SUBIECTE EXAMEN SCRIS

1. Clasificareabacteriilordupa forma sidispunereÎn funcţie de formă, bacteriile se pot grupa în mai multe categorii şi pot avea:

a) formă cocoidală, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat. Majoritarea steptococilor şi stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt lanceolaţi, gonococii şi meningococii pot fi reniformi.

Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultură în care se dezvoltă, de vârsta culturii bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum şi de modul în care are loc diviziunea în cursul procesului de creştere şi multiplicare (planul de diviziune).

Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele genuri de bacterii, de ex.:

- stafilococii sunt coci sferici dispuşi în grămezi („ciorchine”);- pneumococii sunt coci lanceolaţi dispuşi doi câte doi, eventual înconjuraţi de o capsulă comună

(în diplo);- streptococii sunt coci dispuşi în lanţuri etc.;b) formă de bastonaş (bacili, „rods”), drepţi cu capetele uşor rotunjite (enterobacterii), drepţi cu

capetele tăiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuţite (Fusobacterium nucleatum), dispuşi uneori într-un mod caracteristic (de exemplu „în palisade”, ca şi scândurile dintr-un gard - bacilii pseudodifterici);

c) aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus);d) actinomicete, care în culturi tinere formează filamente lungi, ramificate (asemănător

mucegaiurilor); aceste filamente se fragmentează şi rezultă aspecte bacilare (ex. Actinomyces israelli);

e) forma spiralată (bacili curbi - V. cholerae, spirili şi spirochete - T. pallidum).Unele bacterii, chiar şi atunci când rezultă prin multiplicarea unei singure celule „mamă” prezintă

un pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.).În culturi vechi sau sub influenţa unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu antibiotice

etc., pot apărea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care pot crea confuzii de diagnostic pentru examinatorul fără experienţă sau care nu face o examinare ţinând cont de context. Dacă are loc repicarea acestora pe mediu de cultură proaspăt iar examinarea ulterioară se face la timpul potrivit (având în vedere durata optimă de multiplicare) vor rezulta forme „tipice” pentru specia respectivă.

2. Enumerati elementele constant si facultative ale celulei bacterieneAtât din punct de vedere structural cât şi funcţional, există o serie de asemănări între celula

procariotă şi celula eucariotă. Bacteriile prezintă atât elemente structurale interne cât şi structuri externe care pot şi merită a fi studiate având implicaţii în relaţiile dintre celula bacteriană şi organismul gazdă. Există două tipuri de elemente structurale, unele dintre acestea fiind întâlnite la toate speciile de bacterii (constante), altele fiind întâlnite numai în anumite condiţii şi doar la anumite specii sau tulpini bacteriene (facultative).

Structurile constante ale celulei bacteriene sunt reprezentate de:- perete,- membrană citoplasmatică,- citoplasmă (cu ribozomi şi facultativ cu incluzii, vacuole, plasmide) şi de- nucleu.

1

Structurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsulă, cili (flagelii), fimbrii (pili) şi spori (forme de rezistenţă).

3.Structura peretelui la bacteriile Gram (+) si (-)Bacteriile Gram-pozitive conţin aproximativ 80-90% mureină (peptidoglican, glicopeptid

parietal). Mureina este un heteropolimer al cărui schelet este format din lanţuri polizaharidice. Aceste lanţuri sunt formate prin polimerizarea, alternantă, a 2 structuri zaharidice:

- acidul N-acetil-muramic (NAM) şi- N-acetil-glucozamina (NAG).Fiecare moleculă de NAM are substituit un tetrapeptid alcătuit din D şi L-aminoacizi. Se consideră

că aminoacizii în formă D conferă un grad de protecţie faţă de enzimele proteolitice. Între tetrapeptidele substituite, la lanţurile polizaharidice alăturate, se stabilesc legături peptidice prin gruparea terminală COOH a unui tetrapeptid şi grupări terminale libere ale tetrapeptidului vecin. Astfel se formează structuri bidimensionale, destul de complicate, sub forma unor straturi care înconjoară întreaga celulă bacteriană.

Bacteriile Gram-pozitive reţin violetul de metil (violet de genţiană în coloraţia „clasică”) şi au culoare violet pe frotiul colorat Gram. La unele bacterii, reţeaua de bază este acoperită de reţele suplimentare cu specificitate antigenică, alcătuite de exemplu din acid teichoic (polimer de ribitol fosfat şi glicerol fosfat), legat de regulă covalent la peptidoglican. În cazul în care structurile fosfat se găsesc în cantităţi limitate sau nu pot fi sintetizate, la nivelul peretelui bacterian putem întâlni acidul teichuronic. Dintre bacteriile Gram-pozitive se pot aminti stafilococul, streptococul, enterococul, bacilul difteric, bacilul listeriozei, actinomicetele, bacilul antraxului, clostridiile etc.

În cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular în general mai subţire dar mult mai complex. Peretele este alcătuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-20% din structura peretelui) care este acoperit de o membrană externă. Spaţiul dintre membrana citoplasmatică şi membrana externă (include peptidoglicanul) reprezintă spaţiul periplasmic. Din punct de vedere chimic, membrana externă este alcătuită din fosfolipide, proteine şi cantităţi variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se află la acest nivel sunt porinele. Lipopolizaharidul (endotoxina) are în componenţă două structuri esenţiale: lipidul A şi polizaharidul O. Bacteriile Gram-negative se decolorează cu alcool-acetonă şi se recolorează cu fucsină diluată (au culoare roşie la coloraţia Gram). Dintre bacteriile Gram-negative am putea aminti meningococul, gonococul, enterobacteriile, vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii Gram-negativi (ex. Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella abortus) etc.

4. Rolul peretelui bacterianRolurile peretelui bacterian:- prin rigiditate asigură forma caracteristică bacteriei (coci, bacili etc);- asigură rezistenţa bacteriei (de exemplu la variaţii ale presiunii osmotice şi la presiuni interioare

care pot ajunge până la 20 atm.);- flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicată atât prin

flexibilitatea membranei cât şi prin grosimea redusă a peptidoglicanului;- are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic, în cazul bacteriilor

Gram-negative etc);- prezintă receptori, de exemplu pentru bacteriofagi;- are rol în diviziunea bacteriană participând la formarea septului transversal;- la nivelul lui pot acţiona unele antibiotice (exemplu beta-lactaminele, vancomicina, D-

cicloserina);

2

- la bacteriile Gram-negative este asociat cu numeroase enzime (situate în spaţiul periplasmic şi la nivelul membranei externe).

5. Coloratia Gram.Interpretare, timpi, exempleDiluăm într-un recipient fucsina (9 părţi apă distilată / 1 parte fucsină)

· acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet (violet de genţiană din punct de vedere istoric), pentru 1-3 minute (nu are rost să acoperim cu colorant lama în întregime)

· îndepărtăm colorantul· acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator) pentru 1-3 minute· îndepărtăm lugolul· acoperim frotiul cu un amestec de alcool-acetonă (1 parte acetonă / 3 părţi alcool de 96º)

pentru un timp foarte scurt, 7-8 secunde· spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet· acoperim frotiul cu fucsina diluată 1/10 pentru 1 minut· spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet· aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare cu

sugativă sau hârtie de filtru· examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm In cazul în care frotiul a fost realizat din cultură pură putem vizualiza microorganisme cu aceeaşi

formă, aceleaşi dimensiuni (excepţie Proteus spp.), o anumită dispoziţie, cu sau fără capsulă (halou necolorat), gram pozitive (colorate în violet) sau gram negative (colorate în roşu), levurile se colorează în violet

In cazul în care frotiul a fost realizat din produs patologic putem vizualiza celule diferite (în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii pentru care nucleul şi citoplasma apar în diverse nuanţe de roşu, bacterii gram pozitive şi / sau gram negative, fibrină şi levuri care se colorează în violet etc

6.Coloratia Ziehl-NeelsenEste o coloraţie utilă în identificarea prezenţei de bacili acid-alcool rezistenţi (BAAR), solubilizând

peretele bacterian prin creşterea temperaturii, facilitând penetrarea colorantului.· punem frotiul uscat şi fixat pe un suport situat deasupra tăviţei de colorare· acoperim complet lama cu fucsină bazică nediluată (filtrată extemporaneu)· trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperită de fucsină, până începe emiterea de

vapori (nu atingem temperatura de fierbere). În cazul în care lama nu mai este acoperită complet cu fucsină, adăugăm colorant. Timpul de lucru este de 10 minute, perioadă în care repetăm de 3 ori operaţia de încălzire a lamei până la emiterea de vapori.

· spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet· adaugăm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml alcool

etilic 90-95º), pentru 2-3 minute· spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet· recolorăm cu albastru de metilen, 1 minut· spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet· aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare cu

sugativă sau hârtie de filtru· examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm

Putem vizualiza: bacili de culoare roşie, relativ fini (în cazul prezenţei BAAR), alte bacterii (ne-AAR), celule diferite (în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii de culoare albastră (toate

3

structurile ne-AAR apar colorate albastru) etc; în cazul colorării unui frotiu din cultură pură vom evidenţia numai bacili de culoare roşie.

7.Ribozomii.Structura,rolRibozomii au formă aproximativ sferică, pot fi văzuţi la microscopul electronic. Mărimea lor (circa

10-20 nm) depinde de concentraţia ionilor Mg2+ şi K+. Unii ribozomi sunt liberi în citoplasmă, în timp ce alţii apar legaţi de faţa internă a membranei citoplasmatice. Din punct de vedere chimic conţin circa 65% ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de 70 unităţi Swedberg dar sunt constituiţi din două subunităţi de câte 30S şi respectiv 50S. În subunitatea mică intră o singură moleculă de ARNr, 16S şi 21 de tipuri de proteine ribozomale. În subunitatea mare intră mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S). Între cele două subunităţi se formează canalul prin care trec moleculele de ARNm (mesager) în cursul sintezei proteice. Se apreciază că într-o bacterie cu dimensiuni medii, aflată în faza de creştere activă, se sintetizează circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens.

Ribozomii au rol esenţial în procesul de biosinteză proteică. Au tendinţa de a se grupa în polisomi (poliribozomi) cu eficienţă sporită în biosinteza proteică. În aceste condiţii, la un moment dat pe aceeaşi moleculă de ARNm se află în scopul traducerii mesajului genetic mai mulţi ribozomi, care constituie un ansamblu care poartă numele de polisom.

