism (specificitate de acţiune)Manifestă tropism (specificitate de acţiune) Toxicitate înaltă (DLM de ordinul ng/kg)Toxicitate înaltă (DLM de ordinul ng/kg) Exotoxinele sunt imunogene (induc sinteza Exotoxinele sunt imunogene (induc sinteza antianticcorpilororpilor - antitoxine) - antitoxine) Antitoxinele neutralizează activitatea exotoxinei (faza de fixare pe receptorii celulari)Antitoxinele neutralizează activitatea exotoxinei (faza de fixare pe receptorii celulari)

Exotoxinele tratate cu formol 0,4% şi menţinute la 39-40Exotoxinele tratate cu formol 0,4% şi menţinute la 39-40 °° C timp de 3-4 săptămâni se transformă în anatoxine. Ele sunt lipsite de toxicitate dar C timp de 3-4 săptămâni se transformă în anatoxine. Ele sunt lipsite de toxicitate dar păstrează imunogenitatea (utilizate în calitate de vaccin).păstrează imunogenitatea (utilizate în calitate de vaccin).Suportul genetic al exotoxinelor: Suportul genetic al exotoxinelor: cromozomcromozom (dizenterică), (dizenterică), plasmide plasmide (toxina antraxului, toxina tetanică), (toxina antraxului, toxina tetanică), profagi profagi (toxina difterică, botulinică).(toxina difterică, botulinică).

Tipurile de exotoxine:Tipurile de exotoxine:Toxine citolitice. Toxine citolitice. Dereglează membranele celulare prin acţiune enzimatică (fosfolipaza /lecitinaza, sfingomielinaza) sau prin formarea porilor Dereglează membranele celulare prin acţiune enzimatică (fosfolipaza /lecitinaza, sfingomielinaza) sau prin formarea porilor (streptolizina O, (streptolizina O, αα-toxina/hemolizina -toxina/hemolizina S.aureusS.aureus, leucocidina), leucocidina)Toxine citotoxiceToxine citotoxice, de tip A-B (acţionează în interiorul celulei). Ex.: toxina difterică, botulinică, tetanică, holerică, etc, de tip A-B (acţionează în interiorul celulei). Ex.: toxina difterică, botulinică, tetanică, holerică, etc

Au structură bipartită: fracţia polipeptidică Au structură bipartită: fracţia polipeptidică B B ((cell bindingcell binding) este responsabilă de legarea de receptorii specifici din membrana celulei-ţintă, ) este responsabilă de legarea de receptorii specifici din membrana celulei-ţintă, fracţia polipeptidică fracţia polipeptidică AA ( (activeactive) pătrunde în celulă (prin endocitoză sau translocare) şi determină activitatea toxică.) pătrunde în celulă (prin endocitoză sau translocare) şi determină activitatea toxică.

Fiecare citotoxină acţionează strict Fiecare citotoxină acţionează strict specificspecific: toxina difterică – inhibă sinteza proteinelor, toxina botulinică şi tetanică – neurotoxine, inhibă : toxina difterică – inhibă sinteza proteinelor, toxina botulinică şi tetanică – neurotoxine, inhibă eliberarea neurotransmiţătorilor, toxina holerică şi pertusică – activează adenilat-ciclaza membranară, etceliberarea neurotransmiţătorilor, toxina holerică şi pertusică – activează adenilat-ciclaza membranară, etcObţinerea exotoxinelor bacterieneObţinerea exotoxinelor bacteriene

Cultivarea tulpinii toxigene în mediu lichidCultivarea tulpinii toxigene în mediu lichid Filtrarea culturii pentru separarea toxineiFiltrarea culturii pentru separarea toxinei Purificarea toxineiPurificarea toxinei Concentrarea toxineiConcentrarea toxinei Determinarea activităţii Determinarea activităţii toxinei (se mtoxinei (se măăsoarsoarăă in unit in unităţăţi de floculare – i de floculare – Lf Lf ))

Caracteristica endotoxinelor:Caracteristica endotoxinelor: Complexe LPZ din peretele celular G- (cel mai toxic component este lipidul A).Complexe LPZ din peretele celular G- (cel mai toxic component este lipidul A). Este eliberată în urma lizei bacteriilor (sub influenţa sistemului imun al gazdei sau a unor AB). Este eliberată în urma lizei bacteriilor (sub influenţa sistemului imun al gazdei sau a unor AB). TermostabilăTermostabilă Ne-imunogenăNe-imunogenă Nu poate fi transformată în anatoxinăNu poate fi transformată în anatoxină DLM de ordinul mg/kgDLM de ordinul mg/kg Efectul se manifestă imediatEfectul se manifestă imediat Determină efecte generale, indiferent de provenienţă Determină efecte generale, indiferent de provenienţă

Mecanismul de acţiune al endotoxineiMecanismul de acţiune al endotoxinei : LPZ induce secreţia unor substanţe biologic active (citokine pro-inflamatoare: IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a) : LPZ induce secreţia unor substanţe biologic active (citokine pro-inflamatoare: IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a) de către macrofage şi alte celule. Iniţial LPZ se leagă de o proteină serică de către macrofage şi alte celule. Iniţial LPZ se leagă de o proteină serică (LPS-binding protein) (LPS-binding protein) acest complex interacţionează cu CD 14 de pe acest complex interacţionează cu CD 14 de pe membrana macrofagului. Există şi molecule solubile de CD 14, astfel endotoxina poate să acţioneze asupra altor celule, de ex.: celulele epiteliale. membrana macrofagului. Există şi molecule solubile de CD 14, astfel endotoxina poate să acţioneze asupra altor celule, de ex.: celulele epiteliale. Un alt receptor macrofagic poate interacţiona cu LPZ – receptorul Un alt receptor macrofagic poate interacţiona cu LPZ – receptorul toll-liketoll-like (TLR4). (TLR4). În doze mariÎn doze mari citokinele citokinele pot provoca pot provoca şocul endotoxinic (septic),şocul endotoxinic (septic), comun pentru toate bacteriile G-: comun pentru toate bacteriile G-:

Febră (eliberarea pirogenilor IL-1, TNF de către celulele care au captat endotoxina)Febră (eliberarea pirogenilor IL-1, TNF de către celulele care au captat endotoxina) Leucopenie, urmată de leucocitozăLeucopenie, urmată de leucocitoză Tulburări de coagulare (activarea factorului XII – formarea fibrinei şi obstrucţia capilarelor sanguine – coagulare intravenoasă diseminată)Tulburări de coagulare (activarea factorului XII – formarea fibrinei şi obstrucţia capilarelor sanguine – coagulare intravenoasă diseminată) Hemoragii (consumarea factorilor de coagulare) în diverse organe (rinichi, suprarenale, plămâni, creier)Hemoragii (consumarea factorilor de coagulare) în diverse organe (rinichi, suprarenale, plămâni, creier) Vazodilatare, urmată de colaps vascular (sechestrarea periferică a sângelui, hipovolemie, acidoză metabolică, scăderea bruscă a presiunii Vazodilatare, urmată de colaps vascular (sechestrarea periferică a sângelui, hipovolemie, acidoză metabolică, scăderea bruscă a presiunii

sanguine)sanguine) În consecinţă au loc leziuni hemoragice şi necroză în diverse organe (rinichi, suprarenale, plămâni, creier...). În consecinţă au loc leziuni hemoragice şi necroză în diverse organe (rinichi, suprarenale, plămâni, creier...). Pronosticul este foarte sever.Pronosticul este foarte sever.

20

Page 21: Microbiologie Exam

44. Rezistenta nespecifica a macroorganismului. Notiune. Factorii care asigura rezistenta nespecifica. Rolul factorilor tisulari (de bariera) si umorali in prevenirea infectiei.Sursa de infecţieSursa de infecţie: : omulomul bolnav, reconvalescent, purtător sănătos (infecţii antroponoze) sau bolnav, reconvalescent, purtător sănătos (infecţii antroponoze) sau animalele animalele (infecţii zooantroponoze).(infecţii zooantroponoze).Mecanismele de transmitereMecanismele de transmitere

Prin contact (direct, indirect)Prin contact (direct, indirect) Fecal-oral (alimentar, hidric, etc)Fecal-oral (alimentar, hidric, etc) Aerogen (aer-praf, aer-picături) Aerogen (aer-praf, aer-picături) TransmisiTransmisivv ( (prin intermediul prin intermediul vectorivectorilorlor)) Vertical (transplacentar) Vertical (transplacentar)

Microbii penetrează prin tegument, mucoase sau direct în sânge (porţi de intrare). Un microb poate avea una sau mai multe porţi de intrare.Microbii penetrează prin tegument, mucoase sau direct în sânge (porţi de intrare). Un microb poate avea una sau mai multe porţi de intrare.Doza critică – ex.: dizenterie – 10Doza critică – ex.: dizenterie – 102 2 mi/o, febră tifoidă – 10mi/o, febră tifoidă – 1055 , holeră – 10 , holeră – 1099 . .

La poarta de intrare bacteria aderă la celule (La poarta de intrare bacteria aderă la celule (adeziuneaadeziunea) şi se multiplică local () şi se multiplică local (colonizareacolonizarea), formând ), formând focarul primar de infecţiefocarul primar de infecţie. Infecţia poate . Infecţia poate rămâne localizată sau poate să se răspândească rămâne localizată sau poate să se răspândească (invazia) (invazia) pe cale pe cale limfatică, sanguinălimfatică, sanguină, , pe calea nervilorpe calea nervilor sau prin sau prin continuitatecontinuitate (din aproape în (din aproape în aproape). În ţesutul afectat mi/o se multiplică şi provoacă leziuni direct prin intermediul enzimelor sau toxinelor sau indirect, via mecanisme aproape). În ţesutul afectat mi/o se multiplică şi provoacă leziuni direct prin intermediul enzimelor sau toxinelor sau indirect, via mecanisme imune. imune. Mi/o se elimină cu diferite secrete sau excrete ale ma/o, prin care are loc contaminarea altor gazdeMi/o se elimină cu diferite secrete sau excrete ale ma/o, prin care are loc contaminarea altor gazde sau obiecte. sau obiecte.Dinamica evoluţiei bolii infecţioaseDinamica evoluţiei bolii infecţioase

1.1. Perioada de Perioada de incubaţieincubaţie (de la penetrarea mi/o până la apariţia primelor simptome). Durata – variabilă (ore – ani). Microbul se adaptează, se (de la penetrarea mi/o până la apariţia primelor simptome). Durata – variabilă (ore – ani). Microbul se adaptează, se multiplică, produce toxine, enzime, etc.multiplică, produce toxine, enzime, etc.

2.2. Perioada de Perioada de invazieinvazie (prodromală, de debut). Apar primele semne clinice, nespecifice (febră, frison, inapetenţă, astenie, etc). Durata – 2-3 (prodromală, de debut). Apar primele semne clinice, nespecifice (febră, frison, inapetenţă, astenie, etc). Durata – 2-3 zile.zile.

3.3. Perioada de Perioada de starestare (a manifestărilor clinice specifice). Durata variabilă. (a manifestărilor clinice specifice). Durata variabilă.4.4. Perioada Perioada terminalăterminală (convalescenţă şi vindecare, sau cronicizare, sau stare de portaj, sau deces) (convalescenţă şi vindecare, sau cronicizare, sau stare de portaj, sau deces)

Criteriile de apreciere a rolului etiologic al agentului cauzal în survenirea infecţiilor specifice (postulatele lui Koch) Criteriile de apreciere a rolului etiologic al agentului cauzal în survenirea infecţiilor specifice (postulatele lui Koch) Bacteria trebuie să fie prezentă la toate persoanele bolnave.Bacteria trebuie să fie prezentă la toate persoanele bolnave. Bacteria trebuie să fie izolată de la bolnav şi menţinută în cultură pură.Bacteria trebuie să fie izolată de la bolnav şi menţinută în cultură pură. Cultura pură inoculată la un voluntar sau la un animal experimental trebuie să reproducă simptomele bolii.Cultura pură inoculată la un voluntar sau la un animal experimental trebuie să reproducă simptomele bolii. Aceeaşi bacterie trebuie să fie reizolată de la voluntarAceeaşi bacterie trebuie să fie reizolată de la voluntarulul sau animalul infectat. sau animalul infectat.

Actualmente se insistă pe genomul bacterian Actualmente se insistă pe genomul bacterian (prezenţa genelor de patogenitate).(prezenţa genelor de patogenitate).Rolul mediului ambiant şi social în infecţie (condiţiile economice, condiţiile de viaţă, catastrofe ecologice sau naturale, progresul în igiena publică, Rolul mediului ambiant şi social în infecţie (condiţiile economice, condiţiile de viaţă, catastrofe ecologice sau naturale, progresul în igiena publică, etc). etc). Maladii Maladii sociale: tuberculoza, pediculoza (tifosul exantematic), sifilisul, etc.sociale: tuberculoza, pediculoza (tifosul exantematic), sifilisul, etc.Rolul macroorganismului în procesul infecţios. Rezistenţa nespecifică a ma/o.Rolul macroorganismului în procesul infecţios. Rezistenţa nespecifică a ma/o.Pentru menţinerea coerenţei celulelor şi ţesuturilor şi păstrarea integrităţii sale ma/o pune în joc 2 categorii de procese apărute succesiv în Pentru menţinerea coerenţei celulelor şi ţesuturilor şi păstrarea integrităţii sale ma/o pune în joc 2 categorii de procese apărute succesiv în cursul evoluţiei:cursul evoluţiei:Rezistenţa nespecifică, înnăscută – dezvoltată filogenetic, asigurată de factori constituţionali. Răspuns maxim imediat, nespecific, antigen-Rezistenţa nespecifică, înnăscută – dezvoltată filogenetic, asigurată de factori constituţionali. Răspuns maxim imediat, nespecific, antigen-independent.independent.Imunitatea (rezistenţa specifică) – s-a dezvoltat ontogenetic, Ag-dependentă şi Ag-specifică, răspuns maxim peste câteva zile de la agresie, se Imunitatea (rezistenţa specifică) – s-a dezvoltat ontogenetic, Ag-dependentă şi Ag-specifică, răspuns maxim peste câteva zile de la agresie, se caracterizează prin memorie imunologică. caracterizează prin memorie imunologică.

Rezistenţa nespecifică: Rezistenţa nespecifică: Rezistenţa nespecifică este asigurată de factori tisulari (de barieră), factori celulari şi umorali.Rezistenţa nespecifică este asigurată de factori tisulari (de barieră), factori celulari şi umorali.Factori tisulari (de barieră)Factori tisulari (de barieră)

1.1. TegumentulTegumentul ( (barieră mecanică barieră mecanică - integritatea, descuamarea stratului cornos; - integritatea, descuamarea stratului cornos; barieră biologică barieră biologică -flora normală, -flora normală, chimică chimică - pH acid al - pH acid al tegumentului)tegumentului)

2.2. MucoaseleMucoasele ( (barieră mecanică barieră mecanică - integritatea, mişcarea cililor, scurgerea secretelor; - integritatea, mişcarea cililor, scurgerea secretelor; chimică chimică -secreţiile digestive, pH acid al urinei; -secreţiile digestive, pH acid al urinei; biologicăbiologică -flora normală; -flora normală; barieră enzimaticăbarieră enzimatică – enzimele din secreţiile mucoaselor, ex.: lizozimul, lactoferina) – enzimele din secreţiile mucoaselor, ex.: lizozimul, lactoferina)

Dacă barierele au fost depăşite, atunci organismul dispune de alţi factori de rezistenţă nespecifică: factori celulari şi umorali. Dacă barierele au fost depăşite, atunci organismul dispune de alţi factori de rezistenţă nespecifică: factori celulari şi umorali. Factori umorali de rezistenţă nespecificăFactori umorali de rezistenţă nespecificăReactivi de fază acută Reactivi de fază acută – organismul supus unei agresiuni reacţionează prin sinteza şi secreţia crescută a unor proteine plasmatice: – organismul supus unei agresiuni reacţionează prin sinteza şi secreţia crescută a unor proteine plasmatice:

inhibitori de proteazeinhibitori de proteaze proteine ale sistemului complement şi ale coagulăriiproteine ale sistemului complement şi ale coagulării proteina C reactivăproteina C reactivă protrombina, fibrinogenul, etc. protrombina, fibrinogenul, etc.

Acestea măresc rezistenţa gazdei, limitează leziunile tisulare si favorizează vindecarea.Acestea măresc rezistenţa gazdei, limitează leziunile tisulare si favorizează vindecarea.1.1. ComplementulComplementul – reprezintă un sistem complex de proteine termolabile solubile şi membranare. Se întâlnesc în plasma sangvină, limfă şi – reprezintă un sistem complex de proteine termolabile solubile şi membranare. Se întâlnesc în plasma sangvină, limfă şi

exsudate. Nu se detectează în salivă, lacrimi, urină, transsudate.exsudate. Nu se detectează în salivă, lacrimi, urină, transsudate.Există peste 30 de fracţii ale C. C1-C9 sunt solubile, celelalte au rol de receptori membranari.Există peste 30 de fracţii ale C. C1-C9 sunt solubile, celelalte au rol de receptori membranari.Fracţiile C1-C9 circulă în ser sub formă inactivă, care în procesul activării capătă proprietăţi enzimatice.Fracţiile C1-C9 circulă în ser sub formă inactivă, care în procesul activării capătă proprietăţi enzimatice.Activitatea biologică a complementului:Activitatea biologică a complementului:

Opsonizarea bacteriilor Opsonizarea bacteriilor Acţiune citoliticăAcţiune citolitică Activitate anafilactică – stimulare chimiotaxis Activitate anafilactică – stimulare chimiotaxis activare neutrofilele, degranularea mastocitelor,bazofilelor activare neutrofilele, degranularea mastocitelor,bazofilelorActivarea limfocitelor BActivarea limfocitelor B

2.2. ProperdinaProperdina – proteine serice care participă la activarea complementului pe cale alternativă. – proteine serice care participă la activarea complementului pe cale alternativă.3.3. ββ-lizinele-lizinele – proteine serice termostabile (63 grade) cu activitate antimicrobiană asupra bacteriilor G+ în special – proteine serice termostabile (63 grade) cu activitate antimicrobiană asupra bacteriilor G+ în special4.4. X – lizinaX – lizina, proteină serică termostabilă (70-100 grade), produce liza bacteriilor G –, proteină serică termostabilă (70-100 grade), produce liza bacteriilor G –5.5. Lizozimul Lizozimul – prezent în lacrimi, salivă, ser sanguin, favorizează liza bacteriilor– prezent în lacrimi, salivă, ser sanguin, favorizează liza bacteriilor6.6. Anticorpii normaliAnticorpii normali7.7. Interferonii Interferonii (glicoproteine cu acţiune antivirală, antiproliferativă şi imunomodulatoare)(glicoproteine cu acţiune antivirală, antiproliferativă şi imunomodulatoare)

45. Rezistenta nespecifica a macroorganismului. Notiune. Factorii celulari de rezistenta nespecifica. Fagocitoza: celulele fagocitare, etapele fagocitozei. Notiune de opsonine si opsonizare. Rolul fagocitozei in initierea raspunsului imun.Factori celulari de rezistenţă nespecifică:Factori celulari de rezistenţă nespecifică:Reacţia inflamatoareReacţia inflamatoare. Împiedică multiplicarea şi răspândirea microbilor şi asigură distrugerea lor.. Împiedică multiplicarea şi răspândirea microbilor şi asigură distrugerea lor.FagocitozaFagocitoza (component al reacţiei inflamatoare). Asigură captarea şi distrugerea substanţelor străine, inclusiv a mi/o, celulelor infectate, (component al reacţiei inflamatoare). Asigură captarea şi distrugerea substanţelor străine, inclusiv a mi/o, celulelor infectate, celulelor tumorale.celulelor tumorale.Celulele fagocitare (fagocitele)Celulele fagocitare (fagocitele)

21

Page 22: Microbiologie Exam

1.1. Leucocitele PMNLeucocitele PMN2.2. Macrofagele (Macrofagele (monocitemonocite – în sânge, – în sânge, macrofage fixemacrofage fixe – cel. Kupffer, macrofage alveolare, osteoclaste, microglia, macrofage din splină şi – cel. Kupffer, macrofage alveolare, osteoclaste, microglia, macrofage din splină şi

ganglioni limfatici).ganglioni limfatici).Pentru a interveni, fagocitele trebuie să recunoască bacteriile ca particule străine. Pentru a interveni, fagocitele trebuie să recunoască bacteriile ca particule străine. Există molecule solubile şi membranare care pot recunoaşte componente bacteriene: Există molecule solubile şi membranare care pot recunoaşte componente bacteriene:

SolubileSolubile – lectinele care se pot lega de manoza din PC; proteine plasmatice ce leagă LPZ bacterian – lectinele care se pot lega de manoza din PC; proteine plasmatice ce leagă LPZ bacterian MembranareMembranare – pe macrofage există receptori de manoză, receptorul CD 14 pentru LPZ, receptori – pe macrofage există receptori de manoză, receptorul CD 14 pentru LPZ, receptori Toll-likeToll-like (TLR). TLR pot recunoaşte (TLR). TLR pot recunoaşte

diferite molecule bacteriene: LPZ, PG, lipoproteine, acizi lipoteichoici, flagelina. diferite molecule bacteriene: LPZ, PG, lipoproteine, acizi lipoteichoici, flagelina. Alţi receptoriAlţi receptori: receptori pentru Fc al IgG, pentru complement (CR1, CR3, CR4), pentru interferon, limfokine, lectine, fibronectină, ş.a. : receptori pentru Fc al IgG, pentru complement (CR1, CR3, CR4), pentru interferon, limfokine, lectine, fibronectină, ş.a.

FAZELE FAGOCITOZEIFAZELE FAGOCITOZEI1.1. Chemotaxisul (atractanţi – proteine bacteriene, fragmente de PC, capsule, LPZ, chemokine, etc) Chemotaxisul (atractanţi – proteine bacteriene, fragmente de PC, capsule, LPZ, chemokine, etc) 2.2. Adeziunea mi/o la fagocitAdeziunea mi/o la fagocit (fagocitul recunoa (fagocitul recunoaşte molecule străine de pe suprafaţa bacteriilor – monomeri de PG, acizi teichoici, LPZ, acid şte molecule străine de pe suprafaţa bacteriilor – monomeri de PG, acizi teichoici, LPZ, acid

micolicmicolic, AD, ADN bacterianN bacterian, ARNd.c., ARNd.c. viral viral, manoza,, manoza, glicani din fungi, etc glicani din fungi, etc ))Inhibitori Inhibitori – capsula, Ag O, prot. M, prot. A, plasmo-coagulaza– capsula, Ag O, prot. M, prot. A, plasmo-coagulaza, etc, etc. Bacteriile patogene care nu pot fi fagocitate se numesc . Bacteriile patogene care nu pot fi fagocitate se numesc extracelulare.extracelulare.StimulatoriStimulatori – cationi de Ca – cationi de Ca2+2+, prot. C -, prot. C - reactivă, reactivă, opsonineopsonine (fracţii de complement (C3b), fibronectina, unii Ac). Datorită receptorilor opsoninele (fracţii de complement (C3b), fibronectina, unii Ac). Datorită receptorilor opsoninele acoperă suprafaţa bacteriilor (opsonizare). Fagocitele de asemenea posedă receptori pentru opsonine şi astfel facilitează adeziunea şi ingestia acoperă suprafaţa bacteriilor (opsonizare). Fagocitele de asemenea posedă receptori pentru opsonine şi astfel facilitează adeziunea şi ingestia mi/o. mi/o.

3.3. Ingestia (înglobarea) şi formarea fagosomei.Ingestia (înglobarea) şi formarea fagosomei.4.4. Distrugerea (digestia) intracitoplasmatică. Fagosoma fuzionează cu Lz Distrugerea (digestia) intracitoplasmatică. Fagosoma fuzionează cu Lz fagolizosom fagolizosom mi/o va fi omorât sub acţiunea E, anionilor mi/o va fi omorât sub acţiunea E, anionilor

superoxizi, Hsuperoxizi, H22OO22, pH acid, apoi digerat de E hidrolitice., pH acid, apoi digerat de E hidrolitice.5.5. Produsele degradate pot fiProdusele degradate pot fi eliminate eliminate din celulă (PMN, macrofagele) sau după o selecţie şi pregătire prealabilă din celulă (PMN, macrofagele) sau după o selecţie şi pregătire prealabilă (processing)(processing) unele peptide unele peptide

vor fi vor fi expuse pe membrana macrofagelor în asociaţie cu molecule ale CMH.expuse pe membrana macrofagelor în asociaţie cu molecule ale CMH. Ele vor contribui la stimularea imunităţii prin interacţiunea cu Ele vor contribui la stimularea imunităţii prin interacţiunea cu receptorul pentru Ag de pe limfocitele T. Aceasta este receptorul pentru Ag de pe limfocitele T. Aceasta este fagocitoza completăfagocitoza completă..

Fagocitoza incompletăFagocitoza incompletă – agentul persistă şi se multiplică în fagocit (micobacterii, gonococi). – agentul persistă şi se multiplică în fagocit (micobacterii, gonococi). Cauze:Cauze: inhibiţia formării fagolizosomei, eliminarea inhibiţia formării fagolizosomei, eliminarea bacteriei din fagosomă înainte de fuziunea cu lizosoma, etc). Aceştia sunt patogenibacteriei din fagosomă înainte de fuziunea cu lizosoma, etc). Aceştia sunt patogeni facultativ intracelulari. facultativ intracelulari.Aprecierea stării funcţionale a fagocitelor: Aprecierea stării funcţionale a fagocitelor: Procentul fagociProcentul fagocitetelor activlor activee (N - 30-60%) – ponderea fagocitelor care au înglobat cel puţin un mi/o. (N - 30-60%) – ponderea fagocitelor care au înglobat cel puţin un mi/o. Numărul fagocitar (N - 4 - 24) – nr de mi/o înglobate în mediu de un fagocitNumărul fagocitar (N - 4 - 24) – nr de mi/o înglobate în mediu de un fagocitAlte celule cu activitate nespecifică: celulele K şi NKAlte celule cu activitate nespecifică: celulele K şi NK

46. Notiune de antigen. Proprietatile de baza ale antigenelor (imunogenitatea si antigenitatea). Antigenele complete si incomplete (haptenele), caracteristica lor. Antigenele T-dependente si T-independente. Determinantele antigenice (epitopii), tipurile. Valenta antigenului.ANTIGENELEANTIGENELE – substanţe străine – substanţe străine (non-self)(non-self) de natură endo-/exo-genă capabile să declanşeze un răspuns imun (umoral, celular, toleranţă de natură endo-/exo-genă capabile să declanşeze un răspuns imun (umoral, celular, toleranţă imunologică, memorie imunologică, paralizie imunologică).imunologică, memorie imunologică, paralizie imunologică).Proprietăţile de bază ale Ag:Proprietăţile de bază ale Ag:

Imunogenitatea – capacitatea Ag de a Imunogenitatea – capacitatea Ag de a fi recunoscut ca strfi recunoscut ca străăin in şşi de ai de a induce răspuns imun specific induce răspuns imun specific Antigenitatea (specificitatea) – capacitatea Ag de a interacţiona specific cu Ac sau cu receptorul pentru Ag complementar al limfocitelor Antigenitatea (specificitatea) – capacitatea Ag de a interacţiona specific cu Ac sau cu receptorul pentru Ag complementar al limfocitelor

sensibilizate sensibilizate Antigenele care posedă ambele caractere sunt Antigenele care posedă ambele caractere sunt Ag completeAg complete. . Cerinţele faţă de Ag complete:Cerinţele faţă de Ag complete:

Să fie substanţe străine Să fie substanţe străine Să fie formate din gruparea Să fie formate din gruparea carrier carrier (purtător) şi (purtător) şi epitopi (determinante antigenice)epitopi (determinante antigenice)Să aibă o greutate moleculară Să aibă o greutate moleculară de de peste 10 kDapeste 10 kDaSă aibă structură chimică complexă (Să aibă structură chimică complexă (proteine, PZproteine, PZ, LPZ, etc), LPZ, etc)Să aibă o conformaţie spaţială stabilăSă aibă o conformaţie spaţială stabilă

Antigenele incomplete (haptenele)Antigenele incomplete (haptenele) posedă antigenitate dar sunt lipsite de imunogenitate. posedă antigenitate dar sunt lipsite de imunogenitate. Cerinte fata de Ag incomplete (haptenele):Cerinte fata de Ag incomplete (haptenele):

Au masă moleculară micăAu masă moleculară micăPot deveni imunogene combinându-se cu macromolecule purtătoare (proteine sau polizaharide)Pot deveni imunogene combinându-se cu macromolecule purtătoare (proteine sau polizaharide)

Exemple de hapteneExemple de haptene: săruri ale metalelor grele (Cr, Ni), substanţe de origine vegetală, medicamente, coloranţi, oligonucleotide.: săruri ale metalelor grele (Cr, Ni), substanţe de origine vegetală, medicamente, coloranţi, oligonucleotide.SuperAgSuperAg – molecule proteice particulare (enterotoxinele stafilococice, toxina şocului toxic – molecule proteice particulare (enterotoxinele stafilococice, toxina şocului toxic stafilococic stafilococic, toxina exfoliativă a stafilococilor, , toxina exfoliativă a stafilococilor, nucleocapsida virusului rabic), capabile să stimuleze un număr mare de limfocite T (10-40%). N – 0.01%. SuperAg provoacă reacţii nucleocapsida virusului rabic), capabile să stimuleze un număr mare de limfocite T (10-40%). N – 0.01%. SuperAg provoacă reacţii imunopatologice.imunopatologice.Se disting arbitrar:Se disting arbitrar:

Ag solubileAg solubile: proteine plasmatice, : proteine plasmatice, toxine, toxine, enzime, hormoni, etcenzime, hormoni, etc Ag figurateAg figurate (celulare, corpusculare): celule, bacterii, paraziţi, etc. (celulare, corpusculare): celule, bacterii, paraziţi, etc.

În funcţie de provenienţă se deosebesc:În funcţie de provenienţă se deosebesc: Ag heterofileAg heterofile – Ag comune mai multor specii animale. Ex.: – Ag comune mai multor specii animale. Ex.: Ag polizaharidice ForssmanAg polizaharidice Forssman, prezent, prezentee în hematiile de cal, câine, oaie, cobai; în hematiile de cal, câine, oaie, cobai;

sistemul Rhsistemul Rh al eritrocitelor se întâlneşte la om şi maimuţele Macaccus al eritrocitelor se întâlneşte la om şi maimuţele Macaccus rrhesus, etc hesus, etc Ag Ag heterologeheterologe (xeno-Ag, hetero-Ag) – Ag provenite din organismul altei specii (xeno-Ag, hetero-Ag) – Ag provenite din organismul altei specii Izo-AgIzo-Ag (alo-Ag) – Ag de grup în cadrul unei specii (sistemul ABO şi Rh (alo-Ag) – Ag de grup în cadrul unei specii (sistemul ABO şi Rh, clasele de , clasele de Ig)Ig) IdioantigeneIdioantigene – antigenele specifice unui individ. Corespund moleculelor CMH – antigenele specifice unui individ. Corespund moleculelor CMH AutoantigeneAutoantigene – Ag proprii unui organism, devenite imunogene în anumite condiţii (spermatozoizii, tiroglobulina, insulina, cristalinul, – Ag proprii unui organism, devenite imunogene în anumite condiţii (spermatozoizii, tiroglobulina, insulina, cristalinul,

ţesutul nervos, etc)ţesutul nervos, etc) ExoantigeneExoantigene ( (provenite din compartimentul extracelular - provenite din compartimentul extracelular - bacterii, fungi, protozoarebacterii, fungi, protozoare fagocitate fagocitate)) EndoantigeneEndoantigene ( (provenite din citoplasma celulelor,provenite din citoplasma celulelor, reprezintă proteine proprii reprezintă proteine proprii modificate modificate sau proteine virale sintetizate de celulele sau proteine virale sintetizate de celulele

macroorganismului)macroorganismului)Structura antigenică a celulei bacterieneStructura antigenică a celulei bacterieneAg structuraleAg structurale (Ag O/R – somatice, LPZ, termostabile; Ag H – flagelar, proteic, (Ag O/R – somatice, LPZ, termostabile; Ag H – flagelar, proteic, termolabiltermolabil; Ag K – capsular, ; Ag K – capsular, termovariabiltermovariabil; ; Ag F – fimbrial)Ag F – fimbrial) Ag solubileAg solubile (enzime de patogenitate, exotoxine) (enzime de patogenitate, exotoxine)Antigene virale:Antigene virale: proteine/GP proteine/GP de invelisde invelis, , nucleoproteine, nucleoproteine, enzimeenzimeDeterminanDeterminanteletele antigenic antigenicee (epitopii). (epitopii). Imunogenitatea este o caracteristică a întregii macromolecule Ag. Antigenitatea (specificitatea) este Imunogenitatea este o caracteristică a întregii macromolecule Ag. Antigenitatea (specificitatea) este determinată de anumite secvenţe ale Ag. determinată de anumite secvenţe ale Ag. Suprafeţe limitate din macromolecula Ag apte să se combine cu Ac specifici sau cu receptorii de pe Suprafeţe limitate din macromolecula Ag apte să se combine cu Ac specifici sau cu receptorii de pe limfocitele sensibilizate se numesclimfocitele sensibilizate se numesc determinandeterminantete antigenic antigenicee sau sau epitopi.epitopi.La glucideLa glucide epitopul este format din 4-6 monozaharide. Polizaharidele sunt formate dintr-un epitop repetat sau dintr-un număr redus de epitopi epitopul este format din 4-6 monozaharide. Polizaharidele sunt formate dintr-un epitop repetat sau dintr-un număr redus de epitopi diferidiferiţţii. . Polizaharidele sunt Ag T-independente, pot induce sinteza Ac fără intervenţia TL.Polizaharidele sunt Ag T-independente, pot induce sinteza Ac fără intervenţia TL.

22

Page 23: Microbiologie Exam

Epitopul proteicEpitopul proteic este constituit din câţiva este constituit din câţiva aminoacizi (aminoacizi (AAAA)).. Epitopii Epitopii linliniiariari (secvenţiali) sunt determinaţi de structura primară a AA (8 (secvenţiali) sunt determinaţi de structura primară a AA (8-30-30 AA) AA) Epitopii Epitopii conformaţionaliconformaţionali sunt determinaţi de structura secundară sau terţiară a moleculei proteice (juxtapoziţia în spaţiu a AA situaţi la sunt determinaţi de structura secundară sau terţiară a moleculei proteice (juxtapoziţia în spaţiu a AA situaţi la

distanţă). Se modifică la denaturarea proteinei.distanţă). Se modifică la denaturarea proteinei.Fiecare moleculă proteică reprezintă un mozaic de epitopi, fie diferiţi, fie identici.Fiecare moleculă proteică reprezintă un mozaic de epitopi, fie diferiţi, fie identici.Proteinele sunt Ag T-dependente, deoarece ele induc sinteza Ac Proteinele sunt Ag T-dependente, deoarece ele induc sinteza Ac doar doar prin cooperarea dintre T şi B limfocite.prin cooperarea dintre T şi B limfocite.Numărul de epitopi de pe o moleculă imunogenă reprezintă Numărul de epitopi de pe o moleculă imunogenă reprezintă valenţa Ag.valenţa Ag.

47. Sistemul imun, functiile. Organele sistemului imun. Rolul organelor centrale si periferice ale sistemului imun. Celulele sistemului imun si functiile lor.IMUNITATEIMUNITATE – nereceptivitatea organismului la orice agenţi străini din punct de vedere genetic, inclusiv la mi/o şi toxinele lor. – nereceptivitatea organismului la orice agenţi străini din punct de vedere genetic, inclusiv la mi/o şi toxinele lor.IMUNITATE IMUNITATE – capacitatea de apărare specifică a organismului faţă de agresori externi (virusuri, bacterii, fungi, protozoare– capacitatea de apărare specifică a organismului faţă de agresori externi (virusuri, bacterii, fungi, protozoare, toxine, toxine) cât şi faţă de ) cât şi faţă de propriile molecule şi unele celule degradate sau modificate.propriile molecule şi unele celule degradate sau modificate.Sarcina fundamentală a imunităţii – distincţia dintre moleculele şi celulele proprii (Sarcina fundamentală a imunităţii – distincţia dintre moleculele şi celulele proprii (selfself) şi cele străine () şi cele străine (non-selfnon-self))TIPURILE DE IMUNITATETIPURILE DE IMUNITATEEreditarăEreditară (naturală, de specie). Poate fi absolută (lipsa ţintei) sau relativă. (naturală, de specie). Poate fi absolută (lipsa ţintei) sau relativă.DobândităDobândită (achizitionata, adaptativa) (achizitionata, adaptativa)ActivActivă - ă - NaturalNaturală (postinfecţioasă); ă (postinfecţioasă); ArtificialArtificială (în urma ă (în urma vaccinvaccinării) ării) PasivPasivă - ă - NaturalNaturală (transplacentară, prin lapteă (transplacentară, prin laptele maternle matern); ); ArtificialArtificială (administrarea Acă (administrarea Ac//seruri imuneseruri imune sau a limfocitelor) sau a limfocitelor)Imunitatea dobândităImunitatea dobândită se caracterizează prin: se caracterizează prin:

1.1. Dezvoltare lenta si manifestare tardiva Dezvoltare lenta si manifestare tardiva (câteva zile, săptămâni(câteva zile, săptămâni dupa contactul cu un Ag) dupa contactul cu un Ag) 2.2. Specificitate faţă de Specificitate faţă de Ag Ag (capacitatea de a recunoaste si raspunde specific la numeroase substante straine, inclusiv agenti infectiosi)(capacitatea de a recunoaste si raspunde specific la numeroase substante straine, inclusiv agenti infectiosi)3.3. Memorie imunologică Memorie imunologică (capacitatea de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si eficace la intalniri repetate cu un Ag)(capacitatea de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si eficace la intalniri repetate cu un Ag)

Imunitatea dobândită poate fi: Imunitatea dobândită poate fi: Imunitate antibacteriană, antivirală, antimicotică, antitoxică, antitumorală, etc.Imunitate antibacteriană, antivirală, antimicotică, antitoxică, antitumorală, etc.În funcţie de mecanismele reacţiilor imune:În funcţie de mecanismele reacţiilor imune:

Imunitate umoralăImunitate umorală, , exercitatexercitatăă prin intermediul unor proteine numite prin intermediul unor proteine numite anticorpi (Ac, Ig) anticorpi (Ac, Ig) limf. B limf. B. . Fiind secretate in sange si lichide Fiind secretate in sange si lichide biologice neutralizeaza si elimina microbii extracelulari si toxinele lor.biologice neutralizeaza si elimina microbii extracelulari si toxinele lor.

Imunitate celularăImunitate celulară, , eficienta in eliminarea parazitilor intracelulari sau a celulelor tumorale. Este exercitateficienta in eliminarea parazitilor intracelulari sau a celulelor tumorale. Este exercitatăă prin intermediul limf. T prin intermediul limf. T (citotoxicitate directa, activarea macrofagelor, celulelor NK, secre(citotoxicitate directa, activarea macrofagelor, celulelor NK, secreţţia citokinelor).ia citokinelor).

În dependenţă de persistenţa mi/o:În dependenţă de persistenţa mi/o: Imunitate sterilăImunitate sterilă – se manifestă după – se manifestă după eliminareeliminarea agenţilor patogeni din organism (ex.: rujeolă)a agenţilor patogeni din organism (ex.: rujeolă) Imunitate nesterilăImunitate nesterilă – nereceptivitatea se păstrează doar în perioada aflării mi/o în organism (tbc, sifilis). – nereceptivitatea se păstrează doar în perioada aflării mi/o în organism (tbc, sifilis).

Sistemul ImunSistemul Imun reprezinta un ansamblureprezinta un ansamblu de celule de celule, molecule , molecule şi şi tesuturi (tesuturi (organeorgane)) distribuite în tot organismul distribuite în tot organismul, care participa la instaurarea , care participa la instaurarea imunitatiiimunitatii..Functiile Sistemului Imun: Functiile Sistemului Imun: Aparare contra infectiilor; Recunoasterea tesuturilor si proteinelor straine si raspunsul la ele; Protectie contra Aparare contra infectiilor; Recunoasterea tesuturilor si proteinelor straine si raspunsul la ele; Protectie contra tumorilortumorilor

Organele centrale (primare) ale SIOrganele centrale (primare) ale SI – măduva osoasă şi timusul la vertebrate (ficatul în perioada embrionară), bursa Fabricius la păsări. Apar – măduva osoasă şi timusul la vertebrate (ficatul în perioada embrionară), bursa Fabricius la păsări. Apar primele în timpul vieţii embrionare. primele în timpul vieţii embrionare. RolulRolul – sursa celulelor-stem, – sursa celulelor-stem, “instruirea”,“instruirea”, maturizarea maturizarea şişi selectia selectia celulelor imunocompetente (limfocitele T şi B). celulelor imunocompetente (limfocitele T şi B).În măduva osoasă se află celulele-stem, precursori ai T şi B-limfocitelor. Pre-T limfocitele migrează ulterior în timus, unde va avea loc În măduva osoasă se află celulele-stem, precursori ai T şi B-limfocitelor. Pre-T limfocitele migrează ulterior în timus, unde va avea loc instruirea şi instruirea şi maturizareamaturizarea lor, devenind celule imunocompetente, capabile să recunoască specific un singur Ag (prin achiziţionarea unor receptori specifici). lor, devenind celule imunocompetente, capabile să recunoască specific un singur Ag (prin achiziţionarea unor receptori specifici). Instruirea Instruirea si maturizarea si maturizarea B-limfocitelor are loc în măduva osoasă. B-limfocitelor are loc în măduva osoasă. Aceste procese sunt independente de orice stimulare antigenică a organismului.Aceste procese sunt independente de orice stimulare antigenică a organismului.După părăsirea organelor centrale limfocitele nu mai revin aici, ele seDupă părăsirea organelor centrale limfocitele nu mai revin aici, ele se stabilesc în organele limfoide secundare, stabilesc în organele limfoide secundare, rerecirculâcirculândnd prin sânge, limfă. prin sânge, limfă.Organele periferice (secundare) ale SI. Organele periferice (secundare) ale SI. În ele se realizează contactul dintre În ele se realizează contactul dintre Ag, Ag, celulele prezentatoare de antigencelulele prezentatoare de antigen ( CPA) ( CPA) şi celulele imuno-şi celulele imuno-competente, ccompetente, cu inducerea unui raspuns imunu inducerea unui raspuns imun. . Ganglionii limfaticiGanglionii limfatici (raspuns imun contra Ag transportate cu limfa). (raspuns imun contra Ag transportate cu limfa). SplinaSplina (raspuns imun contra Ag (raspuns imun contra Ag transportate cu sangele). transportate cu sangele). Formaţiunile limfoide ale mucoaselor digestive şi respiratorii (amigdale, plăci Peyer, apendice), ţesutul limfoid asociat Formaţiunile limfoide ale mucoaselor digestive şi respiratorii (amigdale, plăci Peyer, apendice), ţesutul limfoid asociat tegumentuluitegumentului (raspuns imun contra Ag ce penetreaza prin epitelii) (raspuns imun contra Ag ce penetreaza prin epitelii)Ariile Ariile timo-dependentetimo-dependente (populate de limfocite T) sunt: (populate de limfocite T) sunt: zona paracorticala a ganglionilorzona paracorticala a ganglionilor limfaticilimfatici (paracortex), (paracortex), manşonul limfoid periarteriolar al manşonul limfoid periarteriolar al pulpei albe a splinei şi zonele interfoliculare ale plãcilor Peyer. pulpei albe a splinei şi zonele interfoliculare ale plãcilor Peyer.   

48. Celulele imunocompetente. Dezvoltarea limfocitelor T si B, receptorii de suprafata. Diferentierea limfocitelor T si B naive la un stimul antigenic. Functiile celulelor efectoare.Limfocitele Limfocitele (celule imunocompetente, recunoasterea Ag)(celule imunocompetente, recunoasterea Ag)Celulele efectoare Celulele efectoare (eliminarea microbilor)(eliminarea microbilor)Celulele prezentatoare de Ag (CPA) Celulele prezentatoare de Ag (CPA) (captarea si prezentarea Ag microbiene )(captarea si prezentarea Ag microbiene )

LIMFOCITELELIMFOCITELEToate limfocitele provin din celule-stem ale maduvei osoase, cu o etapa ulterioara de maturizare si selectie.Toate limfocitele provin din celule-stem ale maduvei osoase, cu o etapa ulterioara de maturizare si selectie.Limfocitele T si B sunt unicele celule ce poarta receptori specifici de Ag Limfocitele T si B sunt unicele celule ce poarta receptori specifici de Ag ((celule imuno-competentecelule imuno-competente)), fiind mediatorii principali ai imunitatii , fiind mediatorii principali ai imunitatii adaptativeadaptativeMaturizarea Maturizarea limf. Blimf. B are loc în măduva osoasă prin intermediul interacţiunii directe cu celulele stromei, iar în stadiile tardive sub acţiunea are loc în măduva osoasă prin intermediul interacţiunii directe cu celulele stromei, iar în stadiile tardive sub acţiunea citokinelor secretate de celulele stromale (în special IL-7).citokinelor secretate de celulele stromale (în special IL-7). Limf. B sunt supuse unei Limf. B sunt supuse unei selectii pozitiveselectii pozitive in favoarea expresiei de receptori intacti si in favoarea expresiei de receptori intacti si unei unei selectii negativeselectii negative contra recunoasterii puternice a antigenelor proprii. contra recunoasterii puternice a antigenelor proprii.In organelor limfoide secundare limf. B se localizeaza in In organelor limfoide secundare limf. B se localizeaza in foliculii cortexului externfoliculii cortexului extern din ganglionii limfatici, foliculii din plãcile Peyer şi foliculii zonei din ganglionii limfatici, foliculii din plãcile Peyer şi foliculii zonei periferice din pulpa albã a splinei periferice din pulpa albã a splinei (arii timo-independente). (arii timo-independente).

Limf. B mature se caracterizează prin prezenţa următorilor receptori de suprafaţă:Limf. B mature se caracterizează prin prezenţa următorilor receptori de suprafaţă:1.1. Receptorul pentru Ag (BCR).Receptorul pentru Ag (BCR). Este reprezentat de molecule de Este reprezentat de molecule de Ig – Ig – monomeri de Ig M şi Ig D. Interacţionează cumonomeri de Ig M şi Ig D. Interacţionează cu molecule antigenice dinmolecule antigenice din

soluţii sau fixate pesoluţii sau fixate pe membrane celulare membrane celulare (macromolecule native – proteine, glucide, AN, etc)(macromolecule native – proteine, glucide, AN, etc)2.2. Receptorul pentru Receptorul pentru fragmentul fragmentul Fc al IgGFc al IgG3.3. Receptor pentru fracţiunea C3b a complementuluiReceptor pentru fracţiunea C3b a complementului4.4. Receptori pentru interleukineReceptori pentru interleukine (IL) (IL)5.5. Proteine ale Complexului Major de Histocompatibilitate - CMHProteine ale Complexului Major de Histocompatibilitate - CMH6.6. Alte proteine specifice – CD79, CD19 – asociate BCR Alte proteine specifice – CD79, CD19 – asociate BCR

23

Page 24: Microbiologie Exam

Organismul contine 10Organismul contine 1077-10-109 9 clone diferite de limf.B, fiecare cu BCR unic. clone diferite de limf.B, fiecare cu BCR unic. BCR recunoaşte antigenele după configuraţia lor.BCR recunoaşte antigenele după configuraţia lor. Limf. B stimulate de Ag Limf. B stimulate de Ag se multiplică şi se diferenţiază în se multiplică şi se diferenţiază în celule efectoare - celule efectoare - plasmocite secretoare de Ig (Ac) şi în celule B-memorie.plasmocite secretoare de Ig (Ac) şi în celule B-memorie.Precursorii Precursorii limf. Tlimf. T migrează în timus, unde sub influenţa celulelor stromale şi a corpusculilor Hassal se diferenţiază în limf. T mature. Migraţia migrează în timus, unde sub influenţa celulelor stromale şi a corpusculilor Hassal se diferenţiază în limf. T mature. Migraţia limf. T din cortex spre medulara timică este însoţită de achiziţia unor proteine de suprafaţă specifice (receptorilimf. T din cortex spre medulara timică este însoţită de achiziţia unor proteine de suprafaţă specifice (receptori: TCR, CD3, CD4, CD8, etc: TCR, CD3, CD4, CD8, etc).). La o La o etapa precoce de selectie doaretapa precoce de selectie doar limfocitele cu TCR functional vor supravietui. limfocitele cu TCR functional vor supravietui. Dezvoltarea Dezvoltarea ulterioara a ulterioara a limf. T este caracterizatălimf. T este caracterizată printr-o selecţie printr-o selecţie pozitivă (supravieţuiesc TL care recunosc pozitivă (supravieţuiesc TL care recunosc moleculele moleculele CMH propriu).CMH propriu). Aceste molecule sunt prezente pe suprafata celulelor dendritice si a Aceste molecule sunt prezente pe suprafata celulelor dendritice si a macrofagelor din timus. macrofagelor din timus. LLimfocitele Timfocitele T care care au trecut selecau trecut selecţţia pozitivia pozitivăă, dar care sunt capabile s, dar care sunt capabile săă recunoasc recunoascăă cu afinitate inalta peptide proprii cu afinitate inalta peptide proprii asociate cu CMHasociate cu CMH suportă o selecţie negativă (moarte programată prin apoptoză). suportă o selecţie negativă (moarte programată prin apoptoză). Selecţia constã în eliminarea clonelor de limfocite potenţial Selecţia constã în eliminarea clonelor de limfocite potenţial autoreactive (potenţial reactive faţã de moleculele proprii).autoreactive (potenţial reactive faţã de moleculele proprii). “Timusul selecţionează utilul, ignoră inutilul şi distruge nocivul.” “Timusul selecţionează utilul, ignoră inutilul şi distruge nocivul.” ( Von ( Von Boehmer )Boehmer )..La etapa finala limf. T care sunt capabile sa recunoasca peptide in asociatie cu moleculele CMH I pierd receptorul CD4 (devenind celule TCD8), iar La etapa finala limf. T care sunt capabile sa recunoasca peptide in asociatie cu moleculele CMH I pierd receptorul CD4 (devenind celule TCD8), iar cele ce recunosc complexe peptid-CMH II pierd receptorul CD8 (devenind celule TCD4)cele ce recunosc complexe peptid-CMH II pierd receptorul CD8 (devenind celule TCD4) Receptorii TL:Receptorii TL:

1.1. TCRTCR, , rreceptorul pentru Ag -eceptorul pentru Ag - format din 2 catene polipeptidice format din 2 catene polipeptidice αα şi şi ββ (90%) sau (90%) sau γγ şi şi δδ. . TCR poate recunoaşte TCR poate recunoaşte doar doar peptide antigenice peptide antigenice asociate cu molecule ale CMH, localizate pe suprafaţa unei CPA. Nu interacţionează cu Ag solubileasociate cu molecule ale CMH, localizate pe suprafaţa unei CPA. Nu interacţionează cu Ag solubile. .

2.2. CD3 CD3 (Cluster Differentiation 3)(Cluster Differentiation 3) – asociat TC – asociat TCRR, ajută la transmiterea în celulă a semnalului de recunoaştere a Ag, ajută la transmiterea în celulă a semnalului de recunoaştere a Ag si de activare a si de activare a limfocituluilimfocitului..

3.3. CD2– prezent la toate limf. T, fixează hematii, poate fi deCD2– prezent la toate limf. T, fixează hematii, poate fi deppiiststat prin testul de formare a rozetelor.at prin testul de formare a rozetelor.

Unii Unii markeri (recmarkeri (receeptori) de suprafaţă definesc 2 ptori) de suprafaţă definesc 2 varietvarietăţi principale de Lăţi principale de LTT: limf. : limf. T T CD4+CD4+ şi şi TTCD8+CD8+CD4CD4 – exprimat pe 60% din TL – exprimat pe 60% din TL.. Recunosc Ag peptidice legate cu moleculele CMH II (exprimate pe celulele dendritice, macrofage şi limf. Recunosc Ag peptidice legate cu moleculele CMH II (exprimate pe celulele dendritice, macrofage şi limf. BB). ). Limfocitele TCD4Limfocitele TCD4 (T4) (T4) au funcţia de coordonator central al răspunsului imun şi au funcţia de coordonator central al răspunsului imun şi la activare se diferenla activare se diferenţiază în subpopulaţia de Thelper (ţiază în subpopulaţia de Thelper (ThTh). ). Th Th aacţionează prin producerea citokinelor. În funcţie de profilul de citokine elaborate se disting 2 grupe de Th: Th1 şi Th2. cţionează prin producerea citokinelor. În funcţie de profilul de citokine elaborate se disting 2 grupe de Th: Th1 şi Th2. Diferenţierea în Diferenţierea în Th1Th1 este favorizată de este favorizată de IL-12 produsă IL-12 produsă de macrofagede macrofage.. Citokinele secretate de Th1 Citokinele secretate de Th1 (IL-2, (IL-2, TNF şi IFN-TNF şi IFN-γγ)) ffavorizează răspunsul imun avorizează răspunsul imun celularcelular şi hipersensibilitatea tardivă şi hipersensibilitatea tardivă (activarea(activarea macrofagelor macrofagelor pentru distrugerea mi/o intracelulare, pentru distrugerea mi/o intracelulare, proliferarea şi diferenţierea limf. T citotoxice proliferarea şi diferenţierea limf. T citotoxice ((TcTc))).). Th2Th2 recunosc Ag prezentate recunosc Ag prezentate în special de în special de limf. Blimf. B.. Secretă IL-4, IL-5, IL-10 şi IL-13, responsabile de imunitatea umorală. Favorizează Secretă IL-4, IL-5, IL-10 şi IL-13, responsabile de imunitatea umorală. Favorizează proliferarea proliferarea si diferentiereasi diferentierea limf. B şi producerea limf. B şi producerea anticorpilor (anticorpilor (Ac, IgAc, Ig)). . Există o competiţie între cele două tipuri de Th: IFN-Există o competiţie între cele două tipuri de Th: IFN-γγ inhibă diferenţierea şi proliferarea Th2, iar IL-4 inhibă activitatea Th1. inhibă diferenţierea şi proliferarea Th2, iar IL-4 inhibă activitatea Th1. CD8 CD8 – exprimat pe 40% LT– exprimat pe 40% LT.. Recunosc Ag peptidice asociate cu moleculele CMH I (exprimate pe toate celulele nucleate). Pot produce citokine, dar Recunosc Ag peptidice asociate cu moleculele CMH I (exprimate pe toate celulele nucleate). Pot produce citokine, dar în special manifestă în special manifestă activitateactivitate citotoxic citotoxicaa. La activare se diferenţiază în limf. T. La activare se diferenţiază în limf. T citotoxice (citotoxice (TcTc) şi T) şi T- - supresoare (supresoare (TsTs). ). TcTc distrug celulele infectate cu distrug celulele infectate cu virus, virus, cu cu bacterii intracelulare sau celulele canceroase, intervin în respingerea grefelor (imunitatea celulară). bacterii intracelulare sau celulele canceroase, intervin în respingerea grefelor (imunitatea celulară). TsTs suprimă răspunsul imun suprimă răspunsul imun fiind fiind responsabile de toleranţa imunologică. responsabile de toleranţa imunologică. T-memorieT-memorie asigură memoria imunologică. Raportul limfocitelor CD4/CD8 este de 1,5 asigură memoria imunologică. Raportul limfocitelor CD4/CD8 este de 1,5

Limfocitele B şi T naiveLimfocitele B şi T naive sunt celulele care sunt celulele care inca nu s-au inca nu s-au întâln întâlnitit cu un Ag. După interacţiunea cu Ag urmeaza activarea lor, proliferarea şi cu un Ag. După interacţiunea cu Ag urmeaza activarea lor, proliferarea şi diferenţierea în diferenţierea în celule efectoarecelule efectoare (LB – în plasmocite, LT în Th, Tc)(LB – în plasmocite, LT în Th, Tc), , care vor elimina microbii sau neutraliza toxinele lor prin diferite mecanisme.care vor elimina microbii sau neutraliza toxinele lor prin diferite mecanisme.LBreprezintă 10-15% din populaţia limfocitară, cu o durată de viaţă scurtă, de 3-5 zile, iar LBreprezintă 10-15% din populaţia limfocitară, cu o durată de viaţă scurtă, de 3-5 zile, iar LT constituie 70% cu o durată de viaţă lungă (luni, ani).LT constituie 70% cu o durată de viaţă lungă (luni, ani).

Alte celule limfocitare (nule, neimuno-competente) –Alte celule limfocitare (nule, neimuno-competente) – 15% 15%Celule NKCelule NK, capabile să distrugă spontan celule canceroase şi celule infectate cu virus., capabile să distrugă spontan celule canceroase şi celule infectate cu virus.Celule KCelule K, posedă pe membrana lor receptori pentru fragmentul Fc al Ig. Distrug celulele-ţintă acoperite cu Ac (Ig) – fenomen de citotoxicitate Ac-, posedă pe membrana lor receptori pentru fragmentul Fc al Ig. Distrug celulele-ţintă acoperite cu Ac (Ig) – fenomen de citotoxicitate Ac-dependentă.dependentă.

49. Recunoasterea antigenului de catre T si B limfocite. Celulele prezentatoare de antigen, functiile lor. Complexul major de histocompatibilitate. Clasele moleculelor CMH si implicarea lor in raspunsul imun umoral si celular.CELULECELULELELE PREZENTATOARE DE ANTIGEN (CPA) PREZENTATOARE DE ANTIGEN (CPA)BL recunosc direct prin intermediul BCR epitopi antigenici conformaţionali solubili sau fixaţi pe membrane celulare. BL recunosc direct prin intermediul BCR epitopi antigenici conformaţionali solubili sau fixaţi pe membrane celulare. TL pot recunoaşte numai epitopi proteici linTL pot recunoaşte numai epitopi proteici liniiari asociaţi cu molecule ale CMH expuşi pe suprafaţa unor celule specializate – ari asociaţi cu molecule ale CMH expuşi pe suprafaţa unor celule specializate – CPACPA (restricţie CMH).(restricţie CMH).