Biosinteza proteicăBiosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor.Cu toate că secvenţa de aminoacizi din structurile proteice este „dictată” de secvenţa de baze

azotate din ADN, pentru că nu există afinitate şi posibilitate de cuplare între ADN şi aminoacizi este necesar ca o altă structură să permită poziţionarea aminoacizilor în lanţul viitoarei proteine.

Iniţial are loc transcrierea informaţiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta această informaţie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este segmentul de ADN care deţine informaţia genetică pentru sinteza unei proteine. Segmentul de ADN care controlează sinteza unui polipeptid poartă numele de cistron.

ARNm care deţine informaţia genetică pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poartă numele de ARNm monocistronic.

La bacterii, de obicei, o moleculă de ARNm trebuie să poarte informaţia necesară pentru sinteza mai multor catene diferite şi în acest caz ARNm poartă numele de ARNm policistronic. Această situaţia particulară este datorată dimensiunii mici a acestor procariote precum şi metabolismului intens care are loc în cursul procesului de creştere şi multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenţial 3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se află deţinut de o singură moleculă de ARNm policistronic.

De regulă, numai o catenă de ADN este folosită drept matriţă pentru ARNm. Transcrierea mesajului genetic este selectivă (se desfăşoară între promotor şi semnalul de terminare) şi este controlată de ARN polimeraza ADN-dependentă.

Pentru traducerea mesajului genetic este necesară intervenţia la nivel ribozomal a moleculelor de ARNt (de transfer). Acestea au o dublă specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi există una sau mai multe molecule de ARNt; în acelaşi timp există enzime specifice fiecărui tip de aminoacid care controlează legarea corectă a aminoacizilor activaţi pe ARNt corespunzător). La nivelul fiecărui ARNt există trei nucleotide (anticodon) complementar codonului care corespunde aminoacidului.

ARNt nu are niciodată la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU şi în aceste condiţii ne putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG şi UGA sunt codoni stop.

4

Succesiunea specifică a nucleotidelor este transpusă într-o secvenţă specifică de aminoacizi care intră în constituţia lanţului polipeptidic din proteina în curs de formare.

8. Flagelii bacterieni–Structura, rol, localizare Cilii sau flagelii conferă mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evidenţiată în preparatul

proaspăt (între lamă şi lamelă) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU). Mobilitatea germenilor din genul Proteus este observată pe orice mediu de cultură solid pe care acest microorganism foarte mobil se dezvoltă (fenomenul de „invazie”).

Flagelii sunt formaţiuni fine, alungite, flexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal. Acesta este alcătuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate ca două perechi pe o structură care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este plasat în perete şi membrana citoplasmatică. Din punct de vedere chimic flagelul este de natură proteică (flagelina).

Roluri:- în mobilitate (cu o viteză de circa 50 µm / secundă); cilul are o mişcare de rotaţie,

asemănătoare unei înşurubări în mediu şi ca atare corpul bacterian este împins în direcţia opusă; „motorul” rotaţiei e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obţinută din ATP;

- antigenic (datorită structurii proteice - antigenul H, specific de tip);- în clasificarea bacteriilor (prin număr şi distribuţie), bacteriile putând fi- monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio cholerae, Pseudomonas

aeruginosa;- lofotriche (cu un mănunchi de flageli dispus la o extremitate);- peritriche (cu mai mulţi flageli dispuşi de-a lungul suprafeţei bacteriene), de exemplu E.

coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi.

9. Sporibacterieni – Structura, rol, localizare Fenomenul de sporogeneză este mai des întâlnit

la Bacillaceae (genurile Clostridium şi Bacillus). Pe sol, în condiţii de uscăciune, la adăpost de lumina solară directă, endosporii persistă zeci şi poate sute de ani.

Materialul genetic este concentrat şi, împreună cu apa legată, lipide, Ca++, Mg++, este înconjurat de un strat protector (membrana sporală, cortexul sporal, învelişurile sporale). „Sâmburele” sporal împreună cu membrana citoplasmatică formează protoplastul sporal.

Roluri:- formă de rezistenţă şi conservare a speciei (în condiţii favorabile un spor se poate transforma

într-o bacterie / forma vegetativă; procesul de formare a sporului ar putea fi considerată una dintre cele mai primitive forme de diferenţiere, dar nu este un proces de reproducere celulară aşa cum se întâmplă la fungi sau paraziţi);

- rezistă la căldură, uscăciune, la anumite substanţe chimice şi antibiotice, raze UV etc.Sporul poate fi localizat:- central sau subterminal, mai mic decât celula (ex. la Bacillus anthracis);- central sau subterminal, mai mare decât celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc);- terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de „băţ de chibrit”).Poate fi evidenţiat prin coloraţii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraţia Gram

(locul sporului rămâne necolorat).Este sensibil la formol, propiolactonă etc. Este distrus prin autoclavare.

10.Nutritia principalelor bacterii studiate. Tipuri de nutritie

5

Nutriţia bacteriană reprezintă suma proceselor metabolice care conduc la producerea de materiale convertibile în energie şi în diferite componente celulare. Nutrienţii sunt substanţe ale căror soluţii pot traversa membrana citoplasmatică pentru a fi antrenaţi în reacţiile metabolice care asigură creşterea şi multiplicarea celulară.