CPACPA “profesioniste” “profesioniste” includinclud celulele dendriticecelulele dendritice foliculare şi tisulare foliculare şi tisulare, , monocitelemonocitele // macrofag macrofageleele şişi limfocite limfocitelele B BFuncFuncţţiile iile CPACPA

1.1. CaptaCaptarea, rea, fragmentafragmentarea rea ( (processingprocessing-ul-ul)) Ag proteice, selectia Ag proteice, selectia şi expune şi expunerearea pe suprafaţa sa pe suprafaţa sa a a peptidepeptidelor lor antigenice antigenice (epitopi liniari)(epitopi liniari) asociate asociate cu moleculele CMH. cu moleculele CMH.

2.2. Transportarea acestorTransportarea acestor complex complexe spre tesutul limfoid periferic, unde e spre tesutul limfoid periferic, unde complexul complexul CMH-peptid CMH-peptid va fi prezentat va fi prezentat LT naivLT naiv cu TCR specific, cu TCR specific, declanşadeclanşandnd activarea activarea luilui..

3.3. CPA care exprima peptide asociate cu CMH I vor interactiona cu limfocite TCD8, iar CPA care exprima peptide in asocoatie cu CMH II – cu CPA care exprima peptide asociate cu CMH I vor interactiona cu limfocite TCD8, iar CPA care exprima peptide in asocoatie cu CMH II – cu TCD4.TCD4.

4.4. Producerea semnalelor secundare de activare a LT (Producerea semnalelor secundare de activare a LT (secreţia unor citokinesecreţia unor citokine).).

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATECOMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATEMoleculele CMH reprezintă un ansamblu unic de glicoproteine exprimate pe suprafaţa celulelor organismului, care sunt veritabili markeriMoleculele CMH reprezintă un ansamblu unic de glicoproteine exprimate pe suprafaţa celulelor organismului, care sunt veritabili markeri/Ag/Ag de de identitate aidentitate aii fiecărui individ. fiecărui individ. Rolul moleculelor CMH:Rolul moleculelor CMH:

1.1. Participă la prezentarea Ag peptidice TL.Participă la prezentarea Ag peptidice TL.2.2. Responsabilitate în respingerea grefelor.Responsabilitate în respingerea grefelor.

CMH este transmis genetic. Genele CMH sunt situate pe cromozomul 6 la om, locus numit HLA (CMH este transmis genetic. Genele CMH sunt situate pe cromozomul 6 la om, locus numit HLA (Human Leukocyte AntigenHuman Leukocyte Antigen). Moleculele CMH sunt ). Moleculele CMH sunt formate din 2 catene polipeptidice, constituite din domenii extracelulare, un fragment transmembranar şi o regiune intracitoplasmatică. Structuraformate din 2 catene polipeptidice, constituite din domenii extracelulare, un fragment transmembranar şi o regiune intracitoplasmatică. Structura tridimensională a moleculei duce la formarea unetridimensională a moleculei duce la formarea uneii cavităţi, la fundul căreia se cavităţi, la fundul căreia se aflaflă R care vor interacţiona cu peptide antigenice proprii sau ă R care vor interacţiona cu peptide antigenice proprii sau străine.străine. Al Alţi receptori ţi receptori ai CMH ai CMH interacţionează cu moleculele CD4 sau CD8 de pe TL.interacţionează cu moleculele CD4 sau CD8 de pe TL.

Se disting molecule (antigene) CMH de clasa I şi de clasa II.Se disting molecule (antigene) CMH de clasa I şi de clasa II.Moleculele Moleculele CMH ICMH I sunt exprimate pe toate celulele nucleate ale organismului. sunt exprimate pe toate celulele nucleate ale organismului. CMH ICMH I recunoaste si recunoaste si interacţionează cu receptorul interacţionează cu receptorul CD8 CD8 de pe TL. de pe TL. CMH I pCMH I participă la prezentarea peptidelor articipă la prezentarea peptidelor antigenice antigenice scurte (9 AA) obţinute în cursul degradării inscurte (9 AA) obţinute în cursul degradării in citoplasma citoplasma (de către proteasome) a (de către proteasome) a Ag Ag endogeneendogene ((molecule proprii sau proteine virale sintetizate de CPAmolecule proprii sau proteine virale sintetizate de CPA)). . Complexul Complexul peptid/CMH Ipeptid/CMH I de pe suprafaţa CPAde pe suprafaţa CPA (macrofage, celule dendritice) poate fi recunoscut de complexul (macrofage, celule dendritice) poate fi recunoscut de complexul TCR/CD8 TCR/CD8 complementar de pe TCD8complementar de pe TCD8 naive naive activarea limfocitelor, diferenţierea lor în limf. Tc - activarea limfocitelor, diferenţierea lor în limf. Tc - iniţierea răspunsului imun celulariniţierea răspunsului imun celular))

24

Page 25: Microbiologie Exam

Complexul Complexul peptidpeptid /CMH I/CMH I dede pe suprafaţa celulelor infectate sau pe suprafaţa celulelor infectate sau a a celulelor tumoralecelulelor tumorale poate fi recunoscut de complexul poate fi recunoscut de complexul TCR/CD8 TCR/CD8 complementar de complementar de pe limfocitele efectoare Tc pe limfocitele efectoare Tc distrugerdistrugereaea celulelor ce conţin Ag endogen celulelor ce conţin Ag endogen..

Moleculele Moleculele CMH de clasa IICMH de clasa II sunt exprimate pe celulele specializate în prezentarea Ag pt sunt exprimate pe celulele specializate în prezentarea Ag pt TTCDCD44: limf. B, celule dendritice, monocite, macrofage. Ele : limf. B, celule dendritice, monocite, macrofage. Ele pot prezenta peptide din 12-3pot prezenta peptide din 12-300 AA derivate din degradarea î AA derivate din degradarea în fagolizosomen fagolizosome a a AgAg exogene exogene ( (bacterii, protozoare, fungibacterii, protozoare, fungi, virioni liberi). , virioni liberi). Complexul Complexul peptid/CMH IIpeptid/CMH II de pe celulele prezentatoare de Ag interacţionează cu complexul de pe celulele prezentatoare de Ag interacţionează cu complexul TCR/CD4TCR/CD4 de pe limfocitele de pe limfocitele CDCD4 naive sau efectoare 4 naive sau efectoare (Th1, Th2). (Th1, Th2). Astfel moleculele CMH II sunt implicate în ambele tipuri de imunitate: umorală şi celulară.Astfel moleculele CMH II sunt implicate în ambele tipuri de imunitate: umorală şi celulară.

Prezentarea Ag limfocitelor T.Prezentarea Ag limfocitelor T. Ag este prezentat receptorului TCR sub formă de peptide asociate moleculelor CMH de clasa I sau II Ag este prezentat receptorului TCR sub formă de peptide asociate moleculelor CMH de clasa I sau II de pe CPA de pe CPA..Limf. TCD8Limf. TCD8 recunosc în special recunosc în special Ag endogeneAg endogene, provenite din proteine citoplasmatice (molecule proprii modificate sau proteine virale) degradate , provenite din proteine citoplasmatice (molecule proprii modificate sau proteine virale) degradate de către proteasome. Aceste de către proteasome. Aceste peptide din 9 AApeptide din 9 AA sunt prezentate în asociaţie cu sunt prezentate în asociaţie cu moleculele CMH de clasa Imoleculele CMH de clasa I de pe de pe macrofage, celule dendriticemacrofage, celule dendritice, , dar şi de pe suprafaţa dar şi de pe suprafaţa tuturor celulelor nucleatetuturor celulelor nucleate ale organismului. ale organismului. Limf. TCD4Limf. TCD4 recunosc recunosc Ag Ag exogeneexogene ( (provenite din provenite din bacterii, protozoarebacterii, protozoare, virusuri libere, virusuri libere)). Prezentarea este asigurată de către . Prezentarea este asigurată de către celule dendritice celule dendritice tisulare, celule Langerhans din epidermă, limf. B, monocite/macrofage tisulare, celule Langerhans din epidermă, limf. B, monocite/macrofage (celule fagocitare)(celule fagocitare). . DupDupăă captarea Ag şi fragmentareacaptarea Ag şi fragmentarea lor lor (în fagolizosome) (în fagolizosome) peptidele antigenicepeptidele antigenice selectate selectate (15-30 AA)(15-30 AA) sunt atasunt ataşşate de ate de moleculele CMH IImoleculele CMH II şşi expuse i expuse pe suprafape suprafaţţa CPA pentru a fi prezentate a CPA pentru a fi prezentate limf. limf. TCD4 naiveTCD4 naive activarea şi diferenţierea lor în celule efectori Th1 sau Th2 activarea şi diferenţierea lor în celule efectori Th1 sau Th2Prezentarea Ag limfocitelor BPrezentarea Ag limfocitelor B poate fi realizata prin intermediul poate fi realizata prin intermediul celulelceluleloror dendritice foliculare dendritice foliculare din splină şi ganglioni limfatici. Aceste celule din splină şi ganglioni limfatici. Aceste celule nefagocitare fixează prin intermediul receptorilor membranari Ag polizaharidice sau proteice prezentându-le ulterior limfocitelor B. nefagocitare fixează prin intermediul receptorilor membranari Ag polizaharidice sau proteice prezentându-le ulterior limfocitelor B.

50. Imunoglobulinele (Ig) si anticorpii. Structura monomerului de Ig. Valenta Ig, anticorpii completi si necompleti. Clasele de Ig si proprietatile lor.IMUNOGLOBULINELE (ANTICORPII)IMUNOGLOBULINELE (ANTICORPII) = = glicoproteine din fracţia glicoproteine din fracţia γγ -globulinelor. Se disting Ig membranare (BCR) şi Ig -globulinelor. Se disting Ig membranare (BCR) şi Ig solubile (solubile (secretatesecretate)) – Ac ca – Ac ca atare.atare.Ac = molecule glicoproteice produse de plasmocitele derivate din limf. Ac = molecule glicoproteice produse de plasmocitele derivate din limf. B B activate de Ag. Ac circulă în sânge şi pătrund în ţesuturi. Sunt eficienţi activate de Ag. Ac circulă în sânge şi pătrund în ţesuturi. Sunt eficienţi contra bacteriilor, toxinelor microbiene şi virusurilor în poziţie extracelulară.contra bacteriilor, toxinelor microbiene şi virusurilor în poziţie extracelulară.

STRUCTURA ŞI PROPRIETĂŢILE IgSTRUCTURA ŞI PROPRIETĂŢILE IgUNITATEA DE STRUCTURĂ a Ig (monomerul) este constituită din UNITATEA DE STRUCTURĂ a Ig (monomerul) este constituită din 2 lanţuri2 lanţuri glicoproteice (catene) identice glicoproteice (catene) identice uşoare Luşoare L ( (LightLight) şi ) şi 2 2 catene catene grele Hgrele H ((HeavyHeavy), legate între ele prin punţi disulfidice.), legate între ele prin punţi disulfidice.Există 2 tipuri de catene L – Există 2 tipuri de catene L – κκ şi şi λλ, identice într-o moleculă de Ig., identice într-o moleculă de Ig.Se disting 5 clase de lanţuri H: Se disting 5 clase de lanţuri H: γγ, , αα, , µµ, , δδ, , εε, ce corespund celor 5 clase , ce corespund celor 5 clase (izotipuri) (izotipuri) de Ig: de Ig: Ig G, Ig A, Ig M, Ig D, Ig E.Ig G, Ig A, Ig M, Ig D, Ig E.În componenţa lanţurilor se disting În componenţa lanţurilor se disting regiuni variabile regiuni variabile (aminoterminale) şi (aminoterminale) şi regiuni constante regiuni constante (carboxilterminale). (carboxilterminale). Regiunile variabileRegiunile variabile ale catenelor L şi H formează o cavitate tridimensională - centrul activ (paratopul) al moleculei de Ig, care va reacţiona ale catenelor L şi H formează o cavitate tridimensională - centrul activ (paratopul) al moleculei de Ig, care va reacţiona specific cu determinanta antigenică (epitopul) Ag corespunzătorspecific cu determinanta antigenică (epitopul) Ag corespunzător,, constituit din 5-7 AA sau 3-4 reziduuri glucidice. Regiunea constituit din 5-7 AA sau 3-4 reziduuri glucidice. Regiunea variabilvariabilă constituie ă constituie fragmentul Fabfragmentul Fab ( (aantigen ntigen bbindinginding) al moleculei de Ig. ) al moleculei de Ig. Regiunea Regiunea constantconstantă corespundeă corespunde fragmentului Fcfragmentului Fc (constant, cristalizabil). Este (constant, cristalizabil). Este purtător de receptoripurtător de receptori şi responsabil de activitatea biologică a Ig: şi responsabil de activitatea biologică a Ig:

1.1. Transportul transplacentar al unor Ig (Ig G)Transportul transplacentar al unor Ig (Ig G)2.2. FFixaixarearea pe diferite celule (mastocite, pe diferite celule (mastocite, bazofile, bazofile, fagocite, limfocite, fagocite, limfocite, etc.etc.))3.3. Capacitatea de a fixa complementulCapacitatea de a fixa complementul4.4. Capacitatea de fixare a prot. A a stafilococilorCapacitatea de fixare a prot. A a stafilococilor5.5. Defineşte clasele şi subclasele de Ig (specificitatea antigenică a catenei H)Defineşte clasele şi subclasele de Ig (specificitatea antigenică a catenei H)

Monomerul de Ig este constituit din 2 fragmente Fab şi unul Fc. Între ele se află Monomerul de Ig este constituit din 2 fragmente Fab şi unul Fc. Între ele se află zona balamazona balama, responsabilă de flexibilitatea moleculei de Ig., responsabilă de flexibilitatea moleculei de Ig.Numărul paratopilor determină Numărul paratopilor determină valenţavalenţa Ig. Ig. Ac cu 2 sau mai mulţi paratopi se numesc Ac compleţi, cei cu un singur paratop – Ac incompleţi.Ac cu 2 sau mai mulţi paratopi se numesc Ac compleţi, cei cu un singur paratop – Ac incompleţi.Ig G, Ig Ig G, Ig DD şi Ig E sunt monomeri, Ig A din ser – monomeri, din secretele mucoaselor – dimeri, Ig M sunt pentameri. şi Ig E sunt monomeri, Ig A din ser – monomeri, din secretele mucoaselor – dimeri, Ig M sunt pentameri.

Proprietăţile claselor de IgProprietăţile claselor de IgIg GIg G (4 subclase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) – 75% din ansamblul Ig serice. CS = 7S, GM = 150kDa. (4 subclase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) – 75% din ansamblul Ig serice. CS = 7S, GM = 150kDa. Sunt unicele Ig capabile să traverseze bariera Sunt unicele Ig capabile să traverseze bariera placentară.placentară. Fc a Fc all IgG a IgG arere centre de fixare a complementului (activarea C pe cale clasică), a centre de fixare a complementului (activarea C pe cale clasică), a mmacrofagelor şi neutrofilelor (rol în opsonizare), a prot. acrofagelor şi neutrofilelor (rol în opsonizare), a prot. A a stafilococilor. Perioada de semi-viaţă 21 zile.A a stafilococilor. Perioada de semi-viaţă 21 zile.Manifestă activitate opsonizantă, antibacteriană, antitoxică, antiviralăManifestă activitate opsonizantă, antibacteriană, antitoxică, antivirală. . Ig MIg M – 5-6% din totalul Ig. Pentamer. CS = 19S, GM = 900kDa. Se distrug sub acţiunea mercapto-etanolului sau cisteinei. Semi-viaţa – 5 zile. – 5-6% din totalul Ig. Pentamer. CS = 19S, GM = 900kDa. Se distrug sub acţiunea mercapto-etanolului sau cisteinei. Semi-viaţa – 5 zile. Fixează si activează complementul pe cale clasică. Nu traversează placenta, Fixează si activează complementul pe cale clasică. Nu traversează placenta, prezenţa Ig M la nou-născut denotă infecţie intrauterină.prezenţa Ig M la nou-născut denotă infecţie intrauterină. Sunt primele Sunt primele care apar după un stimul antigenic primar şi indică un proces infecţios acut. care apar după un stimul antigenic primar şi indică un proces infecţios acut. Monomeri de IgM constituie BCR pe B-limfocite. Monomeri de IgM constituie BCR pe B-limfocite. Ig AIg A – 15% din totalul Ig. CS = 7S, GM = 160 kDa. Bogate în glucide. Se disting 2 subclase: IgA1 (93%) şi IgA2 (7%). Semiviaţa – 6 zile, nu – 15% din totalul Ig. CS = 7S, GM = 160 kDa. Bogate în glucide. Se disting 2 subclase: IgA1 (93%) şi IgA2 (7%). Semiviaţa – 6 zile, nu traversează placenta, traversează placenta, nu activează complementul pe cale clasicănu activează complementul pe cale clasică. . Ig A serice (monomeri) – 6% din totalul Ig serice. Agregate de IgA pot activa complementul pe cale alternativă.Ig A serice (monomeri) – 6% din totalul Ig serice. Agregate de IgA pot activa complementul pe cale alternativă.Ig A secretoare (sIg A) – salivă, lacrimi, colostrum, lapte, secreţii gastro-intestinale, nazale, bronhice. Dimer. Asigură protecţia mucoaselor, Ig A secretoare (sIg A) – salivă, lacrimi, colostrum, lapte, secreţii gastro-intestinale, nazale, bronhice. Dimer. Asigură protecţia mucoaselor, blocând ataşarea bacteriilor şi virusurilor de receptorii mucoaselor.blocând ataşarea bacteriilor şi virusurilor de receptorii mucoaselor.Ig DIg D – 0,2% din totalul Ig. CS – 6,5S, GM – 170 kDa. Semi-viaţa – 3 zile. – 0,2% din totalul Ig. CS – 6,5S, GM – 170 kDa. Semi-viaţa – 3 zile. Rolul – receptor pentru Ag (BCR) pe LB; posibil participă Rolul – receptor pentru Ag (BCR) pe LB; posibil participă lala eliminarea eliminarea limfocitelor B care produc autoAc (Ac autoreactivi).limfocitelor B care produc autoAc (Ac autoreactivi).Ig EIg E – 0,002 - 0,01%, CS – 7,9S, GM – 185 kDa. Semiviaţa – 2-3 zile. Nu traversează placenta, nu fixează complementul. Termolabile (inactivate la – 0,002 - 0,01%, CS – 7,9S, GM – 185 kDa. Semiviaţa – 2-3 zile. Nu traversează placenta, nu fixează complementul. Termolabile (inactivate la 5656°°C în 30 min). C în 30 min). Se pot fixa pe suprafaţa mastocitelor şi bazofilelor, determinând degranularea lor cu eliberarea unor amine vazo-active (şoc Se pot fixa pe suprafaţa mastocitelor şi bazofilelor, determinând degranularea lor cu eliberarea unor amine vazo-active (şoc anafilactic, dereglări alergice). anafilactic, dereglări alergice). Eficiente în afecţiuni parazitare (opsonizarea helminţilor şi artropodelor) .Eficiente în afecţiuni parazitare (opsonizarea helminţilor şi artropodelor) .

51. Raspunsul imun, consecintele. Etapele raspunsului imun. Notiuni de imunitate umorala si celulara. Functiile si efectorii. RI = proces complex, indus de pătrunderea unui Ag. Are loc în organele limfoide secundare şi prevede implicarea mai multor celule (CPA, limfociteRI = proces complex, indus de pătrunderea unui Ag. Are loc în organele limfoide secundare şi prevede implicarea mai multor celule (CPA, limfocite T, B, ş.a.) şi substanţe solubile (citokine).T, B, ş.a.) şi substanţe solubile (citokine).Consecinţele unui răspuns imun: Consecinţele unui răspuns imun: Imunitate (umorală, celulară); Hipersensibilitate (imediată, tardivă); Memorie imunologică; Toleranţă Imunitate (umorală, celulară); Hipersensibilitate (imediată, tardivă); Memorie imunologică; Toleranţă imunologică; Paralizie imunologicăimunologică; Paralizie imunologicăAcAc sunt efectorii principali ai sunt efectorii principali ai imunităţii umoraleimunităţii umorale, iar , iar limfocitele Tc şi macrofagele activatelimfocitele Tc şi macrofagele activate – ale – ale imunităţii celulareimunităţii celulare. . Imunitatea umorală este eficace contra bacteriilor non-invazive (extracelulare)Imunitatea umorală este eficace contra bacteriilor non-invazive (extracelulare), virusurilor libere, virusurilor libere şi contra toxinelor. şi contra toxinelor. Imunitatea celulară intervine în special contra paraziţilor intracelulari (bacterii, virusuri) şi celulelor proprii modificate (tumorale)Imunitatea celulară intervine în special contra paraziţilor intracelulari (bacterii, virusuri) şi celulelor proprii modificate (tumorale)

Etapele unui răspuns imunEtapele unui răspuns imun1.1. Întâlnirea Ag cu CPA, T-, B-limfocite. Întâlnirea Ag cu CPA, T-, B-limfocite. Are loc în organele limfoide Are loc în organele limfoide secundsecundare.are.

25

Page 26: Microbiologie Exam

2.2. Recunoaşterea Recunoaşterea specifică a Ag, asigurată de limfocitele B şi T specifică a Ag, asigurată de limfocitele B şi T naïve naïve prin receptorii pentru Ag (BCR, TCR). BL pot recunoaşte epitopi prin receptorii pentru Ag (BCR, TCR). BL pot recunoaşte epitopi superficiali superficiali conformationali conformationali ale moleculelor de Ag native. TL recunosc doar ale moleculelor de Ag native. TL recunosc doar epitopi lineari din Ag proteiceepitopi lineari din Ag proteice prezentate de CPA prezentate de CPA in in asociaasociatie tie cucu moleculel moleculelee CMH. CMH.

3.3. Activarea, proliferarea şi diferenţierea T sau B limfocitelorActivarea, proliferarea şi diferenţierea T sau B limfocitelor în celule efectoare şi în celule efectoare şi celule B sau T-memoriecelule B sau T-memorie.. Coordonarea acestor procese este Coordonarea acestor procese este asigurată de contacte celulare directe şi de citokine, eliberate de diverse celule.asigurată de contacte celulare directe şi de citokine, eliberate de diverse celule.

4.4. Realizarea efectului (neutralizare, opsonizare, liză, etc).Realizarea efectului (neutralizare, opsonizare, liză, etc).

52. Raspunsul imun umoral (RIU). Destinatia. Factorii implicati in declansarea si dezvoltarea RIU. Fazele RIU. RIU primar si secundar.RIU = RIU = formă a imunităţii achiziţionate asigurată de Ac. Are funcţia de a neutraliza şi elimina microbii extracelulari şi toxinele microbiene.formă a imunităţii achiziţionate asigurată de Ac. Are funcţia de a neutraliza şi elimina microbii extracelulari şi toxinele microbiene. In acest In acest proces participproces participăă Ag, CPA, limf T4, limf B. Ag, CPA, limf T4, limf B. Fazele răspunsului imun umoralFazele răspunsului imun umoral::

1.1. Intalnirea Ag cu limfocitele B.Intalnirea Ag cu limfocitele B. Are loc in organele limfoide secundare. Are loc in organele limfoide secundare. Ag patrunde Ag patrunde direct îdirect în sn sâânge nge int intââlnirea are loc lnirea are loc îîn splinn splină.ă. Ag penetreazAg penetreazăă prin tractul respirator prin tractul respirator amigdale amigdale şşi i ţţesutul limfoid asociat bronhilor esutul limfoid asociat bronhilor şşi mucoaselori mucoaselor Ag penetreazAg penetreazăă îîn tractul intestinal n tractul intestinal pl plăăcile Peyer, foliculii solitaricile Peyer, foliculii solitari Ag patrundAg patrundee prin tegument prin tegument ţţesutul limfoid asociat tegumentului.esutul limfoid asociat tegumentului.

2.2. RecunoaRecunoaşşterea epitopilor terea epitopilor unui Ag de cunui Ag de căătre receptortre receptorulul specific ( specific (BBCR) de pe suprafaCR) de pe suprafaţţa B limfocitelor naive (seleca B limfocitelor naive (selecţţia clonala)ia clonala) şşi activarea i activarea lor.lor.

Limf B naïveLimf B naïve recunosc epitopii prin intermediul moleculelor de Ig recunosc epitopii prin intermediul moleculelor de Ig M şi Ig D M şi Ig D (BCR) de pe suprafata lor, capabile s(BCR) de pe suprafata lor, capabile săă lege epitopi omologi cu forma lege epitopi omologi cu forma complementara. complementara. Antigenele T-independente (polizaharide, LPZ) la fixarea lor pe BCR activeaza direct limf B. Antigenele T-independente (polizaharide, LPZ) la fixarea lor pe BCR activeaza direct limf B. La interactiunea BCR/Ag T-dependent (proteine), limf B naiv se comporta ca o CPA (inglobarea Ag, degradarea lui, selectarea peptidelor La interactiunea BCR/Ag T-dependent (proteine), limf B naiv se comporta ca o CPA (inglobarea Ag, degradarea lui, selectarea peptidelor antigenice si prezentarea pe suprafata celulara a complexului peptid/CMH IIantigenice si prezentarea pe suprafata celulara a complexului peptid/CMH II pentru a fi recunoscute de limf TCD4).pentru a fi recunoscute de limf TCD4). Primul semnal activator reprezinta interactiunea BCR cu epitopul Ag corespunzator. Semnale secundare intervin ulterior (ex.:fixarea pe limf B a Primul semnal activator reprezinta interactiunea BCR cu epitopul Ag corespunzator. Semnale secundare intervin ulterior (ex.:fixarea pe limf B a fracfracţţiei C3d a complementului). Astfel limf B naiv este activat, fiind capabil sa produciei C3d a complementului). Astfel limf B naiv este activat, fiind capabil sa producăă cantitati mari de molecule CMH II, molecule co- cantitati mari de molecule CMH II, molecule co-stimulatoare stimulatoare şşi receptori pentru citokinele produse de limf Th.i receptori pentru citokinele produse de limf Th.

3.3. Proliferarea limfocitelor B Proliferarea limfocitelor B activateactivate si diferentierea lor si diferentierea lor DupDupă activarea Lă activarea LB B de un de un Ag Ag T-independentT-independent urmeaza urmeaza proliferarea proliferarea lui intr-o clona de celule identice lui intr-o clona de celule identice (expansiunea clonala)(expansiunea clonala) şi şi diferenţiereadiferenţierea în în plasmocite, care vor sintetiza si secreta Ac din clasa (izotipul) Ig M, memoria imunologica lipseste. plasmocite, care vor sintetiza si secreta Ac din clasa (izotipul) Ig M, memoria imunologica lipseste. Dacă LB a fost activat de un Dacă LB a fost activat de un Ag T-dependentAg T-dependent, stimularea proliferării se va produce numai prin interacţiunea dintre , stimularea proliferării se va produce numai prin interacţiunea dintre LB activat si limfLB activat si limfocitulocitul Th Th activat de acelaşi Agactivat de acelaşi Ag. LB şi LT au aceeaşi specificitate antigenică, doar ca LB recunoaşte epitopi nativi (conformationali), iar L Th recunoaşte . LB şi LT au aceeaşi specificitate antigenică, doar ca LB recunoaşte epitopi nativi (conformationali), iar L Th recunoaşte fragmente peptidice ale acestui Ag. fragmente peptidice ale acestui Ag. Producerea limf Th are loc Producerea limf Th are loc de asemenea de asemenea în organele limfoide secundareîn organele limfoide secundare (zonele timo-dependente) (zonele timo-dependente), unde limfocitele TCD4 naive interacţionează , unde limfocitele TCD4 naive interacţionează cu peptidul antigenic de pe CPA, urmând proliferarea şi diferenţierea lor în limf efectoare (Th1, Th2), producătoare de citokine. cu peptidul antigenic de pe CPA, urmând proliferarea şi diferenţierea lor în limf efectoare (Th1, Th2), producătoare de citokine. Th2 migrează Th2 migrează spre foliculii limfoizi, unde are loc întâlnirea lor cu limf B activat.spre foliculii limfoizi, unde are loc întâlnirea lor cu limf B activat.Complexul TCR/CD4 de pe limf Th recunoaşte complexul peptid/CMH II de pe limf B activat.Complexul TCR/CD4 de pe limf Th recunoaşte complexul peptid/CMH II de pe limf B activat. Ulterior se formeaza alte legaturi co-stimulatoare. Astfel limf Th devin capabile sa secrete citokine: IL- 4, 5, 10, 13, care vor actiona asupra LB Ulterior se formeaza alte legaturi co-stimulatoare. Astfel limf Th devin capabile sa secrete citokine: IL- 4, 5, 10, 13, care vor actiona asupra LB activat . Aceste citokine induc activat . Aceste citokine induc proliferareaproliferarea LB activate, stimuleaza LB activate, stimuleaza diferentiereadiferentierea lor in lor in plasmocite secretoare de Acplasmocite secretoare de Ac Ig M cu paratopul (centrul Ig M cu paratopul (centrul activ) identic cu BCR de pe LB (2000 Ac/sec sintetizate de un plasmocit)activ) identic cu BCR de pe LB (2000 Ac/sec sintetizate de un plasmocit). Sub influenţa citokinelor produse de limf Th unele LB pot să se . Sub influenţa citokinelor produse de limf Th unele LB pot să se diferenţieze în plasmocite secretoare de Ig din alte clase (IFN –IgGdiferenţieze în plasmocite secretoare de Ig din alte clase (IFN –IgG2; 2; IL-4 –IL-4 –Ig G4, Ig G4, IgEIgE; ; TGF beta- IgA). TGF beta- IgA). Plasmocitele rămân în organele limfoide periferice, iar Ac secretaţi pătrund în circulaţia sangvină. Unele plasmocite migrează spre măduva Plasmocitele rămân în organele limfoide periferice, iar Ac secretaţi pătrund în circulaţia sangvină. Unele plasmocite migrează spre măduva osoasă, continuând să producă Ac mult timp (luni, ani), chiar după eliminarea Ag. In caz de infectie a mucoaselor, plasmocitele se vor afla la osoasă, continuând să producă Ac mult timp (luni, ani), chiar după eliminarea Ag. In caz de infectie a mucoaselor, plasmocitele se vor afla la nivelul mucoaselor (în nivelul mucoaselor (în Lamina propria)Lamina propria), producand Ac (sIg A) care vor fi transportati la suprafata mucoaselor. , producand Ac (sIg A) care vor fi transportati la suprafata mucoaselor. O parte din LB activate se transformă în celule memorie. Limf B memorie nu secretă Ac, ele circulă prin sânge şi supravieţuiesc mai multe luni sau O parte din LB activate se transformă în celule memorie. Limf B memorie nu secretă Ac, ele circulă prin sânge şi supravieţuiesc mai multe luni sau ani fiind gata sa reacţioneze la o pătrundere repetată a Ag.ani fiind gata sa reacţioneze la o pătrundere repetată a Ag.

4.4. Efectul iEfectul interacţiunnteracţiuniiii dintre Ag şi Ac dintre Ag şi Ac in vivoin vivo depinde de natura Ag şi de tipul de Ac şi se poate manifesta prin: depinde de natura Ag şi de tipul de Ac şi se poate manifesta prin: Opsonizarea Opsonizarea bacteriilor bacteriilor şi intensificarea fagocitozei şi intensificarea fagocitozei Activarea complementului pe cale clasică Activarea complementului pe cale clasică citoliză (inclusiv bacterioliză) citoliză (inclusiv bacterioliză) Neutralizarea toxinelor, enzimelorNeutralizarea toxinelor, enzimelor Inhibiţia adeziunii bacteriilor, virusurilor (IgA)Inhibiţia adeziunii bacteriilor, virusurilor (IgA) Neutralizarea virusurilor extracelulareNeutralizarea virusurilor extracelulare Imobilizarea bacteriilor si protozoarelorImobilizarea bacteriilor si protozoarelor Citotoxicitatea mediată celular Ac-dependentă (celulele acoperite de Ac sunt distruse de celulele K)Citotoxicitatea mediată celular Ac-dependentă (celulele acoperite de Ac sunt distruse de celulele K)

Răspunsul umoral primar – la primul contact cu AgRăspunsul umoral primar – la primul contact cu AgI fază – I fază – de latenţăde latenţă – durează 4-7 zile, până la apariţia primilor Ac. – durează 4-7 zile, până la apariţia primilor Ac. In acest timp aIn acest timp are loc recunoaşterea, degradarea Ag, diferenţierea T,B re loc recunoaşterea, degradarea Ag, diferenţierea T,B limfocitelor.limfocitelor.II fază –II fază – logaritmică logaritmică – Titrul Ac creşte, atingând max în a 10-15 zi. Iniţial – Titrul Ac creşte, atingând max în a 10-15 zi. Iniţial are loc producerea are loc producerea Ig M, peste 4-5 zile Ig M, peste 4-5 zile - - IgGIgG sau alte izotipuri de Ig (prin sau alte izotipuri de Ig (prin comutatie de clasa sub influenta citokinelor produse de Th)comutatie de clasa sub influenta citokinelor produse de Th)..III fază – III fază – de producere maximă a Acde producere maximă a Ac – Durata variază în funcţie de Ag. – Durata variază în funcţie de Ag.IV fază – IV fază – de dde diminuaiminuare a titrului de Acre a titrului de Ac (declin)(declin)– În cazul Ag proteice – În cazul Ag proteice dureazadureaza săptămâni, Ag polizaharidice – luni, Ag virale – ani). săptămâni, Ag polizaharidice – luni, Ag virale – ani).Răspunsul umoral secundarRăspunsul umoral secundar (la un contact repetat cu acelaşi Ag). (la un contact repetat cu acelaşi Ag).

Este asigurat de LB-memorieEste asigurat de LB-memorie Perioadă de latenţă scurtă (ore)Perioadă de latenţă scurtă (ore) Ascensiune rapidă a titrului AcAscensiune rapidă a titrului Ac Titru maxim de Ac menţinut o durată mai mareTitru maxim de Ac menţinut o durată mai mare Afinitate crescută a Ac faţă de AgAfinitate crescută a Ac faţă de Ag Producerea anticorpilor Ig GProducerea anticorpilor Ig G

Serul sangvin obţinut de la un organism imunizat cu un Ag conţine o mare varietate de molecule de Ac, produşi de Serul sangvin obţinut de la un organism imunizat cu un Ag conţine o mare varietate de molecule de Ac, produşi de diferitdiferite clone de LB. Aceşte clone de LB. Aceştiia a sunt sunt Ac policlonaliAc policlonali. . Ac monoclonaliAc monoclonali sunt absolut identici. Se obţin prin fuzionarea LB cu o celulă tumorală. Hibridomul obţinut se multiplică ca o sunt absolut identici. Se obţin prin fuzionarea LB cu o celulă tumorală. Hibridomul obţinut se multiplică ca o celulă tumorală şi secretă Ac omogeni, idcelulă tumorală şi secretă Ac omogeni, ideentici ntici cu cu BCR. Servesc la detectarea receptorilor de pe suprafaţa celulelorBCR. Servesc la detectarea receptorilor de pe suprafaţa celulelor, tratament etc, tratament etc. .

53. Raspunsul imun celular (RIC). Destinatia. Factorii implicati in declansarea si dezvoltarea RIC. Fazele RIC. Rolul RIC = a elimina microbii care pot supravieţui în vacuole fagocitare sau în citoplasma celulelor infectate. AcRolul RIC = a elimina microbii care pot supravieţui în vacuole fagocitare sau în citoplasma celulelor infectate. Acest tip de imunitate est tip de imunitate este asigurat este asigurat dede limfocitele T limfocitele T..

26

Page 27: Microbiologie Exam

Principalii Principalii efectoriefectori ai RIC ai RIC sunt limfocitele sunt limfocitele TTcitotoxice (Tc) derivate din limf TCD8 (T8)citotoxice (Tc) derivate din limf TCD8 (T8),, care au capacitatea de a distruge celulele infectate cu care au capacitatea de a distruge celulele infectate cu virus sau tumorale şi virus sau tumorale şi de a de a lilizza macrofaga macrofageleele infecta infectatete cu bacterii cu bacterii facultativ facultativ intracelulare.intracelulare. Ambele tipuri de limfocite (TCD8 Ambele tipuri de limfocite (TCD8 naive naive si Tc) poseda TCR si Tc) poseda TCR si molecule CD8.si molecule CD8.MacrofagMacrofageleele activa activatete reprezintă alţi efectori ai RIC. E reprezintă alţi efectori ai RIC. Elele sunt atra sunt atrasese în focarul infecţios, apoi activa în focarul infecţios, apoi activatete, devenind capabil, devenind capabilee să distrugă bacteriile să distrugă bacteriile intracelulare.intracelulare.Celulele K şi NKCelulele K şi NK participă de a participă de assemenea la realizarea citotoxicităţiiemenea la realizarea citotoxicităţii (nu sunt angajate imun) (nu sunt angajate imun)..LLimfocitele TCD4+imfocitele TCD4+ participa indirect la dezvoltarea raspunsului imun celular participa indirect la dezvoltarea raspunsului imun celular, , deoarece deoarece în urma recunoaşterii Agîn urma recunoaşterii Ag vor produce un număr mare de vor produce un număr mare de citokine care vor acţiona asupra diferitor citokine care vor acţiona asupra diferitor celulecelule: monocite, limfocite TCD8, TCD4, celule NK, etc.: monocite, limfocite TCD8, TCD4, celule NK, etc.Dezvoltarea răspunsului imun celular:Dezvoltarea răspunsului imun celular:I etapa –Prezentarea Ag LT naïveI etapa –Prezentarea Ag LT naïve. Procesul are loc în organele limfoide periferice (OLP).. Procesul are loc în organele limfoide periferice (OLP).CPA profesioniste (macrofage, celule dendriticeCPA profesioniste (macrofage, celule dendritice)) capteaza Ag (ex.: celule infectate cu virus sau celule tumorale) capteaza Ag (ex.: celule infectate cu virus sau celule tumorale) fagocitoza fagocitoza unele proteine unele proteine virale pot fi transferate din fagosome in Ct virale pot fi transferate din fagosome in Ct ele vor fi fragmentate de catre proteasome ele vor fi fragmentate de catre proteasome asamblarea cu moleculele CMH I asamblarea cu moleculele CMH I complexul complexul peptid/CMH I este scos la suprafata CPA (peste 250.000 complexe per celula) peptid/CMH I este scos la suprafata CPA (peste 250.000 complexe per celula) CPA cu limfa sunt transportate in ganglionii limfatici, unde ele CPA cu limfa sunt transportate in ganglionii limfatici, unde ele vor fi capabile sa prezinte Ag limfocitelor TCD8 naïve. vor fi capabile sa prezinte Ag limfocitelor TCD8 naïve. II etapa – Recunoasterea epitopilor AgII etapa – Recunoasterea epitopilor Ag de catre TCR unui LT CD8 naiv si activarea lui. de catre TCR unui LT CD8 naiv si activarea lui. Limf T8 naïveLimf T8 naïve vor recunoaste peptide asociate cu CMH I vor recunoaste peptide asociate cu CMH I de pe suprafata CPA care au captat celule infectate cu virus. Epitopul trebuie sa corespunda cu TCR de pe limfocitul T8, iar CMH I va recunoaste de pe suprafata CPA care au captat celule infectate cu virus. Epitopul trebuie sa corespunda cu TCR de pe limfocitul T8, iar CMH I va recunoaste situsuri de pe CD8. Aceaste interactiuni, precum si alte legaturi moleculare intre CPA si limf T8, participa la activarea limf T8 naïve (costimulare). situsuri de pe CD8. Aceaste interactiuni, precum si alte legaturi moleculare intre CPA si limf T8, participa la activarea limf T8 naïve (costimulare). Citokinele eliberate de CPA se implica de asemenea. Citokinele eliberate de CPA se implica de asemenea. III etapa – Proliferarea limfocitelor T8III etapa – Proliferarea limfocitelor T8 (expansiune (expansiuneaa clonala) clonala) si diferentierea lorsi diferentierea lor.. Dupa activare, sub influenta unor citokine eliberate de limf Dupa activare, sub influenta unor citokine eliberate de limf Th1 (in special IL-2), are loc proliferarea limf T8 si diferentierea lor in Th1 (in special IL-2), are loc proliferarea limf T8 si diferentierea lor in celule efectoare Tccelule efectoare Tc, capabile sa lupte cu infectia intracelulara sau celulele , capabile sa lupte cu infectia intracelulara sau celulele tumorale. Proliferarea incepe la 2 zile de la activarea limfocitelor şi se produce rapid (peste o săptămână după infectare până la 10-20% din toate tumorale. Proliferarea incepe la 2 zile de la activarea limfocitelor şi se produce rapid (peste o săptămână după infectare până la 10-20% din toate limf din OLP pot fi specifice pentru un Ag. N – 1:10limf din OLP pot fi specifice pentru un Ag. N – 1:1066 ). Diferentierea in celule Tc are loc in paralel cu proliferarea. ). Diferentierea in celule Tc are loc in paralel cu proliferarea.Celulele efectoare Celulele efectoare Tc Tc părăsesc OLP şi migrează spre părăsesc OLP şi migrează spre tesutultesutul infec infectattat, unde, recunoscând Ag, vor elimina infecţia. Unele limfocite T se diferenţiază , unde, recunoscând Ag, vor elimina infecţia. Unele limfocite T se diferenţiază în limfocite în limfocite T memorieT memorie, durată de viaţă lungă, inactive funcţional, dar sunt gata să reacţioneze rapid la o nouă expoziţie la acelasi microb , durată de viaţă lungă, inactive funcţional, dar sunt gata să reacţioneze rapid la o nouă expoziţie la acelasi microb (răspuns(răspuns celular secundar).celular secundar).IVIV etapa – Realizarea efectului etapa – Realizarea efectului IC.IC.CitotoxicitateaCitotoxicitatea este rezultatul contactului specific este rezultatul contactului specific direct direct dintre clona de Tc şi ţinta lor (celule infectate cu virus sau bacterii intracelulare, celule dintre clona de Tc şi ţinta lor (celule infectate cu virus sau bacterii intracelulare, celule tumorale). Celulele infectate prezintă pe suprafaţa sa peptide antigenice asociate cu moleculele CMH I, fiind recunoscute de către TCR şi CDtumorale). Celulele infectate prezintă pe suprafaţa sa peptide antigenice asociate cu moleculele CMH I, fiind recunoscute de către TCR şi CD88 de pe de pe limf Tc. limf Tc. Reacţia citotoxică: contact membranar dintre Tc şi celula-ţintă Reacţia citotoxică: contact membranar dintre Tc şi celula-ţintă limfocitele Tc eliberează perforine care se inserează în membrana celulei-ţintă limfocitele Tc eliberează perforine care se inserează în membrana celulei-ţintă formare pori. Paralel, limf Tc secretă enzime (granzime) care penetrează în Ct celulei formare pori. Paralel, limf Tc secretă enzime (granzime) care penetrează în Ct celulei prin pori prin pori apoptoza ei. apoptoza ei. IFN produs si secretat de Th1 este un activator puternic al macrofagelor, stimuland capacitatea lor de a distruge patogeni intracelulari. De IFN produs si secretat de Th1 este un activator puternic al macrofagelor, stimuland capacitatea lor de a distruge patogeni intracelulari. De asemenea, citokinele mentionate activeaza limf Tc si celulele NK, promoveaza asemenea, citokinele mentionate activeaza limf Tc si celulele NK, promoveaza proliferareaproliferarea limf T4, stimuleaza producerea opsoninelor limf T4, stimuleaza producerea opsoninelor (intensificarea fagocitozei), activeaza neutrofilele, stimuleaza cresterea productiei de monocite in maduva osoasa, etc. (intensificarea fagocitozei), activeaza neutrofilele, stimuleaza cresterea productiei de monocite in maduva osoasa, etc. Memorie imunologicaMemorie imunologica – Capacitatea sistemului imun de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si mai eficace la intalniri repetate cu acelasi Ag. – Capacitatea sistemului imun de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si mai eficace la intalniri repetate cu acelasi Ag.TolerantaToleranta – absenta raspunsului imun la antigene proprii (self). Este determinata de inactivarea si eliminarea limfocitelor autoreactive in – absenta raspunsului imun la antigene proprii (self). Este determinata de inactivarea si eliminarea limfocitelor autoreactive in procesul de maturizare a limfocitelor T si B.procesul de maturizare a limfocitelor T si B.

CitokineleCitokinele sunt molecule care permit diferitor celule să comunice între ele în producerea unei reacţii. sunt molecule care permit diferitor celule să comunice între ele în producerea unei reacţii.Citokinele reunesc un grup heterogen de molecule: interleukine (IL), limfokine, monokine, interferoni (IFN), factori de stimulare a coloniilor Citokinele reunesc un grup heterogen de molecule: interleukine (IL), limfokine, monokine, interferoni (IFN), factori de stimulare a coloniilor (CSF), factori de necroză a tumorilor (TNF), etc. (CSF), factori de necroză a tumorilor (TNF), etc. Citokinele permit celulelor Sistemului Imun să se multiplice şi să se diferenţieze (ex.: IL-2 este un factor de creştere al TL, iar IL-4 stimulează BL şiCitokinele permit celulelor Sistemului Imun să se multiplice şi să se diferenţieze (ex.: IL-2 este un factor de creştere al TL, iar IL-4 stimulează BL şi diferenţierea lor în plasmocite producătoare de Ig E)diferenţierea lor în plasmocite producătoare de Ig E)Citokinele sunt glicoproteine care acţionează asupra celulelor prin intermediul receptorilor membranari, care nu sunt întotdeauna activi. Citokinele sunt glicoproteine care acţionează asupra celulelor prin intermediul receptorilor membranari, care nu sunt întotdeauna activi. Expresia lor poate fi indusă de o altă citokină (ex.: IL-1 induce receptorul pentru IL-2 pe T şi BL) . Receptorii citokinelor sunt prezente şi pe alte Expresia lor poate fi indusă de o altă citokină (ex.: IL-1 induce receptorul pentru IL-2 pe T şi BL) . Receptorii citokinelor sunt prezente şi pe alte celule ale organismului. Astfel ele ar putea servi la comunicarea între Sistemul Imun şi alte sisteme ale organismului, ca SNC şi sistemul endocrin.celule ale organismului. Astfel ele ar putea servi la comunicarea între Sistemul Imun şi alte sisteme ale organismului, ca SNC şi sistemul endocrin.

54. Reactiile de hipersensibilitate (RHS). Definitie. Particularitatile RHS. Clasificarea RHS in functie de mecanismele imunologice efectuate.Hipersensibilitate – raspunsuri imune excesive sau anormale, capabile sa provoace leziuni tisulare si maladii. Hipersensibilitate – raspunsuri imune excesive sau anormale, capabile sa provoace leziuni tisulare si maladii. Aceste reacţii se pot dezvolta în Aceste reacţii se pot dezvolta în cadrul mecanismelor de apărare faţă de un microb patogen. În acelaşi timp, reacţii similare pot fi dirijate contra substanţelor cadrul mecanismelor de apărare faţă de un microb patogen. În acelaşi timp, reacţii similare pot fi dirijate contra substanţelor de origine ne-de origine ne-infectioasainfectioasa..Particularităţile RHS:Particularităţile RHS:

RHS sunt specifice de Ag/alergen.RHS sunt specifice de Ag/alergen. RHS sunt induse de un contact primar cu Ag/alergenul care provoacă răspunsul imun specific (umoral, celular).RHS sunt induse de un contact primar cu Ag/alergenul care provoacă răspunsul imun specific (umoral, celular). RHS sunt declanşate la contacte ulterioare repetate cu acelaşi Ag/alergen.RHS sunt declanşate la contacte ulterioare repetate cu acelaşi Ag/alergen.

Clasificarea RHS după mecanismele imunologice efectuate (Gell, Coombs)Clasificarea RHS după mecanismele imunologice efectuate (Gell, Coombs)Hipersensibilitatea de tipul I (reacţii imediate, anafilactice)Hipersensibilitatea de tipul I (reacţii imediate, anafilactice)Hipersensibilitatea de tipul II (citolitic-citotoxică)Hipersensibilitatea de tipul II (citolitic-citotoxică)Hipersensibilitatea de tipul III (prin complexe imune)Hipersensibilitatea de tipul III (prin complexe imune)Hipersensibilitatea de tipul IV (tardivă)Hipersensibilitatea de tipul IV (tardivă)Hipersensibilitatea de tipul V (prin autoAc)Hipersensibilitatea de tipul V (prin autoAc)

55. Reactiile de hipersensibilitate de tip I (imediate, anafilactice). Factorii implicati, alergenii. Anafilaxia locala si generala, mecanismul reactiilor. Depistarea RHS de tipul I. Combaterea reactiilor anafilactice.RHS imediate mai sunt numite “alergie” sau “atopie”. Persoanele predispuse la astfel de reactii sunt numite “atopice”. Antigenele care declanseaza RHS imediate mai sunt numite “alergie” sau “atopie”. Persoanele predispuse la astfel de reactii sunt numite “atopice”. Antigenele care declanseaza o hipersensibilitate imediata sunt calificate ca “alergeni”.o hipersensibilitate imediata sunt calificate ca “alergeni”.Manifestările patologice survin timp de 15-30 min după reîntroducerea Manifestările patologice survin timp de 15-30 min după reîntroducerea alergenului alergenului în organismul sensibilizat.în organismul sensibilizat.În reacţiile anafilactice participă Ig E. În reacţiile anafilactice participă Ig E. la persoanele predispuse la alergii intalnirea cu unele Ag determina activarea limf Th2 si producerea Ac Ig E.la persoanele predispuse la alergii intalnirea cu unele Ag determina activarea limf Th2 si producerea Ac Ig E. Fiind sintetizate în timpul primului contact cu alergenul, IgE se fixează pe receptori ai mastocitelor (în special din ţesutul conjunctiv sau din Fiind sintetizate în timpul primului contact cu alergenul, IgE se fixează pe receptori ai mastocitelor (în special din ţesutul conjunctiv sau din mucoase), persistând mai multe luni.mucoase), persistând mai multe luni.

La pătrunderea repetată (percutan, prin mucoase, intravenos) antigenul omolog leagă încrucişat fragmentele Fab ale Ig E vecineLa pătrunderea repetată (percutan, prin mucoase, intravenos) antigenul omolog leagă încrucişat fragmentele Fab ale Ig E vecine de pe de pe mastocitemastocite. Aceasta duce la eliberarea din celule a unor mediatori, substanţe biologic active (histamină, serotonină, Factorul de Necroză al . Aceasta duce la eliberarea din celule a unor mediatori, substanţe biologic active (histamină, serotonină, Factorul de Necroză al Tumorilor, prostaglandine, leucotriene). Ele se fixează pe receptorii terminaţiilor nervoase inducând contracţia musculaturii Tumorilor, prostaglandine, leucotriene). Ele se fixează pe receptorii terminaţiilor nervoase inducând contracţia musculaturii netede netede ((bronşice, intestinale, uterinebronşice, intestinale, uterine)), vasodilataţie, creşterea permeabilităţii vasculare cu edem, reacţie urticariană în tegument şi hipersecreţie de , vasodilataţie, creşterea permeabilităţii vasculare cu edem, reacţie urticariană în tegument şi hipersecreţie de mucus la nivelul bronşic. mucus la nivelul bronşic. Aceste reactii survin la cateva minute de la reintroducerea Ag.Aceste reactii survin la cateva minute de la reintroducerea Ag.

27

Page 28: Microbiologie Exam

Alti mediatori ai mastocitelor – citokinele – recruteaza, pe parcursul al catorva ore, neutrofile si eozinofile la nivelul localizarii reactiei. Acest Alti mediatori ai mastocitelor – citokinele – recruteaza, pe parcursul al catorva ore, neutrofile si eozinofile la nivelul localizarii reactiei. Acest proces inflamator al RHS imediate reprezinta faza tardiva a reactiei. Este responsabila de leziunile tisulare provocate de catre atacurile proces inflamator al RHS imediate reprezinta faza tardiva a reactiei. Este responsabila de leziunile tisulare provocate de catre atacurile repetate de hipersensibilitate imediata. repetate de hipersensibilitate imediata. Anafilaxia generală (şocul anafilactic)Anafilaxia generală (şocul anafilactic)Este cea mai brutală şi gravă reacţie declanşată de un Ag/alergen. Se manifestă în câteva secunde după administrarea parenterală a dozelor Este cea mai brutală şi gravă reacţie declanşată de un Ag/alergen. Se manifestă în câteva secunde după administrarea parenterală a dozelor mari de Ag/alergen cu semne clinice sistemice: urticarie, asfixie, colaps circulator şi şoc. Poate duce la deces subit.mari de Ag/alergen cu semne clinice sistemice: urticarie, asfixie, colaps circulator şi şoc. Poate duce la deces subit.Ag responsabile de şocul anafilactic:Ag responsabile de şocul anafilactic: medicamente (analgezice, anestetice, AB, seruri medicamente (analgezice, anestetice, AB, seruri sangvine sangvine de animale, enzime), venin de viespi, de de animale, enzime), venin de viespi, de albine, alimente.albine, alimente.Anafilaxia locală (alergenul administrat în doză foarte mică sau depus pe o mucoasă) Anafilaxia locală (alergenul administrat în doză foarte mică sau depus pe o mucoasă) La nivelul mucoaselor:La nivelul mucoaselor: conjunctivita alergică, rinita, astmul şi traheita spasmodică (alergeni: polenuri, dejecte de acarieni din praful de casă) conjunctivita alergică, rinita, astmul şi traheita spasmodică (alergeni: polenuri, dejecte de acarieni din praful de casă)Forme cutanateForme cutanate: dermatita atopică şi urticaria: dermatita atopică şi urticariaAlergia alimentarăAlergia alimentară: manifestări extradigestive (urticarie, edem Quincke, astm, anafilaxie) şi digestive (diaree, vome): manifestări extradigestive (urticarie, edem Quincke, astm, anafilaxie) şi digestive (diaree, vome)Depistarea RHS tipul I:Depistarea RHS tipul I:Teste cutanateTeste cutanate prin aplicarea cutanată sau administrarea intradermică a alergenilor. Reacţie pozitivă – peste 15 min local apare o reacţie prin aplicarea cutanată sau administrarea intradermică a alergenilor. Reacţie pozitivă – peste 15 min local apare o reacţie eritemo-papuloasă.eritemo-papuloasă.Teste de provocareTeste de provocare – se efectuează la astmatici, prin administrarea alergenului în aerozol (pe cale nazală, oculară, orală) şi măsurând – se efectuează la astmatici, prin administrarea alergenului în aerozol (pe cale nazală, oculară, orală) şi măsurând modificările imediate şi tardive a volumului expirat maxim.modificările imediate şi tardive a volumului expirat maxim.Dozarea imunoenzimatică sau radioimună a Ig EDozarea imunoenzimatică sau radioimună a Ig EPrincipii de tratamentPrincipii de tratament: Evitarea alergenului; Desensibilizarea prin administrarea : Evitarea alergenului; Desensibilizarea prin administrarea repetata a dozelor mici de repetata a dozelor mici de AgAg, , care induce sinteza Ac Ig G; care induce sinteza Ac Ig G; Tratament simptomatic (inhibitori ai degranulării mastocitelor, anti-histaminice, etc)Tratament simptomatic (inhibitori ai degranulării mastocitelor, anti-histaminice, etc)

56. Reactiile de hipersensibilitate de tip II (citolitic-citotoxice). Factorii implicati, consecintele. Diagnosticul si combaterea RHS de tipul II.

Implică Ac (Ig G sau Ig M) dirijaţi contra unui Ag natural sau exogen fixat pe suprafaţa unei celule sau a unui ţesut. Se dezvoltă în câteva Implică Ac (Ig G sau Ig M) dirijaţi contra unui Ag natural sau exogen fixat pe suprafaţa unei celule sau a unui ţesut. Se dezvoltă în câteva minute sau ore. Afectează în special celulele sângelui, provocând citoliza prin activarea complementului sau prin opsonizare şi fagocitoză de minute sau ore. Afectează în special celulele sângelui, provocând citoliza prin activarea complementului sau prin opsonizare şi fagocitoză de către macrofage. Celulele K de asemenea pot distruge celulele opsonizate. Aceste mecanisme cauzează citopenie.către macrofage. Celulele K de asemenea pot distruge celulele opsonizate. Aceste mecanisme cauzează citopenie.Reacţii transfuzionale (prezenţa Ac anti-hematii în timpul unei transfuzii sanguine poate induce hemoliză intravasculară prin activarea C pe Reacţii transfuzionale (prezenţa Ac anti-hematii în timpul unei transfuzii sanguine poate induce hemoliză intravasculară prin activarea C pe cale clasică).cale clasică).Maladia hemolitică perinatală prin incompatibilitate Rhesus. Mama Rh- se imunizează în cursul primei gravidităţi contra fătului Rh+ la Maladia hemolitică perinatală prin incompatibilitate Rhesus. Mama Rh- se imunizează în cursul primei gravidităţi contra fătului Rh+ la trecerea hematiilor fetale în sângele matern (la naştere, în timpul unui avort). La o graviditate ulterioară, mama pre-imunizată contra trecerea hematiilor fetale în sângele matern (la naştere, în timpul unui avort). La o graviditate ulterioară, mama pre-imunizată contra factorului Rh+ poate sintetiza Ig G anti-Rh+, dacă fătul este iarăşi Rh+. Aceşti Ac pot traversa bariera placentară şi liza hematiile fătului la factorului Rh+ poate sintetiza Ig G anti-Rh+, dacă fătul este iarăşi Rh+. Aceşti Ac pot traversa bariera placentară şi liza hematiile fătului la finele gravidităţii, provocând o hemoliză gravă.finele gravidităţii, provocând o hemoliză gravă.PrevenireaPrevenirea: administrarea Ac anti-Rh+ tuturor femeilor Rh- în primele 48 ore de la naşterea unui copil Rh+ sau a unui avort. Aceşti Ac : administrarea Ac anti-Rh+ tuturor femeilor Rh- în primele 48 ore de la naşterea unui copil Rh+ sau a unui avort. Aceşti Ac opsonizează hematiile fetale din sângele matern şi provoacă eliminarea lor rapidă. Hemoliza imună de origine medicamentoasă opsonizează hematiile fetale din sângele matern şi provoacă eliminarea lor rapidă. Hemoliza imună de origine medicamentoasă (medicamentul se depune pe membrana eritrocitară şi Ac anti-medicament distrug eritrocitele acoperite de acest medicament). 4. (medicamentul se depune pe membrana eritrocitară şi Ac anti-medicament distrug eritrocitele acoperite de acest medicament). 4. Trombocitopenii şi granulocitopenii.Trombocitopenii şi granulocitopenii.DiagnosticDiagnostic: Depistarea Ac contra celulelor (ţesuturilor) implicare; Prezenţa Ac şi C în leziuni, depistaţi prin RIF: Depistarea Ac contra celulelor (ţesuturilor) implicare; Prezenţa Ac şi C în leziuni, depistaţi prin RIF

57. Reactiile de hipersensibilitate de tip III (mediate de complexe imune solubile). Factorii implicati. Mecanismul, manifestarile patologice. Depistarea RHS de tipul III.