În raport cu sursa de energie, bacteriile se împart în:· bacterii care folosesc energie luminoasă şi trăiesc la lumină (photobacterii) şi· bacterii care îşi procură energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic şi

trăiesc la întuneric (scotobacterii, chimiosintetizante).În raport cu sursele folosite ca material de sinteză în ambele diviziuni se diferenţiază:· bacterii autotrofe, capabile să-şi sintetizeze toţi compuşii organici din materie anorganică

şi· bacterii heterotrofe, dependente de prezenţa unor compuşi organici.

Nutriţia principalelor bacterii studiateMajoritatea bacteriilor comensale, condiţionat patogene sau patogene importante pentru om,

sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se diferenţiază în funcţie de tipul respirator. Există şi bacteriile paratrofe, a căror energie trebuie oferită de gazdă. Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu microorganismele din genurile Rickettsia şi Chlamydia, care depind nutriţional de o gazdă vie).

Creşterea microbiană necesită polimerizarea unor substanţe mai simple pentru a forma: proteine, acizi nucleici, polizaharide şi lipide. Aceste substanţe se obţin fie din mediul de cultură, fie sunt sintetizate de către celulele în creştere (sunt necesare diferite coenzime şi legături macroergice de tipul celor din ATP). Substanţele necesare şi coenzimele implicate se pot obţine dintr-un număr relativ redus de precursori metabolici.

Dacă o celulă bacteriană primeşte substanţele necesare, va sintetiza diferite macromolecule, iar secvenţa aranjării componentelor în aceste macromolecule este determinată fie după un model ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidraţi şi lipide.

După ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansamblează, formând structuri supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor şi activitatea căilor metabolice sunt foarte bine reglate (există o permanentă balanţă a biosintezei).

Microorganismele reprezintă un grup de celule vii care utilizează o mare diversitate de căi metabolice; de exemplu, mai multe căi diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur compus simplu, benzoatul, iar o singură cale metabolică pentru benzoat poate fi reglată de mai multe sisteme de control. Principiul determinant pentru căile metabolice este acela al organizării unui număr relativ mic de tipuri de reacţii biochimice, într-o ordine specifică. Multe dintre căile biosintetice se pot deduce având în vedere structura chimică de la care se porneşte, produsul final şi eventual unul sau doi metaboliţi intermediari. Principiul determinant al reglării metabolismului este acela că enzimele par a fi „chemate” în joc numai când activitatea lor este necesară. Activitatea unei enzime poate fi modificată variind fie cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acţionează.

În unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuată prin cuplarea unor efectori specifici (metaboliţi care modulează activitatea enzimatică).

De multe ori, activitatea unei enzime care catalizează o etapă metabolică iniţială este (poate fi) inhibată de produsul final al căii respective. O astfel de inhibiţie nu poate depinde de competiţia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiţia depinde de faptul că enzimele reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzimă are atât un situs catalitic de legare cu substratul, cât şi unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori). Legarea unui

6

efector de situsul său duce la o modificare conformaţională a enzimei, astfel încât afinitatea situsului catalitic scade (inhibiţie allosterică) sau creşte (activare allosterică).

Când o bacterie peritriche se mişcă, flagelii se asociază şi se mişcă împreună, rezultând o deplasare liniară. La diferite intervale de timp, bacteria îşi schimbă direcţia (flagelii „se dau peste cap”). Acest comportament face posibilă chemotaxia: o celulă care se îndepărtează de sursa atractantului chimic îşi schimbă sensul de mişcare mult mai frecvent în comparaţie cu una care se apropie de atractant şi ca o însumare, bacteria se va deplasa înspre atractant. Spre exemplu, prezenţa unui zahar sau a unui aminoacid este sesizată de receptori specifici localizaţi pe membrana celulară (de multe ori acelaşi receptor participă şi la transportul membranar al acelei substanţe). Celula bacteriană este prea mică pentru a fi capabilă să detecteze existenţa unui gradient chimic (în spaţiu), dar s-a demonstrat experimental că detectează gradienţii în timp (de exemplu, concentraţia unei substanţe scade în timp ce bacteria se îndepărtează de sursă şi creşte în timp ce aceasta se apropie de sursă).

Anumiţi compuşi acţionează ca respingători (R), iar alţii ca atractanţi (A). Un mecanism care ar explica răspunsul celulei faţă de A/R ar implica metilarea şi respectiv demetilarea unei proteine specifice din membrană, care depinde de GMPc. Atractanţii produc o inhibiţie tranzitorie a demetilării acestei proteine. Respingătorii stimulează demetilarea.

Mecanismul prin care o modificare în comportamentul celular se produce ca răspuns la o modificare de mediu poartă numele de transducţie senzorială. Aceasta pare să fie responsabilă de:

· chemotaxie;· aerotaxie (deplasarea către concentraţia optimă de O2);· fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe către lumină);· deplasarea spre acceptorul de electroni etc.

11. Clasificarea bacteriilor in functie de temperatura optima de dezvoltare.Exemple În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:

· mezofile (temperatură optimă 30-37ºC),· psichrofile (temperatură optimă în jur de 20ºC) şi· termofile (temperatură optimă 50-60ºC).Prin acţiunea căldurii procesele chimice şi fizice sunt mult accelerate; distrugerea se produce

după atingerea temperaturii de 50-60ºC prin ruperea legăturilor intramoleculare, mai ales a punţilor de hidrogen care menţin proteinele şi alte macromolecule în stare nativă. Ca urmare protoplasma se denaturează. Celulele bogate în apă sunt mult mai sensibile la acţiunea căldurii decât microorganismele care conţin puţină apă sau sunt liofilizate. Apa din compoziţia microorganismelor absoarbe căldura proporţional cu volumul său. Sterilizarea prin căldura are loc în două variante principale: prin căldură uscată şi umedă.

Temperaturile joase (în jur de 0-4ºC) au în general un efect bacteriostatic. La temperaturi scăzute, reacţiile biochimice încetinesc, multiplicarea poate fi stopată. Majoritatea produselor biologice/patologice pot fi transportate (menţinând viabilitatea germenilor şi încetinind în acelaşi timp multiplicarea acestora) la o temperatură de circa 4ºC. O serie de culturi pot fi de asemenea menţinute la temperatura frigiderului pentru o durată limitată de timp în vederea prezervării şi posibilităţii de a repeta anumite teste de identificare etc.

În funcţie de viteza cu care are loc răcirea, întâlnim situaţii diferite, cu următoarele posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene.

a). Congelarea lentă, la temperaturi mai mici -21,3ºC are efecte bactericide prin formarea de cristale de gheaţă şi prin hiperconcentrarea salină cu denaturarea proteinelor;

7

b). Congelarea bruscă la -70ºC are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea în masă a apei fără apariţia cristalelor de gheaţă;

c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezintă congelarea bruscă concomitent cu desicaţia (deshidratarea în vid). O suspensie microbiană în mediu protector, liofilizată, poate fi păstrată în fiole închise timp îndelungat (de exemplu vaccinul BCG).

12. Definiti notiunea de mediu:selectiv,electiv si de imbogatire Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite

bacterii (de exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric).Prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea altor

bacterii decât cea a cărei izolare se urmăreşte. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii în care includem antibiotice (faţă de care bacteria care se doreşte a fi izolată este rezistentă): agar-sânge azid de sodiu, BSA, Chapman, Mac Conkey, Tinsdale cu telurit de potasiu, medii cu antibiotice etc.

Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând dezvoltarea florei de asociaţie dintr-un produs patologic. Funcţionează concomitent ca mediu selectiv şi ca mediu electiv: apă peptonată alcalină, bulion selenit, O.C.S.T. etc.

13. Definiti notiunea de mediu diferential.Exemple Mediul diferenţial conţine un indicator de pH şi un anumit substrat (de exemplu un zahar)

care poate fi sau nu metabolizat, determinând modificarea pH-ului şi a culorii indicatorului sau modificarea aspectului culturii. De exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) permite diferenţierea bacteriilor lactozo-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactozo negative (Shigella, Salmonella etc). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3 zaharuri şi fier), MIU (mobilitate indol uree).

14. Ce este o colonie bacteriana si cum se pot obtine colonii bacteriene izolate? Colonia este totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene.

O colonie este o clonă bacteriană.Coloniile izolate se pot obţine de exemplu prin tehnica însămânţării prin dispersie (cu ansa

bacteriologică sau cu tamponul). După prelevarea cu ansa a unei porţiuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizează ansa; se verifică temperatura, prin atingerea mediului într-o zonă neînsămânţată, cât mai periferic; cu ansa sterilă se trasează a doua latură a poligonului; se resterizează ansa şi se repetă procedeul descris până la realizarea a 4-5 laturi, fără a atinge prima latură. În acest mod, pe ultimele „laturi” ale poligonului se vor putea observa după trecerea timpului necesar multiplicării bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1)

Incubarea constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate, în condiţiile necesare pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi duc la apariţia unei culturi în circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optimă de dezvoltare (asigurată în termostat) pentru că timpul de generaţie este de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaţie de 12-27 ore şi în acest caz cultura devine pozitivă în 2-8 săptămâni. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesară incubarea în anaerobioză (ex. în medii la care s-au adăugat ingrediente cu activitate reducătoare sau în anaerostat); dorim să subliniem că dacă transportul nu se face în condiţii de anaerobioză, nu vom mai obţine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate

8

15.Fazele dezvoltarii unei culturi bacterieneTeoretic, dinamica unei populaţii bacteriene ar trebui să evolueze exponenţial. Dinamica

reală a populaţiei bacteriene în cultură discontinuă are însă o evoluţie caracterizată printr-o curbă la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmică; faza staţionară şi faza de declin (Figura nr. 13).

Faza de lagNumărul bacteriilor însămânţate rămâne staţionar sau scade; germenii se adaptează la condiţiile

mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, îşi consumă până la dispariţie incluziile, cresc mult în dimensiuni, sintetizează enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag durează aproximativ 2 ore. Această fază este aparent dependentă de o varietate de factori incluzând dimensiunea inoculului, timpul necesar pentru a-şi reveni din şocul fizic datorat transportului, timpul necesar pentru sinteza coenzimelor esenţiale sau a factorilor de diviziune şi timpul necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent în mediu. (2)

Faza de multiplicare logaritmică (exponenţială)Celulele bacteriene prezintă caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt însă ceva mai mari),

citoplasma este intens bazofilă şi omogenă, lipsită de incluzii. Bacteriile sunt foarte sensibile la antibiotice. Această fază este adecvată pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor în vederea preparării de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenţială durează aproximativ 2-3 ore.