RHS de tipul III (mediate de complexe imune Ag-Ac solubile)RHS de tipul III (mediate de complexe imune Ag-Ac solubile)În mod normal CI sunt eliminate repede din organism. În unele circumstanţe CI persistă perioade îndelungate. Cauze: În mod normal CI sunt eliminate repede din organism. În unele circumstanţe CI persistă perioade îndelungate. Cauze: IInfecţii cronice: anginenfecţii cronice: angine streptococice, endocardite bacteriene, hepatite virale, parazitoze, etcstreptococice, endocardite bacteriene, hepatite virale, parazitoze, etcŢesuturi proprii devenite auto-reactive în urma unor procese distructive (ex.: colagenoze)Ţesuturi proprii devenite auto-reactive în urma unor procese distructive (ex.: colagenoze)Introducerea albuminei serice în cantităţi mari (tratament cu seruri imune)Introducerea albuminei serice în cantităţi mari (tratament cu seruri imune)Mecanismul:Mecanismul: Complexele Ag-Ac solubile activează C şi determină leziuni în locul formării sau depunerii lor în ţesuturi sau pe endoteliul Complexele Ag-Ac solubile activează C şi determină leziuni în locul formării sau depunerii lor în ţesuturi sau pe endoteliul vascular.vascular.Fenomene patologice localeFenomene patologice locale: reacţia Arthus, glomerulonefrita, artrită, poliatrerite. Se produc în exces de Ac după 3-10 ore de la contactul cu : reacţia Arthus, glomerulonefrita, artrită, poliatrerite. Se produc în exces de Ac după 3-10 ore de la contactul cu Ag.Ag.Fenomene patologiceFenomene patologice generalegenerale: boala serului (în exces de Ag).: boala serului (în exces de Ag).Depistarea RHS de tipul III: Depistarea RHS de tipul III: Evidenţierea CI în biopsii tisulare. Se efectuează utilizând RIF, RIE sau ARI; Titrarea Complementului seric Evidenţierea CI în biopsii tisulare. Se efectuează utilizând RIF, RIE sau ARI; Titrarea Complementului seric (diminuarea titrului)(diminuarea titrului)

58. Reactiile de hipersensibilitate de tip IV (mediate celular, tardive). Tipurile. Factorii implicati, alergenii. Depistarea RHS de tipul IV.

RHS de tipul IV (mediate celular, tardive, întârziate)RHS de tipul IV (mediate celular, tardive, întârziate)Sunt determinate de limfocite T CD8 (Tc) sau TCD4 (Th1) activate la contactul secundar cu Ag sensibilizant.Sunt determinate de limfocite T CD8 (Tc) sau TCD4 (Th1) activate la contactul secundar cu Ag sensibilizant.Sunt cunoscute 3 modele de hipersensibilitate tardivă: Hipersensibilitatea tuberculinică; Reacţia granulomatoasă; Dermatitele de contactSunt cunoscute 3 modele de hipersensibilitate tardivă: Hipersensibilitatea tuberculinică; Reacţia granulomatoasă; Dermatitele de contact

Hipersensibilitatea tuberculinicăHipersensibilitatea tuberculinică este indusă de infecţii bacteriene, virale, fungice sau parazitare, prin vaccinare cu vaccinuri vii atenuate sau este indusă de infecţii bacteriene, virale, fungice sau parazitare, prin vaccinare cu vaccinuri vii atenuate sau cu proteine fixate pe un adjuvant complet. cu proteine fixate pe un adjuvant complet. Pătrunderea repetată a Ag activează limdocitele Th1 specifice de acest Ag, ducând la activarea Tc şi eliberarea unor citokine, responsabile de Pătrunderea repetată a Ag activează limdocitele Th1 specifice de acest Ag, ducând la activarea Tc şi eliberarea unor citokine, responsabile de acumularea locală a celulelor mononucleate cu apariţia eritemului şi formarea unui infiltrat, în unele cazuri chiar şi necroză. Leziunea apare acumularea locală a celulelor mononucleate cu apariţia eritemului şi formarea unui infiltrat, în unele cazuri chiar şi necroză. Leziunea apare peste 48 ore şi dispare în 3-5 zile. peste 48 ore şi dispare în 3-5 zile.

Hipersensibilitatea granulomatoasăHipersensibilitatea granulomatoasă apare în cursul sensibilizării cu substanţe insolubile sau greu digerabile (constituienţii unor paraziţi, apare în cursul sensibilizării cu substanţe insolubile sau greu digerabile (constituienţii unor paraziţi, compuşi lipoidici ai micobacteriilor, brucelelor, etc). În aceste cazuri RHS se prelungeşte şi se manifestă prin formarea, în câteva săptămâni compuşi lipoidici ai micobacteriilor, brucelelor, etc). În aceste cazuri RHS se prelungeşte şi se manifestă prin formarea, în câteva săptămâni sau luni, a unui granulom.sau luni, a unui granulom.În componenţa granulomului se disting 3 zone: centrală, din celule epitelioide, intermediară – din limfocite şi fibroblaste şi periferică – din În componenţa granulomului se disting 3 zone: centrală, din celule epitelioide, intermediară – din limfocite şi fibroblaste şi periferică – din leucocite PMN, limfocite B şi plasmocite. Granulomul poate fi supus fibrozei şi calcifierii, persistând mai mulţi ani.leucocite PMN, limfocite B şi plasmocite. Granulomul poate fi supus fibrozei şi calcifierii, persistând mai mulţi ani.

Hipersensibilitatea de contactHipersensibilitatea de contact este determinată de haptene (metale grele - Ni, Cr, substanţe chimice – cauciuc, clei, pesticide, vopsele, produse este determinată de haptene (metale grele - Ni, Cr, substanţe chimice – cauciuc, clei, pesticide, vopsele, produse cosmetice, medicamente). cosmetice, medicamente). Aplicate percutanAplicate percutan se combină cu proteinele membranare, în special ale celulelor Langerhans din epidermă. Aceasta duce la expansiunea se combină cu proteinele membranare, în special ale celulelor Langerhans din epidermă. Aceasta duce la expansiunea clonală a limfocitelor TCD8+. La contacte repetate cu aceeaşi haptenă, citokinele eliberate de limfocitele activate determină infiltrarea clonală a limfocitelor TCD8+. La contacte repetate cu aceeaşi haptenă, citokinele eliberate de limfocitele activate determină infiltrarea

28

Page 29: Microbiologie Exam

celulară a glandelor sudoripare, sebacee, a foliculilor piloşi, a epidermei. Peste 48-72 ore local se observă eritem, edem şi formarea celulară a glandelor sudoripare, sebacee, a foliculilor piloşi, a epidermei. Peste 48-72 ore local se observă eritem, edem şi formarea veziculelor.veziculelor.Explorarea hipersensibilităţii tardive: Explorarea hipersensibilităţii tardive: T e s t e c u t a n a t e (in vivo)T e s t e c u t a n a t e (in vivo)Dermatitele de contactDermatitele de contact se depistează prin aplicarea cutanată a haptenelor şi examinarea eritemului, infiltratului cutanat şi a veziculelor se depistează prin aplicarea cutanată a haptenelor şi examinarea eritemului, infiltratului cutanat şi a veziculelor apărute peste 48 ore.apărute peste 48 ore.Hipersensibilitatea tuberculinicăHipersensibilitatea tuberculinică se explorează prin introducerea intradermică a se explorează prin introducerea intradermică a alergenilor microbieni: alergenilor microbieni: tuberculina (derivat proteic al unei tuberculina (derivat proteic al unei culturi de culturi de Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis), brucelina, tularina, antraxina, dizenterina, etc. Peste 48 ore se măsoară diametrul eritemului şi ), brucelina, tularina, antraxina, dizenterina, etc. Peste 48 ore se măsoară diametrul eritemului şi induraţiei. Reacţia pozitivă denotă că organismul a fost în contact cu alergenul (infecţie anterioară sau actuală, vaccinare) şi că acesta persistăinduraţiei. Reacţia pozitivă denotă că organismul a fost în contact cu alergenul (infecţie anterioară sau actuală, vaccinare) şi că acesta persistă în macrofagele organismului. Pentru confirmarea maladiei sunt necesare investigaţii suplimentare. în macrofagele organismului. Pentru confirmarea maladiei sunt necesare investigaţii suplimentare. T e s t e i n v i t r oT e s t e i n v i t r oTestul de transformare limfoblasticăTestul de transformare limfoblastică (limfocitele unei persoane cu hipersensibilitate tardivă cultivate in vitro în prezenţa Ag /alergenului (limfocitele unei persoane cu hipersensibilitate tardivă cultivate in vitro în prezenţa Ag /alergenului suportă o transformare blastică cu proliferare ulterioară).suportă o transformare blastică cu proliferare ulterioară).Testul de inhibiţie a migrării leucocitelorTestul de inhibiţie a migrării leucocitelor (activarea limfocitelor T de către Ag specifice duce la secreţia citokinelor care inhibă migrarea (activarea limfocitelor T de către Ag specifice duce la secreţia citokinelor care inhibă migrarea leucocitelor) leucocitelor)

59. Imunizarea artificiala activa. Vaccinurile. Caracteristica imunitatii postvaccinale. Vaccinarea primara si de rapel. Cerintele fata de vaccinuri. Notiuni de vaccinoterapie si vaccinoprofilaxie.Prevenirea maladiilor infecţioase depinde de controlul (sau eliminarea) sursei de infecţie (aceasta prevede întreruperea lanţului de transmitere) şi ridicarea rezistenţei individuale (utilizarea apei potabile, alimentaţie sănătoasă, respectarea igienei personale, etc.). Cea mai eficace strategie – imunizarea artificială.Formele imunizării artificiale:

- Imunizare activă – prin administrarea în organism a unor Ag microbiene (vaccinuri)- Imunizare pasivă – bazată pe întroducerea în organism a unor preparate ce conţin Ac specifici Imunoprofilaxia – o metodă specifică de prevenire colectivă sau individuală a maladiilor infecţioase, ce are la bază crearea imunităţii

artificiale specifice. Imunoterapia – metode specifice de tratament prin intermediul vaccinurilor, serurilor imune, etc.

Vaccinurile sunt produse biologice cu proprietăţi de imunogen, constituite din microorganisme vii sau omorâte, din componentele lor sau din toxine modificate. Fiind administrate la om sau animale induc o imunitate artificială activă – IAA - (umorală, celulară, mixtă) fără să provoace efecte nocive. Imunitatea postvaccinală (IAA) se instaurează relativ lent, la 15-20 zile de la ultima inoculare, şi durează timp variabil (luni-ani-toată viaţa). Vaccinarea primară (de bază) conferă organismului memorie imunologică. Vaccinările de rapel (revaccinarea) se utilizează pentru stimularea unui răspuns imun secundar, mai rapid si mai intens Calităţile unui vaccin ideal: Imunogenitate înaltă; Lipsit de efecte secundare; Uşor disponibil; Stabil ; Ieftin; Simplu la administrare şi eficace (să creeze imunitate stabilă de lungă durată)Eficienţa vaccinării depinde de: Calităţile imunogene ale vaccinului; Durata persistenţei vaccinului în organism; Capacitatea organismului vaccinat de a elabora răspuns imun eficient. Clasificarea vaccinurilor: T R A D I Ţ I O N A L E (clasice) - Corpusculare (vii atenuate, inactivate), Subunitare (vaccinuri chimice, anatoxinele). D E P E R S P E C T I V Ă – Sintetice, Ribosomale, Anti-adezive, Recombinante, Vaccinuri hibride, Vaccinuri nucleotidice.

60. Vaccinurile vii atenuate. Obtinerea, avantajele si dezavantajele vaccinurilor vii. Exemple. Vaccinurile vii atenuate reprezintă tulpini de bacterii sau virusuri vii cu virulenţa redusă, dar cu capacitate imunogenă păstrată.Căile de obţinere: A. Selecţia tulpinilor naturale cu virulenţa redusă - Vaccinul E (contra tifosului exantematic); Vaccinul EV (antipestos); Vaccinul Brucella N19 (antibrucelos). B. Utilizarea mi/o înrudite genetic, avirulente pentru specia umană - (ex.: virusul vacciniei utilizat în profilaxia variolei) C. Atenuarea dirijată a virulenţei prin:

- Factori fizici (cultivarea la t° neadecvate – vaccinul anti-antrax (42° C), vaccinul anti-pestos (16° C)) - Cultivarea în prezenţa unor compuşi chimici nefavorabili (ex.: BCG – obţinut de Calmette şi Guerin prin cultivarea tulpinii de

Mycobacterium bovis timp de 13 ani pe medii cu bilă)- Prin factori biologici – pasaje multiple pe animale sau pe culturi celulare (Pasteur a efectuat 133 pasaje a suspensiei de creier de la câine

turbat intracerebral iepurilor, obţinând un virus atenuat) - Prin inginerie genetica (inactivarea genelor de patogenitate - mutaţii la nivelul genelor de patogenitate) Alte vaccinuri vii atenuate: anti-tularemic, anti-poliomielitic, anti-gripal, anti-rujeolos, anti-rubeolic, anti-parotidită epidemică, etc.Avantajele vaccinurilor vii: Imunogenitate înaltă, o inoculare unică induce imunitate solidă şi de lungă durată; Se administrează pe cale naturală (intranazal, per os, percutan, etc); Induce imunitate locală şi generală Dezavantaje: Pot provoca complicaţii postvaccinale (accidente alergice, efect teratogen); Revenirea la forma virulentă cu riscul bolii infecţioase induse (ex.: poliomielită paralitică, etc); Pericol de inducere a maladiei la persoane cu imunodeficienţe (BCG-ita, etc); Multiple contraindicaţii; Durată de păstrare limitată.

61. Vaccinurile inactivate (omorate). Obtinerea, avantajele si dezavantajele vaccinurilor inactivate. Exemple. Autovaccinul, utilizarea practica.Vaccinurile inactivate (omorâte) constau din culturi bacteriene sau virale înalt virulente inactivate prin căldură (60° C – 1 oră), prin agenţi chimici (formaldehidă, fenol, acetonă), radiaţii, ultrasunet, etc. Exemple de vaccinuri inactivate: anti-tifoidic, anti-dizenteric, anti-choleric, anti-pertusic, anti-stafilococic, anti-gripal, anti-poliomielitic, etc.Autovaccinul este un vaccin inactivat preparat din tulpina microbiană izolată de la un bolnav şi inoculat aceluiaşi bolnav pentru stimularea imunităţii specifice. Autovaccinul este indicat pacienţilor care suferă de procese cronice: stafilodermii, streptodermii, candidoze, dizenterie cronica, etc. Avantajele vaccinurilor inactivate: Exclud riscul infecţiei post-vaccinale; Stabile la păstrare.Dezavantaje: Imunogenitate redusă (sunt necesare inoculări repetate); Durată limitată a imunităţii 6 – 12 luni; Eficacitate variabilă; Necesitatea unei concentraţii mari de Ag; Administrarea prin injecţii (stimulează slab sau deloc imunitatea locală).Obtinere: 1. Se izoleaza din prelevatul d ela bolnav bacteria cu semnificatie clinica

2. Se obtine cultura pura si se identifica bacteria izolata3. Se replica abundant cultura pe geloza nutritive si geloza sange si peste noapte la 37 grade.4. Se extrage cu pipeta Pasteur in solutie salina izotona fara a include impuritatile, Se ajusteaza densitate.

29

Page 30: Microbiologie Exam

5. Se inactiveaza suspensia in baie de apa 60 grade o ora.6. Se controleaza sterilitatea prin replicare in bulion 4 zile 37 grade, apoi se insamanteaza pe placa.7. Se adauga fenol pt conservative. Si se elibereaza strict aseptic cu numele pacientului varsta etc.

62. Vaccinurile subunitare (fragmentate, chimice) si anatoxinele. Obtinerea, avantajele si dezavantajele vaccinurilor subunitare. Notiune de adjuvant. Vaccinurile adsorbite.Vaccinurile subunitare (acelulare, chimice) constau din componente antigenice majore, capabile să inducă un răspuns imun protector, extrase prin diferite metode din celulele bacteriene (digestie enzimatică, hidroliză cu acidul tricloracetic, etc). Ex.: vaccinul anti-pneumococic, anti-meningococic, anti-hemofilus (conţin polizaharide capsulare), etc. Anatoxinele sunt vaccinuri subunitare obţinute din exotoxine bacteriene.Etapele de obţinere a anatoxinelor:

1. Cultivarea tulpinii toxigene în mediu lichid2. Separarea exotoxinei prin filtrare3. Tratarea cu formol 0,3-0,4 % timp de 3-4 săptămâni la 39-40° C. Toxinele pierd toxicitatea, dar îşi păstrează capacitatea imunogenă4. Purificarea anatoxinei (salinizare cu săruri de amoniu, precipitare cu alcool...)5. Concentrarea6. Determinarea puterii anatoxinei în RN (floculare) cu seruri antitoxice specifice7. Anatoxinele se utilizează în profilaxia specifică a infecţiilor cauzate de mi/o toxigene stimulând producerea antitoxinelor.

Exemple de anatoxine: difterică, tetanică, gangrenoasă, botulinică, holerică, stafilococică, etc.Avantajele vaccinurilor subunitare: sunt lipsite de efecte secundare; stabilitate la păstrareDezavantaje: imunogenitate redusă, necesitatea inoculărilor repetate Pentru sporirea imunogenităţii vaccinurilor inactivate şi subunitare se utilizează substanţe speciale - adjuvanţi.

I. Adjuvanţii minerali (hidroxidul de Al, fosfatul de Ca, emulsii uleioase) generează o reacţie inflamatoare care reţine eliminarea Ag şi favorizează prezentarea lui limfocitelor T

II. Adjuvanţii biologici (unele bacterii: Bordetella pertussis, Corynebacterium parvum, Mycobacterium tuberculosis, sau componente bacteriene – ex. ribosomi bacterieni ) induc expresia moleculelor de co-stimulare pe suprafata CPA, stimuland aceste celule sa secrete citokine care vor activa limfocitele T.

Vaccinuri adsorbite (deponente, conjugate) – au Ag fixate pe adjuvanţi (AD, ADT, ADTP, etc)

63. Imunizarea artificiala pasiva, caracteristica. Preparatele biologice cu anticorpi, tipurile, cerintele fata de ele. Imunizarea artificială pasivă se realizează cu preparate biologice ce conţin Ac (seruri imune, Ig, gamma-globuline, etc), utilizate cu scop de seroterapie sau seroprofilaxie. Imunitatea artificială pasivă se instalează imediat după administrarea preparatului, fiind limitată în timp (max. 3 săptămâni). Din momentul în care Ac exogeni sunt eliminaţi, organismul redevine receptiv la infecţie.Serurile imune sunt preparate biologice ce conţin Ac specifici faţă de diferiţi agenţi patogeni şi produse ale acestora.

După provenienţă există:1. Seruri imune omologe - De la convalescenţi; De la voluntari imunizaţi activ (seruri hiperimune, specifice); Din sângele

donatorilor şi sânge placentar (seruri standarde, normale)2. Seruri imune heterologe, obţinute prin hiperimunizarea animalelor (cai, cămile, lame)

- După modul de acţiune se disting:1. Seruri antibacteriene (anti-meningococic, anti-antrax), ridică sensibilitatea bacteriilor la acţiunea fagocitelor şi complementului.

Se dozează în ml (seruri netitrate)2. Seruri antivirale (ex.: ser anti-rabic). Neutralizează infecţiozitatea virusurilor.3.Seruri antitoxice (anti-difteric, anti-tetanic, anti-botulinic, etc). Neutralizează exotoxinele bacteriene (blochează fixarea de

receptorii celulari). Activitatea lor este apreciată prin titrare şi măsurată în UA (UI).4. Seruri mixte (ex.: antigangrenos)

Serurile imune native conţin pe lângă Ig şi alte proteine ale sângelui (albumine) responsabile de reacţii alergice. Serurile imune purificate şi concentrate sunt lipsite de albumine, care sunt eliminate prin procedee speciale (precipitare cu sulfat de amoniu, prin digestie enzimatică, electroforeză)Imunoglobulinele (gamma-globulinele). Se obţin din seruri omologe rafinate prin procedee care extrag numai gamma-globulinele şi realizează o concentraţie a Ig de 15-20 ori faţă de serul nativ. Ig normale sunt extrase din amestecuri de plasmă de la sute-mii de donatori sau sânge placentar. Se utilizează în seroprofilaxia rujeolei, hepatitei A şi în terapia pacienţilor cu deficit umoral primar. Ig hiperimune (specifice) se obţin din seruri de convalescenţi sau ale persoanelor imunizate (Ig anti-antrax, Ig anti-leptospirozică) Cerinţele faţă de preparatele biologice ce conţin Ac: Sterilitate; Inofensivitate; Apirogenitate ; Aviditate înaltă; Activitate de lungă durată.

64. Clasificarea serurilor imune curative dupa provenienta si modul de actiune. Caracteristica lor, avantajele si dezavantajele serurilor omoloage si heteroloage.

65. Utilizarea practica a preparatelor biologice cu anticorpi. Modul de administrare, reactiile adverse si prevenirea lor. Serurile antibacteriene şi antivirale se aplică contra unei serii de boli sub formă de globuline şi imunoglobuline (gama-globuline): contra antraxului, pestei, variolei, rabiei, rujeolei, poliomielitei, hepatitei A, scarlatinei etc. Serurile antitoxice sunt utilizate contra difteriei, botulismului, tetanusului, contra infecţiei anaerobe, antidotul catre veninul de şarpe.Imunoglobulinele din sîngele uman se folosesc în scopuri profilactice contra rujeolei, poliomielitei, tusei convulsive, hepatitei A, parotiditei epidemice, varicelei, scarlatinei, variolei şi altor infecţii.Modul de administrare

- Serurile imune omologe, Ig se administrează în doză unică fără precauţii- Serurile heterologe, administrate parenteral, pot provoca reacţii adverse (reacţii anafilactice, boala serului, febră).

30

Page 31: Microbiologie Exam

Cauza: albuminele se comportă ca un alergenCombaterea reacţiilor serice:

1. Utilizarea serurilor imune purificate şi concentrate2. Utilizarea Ig (gamma-globulinelor)3. Anamneza pentru recunoaşterea unei eventuale stări de sensibilizare

Efectuarea testării pentru depistarea sensibilităţii la serul heterolog. În acest scop se utilizează testul intradermic cu 0,1 ml din diluţia 1:100 a serului prescris. Dacă testul este negativ (peste 20-30 minute reacţie locală până la 9 mm) se întroduce subcutan a doua doză de 0,1-0,5 ml de ser nediluat. Peste 30-60 minute în lipsa reacţiei se recurge la întroducerea întregii doze curative. Dacă testul este pozitiv (reacţie locală peste 10 mm) există pericolul reacţiilor alergice. În acest caz se recurge la metoda de desensibilizare acută, propusă de Besredca. Ea constă în administrarea repetată, la interval de 20 min., a dozelor crescânde din serul respectiv, la început diluat 1:100 subcutan, trecându-se treptat la ser nediluat intramuscular.Mecanismul: la întroducerea dozelor mici de ser se evită acumularea cantităţilor mari de substanţe biologic-active (histamină, serotonină, bradikinină, etc), responsabile de declanşarea anafilaxiei.În caz de necesitate administrarea serului va fi însoţită de administrarea preparatelor anti-histaminice sau serul va fi administrat sub narcoză (scoaterea din funcţie a scoarţei cerebrale).

66. Rectiile antigen (Ag) – anticorp (Ac) in vitro. Caracteristica legaturii Ag-Ac. Fazele interactiunii Ag-Ac. Aplicarea practica a reactiilor serologice. Serurile imune diagnostice, diagnosticurile: obtinerea, aplicarea practica.

Studiul şi aprecierea imunităţii poate fi efectuată prin intermediul diferitor teste realizate Studiul şi aprecierea imunităţii poate fi efectuată prin intermediul diferitor teste realizate in vitroin vitro sau sau in vivo in vivo (reacţii imunologice).(reacţii imunologice).Pentru aprecierea răspunsului imun umoral se studiază interacţiunea dintre Ag şi Ac, iar pentru aprecierea imunităţii celulare se determină Pentru aprecierea răspunsului imun umoral se studiază interacţiunea dintre Ag şi Ac, iar pentru aprecierea imunităţii celulare se determină numărul total de limfocite, subclasele limfocitelor T, se evaluează citokinele, etc. numărul total de limfocite, subclasele limfocitelor T, se evaluează citokinele, etc. REACREACŢŢIIILEILE ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REAC ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REACŢŢIIILEILE SEROLOGI SEROLOGICCE)E)RReaceacţţiiaa Ag-Ac est Ag-Ac estee d determinată de eterminată de interacinteracţţiiuunneaea specifi specificăcă dintre epitop dintre epitopiiii A Antintiggenuluienului şişi paratop paratopiiii A Antinticcorpilororpilor. . În acest proces intervin patruÎn acest proces intervin patru ttiippuriuri de l de legăturiegături: l: legături deegături de h hiidrogen, ldrogen, legăturiegături electrostati electrostaticce, fore, forţţeelele Van der Waals Van der Waals şişi l legăturiegături h hiidrodroffobe.obe.

Legătura Legătura Ag-Ac a Ag-Ac arere tr treei caracteristii caracteristicici: est: estee exotermi exotermicăcă, specifi, specificăcă şişi reversib reversibiillăă..AAfinitfinitatateeaa un unuiui Ac p Ac pentruentru un un Ag specifiAg specificc caracteri caracterizzeeazăază intensitintensitatateeaa for forţţeelorlor de l de legăturăegătură aa complex complexuluiului Ag-Ac. Ag-Ac. E Eaa depinde de depinde de ccomplementaritomplementaritatateeaa steri stericăcă didintre paratop ntre paratop şişi epitop epitop.. AAviditviditatateeaa uunnuiui Ac p Ac pentru un entru un Ag specifiAg specificc reprezint reprezintăă rapiditrapiditatateeaa apari apariţţiieiei manifestării manifestării reacreacţţiieiei Ag-Ac Ag-Ac ((precipitaprecipitarere, aglutina, aglutinare, etc.)re, etc.). E. Eaa dep depiindndee de constantde constantaa d de e asociasociereere, de , de vvalenalenţaţa Ac, d Ac, dee n nuummăărrulul d de e epitopepitopii, de temperatur, de temperaturăă, d, dee pH, de for pH, de forţaţa ioni ionicăcă aa m mediuluiediului..Un paratop se Un paratop se poate poate combina combina cu cu unun singur singur epitop, epitop, numitnumit “specifi “specificc”. ”. AstfelAstfel,, dacă estedacă este c cuunnoscutoscut un unulul d dinin element elementeleele reac reacţţiieiei - Ag - Ag sausau Ac, p Ac, poaoatte e fifi identifi identificatcat celălalt.celălalt. Reacţiile Ac-Ac (reacţiile serologice) au două direcţii de aplicare practică:Reacţiile Ac-Ac (reacţiile serologice) au două direcţii de aplicare practică:SSeroidentificaeroidentificare: re: DDetectetectareaarea şişi do dozzaarreeaa Ag Ag ((element element necunoscutnecunoscut - - tulpin tulpinii microbiene microbiene izolate din diferite prelevate)izolate din diferite prelevate) cu ajutorul cu ajutorul Ac specifiAc specifici ci cunoscuţicunoscuţi.. PoPott fi fi utili utilizatezate d douăouă sur surssee dde e Ac: Ac: Ac monoclonAc monoclonaliali, , absolut absolut omogenomogeni, dar care i, dar care recrecuunnoosscc doar un singurdoar un singur epitop epitop şişi Ac polAc poliiclonclonaliali, , ce se ce se conconţinţin înîn seruri imune (seruri imune (antiseruriantiseruri)), , carecare perm permiit lt legăturiegături de avidit de aviditatatee înaltă înaltă cucu Ag. Ag. Serurile imune se obţinSerurile imune se obţin prinprin injecta injectarearea lla un animal de laborator a un animal de laborator aa antigene antigenelorlor c cununooscscuutete. . După o perioadă deDupă o perioadă de t tiimp, serump, serull animalu animaluluilui va va conconţţiinne anticorpe anticorpii contr contraa aceacesstortor antigene. antigene. Dar natura exactă a Ac din acest ser nu poate fi cunoscută cu exactitate (Ac policlonali)Dar natura exactă a Ac din acest ser nu poate fi cunoscută cu exactitate (Ac policlonali). . SSpecificitpecificitatateeaa seru seruluilui trebuie să fie permanent controlată şi trebuie să fie permanent controlată şi Ac Ac nedoriţi trebuie să fienedoriţi trebuie să fie elimin eliminaţiaţi pr prinin adsor adsorbţbţiiee..SSerodiagnosticerodiagnostic:: DDetectetectareaarea şişi titra titrarreeaa Ac Ac din serul bolnavilor din serul bolnavilor (component necunoscut) faţă de u(component necunoscut) faţă de un Ag specifin Ag specificc c cununooscutscut ( (conţinut în conţinut în diagnosticuridiagnosticuri)).. Unele Unele reacreacţţiiii Ag-Ac se manifest Ag-Ac se manifestăă direct direct şi pot fi şi pot fi observatobservatee de experimentatde experimentatoor: r: dede exempl exempluu precipitaprecipitarearea sasau u aglutinaaglutinarearea complexe complexelorlor Ag-Ac Ag-Ac, , llizaiza unor celule purtătoare de Ag pe membrana lor unor celule purtătoare de Ag pe membrana lor (hemol(hemolizăiză, bacteriol, bacteriolizăiză, etc)., etc).AlteAlte reac reacţţiiii Ag-Ac n Ag-Ac nuu se vi se vizzualiualizzeeazăază “spontan” in vitro. “spontan” in vitro. În acest caz se vaÎn acest caz se va recur recurge lage la nişte nişte artificartificiiii experimenta experimentale, cum ar fi utilizareale, cum ar fi utilizarea Ac Ac “mar“marcaţicaţi”:”:Ac marAc marcaţicaţi cucu un fluorocrom: un fluorocrom: imunofluorescen imunofluorescenţaţa..Ac marAc marcaţicaţi cucu un i un izzotop radioactiv: otop radioactiv: analiza radio-imun analiza radio-imunăă..Ac marAc marcaţicaţi cu ocu o enz enziimmăă:: analiza imunoenz analiza imunoenziimatimaticăcă..INTERACŢIINTERACŢIUNUNEAEA ANTIGEN-ANTICORP ANTIGEN-ANTICORPFaza specificăFaza specifică: are loc interacţiunea dintre Ag şi Ac specific coresp: are loc interacţiunea dintre Ag şi Ac specific corespuunzătornzător. . Este Este un un ffenomen rapid, invienomen rapid, invizzibibiil, comun l, comun pentrupentru to toateate reac reacţţiiileile Ag- Ag-Ac.Ac. Decurge la temperatura de 37 C, în prezenţa unui electrolit (sol. fiziologică). Decurge la temperatura de 37 C, în prezenţa unui electrolit (sol. fiziologică). Faza nespecificăFaza nespecifică,, vivizzibibiillăă a uniunii Ag-Ac, se manifestă prina uniunii Ag-Ac, se manifestă prin precipit precipitararee, , aglutinaaglutinarere, , liză, etcliză, etc - - fenomene determinate de anumite condiţii fenomene determinate de anumite condiţii (valenţa Ac, dimensiunile Ag, etc).(valenţa Ac, dimensiunile Ag, etc).

67. Reactia de aglutinare (RA). Componentele, mecanismul. Reactiile de aglutinare directa (pe lama, in tuburi). Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica.

REACŢIA DE AGLUTINAREREACŢIA DE AGLUTINAREDin latinăDin latină – agglutinatio - încleiere – agglutinatio - încleiereReacţia Ag-Ac se poate manifesta prin Reacţia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinareaglutinare atunci când determinantele antigenice sunt purtate de atunci când determinantele antigenice sunt purtate de particule figurateparticule figurate (Ag insolubile, (Ag insolubile, corpusculare), iar corpusculare), iar AcAc specifici sunt specifici sunt compleţicompleţi (cel puţin bivalenţi). (cel puţin bivalenţi). Aglutinarea este determinată de formarea unei reţele între Ag şi Ac, ce permite apropierea unui număr suficient de particule figurate pentru Aglutinarea este determinată de formarea unei reţele între Ag şi Ac, ce permite apropierea unui număr suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM cu 10 epitopi potenţiali aglutinează mai activ decât Ac IgG. a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM cu 10 epitopi potenţiali aglutinează mai activ decât Ac IgG.

Clasificarea reacţiilor de aglutinareClasificarea reacţiilor de aglutinareAglutinare “Aglutinare “activăactivă” sau “” sau “directădirectă”, în care particula figurată (Ag corpuscular) este el însuşi purtător de determinante antigenice specifice ”, în care particula figurată (Ag corpuscular) este el însuşi purtător de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi, bacterii)(hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi, bacterii)Aglutinare “Aglutinare “pasivăpasivă” sau “” sau “indirectăindirectă”, în care particula serveşte doar de suport pentru un determinant antigenic solubil fixat artificial ”, în care particula serveşte doar de suport pentru un determinant antigenic solubil fixat artificial pepe suprafaţa sa. Frecvent sunt utilizate suprafaţa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport ca suport hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol.hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol.ReactiReactiii d de e aglutinaaglutinarere activ activaa (direct (directaa))Aspect Aspect ccalitatialitativ. v. RReactieactiaa p poateoate fi fi efectuefectuataata pepe lam lamaa de de sticlasticla sau isau in tubn tuburiuri..Reacţia de aglutinare pe lamelă: pe lamela degresată se aplică cu pipeta Pasteur cîteva picături de ser în diluţii mici (1:10 – 1:20) şi o pic de sol izotonică de clorid de natriu pentru control. În fiecare picătură de ser, înclusiv în cea de control se introduce o ansă de cultură vie de

31

Page 32: Microbiologie Exam

microorganisme de 24 ore de pe suprafaţa mediului solid sau se adaugă cu pipeta Pasteur cîte o pic de suspensie de microorganisme omorîte (diagnosticum). Cultura aplicată se amestecă minuţios pentru a obţine o suspensie tulbure omogenă. Reacţia decurge la temperatura camerei. Rezultatul ei se citeşte cu ochiul liber peste 5-10 min, uneori este folosită lupa. Dacă lamele se introduc în camera umedă închisă, pentru a evita uscarea picăturilor rezultatul reacţiei se citeşte şi peste 30-40 min.

La reacţia pozitivă în picătura de ser apar flocoane (mari sau mici), uşor vizibile la clătinarea lamei. La reacţia negativă lichidul rămîne tulbure omogen. Dacă cantitatea de microorganisme este mică şi citirea rezultatului reacţiei este dificilă, picătura de ser cu amestecul de cultură se usucă, preparatul se fixeazăse colorează cu fuxină Pfaiffer si se examinează la microscop. La reacţia pozitivă toate cîmpurile de vedere sunt libere. Aceasta este reacţia de microaglutinare.

Reacţia de aglutinare în tuburi se foloseşte pentru determinarea serogrupului şi serovarului microorganismelor. Toate ingredientele se repartizează succesiv în eprubete. Serul este diluat în proporţiile 1:100, 1:200, 1:400 etc. În fiecare tub cu serul diluat se adaugă 1-2 picături de antigen (suspensie de 1-2mlrd de microorganisme la 1ml), se agită energic şi se incubează în termostat la 37°C-2 ore, apoi se citesc rezultatele prealabile ale reacţiei, începînd cu cele de control(al serului şi antigenului). Absenţa aglutinării în tuburile de control şi prezenţa de flocoane suspendate în tuburile de experienţă se apreciază ca reacţie pozitivă. Tuburile se menţin la temperatura camerei 18-20 de ore şi după aceea se constată rezultatul definitiv al reacţiei. Intensitatea reacţiei se exprimă prin semne de plus. La aglutinarea completă (++++) lichidul este absolut transparent, iar la fundul tubului se depune sediment din flocoane de microorganisme aglutinate. Cu cît mai puţine microorganisme sînt aglutinate, cu atît este mai tulbure lichidul şi cu atît mai puţin sediment floconos se înregistrează la fundul eprubetei (+++, ++, +). La reacţia negativă (-) sedimentul lipseşte, suspensia rămîne uniform tulbure şi după aspect nu diferă de conţinutul de control al antigenului. RA se utilizează pentru diagnosticul serologic al bolilor infecţioase – febrelor tifo-paratifoide (reacţia Widal), brucelozei (reacţia Wright, Huddleson), tularemiei şi altor boli.

ApreciereaAprecierea: cea mai mare dilutie a serului in care se manifesta aglutinare de cel putin : cea mai mare dilutie a serului in care se manifesta aglutinare de cel putin 3 “+” (+++)3 “+” (+++) se numeste se numeste titrul titrul aanticorpilor aglutinantinticorpilor aglutinanti (titrul serului aglutinant)(titrul serului aglutinant)..AAglutinaglutinarearea direct directaa est estee utili utilizatazata p pententrruu determin determinaarreaea grupe grupelorlor sang sangvvininee sasau u inin diagnostic diagnosticulul unorunor maladi maladiii infecti infectioaoase (seroidentificarea Ag se (seroidentificarea Ag sau depistarea şi titrarea Ac din serul bolnavilor) .sau depistarea şi titrarea Ac din serul bolnavilor) .ReactiReactilele d de e aglutinaaglutinarere pasiv pasivaa (indirect (indirectaa))AAglutinaglutinarearea pasiv pasivaa const constaa inin fix fixaarreaea un unuiui Ag solub Ag solubiil (l (sasau u alal unui unui Ac) Ac) pepe un suport un suport corpuscularcorpuscular inert inert, care nu , care nu intervinterviinnee inin reacti reactiaa Ag-Ac. Ag-Ac. In In calitate de suport inert pot servi hematiile, particule calitate de suport inert pot servi hematiile, particule de latex, de latex, ccristaristalele de colesterol. de colesterol. SSuspensiuspensiaa de particule de particule sensibilizate cu Ag sau Ac sensibilizate cu Ag sau Ac estestee pusa inpusa in contact contact ccu seruu serull imun ( imun (respectivrespectiv cucu Ag), Ag), ca si in cazul aglutinarii directe. ca si in cazul aglutinarii directe.

Avantajele Avantajele reactireactiilorilor indirecte indirecte:: facilit facilitatateeaa lectur lecturiiii sisi sensibilit sensibilitatateea inaltaa inalta. . RReactieactiaa d de e hemaglutinahemaglutinarere indirect indirectaa ((pasivpasivaa) – RHAI / RHAP. Unele ) – RHAI / RHAP. Unele antigeneantigene de origine polizaharidica de origine polizaharidica se fixe se fixeazaaza pra pracctiticc spontanspontan, , dupadupa oo sscurtcurtaa incubati incubatiee, , pe suprafatape suprafata hemati hematiilor. Ailor. Antigenentigenelele protei proteicece se fixe se fixeazaaza doar dupadoar dupa oo pre preggatiatirere prealab prealabiillaa aa hemati hematiilorilor ( (de ex.: tratarea cu de ex.: tratarea cu tanitaninana, formol). , formol). RHAIRHAI se efectuează se efectuează in godeurile in godeurile uneuneii pla placi din polistirenci din polistiren. . RReactieactiaa po pozzitivitivaa se se manifestamanifesta pr prinin aglutina aglutinarearea eritrocitelor eritrocitelor sensibilizate sensibilizate (umbrela inversata de culoare bruna(umbrela inversata de culoare bruna la fundul godeurilor la fundul godeurilor)). . În reacţia de latex-aglutinare Ac sau Ag sunt fixaţi pe particule de latex. Reacţia se efectuează pe lama de sticlă. În reacţia de latex-aglutinare Ac sau Ag sunt fixaţi pe particule de latex. Reacţia se efectuează pe lama de sticlă. Reacţia de latex-aglutinareReacţia de latex-aglutinare este utili este utilizatazata iin identificarea factn identificarea factoorrulului rui reeumatoid umatoid lala bolnavibolnavi suspect suspectii de pol de poliiartritartritaa r reeumatoidumatoidaa, , iin bacteriologien bacteriologie ppentruentru identificarea rapidă a mi/o sau Ag lor în prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor identificarea rapidă a mi/o sau Ag lor în prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor infecţii.infecţii.Reacţia de Co-aglutinareReacţia de Co-aglutinare. La baza acestei reacţii se află proprietatea unei bacterii – . La baza acestei reacţii se află proprietatea unei bacterii – Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus (tulpina (tulpina CowanCowan) - ce are în ) - ce are în componenţa peretelui celular proteina Acomponenţa peretelui celular proteina A - - să fixeze Ig G prin intermediul fragmentului Fc. Astfel se formează diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul să fixeze Ig G prin intermediul fragmentului Fc. Astfel se formează diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi identificare Ag respective necunoscute. Reacţia se efectuează pe lamă.carora pot fi identificare Ag respective necunoscute. Reacţia se efectuează pe lamă.REACŢIA COOMBS. REACŢIA COOMBS. Unii Ac (monovalenţi) nu sunt aglutinanţi în condiţii normaleUnii Ac (monovalenţi) nu sunt aglutinanţi în condiţii normale, fiind monovalenti , fiind monovalenti (ex.: anticorpii anti-Rh, responsabili de (ex.: anticorpii anti-Rh, responsabili de incompatibilitatea materno-fetală în sistemul Rh). Ei pot fi depistaţi graţie testelor Coombs. Sunt posibile 2 tehnici, în funcţie de prelevat: incompatibilitatea materno-fetală în sistemul Rh). Ei pot fi depistaţi graţie testelor Coombs. Sunt posibile 2 tehnici, în funcţie de prelevat: sânge de la nou-născut sau de la femeia gravidă.sânge de la nou-născut sau de la femeia gravidă.Tehnica Coombs directă.Tehnica Coombs directă. La un nou-născut se caută prezenţa Ac materni anti-Rh fixaţi pe hematii, dacă mama este Rh-. La aceste hematii La un nou-născut se caută prezenţa Ac materni anti-Rh fixaţi pe hematii, dacă mama este Rh-. La aceste hematii suspecte se adasuspecte se adauugă un ser anti-Ig umană. Acest ser nu aglutinează hematiile normale, din contra, el provoacă aglutinarea hematiilor pe care gă un ser anti-Ig umană. Acest ser nu aglutinează hematiile normale, din contra, el provoacă aglutinarea hematiilor pe care sunt fixaţi Ac anti-Rh.sunt fixaţi Ac anti-Rh.Tehnica Coombs indirectă. Tehnica Coombs indirectă. La o femeie gravidă Rh- Ac anti-Rh sunt prezenţi în ser. Iniţial la acest ser se agaLa o femeie gravidă Rh- Ac anti-Rh sunt prezenţi în ser. Iniţial la acest ser se agauugă hematii Rh+ (pentru gă hematii Rh+ (pentru formarea complexului Ag-Ac), apoi se aplică serul anti-Ig.formarea complexului Ag-Ac), apoi se aplică serul anti-Ig.

68. Reactia de hemaglutinare indirecta (RHAI) cu scop de seroidentificare. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor RHAI. Aplicarea practica.

Uneori Ag folosite în reacţia de aglutinare sunt atît de microdispersate că complexul aglutinogen-aglutinină nu se observă cu ochiul liber. Pentru ca această reacţie să poată fi văzută s-au propus diferite căi de absorbire a acestor Ag pe particule mai mari cu aglutinarea lor ulterioară cu Ac specifici. Ca adsorbanţi se folosesc diferite specii de bacterii, corpuscule de talc, dermatol, colodii, coalină, carmină, latex ş.a. Această reacţie a căpătat denumirea de reacţie de aglutinare indirectă sau pozitivă. O capacitate mai pronunţată de adsorbţie au eritrocitele. Reacţia în care se folosesc eritrocitele se numeşte hemaglutinare indirectă sau pasivă (RHAI sau RHAP). Pentru efectuarea RHAI se folosesc eritrocite de berbec, cal, iepure, găină, şoarece, om ş.a. care în prealabil sunt prelucrate cu formalină sau glutaraldehidă. Capacitatea de adsorbţie a eritrocitelor creşte la prelucrarea lor cu soluţie de tanină sau clorid de crom.

În RHAI ca antigene pot servi Ag polizaharidice, extractele vaccinurilor bacteriene, Ag virusurilor şi rickettsiilor şi alte substanţe de natură proteică.

Eritrocitele sensibilizate cu antigene se numesc diagnosticumuri eritrocitare. Pentru prepararea diagnosticumurilor eritrocitare se folosesc frecvent eritrocite de berbec, care au o capacitate mare de adsorbţie.

RHAI se efectuează mai uşor în micropanourile aparatului Tacaci, folosind pentru diluţia materialului microtitratorul. Serurile de examinat se încălzesc 30min la temperatura de 56°C, pentru a înlătura hemaglutininele nespecifice, se prepară diluţii duble în serie în soluţie stabilizantă şi cîte o picătură de suspensie de 1% de eritrocite sensibilizate, în rîndul 2 – aceeaşi cantitate de eritrocite de control. Plăcile se agită minuţios şi se introduc în termostat pentru 30-40 min la temperatura 37°C.

Rezultatele reacţiei se citesc după prezenţa hemaglutinării. Ea este pozitivă (umbrelă inversată de culoare brună la fundul godeurilor) în cazul, că titrul de hemaglutinare cu eritrocite de experienţă predomină cel puţin de 4 ori faţă de titrul cu eritrocitele de control. E obligatoriu controlul cu eritrocitele sensibilizate pentru excluderea aglutinării spontane.(conform compendiului)

Conform la cartea mică neagră(Cerkes):

32

Page 33: Microbiologie Exam

„ Metodica: serul cercetat se încălzeşte 30 min la t 56°C, se diluează consecutiv în coraport de 1:10 – 1:1280 şi se toarnă cîte 0,25ml în eprubete sau alveole, unde apoi se adaugă cîte 2 picături de diagnosticum eritrocitar. În calitate de control servesc: suspensia de diagnosticum eritrocitar cu ser imun; suspensia de diagnosticum cu ser normal; suspensia de eritrocite normale cu serul cercetat. În primul control urmează să aibă loc aglutinarea, iar în controalele doi şi trei aglutinarea va lipsi.

Cu ajutorul la RHAI poate fi determinat Ag necunoscut, dacă pe suprafaţa eritrocitelor vom adsorbi anticorpii deja cunoscuţi.Reacţia de hemaglutinare poate fi efectuată şi în volume mai mici – 0.025ml – (micrometoda), folosind microtitratorul Tcaci.”

69. Reactia de hemaglutinare indirecta (RHAI) cu scop de seroidiagnostic. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor RHAI. Aplicarea practica.Acelaş principiu ca şi mai sus doar că se determină Ac necunoscut, iar pe suprafaţa eritrocitelor se adsorb Ag deja cunoscuţi.

70. Reactiile de aglutinare pasiva (indirecta). Reactiile de latexaglutinare si de co-aglutinare. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica.Reacţia în care se folosesc eritrocitele se numeşte hemaglutinare indirectă sau pasivă (RHAI sau RHAP). Reacţia de latex-aglutinare este utilizata in identificarea factorului reumatoid la bolnavi suspecti de poliartrita reumatoida, in bacteriologie pentru identificarea rapidă a mi/o sau Ag lor în prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor infecţii.Reacţia de Co-aglutinare. La baza acestei reacţii se află proprietatea unei bacterii – Staphylococcus aureus (tulpina Cowan) - ce are în componenţa peretelui celular proteina A - să fixeze Ig G prin intermediul fragmentului Fc. Astfel se formează diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi identificare Ag respective necunoscute. Reacţia se efectuează pe lamă.

71. Reactia Coombs. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica. Unii Ac (monovalenţi) nu sunt aglutinaţi în condiţii normale, fiind monovalenţi (ex. Ac anti-Rh, responsabili de incompatibilitatea materno+fetală în sistemul Rh). Ei pot fi depistaţi graţie testelor Coombs. sunt posibile 2 tehnici, în funcţie de prelevat: sînge de la nou-născut sau de la femeia gravidă.Tehnica Coombs directă: la un nou-născut se caută prezenţa Ac materni anti-Rh fixaţi pe hematii, dacă mama este Rh- . La aceste hematii suspecte se adaugă un ser anti-Ig umană. Acest ser nu aglutinează hematiile normale, din contra, el provoacă aglutinarea hematiilor pe care sunt fixaţi Ac anti-Rh. Tehnica Coombs indirectă: la o femeie gravidă Rh- Ac anti-Rh sunt prezenţi în ser. Iniţial la acest ser se adaugă hematii Rh+ (ptr formarea complexului Ag-Ac), apoi se aplică serul anti-Ig.Demonstrarea prezentei de imunoglobuline sau a complementului pe suprafata hematiilor sustine diagnosticul de distructie eritrocitara mediata imun. Exista doua clase majore de anticorpi care reactioneaza cu eritrocitele. Anticorpii completi sau salini aglutineaza eritrocitele suspendate in solutie salina; acestia sunt de obicei de tip IgM (cel mai bun exemplu de aglutinare salina la temperatura camerei este cea utilizata in grupajul ABO). In vivo anticorpii IgM fixeaza complementul si produc hemoliza imediata intravasculara. Anticorpii care nu reactioneaza vizibil in mediu salin si produc reactii de aglutinare numai prin utilizarea de tehnici speciale sunt numiti aglutinine incomplete si sunt de obicei de tip IgG (cel mai bun exemplu sunt anticorpii anti-Rh, care, daca sunt prezenti in serul primitorului de sange incompatibil, produc o reactie hemolitica transfuzionala intarziata, extravasculara).Pentru a certifica faptul ca hematiile unui pacient sunt invelite (sensibilizate) cu imunoglobuline, complement sau ambele, se adauga la o suspensie de eritrocite provenite de la pacient antiser cu reactivitate fata de moleculele de Ig si/sau complement umane, care va determina aglutinarea acestora. Initial testarea se face cu antiseruri polispecifice, care contin anti-IgG, anti-C3d si ocazional si activitate anti-lant usor. Reactivii monospecifici diferentiaza in continuare intre IgG, C3d, existand si seruri monospecifice pentru C3b, C4b, C4d si lantul greu al IgG. Antiseruri specifice pentru IgM sau IgA sunt rar utilizate, deoarece IgM nu mai sunt gasite de obicei inca atasate pe suprafata celulara, iar IgA sunt foarte rar intalnite pe suprafata eritrocitelor.Utilizand sange recoltat pe EDTA sau pe citrat activarea in vitro a complementului de catre autoanticorpii la rece benigni este inhibata. Spalarea eritrocitelor indeparteaza globulinele solubile sau atasate nespecific, ceea ce permite detectia imunoglobulinelor si factorilor complementului specific legate de eritrocite in vivo. Se foloseste metoda de hemaglutinare pe lama. Specimen recoltat - sange venos. Stabilitate proba - testul se efectueaza imediat, daca acest lucru nu este posibil, proba se pastreaza 48 ore la 2-8o C. Prelucrare necesara dupa recoltare - o parte din eritrocite se spala de trei-patru ori cu solutie salina normala, urmata de prepararea unei suspensii eritrocitare in ser fiziologic steril 5 %.

72. Reactiile de precipitare. Mecanismul. Conditiile formarii retelei de precipitare. Reactia de precipitere inelara. Componentele. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica. Reacţie de precipitare (R.P.) se numeşte sedimentarea antigenului (pretipitinogenului) din soluţie la acţiunea serului imun (precipitinei) şi a electrolitului asupra lui. Cu ajutorul reacţiei de precipitare antigenul poate fi evidenţiat în aşa cantităţi minime, care nu se determină pe cale chimică.In reacţia de precipitare se folosesc antigene lichide şi transparente, care prezintă corpuscule ultramicroscopice ale soluţiei coloidale de proteină, polizaharide etc.În calitate de antigene se folosesc extracte din celulele microbiene, organe şi ţesuturi, produsele dezintegrării celulelor rnicrobiene - lizate, filtrate ş. a. Rezistenţa precipitinogenelor la temperaturi înalte se foloseşte la obţinerea antigenelor din agenţii cauzali ai antraxului, pestei ş. a. (metoda de fierbere). Serurile precipitante se pregătesc centralizat prin hiperimunizarea animalelor (iepurilor) cu suspensie de bacterii, filtrat al culturilor bulionice, autolizate, extracte saline ale microorganismelor, proteine serice etc.Titrul serului precipitant, spre deosebire de titrul altor seruri diagnostice, se determină prin diluţia maximă a antigenului care se precipită cu serul dat. Aceasta se explică prin faptul, că antigenul care participă în R.P. are dimensiune ultramicroscopică şi se conţine într-o unitate de volum în cantităţi mai mari decît anticorpi în acelaşi volum de ser. Serurile precipitante se elaborează cu titru nu mai mic de 1:100000.Metodica. Intr-o eprubetă îngustă (d. 0,5 cm) se toarnă 0,3-0,5 ml de ser precipitant nediluat. Cu pipeta Pasteur antigenul lent se prelinge pe peretele eprubetei (în poziţie înclinată) în acelaşi volum. Apoi evitind amestecul lichidelor, eprubeta se aranjează vertical. La suprapunerea corectă a antigenului pe ser se observă clar hotarul dintre cele două straturi de lichide. R.P. este însoţită obligatoriu de controlurile serului şi ale antigenului. Rezultatele reacţiei se citesc, în dependenţa de tipul antigenului şi anticorpilor, peste 5-10 min, 1-2 ore sau 20-24 ore. în cazul reacţiei pozitive în tubul de experienţă la hotarul serului şi al extractului de examinat apare un precipitat sub formă de inel de culoare albă.Reacţia de precipitate se foloseşte pe larg în practica de laborator pentru diagnosticul bolilor infecţioase bacteriene (antrax, pestă, tularmie ş. a.) şi de natură virotică (variolă, infecţia respiratorie acută ş. a.),In medicina judiciară R.P. se foloseşte pentru determinarea apartenenţei de specie a proteinei (pete de sînge, spermă etc.).Cu ajutorul R.P. se va determina atît specificitatea de specie, cît şi de grup a proteinei. Prin intermediul ei s-a determinat, de exemplu, gradul de înrudire a diverselor specii de animale şi plante.