Faza staţionarăMultiplicarea este realizată în progresie aritmetică, dar pentru că numărul bacteriilor care sunt

distruse este aproximativ egal cu numărul bacteriilor nou apărute rata de creştere devine nulă.Germenii au morfologia caracteristică speciei; în această fază realizăm identificarea germenilor.

Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene începe formarea sporilor. Faza staţionară durează aproximativ 2-3 zile.

Faza de declinSubstratul nutritiv sărăceşte, apar metaboliţi toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc

şi enzime autolitice, rezervele de hrană din incluzii (ex. acidul poli-β-hidroxi butiric sau glicogenul) se consumă, pentru un timp sursa de energie rămâne doar ARN-ul celular. Unele bacterii pot persista 2-3 luni. În acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare şi se exprimă o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru o durată limitată de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogeneză devine foarte intens.

16. Definiti notiunile de asepsie si antisepsie.Exemple de antiseptice.Aplicatii Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediului ambiant cu

germeni microbieni sau prin care putem menţine „sterilitatea” ţesuturilor, mediilor de cultură, medicamentelor injectabile etc.

Antisepsia reprezintă înlăturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente, mucoase sau din plăgi. Se realizează cu ajutorul substanţelor antiseptice, netoxice pentru tegument (ex. alcool etilic 70°, tinctură de iod 5%, KMnO4 0,1%, detergenţi cationici etc).

Decontaminarea reprezintă utilizarea agenţilor fizici / chimici pentru a îndepărta, a inactiva sau a distruge unele sau toate microorganismele condiţionat patogene sau patogene de pe suprafeţe sau obiecte, astfel încât acestea să nu mai poată reprezenta o sursă de infecţie sau de transmitere a infecţiei, iar obiectele sau suprafeţele să poată fi manipulate şi / sau utilizate în siguranţă.

9

Sanitizarea reprezintă totalitatea măsurilor pentru asigurarea sănătăţii publice.Prezervarea presupune prevenirea multiplicării unor microorganisme în produse farmaceutice,

vaccinuri, alimente etc.Curăţarea reprezintă utilizarea agenţilor fizici şi / sau chimici pentru a îndepărta murdăria

(materie organică şi anorganică) de pe suprafeţe (inclusiv tegument) sau obiecte, prin procedee mecanice sau manuale, pregătind astfel suprafeţele sau obiectele pentru utilizare în siguranţă sau, pentru trecerea la o altă etapă de decontaminare.

17. Definiti notiunile de sterilizare si dezinfectie.Exemple de dezinfectante.Aplicatii Dezinfecţia reprezintă distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori şi a sporilor) din

anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafeţe. Se realizează cu ajutorul unor agenţi fizici sau cu ajutorul substanţelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative asupra ţesuturilor gazdei). Împiedică răspândirea bolilor infecţioase.

Dezinfecţia igienică a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu acţiune directă asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fără a acţiona asupra florei rezidente.

Dezinfecţia chirurgicală a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu acţiune directă asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia şi cu acţiune asupra florei rezidente.

Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel scăzut” este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate şi virusurile mari necapsulate.

Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel intermediar” este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate şi mycobacteriile.

Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel înalt” este un agent chimic care, în condiţii bine definite de timp şi temperatură, distruge microorganismele, are acţiune sporicidă şi reprezintă un potenţial sterilizant chimic (Figura nr. 2).

Sterilizantul chimic este un agent chimic (nu în formă gazoasă), utilizat pentru sterilizarea dispozitivelor medicale „critice”, care nu se pot steriliza prin metode fizice. Un sterilizant chimic distruge toate categoriile şi formele viabile de microorganisme, nivelul de supravieţuire al acestora fiind mai mic sau egal cu 10-6(probabilitatea prezenţei unui singur microorganism viu pe un dispozitiv medical sterilizat este egală sau mai mică cu 1/1.000.000).

Termenul de valabilitate reprezintă perioada de timp în care un produs dezinfectant este eficient, din punct de vedere al concentraţiei substanţei active şi eficacităţii antimicrobiene.

Timpul de contact (timp de acţiune) reprezintă perioada de timp în care produsul dezinfectant este în contact direct cu suprafaţa sau obiectul care trebuie dezinfectat. Perioada de timp în care produsul antiseptic este în contact direct cu ţesuturile vii.

Sterilizarea reprezintă distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafaţă sau dintr-un mediu (lichid sau solid). Toate materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie să fie sterile înainte de utilizare. Există o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel încât şi metodele de sterilizare sunt destul de variate, după cum urmează:

- Metode de sterilizare prin căldură (căldura uscată sau căldura umedă);- Metode de sterilizare prin filtrare;- Metode de sterilizare utilizând radiaţiile, dar şi- Metode chimice de sterilizare.Metodele de sterilizare care utilizează radiaţiile (cu excepţia radiaţiilor ultraviolete) şi metodele

chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul de microbiologie.