33

Page 34: Microbiologie Exam

Aplicarea R.F. în controlul sanitaro-igienic al produselor alimentare permite de a depista falsificarea fabricatelor de carne, peşte, făinoase, adaosurile îa lapte ş. a.Dezavantaje ale R.P. sînt instabilitatea precipitatului (inelar), care dispare ia o agitare uşoară, precum şi imposibilitatea de a evidenţia cantitatea diferitor antigene ce iau parte la formarea precipitatului. Aceste neajunsuri nu le are reacţia de precipitare în gel.Reacţia de precipitare inelară. In eprubeta de precipitare, cu ajutorul pipetei Pasteur, se toarnă 0,2—0,3 ml (5— 6 picături) de ser (serul nu trebuie să nimerească pe peretele eprubetei). Pe peretele eprubetei, în ser, foarte atent, cu ajutorul pipetei subţiri Pasteur, se adaugă acelaşi volum de antigen. In acest timp eprubeta se ţine în poziţie înclinată. La stratificarea corectă între ser şi antigen se distinge o limită clară. Atent, pentru a evita amestecarea straturilor, eprubeta se trece în stativ, în caz de reacţie pozitivă, la hotarul dintre antigen şi anticorp se formează un inel tulbure, care reprezintă precipitatul Reacţia este însoţită de un şir de controale.Un rol deosebit de important aparţine consecutivităţii introducerii ingredienţilor reacţiei în eprubeta. Nu se admite stratificarea serului pe suprafaţa antigenului (în control — pe soluţia izotonică), deoarece densitatea serului este mai mare decît cea a antigenului şi el se va aşeza la fundul eprubetei, iar hotarul dintre antigen şi anticorp nu se for-ează. Evidenţa rezultatelor se efectuează peste 5—30 min, iar în unele cazuri peste o oră, întotdeauna începînd cu controlul. «Inelul» din eprubeta a doua inidică capacitatea serului imun de a intra în reacţia specifică cu antigenul corespunzător, în eprubetele nr. 3—5 nu trebuie să apară «inele» de precipitare, deoarece lipsesc anticorpii şi antigenii omologi. Prezenţa «inelului» în eprubeta nr. l indică rezultatul pozitiv al reacţiei şi faptul că antigenul cercetat corespunde serului imun folosit în reacţie. Lipsa «inelului» («inelul» e prezent doar în eprubeta nr. 2) indică necorespunderea antigenului cu anticorpul, deci a fost obţinut rezultatul negativ al reacţiei.73. Reactiile de precipitare in gel. Clasificarea. Reactia de imunodifuzie dubla (tehnicile Elek, Ouchterlony). Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica.Ag şi Ac difuzează unul spre altul prin geloză ţi în zona de concentraţie optimă a acestora două reactive se produce precipitarea sub formă de linii albe-cenuşii. Dacă există mai multe sisteme Ag-Ac, se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizat în analiza calitativă a unui amestec de Ag într-o soluţie.componentele: gelul agaros, Ag, Ac. ptr control se folosesc test-sistemul compus din Ac şi Ag cunoscute omoloage.Clasificare: imunodifuzia radială simplă (tehnica Mancini); imunodifuzia dublă radială (tehnica Ouchterlony); test Eleck; imunoelectroforeza; contraimunoelectroforezaimunodifuzia dublă radială (Tehnica Ouchterlony ). Ag şi Ac difuzază radial di godeuri practicate la distanţă convenabilă în statul de gel.După cca 24 ore de incubare, în zona dintre godeuri, unde reactivii corespondenţi în difuziune au realizat proporţii echivalente, apare o linie de precipitare. Tehnica Ouchterlony este utilizate ptr caracterizarea Ag în amestec. testul Eleck: se poate demonstra toxigeneza bacilului difteric. Într-o placă Petri cu mediu de cultură adecvat se aplică în lungul diametrului o bandă din hîrtie de filtru cu antitoxina difterică. Perpendicular pe direcţia benzii de hîrtie se însămânţează, în striu, tulpina de cercetat şi cîte o tulpină toxigenă şi netoxigenă de bacilul difteric (respectiv martorul pozitiv şi cel negativ). Plăcile se încurbează la 37C. După 24 şi 48 ore se urmăreşte apariţia în unghiul dintre striul de cultură şi depozitul de antitoxină a unei linii de precipitare, care continuă de precipitare toxină-antitoxină a martorului pozitiv.Aplicare practică: 1)ptr diagnosticul bolilor, cauzate de virusuri, rickettsi şi bacterii ce elimină exotoxine. 2)ptr determinarea toxigenezei corinebacteriilor difterice. PRECIPITAREA ÎN MEDIU SOLID (ÎN GEL)PRECIPITAREA ÎN MEDIU SOLID (ÎN GEL)În aceste reacţii Ag şi Ac difuzează unul spre altul prin geloză şi în zona de concentraţie optimă a acestor două reactive se produce precipitarea În aceste reacţii Ag şi Ac difuzează unul spre altul prin geloză şi în zona de concentraţie optimă a acestor două reactive se produce precipitarea sub formă de linii albe-cenuşii. Dacă există mai multe sisteme Ag-Acsub formă de linii albe-cenuşii. Dacă există mai multe sisteme Ag-Ac,, se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizată în analiza se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizată în analiza calitativă a unui calitativă a unui amestecamestec de Ag într-o soluţie. de Ag într-o soluţie. Imunodifuzia simplă radială (tehnica Mancini)Imunodifuzia simplă radială (tehnica Mancini)Se efectuează pe o placă acoperită cu geloză, în care sunt încorporaţi Ac specifici. Ag este depus în godeurile din stratul de geloză. Ag difuzează Se efectuează pe o placă acoperită cu geloză, în care sunt încorporaţi Ac specifici. Ag este depus în godeurile din stratul de geloză. Ag difuzează radial în geloză pe parcursul a 48 ore. Dacă Ag corespunde Ac, atunci are loc formarea de discuri de precipitare, cu suprafaţa proporţională radial în geloză pe parcursul a 48 ore. Dacă Ag corespunde Ac, atunci are loc formarea de discuri de precipitare, cu suprafaţa proporţională concentraţiei Ag din godeu. Se utilizeză pentru depistarea şi cuantificarea Ig, hormonilor, enzimelor, etc.concentraţiei Ag din godeu. Se utilizeză pentru depistarea şi cuantificarea Ig, hormonilor, enzimelor, etc.Imunodifuzie dublă (tehnicile Ouchterlony şi Elek)Imunodifuzie dublă (tehnicile Ouchterlony şi Elek)Se acoperă cu geloză o placă de sticlă sau se toarnă geloza în cutia Petri. Se acoperă cu geloză o placă de sticlă sau se toarnă geloza în cutia Petri. În tehnica Ouchterlony Ag şi Ac difuzează din godeurile situate la o distanţă de 15 mm unul de altul. În tehnica Ouchterlony Ag şi Ac difuzează din godeurile situate la o distanţă de 15 mm unul de altul. În tehnica Elek cele 2 reactive difuzează din benzile de hârtie plasate pe suprafaţa gelozei. În tehnica Elek cele 2 reactive difuzează din benzile de hârtie plasate pe suprafaţa gelozei. Moleculele difuzează în gel în funcţie de greutatea lor şi formează Moleculele difuzează în gel în funcţie de greutatea lor şi formează linii de precipitarelinii de precipitare pentru fiecare sistem Ag-Ac ce corespund în zona lor de pentru fiecare sistem Ag-Ac ce corespund în zona lor de echivalenţă. Dacă două Ag sunt identice, liniile lor se unesc, dacă sunt diferite – se intersectează. echivalenţă. Dacă două Ag sunt identice, liniile lor se unesc, dacă sunt diferite – se intersectează. UtilizareaUtilizarea – determinarea toxinelor (toxigeneza), – determinarea toxinelor (toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice antitoxinelor, Ag proteice Contraimunoelectroforeza (CIEF)Contraimunoelectroforeza (CIEF)Este utilă la examinarea amestecurilor antigenice complexe. Este utilă la examinarea amestecurilor antigenice complexe. Lectura este posibila peste 90 minute.Lectura este posibila peste 90 minute.Geloza este turnată pe o placă de sticlă, Ag şi Ac sunt dispuşi în rezervoare circulare de 2 mm diametru, la o distanţă de 10 mm. În timpul Geloza este turnată pe o placă de sticlă, Ag şi Ac sunt dispuşi în rezervoare circulare de 2 mm diametru, la o distanţă de 10 mm. În timpul electroforezeielectroforezei Ag, încărcat negativ, migrează spre polul pozitiv, întâlnind Ac care migrează spre catod. Ag, încărcat negativ, migrează spre polul pozitiv, întâlnind Ac care migrează spre catod. LLa interacţiunea Ag şi Ac omologi are loc a interacţiunea Ag şi Ac omologi are loc formarea liniei de precipitare. CIEF serveşte la examinarea componentelor Ag din lichide biologice: LCR, urină, lichid pleural, ascită, etc.formarea liniei de precipitare. CIEF serveşte la examinarea componentelor Ag din lichide biologice: LCR, urină, lichid pleural, ascită, etc.

74. Reactia de fixare a complementului (RFC) cu scop de seroidiagnostic. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.RFC se bazează pe fenomenul , conform căruia complexul specific dintre Ag şi Ac întotdeauna leagă complementul.RFC cu scop de serodiagnostic prevede identificarea Ac cu ajutorul Ag.componentele: ptr sistemul de bază: antigen (de regulă lizat), extract, haptenă, mai rar suspensia de microorganisme, anticorp: serul bolnavului, complement: serul cobaiului. ptr sistemul hemolitic: antigen: eritrocite de berbec; anticorp: hemolizina faţă de eritrocitele berbecului; soluţie izotonică.Pregătirea ingredienţelor: 1. Serul (bolnavului sau diagnostic) în ajunul efectuării reacţiei se încălzeşte în baie de apă ia temperatura de 56°C (30 min) pentru inactivarea propriului complement.Unele seruri, mai ales de ia animalele imunizate, posedă capacitatea anticomplementară, adică suit capabile de a fixa complementul în lipsa antigenului omolog. Activitatea anticomplementară a serurilor se lichidează prin prelucrare cu bioxid de carbon, prin încălzire la 57-58'C, congelare la -20°C sau -70°C şi înlăturarea sedimentului prin centrifugare, prin adaos în ser a complementului în raport 1:10 şi încălzirea acestuia după 18-20 ore de păstrare la rece. Pentru a preveni activitatea anticomplementară a serurilor, ele se păstrează în stare liofilizată sau congelată la temperaturi joase.2. Ca antigen pentru R.F.C. pot fi diferite culturi <ie microorganisme omorîte, lizatele lor, componentele bacteriene, ale organelor modificate patologic şi normale, lipidelor tisulare, virusurile şi materialul ce conţine virusuri. Multe antigene microbiene se obţin centralizat,Acţiunea anticomplementară a antigenelor este atenuată prin aşa metode ca: termoliza (congelare şi decongelare multiplă), tratarea cu substanţe care dizolvă grăsimile (eter, cloroform, acetonă), alcooli (metanol, etanol ş. a.).

34

Page 35: Microbiologie Exam

3. In calitate de complement se utilizează serul cobailor, proaspăt recoltat, precum şi complementul liofilizat. Pentru căpătarea soluţiei de bază şi titrarea ulterioara complementul se diluează 1:10 cu soluţie izotonică de NaCl.4. Eritrocitele de berbec se folosesc în suspensie da 3% în soluţie izotonică de NaCl. Sîngele (100-150 ml) recoltat din vena jugulară se introduce în borcan steril cu perle de sticlă, se defibrinează prin agitare timp de 10-15 min şi se filtrează prin 3-4 straturi de tifon steril pentru a înlătura fibrina. Eritrotitele se spală de 3 ori cu soluţie izotonică de NaCl, adăugând-o la sedimentul eritrocitelor pînă la volumul iniţial de strige. Eritocitele pot fi păstrate 4-6 zile la temperatura de 5-6°C, Timpul de păstrare se măreşte la conservarea lor cu formalină (0,1 rol de formălină nediluată la 80 ml de sînge defibrinat) sau prin alte metode.5. Serul hemolitic se obţine: Iepurii se imunizează prin vena auriculară cu suspensie (prealabil spălate) de eritrocite de berbec (cîte 1 ml 4-6 ori peste o zi). Peste 7 zile de la ultima injectare se obţine ser de probă. Dacă titrul este nu mai mic de 1:1200, se recurge la sîngerare. Serul se încălzeşte 30 min la temperatura de 56°C. Pentru a preveni contaminarea bacteriană în serul hemolitic se include conservării (mertiolat 1:10000 sau 1% de acid boric).6. Sistemul hemolitic constă din amestec de volume egale ale serului nemobilic (în titru întreit) şi 3% de eritrocite de berbec. Sensibilizarea eritrocitelor cu hemolizine are loc la incubarea amestecului în termostat la temperatura de 37°C, 30 min.De asemenea se efectuează titrarea componentelor:Titrarea serului hemolitic. Serul este titrat prin amestec 0,5 ml (în diluţiile 1:600, 1:1200, 1:1600, 1:3200 ş, a.) cu 0,5 ml de 3% suspensie de eritrocite şi 0,5 ml de complement proaspăt în diluţia 1:10. Volumul amestecului pentru reacţie în tuburile de control se aduce la 1,5 ml, adăugind 0,5 ml de soluţie izotonică de NaCl. Rezultatele reacţiei se citesc peste l oră de incubare la. temperatura de 37°C. Titrul serului hemolitic este apreciat prin diluţia maximă a lui, care manifestă o hemoliză deplină. Serul se păstrează în stare liofilizată.Titrarea complementului. Anterior de efectuarea experienţei de bază soluţia iniţială a complementului (1:10) este repartizată în tuburi de la 0,05 ml pînă la 0,5 ml şi în fiecare tub volumul se completează cu soluţie izotonică NaCl pînă la 1,5 ml. Eprubetele se includ în termostat la temperatura 37°C pentru 45 min, apoi în tuburi se adaugă sistemul hemolitic şi din nou se menţine în termostat 30 min, după ce se apreciază titrul complementului. Titrul complementului reprezintă cea mai mică cantitate a acestuia, la adăugarea căreia în sistemul hemolititc, se înregistrează hemoliza completă în decurs de 1 oră, la 37C. In reacţie se foloseşte doza de lucru a complementului, care se ia următoarea mai mare după titru deoarece în experienţă activitatea complementului poate săs cadă pe contul adsorbţiei nespecifice a acestuia de către alţi componenţi ai reacţiei.Titrarea antigenului. Pentru determinarea titrului antigenului se repartizează în tuburi în cantităţi descrescînde de la 0,5 la 0,05 ml aducînd volumul în ele la 1 ml prin adaosul soluţiei izotonice de NaCl. Apoi, în fiecare tub se adaugă 0,5 ml complement în doză de lucru şi se menţine în termostat l oră la temperatura de 37°C. Ulterior în toate tuburile se adaugă cîte l ml de sistem hemolitic, din nou se încubează 1 oră în termostat şi se citesc rezultatele reacţiei Titrul antigenului se determină prin cantitatea lui minimă, în prezenţa căreia are loc hemoliza deplină, în R.F.C. antigenul se foloseşte în doză de lucru, ce constituie 1/2 - 1/3 din titrul lui.Efectuarea experienţei de bază a R.F.C. Volumul total al ingredientelor reacţiei este de 2,5 ml, iar volumul dozei de lucru a fiecărui din ele - 0,5 ml. În tubul l se introduce serul în diluţia respectivă, antigenul si complementul, în tubul 2 - serul în diluţia respectivă, complementul si soluţie izotonică de NaCl (controlul serului), în tubul 3 - antigen, complement şi soluţie izotonică de clorid de natriu (controlul antigenuîui). Concomitent se prepară sistemul hemolitic, amestecând 2 ml de ser hemolitic în titru întreit (în comparaţie cu cel indicat pe etichetă) si 3% suspensie eritrocite de berbec (referitor la volumul iniţial al sîngelui). Tuburile se păstrează în terrnostat la temperatura 37°C (l oră), apoi în primele 3 tuburi (sistemul întîi), se adaugă cîte l ml de sistem hemolitic (sistemul doi). După o agitare minuţioasă a ingredientelor tuburile din nou sînt incubate în termostat (l oră) la temperatura de 37°C. Rezultatele reacţiei se citesc în prealabil după scoaterea tuburilor din termostat şi definitiv - după o menţinere timp de 15-18 ore în frigider sau la temperatura camerei.Lectura: intensitatea reacţiei se exprimă în plusuri: (++++) - reacţie evident pozitivă, se caracterizează prin reţinerea completă a hemolizei (lichidul în tub e incolor, toate eritrocitele se depun la fund); (+++, ++) - reacţie pozitivă,' se manifestă prin coloraţia accentuată a lichidului în urma hemolizei si reducerii cantitative a eritrocitelor în sediment, (+) - reacţie slab pozitivă (lichidul e intens colorat, în sediment se observă o cantitate neînsemnată de eritrocite). In reacţia negativă (-) se observă hemoliza completă, lichidul în tub are aspect intens roz (sînge lacăt).Aplicarea practică: Prin intermediul R.F.C. se determină anticorpii fixatori de complement în serul sanguin al bolnavilor de sifilis (reacţia Wassermann), morvă, gonoree cronică, rickettsioze, viroze ş. a.REACŢII DE CITOLIZĂ IMUNĂREACŢII DE CITOLIZĂ IMUNĂ (cu participarea complementului) (cu participarea complementului)Activarea fracţiilor complementului (C) duce la liza particulei purtătoare de Ag (hematii, bacterii, diverse celule...)Activarea fracţiilor complementului (C) duce la liza particulei purtătoare de Ag (hematii, bacterii, diverse celule...)Activarea complementului: Activarea complementului: Calea clasică; Calea alternativă; Calea lectinicăCalea clasică; Calea alternativă; Calea lectinicăActivarea C pe cale clasicăActivarea C pe cale clasicăActivatorulActivatorul î îll constituie constituie complexe Ag-Accomplexe Ag-Ac (IgG, IgM) (IgG, IgM)Consecutivitatea activării C: Ag-Ac fixează fracţia C1qrs, care cConsecutivitatea activării C: Ag-Ac fixează fracţia C1qrs, care caapătă ulterior activitate esterazică (în prezenţa obligatorie a Capătă ulterior activitate esterazică (în prezenţa obligatorie a Ca++++). C1 activează C4, ). C1 activează C4, cu formarea complexului AgAcC1C4b. Este apoi activat C2 (AgAcC1C4bC2a), complexul C4bC2a devenind convertază ce acţionează asupra C3. cu formarea complexului AgAcC1C4b. Este apoi activat C2 (AgAcC1C4bC2a), complexul C4bC2a devenind convertază ce acţionează asupra C3. Urmează clivarea C3 în C3a (anafilotoxină) şi C3b, care se uneşte de complex (AgAcC1C4bC2aC3b)Urmează clivarea C3 în C3a (anafilotoxină) şi C3b, care se uneşte de complex (AgAcC1C4bC2aC3b), , formând C5-convertaza, care clivează C5 în formând C5-convertaza, care clivează C5 în C5a şi C5b. C5b se leagă de membrana celulei-ţintă. Urmează fixarea simultană a C,6,7. La final se fixează C8, apoi C9, formând “complexul de atac C5a şi C5b. C5b se leagă de membrana celulei-ţintă. Urmează fixarea simultană a C,6,7. La final se fixează C8, apoi C9, formând “complexul de atac membranar”. Fixarea lor produce leziuni ireversibile – liza celulei.membranar”. Fixarea lor produce leziuni ireversibile – liza celulei.Calea alternativă de activare a CCalea alternativă de activare a CActivatori:Activatori: endotoxine, celule infectate cu virus, levuri, paraziţi, venin de cobră, agregendotoxine, celule infectate cu virus, levuri, paraziţi, venin de cobră, agregaate de IgA sau IgEte de IgA sau IgE. C1,4 şi 2 nu intervin şi reacţia începe cu C3. . C1,4 şi 2 nu intervin şi reacţia începe cu C3. Properdina, factorul B şi ionii de MgProperdina, factorul B şi ionii de Mg++ ++ sunt obligatorii în procesul de activare pe cale alternativă.sunt obligatorii în procesul de activare pe cale alternativă.Calea lectinicăCalea lectinică de activare a C este determinată de legarea unor lectine pe unele grupări de manoză, carbohidrat prezent în componenţa multor de activare a C este determinată de legarea unor lectine pe unele grupări de manoză, carbohidrat prezent în componenţa multor mi/o şi absentă la ma/o. Lectina este echivalentă fracţiei C1q. Alte 2 molecule se asociază, formând o enzimă similară C1, ceea ce duce la formarea mi/o şi absentă la ma/o. Lectina este echivalentă fracţiei C1q. Alte 2 molecule se asociază, formând o enzimă similară C1, ceea ce duce la formarea complexului C4bC2a (C3-convertaza) complexului C4bC2a (C3-convertaza) Componentele reacţiilor de liză: Componentele reacţiilor de liză: Ag (celule bacteriene, hematii, etc). Ac (lizine - IgG şi IgM); Complement–Ag (celule bacteriene, hematii, etc). Ac (lizine - IgG şi IgM); Complement– ser proaspăt de cobai sau ser de cobai liofilizatser proaspăt de cobai sau ser de cobai liofilizatReacţia de bacterioliză (RBL). Reacţia de bacterioliză (RBL). Ag – suspensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...); Ac – serul imun sau serul bolnavului; Complement Ag – suspensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...); Ac – serul imun sau serul bolnavului; Complement RBL in vitro: RBL in vitro: Se efectuează diluţia succesivă a serului; Se adaogă suspensie microbiană vie; Se adaogă complement (martor: Ag+ser fiziologic+C); Se efectuează diluţia succesivă a serului; Se adaogă suspensie microbiană vie; Se adaogă complement (martor: Ag+ser fiziologic+C); Incubare 2 h la 37Incubare 2 h la 37°°C; Reînsămânţare pe cutii cu geloză câte 0,1 ml din fiecare diluţie (24h – 37C; Reînsămânţare pe cutii cu geloză câte 0,1 ml din fiecare diluţie (24h – 37°° C). C). LecturaLectura – se compară nr coloniilor crescute din – se compară nr coloniilor crescute din martor şi probele studiate. martor şi probele studiate. TitrulTitrul – cea mai mare diluţie a serului în care au fost lizate cel puţin 50% din celule – cea mai mare diluţie a serului în care au fost lizate cel puţin 50% din celuleRBL in vivo: RBL in vivo: Amestecul dintre Ag şi Ac se inoculează intra-peritoneal la animale de laborator (ex.: şoareci albi); Peste fiecare 10 min, timp de o Amestecul dintre Ag şi Ac se inoculează intra-peritoneal la animale de laborator (ex.: şoareci albi); Peste fiecare 10 min, timp de o oră, se extrage lichidul peritoneal, se pregăteşte un preparat nativ şi se examinează pe fond negru sau cu contrast de fază. Rezultat pozitiv – oră, se extrage lichidul peritoneal, se pregăteşte un preparat nativ şi se examinează pe fond negru sau cu contrast de fază. Rezultat pozitiv – numărul bacteriilor scade treptat până la dispariţie. numărul bacteriilor scade treptat până la dispariţie. Utilizarea RBLUtilizarea RBL – diagnosticul holerei (RVL), leptospirozelor (RALL) – diagnosticul holerei (RVL), leptospirozelor (RALL)Reacţia de hemoliză (RHL): AgReacţia de hemoliză (RHL): Ag – hematii de berbec, suspensie de 3%; – hematii de berbec, suspensie de 3%; AcAc – ser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic) – ser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic)Complement: Complement: Principiul reacţieiPrincipiul reacţiei: complexele Ag-Ac formate fixează C şi-l activează pe cale clasică, provocând hemoliza. Intensitatea hemolizei se : complexele Ag-Ac formate fixează C şi-l activează pe cale clasică, provocând hemoliza. Intensitatea hemolizei se apreciază vizual (++++) sau prin măsurarea densităţii optice a hemoglobinei eliberate. apreciază vizual (++++) sau prin măsurarea densităţii optice a hemoglobinei eliberate. Utilizarea practică a RHLUtilizarea practică a RHL: pentru dozarea C, precum şi în : pentru dozarea C, precum şi în montarea reacţiei de fixare a complementului. montarea reacţiei de fixare a complementului. REACŢIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC). REACŢIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC). Este o reacţie complexă, constituită din 2 sisteme Ag-Ac şi cu participarea C. În RFC participă Este o reacţie complexă, constituită din 2 sisteme Ag-Ac şi cu participarea C. În RFC participă Ig capabile să fixeze C – IgM şi IgG. RFC se utilizează în diagnosticul virozelor, infecţiilor bacteriene, etc Toate componentele RFC sunt utilizate în Ig capabile să fixeze C – IgM şi IgG. RFC se utilizează în diagnosticul virozelor, infecţiilor bacteriene, etc Toate componentele RFC sunt utilizate în acelaşi volum fiind titrate în prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru. Reacţia este însoţită de martori ai tuturor componenţiloracelaşi volum fiind titrate în prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru. Reacţia este însoţită de martori ai tuturor componenţilorReacţia se efectuează în 2 etape utilizând 2 sisteme.Reacţia se efectuează în 2 etape utilizând 2 sisteme.

35

Page 36: Microbiologie Exam

I etapăI etapă – – Sistemul de bazăSistemul de bază este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau serul imun) şi complement în este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau serul imun) şi complement în doza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37doza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37°° C sau menţinut 16-18 ore la 4 C sau menţinut 16-18 ore la 4°° C. Dacă Ac se combină cu Ag omolog va avea loc şi fixarea C C. Dacă Ac se combină cu Ag omolog va avea loc şi fixarea C (efect frecvent invizibil).(efect frecvent invizibil).II etapăII etapă – la sistemul de bază se adaogă – la sistemul de bază se adaogă sistemul indicator (hemolitic),sistemul indicator (hemolitic), constituit din hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici (Ac2). constituit din hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici (Ac2). Peste 1h incubare la 37Peste 1h incubare la 37°° C reacţia este terminată. C reacţia este terminată.Evaluarea rezultatelorEvaluarea rezultatelor – dacă complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu se observă (rezultat pozitiv). Dacă Ag1 nu – dacă complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu se observă (rezultat pozitiv). Dacă Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul rămâne disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocând hemoliza (rezultat negativ)corespunde cu Ac1, complementul rămâne disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocând hemoliza (rezultat negativ)Complement FixationComplement Fixation

75. Reactia de fixare a complementului (RFC) cu scop de seroidentificare. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.

76. Reactia de imunofluorescenta (RIF, reactia Coons) directa. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.Marcanţii utilizaţi uzual: fluorocromi(rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumină roşu-oranj sau verde-galbenă la tratarea lor cu raze UV.Reacţia de imunofluorescenta directă este folosită numai în scop de seroidentificare. Din materialul ce conţine Ag (material nativ, cultura pură, biopsie tisulară) se prepară un frotiu, peste care se aplică serul imun specific cu Ac marcaţi cu fluorocrom. Peste 20 min de incubare într-o cameră umedă, preparatul este studiat la microscopul luminescent. În caz de reacţie pozitivă se observă luminiscenţă locală. Inconvinient:necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice ptr fiecare Ag.Are la bază folosirea fluorocromilor, chimic conjugaţi cu anticorpii. Anticorpii marcaţi îşi păstrează specificitatea imunologică si reacţionează strict cu anumite antigene. Complexele antigenelor cu anticorpii marcaţi se evidenţiază uşor după intensitatea de luminiscenţă galben-verzuie la studierea frotiului în microscopul luminiscent.R.I.F. directă prevede folosirea serurilor imunofluorescente faţă de fiecare antigen examinat.R.I.F. poate fi aplicată pentru examinarea diferitor antigene: culturi de bacterii, ciuperci, protozoare; frotiuri din materialul bolnavului; celulelor infectate, secţiuni de ţesut ş. a. Materialul de examinat se aplică pe lamă şi se fixează (deseori în acetonă (10 min) la temperatura camerei), apoi ss usucă 20 min la temperatura de 37°C. Prelucrarea preparatelor în continuare depinde de varianta R.I.F. folosite.Preparatul în R.i.F. directă se colorează cu antiser specific marcat în cameră umedă 30 min la temperatura 25°C, apoi se spală cu soluţie tampon (pH 7,2) 10 min îa temperatura de 25°C.Pentru a evita rezultate fals-pozitive reacţia este însoţită de un şir de controluri, printre care un rol deosebit îi revine controlului cu antigen eterogen (de exemplu, cu cultura bacteriană ce nu corespunde anti-genic antiserului folosit). La studierea culturilor celulare infectate se foloseşte obligatoriu controlul cu cultura normală neinfectată (pentru excluderea autofluorescenţei şi fixarea nespecifică a anticorpilor marcaţi de suprafaţa celulelor). Pentru a frîna autofluorescenţa preparatelor poate fi folosită albumina bovină, marcată cu sulfarodamină.Reacţia de imunofluorescenţa, păstrînd specificitatea reacţiilor imunologice, se caracterizează prin simplitatea şi rapiditatea executării. Totodată R.I.F. nu poate fi calificată ca reacţie extrem de sensibilă. Deasemenea, nu se exclude posibilitatea de adsorbţie nespecifică a anticorpilor marcaţi pe preparat cu apariţia rezultatelor pseudopozitive.Tehnici serologice cu utilizarea Ac marcaţiTehnici serologice cu utilizarea Ac marcaţiÎn unele cazuri este imposibil de a detecta o reacţie Ag-Ac: unii Ac nu precipitează, alţii nici nu precipitează, nici nu aglutinează, există complexe În unele cazuri este imposibil de a detecta o reacţie Ag-Ac: unii Ac nu precipitează, alţii nici nu precipitează, nici nu aglutinează, există complexe Ag-Ac care nu fixează C. În aceste cazuri pot fi utilizaţi Ac marcaţi pentru a vizualiza Ag respectiv. Conjugarea Ac cu marcanţi nu afectează Ag-Ac care nu fixează C. În aceste cazuri pot fi utilizaţi Ac marcaţi pentru a vizualiza Ag respectiv. Conjugarea Ac cu marcanţi nu afectează proprietăţile lor imunologice.proprietăţile lor imunologice.Aceste reacţii se montează pe suport solid (lamă, plăci din plastic)Aceste reacţii se montează pe suport solid (lamă, plăci din plastic)Marcanţii utilizaţi uzual:Marcanţii utilizaţi uzual:Fluorocromi (rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumină roşu-oranj sau verde-galbenă Fluorocromi (rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumină roşu-oranj sau verde-galbenă la tratarea lorla tratarea lor cu raze UV (Reacţia de Imuno- cu raze UV (Reacţia de Imuno-Fluorescenţă)Fluorescenţă)Enzime (fosfataza alcalină, peroxidaza), capabile să modifice culoarea unui substrat (Reacţia Imuno-enzimatică)Enzime (fosfataza alcalină, peroxidaza), capabile să modifice culoarea unui substrat (Reacţia Imuno-enzimatică)Radio-izotopi (Radio-izotopi (125125J sau J sau 33H), care emit respectiv raze gamma şi beta (Analiza Radio-Imună)H), care emit respectiv raze gamma şi beta (Analiza Radio-Imună)Reacţia de imunofluorescenţă (RIF, reacţia COONS)Reacţia de imunofluorescenţă (RIF, reacţia COONS)Metoda directăMetoda directă (numai în scop de seroidentificare). Din materialul ce conţine Ag (material nativ, cultură pură, biopsie tisulară) se prepară un (numai în scop de seroidentificare). Din materialul ce conţine Ag (material nativ, cultură pură, biopsie tisulară) se prepară un frotiu, peste care se aplică serul imun specific cu Ac marcaţi cu fluorocrom. Peste 20 min de incubare într-o cameră umedă preparatul este studiat frotiu, peste care se aplică serul imun specific cu Ac marcaţi cu fluorocrom. Peste 20 min de incubare într-o cameră umedă preparatul este studiat la microscopul luminiscent. În caz de reacţie pozitivă se observă luminiscenţă locală. la microscopul luminiscent. În caz de reacţie pozitivă se observă luminiscenţă locală. Inconvenient Inconvenient – necesitatea de a avea seruri imune marcate – necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice pentru fiecare Ag.specifice pentru fiecare Ag.Metoda indirectăMetoda indirectă. Poate fi utilizată pentru sero-identificare şi sero-diagnostic.. Poate fi utilizată pentru sero-identificare şi sero-diagnostic.Pe frotiul ce conţine Ag se aplică Ac corespunzători nemarcaţi. Peste 20 min se spală minuţios preparatul, apoi se adaogă anti-Ig fluorescentă, carePe frotiul ce conţine Ag se aplică Ac corespunzători nemarcaţi. Peste 20 min se spală minuţios preparatul, apoi se adaogă anti-Ig fluorescentă, care se va combina cu Ac din complex. Acest reactiv poate fi utilizat în numeroase reacţii.se va combina cu Ac din complex. Acest reactiv poate fi utilizat în numeroase reacţii.Anti-Ig se obţine prin imunizarea iepurilor (sau altor animale) cu Ig.Anti-Ig se obţine prin imunizarea iepurilor (sau altor animale) cu Ig.Tehnica fondată pe fixarea C:Tehnica fondată pe fixarea C: Markerul fluorescent este un ser anti-complement care se va lega de complementul fixat pe complexul Ag-Ac. Markerul fluorescent este un ser anti-complement care se va lega de complementul fixat pe complexul Ag-Ac.RIF se utilizează pentru identificarea rapidă a Ag din biosubstrate sau pentru serodiagnostic.RIF se utilizează pentru identificarea rapidă a Ag din biosubstrate sau pentru serodiagnostic.Reacţia Imuno-Enzimatică (RIE, ELISAReacţia Imuno-Enzimatică (RIE, ELISA - -Enzyme Linked Immunosorbent Enzyme Linked Immunosorbent AAssaysssays).). RIE directă (metoda sandwich).RIE directă (metoda sandwich). Utilizată doar în sero-identificarea Ag.Utilizată doar în sero-identificarea Ag. În godeurile din placa de polistiren în care sunt fixaţi Ac cunoscuţi se În godeurile din placa de polistiren în care sunt fixaţi Ac cunoscuţi se toarnă soluţia de Ag necunoscut. Se incubează 1h. După o spălare minuţioasă a godeurilor se adaogă Ac marcaţi cu enzime, care se fixează pe toarnă soluţia de Ag necunoscut. Se incubează 1h. După o spălare minuţioasă a godeurilor se adaogă Ac marcaţi cu enzime, care se fixează pe epitopii liberi ai Ag polivalent. După incubare de 30 min-1h se spală iarăşi godeurile. Prezenţa complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depistează cu epitopii liberi ai Ag polivalent. După incubare de 30 min-1h se spală iarăşi godeurile. Prezenţa complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depistează cu ajutorul substratului cromogen (substanţă iniţial incoloră, dar care se colorează sub acţiunea enzimei, ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina). ajutorul substratului cromogen (substanţă iniţial incoloră, dar care se colorează sub acţiunea enzimei, ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina). RIE indirectă.RIE indirectă. Utilizată în serodiagnosticUtilizată în serodiagnostic. Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul testat) se întroduce în godeu, după 1h se spală . Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul testat) se întroduce în godeu, după 1h se spală totul şi se adaogă ligandul marcat cu enzimă (anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzimă). Acest ligand se fixează pe Ac testaţi. Se adaogă apoi totul şi se adaogă ligandul marcat cu enzimă (anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzimă). Acest ligand se fixează pe Ac testaţi. Se adaogă apoi substratul cromogen. Cantitatea de Ac se măsoară după densitatea optică a lichidului din godeuri.substratul cromogen. Cantitatea de Ac se măsoară după densitatea optică a lichidului din godeuri.Tehnica imunoblot (western blot)Tehnica imunoblot (western blot) permite identificarea Ag dintr-un amestecpermite identificarea Ag dintr-un amestec..

I etapă – electroforeza în gel a probei de AgI etapă – electroforeza în gel a probei de AgII etapă – transferul electric al Ag pe membrana de nitrocelulozăII etapă – transferul electric al Ag pe membrana de nitrocelulozăIII etapă – pe membrană sunt aplicaţi succesiv Ac dirijaţi contra Ag, apoi conjugatul marcat cu enzimă, care permite depistarea Ac fixaţi. DupăIII etapă – pe membrană sunt aplicaţi succesiv Ac dirijaţi contra Ag, apoi conjugatul marcat cu enzimă, care permite depistarea Ac fixaţi. După o spălare se adaogă substratul cromogen. Fiecare complex Ag-Ac formează zone colorate distincte. o spălare se adaogă substratul cromogen. Fiecare complex Ag-Ac formează zone colorate distincte. UtilizareUtilizare: depistarea Ac anti-HIV, : depistarea Ac anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali...caracterizarea Ac monoclonali...Proteinele sunt separate electroforetic în gel poliacrilamid. Sub acţiunea câmpului electric are loc difuzia proteinelor conform greutăţii Proteinele sunt separate electroforetic în gel poliacrilamid. Sub acţiunea câmpului electric are loc difuzia proteinelor conform greutăţii moleculare, aranjându-se în zone liniare subţiri diferite: mai aproape de start se aranjează proteinele cu masă moleculară mare (120-150 moleculare, aranjându-se în zone liniare subţiri diferite: mai aproape de start se aranjează proteinele cu masă moleculară mare (120-150 kDa), la final se aranjează proteinele cu masă moleculară mică (5-10kDa). Apoi lamela de gel este transferată pe o foaie de nitroceluloză kDa), la final se aranjează proteinele cu masă moleculară mică (5-10kDa). Apoi lamela de gel este transferată pe o foaie de nitroceluloză amplasată între electrozii unei surse de curent continuu. Sub acţiunea câmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloză, amplasată între electrozii unei surse de curent continuu. Sub acţiunea câmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloză,

36

Page 37: Microbiologie Exam

unde se fixează foarte bine pe hârtie. Proteinele fixate sunt marcate cu o enzimă (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase) incoloră. unde se fixează foarte bine pe hârtie. Proteinele fixate sunt marcate cu o enzimă (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase) incoloră. Procedura ulterioară de montare a reacţiei este similară tehnicii ELISA.Procedura ulterioară de montare a reacţiei este similară tehnicii ELISA.

Analiza radioimună (ARI). Analiza radioimună (ARI). Principiul este identic cu cel al RIE. Ag se fixează la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaogă Ac testaţi care se Principiul este identic cu cel al RIE. Ag se fixează la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaogă Ac testaţi care se vor combina cu Ag omolog. După spălarea godeurilor, se adavor combina cu Ag omolog. După spălarea godeurilor, se adauugă un ligand radiomarcat (anti-Ig). După eliminarea excesului de izotopi prin gă un ligand radiomarcat (anti-Ig). După eliminarea excesului de izotopi prin spălare, se măsoară radio-activitatea: ea este proporţională cu concentraţia Ac dozaţi.spălare, se măsoară radio-activitatea: ea este proporţională cu concentraţia Ac dozaţi. 77. Reactia de imunofluorescenta (RIF, reactia Coons) indirecta. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.RIF indirectă poate fi utilizată ptr seroidentificare şi serodiagnostic. pe frotiul ce conţine Ag se aplică Ac corespunzători nemarcaţi. Peste 20 min se spală minuşios preparatul, apoi se adaugă anti- Ig fluorescentă, care se va combina cu Ac din complex. Acest reactiv poate fi utilizat în numeroase reacţii. Anti-Ig se obţine prin imunizarea iepurilor(sau altor animale) cu Ig umoane.R.I.F. indirectă are la bază folosirea a două antiseruri diferite. La început se aplică anticorpii nemarcaţi faţă de antigenul studiat, iar în etapa a doua a reacţiei complexul format antigen-anticorp este prelucrat cu antiser marcat cu F.I.T.C (fluresceinizotiocianată., ce conţine anticorpi contra gama-globulinelor acelui animal, de la care s-au obţinut antiserurile folosite în prima etapă a reacţiei (ser antigen de specie).De exemplu, în caz că antiserul folosit în prima etapă a fost obţinut prin imunizarea iepurilor, în etapa a doua se foloseşte serul antispecie faţă de iepure obţinut prin imunizarea măgarilor sau a altor animale cu gama-globulină de iepure, în acest caz anticorpii antiglobuliniti marcaţi acoperă cu un al doilea strat antigenul examinat (primul strat, datorită anticopilor nemarcaţi, care la rîndul lor servesc ca antigene pentru serul antiglobulină (antispecie). Prin urmare, antigenul devine vizibil în microscopul luminiscent, Valoarea R.I.F. indirecte şi anticomplementare constă în folosirea unui singur ser luminiscent (de antispecie şi corespunzător anticomplementar) pentru studierea diferitor antigene, ceea ce evident simplifică reacţia. Materialul de examinat se aplică pe lamă şi se fixează (deseori în acetonă (10 min) la temperatura camerei), apoi ss usucă 20 min la temperatura de 37°C. Prelucrarea preparatelor în continuare depinde de varianta R.I.F. folosite.In R.I.F. indirectă preparatul îa început se prelucrează cu antiser specific nemarcat în cameră umedă (30 min), la temperatura 25°C, ulterior se spală cu soluţie tampon (ca şi Ia R.I.F. directă). In continuare preparatul se colorează cu ser antispecie marcat în camera umedă (30 min). la temperatura 25°C şi se spală cu soluţie tampon.Pentru a evita rezultate fals-pozitive reacţia este însoţită de un şir de controluri, printre care un rol deosebit îi revine controlului cu antigen eterogen (de exemplu, cu cultura bacteriană ce nu corespunde anti-genic antiserului folosit). La studierea culturilor celulare infectate se foloseşte obligatoriu controlul cu cultura normală neinfectată (pentru excluderea autofluorescenţei şi fixarea nespecifică a anticorpilor marcaţi de suprafaţa celulelor). Pentru a frîna autofluorescenţa preparatelor poate fi folosită albumina bovină, marcată cu sulfarodamină.Reacţia de imunofluorescenţa, păstrînd specificitatea reacţiilor imunologice, se caracterizează prin simplitatea şi rapiditatea executării. Varianta R.I.F. indirectă poate fi folosită nu numai pentru studierea antigenelor, cât şi la determinarea cantităţii de anticorpi în serul imun. Totodată R.I.F. nu poate fi calificată ca reacţie extrem de sensibilă. Deasemenea, nu se exclude posibilitatea de adsorbţie nespecifică a anticorpilor marcaţi pe preparat cu apariţia rezultatelor pseudopozitive.

78. Reactia imunoenzimatica (RIE, ELISA) directa (tehnica “sandwich”). Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.

RIE reprezintă o interacţiune a Ag cu Ac care este asociat cu o enzimă. Complexul format capătă o activitate enzimatică şi scindează substratul respectiv, exteriorizînd efectul de coloraţie pregnantă.RIE directă aprecizează prezenţa Ag prin intermediul Ac. cantitatea de enzimă fixată de substrat corespunde cantităţii de Ag.componentele: Ag, Ac, enzima (peroxidaza de hrean sau fosfataza bazică)RIE directă (metoda sandwich) este utilizată doar în sero-identificarea Ag. În godeurile din placa de polistiren în care sunt fixaţi Ac cunoscuţi se toarnă soluţia de Ag necunoscuţi. se incurbeaza pe 1 oră. după spălare minuţioasă a godeurilor se adaugă Ac marcaţi cu enzime, care se fixează pe epitopii liberi ai Ag polivalent. După incurbare de 30 min.-1 oră se spală iarăşi godeurile. Prezenţa complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depistează cu ajutorul substratului cromogen (substanţă iniţial incolorp,dar care se colorează sub acţiunea enzimei,ex. apa oxigenată şi orthofenilendiamina).rezultatele reacţiei se aăreciază vizual sau instrumental. la citirea vizuală se determină diluţia maximă a materialului de examinat, în care intensitatea coloraţiei este mai pronunţată faţă de cea de control (albumina serică bovină).la citirea rezultatelor cu spectrofotometrul ca pozitivă se consideră diluţia maximă a materialului examinat, unde nivelul extincţiei prevalează cel puţin de 2 ori nivelul extincţiei din diluţia respectivă a componentului eterolog al reacţiei. Aplicarea practică: pot fi detectaţi Ag în diferite afecţiuni umane.

79. Reactia imunoenzimatica (RIE, ELISA) indirecta. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.RIE indirectă este utilizată în serodiagnostic.Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac(serul testat) se introduce în godeu, după 1h se spală totul şi se adaugă ligandul marcat cu enzimă(anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzimă). Acest ligand se fixează pe Ac testaţi. se adaugă apoi substanţa cromogen. Cantitatea de Ac se măsoară după densitatea optică a lichidului din godeuri.Metoda indirectă detectează anticorpul. Antigenul de referinţă, fixat pe suprafaţa de polistiren, este incubat cu serul testat, apoi cu anticorpi antiimunoglobulină marcaţi cu enzimă. După fiecare etapă, reactivii necuplaţi sunt îndepărtaţi prin spălarea suportului, în final se adaugă substratul cromogen, iar culoarea dezvoltată in interval de 30 minute este măsurată (figura 10.12, a).• Metoda competitivă detectează de asemenea anticorpi. Anticorpul din serul testat şi anticorpul omolog monoclonal marcat cu peroxidaza din hrean, pipetaţi în ordinea enunţată, intră în competiţie pentru antigenul fixat pe suprafaţa de polistiren. Anticorpii necuplaţi sunt îndepărtaţi prin spălare, apoi este adăugat substratul cromogen pentru testarea enzimei restante pe suprafaţa de reacţie. Intensitatea culorii, măsurată după stoparea reacţiei la 30 minute, deci activitatea enzimei de marcaj este invers proporţională cu concentraţia anticorpului din serul pacientului testat.

80. Reactiile de hemaglutinare (RHA) si de inhibare a hemaglutinarii (RIHA). Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica.In practica de laborator se întrebuinţează două tipuri de reacţii de hemaglutinare (RHA), care se deosebesc după mecanismul de acţiune.Prima RHA face parte din reacţiile serologice. In această reacţie eritrocitele se aglutinează la interacţiunea cu anticorpi corespunzători (hemaglutinine). Această reacţie se aplică pe larg pentru determinarea grupelor de sînge.A doua RHA nu este serologică. In această reacţie aglutinarea eritrocitelor e condiţionată nu de anticorpi, ci de substanţe deosebite, formate în cazul infecţiei virotice. De exemplu, virusul gripei aglutinează eritrocitele de găină şi cobai, iar virusul poliomielitei — eritrocitele de berbec. Această reacţie permite de a constata prezenţa unui sau altui virus în materialul de cercetat.Metodica. Reacţia se efectuează în eprubete sau pe plăci speciale cu adîncituri. Materialul de cercetat se diluează în soluţie izotonică de la 1:10 pînă la 1:1280; 0,5 ml din fiecare diluţie se amestecă cu volum egal de suspensie de l—2% de eritrocite. In control, 0,5 ml suspensie de eritrocite se amestecă cu 0,5 ml de soluţie izotonică Eprubetele se amplasează în termostat pe 30 min, iar plăcile se ţin la temperatura camerei timp de 45 min.

37

Page 38: Microbiologie Exam

Evidenţa rezultatelor. In cazul rezultatului pozitiv al reacţiei, pe fundul eprubetei sau al adînciturii din placă se formează sediment de eritrocite în formă de «umbrelă», care astupă tot fundul. In cazul rezultatului negativ, eritrocitele formează un sediment compact cu margini netede, care se aseamănă cu un nasture. Sediment asemănător se formează şi în control. Intensitatea reacţiei se indică cu ajutorul semnului «plus». Titrul virusului indică diluţia maximă a materialului, în care mai are loc aglutinarea.Reacţia de inhibare a hemaglutinării. Aceasta reprezintă o reacţie serologică, în care anticorpii antivirotici specifici, interacţionînd cu virusul (antigenul), asigură neutralizarea acestuia şi exclud capacitatea de a aglutina eritrocite, adică inhibă reacţia de hemaglutinare. Specificitatea înaltă a reacţiei de inhibare a hem aglutinării (RIHA) permite de a determina, cu ajutorul ei specia şi chiar tipul de virusuri înregistrate în timpul RHAMetodica. 0,25 ml de ser antiviral se diluează consecutiv de h; 1:10 pînă la 1:2560 şi se amestecă cu volume egale de material ci conţine virus şi este diluat de 4 ori în comparaţie cu titrul determina prin RHA. Amestecul se agită şi se termostatează 30 min, după cars se adaugă cile 0,5 ml suspensie de l—2% de eritrocite. Reacţia e însoţită de 3 controale. Evidenţa rezultatelor se efectuează după incubarea repetata îi termostat, în decurs de 30 min, sau menţinerea timp de 45 min 1; temperatura camerei. La pregătirea corectă a experienţei, în controlu serului şi eritrocitelor trebuie să se formeze «nasturele», deci lipseşti factorul ce condiţionează aglutinarea eritrocitelor, iar în controlul anti genului se formează «umbrela», deci virusul a dus la aglutinare; eritrocitelor. In experienţă, dacă serul este omolog cu virusul cercetat. s< formează «nasturele», deci serul a neutralizat virusul, în acest caz titrul serului reprezintă diluţia maximă, în care se mai înregistrează inhibarea hemaglutinării.

81. Infectiile stafilococice. Clasificarea stafilococilor (familie, gen, sp.) . Factorii de patogenitate. Habitatul, infectiile cauzate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Metoda microscopica, izolarea si identificarea culturii pure. Markerii epidemiologici. Profilaxia si tratamentul specific al infectiilor stafilococice.CARACTERISTICA GENERALĂ A GRUPULUI COCILOR PIOGENIFamilia StaphylococcaceaeGenuri: Staphylococcus; Gamella; Macrococcus; Salinicoccus Familia StreptococcaceaeGenuri: Streptococcus; LactococcusFamilia NeisseriaceaeGenul: NeisseriaCaracter comun – capacitatea de a condiţiona procese supurative-distructive.Morfologic reprezintă coci (sferici, lanceolaţi, riniformi), imobili, nesporogeni, unele specii formează capsule. În funcţie de caracterele tinctoriale se disting: Coci G+ (Staphylococcaceae, Streptococcaceae); Coci G- (Neisseriaceae)Cocii piogeni se deosebesc prin: Caractere de cultură (exigenţe nutritive, tipul de respiraţie, etc); Caractere biochimice; Factori de patogenitateRolul în patologia umană: Infecţii nespecifice ; Infecţii specifice (gonoreea, scarlatina, etc)GENUL STAPHYLOCOCCUSSe disting 2 grupuri (varietăţi):

Stafilococi coagulazo-pozitivi - SCP – foarte virulenţi (S.aureus, S.intermedius)Stafilococi coagulazo-negativi – SCN – potenţial-patogeni (aproximativ 30 specii: S.epidermidis, S. saprophyticus, S. capitis, S.haemolyticus, S.hominis, etc)

Habitat: 20-70% din populaţie sunt purtători: S.aureus - cavitatea nazală, intestin, S.epidermidis – narine, tegument, S.saprophyticus - tegument. Staphylococcus aureusCaracterele morfobiologice: Caractere morfo-tinctoriale: coci gram+, în frotiu se aranjează în grămezi neregulate (greacă: staphylos-ciorchine, kokkos – grăunte), în perechi sau izolat . Imobili, nesporogeni, necapsulaţi (uneori microcapsule)Caractere de cultură: facultativ anaerobi, nepretenţioşi la cultivare, cresc pe medii uzuale. Temperatura optima 37°C, pH-7,0–7,5. În BP – turbiditate uniformăGeloza salină cu gălbenuş de ou-GGO (3 % NaCl) Mediul Chapman (7,5 % NaCl, manitol) Geloză-sângeColonii S, opace, pigmentate (auriu, citric, alb), pe geloză-sânge cauzează hemoliză. Pe GGO coloniile sunt înconjurate cu un halou opac (acţiunea lecitinazei).Caractere biochimice: catalazo-pozitivi, fermentează manitolul

Factori de patogenitateI. Factori structurali:

peptidoglicanul (induce secreţia citokinelor de către celulele limfocitare, responsabile de starea de şoc) acizii lipoteichoici (induc o hipersensibilitate tardivă) proteina A (asigură fixarea Fc al IgG, împiedică opsonizarea şi fagocitoza) adezine, care permit fixarea S.aureus pe diverse molecule plasmatice ale gazdei:

Fibronectină şi laminină. Fibronectina este prezentă pe suprafeţe epiteliale şi endoteliale, precum şi în chiaguri sanguine. Fibrinogen. Fixarea de fibrinogen asigură aderarea la chiaguri şi ţesuturi lezate. Colagen. Tulpinile ce posedă astfel de adezine cauzează osteomielite şi artrite septice

Microcapsula, rol antifagocitarII. Toxine

1. A lfa-toxina (alfa-hemolizina). Efect citolitic faţă de trombocite, monocite, hematii, cu eliminarea citokinelor, care pot fi cauza şocului septic stafilococic.

2. Beta-toxina (sfingomielinaza). Prezentă la tulpinile izolate de la bovine cu mastită. 3. Gamma şi delta-toxine . Efect leuco- şi hemolitic. 4. Leucocidina , efect litic faţă de leucocite şi macrofage, factor important în procese dermonecrotice5. Exfoliatine (epidermolizine) A şi B. Manifestă tropism cutanat. 6. Mecanism: se fixează de unele proteine cutanate (profilagrină şi filagrină), inducând desprinderea intra-epidermică dintre stratum

granulosum şi stratum spinosum, cu formarea leziunilor buloase (impetigo bulos, sindromul pielii opărite).7. Enterotoxine: A, B, C1, C2, C3, D, E, G . Termostabile, rezistente la acţiunea enzimelor proteolitice ale tubului digestiv. Determină

intoxicaţii alimentare (enterotoxina B poate cauza şoc toxic). 8. Toxina sindromului toxic stafilococic (TSST-1). Determină stare de şoc stafilococic.

Toate toxinele sunt imunogene.Enterotoxinele, TSST-1 reprezintă superantigene, activând 20% de limfocite T (participă la declanşarea stării de şoc)

III. CoagulazeleCoagulaza liberă - proteină extracelulară care se leagă de protrombina gazdei cu formarea unui complex. Astfel activată, trombina determină conversia fibrinogenului în fibrină cu coagularea plasmei. Reprezintă cauza tromboflebitelor septice şi protejează cocii de fagocitoză.

38

Page 39: Microbiologie Exam

Coagulaza legată (clumping factor) este un determinant superficial al S.aureus fixator de fibrinogen. Antifagocitar. Provoacă fenomenul de aglutinare a stafilococilor în prezenţa fibrinogenului.

IV. Stafilokinaza (fibrinolizina) – activator al plasminogenului (asociat cu bacteriofagi lizogeni). Complexul stafilokinază-plasminogen manifestă activitate proteolitică, cauzând dizolvarea trombilor (responsabilă de localizări septice secundare).

V. Enzime de patogenitate:Hialuronidaza – facilitează diseminarea bacteriilorAlte enzime: proteaze, lipaze (inclusiv lecitinaza), ADN-aze, fosfataze, etc. Rol în diseminarea infecţiei şi producerea leziunilor.

Se disting multiple serotipuri de S.aureus, iar receptorii pentru bacteriofagi permit clasificarea în lizotipuri (fago-variante).

Epidemiologia infecţiilor stafilocociceSursa de infecţie: omul bolnav sau purtători sănătoşi de germeni. Rareori – bovinele bolnave de mastită.Mecanismele şi căile de transmitere:

Contact direct sau diseminare manuportată Contact indirect (alimente, praf, îmbrăcăminte, etc)

Factori favorizanţi: diabet, tratament imunosupresiv, arsuri, plăgi, etc

Formele clinice ale infecţiilor cu S.aureusInfecţii supurativeInfecţii cutanate: foliculite, furuncule, carbuncule, abcese, panariţiu, infecţie de plagă (frecvent de origine nosocomială). Exfoliatina determină sindromul pielii opărite (sindromul Lyel) la copii, pemfigus epidemic la nou-născuţi (boala Ritter) şi impetigo bulos la maturi.Infecţii ale mucoaselor: mastoidite, sinusite, otite, angine...Infecţii ale seroaselor: artrite, pleurezie, peritonită, meningită...Infecţii osoase: osteomielită, spondilodiscită, infecţie de protezăInfecţii viscerale: abces pulmonar, cerebral, flegmon perirenal, pielonefrite, etcSepticemii şi endocardite. Cauzate şi întreţinute de un focar infecţios primar complicat de tromboflebită. În mediu spitalicesc au caracter nosocomial (catetere intravasculare, proteze valvulare cardiace, articulare, stimulatoare cardiace...)Manifestări digestiveIntoxicaţii alimentare (doza toxică - 1µg la 100 g aliment). Vome, diaree, deshidratare, absenţa febreiEnterocolite consecutive unei antibioterapiiSindromul şocului toxic stafilococic: febră, hipotensiune arterială, erupţie cutanată scarlatiniformă, stare de şoc, leziuni viscerale (cerebrale, renale, hepatice, musculare). Descris în 1978 în SUA la femei care utilizau tampoane periodice şi sufereau de vaginită cu S. aureus. Tulpini responsabile de acest sindrom pot fi izolate din diverse leziuni stafilococice.

Infecţii cauzate de SCNS.epidermidis determină infecţii asociate cu proteze şi catetere, frecvent de origine nosocomială (endocardite, endoftalmii, peritonite la pacienţi cu dializă peritoneală, bacteriemii). S.epidermidis produce un polizaharid de adeziune, care-l fixează pe implante din plastic.S.saprophyticus şi S.haemolyticus pot cauza infecţii ale tractului urinarS.lugdunensis – infecţii de plagă, endocarditeImunitatea antistafilococică este mixtă: celulară şi umoralăDiagnostic de laboratorMateriale de examinat – în funcţie de forma clinicăDiagnostic direct:

Examen microscopic direct (Gram, RIF)Examen bacteriologic. La interpretare se ţine cont de datele clinice. În caz de infecţii nosocomiale sau otrăvire alimentară se identifică markerii epidemiologici (lizotip, serotip, antibiotip). Determinarea antibiogramei este obligatorie (tulpini multirezistente).Identificarea acizilor nucleici prin tehnici de biologie molecularăÎn cazuri particulare se caută prezenţa toxinelor (reacţia de latex-aglutinare, ELISA)

Diagnostic indirect (serologic): Se examinează seruri sanguine pentru depistarea anticorpilor anti-stafilolizine-alfa (titru> 2 UI/ml) – în caz de infecţii profunde sau cronice, sau anti-acizi teichoici (titru> 1:16) – în caz de endocardite sau focare inaccesibile.Tratamentul specific al infecţiilor stafilococice: autovaccinuri, vaccinuri inactivate, seruri imune (în infecţii cronice)Antibiotice: peniciline semi-sintetice (oxacilină), augmentină, imipenem, aminoside, macrolide, fluorochinolone, glicopeptide (vancomicină, teicoplanină) cotrimoxazol, fosfomicină, rifampicină, acidul fuzidic, etc Profilaxia specifică: plasmă antistafilococică, Ig anti-stafilococică, ser hiperimun, anatoxină stafilococică

82. Infectiile streptococice. Clasificarea streptococilor (familie, gen, sp.). Clasificarea dupa aspectul hemolizei si structurii antigenice. Factorii de patogenitate (structurali,exotoxinele, enzimele de patogenitate). Infectiile cauzate de S.pyogenes. Diagnosticul microbiologic. Prelevate patologice. Metoda microscopica, izolarea culturii pure, identificarea. Serodiagnosticul scarlatinei si reumatismului.

FAMILIA STREPTOCOCCACEAE: Genul Streptococcus (fragili şi exigenţi la cultivare); Genul Lactococcus (anterior streptococi din grupul N)Genul Streptococcus. Reuneşte specii facultativ anaerobe caracterizate prin morfologie tipică (coci gram+ în lanţuri, imobili, nesporogeni, capsulaţi), metabolism fermentativ şi lipsa catalazei.Clasificarea streptococilorDupă aspectul hemolizei pe geloză-sângeStreptococi beta-hemolitici (hemoliză completă, zonă clară în jurul coloniilor)Streptococi alfa-hemolitici (hemoliză incompletă, zonă verzuie în jurul coloniilor) Streptococi nehemolitici (gamma-hemoliză)Clasificarea imunologică LancefieldDupă antigenul polizaharidic C din peretele celular se disting 20 grupe serologice (A – H, K – W). Streptococii care nu posedă acest Ag nu se încadrează în clasificarea Lancefield (ex.: S.pneumoniae). Ei se identifică după caractere de cultură şi biochimice.După habitat şi patogenitateStreptococi piogeni, virulenţi, beta-hemolitici (aparţin grupurilor A,B,C,G)Streptococi orali, comensali, nehemolitici sau alfa-hemolitici, negrupabili după Lancefield

39

Page 40: Microbiologie Exam

Streptococi fecali, specii comensale sau condiţionat patogene ale tractului digestiv uman şi animalStreptococi lactici, reprezintă flora laptelui şi produselor lactateDiferenţierea streptococilor patogeni de cei saprofiţi se efectuează de asemenea în baza criteriilor Cherman:Creşterea la 10 şi 45° CCreşterea în bulion cu 6,5% NaClCreşterea în mediu cu pH 9,6Hidroliza esculinei pe mediu cu 40% bilăLiza culturii în bulion biliatSensibilitatea la bacitracină şi optochinăHidroliza hipuratului de sodiu Streptococcus pyogenes (gr. A). Bacterie strict umană, posibil portaj oro- şi nasofaringean (20%).Caractere morfologice: lanţuri scurte sau perechi de coci sferici gram+, imobili, capsulaţi, nesporogeni. Caractere de cultură: facultativ-anaerobi, cultivă pe medii elective. Pe geloză-sânge, după 18-24 ore incubare la 37° C – colonii S mici, cu zonă de β-hemoliză. În bulion glucozat, bulion-ser formează depozit la fundul şi pe pereţii tubului. S.pyogenes este sensibil la bacitracină. Factori de patogenitate. Factori de structură: Capsula din acid hialuronic, neimunogenă. Efect antifagocitarProteina M, adeziune, antifagocitar. Acizii lipoteichoici, adeziune la celule epiteliale. Proteina F, receptor de fibronectină Toxine: Streptolizinele O (oxigen-labilă) şi S (oxigen-stabilă). Sunt toxine citolitice. SLO manifestă efect cardiotoxic, hemolitic. Inhibă chimiotactismul PMN şi reduce activitatea celulelor imunocompetente. Induce formarea Ac neutralizanţi – antistreptolizine (ASLO). SLS nu este imunogenă. Manifestă activitate citolitică şi leucotoxică.Toxinele eritrogene (pirogene) A, B şi C sunt determinate de fagi moderaţi. Au activitate de superantigen, producând inflamaţie asociată cu stare de şoc. Mitogene şi imunosupresive. Tulpinile lizogene determină scarlatina. Enzime de patogenitate: hialuronidaza, streptodornaza B (ADNaza), lipoproteinaza, streptokinaza (fibrinolizina)Epidemiologia infecţiilor provocate de S.pyogenesSursa de infecţie: bolnavii şi purtătorii sănătoşi (faringe şi amigdale, mai rar – anus, vagin, tegument). Mecanismele şi căile de transmitere: Aerogen (picături Pflugge); Contact direct (leziuni cutanate)Patogenia şi formele clinice ale infecţiilor provocate de S.pyogenesInfecţii ale mucoaselor. Sfera ORL: rinite, faringite, angine eritematoase (risc de reumatism articular acut), abcese periamigdaliene, adenite cervicale, sinusite, otite, mastoidite.Scarlatina (angină streptococică însoţită de erupţie cutanată). Infecţii cutanate şi subcutanate: erizipel, impetigo, celulită, fasciită necrozantă, mionecroză (sindromul Meleney), eritemul nodos, infecţii ale plăgilor şi arsurilorSepticemii. Sindromul şocului toxic streptococic, secundar unei infecţii locale, în special subcutanatăAlte infecţii: endometrite, pneumoniiInfecţii post-streptococice. RAA (reumatismul articular acut), mai frecvent la copii de vârstă şcolară. Apare după infecţii faringiene şi este determinată de acţiunea directă a streptolizinei, depozite de complexe imune (RHS III), precum şi prin interacţiunea autoAc şi al Ac anti-streptococici cu autoantigene din miofibrile, valvule cardice şi sinoviale (RHS II). Glomerulonefrita acută (GNA)- Maladie a copilului de vârstă preşcolară. Survine după 10-20 zile de la o infecţie cutanată, mai rar faringeană. Se caracterizează prin perturbarea funcţiei renale, edem şi hipertensiune arterială. Patogenie: efect toxic direct, reacţii autoimune, bazate pe asemănarea unor Ag streptococice din MCP şi membrana bazală glomerulară (RHS II şi III), persistenţa formelor L.Imunitatea antistreptococică este specifică de tip, asigurată de Ac anti-proteina M. Ac anti-eritrotoxină protejează de eritemul scarlatinos.

83. Infectiile pneumococice. Clasificarea agentului (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Infectiile cauzate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Microscopia directa, izolarea si identificarea culturii pure, diferentierea de S.pyogenes. Profilaxia specifica a infectiilor pneumococice.Streptococii negrupabili (lipsiţi de antigene de perete)Streptococcus pneumoniae (prezent pe mucoasele omului şi ale unor mamifere, în special în nasofaringe)Alţi streptococi negrupabili (S.mitis, S.mutans, S.oralis, S.sanguis). Prezenţi în cavitatea bucală, joacă rol în geneza cariei dentare, în infecţii materno-fetale, bacteriemii şi endocarditeStreptococcus pneumoniaeCaractere morfo-tinctoriale: diplococi ovoizi sau lanceolaţi, gram+, imobili, nesporogeni, capsulaţi.Caractere de cultură: cultivă pe medii elective (geloză-sânge, geloză-ser, bulion-ser), pH optimal 7,8. Pe geloză-sânge, peste 18-24 ore de incubare la 35-37° C în atmosferă cu 5-10% CO2, formează colonii S mici, cu o zonă de hemoliză alfa (verzuie). Din cauza autolizei pneumococilor centrul coloniilor se deprimă. Tulpinile necapsulate formează colonii R. Structura antigenică: Antigene capsulare, de origine polizaharidică. Permit clasificarea pneumococilor în 90 serotipuri. Antigenul proteic R, mascat de Ag capsulare. Antigenul proteic M, specific de tip. Factori de patogenitate: Capsula (rol antifagocitar); Adezine; sIgA – protează; Acidul lipoteichoic (implicat în reacţii inflamatoare cu semne generale şi leziuni tisulare, posibil şoc); Autolizinele (eliberarea unor factori bacterieni cu rol în virulenţă); Pneumolizina (hemolizina). Efect citotoxic asupra celulelor epiteliale şi endoteliale. Reduce activitatea bactericidă a PMN; Hialuronidaza; Neuraminidaza S.pneumoniae se diferenţiază de alţi streptococi prin: Sensibilitatea la optochină; Liza culturii de pneumococi în prezenţa sărurilor biliare (activarea autolizinelor) – testul de solubilitate în bilă; Patogenitatea pneumococilor pentru şoarece; Prezenţa capsulei; Hidroliza inulinei Epidemiologia infecţiilor cu pneumocociSursa de infecţie – purtătorii sănătoşi (naso-faringe) sau bolnaviiCalea de transmitere – aerogenăInfecţiile cauzate de S.pneumoniaeInfecţii respiratorii: pneumonia francă lobară acută, broncho-pneumonii, bronşite, otite, sinusite, mastoidite. Meningite (în special la copii). Bacteriemii cu artrite, peritonită, pericardită, endocardită.Imunitatea antipneumococică este specifică de tip, prin Ac anti-capsulari.

Diagnosticul de laborator al infecţiilor streptococicePrelevate – în funcţie de forma clinică (tampon faringean sau cutanat, puncţie a ţesutului sub-cutanat, LCR, puroi, sânge, etc)Diagnosticul directExamenul microscopic (frotiu Gram – orientativ, RIF)Examenul bacteriologic (de bază)Detectarea serologică a Ag specificeIdentificarea ADN prin tehnici de biologie molecularăDiagnosticul indirect (util în infecţii post-streptococice)Evidenţierea Ac ASLO în cazul RAA (titru diagnostic > 200 UA/ml)

40

Page 41: Microbiologie Exam

Ac antistreptodornază B (titru diagnostic > 240 UA/ml) + ASLO în cazul GNA Dozarea Ac anti-hialuronidază (titru diagnostic > 350 UA/ml) şi anti-streptokinază (titru diagnostic > 160 UA/ml)

Diagnosticul scarlatinei Pentru identificarea eritemului scarlatinos se utilizează reacţia Schultz-Charlton (anti-eritrotoxina inoculată în erupţie determină dispariţia exantemului). Reacţia Dick pentru depistarea Ac anti-eritrotoxină (determinarea receptivităţii la scarlatină). I/dermic se inoculează 0,1 ml eritrotoxină. Rezultat pozitiv: peste 24 ore eritem local peste 10 mm (lipsa anti-eritrotoxinei, receptivitate). Rezultat negativ: absenţa eritemului (anticorpi prezenţi, persoană imună la scarlatină)

Profilaxia specifică a infecţiilor streptocociceVaccin contra S.pyogenes nu există (variabilitatea proteinei M, Ag comune cu ţesuturile umane)Femeile purtătoare de S.agalactiae sunt imunizate cu vaccin din polizaharide capsulareExistă un vaccin anti-pneumococic, constituit din antigene capsulare mai frecvent întâlnite în regiune Tratamentul infecţiilor streptocociceS.pyogenes este sensibil la penicilina G şi macrolide. Tratamentul anginelor previne complicaţiile post-streptococice.S.pneumoniae este sensibil la peniciline şi cefalosporine. Există tulpini rezistente la tetraciclină, eritromicină, macrolide.

84. Infectiile meningococice. Clasificarea meningococilor (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Infectiile cauzate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Metoda microscopica. Izolarea si identificarea culturii pure. Depistarea antigenelor meningococice in LCR. Profilaxia specifica.

Clasificarea (Bergey's 2001) :Familia – NeisseriaceaeGenurile - Neisseria, Kingella, Chromobacterium, Aquaspirillum Genul Neisseria include două specii patogene umane importante N. gonorrhoeae şi N.meningitidis (neisserii “pretenţioase”). Specii comensale, găzduite pe mucoasele tractului respirator şi digestiv, conjunctivă, vagin, uretra distală (neisserii “nepretenţioase”): Neisseria flava; Neisseria flavescens; Neisseria subflava; Neisseria perflava; Neisseria lactamica; Neisseria mucosa; Neisseria pharyngis; Neisseria polysaccharea; Neisseria sicca; Neisseria sp. In unele condiţii se pot comporta ca patogeni oportunişti. Caractere generale ale genului Neisseria. Coci gramnegativi, asociaţi în diplococi, uneori tetrade, imobili. Bacterii carboxifile, cu metabolism respirator. Catalazo- şi oxidazo-pozitive. Sunt găzduite pe mucoasele omului şi animalelor. Speciile patogene sunt exigente la cultivare

N.meningitidis se prezintă sub formă de coci imobili, gram-, in frotiu se aranjează in diplococi cu suprafeţele adiacente aplatizate sau puţin concave (aspect riniform, de “boabe de cafea”). Posedă capsulă şi fimbrii.Structura antigenică a N.meningitidis: Ag polizaharidice capsulare permit caracterizarea a 13 serogrupe: A, B, C, D, X, Y, Z, 29E, W135, H, I, K et L. Mai frecvent intâlnite sunt serogrupele A, B, C, Y şi W135. Ag proteice din membrana externă (cinci proteine majore) permit distincţia tipurilor serologice. Ag lipo-oligozaharidice (serotipuri). Aceste antigene servesc în calitate de markeri epidemiologici. Caractere de cultură. N.meningitidis este un mi/o carboxifil, foarte exigent la cultivare. Se cultivă doar pe medii îmbogăţite cu sânge sau ser: geloză-ser, geloză-sânge, geloză-ciocolată, mediul Mueller-Hinton şi preîncălzite în termostat. Coloniile S, mici (1-2 mm), cu marginile netede, bombate, translucide apar peste 24-48 ore de incubare la 37 C în atmosferă umedă îmbogăţită cu 5-10% CO2. Activitate biochimică. N.meningitidis posedă catalază şi oxidază, scindeaza glucoza şi maltoza fără a produce gaz.Rezistenţa în mediul extern: N.meningitidis este o bacterie deosebit de fragilă, sensibilă în special la desicare, radiaţii solare, variaţii de pH şi refrigerare; temperaturi sub 37 C determină autoliza bacteriilor. Factorii de patogenitate: Adezine (fimbriile şi proteine ale ME); Capsula – rol antifagocitar; sIg A-proteaza – descompune sIg A de pe mucoase; Endotoxina – declanşeaza secreţia diferitor cytokine; Receptori şi captatori de Fe (receptori membranari pentru transferină şi lactoferină, care permit captarea directa a Fe din aceste substanţe, precum şi extragerea lui directă din hemoglobină) Epidemiologia infectiilor meningocociceSursa de infecţie – bolnavii cu meningită sau rinofaringită meningococică sau purtătorii de germeniTransmiterea – aerogen, prin picături Pflugge, prin obiecte contaminate (jucării…) - exceptionalPatogeneza infectiilor meningocociceMeningococul aderă la epiteliul rinofaringelui, provocând sau o infecţie locală (rinofaringita), sau o infectie inaparentă. In caz de diminuare a rezistenţei organismului, bacteria trece în submucoasă şi apoi în circulaţia sanguină generală (meningococcemia). Această translocaţie este favorizată de inflamaţii rinofaringiene, în special virale. In circulaţia generală, graţie capsulei, bacteria este protejată de mijloacele de rezistenţă a organismului. Prin tropism pentru celulele plexului choroid, meningococul aderă la acest nivel şi, prin translocaţie, trece în spaţiul meningean, inducând meningita cerebrospinală. Odată cu dispariţia anticorpilor materni, N. meningitidis devine principala bacterie responsabilă de meningite la nou-născuţi. Ulterior, imunitatea antimeningococică se instalează progresiv şi frecvenţa meningitelor meningococice diminuează.Formele clinice de infectii meningocociceRinofaringita (forma clinică cea mai frecventă, deseori asimptomatică)Septicemia (meningococcemia). Reprezintă etapa a doua a maladiei. Complicaţii: meningococcemie fulminantă (sindromul Waterhouse-Friderichsen) în 10 - 20 % de cazuri (şoc endotoxinic, purpură extensivă indusă de coagulopatie de consumare (coagulare intra-vasculară diseminată)).Meningita cerebrospinală epidemică. Este precedată de o faringită şi însoţită de bacteriemie. Este caracterizată prin febră înaltă, cefalee, vomă, fotofobie, hiperestezie cutanată. Poate fi prezentă poziţia caracteristică în "cocoş de puşcă" dată de sindromul de contractură. Frecvent se întâlneşte herpesul labial, peteşii cutanate sau artralgii. Afectarea sistemului nervos se face în grade variabile, cu delir, agitaţie psihomotorie, somnolenţă, uneori comă, pareze şi paralizii, convulsii. Evoluţia în absenţa tratamentului se face spre deces în 80-90% din cazuri, restul prezentând sechele grave.Alte forme: infecţii bronhopulmonare, endocardite, pericardite, osteomielite, artrite (determinate de formarea de complexe imune), conjunctivite, angine. Diagnosticul de laborator al infectiilor meningococicePrelevate: in funcţie de forma clinică se prelevă exsudatul nasofaringean, sânge pentru hemocultură, LCR, lichidul articular, etc. Probele se prelevă înainte de a se administra antibiotice şi se transportă rapid la laborator, ferite de variaţii de temperatură şi lumină. La necesitate se utilizează mediul de transport Stuart

Diagnosticul directExamenul LCR este primordial pentru diagnosticul meningitei. Prelevat în condiţii aseptice prin puncţie lombară, în volum de 4-6 ml în 2 eprubete de centrifugă. LCR este tulbure, conţine mii sau zeci de mii de elemente celulare, cu predominanţa de 95-100% a neutrofilelor. Această reacţie celulară este insoţită de hipoglicorahie, de hiperalbuminorahie şi pH acid prin acumularea de acid piruvic şi lactic.

41

Page 42: Microbiologie Exam

Examenul microscopic al sedimentului LCR.Frotiuri colorate cu albastru de metilen sau Gram: diplococi Gram-negativi riniformi în pozitie intra şi extracelulară, dar densitatea bacteriană este scăzută, şi examenul este negativ în 1/3 cazuri. Prezenţa leucocitelor în număr mare pledează pentru un prognostic favorabil. b) RIF Examenul bacteriologic Sedimentul din LCR se însemânţează pe medii de cultură îmbogăţite, cum sunt geloza-sânge, geloza-ciocolată, mediul Mueller-Hinton preîncălzite la 37 C.Exsudatul nazofaringean se însemânţează imediat după recoltare pe medii cu adaos de antibiotice (lincomicină, vancomicină, ristomicină) pentru inhibarea altor specii microbiene existente în exsudat. Sângele pentru hemocultură se însemânţează direct pe medii de cultură lichide (bulion glucozat 2% respectând proporţia de 5 % sânge). Examinările se fac zilnic timp de 5-7 zile prin subculturi.Identificarea şi diferenţierea de neisseriile comensale se bazează pe aspectul morfologic pe frotiuri colorate Gram, prin testul oxidazei care este pozitiv, scindarea numai a glucozei şi maltozei, identificarea serologică prin RA cu seruri imune specifice de grup.Decelarea directă în sânge şi LCR a antigenelor polizaharidice capsulare, utilizând reacţiile de contraimunoelectroforeză, ELISA, latex şi coaglutinare cu antiseruri specifice de grup. Detectarea acizilor nucleici

Diagnosticul indirectDiagnosticul serologic. Pot fi titraţi Ac antimeningococici utilizând RA sau RHAI. Are valoare diagnostică redusă

Tratamentul trebuie instituit extrem de urgent, imediat după internare şi efectuarea puncţiei lombare. Tratamentul etiotrop constă în administrarea de antibiotice timp de 7-10 zile: Penicilină, Ampicilină, Cloramfenicol, Cefalosporine.Profilaxia specifică: imunizare activă cu vaccin polizaharidic antimeningococic monovalent sau polivalent (A, C, Y, W), care se poate administra intradermic sau subcutanat, după vârsta de 3 luni (pentru grupul A), oferind protecţie de 95-100% pentru o durată de 2-3 ani; polizaharidul capsular de grup B este un homopolimer al acidului sialic şi nu este imunogen pentru oameni. Contacţii vor fi supravegheaţi clinic timp de 10 zile. Chimioprofilaxia cu Penicilină V, timp de 7 zile, sau cu Rifampicină, 3 zile, se aplică în familii sau în colectivităţi de preşcolari Purtătorii, depistaţi în focar, vor fi trataţi timp de 7-10 zile cu Penicilină V.Cazurile de meningită sau meningococcemie vor fi declarate în 24 de ore de la depistare

85. Infectia gonococică. Clasificarea gonococilor (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Infectiile gonococice acute si cronice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Microscopia directa, izolarea si identificarea culturii pure. Particularitatile de recoltare a prelevatelor si de diagnostic a gonoreei cronice.

MICROBIOLOGIA ŞI DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL GONOREEIGonoreea este o uretrită specifică, cu eliminare masivă de puroi, mai aparent la barbati decât la femei. Termenul "gonoreea", a fost utilizat prima data de Galen în secolul II şi înseamnă “scurgerea seminţei". Multe secole gonoreea şi sifilisul erau confundate. Paracelsus (1530) credea ca gonoreea este un simptom precoce al sifilisului. Aceasta confuzie a fost întărită de medicul englez John Hunter, în 1767. Hunter intenţionat şi-a inoculat puroi de la un bolnav cu simptome de gonoree, îmbolnavindu-se de sifilis! Agentul cauzal al gonoreei, Neisseria gonorrhoeae, a fost descris pentru prima oară de A. Neisser în 1879 în puroi de la un bolnav de gonoree.

Neisseria gonorrhoeaeCaractere morfobiologiceNeisseria gonorrhoeae este un coc gram-negativ, cu diametrul de 0.6 - 1.0 µm, uzual observat în perechi cu suprafeţele concave alăturate. In prelevate patologice (puroi, exsudate) se localizează frecvent intracelular în leucocite polimorfonucleare (neutrofile). Imobil, posedă fimbrii cu lungimea de câţiva micrometri. În funcţie de prezenţa fimbriilor se cunosc patru tipuri de N. gonorrhoeae : T1, T2, T3, T4

Caractere de culturaGonococul este exigent la cultivare. Pentru izolarea lui se utilizează medii îmbogăţite cu ser sangvin, extract de drojdii, lichid ascitic, etc (mediul HYL, Thayer-Martin, geloză-ciocolată). Culturile cresc la 35-36 C în atmosferă umedă cu 5-10 % CO2. Peste 24-48 ore apar colonii mici (0,5-1mm), netede, translucide. După aspectul coloniilor pot fi descrise 4 tipuri: Colonii de tipul I şi II apar la izolare, corespund tulpinilor virulente, purtătoare de pili (fimbrii), Colonii de tipul III şi IV, apar la repicare, mai mari, corespund tulpinilor fără pili Structura antigenică: 3 proteine majore din ME (Por / PI, Opa/PII, PIII) definesc multiple serotipuri (variante). Opa prezintă o mare variabilitate antigenică, chiar în interiorul unei tulpini. Lipopolizaharidul din ME. Proteina fimbriilor, cu o mare diversitate antigenică.Caractere biochimice: gonococii sunt oxidazo-pozitivi, scindeaza doar glucoza pâna la acid, nu atacă maltoza

Factorii de patogenitate: Adezinele (fimbriile, unele proteine din membrana externă – Opa). sIgA-proteaze, cu rol in colonizarea mucoaselor. Proteine ale ME (Por), care inhibă formarea fagolizosomei (supravieţuirea şi multiplicarea gonococilor în fagocite). Endotoxina (rezistenţă la complement, secreţia citokinelor). Sisteme de captare a Fe (receptori membranari pentru transferină şi lactoferină). Variaţia antigenică rapidă a fimbriilor de adeziune şi a proteinei Opa (conversie, hipermutaţie, transformare)Gonococul este inhibat de bumbacul din tampoane (hipoclorit...). Pentru prelevări sunt indicate tampoane cu alginat de Ca sau din dacron.Epidemiologia infecţiei gonocociceSursa de infecţie – unica sursă este bolnavul cu gonoree, în special cu infecţie inaparentăTransmiterea - la maturi exclusiv prin contact sexual; la nou-născut – la trecerea prin canalul de naştere al mamei bolnavePatogeneza infecţiilor cauzate de N.gonorrhoeaeInfecţia gonococică este în general limitată la mucoasele cu epiteliu columnar. Mai frecvent implicată este uretra, cervixul, rectul, faringele şi conjunctiva. Epiteliul scuamos al vaginului nu este sensibil la infecţia cu N. gonorrhoeae. Totuşi, la fetiţe gonococul poate provoca vulvovaginite. Infecţiile mucoaselor sunt caracterizate uzual prin secreţii purulente. Patogeneza gonoreei - Prin intermediul fimbriilor şi a unor proteine din ME (Opa) gonococii aderă la vilozităţile celulelor epiteliale columnare neciliate. Urmează penetrarea lor în celulă (prin endocitoză), apoi vacuola este transportată la baza celulei, unde bacteria este eliberată prin exocitoză în ţesutul subepitelial. Pe parcursul infecţiei, lipopolizaharidul bacterian (LPZ/LOZ) şi peptidoglicanul sunt eliberate prin autoliza celulelor. Ambele substanţe activează complementul pe calea alternativă, LPZ de asemenea stimulează producţia factorului de necroză a tumorilor (TNF), care provoacă distugerea celulelor. Neutrofilele sunt imediat atrase în focar şi inglobeaza bacteriile. Mulţi gonococi sunt capabili să supravieţuieasca în interiorul fagocitelor până la moartea lor, cu eliberarea bacteriilor ingerate.Particularitaţile gonoreei la bărbaţi: In majoritatea cazurilor decurge acut (85-95%), fiind manifestată clinic: Uretrita (secreţie uretrală alb – galbuie, durere şi usturime la mictiune, dizurie) ; Prostatita; Orhita; Epididimita Particularităţile gonoreei la femei: In majoritatea cazurilor infecţia decurge asimptomatic (80% de cazuri), cu evoluţie spre cronicizare. Formele clinice: Cervicita, Uretrita, Bartolinita, Salpingita, Ovarita, Endometrita, Peritonita Alte forme clinice: Faringita şi proctita gonococică. Diseminarea infecţiei gonococice (1-3%) determină artrite, leziuni cutanate, septicemii, endocardite, meningite. Tulpinile de N. gonorrhoeae care cauzeaza infecţii diseminate sunt uzual rezistente la complement şi la reacţia bactericidă

42

Page 43: Microbiologie Exam

a serului. La nou-născut conjunctivita purulentă cu extinderea rapidă a infecţiei la globul ocular (ophtalmia neonatorum) poate fi urmare a contaminării la trecerea prin canalul de naştere Diagnosticul de laborator al gonoreeiPrelevate: La bărbaţi - secreţiile uretraleLa femei - secreţiile uretrale, vaginale, din endocol sau orificiile glandelor vulvarePot fi examinate conţinutul leziunilor cutanate, exsudat articular, nasofaringean, sânge, puroi din conjunctivă, LCR, tampon rectal. Pentru recoltarea acestor secreţii se foloseste un tampon de alginat de Ca (sau ansa bacteriologică), care este apoi trimis imediat în laborator pentru testare (dupa necesitate se foloseste mediul de transport Stuart cu tioglicolat şi cărbune activat). Daca eliminările sunt sărace, se procede la stimularea secreţiei (reactivare, provocare): Alimentară (cu bauturi alcoolice – bere); Chimică (instilaţii cu nitrat de Ag – sol. 1% in uretră, 10% în colul uterin); Biologică (inocularea gonovaccinului, recoltarea secreţiilor imediat dupa menstre la femei); Mecanică (masaj al prostatei); Termică (diatermie sau inductotermie) Examenul microscopic (elocvent doar în cazul uretritelor acute la bărbaţi). In frotiuri din puroiul uretral colorate Gram sau cu albastru de metilen se observă diplococi gram- situaţi intra- sau extracelular. RIFExamenul bacteriologic (este obligator în forme asimptomatice sau cronice)Gonococul fiind o bacterie foarte fragilă, este obligator de a însămânţa imediat prelevatele sau de a utiliza un mediu de transport adaptat. Pentru izolare se folosesc medii îmbogatite (ex.: mediul Thayer-Martin, care este bogat în factori de creştere şi conţine antibiotice (vancomicina, colistina, amfotericina) care inhibă alte bacterii din prelevat, geloza-ciocolata). Coloniile apar peste 18 - 24 h de incubare in atmosferă cu CO2.Identificarea N.gonorrhoeae se efectuează în baza caracterelor morfotinctoriale, aspectul coloniilor crescute pe medii selective, oxidaza +, scindarea doar a glucozei până la acid. Seroidentificarea cu Ac monoclonali în reacţia de Co-aglutinare Depistarea directă a N. gonorrhoeae în prelevate poate fi realizată prin tehnici ELISA sau RIFDetectarea acizilor nucleici prin hibridare sau amplificare genicăExamenul serologic (serodiagnosticul) RFCTratamentul gonoreei: Peniciline, Cefalosporine de generaţia III, Fluorochinolone, Cotrimoxazol Profilaxia gonoreei: Nespecifica (individuală sau generală), Prevenirea oftalmiei gonococice se efectueaza prin instilarea intraconjunctivală la nou-născuţi a soluţiei 1% de nitrat de Ag

86. Bruceloza. Clasificarea agentilor (familie, gen, sp.) . Patogeneza brucelozei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, izolarea si identificarea speciilor de brucele. Diagnosticul imunologic (reactiile Huddelson, Wright), intradermoreactia Burnet. Profilaxia specifica a brucelozei.

87. Tularemia. Clasificarea agentului patogen (familie, gen, sp.) . Patogeneza, formele clinice ale infectiei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, metoda biologica, izolarea si identificarea agentului. Metodele alergica si serologica. Profilaxia specifica a tularemiei.Zooantroponozele = maladii ale animalelor care pot fi transmise oamenilor în rezultatul unui contact direct sau indirect cu populaţii animale infectate. Unele dintre aceste infecţii - antraxul, tularemia, pesta, bruceloza – fac parte din categoria infecţiilor extrem de periculoase. Sunt foarte contagioase (transmitere aerogenă, alimentară, prin contact direct, receptivitate generală). Se manifestă nu doar ca epidemii, ci şi ca pandemii. Reprezintă infecţii cu evoluţie foarte gravă. Agenţii cauzali sunt rezistenţi în mediul extern.Clasificarea Familia FrancisellaceaeGenul FrancisellaSpecii: F.tularensis (agentul cauzal al tularemiei)

F.philomiragia (infectii sistemice)Se cunosc 4 biovaruri (subspecii) de F.tularensis, care diferă dupa activitatea biochimică, virulenţă şi răspândire geografică:

1. F.tularensis tularensis (nearctica) (tip A; foarte virulentă, raspândită în America de Nord)2. F. tularensis holarctica (palearctica) (tip B; mai puţin virulentă, cu raspândire în Europa) 3. F. tularensis mediasiatica: virulenţă similară cu F. tularensis holarctica4. F. tularensis novicida: virulenţă redusă, cauzeaza infecţie numai la gazde imunocompromise. Izolată în SUA.

Caracterele morfobiologice ale F.tularensisMorfologia: F.tularensis reprezintă o cocobacterie foarte mică (0.2-0.5 µm x 0.7-1.0 µm), gram-negativă, uneori se colorează mai intens la poli, pleomorfă, imobilă, asporogenă, tulpinile virulente posedă capsulă.Caractere de cultură: bacteria nu poate fi cultivată pe medii uzuale. Pentru izolare se utilizează medii îmbogăţite: mediul Francis (geloză + sânge de iepure + cisteină + glucoză); mediul McCoy (cu gălbenuş de ou); geloză-ciocolatăCultivă la 35 - 37 grade, în aerobioză. Peste 2-4 zile apar colonii S, mici (1 - 2 mm în diametru), albe-cenuşii, mucoide, cu marginile regulate şi suprafaţa lucioasă. Caractere biochimice: F.tularensis este catalazo+ şi oxidazo-, nu descompune ureea, produce H2S, unele biovaruri fermentează glicerolul. Rezistenţa în mediul extern: Mi/organismele pot supravieţui perioade îndelungate de timp în apă, nămol, cadavre de animale (mediu umed). F.tularensis este distrusă la 56 grade în 10 minute, dar congelarea permite conservarea bacteriei.Factorii de patogenitate : Capacitatea de a penetra în macrofage, supravieţuind şi multiplicându-se în interiorul celulelor până la moartea lor (parazitism facultativ intracelular); Capsula (rol protector); Endotoxina (LPZ)Sursa de infecţie – animale bolnave sau cadavre de animale, transmiterea de la om la om nu are loc. Rezervorul principal – mamifere mici şi medii (iepuri, veveriţe, şobolani, şoareci, rozătoare acvatice, lemingi). Omul, pisicile, câinii, anumite specii de păsări, peşti şi amfibii pot fi gazde accidentaleVectori – insecte (tăuni, ţânţari, căpuşe ) Porţi de intrare – tegumentul (chiar intact), mucoasele, conjunctivaTransmiterea: Contact cu animale infectate, cadavre sau cu apa contaminată (lacuri, bazine, etc); Aerogen prin inhalare (vânători...); Alimentar, prin consum de apă sau alimente infectate; Înţepătura artropodelor hematofage Francisella tularensis este una dintre cele mai virulente bacterii. Câteva zeci de mi/o (10-50) pot provoca suferinţe grave. Patogeneza şi formele clinice de tularemie: Francisella tularensis este o bacterie facultativ intracelulară. Iniţial infectează macro f age le , cu diseminarea mi/o şi afectarea diferitor organe, inclusiv plămânii, ficatul, splina, ganglionii limfatici. Un rol important în patogeneza leziunilor îl joacă hipersensibilitatea tardivă.Formele clinice de tularemie sunt în relaţie cu calea de pătrundere:

1. Forma ulceroganglionară (70-85% de cazuri), penetrarea agentului patogen prin tegument sau mucoase. Mi/o se multiplică local şi determină apariţia, peste 3-5 zile de la expoziţie, a unei papule la locul de inoculare. Peste cîteva zile se transformă în pustulă, care se ulcerează rapid. Ulcerul are 2 - 4 cm în diametru şi marginile neregulate. Uneori ulcerul poate fi acoperit cu o crustă neagră

43

Page 44: Microbiologie Exam

(asemănătoare cu escara în antrax). Bacteriile se răspândesc spre ganglionii limfatici regionali, unde cauzează limfadenite necrotice, înconjurate de infiltrate granulomatoase (bubonul tularemic). Ganglionii limfatici afectaţi devin fluctuanţi, uneori creând canale de drenare în tegument. Mi/o pot disemina hematogen infectând multiple organe, cu dezvoltarea septicemiei.

2. Forma ganglionară se manifestă prin afectarea ganglionilor limfatici regionali, leziunea de la poarta de intrare lipseşte.3. Forma oculoganglionară apare la pătrunderea agentului cauzal prin conjunctivă. Se dezvoltă necroza şi ulceraţia conjunctivei, cu

infiltraţie limfocitară. Din conjunctivă bacteriile trec în ganglionii limfatici preauriculari, submandibulari sau cervicali, provocând leziuni similare cu cele din tularemia ulceroganglionară.

4. Forma orofaringeană (angino-ganglionară). Mi/o intră prin mucoasa orofaringelui în urma ingestiei sau inhalării lor. Uzual se dezvoltă faringite sau tonzilite exsudative, cu ulceraţie ulterioară. Pătrunderea în ganglionii limfatici cervicali determină necroză şi supuraţie.

5. Forma tifoidică (abdominală), cu afecţiuni generalizate. Mi/o pătrund în sânge prin tegument sau mucoase şi afectează plămânii şi organele reticulo-endoteliale. Determină frecvent septicemie şi şoc

6. Forma pneumonică, foarte gravă. Mi/o pătrund în plămâni aerogen sau hematogen. Prelevate: în funcţie de forma clinică: serozitate din leziunea cutanată sau conjunctivă, exsudat faringean, punctat din ganglionul limfatic afectat, spută, sânge.Diagnosticul directExamenul microscopic direct este foarte dificil, aproape imposibil. RIF are o sensibilitate mai mare Examenul bacteriologic. Izolarea F.tularensis direct din prelevate este practic imposibilă. Uzual se utilizează inocularea prelevatelor la animale experimentale sensibile (şoareci, cobai). La necropsii se studiază frotiuri-amprente din organele afectate (Giemsa, RIF), se fac însămânţări pe medii speciale (Francis, Mc Coy). Tulpinile izolate sunt identificate morfologic, cultural, biochimic, antigenic (RA cu seruri anti-F.tularensis).Diagnosticul indirectSerodiagnosticul. Detectarea Ac este un element esenţial în diagnosticul tularemiei. Ac apar după ziua a 7 de boală, ating titrul maxim peste 1-2 luni (1:1000 sau mai mult) şi persistă mai mulţi ani. RA cu suspensie de bacterii omorâte este cea mai utilizată. Titrul diagnostic – 1:80, cu creşterea lui în dinamică de cel puţin 4 ori. ELISA este posibilă.Intradermoreacţia cu tularină. Hipersensibilitatea poate fi testată peste 5 zile de la debutul bolii. Tratamentul tularemiei: Antibiotice: aminozide (streptomicină, gentamicină), tetracicline, cloramfenicol, fluorochinolone, eritromicină (există şi tulpini rezistente).Profilaxia tularemiei: Informarea persoanelor expuse contaminării; Supraveghere sanitară; Vaccinarea contingentelor de risc cu vaccin viu atenuat asigură imunitatea pe o durată de 5-7 ani.

88. Antraxul. Clasificarea agentului patogen (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Formele clinice de antrax. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica. Izolarea si diferentierea de antracoizi. Metoda biologica, metodele rapide (reactia Ascoli), proba alergica. Profilaxia si tratamentul specific al antraxului.

Clasificarea:Familia BacillaceaeGenul: BacillusSpecii: Bacillus anthracis (patogen, agentul antraxului)

Bacillus cereus (intoxicaţii alimentare), Bacillus polymyxa (genul Paenibacillus), Bacillus brevis (genul Brevibacillus), Bacillus subtilis – bacili antracoizi, producenţi de AB

Bacillus anthracis a fost prima bacterie la care a fost demonstrat rolul ei în patogenia unei infecţii.În 1877, Robert Koch a izolat microorganismul în cultură pură, demonstrând capacitatea lui de a forma endospori şi a produs antraxul experimental inoculându-l la animale.

Caracterele morfobiologice ale B.anthracisBacil mare (5-6 µm x 1 µm), cu extremităţile drepte (tăiate), gram-pozitiv, imobil (antracoizii sunt mobili), în produse patologice se prezintă sub formă de lanţuri scurte, iar în cultură – lanţuri lungi (“tulpină de bambus”).Tulpinile virulente formează capsulă polipeptidică (acidul D-glutamic).Sporul este ovoid, în poziţie centrală, nu deformează celula. Sporogeneza are loc în cultură, în sol şi în ţesuturi şi exsudate din animale moarte (în prezenţa oxigenului), dar nu în sânge sau ţesuturi de animale vii. Caractere de culturăB.anthracis nu este exigent nutritiv, cultivă pe medii uzuale. Facultativ-anaerob, t optimă – 35-37 grade, pH 7-7,4.Peste 24 ore de incubare formează colonii R, mari, cu contur neregulat, opace, plate, uscate, rugoase (“coamă de leu”, “cap de meduză”). Nehemolitice pe geloză-sânge (antracoizii sunt hemolitici). Pe geloză-ser, în exces de CO2, formează colonii S (producerea capsulei). Pe mediu cu 0,5-1 UI de penicilină B.anthracis formează lanţuri din forme globulare - “colier de perle” (proprietate absentă la antracoizi).În bulion peptonat formează flocoane la fundul eprubetei, cu supernatantul clar. B.anthracis este sensibil la fagul gamma.Caractere biochimice: Activitate proteolitică – lichefiază gelatina în formă de “brad inversat”, peptonizează laptele, digeră serul coagulat, nu produce H2S. Activitate zaharolitică – fermentează unele glucide: glucoza, maltoza, zaharoza, tregaloza, etc. Nu fermentează lactoza şi arabinoza.Rezistenţa în mediul extern: formele vegetative sunt slab rezistente, sporii rămân viabili în sol decenii, se distrug la fierbere în 30-40 min.Factori de patogenitate Capsula polipeptidică, codificătă de plasmida pX02. Inhibă fagocitoza şi puterea bactericidă a sângelui. Capsula joacă un rol important în

etapele iniţiale ale infecţiei. Formarea capsulei are loc in vivo şi in vitro, pe medii cu ser şi în atmosferă cu 5 % CO2. Exotoxina antraxului, codificată plasmidic (pX01). Este constituită din 3 componente: Factorul I, edematogen (EF), care este o adenilat-ciclază. Acumularea de cAMP duce la modificarea permeabilităţii membranare cu producerea edemului. inta – celulele endoteliale (efect - oc Ț șhipovolemic, oc septic). ș Factorul III, letal (LF), responsabil de efectele letale ale toxinei anthrax. Este o protează Zn++ dependentă care induce producerea citokinelor de către macrofage şi limfocite (efect – rec ie inflamatoare, oc septic). ț ș Factorul II, antigen protector (PA), induce sinteza Ac antitoxici protectori. PA este responsabil de fixarea toxinei pe receptorii celulelor sensibile. Aparte, aceşti factori exercită activitate biologică nesemnificativă la animal. Din contra, combinaţii din doi sau trei factori toxici determină următoarele consecinţe la animale experimentale: PA+LF = activitate letală; PA+EF = produce edem ; PA+LF+EF = edem şi necroză cu efect letal; EF+LF = inactiv Acest experiment sugerează că toxina antraxului are structură clasică de citotoxină bacteriană de tip A-B cu PA în calitate de B-fragment (de fixare pe receptori celulari) şi cu factorii EF şi LF cu funcţie de fragment A (activ), care acţionează în interiorul celulei. Structura antigenică a B.anthracis: Ag polipeptidic capsular (induce Ac neprotectori); Ag polizaharidice somatice termostabile (depistate în reacţia de precipitare Ascoli); Toxina (componentul PA), induce formarea Ac protectori, neutralizanţi

44

Page 45: Microbiologie Exam

Sursa de infecţie – animalele erbivore bolnave de antrax (ovine, caprine, bovine, suine). Solul contaminat cu spori este un rezervor de germeni important şi permanent (decenii).Transmiterea: prin contact direct cu animalele bolnave sau produse contaminate (carne, piei, lână, blană, etc), păşuni şi nutreţuri contaminate, cu pătrunderea agentului prin tegumentul lezat. aerogen, prin inhalarea sporilor de B.anthracis. pe cale alimentară (consum de carne de la animale bolnave de antrax insuficient prelucrate termic) În majoritatea cazurilor antraxul se manifestă ca boală profesională a îngrijitorilor de animale, personalului de la abatoare, întreprinderi de prelucrare a produselor animaliere, veterinarilor, zootehnicienilor, măcelarilor, tăbăcarilor, etc.Formele clinice de antraxAntraxul cutanat , “pustula malignă” (forma cea mai frecventă). Sporii intră printr-o leziune a tegumentului, germinează şi proliferează la poarta de intrare, cu dezvoltarea unui edem gelatinos local caracteristic. La poarta de intrare, peste 12-36 ore de la penetrare, apare o papulă, care evoluează rapid într-o veziculă, apoi în pustulă cu conţinut sanguinolent. La spargerea pustulei se formează o leziune necrotică, prezentând în centru o escară neagră înconjurată de vezicule satelite. Leziunea se localizează mai frecvent pe mâini, faţă, ceafă, etc. Pătrunderea în sânge determină diseminarea sistemică a bacteriei.Antraxul pulmonar apare la inhalarea sporilor de B. anthracis , care sunt înglobaţi de macrofagele alveolare unde ei germinează şi se multiplică, determinând o pneumonie foarte gravă cu edem. Urmează infectarea ganglionilor limfatici mediastinali cu dezvoltarea unei necroze hemoragice. Pacientul manifestă febră, stare de rău, mialgie, tuse ne-productivă. Din ganglionii limfatici infecţia poate trece în sânge.Decesul poate surveni în 24 h. Antraxul digestiv apare în urma consumului de carne infectată. În mucoasa intestinală se dezvoltă procese identice cu cele din antraxul cutanat (enterocolită ulceroasă). Clinic: vomă şi diaree, cu sânge în masele fecale. Poate urma invazia ganglionilor limfatici mezenterici şi a sângelui, asociată cu prostraţie profundă, şoc şi moarte.Meningita poate apare (foarte rar) ca urmare a oricărei forme de antrax.Prelevate (în funcţie de forma clinică): exsudat din leziunea cutanată, spută, sânge, LCR, materii fecale, bioptate din ganglioni limfatici, probe necroptice, probe de la animalul suspect şi elemente din mediul extern Examenul microscopic: direct, RIF. În frotiuri pregătite din prelevate şi colorate Gram sau cu albastru de metilen se observă bacili mari cu morfologia caracteristică, izolaţi sau în lanţuri scurte. Sporii sunt rareori prezenţi.Examenul bacteriologic Prelevatele monomicrobiene se însămânţează pe geloză şi geloză-sânge, iar cele polimicrobiene se încălzesc în prealabil 10 min la 75 grade C. Incubarea la 37 C timp de 24 ore. Sângele – în bulion glucozat, repicări zilnice timp de 7 zile pe geloză-sânge. Examinarea coloniilor crescute, selecţia celor suspecte şi acumularea lor. Identificarea culturii pure acumulate şi diferenţierea de antracoizi. Examenul biologic - Se inoculează prelevatele la cobai sau şoareci, care sunt foarte sensibili la infecţie. După moartea lor (36-48h) bacilii sunt depistaţi în frotiuri din sânge şi organe. Depistarea Ag polizaharidice termostabile în prelevate (reacţia de precipitare inelară Ascoli)Diagnosticul serologic. Ac anti-antrax pot fi depistaţi la convalescenţi în RP sau RFCDiagnosticul imunologic (proba cutanată alergică). Se pune în evidenţă starea de hipersensibilizare prin inocularea intradermică a 0,1 ml de antraxină (extract din tulpina vaccinantă de B.anthracis). Reacţie pozitivă – edem şi hiperemie cu diametrul de peste 8 mm.Tratamentul antraxului: Antibiotice (peniciline, cefalosporine, fluorochinolone); Imunoglobulina antiantraxProfilaxia specifică a antraxului Depistarea şi izolarea animalelor bolnave, incinerarea animalelor moarte sau îngroparea adâncă a cadavrelor şi acoperirea cu var nestins. Vaccinarea animalelor. Imunizarea personalului expus cu vaccin viu atenuat , vaccin acelular (elaborat din tulpini acapsulate avirulente, con inând proteina PA). În curs de elaborare – vaccin cu PA i antigen capsular.ț ș

89. Pesta. Clasificarea agentului patogen (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Formele clinice de pesta. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Regulile de recoltare, transportare si examinare a prelevatelor. Metodele microscopica, bacteriologica si serologica. Profilaxia specifica a pestei.Pesta (din latină pestis, maladie contagioasă) este o maladie cu multiple fațete mortale pentru om. Ea este cauzată de Yersinia pestis, descoperită de Alexandre Yersin de la Institutul Pasteur în 1894.Clasificare Familia Enterobacteriaceae, Genul Yersinia, Specia Yersinia pestis. Se disting 3 varietă i de tulpini - ț orientală, medievală iș antică.Caractere morfotinctoriale – yersiniile reprezintă bastona e drepte, uneori coco-bacterii Gram negative, uneori colorate bipolar, acapsulate, șasporulate, imobile la 37 C.Caractere de cultură – yersiniile sunt mi/o anaerobe facultative, cultivă pe medii uzuale la 25-28 C. În BP cultura se manifestă printr-un voal la suprafa ă i un aspect floconos în interior. Pe geloză peste 48h apar colonii R mari, cu margini ț șneregulateActivitate biochimică – catalaza+, oxidaza-, fermentează glucoza, reduce nitra ii în nitri i. ț țRezistenta: Yersiniile sunt rezistente în mediul extern şi în cadavre de animale.După înţepătura unui purice infectat, germenul se multiplică la locul de inoculare cu formarea unei vezicule-pustule apoi pătrund în sistemul limfatic iș colonizează ganglionii regionali în care se multiplică. Peste 2-5 zile apar semne de limfadenită hemoragică (bubonul pestos). Pesta bubonică – 90% din cazurile de pestă. Diseminarea hematogenă permite bacteriilor să atingă ansamblul organelor cu apari ia semnelor clinice de ț septicemie. Afectarea plămânilor duce la pesta pulmonară secundară, cu expectora ii sanguinolente bogate în germeni, foarte contagioase. Contactul cu ace ti pacien i duce, prinț ș ț contact direct, la apari ia ț pestei pulmonare primare care prezintă o mortalitate de 90-100% în lipsă de tratament. Prelevate: punctat din bubon, spută, sânge. Toate prelevatele de la o persoană infectată sunt foarte contagioase i manipularea lor cere măsuri șspecial de precau ie.țExamenul direct Examenul microscopic al punctatului din bubon colorat Gram sau Giemsa poate fi evocator (bacterii Gram-, ovoide, cu colora ie țbipolară). RIF nu este destul de semnificativ, deoarece există rec ii încruci ate cu alte yesinii. ț ș Examenul bacteriologic (izolarea culturii pure cu identificarea ei ulterioară) este o investiga ie de bază. țÎn pesta pulmonară, diagnosticul este confirmat prin izolarea culturii din spută sau din aspirat bron ic. Hemocultura (izolarea culturii din sânge) șreprezintă examenul-cheie în forma septicemică. Pot fi examinate i probe necroptice, deoarece germenul este foarte rezistent în cadavre în curs șde putrefac ie. Depistarea rapidă a antigenelor F1.țTratamentul pestei: Antibiotice (streptomicină, gentamicină, doxiciclină, cloramfenicol)Profilaxia pestei: Izolarea bolnavilor; Persoanele de contact – carantină 6 zile

90. Gangrena gazoasa. Clasificarea agentilor etiologici (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate (exotoxine, enzime). Manifestarile clinice in dependenta de specia microbiana. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, izolarea si identificarea culturii pure. Diagnosticul rapid. Profilaxia si tratamentul specific al gangrenei gazoase.Particularităţi ale bacteriilor anaerobe: Oxigenul este toxic (lipsa superoxid dismutazei/catalazei, peroxidazei); Cresc în lipsa oxigenului/potenţial redox scăzut; Energia este obţinută prin fermentare

45

Page 46: Microbiologie Exam

Circumstanţe ce favorizează infecţiile cu anaerobi: Hipoxii tisulare (ateroscleroză, necroză, tumoare malignă, corp străin...); Tratament prelungit cu aminozide; Stări de imunosupresie sau imunodepresieCLASIFICAREA ANAEROBILORBacterii telurice (sporogene). Prezente în sol, supravieţuesc graţie sporilor termorezistenţi.Familia Bacillaceae, Genul Clostridium, C. perfringens, C.septicum, C.novyi (oedematiens), C.histolyticum – agenţii gangrenei gazoase; C.tetani – agentul tetanosului; C.botulinum – agentul botulismului; C.difficile – agentul colitei pseudomembranoase. Patogene, provoacă infecţii specifice necontagioase CLOSTRIDIILE GANGRENEI GAZOASEAgenţii cauzali: C.perfringens (serotipuri A, B, C, D, E); C.novyi (oedematiens); C.septicum; C.histolyticumCaractere morfotinctoriale: C. perfringens - bastonaş gram+ imobil, capsulat, sporogen (sporul oval sau rotund, central sau subterminal, deformează celula bacteriană). Alte clostridii – mobile, necapsulateMedii de cultură: Kitt-Tarrozzi regenerat, geloză-sânge glucozată, geloză cu gălbenuş de ou şi lactoză, Wilson-Blair Colonii – C.perfringens – lenticulare, hemolitice, clostridiile mobile – colonii R, pufoase. Manifestă activitate proteolitică (digestia cazeinei, producerea H2S, gelatinaza) şi zaharolitică cu producere abundentă de gaz.TOXINE: Toxina alfa (lecitinaza) – mionecroză, hemoliză, trombocitoliză, dereglări de coagulare, creşterea permeabilităţii vasculare, inactivarea ATPazei musculare, hipotensiune, bradicardie, şoc; Toxina teta – necrozantă, hemolitică; Toxina beta – necroza epiteliului intestinal; Enterotoxina – perturbă transportul apei, ionilor şi a glucozei prin membrana enterocitelorENZIME DE PATOGENITATE: colagenaza (toxina kappa), proteinaza (toxina lambda), elastaza, hialuronidaza (toxina Mu), ADN-aza (toxina Nu), etc. CAPSULA – rol antifagocitarHABITAT – sol, apă, aer, praf; Intestin, vagin, tract respirator superior (om şi animale)Forme clinice: Gangrena gazoasă (post-traumatică, post-operatorie); Mionecroze ; Celulite, fasciite; Septicemii; Toxiinfecţii alimentare; Enterita necrozantăPatogenia gangrenei gazoase - Porţi de intrare – tegumentul sau mucoasele lezate.Omul se contaminează: Exogen - bacteria sau sporul pătrunde în plaga contaminată cu sol, apă, praf (accidente rutiere, de muncă, etc.) – gangrena gazoasă post-traumatică; gangrena gazoasă uterină (urmare a avortului septic).Endogen – flora internă a bolnavului contaminează plaga (chirurgie septică viscerală, chirurgia ortopedică, etc) - gangrena gazoasă post-operatorie. Gangrena spontană – in cancer intestinal.Condiţii suplimentare pentru apariţia infecţiei:

1. Traumatisme cu necroză tisulară, hematom, corpuri străine2. Penetrare profundă a germenului 3. Potenţial rH2 scăzut (- 0,5 V)4. Multiplicarea bacteriilor aerobe asociate (enterobacterii, enterococi, stafilococi)5. Imunitate deficitară (radioterapie, imunosupresori, antibioticoterapie neadecvată, etc)6. Injecţia substanţelor vasoconstrictive

Multiplicându-se bacteriile degradează ţesuturile, distrugându-le din aproape în aproape, fiind responsabile de extensia infecţiei şi de toxemie. Produsele gazoase formate produc disecţia ţesuturilor.Clinic: durere locală, edem, mionecroză, crepitaţie la palpare, scurgeri sero-hemoragice, stare generală gravă (febră, hipotensiune, bradicardie, perturbări de coagulare, şoc, posibil deces)Alte forme clinice cauzate de C. perfringens – celulite, fasciite, enterită necrozantă, toxiinfecţii alimentare

DIAGNOSTICUL GANGRENEI GAZOASE Clinic – crepitaţie, miros fetid, scurgeri hemoragice din plagă. Confirmare prin diagnostic microbiologicPrelevate: puroi, sânge, lichid seros, bioptate. Precauţii la prelevare: excluderea contactului cu aerul, transportare imediată sau utilizarea mediilor de transport lipsite de oxigen.Examenul microscopic – bastonaşe gram+, în cantităţi mari, asociate cu reacţie leucocitară slabă – Intervenţie chirurgicală imediată !!!!!Examenul bacteriologic – condiţii anaerobe (anaerostat, gaz-pachete, medii anaerobe), metode clasice (Zeissler, Weinberg). Important: bacterii aerobe sau facultative asociateTehnici de amplificare genică Diagnostic rapid – Mediul Kitt-Tarrozzi, mediul cu lapte, mediul Wilson-Blair Tratament: Chirurgical (debridarea plăgilor, eliminarea maselor necrotizate şi a corpurilor străine, drenarea); Administrarea serului antitoxic polivalent (anti-C.perfringens, C.novyi, C.septicum); Antibioterapia cu asociaţii de antibiotice (beta-lactamine, aminozide, metronidazol); Oxigenoterapia hiperbară – incizii cutanateProfilaxia: prelucrarea minuţioasă a plăgilor, eliminarea corpurilor străine şi a ţesuturilor necrotice, seroterapie preventivă, anatoxina, antibioterapie, supravegherea bolnavilor

91. Tetanosul. Clasificarea agentului (familie, gen, sp.), factorii de patogenitate. Patogeneza tetanosului, evolutia simptomelor clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, izolarea si identificarea culturii pure. Profilaxia si tratamentul specific al tetanosului.Agentul cauzal – C.tetaniCaractere morfotinctoriale – bastonaş mobil, cu flageli peritrichi, sporogen. Sporul rotund este plasat terminal (bastonaş de tobă). Gram+. Inert biochimic.Rezistenţa – forma vegetativă este sensibilă, sporul supravieţuieşte în sol decenii.Toxina tetanică: Tetanolizina – hemoliză; Tetanospasmina – contracturi ai muşchilor striaţi. Compusă din 2 fragmente proteice: fragmentul A (toxic, neimunogen) şi fragmentul B (atoxic, imunogen).

Habitat – sol, intestinul omului, animalelorPorţi de intrare – tegumentul, mucoasele lezate (plăgi, arsuri, mucoasa uterină post-partum, intervenţii chirurgicale, ulcere varicoase, focare dentare, droguri intravenoase, etc.), cordonul ombilical la nou-născuţi.C. tetani este o bacterie ne-invazivă, multiplicându-se la poarta de intrare şi elaborând toxina, care difuzează în organism.Mecanismul de acţiune al toxinei: la nivelul plăcii motrice neuro-musculare toxina completă penetrează într-o veziculă de endocitoză, fiind transportată pe calea retro-axonală până la prima sinapsă a măduvei spinării. Aici toxina traversează spaţiul intersinaptic şi urmează calea spre SNC. Locul de atac al toxinei îl constituie sinapsa dintre motoneuron şi neuronii căilor de inhibiţie. Tetanospasmina blochează eliberarea glicinei (inhibitor al motoneuronului) de către interneuron şi permite contracţia simultană a perechilor de muşchi protagonist-antagonist, producând paralizie spastică (rigidă) Clinica tetanosului: Incubaţia – 6-15 zile (3 zile-3 săptămâni). Semne clinice – trismus (contractură dureroasă a muşchilor masticatori), facies sardonicus (contracţii ale muşchilor feţei), anxietate, contracturi generalizate cu paroxisme spontane sau declanşate de stimuli externi (zgomot,

46

Page 47: Microbiologie Exam

lumină, etc), poziţia corpului în formă de arc (opistotonus), dereglări de vorbire. Febra lipseşte. Moarte prin asfixie (spasm laringean) sau stop cardiac. Diagnostic de laborator. Prelevate: secreţii din plagă, material de pansament, medicamente, etc. Examenul microscopic (de orientare). Examenul bacteriologic (tardiv, de confirmare). Examenul biologic (depistarea toxinei prin infectarea şoriceilor cu apariţia semnelor clinice ale maladiei peste 24-48 ore), identificarea toxinei prin RN cu anti-seruri. Examenul serologic – dozarea antitoxinelor pentru studierea imunităţii populaţiei (RP, RLA, RHAI, ELISA)Tratament: Ser imun antitetanic (gama-globulină specifică) intramuscular, intravenos; Anatoxină tetanică; Tratament simptomatic (sedative, miorelaxante, antibioterapie, respiraţie asistată, etc)Profilaxie: Imunizarea activă cu anatoxină tetanică (conform calendarului vaccinării – ADTP, ADT, AT); În caz de plagă: prelucrarea corectă, anatoxină, ser imun antitoxic

92. Botulismul. Clasificarea agentului cauzal (familie, gen, sp.), factorii de patogenitate. Patogeneza botulismului, principalele simptome clinice ale intoxicatiei botulinice. Diagnosticul microbiologic. Materiale de examinat. Depistarea si identificarea toxinelor botulinice. Izolarea si identificarea C.botulinum. Profilaxia si tratamentul specific al botulismului.Agentul cauzal – C.botulinumCaractere morfotinctoriale – bastonaş mobil, sporogen, gram+. Sporul este ovoid, subterminal (aspect de rachetă de tenis), termorezistent, distrus la 120 grade – 15 minute (autoclavare). Scindează proteinele şi glucidele cu formare de gaze şi acizi (acetic, butiric, lactic, etc).Factori de patogenitate – toxina botulinică serotipuri A,B,C,D,E,F,G. Este de natură proteică, antigenică, specifică de tip, transformabilă în anatoxină. Doza letală pentru om – 1-2 μg. Stabilă în mediu acid şi la acţiunea enzimelor digestive. Poate fi distrusă prin încălzire 15 min la 80 grade sau 10 min la 100 grade.Habitat mixt – sol, ape şi flora comensală a omului şi animalelorTransmiterea: Alimentar (alimente conservate în casă: cârnaţi, şuncă, jambon, peşte sărat sau afumat, conserve de fructe şi legume)Condiţii favorabile toxigenezei: Salinitate insuficientă (mai mică de 10 %); -Temperatura peste 16 grade; Anaerobioză (alimente compacte sau ambalaje ermetice); -Prezenţa glucidelor (conserve de fructe, legume); Timp suficient pentru producerea toxinei (cel puţin 8 zile)Botulismul infantil apare la sugari sub 6 luni (germinarea în intestin a sporilor vehiculaţi prin alimente)Perioada de incubaţie – 18-96 oreToxina ingerată este absorbită în sistemul limfatic intestinal, apoi în sânge. Acţionează la nivelul periferic asupra sinapselor cu acetilcolina ca mediator (joncţiunile neuro-musculare).Mecanismul acţiunii botulotoxinei: inhibă eliberarea acetilcolinei din veziculele sinaptice rezultând blocarea stimulării nervoase a muşchiului (paralizii flasce).Semne clinice : Paralizii în sfera nervilor cranieni: diplopie, ptoză palpebrală, midriaz, disfagie, disartrie, senzaţie de sete; Paralizii descendente; Dereglări digestive: nausee, vomă, constipaţie; Lipsa febrei şi a dereglărilor cardiaceCauza decesului: paralizie flască a muşchilor respiratori sau stop cardiacDiagnostic microbiologicPrelevate: ser sangvin, extract din alimente, mase vomitive, mase fecaleDepistarea toxinei (RN pe şoareci, RP, RHAI, RCoA, RLA, ELISA)Tehnici de biologie molecularăExamenul bacteriologic este suplimentar!

TRATAMENTUL ŞI PROFILAXIA BOTULISMULUITratament specific: seroterapie precoce (ser polivalent, apoi monovalent) asociată cu anatoxinoterapieProfilaxie: nespecifică

93. Difteria. Clasificarea agentului patogen (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Patogeneza difteriei si formele clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate patologice. Microscopia directa, izolarea si identificarea culturii pure (proba Pizu, Zacs, determinarea toxigenezei, diferentierea biovariantelor). Profilaxia si tratamentul specific al difteriei.DIFTERIA – toxiinfecţie acută, caracterizată printr-o angină pseudo-membranoasă cu efecte toxice la distanţă (miocardul, SNC şi rinichii).DIFTERIA – toxiinfecţie acută, caracterizată printr-o angină pseudo-membranoasă cu efecte toxice la distanţă (miocardul, SNC şi rinichii).Este provocată de mi/o din genul Corynebacterium.Este provocată de mi/o din genul Corynebacterium.Genul Corynebacterium se caracterizează prin prezenţa in componenţa peretelui celular:Genul Corynebacterium se caracterizează prin prezenţa in componenţa peretelui celular:

oo Acidului mezo-diaminopimelicAcidului mezo-diaminopimelicoo Acizilor micolici cu catenă scurtă (22-38 atomi de C)Acizilor micolici cu catenă scurtă (22-38 atomi de C)oo Conţinutul GC între 46-74 %.Conţinutul GC între 46-74 %.

Prezintă asemănări cu mi/o din genurile Mycobacterium şi Nocardia.Prezintă asemănări cu mi/o din genurile Mycobacterium şi Nocardia.

ClasificareaClasificarea genului Corynebacterium genului Corynebacterium Corinebacterii fitopatogeneCorinebacterii fitopatogene Corinebacterii patogene pentru animale, care afectează accidental omul: Corinebacterii patogene pentru animale, care afectează accidental omul: C.pseudotuberculosis, C.ulceransC.pseudotuberculosis, C.ulcerans Corinebacterii cu tropism uman:Corinebacterii cu tropism uman:

Specie patogenă: Specie patogenă: C.diphtheriaeC.diphtheriae (biovaruri (biovaruri gravis, mitis, intermediusgravis, mitis, intermedius))Specii comensale (specii pseudodifterice, difteroizi): Specii comensale (specii pseudodifterice, difteroizi): C.xerosis, C.pseudodiphthericum, C.jeikeiumC.xerosis, C.pseudodiphthericum, C.jeikeium, etc, etcCaractere morfotinctorialeCaractere morfotinctoriale ale ale C.diphtheriaeC.diphtheriaeBacterii (bastonaşe) drepte sau puţin încurbate, cu extremităţile rotunjite sau îngroşate (aspect de halteră sau de măciucă). În frotiuri se Bacterii (bastonaşe) drepte sau puţin încurbate, cu extremităţile rotunjite sau îngroşate (aspect de halteră sau de măciucă). În frotiuri se aranjează ungiular, în palisade sau sub forma caracterelor chinezeşti, cifre romane sau litere majuscule: Y, M, N, V... Imobile, aranjează ungiular, în palisade sau sub forma caracterelor chinezeşti, cifre romane sau litere majuscule: Y, M, N, V... Imobile, aasporogene, sporogene, nenecapsulate.capsulate.Se colorează Se colorează G+G+, pentru evidenţierea granulaţiilor de volutină - Loeffler, Neisser., pentru evidenţierea granulaţiilor de volutină - Loeffler, Neisser.Caractere de cultură şi biochimiceCaractere de cultură şi biochimiceC.diphtheriaeC.diphtheriae este o specie facultativ anaerobă, posedă catalază, citocromi a,b,c, oxidazo-. este o specie facultativ anaerobă, posedă catalază, citocromi a,b,c, oxidazo-.Temperatura optimă de cultivare 37Temperatura optimă de cultivare 37°°C, pH 7,4.C, pH 7,4.

Medii de cultură elective: Medii de cultură elective: Mediul Loeffler (ser bovin coagulat): colonii S, mici, netede, opace, albe-cenuşii, Mediul Loeffler (ser bovin coagulat): colonii S, mici, netede, opace, albe-cenuşii, apar apar peste 16-24 ore de cultivare; peste 16-24 ore de cultivare; Geloză-sângeGeloză-sângeMedii de cultură selective diferenţiale: Medii de cultură selective diferenţiale: Mediul Clauberg (geloză-sânge cu telurit de potasiu). Mediul Clauberg (geloză-sânge cu telurit de potasiu). C.diphtheriae gravis:C.diphtheriae gravis: colonii R, mari, negre, colonii R, mari, negre, crenelate, aspect de “floare de margaretă”, nehemolitice; crenelate, aspect de “floare de margaretă”, nehemolitice; mitismitis: colonii S, mijlocii, negre, bombate, cu zonă de hemoliză; Mediul Tinsdale (geloză-: colonii S, mijlocii, negre, bombate, cu zonă de hemoliză; Mediul Tinsdale (geloză-ser-cistină-telurit de potasiu-tiosulfat) - colonii negre cu halou brun ; Mediul Bucin (geloză-sânge cu hinozol) – colonii albastreser-cistină-telurit de potasiu-tiosulfat) - colonii negre cu halou brun ; Mediul Bucin (geloză-sânge cu hinozol) – colonii albastreMedii de transport: Medii de transport: geloză-ser semilichidă cu telurit de K; Mediul OCST (ou-cistină-ser-telurit)geloză-ser semilichidă cu telurit de K; Mediul OCST (ou-cistină-ser-telurit)

47

Page 48: Microbiologie Exam

Activitatea biochimică a C.diphtheriae:Activitatea biochimică a C.diphtheriae: Proteolitică: Proteolitică: UUreaza- (testul Zaks), cistinaza+ (testul Pizu), indol-. Zaharolitică: reaza- (testul Zaks), cistinaza+ (testul Pizu), indol-. Zaharolitică: GravisGravis: glucoza+, amidon+, zaharoza-; : glucoza+, amidon+, zaharoza-; MitisMitis: glucoza+, amidon-, : glucoza+, amidon-, zaharoza-. Se disting 22 lizotipuri de zaharoza-. Se disting 22 lizotipuri de C.diphtheriaeC.diphtheriae şi multiple serogrupuri (antigen O polizaharidic) şi serovaruri (antigen K proteic). şi multiple serogrupuri (antigen O polizaharidic) şi serovaruri (antigen K proteic).Factori de patogenitateFactori de patogenitate

1.1. Toxina difterică - origine proteică, secretată de tulpinile lizogene (profagi Tox+), Toxina difterică - origine proteică, secretată de tulpinile lizogene (profagi Tox+), în prezenţa unor cantităţi reduse de Fe. în prezenţa unor cantităţi reduse de Fe. Exotoxină tipicăExotoxină tipică (fragmente polipeptidice A şi B). (fragmente polipeptidice A şi B). Mecanismul de acţiuneMecanismul de acţiune - stoparea sintezei proteice prin inactivarea factorului de elongare EF-2 - stoparea sintezei proteice prin inactivarea factorului de elongare EF-2 (activitate de ADP-riboziltransferază). Conduce la moartea celulei afectate.(activitate de ADP-riboziltransferază). Conduce la moartea celulei afectate. Toxina difuzează în organism perturbând funcţionarea Toxina difuzează în organism perturbând funcţionarea diferitor organe (SNC, cord, rinichi). Poate fi transformată în anatoxină, utilizată în vaccinare.diferitor organe (SNC, cord, rinichi). Poate fi transformată în anatoxină, utilizată în vaccinare.

2.2. Enzime de patogenitate: hialuronidaza, neuraminidazaEnzime de patogenitate: hialuronidaza, neuraminidaza

Sursa de infecţieSursa de infecţie: bolnavul cu difterie şi purtătorii sănătoşi de germeni (colonizează rinofaringele, rareori tegumentul sau conjunctiva).: bolnavul cu difterie şi purtătorii sănătoşi de germeni (colonizează rinofaringele, rareori tegumentul sau conjunctiva).Mecanismele şi căile de transmitereMecanismele şi căile de transmitere: Direct pe cale aerogenă (picături) sau contact cu plăgi contaminate. Indirect prin obiecte (jucării, cărţi), praf : Direct pe cale aerogenă (picături) sau contact cu plăgi contaminate. Indirect prin obiecte (jucării, cărţi), praf sau alimente contaminate (lactate).sau alimente contaminate (lactate).La poarta de intrare bacteriile se multiplică şi provoacă un focar inflamator local, determinat de acţiunea toxinei, care fiind ulterior difuzată pe La poarta de intrare bacteriile se multiplică şi provoacă un focar inflamator local, determinat de acţiunea toxinei, care fiind ulterior difuzată pe cale limfo- şi hematogenă provoacă starea de intoxicaţie generală. Focarul inflamator se localizează în faringe (angina difterică), mai rar în laringe cale limfo- şi hematogenă provoacă starea de intoxicaţie generală. Focarul inflamator se localizează în faringe (angina difterică), mai rar în laringe (crupul difteric), nas, urechi, conjunctivă, mucoasa organelor genitale, plăgi cutanate. Leziunile locale se caracterizează prin inflamaţie fibrinoasă. (crupul difteric), nas, urechi, conjunctivă, mucoasa organelor genitale, plăgi cutanate. Leziunile locale se caracterizează prin inflamaţie fibrinoasă. Exotoxina cauzează necroză, dilatarea vaselor şi creşterea permeabilităţii, eliminarea fibrinogenului, care coagulează cu formarea unei Exotoxina cauzează necroză, dilatarea vaselor şi creşterea permeabilităţii, eliminarea fibrinogenului, care coagulează cu formarea unei pseudomembrane fibrinoase. Ea conţine bacterii, hematii, PMN şi celule necrozate. Se detaşează dificil, nu se dizolvă în apă, este reproductibilă pseudomembrane fibrinoase. Ea conţine bacterii, hematii, PMN şi celule necrozate. Se detaşează dificil, nu se dizolvă în apă, este reproductibilă in in situsitu în câteva ore. Membrana are tendinţă să se extindă. În forma malignă difteria este însoţită de edem al gâtului, semne toxice şi paralizia vălului în câteva ore. Membrana are tendinţă să se extindă. În forma malignă difteria este însoţită de edem al gâtului, semne toxice şi paralizia vălului palatin. Intoxicaţia generală afectează SN (disfagie, paralizii), sistemul cardio-vascular (miocardite), suprarenalele (insuficienţă a suprarenalelor),palatin. Intoxicaţia generală afectează SN (disfagie, paralizii), sistemul cardio-vascular (miocardite), suprarenalele (insuficienţă a suprarenalelor), rinichii (nefroză). Tulpini de rinichii (nefroză). Tulpini de C.ulceransC.ulcerans pot produce toxină identică cu cea difterică. pot produce toxină identică cu cea difterică.Metode de diagnosticMetode de diagnostic

1.1. Examenul microscopic (Gram, Loeffler, Neisser)Examenul microscopic (Gram, Loeffler, Neisser), m, microscopia icroscopia iimunofluorescentă munofluorescentă 2.2. Examenul bacteriologic (izolarea, identificarea culturii pure). Studierea toxigenezei – obligator. Se efectuează prin RN cu ser antitoxic Examenul bacteriologic (izolarea, identificarea culturii pure). Studierea toxigenezei – obligator. Se efectuează prin RN cu ser antitoxic in in

vivovivo (cobai), (cobai), in vitroin vitro (RP Elek), sau depistarea genei (RP Elek), sau depistarea genei ToxTox în prelevat sau în cultura pură prin PCR. în prelevat sau în cultura pură prin PCR.3.3. Examenul serologic – retrospectiv, Examenul serologic – retrospectiv,

RA cu seruri perechi (I săptămână şi a IIIa) şi cultură de RA cu seruri perechi (I săptămână şi a IIIa) şi cultură de C.diphtheriaeC.diphtheriae. . Titru sTitru semnificativ – emnificativ – 1:100 sau 1:100 sau creşterea titrului de Ac.creşterea titrului de Ac.Evaluarea titrului de antitoxine în serul bolnavului. La debutul bolii el este absent sau nu depăşeşte 0,5 UI/mlEvaluarea titrului de antitoxine în serul bolnavului. La debutul bolii el este absent sau nu depăşeşte 0,5 UI/mlReceptivitatea la difterieReceptivitatea la difterie poate fi determinată prin: Testul Schick ( poate fi determinată prin: Testul Schick (in vivoin vivo); RN ); RN in vitro; in vitro; RHAI; ELISA; RHAI; ELISA; Titru antitoxinelor Titru antitoxinelor >> 0,1 UI/ml – protector 0,1 UI/ml – protectorTitru inferior 0,01 UI/mTitru inferior 0,01 UI/mll – lipsa protecţiei – lipsa protecţieiTratamentul difteriei: Tratamentul difteriei: Seroterapie precoce (ser antitoxic antidifteric, Ig). Neutralizează activitatea toxinei, blocând fixarea ei pe receptorii Seroterapie precoce (ser antitoxic antidifteric, Ig). Neutralizează activitatea toxinei, blocând fixarea ei pe receptorii celulari. Antibioticoterapie (macrolide, tetracicline, cloramfenicol, aminozide, beta-lactamine). Asigură eradicarea germenilor. Tratament celulari. Antibioticoterapie (macrolide, tetracicline, cloramfenicol, aminozide, beta-lactamine). Asigură eradicarea germenilor. Tratament simptomaticsimptomaticProfilaxia specifică a difteriei: Profilaxia specifică a difteriei: Vaccinarea obligatorie a copiilor conform calendarului de vaccinări cu anatoxină difterică. Există vaccinuri Vaccinarea obligatorie a copiilor conform calendarului de vaccinări cu anatoxină difterică. Există vaccinuri asociate: ADT, ADTP.asociate: ADT, ADTP. Vaccinarea primara cu ADTP la 4-5-6 luni, revaccinarea la 22-24 luni cu ADTP, la 6-7, apoi la 14-15 ani cu ADT. Vaccinarea primara cu ADTP la 4-5-6 luni, revaccinarea la 22-24 luni cu ADTP, la 6-7, apoi la 14-15 ani cu ADT. Recent a fost Recent a fost obţinut un vaccin sintetic antidifteric. Reprezintă un polipeptid situat la joncţiunea fragmentelor A şi B a toxinei difterice, o moleculă peptidică obţinut un vaccin sintetic antidifteric. Reprezintă un polipeptid situat la joncţiunea fragmentelor A şi B a toxinei difterice, o moleculă peptidică “purtătoare” şi un adjuvant sintetic.“purtătoare” şi un adjuvant sintetic.

94. Tusea convulsiva. Clasificarea agentului cauzal (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Patogeneza tusei convulsive, stadiile bolii. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Izolarea (metode de insamintare) si identificarea culturii pure, metoda serologica. Profilaxia si tratamentul specific al tusei convulsive. FamiliaFamilia Halobacteriaceae HalobacteriaceaeGenulGenul Bordetella BordetellaSpecii:Specii:Bordetella pertussisBordetella pertussis (agentul tusei convulsive) (agentul tusei convulsive) Bordetella parapertussisBordetella parapertussis (agentul parapertusei) (agentul parapertusei)Bordetella bronhisepticaBordetella bronhiseptica (pneumonii, bacteriemii) (pneumonii, bacteriemii)Bordetella aviumBordetella aviumBordetella holmensiiBordetella holmensii (izolată din hemoculturi) (izolată din hemoculturi)Bordetella hinziiBordetella hinzii (izolată din prelevate respiratorii) (izolată din prelevate respiratorii)Bordetella trematumBordetella trematum (infecţii cutanate şi auriculare) (infecţii cutanate şi auriculare)

Caractere morfobiologice B. pertussisCaractere morfobiologice B. pertussisCocobacterii Cocobacterii G-G-, asporogene, imobile, formează microcapsulă, în frotiu se dispun separat, în perechi sau lanţuri scurte. Reprezintă mi/o strict , asporogene, imobile, formează microcapsulă, în frotiu se dispun separat, în perechi sau lanţuri scurte. Reprezintă mi/o strict aerobe, foarte pretenţioase la cultivare.aerobe, foarte pretenţioase la cultivare.Medii speciale de izolare:Medii speciale de izolare: mediul Bordet-Gengou (geloză-sânge cu amidon şi glicerină); geloză-cazeină-sânge-cărbune activat mediul Bordet-Gengou (geloză-sânge cu amidon şi glicerină); geloză-cazeină-sânge-cărbune activatMediul de transport KuzneţovMediul de transport Kuzneţov (soluţie tampon fosfat, 0,5% agar-agar, 0,2% cărbune activat) (soluţie tampon fosfat, 0,5% agar-agar, 0,2% cărbune activat)Peste 3-5 zile de incubare în atmosferă umedă la 37Peste 3-5 zile de incubare în atmosferă umedă la 37°° C apar colonii S mici, bombate, lucioase, cu aspect de picături de mercur, hemolitice C apar colonii S mici, bombate, lucioase, cu aspect de picături de mercur, hemolitice (corespund bacteriilor virulente – faza I), forme R – avirulente, faza IV.(corespund bacteriilor virulente – faza I), forme R – avirulente, faza IV.B.pertussis B.pertussis manifestă activitate biochimică redusă: oxidaza+, nu fermentează glucidele, ureaza-, nitrat-reductaza- .manifestă activitate biochimică redusă: oxidaza+, nu fermentează glucidele, ureaza-, nitrat-reductaza- .Structura antigenicăStructura antigenică a a B.pertussisB.pertussis este complexă: Ag capsulare polizaharidice; Ag proteice; Ag fimbrial ; (hemaglutinina); Ag lipopolizaharidic. este complexă: Ag capsulare polizaharidice; Ag proteice; Ag fimbrial ; (hemaglutinina); Ag lipopolizaharidic.Factorii de patogenitate. Factorii de patogenitate. Adezine: Adezine: Hemaglutinina filamentoasăHemaglutinina filamentoasă (purtată de pili). Permite ataşarea bacteriei la mucoasa tractului respirator, de (purtată de pili). Permite ataşarea bacteriei la mucoasa tractului respirator, de asemenea se fixează pe macrofagi şi limfocite. asemenea se fixează pe macrofagi şi limfocite. AglutinogeneAglutinogene. Proteine de suprafaţă situate pe fimbrii. Participă la ataşarea . Proteine de suprafaţă situate pe fimbrii. Participă la ataşarea B.pertussis B.pertussis la celulele la celulele epiteliale. epiteliale. PertactinaPertactina. Proteină a membranei externe, permite fixarea pe membrana celulelor eucariote . Proteină a membranei externe, permite fixarea pe membrana celulelor eucariote Subunitatea B a toxinei pertusiceSubunitatea B a toxinei pertusice. Se . Se fixează pe leucocite şi împiedică migrarea lor spre focarul inflamator. fixează pe leucocite şi împiedică migrarea lor spre focarul inflamator. Toxine: Toxine: Toxina pertussisToxina pertussis (citotoxină de tip A-B). Acţionează asupra (citotoxină de tip A-B). Acţionează asupra diferitor celule eucariote, mărind concentraţia intracelulară de AMP ciclic (în special în celulele epiteliale ale TR). Provoacă hiperlimfocitoză, diferitor celule eucariote, mărind concentraţia intracelulară de AMP ciclic (în special în celulele epiteliale ale TR). Provoacă hiperlimfocitoză, sensibilizare la histamină, hipersecreţie de insulină. sensibilizare la histamină, hipersecreţie de insulină. Adenilat-ciclaza-hemolizinăAdenilat-ciclaza-hemolizină. Hemolizina provoacă moartea macrofagelor şi monocitelor, . Hemolizina provoacă moartea macrofagelor şi monocitelor, adenilat-ciclaza perturbă activitatea bactericidă a PMN, monocitelor şi macrofagelor şi stimulează secreţia sero-mucoasă a căilor respiratorii. adenilat-ciclaza perturbă activitatea bactericidă a PMN, monocitelor şi macrofagelor şi stimulează secreţia sero-mucoasă a căilor respiratorii. Toxina dermonecroticăToxina dermonecrotică. Se eliberează în urma lizei bacteriene. . Se eliberează în urma lizei bacteriene. Toxina citotrahealăToxina citotraheală. Glicopeptid care inhibă sinteza ADN, provocând . Glicopeptid care inhibă sinteza ADN, provocând distrugerea celulelor ciliate distrugerea celulelor ciliate EndotoxinaEndotoxina

Sursa de infecţieSursa de infecţie – omul bolnav, în special în perioada de debut al bolii. – omul bolnav, în special în perioada de debut al bolii. Mecanismul de transmitereMecanismul de transmitere – aerogen, prin picături – aerogen, prin picături B.pertussisB.pertussis manifestă tropism pentru mucoasa căilor respiratorii: faringe, trahee, bronşii, bronhiole, chiar alveole. Alterarea epitelilului ciliat manifestă tropism pentru mucoasa căilor respiratorii: faringe, trahee, bronşii, bronhiole, chiar alveole. Alterarea epitelilului ciliat împiedică eliminarea mucusului, el fiind eliminat doar prin tuse. Tusea survine din cauza iritaţiei mucoasei de către endotoxina bacteriană. împiedică eliminarea mucusului, el fiind eliminat doar prin tuse. Tusea survine din cauza iritaţiei mucoasei de către endotoxina bacteriană.

48

Page 49: Microbiologie Exam

Excitaţia de lungă durată a receptorilor terminali ai nervului pneumogastric determină un flux continuu de impulsuri în bulbul rahidian, ce duce Excitaţia de lungă durată a receptorilor terminali ai nervului pneumogastric determină un flux continuu de impulsuri în bulbul rahidian, ce duce la formarea unui focat de excitaţie dominant. El atrage excitaţii nespecifice de la alţi receptori, fapt ce determină accesele de tuse, care devin tot la formarea unui focat de excitaţie dominant. El atrage excitaţii nespecifice de la alţi receptori, fapt ce determină accesele de tuse, care devin tot mai grave şi mai frecvente. Un stimul puternic poate stinge dominanta, cu atenuarea tusei. Focarul este foarte stabil, persistă şi după dispariţia mai grave şi mai frecvente. Un stimul puternic poate stinge dominanta, cu atenuarea tusei. Focarul este foarte stabil, persistă şi după dispariţia bacteriei din organism. În evoluţia tusei convulsive se disting 4 stadii (perioade):bacteriei din organism. În evoluţia tusei convulsive se disting 4 stadii (perioade):

Perioada de Perioada de incubaţieincubaţie (3-15 zile) (3-15 zile) Perioada Perioada cataralăcatarală, foarte contagioasă. Caracterizată prin tuse seacă, rinoree (3-14 zile), foarte contagioasă. Caracterizată prin tuse seacă, rinoree (3-14 zile) Perioada Perioada convulsivăconvulsivă (paroxistică). Accese de tuse spasmodică, epuizantă, asociată cu cianoză, vomă, convulsii. (2-4 săptămâni) (paroxistică). Accese de tuse spasmodică, epuizantă, asociată cu cianoză, vomă, convulsii. (2-4 săptămâni) Perioada de Perioada de convalescenţăconvalescenţă (2-4 săptămâni) (2-4 săptămâni)

Complicaţii grave sunt posibile la copiii sugari: bronho-pneumonii, encefalite. Imunitatea este durabilă, umorală. Rol protector au Ac anti-toxină Complicaţii grave sunt posibile la copiii sugari: bronho-pneumonii, encefalite. Imunitatea este durabilă, umorală. Rol protector au Ac anti-toxină pertussis şi anti-hemaglutinină filamentoasă.pertussis şi anti-hemaglutinină filamentoasă.

PrelevatePrelevate: mucozităţi nasofaringiene sau bronşice, recoltate cât mai precoce.: mucozităţi nasofaringiene sau bronşice, recoltate cât mai precoce.Metode de diagnostic: Metode de diagnostic: RIF; Examenul bacteriologic (însămânţare cu tamponul sau prin tehnică “plăcilor tuşite”); Tehnnici de biologie molecularăRIF; Examenul bacteriologic (însămânţare cu tamponul sau prin tehnică “plăcilor tuşite”); Tehnnici de biologie moleculară (PCR); Examenul serologic (RA, RFC, ELISA). Reacţiile se pozitivează din săptămâna a II a perioadei convulsive. Se examinează seruri perechi (PCR); Examenul serologic (RA, RFC, ELISA). Reacţiile se pozitivează din săptămâna a II a perioadei convulsive. Se examinează seruri perechi prelevate la interval de 14-21 zile. Semnificativă este o creştere de cel puţin 4 ori a titrului Ac.prelevate la interval de 14-21 zile. Semnificativă este o creştere de cel puţin 4 ori a titrului Ac.

Tratamentul: Tratamentul: Eritromicină sau cloramfenicol– cel puţin 10 zile (până la apariţia Ac); Imunoglobulină umană antipertussisEritromicină sau cloramfenicol– cel puţin 10 zile (până la apariţia Ac); Imunoglobulină umană antipertussisProfilaxia specifică: Profilaxia specifică: Imunizarea artificială obligatorie cu vaccin ADTP. Componentul antipertusic este reprezentat de o suspensie de bordetele deImunizarea artificială obligatorie cu vaccin ADTP. Componentul antipertusic este reprezentat de o suspensie de bordetele de faza I, adsorbite pe adjuvant. Vaccinul acelular conţine unele componente bacteriene (anatoxina pertussis, hemaglutinina filamentoasă). Este mai faza I, adsorbite pe adjuvant. Vaccinul acelular conţine unele componente bacteriene (anatoxina pertussis, hemaglutinina filamentoasă). Este mai bine tolerat, dar mai puţin eficace. Imunoglobulină umană antipertussisbine tolerat, dar mai puţin eficace. Imunoglobulină umană antipertussis

95. Tuberculoza. Clasificarea agentilor cauzali (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Primoinfectia tuberculoasa - granulomul tuberculos, ”complexul primar”. Evolutia procesului infectios la indivizii cu rezistenta necompromisa. Diagnosticul microbiologic. Metoda alergica (proprietatile tuberculinei), metodele rapide. Profilaxia specifica a tuberculozei.FamiliaFamilia Mycobacteriaceae MycobacteriaceaeGenulGenul Mycobacterium MycobacteriumSpecii:Specii:

oo Responsabile de tuberculoza umană: Responsabile de tuberculoza umană: M.tuberculosis, M.bovis, M.africanumM.tuberculosis, M.bovis, M.africanum (“complex tuberculosis”)(“complex tuberculosis”)oo Agentul leprei: Agentul leprei: M.leprae M.leprae (strict umană)(strict umană)oo Micobacterii “atipice”, condiţionat patogene: Micobacterii “atipice”, condiţionat patogene: M.avium, M.ulcerans, M.fortuitumM.avium, M.ulcerans, M.fortuitum,, M.kansasii, M.marinum, M.kansasii, M.marinum, etc. Cauzează micobacterioze la etc. Cauzează micobacterioze la

persoane imunocompromise.persoane imunocompromise.oo Micobacterii nepatogene: Micobacterii nepatogene: M.smegmatis, M.gastri, M.phley M.smegmatis, M.gastri, M.phley

Caracteristica generală a micobacteriilorCaracteristica generală a micobacteriilor: bastonaşe : bastonaşe G+G+ drepte sau uşor încurbate, necapsulate, asporogene, imobile, acido-alcoolorezistente prin drepte sau uşor încurbate, necapsulate, asporogene, imobile, acido-alcoolorezistente prin tehnica de colorare Ziehl-Neelsen.tehnica de colorare Ziehl-Neelsen.M.tuberculosisM.tuberculosis este o bacterie patogenă strict umană, responsabilă de tuberculoză. Este sensibilă la căldură, lumină solară directă, raze UV sau X. este o bacterie patogenă strict umană, responsabilă de tuberculoză. Este sensibilă la căldură, lumină solară directă, raze UV sau X. Rezistentă la frig sau desicare. Este puţin sensibilă la acizi, baze (se utilizează în decontaminarea prelevatelor) sau detergenţi şi foarte sensibilă la Rezistentă la frig sau desicare. Este puţin sensibilă la acizi, baze (se utilizează în decontaminarea prelevatelor) sau detergenţi şi foarte sensibilă la soluţia de alcool de 70soluţia de alcool de 70°°. . Caractere morfotinctoriale: Caractere morfotinctoriale: M.tbcM.tbc este un bastonaş fin sau uşor încurbat, în frotiu se observă izolat, în grămezi sau corzi. Se colorează este un bastonaş fin sau uşor încurbat, în frotiu se observă izolat, în grămezi sau corzi. Se colorează iin roşu n roşu prin tehnica Ziehl-Neelsen.prin tehnica Ziehl-Neelsen.Caractere de cultură: Caractere de cultură: M.tbcM.tbc este o bacterie strict aerobă, foarte exigentă la cultivare. Toate mediile de izolare au la bază ou coagulat. Mediul de este o bacterie strict aerobă, foarte exigentă la cultivare. Toate mediile de izolare au la bază ou coagulat. Mediul de referinţă – referinţă – Lowenstein-JensenLowenstein-Jensen (ou, glicerină, asparagină). Alte medii solide – Popescu (acid glutamic (ou, glicerină, asparagină). Alte medii solide – Popescu (acid glutamic in locul asparaginei in locul asparaginei), Finn (glutamat de Na). ), Finn (glutamat de Na). Mediul lichid Mediul lichid SautonSauton. Contine saruri minerale, asparagina, glicerina. M.tbc creste in 8-10 zile sub forma de voal. . Contine saruri minerale, asparagina, glicerina. M.tbc creste in 8-10 zile sub forma de voal. Micobacteriile patogene cresc lentMicobacteriile patogene cresc lent (perioada de generaţie – 20 ore), la 37(perioada de generaţie – 20 ore), la 37°°C, pH 6,8-7,0. Coloniile de C, pH 6,8-7,0. Coloniile de M.tbc M.tbc apar peste 2-4 săptămâni, sunt colonii R, rugoase, friabile, conopidiforme, apar peste 2-4 săptămâni, sunt colonii R, rugoase, friabile, conopidiforme, opace, de culoare crem-bej. opace, de culoare crem-bej. M.bovisM.bovis şi şi M.africanumM.africanum formează colonii S, mici, netede, nepigmentate, vizibile peste 4-8 săptămâni. formează colonii S, mici, netede, nepigmentate, vizibile peste 4-8 săptămâni.Activitatea biochimicăActivitatea biochimică a micobacteriilor patogene: Toate micobacteriile patogene produc o catalază termolabilă, distrusă la 68 a micobacteriilor patogene: Toate micobacteriile patogene produc o catalază termolabilă, distrusă la 68°°C timp de 20 C timp de 20 min. Celelalte micobacterii posedă catalază termostabilă. min. Celelalte micobacterii posedă catalază termostabilă. M.tbsM.tbs şi şi M.bovisM.bovis hidrolizează ureea. hidrolizează ureea. M.tbcM.tbc produce acid nicotinic (niacină), reduce nitraţii produce acid nicotinic (niacină), reduce nitraţii în nitriţi. în nitriţi. M.bovisM.bovis nu manifestă astfel de activitate. nu manifestă astfel de activitate.

Compoziţia chimică şi factorii de patogenitate ai micobacteriilorCompoziţia chimică şi factorii de patogenitate ai micobacteriilorLipideleLipidele constituie 20-45% din masa celulei. Sunt reprezentate de acizi micolici şi ceruri (condiţionează transformarea macrofagelor în celule constituie 20-45% din masa celulei. Sunt reprezentate de acizi micolici şi ceruri (condiţionează transformarea macrofagelor în celule epitelioide şi celule gigante Langhans). Cord-factorul (sulfo-lipid) perturba respiraţia în mitocondrii, induce cultivarea în corzi (cosiţe) a epitelioide şi celule gigante Langhans). Cord-factorul (sulfo-lipid) perturba respiraţia în mitocondrii, induce cultivarea în corzi (cosiţe) a M.tbcM.tbc. . Polizaharidele Polizaharidele joacă un rol important în formarea Ac serici, conferind specificitatea imunologică. joacă un rol important în formarea Ac serici, conferind specificitatea imunologică. ProteineleProteinele reprezintă suportul imunităţii celulare şi a hipersensibilităţii tardive. reprezintă suportul imunităţii celulare şi a hipersensibilităţii tardive.

Sursa de infecţie – omul bolnav cu TBC cu leziuni pulmonare cavitare deschise în bronsii (Sursa de infecţie – omul bolnav cu TBC cu leziuni pulmonare cavitare deschise în bronsii (M.tbc, M.africanumM.tbc, M.africanum) sau bovinele bolnave () sau bovinele bolnave (M.bovisM.bovis). ). Transmiterea se efectuează pe cale aeriană (picături, praf). Rareori este posibilă contaminarea prin obiecte, alimente (lapte nepasteurizat) sau Transmiterea se efectuează pe cale aeriană (picături, praf). Rareori este posibilă contaminarea prin obiecte, alimente (lapte nepasteurizat) sau mâini contaminate. Receptivitatea este influenţată de vârstă şi factorii de mediu: carenţe nutritive, alcoolism, tratament imunosupresiv, etc mâini contaminate. Receptivitatea este influenţată de vârstă şi factorii de mediu: carenţe nutritive, alcoolism, tratament imunosupresiv, etc Primoinfecţia tuberculoasă.Primoinfecţia tuberculoasă. Reprezinta un ansamblu de manifestari clinice, umorale si anatomice care se desfasoara in organism in urma Reprezinta un ansamblu de manifestari clinice, umorale si anatomice care se desfasoara in organism in urma primului contact cu agentul TBC. primului contact cu agentul TBC. După contaminareDupă contaminare (mai frecvent in copilarie) (mai frecvent in copilarie), la poarta de intrare (90% - tractul respirator), bacteriile sunt , la poarta de intrare (90% - tractul respirator), bacteriile sunt captate de macrofage în care se multiplică (bacterii facultativ intracelulare, împiedică formarea fagolizosomei). Apare o leziune inflamatoare captate de macrofage în care se multiplică (bacterii facultativ intracelulare, împiedică formarea fagolizosomei). Apare o leziune inflamatoare nespecifică. Peste câteva săptămâni (4-12) se dezvoltă o imunitate celulară şi leziunea exsudativă evoluează în leziune granulomatoasă. Sub nespecifică. Peste câteva săptămâni (4-12) se dezvoltă o imunitate celulară şi leziunea exsudativă evoluează în leziune granulomatoasă. Sub acţiunea unor citokine macrofagii activaţi se diferenţiază în celule epitelioide şi celule multinucleate gigante. Ele sunt înconjurate de limfocite şi acţiunea unor citokine macrofagii activaţi se diferenţiază în celule epitelioide şi celule multinucleate gigante. Ele sunt înconjurate de limfocite şi fibroblaste. Acesta este granulomul tuberculos, semn caracteristic primo-infecţiei. Infecţia se extinde pe cale limfatică, cu afectarea ganglionilor fibroblaste. Acesta este granulomul tuberculos, semn caracteristic primo-infecţiei. Infecţia se extinde pe cale limfatică, cu afectarea ganglionilor regionali. regionali. Primoinfecţia inaparentăPrimoinfecţia inaparentă. La cca 85% leziunile se vindecă şi se pot autosteriliza. Nici o expresie clinică sau radiologică.. La cca 85% leziunile se vindecă şi se pot autosteriliza. Nici o expresie clinică sau radiologică.Tuberculoza primară subclinicăTuberculoza primară subclinică. Dacă multiplicarea bacteriilor este masivă, în leziunile tuberculoase se realizează o necroză cazeoasă . Dacă multiplicarea bacteriilor este masivă, în leziunile tuberculoase se realizează o necroză cazeoasă (tuberculom). Frecvent are loc calcifierea tuberculomului (leziunea este vizibilă radiologic), cu autosterilizarea spontană sau cu persistenţa unor (tuberculom). Frecvent are loc calcifierea tuberculomului (leziunea este vizibilă radiologic), cu autosterilizarea spontană sau cu persistenţa unor bacterii în leziune.bacterii în leziune.Consecinţele primoinfecţiei inaparente sau subcliniceConsecinţele primoinfecţiei inaparente sau subclinice:: dezvoltarea imunităţii antituberculoase şi a sensibilizării tuberculinice. dezvoltarea imunităţii antituberculoase şi a sensibilizării tuberculinice.Tuberculoza primară manifestăTuberculoza primară manifestă necomplicată.necomplicată. Pacienţii au febră, astenie, pierdere în greutate, etc. Etapa ganglionară poate fi depăşită cu Pacienţii au febră, astenie, pierdere în greutate, etc. Etapa ganglionară poate fi depăşită cu diseminări hematogene şi afectarea pleurei, meningelui, măduvei osoase, parenhimei organelor. Leziunile pot evolua fie spre agravare, fie spre diseminări hematogene şi afectarea pleurei, meningelui, măduvei osoase, parenhimei organelor. Leziunile pot evolua fie spre agravare, fie spre cicatrizare.cicatrizare.

49

Page 50: Microbiologie Exam

Primoinfecţia cu complicaţiiPrimoinfecţia cu complicaţii. Rareori (10% cazuri), evoluţia este defavorabilă: masele necrotice sunt evacuate în bronşii, vase sanguine, pleură sau. Rareori (10% cazuri), evoluţia este defavorabilă: masele necrotice sunt evacuate în bronşii, vase sanguine, pleură sau pericard cu formarea unei caverne, unde bacteriile se multiplică intens. Fistulizarea într-un vas sangvin diseminează infecţia sistemic pericard cu formarea unei caverne, unde bacteriile se multiplică intens. Fistulizarea într-un vas sangvin diseminează infecţia sistemic (tuberculoza miliară). Starea generală este alterată, apare febră, tuse, uneori hemoptizie. (tuberculoza miliară). Starea generală este alterată, apare febră, tuse, uneori hemoptizie. Bolnavul este contagios, eliminând bacterii cu sputa.Bolnavul este contagios, eliminând bacterii cu sputa.Tuberculoza secundarăTuberculoza secundară. Se manifestă în condiţii de scădere a reactivităţii imune, reinfecţii masive sau reactivarea unor focare latente. Focarele . Se manifestă în condiţii de scădere a reactivităţii imune, reinfecţii masive sau reactivarea unor focare latente. Focarele noi apar în ritm lent şi evoluează cronic fără tendinţă de vindecare spontană.noi apar în ritm lent şi evoluează cronic fără tendinţă de vindecare spontană.Alte forme clinice de tuberculozăAlte forme clinice de tuberculoză: ganglionară, meningeană, osteo-articulară, uro-genitală.: ganglionară, meningeană, osteo-articulară, uro-genitală.Imunitatea antituberculoasăImunitatea antituberculoasă este celulară, nesterilă. Hipersensibilitatea tardivă însoţeşte imunitatea celulară. Ac circulanţi nu au rol protector. este celulară, nesterilă. Hipersensibilitatea tardivă însoţeşte imunitatea celulară. Ac circulanţi nu au rol protector.

96. Tuberculoza. Clasificarea agentilor patogeni, factorii de patogenitate. Evolutia procesului infectios in tuberculoza pulmonara la gazda inalt receptiva. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele: recoltarea, omogenizarea, decontaminarea. Concentrarea micobacteriilor din sputa. Microscopia directa, izolarea si identificarea micobacteriilor. Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice si chimioterapice. Tratamentul specific al tuberculozei. Strategia DOTS.Diagnosticul de laborator al tuberculozeiDiagnosticul de laborator al tuberculozeiPrelevatePrelevate: în funcţie de forma clinică : în funcţie de forma clinică În caz de necesitate se efectuează omogenizarea (decontaminarea) şi concentrarea prelevatelor.În caz de necesitate se efectuează omogenizarea (decontaminarea) şi concentrarea prelevatelor.Metode de diagnosticMetode de diagnosticExamenul microscopicExamenul microscopic – frotiuri colorate Ziehl-Neelsen (bastonaşe purpurii izolate) sau cu auramină – frotiuri colorate Ziehl-Neelsen (bastonaşe purpurii izolate) sau cu auramină (bastonase galbene pe fondul negru) (bastonase galbene pe fondul negru)..Examenul bacteriologicExamenul bacteriologic – izolarea culturii pure pe mediile speciale, identificarea ei, testarea sensibilităţii la chimioterapice (prin metoda diluţiilor – izolarea culturii pure pe mediile speciale, identificarea ei, testarea sensibilităţii la chimioterapice (prin metoda diluţiilor în mediu solid)în mediu solid)PCRPCR pentru detectarea rapidă a micobacteriilor direct în prelevate pentru detectarea rapidă a micobacteriilor direct în prelevateIntradermoreacţia la tuberculinăIntradermoreacţia la tuberculină (reacţia Mantoux). Se cercetează starea de hipersensibilitate cutanată la tuberculină. Tuberculina reprezintă un (reacţia Mantoux). Se cercetează starea de hipersensibilitate cutanată la tuberculină. Tuberculina reprezintă un filtrat dintr-o cultură bulionică autoclavată de filtrat dintr-o cultură bulionică autoclavată de M.tuberculosis. M.tuberculosis. Pe faţa anterioară a antebraţului se injectează i/dermic 2, 5 sau 10 UI de tuberculină în volum de 0,1 ml. Lectura peste 72 ore. Reacţia pozitivă se Pe faţa anterioară a antebraţului se injectează i/dermic 2, 5 sau 10 UI de tuberculină în volum de 0,1 ml. Lectura peste 72 ore. Reacţia pozitivă se manifestă printr-o induraţie şi congestie cu diametrul superior sau egal cu 5 mm. Interpretarea se efectuează în funcţie de contextul clinicmanifestă printr-o induraţie şi congestie cu diametrul superior sau egal cu 5 mm. Interpretarea se efectuează în funcţie de contextul clinicReacţia + indică că subiectul a fost infectat cu micobacterii (primoinfecţie), a fost vaccinat cu BCG sau este bolnav de tuberculoză (în acest caz Reacţia + indică că subiectul a fost infectat cu micobacterii (primoinfecţie), a fost vaccinat cu BCG sau este bolnav de tuberculoză (în acest caz diametrul depăşeşte 10 mm).diametrul depăşeşte 10 mm).Reacţia negativă exclude diagnosticul de tuberculoză.Reacţia negativă exclude diagnosticul de tuberculoză.Tratamentul tuberculozei: Tratamentul tuberculozei: Antibiotice cu spectru larg: rifampicină, streptomicină, kanamicină; Fluorochinolone; Chimioterapice care inhibă Antibiotice cu spectru larg: rifampicină, streptomicină, kanamicină; Fluorochinolone; Chimioterapice care inhibă sinteza acizilor micolici (Izoniazida, Pirazinamida, Etambutolul, Etionamida)sinteza acizilor micolici (Izoniazida, Pirazinamida, Etambutolul, Etionamida)Exigenţele terapiei antituberculoase: a împiedica selecţia mutanţilor rezistenţi şi a steriliza definitiv focarul.Exigenţele terapiei antituberculoase: a împiedica selecţia mutanţilor rezistenţi şi a steriliza definitiv focarul.În acest scop se utilizează asocierea a 3-4 droguri pe o perioadă de 6-12 luni. În acest scop se utilizează asocierea a 3-4 droguri pe o perioadă de 6-12 luni. Profilaxia specifică: Profilaxia specifică: Vaccinarea obligatorie cu vaccinul BCG. El reprezintă o tulpină vie avirulentă de Vaccinarea obligatorie cu vaccinul BCG. El reprezintă o tulpină vie avirulentă de M.bovisM.bovis. A fost obţinută de Calmette şi . A fost obţinută de Calmette şi Guerin în 1921 după multiple repicări (230 pasaje) pe mediu cu cartof, bilă şi glicerină.Guerin în 1921 după multiple repicări (230 pasaje) pe mediu cu cartof, bilă şi glicerină.Vaccinul se administrează i/dermic la vârsta de Vaccinul se administrează i/dermic la vârsta de 4-54-5 zile de la naştere. zile de la naştere. Revaccinarea – la 7 ani, apoi peste fiecare 5 ani (persoanele cu reactia Revaccinarea – la 7 ani, apoi peste fiecare 5 ani (persoanele cu reactia Mantoux negativa).Mantoux negativa). Revaccinarea se efectuează la 7 ani persoanelor cu proba Mantoux negativă. Revaccinarea se efectuează la 7 ani persoanelor cu proba Mantoux negativă.

97. Sifilisul. Clasificarea agentului cauzal (familie, gen, sp.), factorii de patogenitate. Patogeneza si stadiile infectiei. Sifilisul congenital. Diagnosticul microbiologic al sifilisului. Prelevatele in dependenta de stadiile bolii. Metoda microscopica. Metoda serologica.CLASIFICAREA SPIROCHETELORSpirochetele – bacterii helicoidale, flexibile şi mobile (fibrile interne), răspândite în natură, unele comensale ale mucoaselor umane.Familia: SpirochaetaceaeGenuri: Treponema, Borrelia, Spirochaeta, Cristispira

Familia: Leptospiraceae Genul: Leptospira

MICROBIOLOGIA ŞI DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL SIFILISULUIGenul TreponemaSpecii : T.pallidum (patogenă)subspecii (variante):

o T.pallidum pallidum (agentul sifilisului)o T.pallidum endemicum (agentul bejelului, sifilis endemic nevenerian – leziuni cutanate)o T. palidum pertenue (agentul pianului, maladie cutanată, neveneriană, zone tropicale şi subtropicale)o T. carateum (agentul pintei/carate, neveneriană, America Centrală şi de Sud)

Treponeme comensale:Orale (T.denticola, T.orale, etc)Genitale (T.phagedenis, T.refringens, etc)

T.pallidum – bacterie fină, helicoidală, cu 8-14 spire regulate şi capetele ascuţite, mobilă cu mişcări de flexie, înşurubare şi translaţie. G -Evidenţierea: preparate native (microscopul cu fond negru, contrast de fază); nu se colorează după Gram; Romanovsky-Giemsa – roz-pal; impregnaţie cu săruri de argint (filamente negre-brune pe fondul galben); frotiuri Burri – necolorate pe fondul negru

Cultivarea T.pallidum in vitro – imposibilă. Pasaje succesive în testicule de iepure (tulpina Nichols de T.pallidum). Suspensii de astfel de treponeme supravieţuiesc 72 ore în mediul Mayer-Nelson (la 25 grade în anaerobioză).

Factori de patogenitate: Factori de adeziune; Factori de invazie (hialuronidaza); Factori de sensibilizare; Endotoxina Supresia răspunsului imun celular în stadiile iniţiale ale boliiSursa de infecţie – omul bolnavCăile de transmitere: Sexual; Contact indirect (sărut, obiecte, instrumente chirurgicale recent contaminate, transfuzii de sânge, etc.); Transplacentar (vertical) Poarta de intrare – tegumentul lezat, mucoasa genitală, anală, bucalăPerioada de incubaţie – 2-6 săptămâni (3)Evoluţia sifilisuluiSifilisul primar (4-6 săptămâni): La poarta de intrare apare şancrul sifilitic: ulceraţie cu baza indurată, nedureros, bogat în treponeme (99% localizare genitală şi anală, 1% - bucală). Adenopatie satelită. Vindecare spontană a şancrului este posibila (imunitatea locală).

50

Page 51: Microbiologie Exam

Sifilisul secundar (urmare a diseminării sangvine) – după 6-8 săpt. de evoluţie: Manifestări cutanate (rozeole, sifilide erozive,etc), foarte contagioase; Manifestări la nivelul mucoaselor (plăci mucoase); Poliadenopatie; Leziuni ale organelor interne (hepatite, nefrite, periostite, meningite, etc); Răspunsul imun poate duce la dispariţia leziunilor în 1-3 luniSifilisul latent (persoanele la care treponemele persistă în ganglioni limfatici şi splină): Lipsa semnelor clinice; Necontagios ; Durata nedeterminataSifilisul terţiar (după 4-30 ani de la contaminare): Afecţiuni cardio-vasculare (aortite, anevrisme); Afecţiuni neurologice (tabes, paralizie generală); Afecţiuni osoase şi cutanate (gome); Deces posibilSifilisul congenital: În timpul gravidităţii – moartea fătului prin afecţiuni poliviscerale. La finele gravidităţii sau la naştere – leziuni tardive (dentare, osoase, oculare)Imunitatea (nesterilă): Umorală ; Celulară (protectoare, deprimată în sifilisul primar şi secundar)

Prelevate: serozitatea din leziunile primare sau secundare, puncţii din ganglioni limfatici, serul sangvin, LCRMetode de diagnostic: Examenul microscopic (sifilis primar, secundar); Microscopia pe fond negru, contrast fază; RIF; Impregnare argentică, coloraţia GiemsaExamenul serologic (sifilis secundar, terţiar)

I. Reacţii nespecifice (cu Ag cardiolipidice): Reacţia VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) – RP (RF)Ieftină, facilă, specificitate redusă; Reacţii fals pozitive: viroze, colagenoze, paludism, ciroze, reumatism, graviditate, etc. RFC (Wassermann)

II. Reacţii specifice (cu Ag treponemice): RFC Wassermann sau Kolmer; RHAI (Ag – lizat din tulpina Nichols fixat pe hematii); RIFI (Ag – suspensie de T.pallidum fixată pe lamă); RIT (testul Nelson) (Ag – tulpina Nichols a T.pallidum); RIE (ELISA); PCR (detectarea ADN) în LCR, lichidul amniotic, ţesut

EVOLUŢIA TITRURILOR DE ACRIFI se pozitivează la apariţia şancrului (o lună după infectare)VDRL – după 6 săptămâniRHAIRIT – în stadiul secundar, 2 luni după infectare

După tratamentul sifilisului: VDRL se negativează prima. Alte reacţii rămân pozitive.

Tratamentul: beta-lactamine, tetracicline, macrolide (rezistenţă la aminoside); Reacţia Herxheimer este posibilă (efectul endotoxinei). PROFILAXIA – depistarea sistematică activă şi tratarea bolnavilor.

98. Borreliozele. Clasificarea agentilor cauzali ai febrei (tifosului) recurente epidemice si endemice (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Patogeneza febrei recurente, manifestarile clinice. Diagnosticul microbiologic al febrei recurente. Prelevate. Examenul microscopic. Metoda biologica.CLASIFICARE: Familia Spirochaetaceae, Genul Borrelia. Specii: B.recurrentis (transmisă prin păduchi); B.duttoni, B.hispanica, B.persica, B.burgdorferi, etc (transmise prin căpuşe)

Caractere morfobiologice: filamente spiralate cu 5-8 spire neregulate, flexibile şi mobile, cu mişcări de flexie şi înşurubare. G-, colorate în albastru-violet după Giemsa.Caractere de cultură: bacterii anaerobe, cultivă in vitro pe medii complexe şi in vivo (ou embrionat, artropode, animale de laborator).Structura antigenică: variabilitate pronunţată!Habitat: Omul bolnav – în sânge şi ţesuturi infectate; Rozătoare; Vectori (păduchi, căpuşe) – în hemolimfă, salivă, intestin

Febra recurentă epidemică - Agentul cauzal - B.recurrentis, Sursa de infecţie – omul bolnav, Vector - Pediculus humanus, Contaminare – prin hemolimfa eliberată la zdrobirea păduchilor, Poarta de intrare – tegumentul lezat, conjunctiva Febra recurentă endemică - Agenţii cauzali - B.hispanica, B.persica, B.duttoni, etc, Sursa de infecţie – rozătoarele sălbatice sau peridomestice, Vectori–căpuşe din genul Ornithodoros, Contaminare – prin înţepătură, prin intermediul lichidului coxal, prin dejecţii anale

Patogeneza febrei recurente:Perioada de incubaţie – 3-14 zile (borreliile se multiplică în viscere – ficat, splină, creier, etc.)Perioada febrilă – debut brutal, cu febră 40-41 grade şi frison (endotoxina eliberată în sânge la distrugerea borreliilor). Algii difuze, stare de tifos, semne meningeale, hepato-splenomegalie, icter. Criza febrilă durează 7 zile.Urmează o perioadă afebrilă de o săptămână, succedată de altă criză termică cu durată mai scurtă.Accesele se repetă (2-4-10 recurenţe).Mecanismul recurenţelor: Borreliile care pătrund în organism prezintă variaţii antigenice succesive. Sub acţiunea anticorpilor bactericizi formaţi la sfârşitul acceselor febrile se selectează varianta antigenică responsabilă de următorul acces. Febra recurentă endemică are o evoluţie mai benignă, cu recurenţe mai frecvente.

Prelevate: sânge, LCRMetode de diagnostic:Examenul microscopic (în perioada febrilă): preparate native (fond negru, contrast de fază); frotiuri colorate Giemsa; RIF. Examenul biologic (infectarea cobailor, şobolanilor)Tratament: peniciline, tetracicline, cloramfenicolProfilaxie: lupta contra vectorilor şi protecţia individuală

99. Borreliozele. Clasificarea agentului cauzal al bolii Lyme (familie, gen, sp.). Patogeneza bolii Lyme, manifestarile clinice. Diagnosticul microbiologic al bolii Lyme. Prelevate. Examenul microscopic. Izolarea si identificarea B.burgdorferi. Diagnosticul serologic.Agentul cauzal – Borrelia burgdorferi (B.burgdorferi sensu stricto, B.afzelii, B.garinii)Caractere morfoculturale – bacterie helicoidală, mobilă, efectuează mişcări de flexie şi rotaţie. Nu se colorează prin metoda Gram. Se cultivă lent (câteva săptămâni) numai pe medii speciale.Habitat şi contaminare: Rezervor de infecţie: rozătoare, animale domestice (câini, cai, etc), păsări. Vectori: căpuşe din genurile Ixodes şi Amblyomma, ţânţari, tăuni. Contaminare: prin înţepătura vectorului infectat

Incubaţie – 2-4 săptămâniFaza primară (leziune cutanată – eritemul cronic migrator, febră, cefalee, astenie). Durata – 3-4 săpt.Faza secundară – durata 2-6 săptămâni – manifestări neurologice, cardiace, cutanate, osteo-articulare.

51

Page 52: Microbiologie Exam

Faza terţiară – durează luni, ani – afecţiuni cronice cutanate (acrodermatită cronică atrofiantă), articulare (artrite cronice), neurologice (encefalomielite).

Prelevate: biopsii cutanate, sânge, LCR, lichid articularMetode de diagnostic: Examenul microscopic (preparate native, coloraţia specială a biopsiilor, impregnare argentică), Examenul bacteriologic, Diagnosticul serologic (RIFI, ELISA, Western-blot), PCRTratament – peniciline, tetraciclineProfilaxie – informarea populaţiei, extragerea căpuşelor

100. Leptospirozele. Clasificarea agentilor patogeni (familie, gen, sp., s/v). Factorii de patogenitate ai leptospirelor. Patogeneza infectiei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate, examenul microscopic, izolarea si identificarea culturii pure. Metoda biologica, diagnosticul serologic ( RHAI, RFC, RAL). Profilaxia si tratamentul specific al leptospirozelor.Leptospirele sunt bacterii care pot infecta numeroase specii de animale (în special vertebrate) şi accidental omul. ClasificareFamilia LeptospiraceaeGenul LeptospiraSpp. L.interrogans (patogenă pentru om şi animale)

L.biflexa (saprofită, ape de suprafaţă)L.parva (saprofită, apa de conductă)

Caractere morfologice – bacterii fine şi spiralate, cu 10-30 spire strânse şi regulate, cu capetele îndoite în cîrlig (aspect de S, C, ?). Realizează mişcări de înşurubare, flexie şi translaţie. Pot fi examinate la microscopul cu fond negru sau cu contrast de fază. Coloraţia Giemsa – roz-palCaractere de cultură. Medii lichide cu săruri anorganice tamponate cu fosfaţi şi îmbogăţite cu ser de iepure (mediile Korthof, Stuart, Wervort-Volf), medii semisintetice. Aerobioză. 28-30 grade C. Leptospirele se multiplică în 3-10 zile (până la o lună) fără a tulbura mediul

Structura antigenică a L.interrogans: Antigene cu specificitate de gen, LPZ, Antigene majore de grup (peste 20 serogrupuri), Ex.: L.icterohaemorrhagia, grippotyphosa, hebdomadis, canicola, pomona, autumnalis, etc. Antigene proteice minore de tip (peste 200 serotipuri/variante) - proteice

Sursa de infecţie: rozătoarele sălbatice, accidental-rozătoarele peridomestice sau animalele domestice (porci, câini, cai, bovine) – leptospirele sunt gazduite in tubii contorţi proximali renali.Poarta de intrare: tegument şi mucoaseCăile de transmitere: Alimentar (alimente şi apa contaminată), Contact direct cu animalele infectate , Contact indirect (cu apa contaminată). Leptospirele sunt antrenate în circulaţia sangvină fără leziuni la poarta de intrare. Incubaţia – 1-2 săptămâni (10 zile)Evoluţia leptospirozelor: Faza septicemică (generalizată) – 7 zile: febră, frison, sindrom meningeal. Faza afebrilă (1-3 zile). Faza organică (febră, sindrom meningeal, sindrom hepato-renal, sindrom cardio-vascular-hemoragic, icter) Imunitatea: umorală, specifică de tip, durabilă

Prelevate: sânge, LCR (prima săptămână), urină (din săptămâna II de boală), probe necroptice (secţiuni histologice renale, hepatice)Metode de diagnosticExamenul microscopic (fond negru, contrast de fază, coloraţia Giemsa sau impregnaţia argentică a secţiunilor histologice), RIFExamenul bacteriologicProbele sunt însămânţate în câte 3-5 tuburi cu mediu de cultură, incubate în aerobioză la 28 grade până la 1-3 luni.Identificarea în baza caracterelor: Microscopice; De cultură; De patogenitate; Serologice (RFC, RAL) Examenul biologic (inocularea intraperitoneală a cobailor). Peste 1-3 zile leptospirele pot fi depistate în exsudatul din cavitatea abdominală.Tehnici PCR (detectarea ADN)Diagnocticul serologic (din săpt. II)

Reacţii cu specificitate de gen (RFC, RHAI, RIFI, ELISA) Reacţii cu specificitate de tip (de referinţă)-RAL (Reacţia de Aglutinare-Liză)Titrul diagnostic - 1/400 sau creşterea în dinamică de 4 ori

Tratament: penicilină, tetraciclină, gama-globulina antileptospiroasă Profilaxie: deratizarea, igiena şi protecţia muncii, supravegherea bazinelor de apă, vaccinarea selectivă (vaccin inactivat, durata imunităţii-1 an)

101. Escherichiozele. Clasificarea E.coli dupa structura antigenica. Habitatul, rolul in fiziologia omului. Factorii de patogenitate. Fenotipurile diareigene, bacteriemice, uropatogene. Infectiile intestinale cauzate de categoriile fenotipurilor diareigene. Infectiile extraintestinale cauzate de E.coli. Diagnosticul microbiologic al colienteritelor la copii. Prelevate. Izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (biochimica, serologica), diagnosticul serologic. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE. Peste 30 genuri cu 130 specii. Habitat: intestinul omului, animalelor . Martor al contaminării fecale a mediului. Majoritatea constituie flora normală (comensală) intestinalăEnterobacterii patogene: genurile Shigella, Salmonella, Yersinia, unele variante ale speciei Escherichia coli;Enterobacterii condiţionat patogene: genurile Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Edwardsiella, etc.

Teste-cheie ale familiei: Bacterii (bastonaşe) gramnegative; Nesporogene; Mobile-peritriche/imobile; Facultativ-anaerobe; Fermentează glucoza (A, AG); Catalaza-pozitive; Oxidaza-negative; Reduc nitraţii în nitriţiTeste primare (identificarea genurilor): Utilizarea citratului de Na (mediul Simmons); Utilizarea malonatului de Na; Hidroliza ureei (testul Preus); Decarboxilarea lizinei (LDC); Dezaminarea fenilalaninei (FAD); Producere de H2S în mediul multitest (ex.: Kligler); Fermentarea glucozei până la acizi (testul MR); Fermentarea glucozei până la acetoină (testul VP); Mobilitatea (în geloză semilichidă)Teste secundare (identificarea speciilor/variantelor): Teste biochimice (fermentarea glucidelor, decarboxilarea aminoacizilor (arginină, ornitină), producerea indolului, etc); Fagoidentificarea şi lizotipia; Colicinogenotipia; Seroidentificarea ; Antibiograma Caractere morfologice: bastonaşe G-, 1 - 6 µm x 0,3 - 1 µm, mobile peritriche (Klebsiella, Yersinia pestis, Shigella – imobile), nesporogene, formează microcapsule (Klebsiella – capsulată), posedă fimbrii.Caractere de cultură: Anaerobe facultativ; Temperatura optimă 37 grade C (limite – 18 – 45 grade) ; Nepretenţioase nutritiv; Colonii S, apar după 18-24 h de incubare, 2 - 3 mm (după repicări pot apare colonii R), Klebsiella – mucoide, Proteus – invadează suprafaţa mediului MEDII DE CULTURĂDe transport: glicerină 30%, soluţie salină 3%, soluţie tampon-fosfat

52

Page 53: Microbiologie Exam

De îmbogăţire a bacteriilor patogene: Kauffmann, Muller, bulion selenit, etcDiferenţial-diagnostice:

I. De izolare ENDO, LEVIN, PLOSKIREVComponenţa: bază nutritivă, lactoză, indicatorColoniile L+ : colorate Coloniile L- : incolore (frecvent flora patogenă)Mediul Wilson-Blair cu sulfit de Bi (Salmonella reduce sulfitul în sulfură de Bi – colonii negre pe mediul verde)

II. De acumulare şi identificare preliminară (medii multitest)Russel, Kligler (glucoză, lactoză, săruri de Fe)Olkeniţki (glucoză, lactoză, zaharoză, uree, săruri de Fe)

III. De identificare finală (medii cu citrat, malonat, şirul Hiss, medii cu aminoacizi, gelatina, etc)

CARACTERE ANTIGENICEAg O (R), de perete, LPZ, termostabil şi rezistent la alcool, sensibil la formol, specificitate de gen, specie, grupAg H, flagelar, proteic, termolabil şi inactivat de alcool, rezistent la formol, specificitate de tip (variantă) Ag K, superficial, capsular, termovariabil, specificitate de specie, tip (maschează Ag O, inaglutinabilitate cu seruri anti-O). Variante – L, A, B la E.coli, Vi – la Salmonella şi CitrobacterAg F, fimbrial, termolabil, nespecific ECA – antigen comun fam. Enterobacteriaceae (interes taxonomic) – Ag Kunin

GENUL ESCHERICHIAGenul Escherichia Spp.: E.coli, E.blattae, E.fergusonii, E.vulneris, E.hermaniiHabitat: intestinul omului şi animalelor (80% din flora aerobă intestinală), 107-109 bacterii/gram fecale.Contaminează solul şi apele de suprafaţă. Prezenţa E.coli - indicator de contaminare fecală.Rolul E.coli în fiziologia umană1. Manifestă activitate antagonistă faţă de alte bacterii, inclusiv cele patogene.2. Stimulează dezvoltarea ţesutului limfoid prin intermediul Ag sale3. Participă la procesele de digestie, inclusiv în metabolismul colesterolului şi acizilor biliari4. Asigură organismul cu vitamine, sintetizând vitamine B, K, acid nicotinic, acid folic, etc.

CARACTERE MORFOBIOLOGICEE.coli – enterobacterie tipică, mobilă, lactoza+, fermentează glucidele cu formare de AG (teste primare: MR +, mobilitate +, celelalte sunt negative)Structura antigenică: Ag O – 180 tipuri (O1, O2, O3......O180); Ag H – 60 tipuri (H1, H2, etc); Ag K – 100 tipuriDin combinaţii rezultă serovariante: ex. O55:H2:K1Factori de patogenitate1. Capsula (antifagocitar, Ag K1 – camuflaj imunologic datorită epitopilor comuni cu polisialozil-glicopeptide cerebrale la nou-născuţi)2. Proteine din ME şi LPZ (anti-complement, protecţie de factorii bactericizi ai sângelui, adeziune, invazie)3. Fimbrii (adeziune)4. Toxine (endotoxina, enterotoxine termostabile - ST şi termolabile - LT, citotoxine – “Shiga-like” toxine (SLT-1, SLT-2)5. Hemolizina 6. Siderofori (sisteme de captare a Fe)

ROLUL E. COLI ÎN PATOLOGIA UMANĂ FENOTIPURI DIAREIGENE

Tulpini enteropatogene: EPEC (O26, O55, O111, O125, O142, etc). Responsabile de gastro-enterite infantile (infecţii salmoneliforme). Aderă la mucoasa intestinului subţire printr-o proteină din membrana externă fără a penetra intracelular. Tulpini enteroinvazive: EIEC (O28, O124, O143, etc). Responsabile de sindrom dizenteric cu invazia mucoasei colonului, penetrare intracelulară, ulceraţii. Factori de patogenitate: adezine, citotoxine.Tulpini enterotoxigene: ETEC (O6, O8, O20, O25, O115, etc). Responsabile de “diareea călătorului”, sindrom holeriform. Adeziunea la enterocitele intestinului subţire este asigurată de pili (CFA “colonization factor antigen” sau CS “coli surface factors”). Elaborează toxine – enterotoxine ST şi/sau LT. Activează adenilat- respectiv guanilat ciclaza enterocitelor, provocând o secreţie sporită a ionilor de Cl- şi inhibiţia absorbţiei ionilor de Na+, antrenând o pierdere hidrică importantă.Tulpini enterohemoragice: EHEC (O157:H7; O26, O111). Responsabile de colite hemoragice cu sindrom uremic-hemolitic (anemie hemolitică+trombocitopenie+insuficienţă renală). Posedă factori de adeziune şi produc citotoxine capabile de difuzie în organism (“Shiga-like” toxine – SLT 1 şi SLT 2). Produc frecvent hemolizină. Tulpini enteroagregative: EAggEC (O111:H12). Posedă adezine, hemolizine şi SLT. Provoacă diaree persistentă (peste 14 zile) la copii. Aderă agregativ la suprafaţa culturilor de celule.Tulpini enteroadezive: EAEC. Aderă difuz la celulele intestinale şi culturile de celule. Provoacă sindroame diareice.

FENOTIPURI UROPATOGENE (O1, O2,O4,O6). Posedă afinitate pentru mucoasa uro-genitală (fimbrii tipul P sau 1, Ag O şi K specifice, hemolizine, etc).

FENOTIPURI BACTERIEMICE Alte forme clinice provocate de E.coli: Şoc endotoxinic; Meningite la nou-născuţi (preponderent tulpini cu Ag K1); Infecţii ale plăgilor (frecvent de origine nozocomială); Colecistite, peritonite, salpingite, etc.; Toxiinfecţii alimentare

DIAGNOSTIC DE LABORATORPrelevate în funcţie de forma clinică: materii fecale, urină, sânge, LCR, puroi, etcMetode de diagnostic. Examenul microscopic de orientare (frotiu Gram în infecţii extra-intestinale, RIF); Examenul bacteriologic (de bază, cantitativ); Examenul serologic (retrospectiv, de confirmare); RA cu autotulpini (titru diagnostic – 1:200) Tratamentul: Antibiotice (conform antibiogramei); Eubiotice (colibacterină, lactobacterină, bifidumbacterină, bificol, etc). Profilaxia escherichiozelor - nespecifică

102. Dizenteria. Clasificarea agentilor patogeni (familie, gen, spp.). Factorii de patogenitate ai shigelelor. Patogeneza dizenteriei, simptomele clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Microscopia (RIF), izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (biochimica, serologica), serodiagnosticul. Profilaxia si tratamentul specific al dizenteriei.Shigelele – strict umane. Cauzează infecţii intestinale - şigeloze, cea mai gravă formă–dizenteria bacteriană.

53

Page 54: Microbiologie Exam

Clasificarea genului Shigella (biochimic şi antigenic):A – Shigella dysenteriae (12 s/v, 12 b/v) Manitol -B – Shigella flexneri (6 s/v, 14 ss/v, 23 b/v)C – Shigella boydii (18 s/v)D – Shigella sonnei (1 s/v, 7 b/v)

Subgrupele B, C, D – manitol +

Enterobacteriaceea tipice, imobile, lactozo-negative, scindează glucoza pana la acizi (testul MR+), celelalte teste primare sunt negative.Factori de patogenitate:

1. Factori de adeziune la mucoasa colonului (fimbrii, LPZ)2. Microcapsula (antifagocitar)3. Factori de penetrare şi multiplicare intracelulară4. Toxine:

Shigatoxina - neurotoxică, enterotoxică, citotoxică – elaborată de S.dysenteriae 1 Enterotoxine (Shiga-like toxine (SLT), verotoxine) Endotoxina

Structura antigenică: Ag O şi K cu specificitate de gen, specie, subspecie, variantă Rezistenţa în mediul extern: S.dysenteriae - foarte sensibilă (1-2 ore); S.flexneri – persistă 1-3 săptămâni în apă, 2 luni în lactate; S.sonnei – persistă şi se multiplică în lactateSursa de infecţie: bolnav, reconvalescent, purtătorTransmiterea fecal-orală: Contact direct (mâini murdare); Alimentar (alimente, apă); Doza infectantă: 10-102 bacterii; Bacteriile se multiplică în intestin, colonizează epiteliul colonului şi macrofagele din foliculii limfoizi, penetrează intracelular (prin macropinocitoză dirijată). Bacteriile se propagă intra- şi entercelular graţie polimerizării actinei la un pol al celulei (caracter determinat plasmidic). Urmează multiplicarea locală intracelulară cu invazia celulelor vecine provocând moartea lor. Aceasta duce la inflamaţie fibrinoasă intensă a colonului, micro-abcese şi ulceraţii, cu apariţia mucusului, puroiului şi sângelui în materiile fecale.Perioada de incubaţie – 2 - 4 zileSemne clinice – febră, dureri abdominale, tenesme (spasme rectale), scaune lichide muco-sanguinolente frecvente. Vindecarea în 2-5 zile (clinică, apoi microbiologică).Forme cronice sau portaj sunt posibile.

Prelevate: probe de scaun (elementele muco-sanguinolente), apa, alimente, lavaje de pe suprafeţeMetode de diagnostic. Examenul microscopic – RIF. Examenul bacteriologic:Izolarea culturii pure pe medii DD (Endo, Levin, Ploskirev) sau Îmbogăţirea şighelelor în bulion selenit

Coloniile L- sunt repicate pe mediile Olkeniţki, Kligler pentru acumularea culturii pure şi identificare preliminară(lactoza/zaharoza -, glucoza A, ureea -, H2S -)

Identificarea definitivă a culturii pure: Caractere morfotinctoriale; Caractere de cultură ; Caractere biochimice (teste primare, secundare); Caractere antigenice (seroidentificarea prin RA pe lamă cu seruri imune anti-Shigella poli- şi monovalente); Fagoidentificarea; Virulenţa (testul Sereny la cobai); AntibiogramaDiagnosticul serologic (din a 5-7 zi de boală) : RA, RHAI (adulţi 1:400 (S.flexneri); 1:200 (S.sonnei); copii 1:100; coproanticorpi (Ig A – 1:80); ELISA; RIFIImunitate: specifică de tip, 1-2 ani, umorală (IgA)Profilaxie: vaccinuri ribosomale, inactivate, atenuate (imunitate de scurtă durată) Tratament: antibiotice (trimetoprim, sulfamide, tetraciclină, ampicilina, etc), eubiotice, bacteriofagi, vaccin inactivat (dizenteria cronică)

103. Salmonelozele. Clasificarea salmonelelor (familie, gen, specii, subspecii). Clasificarea Kauffmann-White dupa structura antigenica. Samonelele tifoparatifoidice. Dinamica titrului de anticorpi in febrele tifoparatifoidice, la purtatori sanatosi si ai anticorpilor anamnestici. Diagnosticul serologic. Reactia de aglutinare Widal. Tehnica efectuarii, citirea si interpretarea rezultatelor. Aplicarea practica a reactiilor RHAI, Vi-RHAI.Genul: Salmonella (Daniel Elmer Salmon, veterinar american, care a descoperit bacteria în 1885)Specii: Salmonella enterica, Salmonella bongoriSubspecii ale speciei S.enterica: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indicaSe cunosc peste 2500 Serovariante, majoritatea tulpinilor izolate din patologii umane (99,5%) aparţin ss. S.enterica enterica: S. London, S. Enteritidis, S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B, S.Choleraesuis, etc Salmonella enterica subspecia enterica serovar Typhi = Salmonella Typhi

CLASIFICAREA KAUFFMANN-WHITE (conform structurii antigenice)Ag O – 67 varietăţi antigenice (O1, O2, O3, ... O65, etc), permite repartizarea salmonelelor in serogrupe (A, B, C, D, E,...Z, O51,...)Fracţii antigenice majore desemnează grupa: O2 – A; O4 – B, O6 – C, O9 – D, etcFracţii antigenice minore – comune O1, O12,…Ag H –defineşte serovariante în cadrul grupei. Structura flagelinei este determinată de 2 gene cromozomiale diferite, care se exprimă alternativ (variaţie de fază, frecvenţa 10-4).

Ag H faza 1 (specifică) – Ha; Hb; Hc; Hd; Hg,m… Ag H faza 2 (nespecifică) – H1,2; H1,5; H1,7;…

Serovar monofazic: O1,2,12:Ha (S.Paratyphi A)Serovar difazic: O1,4,12:HbH1,2 (S.Paratyphi B)Ag Vi (K), termolabil, prezent la S.Typhi, S.Paratyphi C, S.Dublin. Este concentrat la polii bacteriei.S. Typhi – O9,12:HdVi+ / O9,12:HdVi-

Conform patogenităţii pentru gazdă se disting: Salmonele monopatogene (umane) (S.Typhi, S.Paratyphi A); Salmonele bipatogene (patogene pentru om şi animale, ubicvitare) – majoritatea

104. Salmonelozele. Salmonelele tifoparatifoide, clasificarea (familie, gen, specie, subspecii), structura antigenica, factorii de patogenitate. Patogeneza febrelor tifoparatifoide. Prelevatele si metodele de diagnostic in dependenta de perioada de boala. Izolarea, acumularea, identificarea hemoculturii si coproculturii (biochimica, serologica, fagoidentificarea). Profilaxia si tratamentul specific.Caractere de cultură

Medii de îmbogăţire : Muller, Kauffmann (medii cu bilă, tetrationat), bulion cu selenit de Na

54

Page 55: Microbiologie Exam

Medii DD de izolare a culturii pure: Endo, Levin , Ploskirev (colonii S, lactozo-); mediul cu sulfit de bismut Wilson-Blair (colonii negre) Medii DD de acumulare şi diferenţiere: Olkeniţki, Kligler (glucoza AG, lactoza-, H2S+, ureaza-)

Teste primare: utilizează citratul de Na, produc H2S, MR+, LDC+, mobilitate+, celelalte teste – negative.Teste secundare: scindează glucidele AG, indol-, ornitindecarboxilaza+, etcEXCEPŢIE: S.Typhi – citrat-, H2S-, scindează glucoza până la acid; S.Paratyphi A – H2S+/-, LDC-

Factori de patogenitate: Fimbrii (adeziune); Capacitatea de a penetra în celule şi de multiplicare intracelulară (Macrofage, celule epitel); Endotoxina ; Citotoxine (SLT) – inhibă sinteza proteică (necroză); Enterotoxine (LT, ST) – activează adenilat/guanilatciclazele membranare (diaree); Siderofori (captarea Fe); Ag Vi (antifagocitar, inhibă activarea C, rezistenţă la activitatea bactericidă a serului). Majoritatea salmonelelor (98%) sunt sensibile la bacteriofagul O1. Există bacteriofagi cu specificitate de specie şi variantă.Habitat: intestinul omului, animalelor, păsărilor. Rezistenţa în mediul extern: salmonelele rezistă la 70°C 30 min., rezistente la concentraţii mari de sare. Se înmulţesc în produse alimentare la temperatura camerei.

ROLUL SALMONELELOR ÎN PATOLOGIA UMANĂSALMONELOZE:

Febre tifo-paratifoide (S.Typhi, S.Paratyphi A, B, C) Salmoneloze digestive (toxi-infecţii alimentare, gastro-enterite)Manifestări extra-digestive: bacteriemii nontifoidice; infecţii pleuro-pulmonare; afecţiuni osteo-articulare (osteite, osteomielite, artrite septice, etc); infecţii cardio-vasculare (pericardite, arterite); infecţii urinare; infecţii abdominale (colecistite, abces al ficatului, splinei); infecţii ale SNC (meningite, abces al creierului, abces epidural, etc)

FEBRELE TIFO-PARATIFOIDEAgenţii cauzali – S.Typhi, S.Paratyphi A, B, (C)Sursa de infecţie – omul bolnav, purtătorul Contaminarea fecal-orală (apă, alimente), contact directDoza infectantă – 105 bacteriiPATOGENEZA

a. Traversarea epiteliului intestinal intact b. Invazia şi multiplicarea intracelulară la nivelul plăcilor Peyer şi ţesutului limfoid al tubului digestiv (perioada de incubaţie)c. Pătrunderea în ganglionii limfatici mezenterici cu multiplicarea salmonelelor (perioada prodromală)

I săptămână de boală (bacteriemie). Invadarea fluxului sangvin, via sistemul limfatic (diseminarea germenilor cu eliberarea endotoxinei). Endotoxina pe cale sangvină parvine la centrii neurovegetativi ai ventriculului 3, determinând febră, stare de tifos, colaps cardio-vascular, leziuni intestinale.II săptămână de boală (difuzie parenchimatoasă)Bacteriile sunt fixate în organele SRE şi se multiplică în ficat, splină, măduvă osoasă, ţesut limfoid, etc III-IV săptămână de boală (faza alergică). Din ficat salmonelele pătrund în căile biliare, apoi iarăşi în intestin. La nivelul plăcilor Peyer se dezvoltă o reacţie de hipersensibilitate tip 4 - necroză, ulceraţii. Din această perioadă începe eliminarea salmonelelor cu saliva, materiile fecale, urina, bila, etc.

Manifestări clinicePerioada de incubaţie - 1-3 săptămâniPerioada prodromală (de invazie) – 1-3 zilePerioada de stare. Debut brutal, cu frison, febră 39-41 grade, cefalee, stupoare, somnolenţă, delir, comă. Erupţii cutanate (rozeole) apar pe abdomen, torace, spate în ziua a 8-9 de boală (embolii limfatice cu bacterii). Diaree, constipaţie, tulburări cardiovasculare. Durata 7-10 zile Complicaţii: hemoragii intestinale, perforarea intestinului, peritonită, miocardită, meningită, psihoză etc. Perioada de reconvalescenţă (1-3-6 luni)

Imunitatea – celulară, umorală. 5-10% convalescenţi – purtători până la 3 luni (cu depistarea salmonelelor în bilă sau/şi urină). 3-5% convalescenţi (cu litiază biliară) – purtători cronici– (1-10 ani – toată viaţa)Recidive sunt posibile (descărcări bacteriemice din focare profunde, forme L), se caracterizează prin simptome atenuate şi evoluţie de scurtă durată

PRELEVATE: sânge (perioada febrilă, în special I săptămână de boală), urină (începând cu a II săptămână), materii fecale (II-III săptămână de boală), exudat din rozeole, ser sangvin (din ziua a 7-ea), bilă, măduvă osoasă METODE DE DIAGNOSTICExamenul microscopic – RIFIdentificarea finală în baza studiului caracterelor morfotinctoriale, de cultură, biochimice, antigenice (RA pe lamă cu seruri imune polivalente ABCDE, seruri monovalente anti-O de grup (O2, O4, O6, O9, etc) , seruri monospecifice anti-H (de variantă), seruri anti-Vi, sensibilitatea la bacteriofagi). Rezultatul definitiv negativ – în ziua a 11.

Rozeolocultura (exudatul din rozeole se întroduce în 3-5 ml bulion biliat). Mielocultura (0,5 ml măduva osoasă din stern în 3-5 ml bulion biliat). Bilicultura (după 3-6 luni de la vindecare, 5-10 ml bilă se întroduc în BP).

Se examinează ca şi hemocultura. Coprocultura (din săpt. 2) – 3-5 g materii fecale se însămânţează direct pe medii DD şi pe medii de îmbogăţire. Urocultura (10 ml urină se centrifughează, sedimentul se examinează ulterior ca şi coprocultura).

Serodiagnostic (din II săptămână)RA Widal (la diluţii ale serului bolnavului se adaogă diagnosticuri OH din S.Typhi, ParatyphiA şi B). Titrul diagnostic 1/200 sau creşterea în dinamică a titrului RA modificarea Felix (utilizarea separată a diagnosticurilor O şi H). Anticorpii anti-O (Ig M) apar primii (începând cu ziua 7-8) şi dispar după 2-3 luni (maximum săpt. II-III).Anticorpii anti-H (Ig M, apoi Ig G) apar mai târziu (10-12 zi) şi persistă o durată mai lungă. În debut de reconvalescenţă (săptămâna a IV) titrul Ac anti-O şi anti-H se egalează.RHAI (cu diagnosticuri eritrocitare O).

55

Page 56: Microbiologie Exam

Investigarea purtătorilor: Coproculturi repetate; Urocultura; Bilicultura ; Serodiagnostic; Reacţia de Vi-aglutinare (eritrocite sensibilizate cu Ag Vi). Titrul diagnostic - 1/40; Reacţia de latex-aglutinare; Determinarea claselor de imunoglobuline Ig M sau Ig G

Tratament: Fluorochinolone; Cefalosporine de generaţia III; Cloramfenicol; Ampicilină ; CotrimoxazolProfilaxia specifică: vaccinarea selectivă (zone endemice, militari, personal medical, etc) Vaccinul chimic TABTe; Vaccinul atenuat Ty2 (administrare orală, imunitate locală sIg A), contraindicat gravidelor, copiilor, imunodeprimaţilor; vaccinul subunitar din Ag Vi (areactogen, imunitate 3-5 ani)

105. Salmonelozele. Salmonelele nontifoidice (bipatogene). Clasificarea (familie, gen, specii, subspecii). Structura antigenica, clasificarea Kauffmann-White. Serovariante mai frecvent izolate. Factorii de patogenitate. Patogeneza salmonelozelor, formele clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate, izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (biochimica, serologica). Diagnosticul serologic. SALMONELOZE DIGESTIVE (gastro-enterite, toxi-infecţii alimentare)Consecutive consumului de alimente contaminate cu salmonele (ouă, maioneză, patiserie cu cremă, carne, etc).Agenţii cauzali: salmonele bipatogene

Gr. B (S. Typhimurium, S. Paratyphi B, S. Heidelberg, S. Derbi)Gr. C (S. Choleraesuis, S. Newport, S. Paratyphi C)Gr. D (S. Enteritidis, S. Dublin)Gr. E (S. Anatum)

PATOGENEZA GASTROENTERITELOR Sursa de infecţie: animalele domestice şi păsările (bolnave sau purtători cronici)Transmiterea pe cale alimentară (alimente contaminate direct de la sursă sau pe parcursul procesului tehnologic), prin apă sau contact direct.Doza infectantă – 106-108 salmoneleSalmonelele colonizează mucoasa intestinului subţire, fiind entero-invazive provoacă distrugerea epiteliului (SLT) şi o reacţie inflamatoare intensă (gastroenterită, gastroenterocolită acută). Enterotoxina provoacă diaree (activează adenilatciclaza sau guanilatciclaza enterocitelor), endotoxina absorbită acţionează asupra SNC – semne de intoxicaţie. Gastroenteritele pot fi urmate de bacteriemii.Manifestări clinice:

Perioada de incubaţie – 8 - 48 oreDebut brusc şi evoluţie acută (1-3 zile) cu diaree, vomă, febră, cefalee, stare de rău.Evoluţie severă – la sugari, bătrâni, imunodeprimaţi (în special cu SIDA).

TOXIINFECŢII ALIMENTARESurvin ca urmare a ingestiei unui aliment în care s-au acumulat cantităţi mari de mi/o (105 – 107). Nimerind în intestin, bacteriile pătrund în sânge, se distrug, iar endotoxina eliberată provoacă semnele clinice de intoxicare.Alte forme de salmoneloze (septicemii, meningite, infecţii urinare, etc) se dezvoltă la persoane cu rezistenţa scăzută.

Diagnosticul de laborator al salmonelozelorPrelevate: mase fecale, mase vomitive, sânge, spălături gastrice, urină, resturi de alimente suspecte.Metode de diagnostic: Examenul bacteriologic – de bază (coprocultură, hemocultură, urocultură...); RIF – pentru diagnostic rapid; Serodiagnostic - RHAIProfilaxia salmonelozelor – nespecifică. Tratamentul– simptomatic, antibioterapie la necesitate

106. Holera. Clasificarea vibrionilor (familie, gen, sp.). Criteriile de clasificare a V.cholerae în serogrupe, biovariante, serovariante. Factorii de patogenitate ai V.cholerae. Patogeneza holerei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Principiile metodelor rapide, citirea, interpretarea rezultatelor. Importanta metodei serologice de diagnostic a holerei.Familia: VibrionaceaeGenuri: Vibrio Aeromonas (inf de plagă, diaree, septicemii) Plesiomonas (gastroenterite, septicemii, meningite) Photobacterium (saprofit) Enhydrobacter (saprofit)Caractere generale (cheie): bastonaşe G-, drepte sau încurbate, mobile (mono sau lophotrichi), reduc nitraţii în nitriţi, fermentează glucidele, oxidaza+, catalaza+

GENUL VIBRIOBastonaşe G-, încurbate, nesporogene, necapsulate, mobile monotricheClasificarea:- Vibrioni halotoleranti - Vibrio cholerae (agenţii holerei şi diareelor holeriforme)- Vibrioni halofili – V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.anguillarum, V.vulnificus, V.metschnikovii (oportunisti, cauzează toxiinfecţii alimentare, septicemii, meningite, supuraţii)- Vibrioni free life (saprofiţi)

VIBRIO CHOLERAEClasificare :Serogrupuri:Vibrio cholerae O1, O2, ... O155- V.cholerae O1 şi V.cholerae O139 Bengal (descris in 1992, mutant al Ag O, biovarul El Tor)– agenţii cauzali ai holereiBiovariante ale V.cholerae O1 :

V.cholerae cholerae (clasic) – descoperit in 1817 de catre R. Koch, 6 pandemii V.cholerae El Tor – izolat in 1905 in Lazaret din El Tor, in 1961 determina pandemia a VII

Serovariante ale V.cholerae O1 - Ogawa, Inaba, HikojimaV.cholerae non O1/non O139 (O2, O3,... etc, vibrioni NAG) – responsabili de sindrom holeriform, diaree, toxiinfecţii alimentare

HOLERA

56

Page 57: Microbiologie Exam

Agenţii cauzali: V.cholerae O1 (b/v Clasic şi El Tor; s/v Ogawa, Inaba, Hikojima), V.cholerae O139 BengalCaractere de cultură: Anaerobi facultativi, temperatura optimă de cultivare -- 37 grade. Cresc pe medii simple, dar preferă pH alcalin (8-9) şi concentraţii de 3% NaCl. Sensibili la pH acid Mediu de îmbogăţire – Apa peptonată alcalină 1% (AP)Medii de izolare a culturii pure – Geloza alcalină (mediu electiv-selectiv) - GAMediul TCBS (tiosulfat-citrat-bilă-zaharoză) – DD şi selectivManifestarea creşteriiAP – peste 6 ore de incubare – văl fin la suprafaţa mediului GA – peste 12 ore – colonii S (R atipice), transparente, cu nuanţă albăstruieTCBS – peste 12 ore – colonii S, opace, galbene (fermentarea zaharozei)Caractere biochimice: V.cholerae este catalaza+ şi oxidaza+, reduce nitraţii în nitriţi, produce indol, posedă gelatinază şi LCD, fermentează glucoza până la acid.Conform activităţii glicolitice V.cholerae aparţine grupului I Heiberg (fermentează zaharoza şi manoza, nu fermentează arabinoza)Se disting 2 biotipuri (variante) de V.cholerae: clasic (V.cholerae cholerae) şi El Tor (V.cholerae El Tor), identice morfologic şi antigenic.

Diferenţierea biovariantelorSTRUCTURA ANTIGENICĂ A VIBRIO CHOLERAE

Ag O somatic, LPZ, termostabil (peste 155 serogrupe - O1, O2....O155…) Ag O1 este constituit din 3 fracţii - A,B,C 3 serovariante V.cholerae: Ogawa (A,B), Inaba (A, C), Hikojima (A; B; C)

Ag H, proteic, termolabil, comun pentru V.cholerae

FACTORI DE PATOGENITATE Factori de adeziune (pili, Ag O1, glicocalixul) Enzime de patogenitate (mucinaza, neuraminidaza, LDC, lecitinaza) Enterotoxina (toxina holerică, holeragen), constituită dintr-o subunitate A (A1, A2) şi 5 subunităţi B. Mecanismul de acţiune: Subunităţile B servesc la fixarea de receptorul gangliozidic GM1 de pe membrana enterocitului, A2 asigură pătrunderea intracelulară a fragmentului A1. Acesta activează adenilatciclaza membranară, ce duce la creşterea concentraţiei de AMPc intracelular cu inhibitia absorbtiei bicarbonatului şi secreţia exagerată a cloridului. Apa şi electroliţii (Na+ şi K+) se acumulează în lumenul intestinal. Rezultă deshidratare extracelulară intensă cu hemoconcentraţie, şoc hipovolemic şi acidoză metabolică.

PATOGENEZA HOLEREI ŞI MANIFESTĂRILE CLINICEHOLERA – toxiinfecţie intestinală acută, strict umană.Agentul cauzal – V.cholerae O1/O139Sursa de infecţie – bolnav, convalescent, purtător sănătos (crustacee acvatice?)Mecanismul de transmitere: fecal-oral; contact direct (manual); alimentar (apa, alimente)Doza infectantă – 109 UFC (104 pentru persoane cu hipoaciditate gastrică)Vibrionii care au supravieţuit nimeresc în intestinul subţire. Local mucinaza descompune mucusul, ce permite adeziunea la enterocit şi multiplicarea vibrionilor (colonizarea) cu secreţia toxinei.

Evoluţia clinică a holerei:I - perioada de incubaţie (2-5 zile)II – enterita holerică (scaune frecvente, abundente, apoase, aspect “zeamă de orez”)III – gastro-enterita (scaune frecvente – 20 ori pe zi – vome abundente. Consecinţe – deshidratare, carenţe de săruri, acidoză, hipoxie tisulară, hipotensiune, contracţii (crampe) musculare.IV - Algida holerică (stare extrem de gravă, hipotermie, asfixie, colaps, comă, deces)

Imunitatea – umorală (sIgA, IgG), antibacteriană şi antitoxică, de scurtă durată (2 ani), reinfecţii sunt posibile

107. Holera. Criteriile de clasificare a V.cholerae (serogrupe, biovariante, serovariante), factorii de patogenitate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele, recoltarea, conservarea. Metoda microscopica. Metoda bacteriologica: îmbogaţirea, izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (teste biochimice, biologice, serologice). Etapele, durata examenului bacteriologic. Profilaxia specifica a holerei.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HOLEREIPrelevate: mase vomitive, materii fecale, bilă (purtători), de la cadavru – 3 fragmente din intestinul subţire şi vezica biliară, prelevate din mediul extern (apa, alimente)Metode de diagnostic1. Diagnosticul rapid: Studierea mobilităţii (preparate native – bacterii mobile, încurbate, grupate în “bancuri de peşti” sau “pescăruşi în zbor”; Frotiu Gram (bacterii G-, încurbate); Imobilizarea vibrionilor cu serul anti-O1; Imobilizarea vibrionilor cu bacteriofagi “C” şi “ET”; RIF2. Examenul bacteriologic (de bază)Prelevatele se însămânţează în AP I (îmbogăţire) şi GA I (TCBS) (izolarea culturii pure) – termostatPeste 6 ore se examinează cultura din AP (văl la suprafaţă), utilizată pentru diagnosticul rapid, apoi se reînsămânţează pe AP II şi GA II.Peste 12 ore se examinează coloniile de pe GA I sau TCBS. Coloniile suspecte (plate şi transparente cu nuanţă albăstrie pe GA, galbene pe TCBS) sunt expuse diagnosticului rapid (5 teste), apoi repicate pe mediul cu lactoză şi zaharoză pentru acumularea culturii pure şi diferenţiere primară. AP II poate fi utilizată pentru efectuarea testelor rapide si însămânţare pe GA III.Culturile lactoza-/zaharoza+ sunt identificate morfologic, cultural, biochimic, serologic (cu ser O1 polivalent, apoi cu seruri monospecifice Ogawa şi Inaba), diferenţierea biovariantelor.3. Depistarea toxinei In vivo (ansa ligaturata la iepure, culturi de celule)In vitro (ELISA, cu utilizarea gangliozidului GM1) Tehnici de biologie moleculara (PCR, etc)4. Serodiagnostic (retrospectiv)Anticorpii (aglutinine, vibriocine) apar după 10-15 zile de boală.- RA (serul bolnavului + diagnostic din V.cholerae O1 (titrul diagnostic 1/80)

57

Page 58: Microbiologie Exam

- RHAI (serul bolnavului + diagnostic eritrocitar)- Dozarea antitoxinelor (ELISA, RHAI)- Reacţia de vibrioliză (serul bolnavului + cultură de vibrioni + complement). - Titrul diagnostic – 10-4

Tratament: Antibiotice (tetraciclină, sulfanilamide, doxiciclina); Rehidratare; Tratament simptomatic Profilaxie: Igiena individuală şi colectivă; Vaccinarea (vaccin inactivat, vaccin subunitar, holeragen-anatoxină); Imunitatea –până la 6 luni; Vaccinul viu este in proces de studiu.

108. Rickettsiozele. Tifosul exantematic. Agentii cauzali (familie, gen, sp.). Patogeneza infectiei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metodele microscopica, biologica. Diagnosticul serologic si diferentierea tifosului exantematic epidemic, endemic, bolii Brill-Zinsser. Profilaxia specifica.CARACTERISTICA GENERALĂ A RICKETTSIILORRickettsiile = bacterii intracelulare obligatorii. Ciclul lor de dezvoltare necesită o gazdă vertebrată (om, câine, şobolan) şi un vector (păduche, purice, căpuşă, acarian).Reprezintă mi/o G- de dimensiuni mici, comparabile cu virusurile mari (500 nm). Totuşi, reprezintă bacterii, deoarece se multiplică prin diviziune binară, posedă ADN şi ARN, sunt sensibile la antibiotice.

CLASIFICAREFamilia RickettsiaceaeGenuri: Rickettsia (care include 2 grupuri)Grupul tifos, constituit din R.prowazekii (responsabilă de tifosul exantematic epidemic, vector păduchele) şi R. typhi (responsabilă de tifosul exantematic endemic, murin, vector puricele)Grupul febrelor pătate, transmise prin căpuşe (R.rickettsii, R.conorii, R.australis, R.akari, R.sibirica, etc)Genul Orientia, cu unica specie O.tsutsugamushi, agentul febrei de lăstărişGenul Coxiella, unica specie C.burnetii, responsabilă de febra QN.B. Genurile Ehrlichia şi Bartonella nu mai aparţin familiei Rickettsiaceae.

RICKETTSIACaractere morfotinctoriale: bacterii G-, polimorfe (coco-bacterii, bastonaşe, forme filamentoase, etc), imobile, asporogene, posedă microcapsulă. Prin tehnica de colorare Macchiavello-Gimenez (fucsină+verde de malahit) rickettsiile apar colorate în roşu pe fondul verde palid al citoplasmei. Coloraţia Giemsa – roşii în citoplasma albastră.Caractere de cultură: fiind paraziţi intracelulari (nu pot fosforila glucoza şi folosesc metaboliţi intermediari din gazdă), rickettsiile nu cresc pe medii artificiale. Ele pot fi cultivate doar pe animale de laborator, vectori, ou embrionat de găină sau culturi de celule.Rickettsiile se multiplică prin diviziune binară în interiorul celulei-gazdă. Imediat după diviziune, în condiţii nutritive bune, rickettsiile sunt antrenate în mişcări rapide şi parcurg citoplasma celulei-gazdă în toate direcţiile. Aceste deplasări sunt determinate de polimerizarea filamentelor de actină. Atunci când mediul este sărac diviziunea se opreşte, bacteriile se alungesc, cu apariţia formelor filamentoase.

Strategii de multiplicare intracelulară:Reprezentanţii genului Rickettsia vieţuiesc liber în citoplasmă, graţie capacităţii de a părăsi rapid vacuola de fagocitoză. Coxiella burnetii se multiplica în fagolizosomi cu pH acid.Structura antigenică a rickettsiilor:

Ag corpuscular cu specificitate de specie Ag solubil cu specificitate de grup

Fracţii Ag comune cu tulpina Proteus OXo OX 19 pentru grupul tifos exantematico OX 2 şi OX 19 pentru grupul febrelor pătateo OX K pentru grupul tifos de lăstăriş

Factori de patogenitate: Exotoxina; Hialuronidaza; Hemolizina

Agenţii cauzali ai tifosului exantematic: R.prowazekii – provoacă tifosul exantematic epidemic. R.typhi – provoacă tifosul endemic, murin.

Patogeneza tifosului exantematic epidemic:Sursa de infecţie – omul bolnav de tifos exantematic sau de boala Brill-ZinsserVectorul – păduchele uman. Păduchele se infectează de la bolnav în ultimele 2 zile de incubaţie, pe parcursul perioadei febrile şi 2-3 zile după normalizarea temperaturi. Rickettsiile se multiplică în celulele epiteliale intestinale ale păduchelui fiind eliminate cu dejectele. Astfel, omul se contaminează nu prin înţepătura păduchelui, ci prin leziunile cutanate sau mucoase în care au nimerit dejectele insectei. Infectarea este posibilă şi prin inhalarea prafului în care se conţin rickettsii uscate sau la nimerirea acestui praf pe conjunctiva ochiului. În SUA – de la veveriţe zburătoare prin intermediul ectoparaziţilor acestora. După inoculare rickettsiile trec în sânge, penetrează în celulele endoteliale ale vaselor sangvine mici, se înmulţesc şi le distrug. Rickettsiile secretă factori procoagulanţi care determină tromboză cu inflamaţie periadventiţială a vaselor mici (nodulii Popov-Frankel). Leziunile sunt mai numeroase în tegument, SNC, miocard.Perioada de incubaţie – 6-23 zile (10-12 zile)Debutul este brusc, cu febră 40-41 grade C, cefalee, insomnie, slăbiciuni, excitaţie, hiperactivitate nervoasă şi psihică. Se observă hiperemia feţei şi faringelui, sclerele sunt injectate. În ziua a 4-6 a maladiei apare o erupţie cutanată rozeolo-peteşială (pe trunchi, apoi pe membre), însoţită de splenomegalie. Febra dispare peste 2 săptămâni. Convalescenţa este lungă şi astenia durabilă. După vindecare nu rămân sechele.

Imunitatea anti-rickettsiană este mediată celular, anticorpii neutralizează efectul toxic al rickettsiilor. Însă imunitatea nu elimină obligatoriu toate rickettsiile prezente în organismul convalescentului. Aceste bacterii latente se manifestă la persoane în vârstă în absenţa pediculozei, atunci când imunitatea scade (boala Brill-Zinsser, tifosul de recădere, tifosul fără păduche). Procesul infecţios poate fi reactivat sub influenţa unor maladii intercurente, a stresului, etc. În timpul maladiei B-Z rickettsiemia este de 10 ori mai rară decât în

58

Page 59: Microbiologie Exam

forma epidemică a tifosului exantematic şi durează cel mult 5-8 zile. Evoluţia este benignă, erupţia este mai abundentă, roză, intoxicaţia este redusă. La bătrâni pot surveni complicaţii vasculare.

Tifosul exantematic endemic: agentul cauzal este R.typhi, sursa de infecţie – şobolanul, iar vectorul – puricele. Clinica se aseamănă cu cea a tifosului epidemic, dar gravitatea este redusă - simptome mai puţin severe, erupţia mai săracă.

Diagnosticul direct (examenul microscopic, bacteriologic) se efectuează în laboratoare specializate.Prelevate: sânge, bioptate din ţesuturile infectate, vectoriExamenul microscopic: se examinează celulele endoteliale circulante în sânge sau frotiuri-amprente din ţesutul infectat. Frotiurile se colorează Giemsa sau Macchiavello. Rickettsiile apar roşii pe fondul albastru (respectiv verde) al citoplasmei celulei-gazdă. Poate fi montată RIF.Examenul bacteriologic: prelevatele sunt inoculate la cobai sau şoarece, în cavitatea vitelină a oului embrionat de găină sau pe culturi celulare. Tulpina izolată astfel va fi identificată prin RIF, RFC, RAR.Examenul serologic: este bazat pe depistarea Ac din serul bolnavului cu ajutorul Ag din Proteus OX şi Ag rickettsiene (de grup sau de specie).Reacţii nespecifice: Reacţia de aglutinare Weil-Felix, foloseşte ca Ag suspensii de Proteus OX 19. Se pozitivează la sfârşitul primei săptămâni de boală. Titrul aglutininelor atinge valoarea maximă la începutul convalescenţei şi scade la valori nesemnificative peste câteva luni după boală. Valoare diagnostică are creşterea titrurilor de cel puţin 4 ori pe parcursul bolii. Reacţii cu antigene rickettsiene (specifice): RFC, cu Ag rickettsian total. Devine pozitivă la finele primei săptămâni de boală, maxim în săptămâna 3 sau 4 şi persistă mai mulţi ani după vindecare. Sunt semnificative titruri peste 1:16, cu creşterea de cel puţin 4 ori în evoluţia bolii. RAR (reacţia de aglutinare a rickettsiilor). Este foarte sensibilă şi specifică, cu utilizarea Ag corpusculare purificate. Curba aglutininelor evoluează paralel cu cea a Ac fixatori de complement. Titrul diagnostic - 1:160 şi mai mult. RHAI. Hemaglutininele pot fi detectate din ziua a 4 de boală în titruri 1:20 – 1:40 care cresc în săptămâna a 2 atingând cifrele 1:160-1:320. Titrul diagnostic este de 1:160. Peste 3 luni de la debutul bolii titrul acestor Ac scade până la valori nesemnificative. RIFI. RN a toxinei rickettsiene. Se efectuează pe şoricei. In calitate de toxină se utilizează o suspensie de rickettsii vii, care va fi neutralizată cu ser imun în diferite diluţii. Identificarea ADNului rickettsian prin PCR

Diferenţierea dintre tifosul exantematic şi boala Brill-ZinsserPentru boala Brill-Zinsser este caracteristic: Tifos exantematic în anamneză. Absenţa pediculozei. Evoluţie benignă. Reacţia Weil-Felix negativă. Titrul Ac în RFC nu creşte în dinamică. Ac din clasa Ig G

Diferenţierea tifosului exantematic epidemic de cel endemic: Evoluţie benignă în tifos endemic; După titrul Ac în reacţiile cu Ag specifice; Inocularea intraperitoneală la cobai masculi: R.prowazekii provoacă febră, iar R.typhi – inflamaţie scrotală

Tratamentul tifosului exantematic: Antibiotice care penetrează intracelular: Tetracicline (doxiciclina, minociclina); Cloramfenicol; Rifampicina, eritromicina, ciprofloxacinaProfilaxia tifosului exantematic: Măsuri antiparazitare: despăduchere, deratizare, respectarea igieneiProfilaxia specifică: există vaccinuri inactivate (corpusculare şi subunitare) preparate din cultură rickettsiană izolată în oul embrionat, în păduchi sau în plămânii şoriceilor albi. Aceste vaccinuri conferă imunitate de scurtă durată.Vaccinul viu, preparat din tulpina E de R.prowazekii este mai imunogen, dar are proprietăţi alergizante.

Genul Coxiella reuneşte bacterii intracelulare G- (coco-bacterii), care se disting de reprezentanţii genului Rickettsia prin rezistenţa la agenţi fizici (formează spori) şi prin structura lor antigenică diferită. Se caracterizează prin variaţie antigenică (de fază). Faza I este virulentă, faza II este atenuată.Specia-tip este C.burnetii, cu repartiţie mondială. Provoacă febra Q (Query fever). Rezervorul de germeni şi sursa de infecţie îl constituie animalele (rozătoare, ovine, caprine, bovine). Căile de transmitere la om: Aerogen (picături, praf); Alimentar (lapte contaminat); Prin vectori-artropode – foarte rarProfesiile expuse riscului: agricultori, veterinari, muncitori la abatoare, măcelariDupă o incubaţie de 2-3 săptămâni boala debutează brutal cu febră iniţial în platou, apoi ondulantă, cefalee, transpiraţii, astenie, semne de bronho-pneumonie, pneumopatie atipică şi/sau hepatită. Complicaţii – endocardita subacută sau cronică cu hemoculturi negative.

Diagnosticul de laborator al febrei QIzolarea bacteriilor din bioptate (ficat, tegument, valve) sau din sânge. Se efectuează inocularea cobailor, a oului embrionat de găină sau a culturilor de celule. Tulpina izolată se identifică în RIFDepistarea rapidă a C.burnetti în prelevate prin RIFDetectarea genomului cu ajutorul PCRDiagnosticul serologic: RFC cu Ag de faza I şi II (existenţa Ac anti-faza I este utillă în diagnosticul endocarditelor); RIFI (permite separarea IgG, IgM şi IgA); creşterea titrului Ac IgA este specific în endocardite; ELISA.

109. Caracterele morfobiologice ale virusurilor gripale (clasificarea in serogrupuri si serotipuri, morfologia, structura virionului, structura antigenica, variabilitatea genetica). Patogeneza gripei. Diagnosticul de laborator al gripei. Prelevatele, metodele de diagnostic (virusoscopica, virusologica, serologica). Profilaxia si terapia specifica a gripei. FAMILIILE ORTHO- ŞI PARAMYXOVIRIDAE Mixovirusurile reunesc virusuri ARN- cu afinitate pentru mucoproteine (myxo – mucus) repartizate în 2 familii: Orthomyxoviridae; Paramyxoviridae

FAMILIA ORTHOMYXOVIRIDAEGenuri: Influenzavirus A (virusul gripal A); Influenzavirus B (virusul gripal B); Influenzavirus C (virusul gripal C); Thogotovirus (virusurile Dhori şi Thogoto)Agenţii cauzali ai gripei – infecţie respiratorie acută cu simptome sistemice importante. Tipul A provoacă pandemii periodice (1918 – 20 mln decesuri, 1957, 1968, 1977)Tipurile A şi B – epidemii regionale şi locale. Anual – 3-5 mln cazuri grave, 300 – 500 mii decesuri1933 – prima cultură de virus gripal uman (Smith, Andrewes şi Laidlaw).

MORFOLOGIA, COMPOZIŢIA CHIMICĂ A VIRUSULUI GRIPAL tipul AParticule rotunde, 80-120 nm, sau filamentoase, constituite din:

1. Genom = 8 segmente de ARN2. Capsida (NC) – tubulară, de simetrie helicoidală, separată pentru fiecare segment

59

Page 60: Microbiologie Exam

3. Supercapsida: Dublu strat lipidic extern (origine celulară) Strat intern proteic (matrice, prot. virale M1, M2) – asigură legătura dintre GP de suprafaţă şi NC; M2-canal ionic 2 tipuri de GP înserate în membrană: hemaglutinina - HA (H) şi neuraminidaza -NA (N), distincte morfologic şi biologic (virusul

gripal C – doar HA)Hemaglutinina (HA, H) H1 – H16Trimer compus din 2 polipeptide HA1 şi HA2HA1 – fixarea specifică a virionilor la receptori glicopeptidici membranari (inclusiv de pe hematii), ce conţin acid N-acetilneuraminic/acid sialicHA2 – fuziunea supercapsidei cu membrana celulei-gazdăAnticorpii anti-HA: Inhibă fixarea virusului de celula-ţintă; Inhibă hemaglutinarea Neuraminidaza (NA) N1 – N9. Tetramer, polipeptid unic. Funcţii : Clivează legătura dintre acidul sialic şi glucidul alăturat (tratarea celulelor cu neuraminidază impiedică infecţia celulei cu virus). Asigură detaşarea virionilor înmuguriţi prin eliminarea acidului neuraminic/sialic din receptorii celulariAnticorpii anti-NA limitează diseminarea virionilorSTRUCTURA ANTIGENICĂ: Ag interne NP şi M, specifice de tip A,B,C; Ag externe HA şi NA, specifice de subtip şi de variantă. 16 variante de HA (H1-H16) şi 9 de NA (N1-N9), asociaţiile lor formează subtipuri de virus A. La om – N1, N2 şi H1, H2, H3 (H1N1; H2N2; H3N2)Variaţii antigenice ale ha şi na:Variaţii Ag minore – drift (mutaţii punctiforme, modifică câţiva AA din HA sau/şi NA cu aparitia unor varietăţi de serotipuri, caracteristic pentru tipurile A şi B) – provoacă epidemii fiecare 3-4 ani.Variaţii Ag majore – shift (recombinaţii genetice, schimbarea completă a unui sau câtorva segmente genomice –HA, NA, P, M, etc. Determina mutaţii importante, aparitia serotipurilor noi) - provoacă pandemii.

Cultivarea virusului gripal: Ou embrionat de găină (cavitatea amniotică şi alantoică); Culturi de celule (fibroblaşti de pui, culturi primare de rinichi de maimuţă, etc); Reproducerea infecţiei la maimuţe, dihori Multiplicarea virusului. Ataşarea (adsorbţia) – HA1+acid neuraminic. Penetrarea – endocitoză. Decapsidarea – fuziunea supercapsidei şi membranei vacuolei de endocitoză, NC penetrează în nucleu prin porii membranei nucleare. Biosinteza (eclipsa): Transcrierea ARNm (transcriptaze P1, P2, P3), Translaţia ARNm şi sinteza proteinelor virale (Ct), Replicarea genomului (ARNv....ARNc....ARNv). Asamblarea: În citoplasmă: HA şi NA se inseră în MCt, iar M1 şi M2 o căptuşesc din interior, În nucleu: NP se asociază cu ARN-, formând NC, apoi migrează spre zonele modificate ale MCt (via AG). EliberareA – înmugurire. NA ajută la desprinderea virionilor de MCt şi evită formarea agregatelor. Celula rămâne aparent viabilă, dar epuizată şi moare. Citoliza este determinată de răspunsul imun citotoxic (NK, LTC).

Virusul gripal A se întâlneşte la om şi animale: porc, cal, păsări, foci, balene, etc. Virusul gripal B – om (foci)Virusul gripal C – om (câine, porc). Sursa de infecţie – omul bolnav (animale? Cazuri sporadice de gripă aviară la om (H7N1, H9N2, H5N1) – 2003/04 în Vietnam, 1997 – Hong Kong).

Virusul este prezent în rinofaringe în primele 2 zile de la debutul bolii. Mecanismul de transmitere – aerogen, prin picături Flugge (tuse, strănut). Virusul se propagă în căile respiratorii superioare şi inferioare, inducând o inflamaţie a mucoasei şi edem al laringelui, traheii şi bronhilor. Celulele epiteliale ciliate sunt distruse (fără a afecta celulele bazale). Procesul regenerativ începe cu ziua a 5 şi repararea completă a epiteliului are loc în 1 lună. Contingent de risc - persoane în vârstă, copii, imunodeprimaţi, bolnavi cu maladii cronice cardiovasculare, respiratorii, insuficienţă renală, diabet.

Forme clinice:o Gripa inaparentă, asimptomaticăo Gripa comună (benignă, durata 4-7 zile). Incubaţia câteva ore - 2 zile. Debut brutal, cu frison, febră, cefalee, rinoree, tuse, mialgii,

artralgii, anorexie, astenie (IFN?). Complicaţii (infecţii secundare bacteriene): otite, sinusite, bronşite, bronhopneumonii, etc. Complicaţii rare: sindromul Reye (encefalită acută cu degenerescenţa ficatului); sindromul Guillain-Barre (poliradiculonevrită).

o Gripa malignă (pneumonie virală primitivă cu edem pulmonar şi IRA)

Prelevate: lavaje/aspiraţii nazale, traheale, expectoraţii bronşice (în primele 48 ore)Examenul virusoscopic –microscopia electronica, RIFExamenul virusologic

1. Izolarea în oul embrionat de găină de 10-11 zile sau culturi de celule (MDCK). 2. Indicarea virusului – activitate hemaglutinantă faţă de eritrocite de cobai, găină, curcan a lichidului amniotic şi alantoic, hemadsorbţia

lor pe cultura de celule. 3. Identificarea – RIF, RIHA, RIHAds, RN

Detectarea Ag virale în sedimentul celular (RIF, ELISA) Detectarea genomului viral Serodiagnosticul gripei: Retrospectiv, de confirmare. Se examinează seruri perechi. Se determină creşterea titrului de Ac de 4 ori, sau prezenţa Ac Ig M. Reacţii: RFC cu Ag NP (determinarea tipului), RIHA cu suşa virală circulantă, ELISA, RNImunitatea: celulară (LTC, NK), umorală (Ig G, Ig A), specifică de subtip.

Tratamentul gripei: Amantadină, rimantadină. Împiedică pătrunderea NC în citoplasma celulei infectate cu virus A. Posibilitate rezistenta tulpini. Zanamivir, oseltamivir. Au structura similară acidului neuraminic. Inhibă activitatea NA, împiedicând eliberarea virusurilor A şi B şi diseminarea lor prin mucus, determină agregarea virionilor. Interferon, unguent oxolinic.Tratament simptomatic (antipiretice, antibiotice, etc)Profilaxia specifică a gripei: Vaccinuri inactivate: conţin 2 tulpini de virus A (H1N1 şi H3N2) şi o tulpină B, cultivate in ovo şi inactivate cu beta-propiolacton. Inoculare i/m, s/c; Ig G persistă 5-6 luni. Vaccinuri vii atenuate: tulpinile sunt cultivate in ovo la 25 C, atenuate prin pasaje multiple. Administrare intranazală prin aerozol, imunitate locală (Ig A). Vaccinuri subunitare: constituite din HA şi NA

110. Familia Picornaviridae. Genul Enterovirus. Caracterele morfobiologice ale virusurilor poliomielitice (morfologia, structura virionului, structura antigenica). Patogeneza poliomielitei. Diagnosticul de laborator. Prelevatele (recoltarea, prelucrarea prealabila), metodele de diagnostic (virusologica, serologica). Profilaxia specifica a poliomielitei.

FAM. PICORNAVIRIDAE. agenti patogeni ai unor imbolnaviri digestive, respiratorii, uneori nervoase, +/- exantem la om si animale (bovine, porcine, simiene) Clasificare: Genul Enterovirus - boli la om, Genul Rhinovirus - boli la om, Genul Cardiovirus, Genul Aphtovirus

60

Page 61: Microbiologie Exam

Genul Enterovirus Clasificare: 68 serotipuri (antigenicitate, imbolnaviri): v. Poliomielitice 1, 2, 3; v. Coxsackie: grup A (23 serotipuri), grup B (6 serotipuri); v. Echo: 32 serotipuri ; Enterov. (Ev): 68- 71; v. Hepatitei A (Ev 72) Caractere comune Morfologie virioni sferic , 27-30nm, neinveliti

capsid : cubica (icosaedric, 60 subunitati (organizate in 12 pentamere); subunitatea are 4 proteine capsidale (VP1, VP2, VP3 in exterior si VP4 in interior)

genom: ARN m.c., sens +, are atasat o VPg cu rol de initiere replicare Structura antigenica depinde de epitopii exteriori VP1, VP2 si VP3 induc Ac SN, v.polio VP1 rol in SN. Diferente Ag prin: RSN, imunodifuzie - in gel, RFC. Reactii incrucisate : v.polio 1 si 2

Actiunea agentilor fizici si chimici: rezista zile la +220C si n sapt. la +40C. distruse la +500C; ionii Mg++ rol protector (Mg Cl2 stabilizator vaccin ); conservare indelungata : - 700C ; UV, deshidratarea: inactivare rapida; Incorporarea de coloranti (rosu neutru, acridin orange) le sensibilizeaza la lumina. lipsa invelis: rezistenta la solventi lipidici (eter, cloroform) detergenti. rezistente la: lizol, fenol, derivati de amoniu cuaternar. sensibile la: formol (0,3%), clor, guanidina

Multiplicare:1. adsorbtia pe receptori dep. de: pH si electroliti; la om: gena de pe cromozom 19 codifica receptor pentru v. polio 2. patrundere: viropexie 3. decapsidare, pierdere VP4 :4. eliberare ARNv care devine ARNm, tradus la ribozomi 5. sinteza poliproteina gigant, scindare in P1 apoi clivare in VPO, VP3, VP1 si P1 si P3 (clivare in replicaze si proteaze = VPg care initiaza

sint. ARN si ARN polimeraza)6. prod. de ARN progen sens + se face cu ARN polimeraza care sintetiz. catene complementare sens- apoi de sens + , concomitent cu sint.

proteine virale7. asamblarea in reticulul endoplasmatic

ciclu infectant: 5-10 ore (particule/celula = 10 5)

V. POLIOMIELITIC PoliovirusClasificare – serotipuri: tip 1: Brunhilde; tip 2: Lansing ; tip 3: Leon

cultivare: culturi primare rinichi maimuta, amnios uman, linii continue: KB, HeLa, Hep2efect citopatic: rotunjire, crestere refringentei, picnoza, degenerare, desprindere det. plaje circulare, clare, margini nete – folosite la clonarea tulpini atenuateanimale: cimpanzei, maimute Rhesus, Cinomoglus: inoculare i. medulara, i. cerebrala sau orala: viremie, eliminare v. fecale, paralizii flasce si r.i. umoralmanifestare infectie: asimptomatica/imbolnavire minora – majoritara. afectare sistem nervos, meningita aseptica si/sau poliomielita paralitica severa evolutie: patrundere: orofaringe, transport tesut limfoid (rinof., placi Peyer), multiplicare, diseminare limfatica, viremie tranzitorie cu manifestari clinice minore (respiratorii, digestive). Uneori multiplicare masiva tesut r.e. cu viremie persistenta si invazia sistemului nervos; virus prezent sange inainte debut clinic (+/- paralizii); infectare sanguina a sistemului nervos, diseminare pe axoni, clinic: febra, cefalee, redoarea cefei, paralizii flasce (leziuni neuroni motori coarne ant. maduva = poliomielita paralitica acuta). Posibila invazie a creier, talamus, hipotalamus, nuclei cerebelosi, trunchi cerebral, cortex motor = poliomielita bulbara/encefalita poliomielitica cu evolutii extrem de grave. Lezare nervi cranieni: paralizia faringe, paralizia corzi vocale (perechea X), paralizii oculare (perechea V)leziuni neuronale/extraneuronale: cromatoliza, distructie masiva, neuronofagie; edem, proliferare cel., infiltrat perivacular limfocitar (ggl ., placi Peyer, miocard). factori predispozanti: traume, efort fizic, sarcina, injectii, amigdalectomie. incubatie 7-14 zile

Imunitate : dupa boala sau vaccinare: rezistenta indelungata de tip

RIU: Ac neutralizanti fata de VP1 si VP2 apar inainte debut (multiplicare intestinala si tesut limfoid) Ac circulanti previn diseminarea, nivel maxim 2-6 sapt., persista toata viata Ac FC apar mai tirziu si dureaza mai putin Ac SN si FC trec pasiv la copil = rezistenta 0-6 luni

imunodeficienti: fac boala atipica cu afectare s.n. imunitatea locala:

IgA impiedica reinfectia la intestin amigdalectomia scade rezistenta locala

Epidemiologie: raspindire globala; fosta endemica zone calde si epidemica zone remperate; eradicare: 2000; sursa de v.: om cu infectie inaparenta; transmisie: fecal-orala (direct/indirect: apa, alimente infectate, secretii faringiene); v. prezent in orofaringe n. zile inainte debut; eliminare fecale: 3-6 sapt dupa imbolnavire; susceptibilitate: generala

Profilaxie:vaccin inactivat (Salk): preparat culturi rinichi maimuta, inactivat formol

1. confera imunitate umorala (blocheaza v. la orof)2. elimina posib de mutante si revertanti 3. utilizabil in zone tropicale 4. utilizare imunodepresati 5. necesita rapeluri numeroase

vaccin viu atenuat (Sabin): preparat pe diploide umane sau culturi simiene 1. induce i. locala si umorala persistenta (toata viata) 2. blocheaza multiplicarea intestinala 3. administrare orala

61

Page 62: Microbiologie Exam

4. posiblie reversii si mutante virulente 5. transmitere v. vaccinale la neimunizati6. paralizii post vaccinale (1 caz/1milion vaccinari)

vaccin ADN recombinant (de viitor din polipeptide virale VP1 sau genom viral

111. Familia Picornaviridae. Genul Enterovirus. Caracterele morfobiologice ale virusurilor Coxsackie (morfologia, structura virionului). Clasificarea dupa structura antigenica. Rolul in patologia umana. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de virusurile Coxsackie. Prelevatele (recoltarea, prelucrarea prealabila), metodele de diagnostic.Coxsackie virusRelatii virus – celula gazda cultivare: culturi de celule: V. Coxsackie B: culturi primare rinichi maimuta, rinichi embrionar, amnios umanV. gr. A: linie continua RD ECP: rotunjire, desprindere animale: V.C grup A inoc. soarece n.n. (i. cerebral, subcutanat, i. peritoneal) polimiozita, edem/necroza musculaturii striate, paralizii flasce; VC grup B: meningoencefalita (encefalomalacie), pancreatita, miocardita, hepatita si necroza tesut adipos Patogeneza – clinica patrundere: respiratorie si digestiva, diseminare sanguina cu localizari diverse:herpangina: debut brusc, febra, disfagie (vezicule, papule, zone rosii pe pilieri, palat, amigdale). Evolutie benigna (4-6 zile). Afectare copii.Boala – gurii, mainilor si picioarelor: herpangina, exantem maculopapular si veziculos bulos (maini, picioare, fese). Vindecare 7-14 zile Pleurodinia, mialgia epidemica (boala Bornholm): febra, stare generala alterata, durere retrosternala (diafragm), +/- pericardita Miocardita: la nou-nascut (transmitere perinatala), frecvent fatala; adult benigna Menigite aseptice, pancreatite, nefrite, malformatii congenitale (gravide) Imunitate: specifica de serotip: evid. prin RSN, IF, ELISA Ac SN apar la 7 zile, max. 3 saptamini, persista indelungat.

Epidemiologie: raspindire globala. endemo- epidemic (vara – toamna); focare epidemice colectivitati (scoli,crese) sursa: om. transmisie: fecal – orala; aerosoli. susceptibilitate: generala

DIAGNOSTIC LABORATORproduse patologice: materii fecale, exsudat faringian, l.c.r., cheag sanguin, lichide veziculare, exsudat conjunctival, probe necroptice (maduva spinarii, perete – continut intestinal, muschi toracici, formatiuni nervoase)izolare

culturi celulare v Coxsackie B, V.polio, V.Echo : culturi primare rinichi maimuta, diploide umane V.Coxsackie A: lina celulara RD animale: V.Coxsackie A si B: soarece nou-nascut

identificare : culturi celulare : SN cu seruri specifice de tip (Polio, Coxsackie B si Echo) animale : SN la v Coxsackie A

diagnostic serologic:Det. Ac pe probe duble (0-2/3 sapt) prin: SN, RFC, HAI, ELISA, precipitare in gel, reducerea plajelor

diagnostic de certitudine: virus izolat si r.i. serc (crestere de 4 ori a Ac) tablou clinic caracteristic (paralizii)context epidemiologic pentru enteroviroze

112. Familia Picornaviridae. Genul Enterovirus. Caracterele morfobiologice ale virusurilor ECHO (morfologia, structura virionului, structura antigenica). Rolul in patologia umana. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de virusurile ECHO. Prelevatele (recoltarea, prelucrarea prealabila), metodele de diagnostic.

Echovirus. Grupa: Grupa IV ((+) ssRNA). Familie: Picornaviridae. Genul: Enterovirus. Specia: Human enterovirus B. Subtipul: Echovirus Un echovirus este un tip de virus ARN care aparţine Enterovirus gen de familie Picornaviridae. [1] Echoviruses se găsesc în tractul gastro-intestinal (prin urmare, ea fiind parte din genul enterovirus), precum şi expunerea la virusul cauzeaza infecţii oportuniste şi alte boli. Echovirus este foarte infecţioas, iar obiectul său principal este de copii. Echovirus se numără printre principalele cauze de boli acute febrile la sugari şi copii mici, si este cea mai frecventa cauza de meningită aseptică. [3]In cazul unui sugar infectare cu acest virus după naştere poate provoca boli sistemice grave, şi se asociaza cu o mare rata a mortalităţii infantile. Echovirus poate imita simptomele provocate de alte infecţii bacteriene comune şi virale. Structura şi infecţii virale: echovirus are 24-30 nanometri (nm), şi este similar cu alte virusuri, deoarece are o capsidă goala de proteine, care reprezintă 75% din particule de virus care înconjoară un nucleu dens central al ARN-unicatenar. Acest ARN-ul are o lungime de aproximativ 7,5 kilobase (KB), conţine o replicaza ARN, codificarea de proteinevirale, şi un singur polyprotein care este responsabil de formarea de proteine structurale şi alte proteine necesare pentru replicarea celulară. Proteinele structurale determina domeniul gazdă şi joacă un rol foarte important în realizarea genomului ARN-ul în citoplasma celulelor gazdă noi.

Unele replicari virale a unui echovirus are loc în nazofaringe după infecţare şi apoi se extinde la ganglionii limfatici regionali. Cu toate acestea, cele mai multe particule virale sunt înghiţite şi ajunge la nivelul tractului intestinal mai putin, în cazul în care virusul se presupune că se leagă de receptori specifici. Virusul se răspândeşte apoi la inferior tractului intestinal, replicinduse dar care nu provoacă nici un efect major celular de-a lungul drumului. Apoi, virusul se răspândeşte la multe siste-uri secundare în organism, cum ar fi sistemul nervos central, ficatul, splina, maduva osoasa, inima şi, în final la plămâni. Adiţional replicarea virusului va avea loc, provocând simptome 4 - 6 zile de la infectareSimptome si diagnostic: Imbolnavirea cu Echovirus apare în mod disproporţionat la bărbaţi. Infecţia în primele două săptămâni de la naştere poate provoca efecte devastatoare şi potenţial boli letale . La această populaţie, decesul de obicei rezulta de la insuficienţă hepatică copleşitoare sau miocardită, mai degrabă decât infecţiile sistemului nervos central. Copiii mai mari şi adulţii au un prognostic mai bun. Miocardită este cea mai frecventă complicaţie la adulţi. Infecţii Echovirus pot apărea la oameni de toate grupele de vârstă. Cu toate acestea, mai în vârstă, scade producerea de anticorpi specifici pentru a echovirus. Mai multe studii efectuate în timpul epidemiilor arată că sugarii devin infectati cu rate mai mari decât copiii mai mari şi adulţi.

62

Page 63: Microbiologie Exam

Prelevate: Spalatura nazofaringiana,singe materii fecale LCRDiagnostic: Virusoscopia. Se izoleaza in culturi de celule are efect citopatic. Identificarea Rnpe culturi de celule RHAI, RIF, Serologic:RN<RIF<RFC Tratament: Nici un tratament specific pentru infecţia cu echovirus nu este în prezent disponibila. Aceasta este direcţionata la ameliorarea simptomelor.

113. Virusurile hepatitice. Virusurile hepatitelor A si E. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitelor A si E. Diagnosticul de laborator al hepatitelor A si E. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.HEPATITE – leziuni inflamatoare ale ficatuluiORIGINE – infecţioasă, medicamentoasă, toxică, autoimună, etc Hepatitele virale – leziuni determinate de acţiunea citopatică directă a virusului în cauză, sau, mai frecvent, de reacţia imună contra celulelor hepatice infectate.VIRUSURILE HEPATITICEVirusuri dominant hepatotrope

1. Virusul hepatitei A – HAV- (fam. Picornaviridae)2. Virusul hepatitei B – HBV- (fam. Hepadnaviridae)3. Virusul hepatitei C – HCV- (fam. Flaviviridae)4. Virusul hepatitei D – HDV - (neclasificat)5. Virusul hepatitei E – HEV - (fam. Hepeviridae)6. Virusul hepatitei G – HGV?7. Virusurile TT (Circovirus ?)8. Virusuri ce afectează ficatul ocazional: Coxsackie, virusul citomegalic (CMV), virusul Epstein-Barr (EBV), virusul herpes simplex (HSV),

ş.a.MANIFESTĂRI CLINICO-BIOLOGICE ALE HEPATITELORIncubaţia – variabilă (15 zile – 6 luni)Gravitatea – hepatitele A şi E au evoluţie benignă, hepatitele B, C, D – acute şi cronice, complicaţii graveForma clinică clasică – febră, artralgii, astenie, erupţii, dereglări digestive, urmate de icter (3 săptămâni), asociat cu anorexie, oligurie, decolorarea maselor fecale, bilirubinurie.Forme anicterice, asimptomatice (80-90% cazuri)Hepatita fulminantă – foarte gravăHepatita cronică persistentă şi cronică activă (cu citoliză)Complicaţii – ciroză, cancer primitiv al ficatuluiManifestări extrahepatice, determinate de complexe imune circulante – periarterită nodoasă, poliartrită, glomerulonefrită, poliradiculonevrite, etc.RM - ţară endemică prin hepatitele B şi C. Indicele de prevalenţă a HBV este de peste 8%, iar al HCV de 5%.

VIRUSUL HEPATITEI AFamilia PicornaviridaeGenul HepatovirusSpecie Virusul hepatitei A (HAV)Dimensiuni – 28-30 nm

Genom – ARN+, liniar Capsidă – icosaedrică, 60 capsomeri, compuşi fiecare din 4 polipeptide VP1, VP2, VP3, VP4

Rezistenţă: totală la 600C – 1 oră, parţială - 12 ore, rezistă la % de clor uzuale. Inactivat de formol, beta-propiolacton, UV, hipoclorit de sodiu. Se cunosc 7 genotipuri (om, maimuţe)Cultivarea : Marmozete, cimpanzei, Celule de hepatocarcinom uman; Celule diploide umane; Celule din rinichi de maimuţăReceptorul celular – mucina (GP membranar). ECP nu provoacăSursă şi rezervor de infecţie – omul bolnavMecanismul de transmitere – fecal-oral (mâini murdare, alimentele, apa contaminate); cazuistic – transfuzionalHAV se multiplică în ţesutul limfoid intestinal şi citoplasma hepatocitelor. Se elimină cu masele fecale după 2 săptămâni de la infectare, diminuează odată cu apariţia semnelor clinice. Viremia – 1-2 săptămâni.Hepatocitoliza este determinată de LT CD8, NK. Incubaţia – 30 zile (15 – 50 zile)Forme clinice – forme asimptomatice (90%), forme benigne (1-2 săpt.), rareori – forme grave, fulminante. Lipsa cronicizării!

Markerii virali în cursul maladiei: HAV (Ag viral) (mase fecale, sânge) în ultimele 2 săptămâni de incubaţie şi câteva zile de la apariţia icterului IgM anti-HAV – depistate de la debutul fazei icterice, titru maxim peste o săptămână şi dispar după 8-12 săptămâni. IgG anti-HAV – persistă toată viaţa. ARN viral (în mase fecale, sânge, hepatocite).

VIRUSUL HEPATITEI VIRALE E (HEV)HEV – depistat în 1983 prin MEFamilia– HepeviridaeGenul - HepevirusStructura HEVDimensiuni – 27 – 30 nm

Genom – ARN+ (descris în 1990)Capsidă – icosaedrică (proteină unică glicozilată)

HEV se repartizează în 3 grupe genomice: I – asiatică, II – mexicană, III – nord-americană (include şi tulpini porcine)Sursa de infecţie – omul bolnavMecanismul de transmitere – fecal-oral (apă, alimente), posibil parenteral (la hemofili, persoane cu transfuzii, hemodializă)Perioada de incubaţie – 30 zileClinica – hepatită acută, asemănătoare cu hepatita A. Forme grave la femei gravide, în special în trimestrul III al sarcinii (20-40% mortal). Risc de avort şi naştere prematură (12 – 30% cazuri)

63

Page 64: Microbiologie Exam

Markerii HEV: Virusul (Ag viral) prezent în mase fecale în faza acută (ME) IgM (3 luni de la debut) şi IgG anti-HEV Genomul viral în mase fecale, hepatocite

114. Virusurile hepatitice. Virusul hepatitei B. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitei B, consecintele. Diagnosticul de laborator al hepatitei B. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.Ag “Australia” a fost detectat în 1964 de Blumberg, actualmente numit Ag HBsHBV – virus ADN, ciclul de replicare comportă o etapă de transcripţie inversăExtrem de contagios şi prezent în titruri mari în lichide biologice. Provoacă hepatite acute, chiar fulminante, hepatite cronice, ciroză, hepatocarcinom. Peste 350 mln persoane infectate în lume.Peste 1,5 mln decesuri anual.Clasificare: Familia – Hepadnaviridae; Genul – Orthohepadnavirus; Specia – Virusul hepatitei B (HBV)Morfologia: Particule sferice de 42 nm (particulele Dane), infecţioase – virionul complet (109 part/ml). Particule sferice, lipsite de acid nucleic, de 22 nm, neinfectioase; Structuri tubulare, 200-700 nm lungime, neinfectioase

Structura HBV (particula Dane)Genomul: ADN circular bicatenar parţial (2/3). Posedă catena lungă L(-) şi catena scurtă S(+). Se disting 8 genotipuri (A – H). Nucleocapsida (NC, core) – icosaedrică, comportă Ag HBc, asociat cu Ag HBe (solubil). În NC se află şi ADN-polimeraza şi timidin kinaza.Supercapsida – dublu strat lipidic asociat cu proteine virale (Ag HBs). Un receptor pentru albumină din supercapsidă intervine la etapa de penetrare a virusului. Rezistenţa : HBV este rezistent la acţiunea eterului, la desicare şi căldură. HBV îşi păstrează infecţiozitatea mai mulţi ani la -20 grade, câteva luni la +30 grade, câteva ore la +60 grade. Este distrus la fierbere şi cu hipoclorit de sodiu. Animale experimentale – maimuţe cimpanzei.

Structura antigenică a HBV (markeri epidemiologici) Ag HBs, de suprafaţă. Posedă determinanţi de grup (a) şi de tip (d/y şi w/r). Serotipuri ale Ag HBs : ayw, ayr, adw, adr, etc. Anticorpii anti-

HBs au rol protector. Ag HBc, din NC, nu este detectabil în ser, doar în nucleul hepatocitelor infectate. Ag HBe, solubil, component al NC. Prezent în ser şi martor de infecţiozitate (replicare virală). ADN polimeraza Timidin kinaza

Ag suscită sinteza Ac anti-HBs, anti-HBc, anti-HBe, anti-ADN polimerază.

Multiplicarea HBVVirusul penetrează în hepatocit debarasat de supercapsidă datorită receptorului său pentru albumină. După decapsidare ADN este completat de polimeraza virală, devenind bicatenar. ADN-ul viral pătrunde în nucleul celulei. ARN polimeraza gazdei transcrie catena ADN L(-) în ARN-pregenomic (+) şi ARNm. În citoplasmă are loc translarea ARNm şi sinteza proteinelor virale. ARN-pregenomic (+) este încorporat în capsidă şi ADN polimeraza virală sintetizează catena L (-) – activitate de reverstranscriptază. Pe matricea catenei L (-) este sintetizată catena S (+). Polimeraza manifestă activitate de RNază H şi degradează ARN-pregenomic. NC capătă supercapsida la nivelul MCt şi virionul nou format este eliberat prin înmugurire (particulele Dane, infecţioase). Proteinele externe (HBs) sunt produse în exces şi se asamblează în ser în particule sferice sau tubulare, neinfecţioase. HBV nu este citolitic. Hepatocitoliza este determinată de răspunsul imun al gazdei. Hepatocitele infectate prezintă pe suprafaţa lor antigene virale, ce stimulează un răspuns imun. Limfocitele T CD8 şi celulele NK atacă şi distrug celulele bolnave, iar anticorpii specifici neutralizează virusul circulant.

DE REŢINUT !!!1. ADN viral dublu catenar este extrem de stabil, poate persista sub formă de plasmidă în hepatocit, fiind la originea portajului cronic şi

fenomenelor de reactivare.2. ADN viral se poate integra în cromozomul hepatocitelor (acţiune oncogenă posibilă).3. Implicarea transcriptazei inverse se află la originea unei rate de mutaţii crescute (rezistenţă la chimioterapice, eşec în cursul

seroterapiei sau vaccinare, mutante fără Ag HBe).

Patogeneza hepatitei virale BSursa de infecţie – omul. HBV este prezent în sângele bolnavului, secreţii genitale şi spermă, salivă, lapte, urină, lacrimi.Căile de transmitere a HBV:

1. Parenteral prin sânge şi derivate (transfuzii, tratament cu produse sangvine, activitate profesională, injecţii cu seringi contaminate -toxicomani, tatuaj, piercing, acupunctură).

2. Sexual (homo-/hetero-).3. Vertical – de la mamă la copil (la naştere sau în perioada neonatală).4. Transmiterea directă (contact, sărut) nu este exclusă.5. Riscul infecţiei prin injecţie – 20-30%6. Contagiozitate sangvină extremă – de 10 ori superioară infecţiei cu HCV şi de 100 ori – HIV.

Perioada de incubaţie - 30–180 zile (10 săptăm)Perioada de stare – simptomatică la 20-30% pacienţi (forme anicterice 70-80%) Vindecare – 90%Hepatita virală B poate evolua spre cronicizare (10% la persoane imunocompetente).Hepatita fulminantă – 0,1 - 1%Ciroza hepatică sau cancer – 20%

CINETICA MARKERILOR Hepatita acută

o Ag HBs este primul marker depistat în ser după 1-3 luni de la contagiu, persistă 1-2 luni şi dispare peste câteva săptămâni după normalizarea transaminazelor. Persistă la purtătorii cronici.

o Ag HBe apare imediat după HBs, marker de replicare virală, dispare înaintea Ag HBs.

64

Page 65: Microbiologie Exam

o Ac anti-HBc (IgM) apar peste 2-4 săpt după Ag HBs.o Ac anti-HBe apar după încetarea replicării virale, odata cu dispariţia Ag HBe. Marker de pronostic favorabil.o Ac anti-HBs apar peste 2-3 săptămâni după dispariţia Ag HBs (fereastră imunologică). Neutralizanţi. Markeri ai vindecării. Lipsesc

la purtătorii cronici.Evoluţie favorabilă: dispariţia Ag HBs şi Ag HBe, apariţia succesivă a Ac anti-HBc, anti-HBe şi anti-HBs. Hepatita fulminantă – prezenţa constantă a IgM anti-HBc în titru înalt. Hepatite cronice (evoluţie peste 6 luni). Hepatită cronică activă (persistenţa Ag HBs, Ag HBe şi Ac anti-HBc - IgG). Hepatită cronică persistentă (Ag HBs, Ac anti-HBe, anti-HBc) - purtător cronic de Ag HBs. (Reactivări sunt posibile, supraveghere

necesară).

115. Virusurile hepatitice. Virusul hepatitei C. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitei C, consecintele. Diagnosticul de laborator al hepatitei C. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.Familia Flaviviridae, Genul Hepacivirus, Dimensiuni – 55-65 nm. Genom – ARN+, liniar. Heterogenitate genetică - se disting 6 (11 ?) genotipuri şi numeroase subgenotipuri. HCV circulă sub forma de un amestec complex şi instabil de populaţii virale genetic distincte. În Europa predomină genotipul 1, care este mai puţin sensibil la tratamentul cu IFN. Capsida – icosaedrică, proteină unică. Supercapsida – derivată din membrana reticulului endoplasmatic, cu 2 glicoproteine virale E1 şi E2.Replicarea HCV are loc in citoplasma hepatocitelor şi a celulelor mononucleate din sângeMarkeri epidemiologici – Ag HCV, Ac anti-HCV, ARN viralTransmitere: Prin transfuzii, transplant de ţesut şi organe, Droguri administrate i/v, Nozocomial (în mediu medico-chirurgical, stomatologie, piercing, tatuaj, acupunctură), Vertical , Sexual, Intrafamilial (foarfece, peptene, aparat de ras, etc)Incubaţia – 4 – 12 săptămâniHepatita C acută: 70-90% - asimptomatică, activitatea serică a transaminazelor (în special ALAT) este moderat crescută şi tranzitorie, uneori oscilantă. Se poate vindeca spontan în 20 % cazuri, fără a conferi imunitate completă.Hepatita C fulminantă – co-infecţie cu HBV sau HAV.Hepatita C cronică (80% cazuri) – persistenţa HCV peste 6 luni de la infecţia acută. Creştere cronică a activităţii ALAT, care este moderată şi fluctuantă. Co-infecţia cu HIV – factor stimulator. Complicaţii – ciroză (20% cazuri), cancer.

116. Virusurile hepatitice. Virusul hepatitei D. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitei D, superinfectie si coinfectie. Diagnosticul de laborator al hepatitei D. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.Agent viral defectiv, satelit al HBV, 36-37 nm. Descoperit în 1977.Genul Deltavirus

Genom – ARN-, circular (3 genotipuri). Capsida – sferică, 2 proteine, Ag Delta. Supercapsidă – derivată din HBV, cu 3 forme de Ag HBsSe replică în nucleu, independent de HBV, dar care îi asigură supercapsida cu Ag HBs. Manifestă efect citopatic direct sau via răspunsul imun celular.Markerii HDV – Ag HDV, Ac anti-HDV, ARN viral (asociaţi cu markeri ai HBV).Mecanismele şi căile de transmitere – identice cu HBV. Infecţia Delta se poate manifesta în acelaşi timp cu hepatita B (co-infecţie, evoluţie acută, risc de forme fulminante) sau survine la un purtător cronic (suprainfecţie, risc de hepatită cronică activă cu evoluţie rapidă în ciroză, forme fulminante sunt posibile).

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALEDiagnostic paraclinic: dozarea transaminazelor, bilirubinei, raportul albumine/globuline. Trombopenie, leucocitoză, diminuarea protrombinei – factori de “alertă”.Diagnostic etiologicDetectarea virionilor (ME, IME) sau Ag virale (ELISA, RIF) în bioptate hepatice sau sânge.Detectarea AN virali întrahepatic sau în sânge (hibridare, PCR).Evidenţierea anticorpilor antivirali în serul sangvin prin tehnici ELISA, ARI, imunoblot, RIFIDiagnosticul hepatitei AEvidenţierea Ig M anti-HAV (Ig G – imunitate)Diagnosticul hepatitei BDepistarea Ag HBs, Ag HBe, Ac anti-HBc, anti-HBs, anti-HBe, anti-polimerază în ser; Ag HBc – în hepatocit)Diagnosticul hepatitei CDepistarea Ac anti-HCV (80% peste 15 săpt de la expoziţie, 95% - 5 luni, 97% - 6 luni )Diagnosticul hepatitei DEvidenţierea Ac anti-HDV

PROFILAXIA HEPATITELOR VIRALE1. Control eficace al donatorilor de sânge, ţesuturi, organe, spermă, prevenirea MST şi nozocomiale, utilizarea materialelor de uzaj unic,

ameliorarea condiţiilor sanitare, etc. 2. Imunizarea activă

Anti-hepatita A – vaccin inactivat (10-20 ani).Anti-hepatita B (vaccin recombinant Ag HBs). Vaccin anti-hepatita D şi E– în curs de studiu.

3. Imunizarea pasivăImunoglobuline specifice anti- HAV, anti-HBV, anti-HEV.

Tratament specific al hepatitelor A şi E nu există.Tratamentul specific al hepatitei B: Interferon alfa; Vidarabin, lamivudin, entecavir, telbivudin, adefovir (!!! Selecţia tulpinilor rezistente); ImunoterapieTratamentul specific al hepatitei C: Interferon alfa; Ribavirin; Imunoterapie

65

Page 66: Microbiologie Exam

117. Infectia HIV-SIDA. Virusul HIV. Clasificarea (familie, gen, variante). Structura virionului. Markerii serologici. Celulele tinta si rezervorul celular. Patogeneza infectiei HIV. SIDA. Diagnosticul de laborator al infectiei HIV-SIDA (reste directe si indirecte de depistare, teste de confirmare, diagnosticul serologic). Terapia specifica.Retroviridae – familie numeroasă de virusuri ARN dotate cu o enzimă numită reverstranscriptază: ARN ADNd.cCLASIFICAREA FAM. RETROVIRIDAESubfamilia OrthoretrovirinaeGenurile: Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus (induc tumori şi leucemii), Lentivirus (virusul HIV)Subfamilia SpumaretrovirinaeGenul: Spumavirus (nepatogeni)

CARACTERE MORFOSTRUCTURALE GENERALE ALE FAMILIEI RETROVIRIDAEDimensiuni – 80-130 nmFormă – sferică

Genom – două molecule de ARN+, capacitate de integrare în nucleu sub formă de ADN proviralEnzima – reverstranscriptazaCapsidă – icosaedricăSupercapsidă – derivată din MCP, lipidică cu GP virale înserate

Ciclul replicativ este identic.VIRUSUL HIV. STRUCTURA ŞI ORGANIZAREA GENOMULUI

HIV-1 şi HIV-2 – responsabili de Sindromului Imuno-Deficienţei Achiziţionate (SIDA)HIV-1 – repartiţie mondialăHIV-2 – limitat la Africa de Vest

Structura virusului HIV-1 / HIV-2Genomul: diploid – 2 molecule de ARN+ identice, nu sunt utilizate în calitate de ARNm Enzime: reverstranscriptaza (RT), integraza, proteazaCapsida: în formă de trunchi de con, constituită din 2 proteine p24/26 CA (internă, majoră) şi p7,9 NC (a nucleocapsidei, asociată ARN)Supercapsida: dublu strat lipidic de origine celulară în care sunt înserate 2 GP virale

Gp120/125, de suprafaţă, asigură fixarea virusului la receptorul celular CD4. Regiunea V3 este responsabilă de ataşare şi induce anticorpi neutralizanţi specifici

Gp41/36, transmembranară, legată de gp120, responsabilă de fuziunea supercapsidei cu membrana celularăProteina p17/16, matrice, căptuşeşte stratul intern al SC, asociată cu proteazaGenomul, proteinele interne (p24, p7, p17) şi enzimele constituie nucleoidul (core) viral.Structura genomului (apr. 10 mii nucleotide)

Gena gag (group antisens) prot. structurale interne (p24 şi p17) Gena pol (polimerase) 3 enzime: RT (p66), integraza (p31), proteaza (p9) Gena env (enveloppe) o prot. precursor gp160, clivată ulterior în gp41 şi gp120 Gene regulatoare tat, rev, nef, vif, vpr şi vpu (HIV-1) sau vpx (HIV-2)

Omologia dintre HIV-1 şi HIV-2 este de 42%, mai înaltă la nivelul genelor gag şi pol (peste 50%) şi redusă la nivelul genelor env (39%).Se disting 3 grupe genomice ale HIV-1: M, O şi N. Grupul M (major) comportă 10 subtipuri (A-H, J şi K), repartizate geografic neuniform (majoritatea – în Africa, B – Europa occidentală si America de Nord, F – România, G – Rusia, etc).Structura antigenică – toate proteinele şi glicoproteinele virale sunt imunogene.Rezistenţa HIV: HIV este sensibil la solvenţi lipidici şi detergenţi, la 56 grade C este inactivat în 30 min, în 5 minute - 0,2 % hipoclorit de Na, 70% etanol, 0,2% glutaraldehidă. Labil la pH-uri extreme, radiaţii UV şi RXCultivarea: Celule mononucleate de la persoane sănătoase; Linii celulare din LT – MT2; Animale sensibile – maimuţele cimpanzei (HIV-1), Rhesus (HIV-2)

Ciclul de replicare. Ataşarea HIV la celula-gazdă prin legarea gp120 la receptorul celular CD4. Rezultă o modificare conformaţională a gp120, ce permite buclei V3 a acestei gp să se fixeze de coreceptori de pe suprafaţa celulei: CCR5 şi CXCR4, CCR3, CCR2b ş.a. Penetrarea NC prin fuziunea supercapsidei (gp41) cu MCt. Decapsidarea şi eliberarea ARN viral asociat cu RT. Retrotranscrierea ARN+ în ADN- (RT). RT degradează ARN+, apoi transcrie ADN- în ADNd.c., care va fi circularizat, apoi integrat (integraza) în cromozomul celular, constituind provirusul. Transcrierea ADNv în ARNm prin intermediul ARN-polimerazei II celulare. Sinteza proteinelor virale sub controlul factorilor celulari şi proteinelor reglatoare. Poliproteina gag/pol 160 kd (p17 MA, p24 CA, p7 NC, p10 (proteaza), p66 (RT), p31 (integraza). Poliproteina env 160 kd (gp41 şi gp120); Transcrierea ARN viral (ARN+); Asamblarea NC; Eliberarea prin înmugurire la nivelul MCt modificată prin inserarea gp virale: 10 mlrd de virioni/zi/o persoană infectată.Variabilitatea HIV este determinată de erorile comise de RT (o eroare la fiecare 10 mii baze). Mutaţiile survin în special la nivelul genei env (bucla V3 din gp120, care intervine în fixarea HIV de coreceptori, reprezintă epitopul major de neutralizare). Nu există 2 suşe virale identice. La bolnav este prezentă o populaţie virală polimorfă, cu genomuri diferite.Consecinţe: dificultatea de a obţine vaccin eficient; selecţia mutantelor rezistente la antiretroviraleCelulele-ţintă şi rezervorul celular: Limfocite TCD4+ (Th) (99% de replicare, ECP-sinciţii); CPA: monocite/macrofage tisulare (replicare slabă, ECP minim), celulele dendritice (prezente în timus, tegument, mucoase, organe limfoide, SNC şi sânge perif.). Ele au rol de vector şi rezervor de virus (adsorb HIV la suprafaţa lor şi il transportă în organele limfoide, unde el se replică în celulele CD4+). Se disting suşe cu tropism macrofagic (M, sau R5), utilizează coreceptorul CCR5, şi suşe cu tropism limfocitar (T, sau X4), coreceptorul CXCR4. Limfocitele T pot fi infectate cu ambele suşe (prezintă ambii receptori).În primo-infecţie – suşe R5, în stadiu de SIDA – suşe X4.Mecanismele de distrugere a limfocitelor T CD4:

1. Liza directă a celulelor infectate (ECP).2. Limfocitele T CD8 pot distruge limfocitele T CD4 infectate.3. Apoptoză în urma stimulării antigenice a celulelor care au fost în contact cu Ag HIV.4. Limfocitele infectate, acoperite cu gp120 pot provoca fixarea, fuziunea şi moartea limfocitelor neinfectate.5. Hiperstimulare celulară cu dezvoltarea anergiei celulare.

PATOGENEZA ŞI CLINICA INFECŢIEI CU HIVTransmiterea:

Cale sexuală (hetero-/homo-). Cale sangvină (toxicomani, hemofili, transfuzii de sânge sau transplante de organe, manopere medicale penetrante-injecţii, acupunctură,

tatuaj, pearcing).

66

Page 67: Microbiologie Exam

Cale verticală (in utero în ultimele săptămâni de sarcină, în timpul naşterii sau în timpul alăptării).Evoluţia maladieiPrimo-infecţia (peste 20 zile după contaminare). Durata 2-4 săptămâni. Are loc:

1. multiplicarea intensă şi diseminarea virusului, 2. scăderea numărului de limfocite T CD4,3. creşterea numărului limfocitelor CD8.

Diminuarea şarjei virale este determinată de răspunsul imun specific celular şi umoral (Ac anti-gp120, gp41, p24). Evoluţia poate fi asimptomatică sau simptomatică (50%): adenopatie cervicală, febră, faringită, oboseală, mialgii, erupţii cutanate.Faza asimptomatică, de latenţă clinică (durata aproximativ 10 ani). Virusul se replică în organele limfoide, numărul LT CD4 diminuează lent sau rămâne stabil. Apar variante noi de virus care se multiplică, SI le recunoaşte şi reacţionează specific, ciclul se repetă de multiple ori. Aceasta duce la diminuarea progresivă a LT CD4 şi epuizarea SI, urmată de multiplicarea necontrolată a HIV şi dispariţia completă a limf. T CD4.Faza clinică (SIDA) – incubaţia 8-10 ani Numărul LT CD4 500-200 celule/ml.Se manifestă clinic prin febră cronică, pierdere în greutate, diaree, afecţiuni ale tuturor organelor şi sistemelor, infecţii oportuniste, tumori (sarcomul Kaposi, limfome).

Paraziţi: Toxoplasma, Histoplasma, Leishmania Bacterii: Mycobacterium, Salmonella, etc Fungi: Pneumocystis carinii, Cryptococcus neoformans, Cryptosporidium, Candida, etc Virusuri: HSV, HZV, CMV.

5-10% de infectaţi sunt “asimptomatici de lungă durată”. Şarjă virală redusă. Numărul LT CD4 stabil (peste 500/ml). Răspuns imun celular şi umoral constant. Absenţa semnelor clinice.

Răspunsul imun:Umoral – Ac anti-gp120 împiedică fixarea HIV.Celular – LT CD8 recunosc şi distrug celulele infectate (în special LT CD4, Th).

Teste indirecte de depistareTeste ELISA de depistare a Ac (după 22 zile de la contagiu)Teste combinate Ag - Ac (detectarea Ag p24 şi Ac anti-p24 prin tehnici ELISA)Teste rapide (RA cu particule de gelatină sensibilizate)

Teste de confirmare (în caz de reacţie pozitivă). Tehnica de referinţă – Western-blot (separarea el-for. a proteinelor virale, transferarea lor pe o bandă de nitroceluloză, tratarea cu serul cercetat, apoi efectuarea RIE). Pot fi detectaţi Ac contra tuturor Ag.Criterii de apreciere: un ser este considerat pozitiv dacă sunt prezenţi Ac contra cel puţin 2 Ag de suprafaţă (gp160, gp120, gp41), asociaţi cu Ac contra cel puţin o proteină internă (p24, p17 sau a enzimelor) Teste directeDetectarea Ag p24 (marker direct al infecţiei HIV) prin tehnici ELISA. Poate fi detectat în primo-infecţie până la seroconversie, apoi dispare şi reapare în momentul evoluţiei spre SIDA. Detectarea ARN-lui plasmatic sau ADNv prin teste de amplificare genică.Prezenţa ARNv în ser denotă replicarea constantă a virusului. Determinarea şarjei virale este utilizată pentru monitorizarea unui pacient infectat.Izolarea HIV în culturăSe realizează prin inocularea cu plasmă sau celule mononucleate de la bolnav a unei culturi de celule mononucleate de la donatori sănătoşi.Replicarea este detectată prin evidenţierea Ag p24, RT sau a ARNv.Diagnosticul primo-infecţiei (markerii virali)

1. ARNv plasmatic (apare după 8-17 zile de la contagiu)2. Ag p24 în ser (pănă la apariţia Ac anti-p24)3. Ac anti-HIV (după 3 săptămâni de la contagiu)4. Monitorizarea virologică a seropozitivilor5. Parametrii imuno-hematologici (formula sangvină, determinarea subpopulaţiilor de LT (valori absolute, raport T CD4/T CD8),

dozarea Ig, microglobulinei beta2)6. Markerii virali (şarja virală plasmatică (ARNv), Ag p24, Ac anti-p24)

CHIMIOTERAPIA ANTIRETROVIRALĂDupă mecanismul de acţiune:Inhibitori nucleozidici şi nucleotidici ai RT (Abacavir, Didanosin, Lamivudin, Stavudin, Zalcitabin, Zidovudin, Tenofovir)Inhibitori nenucleozidici ai RT (Delavirdin, Efavirenz, Nevirapin)Inhibitori ai proteazelor (Amprenavir, Indinavir, Lopinavir, Nelfinavir, Ritonavir, Sanquinavir Inhibitorii adeziunii şi penetrării – în curs de evaluare (CD4, T20)Inhibitor al asamblării şi eliberării - Interferonul alfa Tratamentul este indicat tuturor bolnavilor de SIDA şi persoanelor cu numărul LT CD4+ mai mic de 350/ml.Este indicată asocierea a 3 chimioterapice: 2 INRT + 1 IP; 2 INRT + 1 INNRT, 3 INRT, 1 INRT+1 INNRT+IPDificultăţi: Durata şi costul tratamentului; Toxicitatea preparatelor; Dezvoltarea rezistenţeiMonitorizarea terapiei antiretrovirale: Măsurarea şarjei virale (copii ARNv în plasmă); Determinarea numerică a LT CD4+

PROFILAXIA: Măsuri nespecifice: prevenirea transmiterii HIV. Profilaxia specifică – dificilă: Existenţa a 2 virusuri HIV-1 şi HIV-2 cu numeroase subtipuri genetice şi antigenice. Infecţia naturală nu este stopată de răspunsul imun, iar memoria imunologică este mediocră. Nu este definitiv clar rolul LT CD8+ (Tc). Lipsa unui model animal satisfăcător.

118. Familia Herpesviridae. Clasificarea (subfamilii, genuri, spp.). Caracterele morfobiologice ale virusurilor herpetice. Virusurile HSV 1 si HSV 2. Patogeneza infectiilor cauzate (infectia primara, latenta, reactivarile). Particularitatile de evolutie la persoane imunocompromise. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de HSV. Prelevatele. Metodele de diagnostic. Profilaxia si terapia specifica.FAMILIA HERPESVIRIDAE

67

Page 68: Microbiologie Exam

Virusurile herpetice - agenţi patogeni ai omului, primatelor şi altor mamifere (porci, cai, vite), ai păsărilor (găini, curcani, etc), peştilor şi broaştelor, reunind peste 100 de virusuri.Clasificarea virusurilor herpetice de interes medical:Subfamilia Alphaherpesvirinae: genul Simplexvirus (HSV-1, HSV-2); genul Varicellovirus (VZV)Subfamilia Betaherpesvirinae: genul Cytomegalovirus (CMV ); genul Roseolovirus (HHV-6/7)Subfamilia Gammaherpesvirinae: genul Lymphocryptovirus (EBV); genul Rhadinovirus (HHV-8)

Virion sferic, 150-200 nm diametru, constituit din:centru dens, de forma unui mosor (bobină), de natură proteică, pe care este înfăşurat acidul nucleic;genomul viral – ADNd.c., constituit din 80-100 genecapsida de simetrie icosaedrică, formată din 162 capsomere;tegument – structură proteică fibrilară, situată între capsidă şi supercapsidă;peplos (supercapsida), dublu strat lipidic, pe suprafaţa căreia proiemină spiculi scurţi, constituţi din 5-8 glicoproteine, responsabile de adeziune şi fuziune.

Enzime (ADN-polimeraza ADN-dependentă, timidin-kinaza, ribonucleotid-reductaza, serin-proteaza).Caractere biologice

virusuri dermo, limfo şi neurotrope determină infecţii latente, recurente majoritatea prezintă potenţial oncogen posedă numeroase enzime ce intervin în multiplicarea virală prezintă un spectru foarte larg de gazde şi o gamă diversă de forme clinice sunt virusuri fragile şi se transmit numai prin contact direct

Rezistenţa la agenţi fizici şi chimiciÎn stare liofilizată, la 4 grade, virusurile herpetice se menţin ani de zile. Relativ instabile la temperaturi ambientale (+ 22 grade C), inactivate de solvenţi lipidici, detergenţi, dezinfectanţi uzuali, pH extreme. Prezintă sensibilitate la acţiunea inhibitorilor sintezei ADN (acyclovir, etc).

Multiplicarea virală Adsorbţia virionului la suprafaţa celulei-ţintă. Penetrarea NC prin fuziunea supercapsidei virale cu membrana celulară. Degradarea partiala a capsidei de enzime celulare şi pătrunderea ADN viral în nucleul celulei. Sinteza proteinelor celulare se opreşte. Biosinteza: în 3 runde consecutive are loc transcrierea ARNm viral cu sinteza ulterioară a 3 tipuri de proteine: foarte precoce (alpha,

immediate early), precoce (beta, early), care sunt în majoritate enzime şi proteine tardive (gamma, late), care sunt proteine de structură. Replicarea ADN Asamblarea NC are loc în nucleu. Părăsindu-l prin inmugurire, NC se învelesc cu membrana nucleară internă, în care sunt înserate GP virale

imature, pe care o „dezbracă” în procesul de înmugurire prin membrana nucleară externă. În citoplasmă NC capătă proteinele tegumentului şi sunt ulterior re-învelite în supercapsidă într-o veziculă de exocitoză, în membrana căreia se conţin GP virale mature.

Virionii sunt eliberaţi prin exocitoză .

Celula infectată este alterată ireversibil prin: Inhibarea rapidă a metabolismului celular. Fragmentarea cromozomului şi apariţia incluziilor intranucleare – corpusculii Cowdry. Apariţia de sinciţii şi celule gigante.

SUBFAMILIA ALPHAHERPESVIRINAEGENUL SimplexvirusSpecii: Herpes simplex virus tip 1 (HSV-1); Herpes simplex virus tip 2 (HSV-2) Cultivare:

Culturi celulare primare umane sau din rinichi de iepure, fibroblaste de embrion de găină, linii celulare HeLa Ouă embrionate de găină (pe membrana chorioalantoică produc pustule – pocks-uri) Animale de laborator Şoarece nou-născut (letal) Iepure (keratoconjunctivită după scarificarea corneei) Cobai infectat intraplantar (erupţie veziculară locală)

Patogeneza infecţiilor cu HSVSursa de virus – omul (90% au Ac anti-HSV1 şi 20% anti-HSV2)Transmiterea virusului:

1. Contact direct: prin salivă sau lichidul vezicular, mai rar prin obiecte contaminate recent cu salivă (preponderent HSV-1)2. Contact sexual (preponderent HSV 2)3. În timpul naşterii (herpes neonatal, HSV 2) 4. Transplacentar (herpes congenital, HSV 2))5. Prin intermediul transplantelor de organe infectate6. Autoinocularea

Primo-infecţia este precoce, la 1-3 ani, în 90% cazuri – asimptomatică. Manifestări clinice:

herpesul labialgingivostomatită (erupţie veziculară şi ulceroasă, adenopatie cervicală, febră)kerato-conjunctivită (prezintă riscul ulceraţiei corneei şi orbirii)eczema herpeticum (survine la pacienţi cu eczeme cronice, se manifestă ca o dermatită veziculară generalizată)panariţiu herpetic (la personalul medical, la copii – autoinoculare)meningite, menindo-encefalite, consecutiv infecţiei pe calea nervilor trigemen sau olfactiv (letalitate 70%).

După infecţie (clinică sau asimptomatică) virusul se localizează în ganglionul trigemen, determinând o infecţie latentă. Genomul viral persistă sub formă de episom. Replicarea ADN nu are loc, exprimându-se doar câteva gene “de latenţă”.

68

Page 69: Microbiologie Exam

Reactivarea infecţiei (herpesul recurent) are loc consecutiv scăderii rezistenţei organismului: stress, radiaţii, frig, infecţii, perturbări hormonale, etc. Virusul se propagă centrifug pe cale nervoasă, determinând o infecţie locală (frecvent la joncţiunea cutaneo-mucoasă): herpes labial, nazal, keratita herpetică (buchet de vezicule, se acoperă cu cruste în câteva zile, vindecarea survine în 10 zile).

Infecţia cu HSV -2 Determină preponderent infecţii genitale. Primo-infecţia are loc la persoane de 15-25 ani (primele contacte sexuale) sau la nou-născuţi (herpes congenital, neonatal). 75% cazuri primo-infecţia este inaparentă.Manifestări clinice:

herpesul genital (leziuni veziculo-ulcerative ale penisului, vulvei, vaginului, colului uterin, perineului, feselor, proctita herpetică. După infecţia primară virusul rămâne latent în ganglionii lombari şi sacrali, determinând recurenţe, cu aceeaşi localizare, care sunt mai puţin severe.

herpesul neonatal. Contractat de nou-născut la naştere sau de la personalul medical cu herpes oral sau panariţiu herpetic. Se manifestă prin septicemie sau conjunctivită. Netratat progresează cu diseminare viscerală şi deces (65%). Infecţia poate fi asimptomatică.

infecţie congenitală. Transmiterea transplacentară determină malformaţii congenitale, vicii. cancer de col uterin şi vulvar.

La gazde imunocompromise infecţia cu HSV evoluează grav, cu diseminare masivă şi afectarea organelor interne. Recurenţele sunt mai frecvente, cu ulcerare, necroză, extindere.

Răspuns imun: umoral şi celular, se instalează după 1-3 săptămâni de la infecţie. Ig M apar şi în reactivări şi sunt martor de multiplicare virală. Ig nu sunt protectoare, reactivările au loc în prezenţa Ac. Imunitatea celulară joacă rolul principal în controlul infectiei cu HSV.

Diagnosticul de laborator al infecţiei cu HSVPrelevate: lichid din vezicule, ulceraţii, cruste, fragmente bioptice sau necroptice.Examenul microscopic: ME; Microscopia optică – pe frotiuri colorate cu hem-eozină se observă celule mari, cu incluzii intranucleare eozinofile (Cowdry); Detectarea Ag virale: RIF cu Ac monoclonali Examenul virusologic: Izolarea virusului pe animale sensibile, ou embrionat de găină sau culturi celulare; Indicarea virusului : manifestări clinice la animal, apariţia veziculelor pe membrana chorio-alantoica a oului embrionat, ECP specific pe culturile de celule (celule gigante sincitiale cu incluzii intranucleare); Identificarea virusului cu ajutorul serurilor imune specifice (RN, RIF, ELISA); Detectarea genomului viral prin tehnici de biologie moleculară (hibridare in situ, PCR)Diagnosticul indirect. Serodiagnostic. Examinarea serurilor perechi (precoce şi tardiv) cu evidenţierea creşterii titrului de Ac de cel puţin 4 ori. Reacţii utilizate: RFC, RN, RIFI, ELISA.

Tratamentul specific al infecţiei cu HSV: Vidarabin (adenin-arabinosid). Analog nucleozidic al guaninei. Inhibitor competitiv al ADN polimerazei virale; Acyclovir, Valacyclovir, Zovirax (acycloguanosid), Penciclovir, famciclovir. Analogi nucleozidici ai guaninei. Inhibitori ai ADN polimerazei virale, manifestă activitate numai asupra virusului în curs de replicare. Foscarnet (phosphonoformat). Dezechilibrează reacţia de polimerizare a ADN.

119. Familia Herpesviridae. Genul Varicellovirus. Caracterele morfobiologice ale VZV. Patogeneza varicelei si zonei-zoster. Particularitatile de evolutie la persoane imunocompromise. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de HZV. Prelevatele. Metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.GENUL VaricellovirusSpecia – virusul Varicella-Zoster (VZV), agentul etiologic al varicelei în primo-infecţie şi al zonei-zoster prin reactivare.Cultivarea – numai pe culturi celulare (celule primare de origine umană, simiană, din rinichi de iepure, linii celulare)

Infecţia primară – varicelaSursa de virus – omulTransmiterea – aerogenă, prin secreţii rinofaringiene sau prin contact cu lichidul vezicular sau obiecte recent contaminate cu lichid vezicular.Varicela se manifestă în special la copii de 2-6 ani, evoluând epidemic iarna şi primăvara. Contagiozitate maximă cu 1-2 zile înaintea erupţiei şi o săptămână după ultimul puseu eruptiv. Perioada de incubaţie – 14 zileDupă pătrundere virusul se multiplică local în căile respiratorii (mai rar conjunctivă) şi ganglionii limfatici locali. Urmează faza de viremie primară, cu durata de 10-11 zile şi cu afectarea sistemului reticulo-endotelial. Peste 5 zile urmează viremia secundară cu răspândirea şi multiplicarea virusului în tegument, conjunctivă, tractul respirator (ţesuturilor de origine ectodermică). Apare febra şi succesiunea unor valuri de erupţie pruriginoasă care evoluează independent (maculă – papulă – vezicule cu lichid clar, apoi cruste) şi ating tot corpul. Dispar fără cicatrice. Odată cu apariţia Ac (2-3 săptămâni) simptomele dispar. Evoluţia este benignă.La persoane cu deficienţe imunitare – leziuni hemoragice, suprainfecţie bacteriană, encefalite, pneumonii, varicela diseminată, letală.La gravide în primele 20 săptămâni de sarcină varicela poate determina o embriofetopatie.

Reactivarea (Zona-Zoster): În cursul primoinfecţiei, prin nervii senzitivi sau hematogen, VZV diseminează spre ganglionii spinali sau ai nervilor cranieni, unde persistă latent. În caz de reactivare virusul se multiplică şi se deplasează pe cale nervoasă centrifugă spre sectorul cutanat corespunzător, determinând Zona-Zoster. Infecţia debutează cu neuralgie severă, hiperestezie şi erupţie veziculară localizată unilateral în dermatomul nervului afectat. Poate fi asociată cu meningită sau paralizii. Forme clinice: zoster oftalmic, zoster motor, encefalomielita.Erupţiile persistă până la apariţia răspunsului imun (umoral, celular).

Tratament – acyclovir, valacyclovir, famciclovir. Tratament simptomatic (analgezice, antipruriginoase).Profilaxie – vaccin viu atenuat, tulpina Oka (în special la imunodeprimaţi). Pentru prevenirea evoluţiei grave la contacţi (nou-născuţi, copii până la 15 ani, gravide neimunizate, persoane cu imunodeficienţe) se administrează Ig umană hiperimună specifică sau gammaglobuline de convalescenţi de zona.

120. Familia Herpesviridae. Genul Cytomegalovirus. Caracterele morfobiologice ale virusului citomegalic. Patogeneza infectiilor cauzate de CMV , manifestarile clinice (infectie primare, reactivarile). Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de CMV. Prelevatele. Metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.SUBFAMILIA BETAHERPESVIRINAEGENUL CytomegalovirusSpecia Virusul cytomegalic (CMV)Cultivarea – numai pe culturi de celule primare din fibroblaste umane sau culturi de miometru.

69

Page 70: Microbiologie Exam

Celulele – ţintă: macrofagele, celulele endoteliale, limfocitele T şi B, celulele-suşă din măduva osoasă, celulele epiteliale ale canalelor glandulare.

Patogeneza infecţiei cu CMVSursa de infecţie – omulTransmiterea:

1. Prin contact direct cu secrete şi excrete ale bolnavilor (salivă, lacrimi, lapte, urină, secreţii ale colului uterin, vaginale, spermă, mase fecale, sânge).

2. Congenital (vertical).3. Neonatal (în timpul naşterii, prin lapte).4. Transfuzii de sânge sau transplante de organe.

Primoinfecţia este în general asimptomatică (80-90%). În caz de viremie este urmată de persistenţa latentă a virusului în glandele salivare şi limfocite B.Manifestări clinice:Infecţia congenitală

moarte in utero cu avort; naştere prematură, cu dezvoltarea bolii cu incluzii citomegalice (microcefalie, hepatosplenomegalie, purpură trombocitopenică,

pneumonie interstiţială, defecte neurologice). Patomorfologic - celulele infectate devin gigante (citomegalie), cu incluzii intranucleare specifice în „ochi de bufniţă”.

Infecţia postnatală (infectarea în timpul naşterii sau cu laptele matern). Copiii elimină virusul prin urină şi salivă. Decurge inaparent în majoritatea cazurilor. La prematuri – pneumonie interstiţială, sechele neurologice şi retardare psihomotorie.Infecţia primară a copilului sau a adolescentului. După o incubaţie de 30 de zile diseminarea virală se manifestă prin febră, hepatosplenomegalie, adenopatii asociate cu sindrom mononucleozic (neutropenie, limfocitoză, bazofilie). Evoluţie benignă.Infecţia adultului (doar la imunodeprimaţi, persoane cu transfuzii sau transplante). Se aseamănă cu mononucleoza infecţioasă (cu febră şi splenomegalie, dar fără angină, fără adenită şi fără Ac heterofili )După primoinfecţie virusul persistă latent în limfocite.

Reactivările se traduc prin apariţia unei viremii tranzitorii şi excreţia virusului. La imunodeprimaţi – pneumonie, hepatită, infecţie generalizată.Imunitate – umorală (Ac neutralizanţi, fixatori de complement) şi celulară prin intermediul limfocitelor Tc şi celulelor NK. CMV are efect imunosupresor, ducând la creşterea nr limfocitelor Ts şi diminuarea limfocitelor Th.

Diagnosticul de laborator al infecţiilor citomegalicePrelevate: fracţia leucocitară a sângelui, urină, spălătură rinofaringeană, secreţii cervicale, probe bioptice sau necroptice.Diagnosticul microscopic. Prezenţa celulelor mari, cu incluzii intranucleare în „ochi de bufniţă” pe frotiuri din leucocite, plasmă, sediment urinar sau secţiuni tisulareDetectarea Ag virale cu Ac monoclonali (RIF, ELISA)Examenul virusologic – dificil. Cultivarea pe culturi de celule este lentă (2-8 săptămâni). ECP- celule mari, incluziuni eozinofile intranucleare şi bazofile intracitoplasmaticeDetectarea genomului viral (PCR)Serodiagnostic. Cercetarea serurilor perechi în RFC, RHAI, RIFI, ELISA

Infecţie congenitală – izolarea virusului în primele 2 săptămâni de viaţă, depistarea Ig M.Infecţie recurentă: reapariţia excreţiei virale la pacienţi seropozitivi.

Tratament: gancyclovir, valgancyclovir, foscarnet, cidofovirProfilaxie: vaccin viu atenuat sau/şi plasmă sau globulină hiperimună se administrează gravidelor seronegative, recipienţilor de transplant HHV 6 – întâlnit la adulţi în 90%. Agent implicat în etiologia unei afecţiuni cutanate - exanthum subitum. La persoane cu imunosupresie – pneumonii, encefalite, retinite, etc.HHV 7 – izolat de la adulţi sănătoşi (aprox. 75%), care excretă virusul prin salivă. Sediul latenţei – epiteliul glandelor salivare, limfocite T CD4. Omologie de 50% cu CMV.HHV 8 – asociat cu sarcomul Kaposi.

70