10

Sterilizarea va fi întotdeauna precedată de pregătirea materialului care urmează să fie sterilizat, respectiv: spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor curate, necontaminate) urmat de autoclavare, spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor contaminate refolosibile). Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc. trebuie curăţate perfect, de ex. prin spălare cu ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste materiale au fost contaminate cu sânge, înainte de spălare se vor dezinfecta. Sticlăria de laborator este colectată în recipiente speciale şi se sterilizează prin autoclavare; pipetele vor fi menţinute în amestec dezinfectant până a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile şi acele (deşi este necesară utilizarea pe scară largă a seringilor şi acelor de unică întrebuinţare) contaminate se vor introduce în baie de amoniac 1-2% timp de 15-30 minute, se vor peria în soluţie de 1-2% detergent cationic şi se vor spăla cu jet de apă pentru îndepărtarea substanţelor chimice (Figura nr. 3).

Instrumentele de unică utilizare sunt, în general, destinate chirurgiei moderne. Pot fi izolate (aparate de sutură mecanică toracică, abdominală, vasculară etc) sau pot fi furnizate în seturi de instrumente de unică utilizare. Sterilizarea acestor instrumente se face industrial prin iradiere cu raze gamma sau etilenoxid. Utilizarea instrumentelor de unică utilizare (”disposable”) conferă un plus de siguranţă, în pofida unui preţ relativ ridicat.

Există o serie de metode pentru a controla eficienţa sterilizării, prin indicatorii fizici (ex. termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verificarea eficacităţii sterilizării cu ajutorul radiaţiilor, pot fi utilizaţi spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus)

18+19. Sterilizarea prin caldura umeda - Metode.Parametrii.Aplicatii Sterilizarea prin căldură umedă este cea mai eficientă metodă de sterilizare şi are ca

mecanism coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite substanţe în soluţie, sticlărie (cu excepţia pipetelor şi lamelor), instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultură, aparate de filtrat etc.

b1. Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât şi pentru unităţile sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă realizează

· la 0,5 atmosfere o temperatură de 115ºC,· la 1 atmosferă o temperatură de 121ºC şi respectiv· 134ºC la 2 atmosfere.Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu un capac

prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă sunt comprimaţi la presiunea necesară în vederea sterilizării (Schema nr. 2).

Există mai multe tipuri de autoclave:- autoclave cu perete simplu· verticale· orizontale- autoclave cu manta de aburi· verticale· orizontale.În continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la

care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung în camera de sterilizare de jos în sus (Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru. Pentru punerea în funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete: unul superior (robinetul de aer şi vapori, care permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele există o supapă de siguranţă care se deschide şi permite

11

evacuarea vaporilor atunci când, accidental, presiunea vaporilor depăşeşte limita de siguranţă. În momentul de faţă pentru evitarea riscului de a veni în contact cu vapori de apă fierbinţi aflaţi sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului până când presiunea din interior nu o egalizează pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un spaţiu în care se află sursa de căldură.

În partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă de metal perforată (Figura nr. 9). Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa este perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea apei. În vederea sterilizării se procedează astfel:

· verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie până la o distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează (recomandabil se va utiliza apă distilată);

· aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate corespunzător;· închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care este dotat

autoclavul pe care îl avem la dispoziţie;· conectăm sursa de căldură;· deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în

cazanul cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai uşori, vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului) ;

· închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori;· presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul manometrului;

atunci când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldură în aşa fel încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30 minute) ;

· după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să se răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice;

· deschidem lent robinetul de vapori;· deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului;· lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis;· atunci când temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele

sterilizate.b2. Tindalizarea (sterilizarea fracţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură umedă care

evită depăşirea unei temperaturi de 100ºC. Substanţele de sterilizat se menţin la 56-100ºC timp de 30-60 minute, 3 până la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care permit germinarea, după prima încălzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar după răcire are loc germinarea sporilor. În ziua următoare sunt distruse prin încălzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după răcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat în prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va menţine permanent deschis robinetul de vapori (şi astfel nu se va depăşi în interior temperatura de 100ºC), băi de apă sau băi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultură etc.

b3-4. Pasteurizarea şi fierberea nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate în anumite situaţii.

Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii în conservarea pentru scurtă durată a unor alimente (lapte, bere etc). Există o pasteurizare joasă (30 minute la 56-65ºC), o pasteurizare medie (15 minute la 65-75ºC) şi o pasteurizare înaltă (2-5 minute la 85-90ºC). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii.

12

Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare, iar mecanismul de acţiune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30 minute la 100oC, distruge bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile, dar nu şi sporii bacterieni. Timpul se înregistrează după ce apa a început să fiarbă. Eficienţa acestei metode poate fi crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-2%.

20.Sterilizarea prin caldura uscata – Metode.Parametrii.Aplicatii Sterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor

bacteriene. Amintim câteva dintre variantele tehnice:a1. Sterilizarea prin încălzire la incandescenţă („la roşu”) reprezintă introducerea şi menţinerea

în flacăra becului Bunsen până la înroşire, pe toată lungimea, a obiectului care urmează a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologică (cu buclă sau fir) sau pentru spatulă (Figura nr. 5, Film nr. 2).

Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge

temperatura de incandescenţă. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient de sticlă (tub, eprubetă, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur şi nu reprezintă sterilizare.

a2. Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr. 6). Etuva este o cutie metalică cu pereţi dubli. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui termostat se obţine şi menţine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii în interiorul aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem de ventilaţie (Schema nr. 1).

Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă trebuie să atingă 180ºC, pentru o durată de 1 oră sau 160°C pentru o durată de 2 ore. Pot exista şi alte variante, de exemplu în funcţie de dimensiunea obiectelor de sterilizat.

Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan, pulberi inerte şi termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menţionat faptul că repetarea sterilizării, în timp, conduce la decălirea oţelului) etc.

Nu se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vată, bumbac, fibră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.

a3. Incinerarea reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă (Figura nr. 7). Există anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. În cazul spitalelor, în România au existat astfel de incineratoare în structura unităţii sanitare respective. Odată cu procesul de aderare la Uniunea Europeană şi respectiv necesitatea aplicării unor reguli impuse pentru toate ţările membre, majoritatea incineratoarelor de spital au fost închise. Modul în care s-a realizat în perioada 2003-2004 negocierea privind stoparea activităţii acestor incineratoare nu a ţinut cont de situaţia reală din ţara noastră. În lipsa unui incinerator propriu, unitatea sanitară trebuie să încheie un contract de prestări servicii cu o firmă de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerării materiale de unică folosinţă din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experienţă etc.

21+22+23. Bacteriofagii – Definitie.Structura.Tipuri de interactiuni fag-bacterieBacteriofagii sunt virusuri care parazitează bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7 cu

specificitate pentruE. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperiţi în 1915. Prof. Mihai Ciucă obţine în anul 1921 primele tulpini lizogene. În 1949 se înfiinţează în România un Centru naţional pentru bacteriofagi. Fagii au o structură mai complexă decât cea a virusurilor obişnuite. Se descriu (Figura nr. 14):

13

1. capul fagului are formă de prismă hexagonală bipiramidală. Conţine ADN dublu catenar helicoidal sau ARN înconjurat de capsida formată din capsomere (înveliş proteic); fagii ARN pot avea un număr mic de gene (ex. 3) în timp ce fagii ADN pot avea până la 150 gene;

2. coada fagului are structură proteică, simetrie helicoidală; are rol de adsorbţie, ajutând fagul să penetreze bacteria. Se descriu următoarele formaţiuni:

- cilindrul axial;- teaca cozii;- placa bazală (cu croşetele de fixare);- fibrele cozii (formând un strat în jurul tecii cozii).Toate proteinele fagice pot conduce la apariţia de anticorpi, descoperire utilizată în studierea

înrudirii dintre diferiţi bacteriofagi.Relaţii bacteriofag-bacterieÎntre bacteriofag şi bacteria gazdă se pot stabili două tipuri de relaţii:- de tip litic sau productiv (Figura nr. 15);- de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16).Relaţiile sunt strict specifice şi sunt mediate de receptori.Ciclul litic are mai multe etape şi anume:1. Adsorbţia: Ataşarea este specifică. Există receptori strict specifici la nivelul bacteriofagului, ce

recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este iniţial reversibilă (prin fibrele cozii), apoi ireversibilă (prin croşetele plăcii bazale). Adsorbţia fagică modifică permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene.

2. Penetrarea: Fagul eliberează muramidaza care lizează mureina din peretele bacterian. Teaca cozii se contractă şi antrenează cilindrul axial prin peretele bacterian, ducând apoi la injectarea ADN-ului fagic în citoplasma bacteriană;

3. Multiplicarea: După aproximativ 4-5 minute, funcţia ADN-ului bacterian este blocată şi preluată de ADN-ul fagic ce coordonează sinteza componentelor proprii. Se sintetizează un număr însemnat de proteine virale.

4. Maturarea (ansamblarea) fagului5. Liza bacteriei (ex. datorită sintezei unor enzime asemănătoare lizozimului) şi eliberarea

bacteriofagului matur, virulent.Bacteriile lizosensibile permit adsorbţia, penetrarea şi multiplicarea fagilor virulenţi până la

realizarea lizei celulei bacteriene.Evidenţierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene· în mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunzător duce după câteva zeci de

minute (uneori chiar şi câteva zile) la limpezirea mediului;· pe mediu solid, însămânţat uniform, inocularea fagului litic duce la apariţia unei zone de

liză, clară, bine circumscrisă (spotul de bacteriofagie), metodă utilizată în lizotipie;· dacă se amestecă o suspensie de fagi cu o picătură de cultură (pură) bacteriană, iar tulpina

respectivă are receptori potriviţi bacteriofagilor şi această suspensie se amestecă cu geloză încălzită putem transfera suspensia într-o placă Petri;

· bacteriofagii infectează bacteriile; după circa 30 minute bacteriile sunt lizate şi eliberează fagii; aceştia difuzează prin geloză şi infectează bacteriile situate în apropiere şi ciclul se reia;

· o parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potriviţi) nu sunt infectate şi în timp se multiplică iar cultura bacteriană opacizează mediul; după circa 18-24 de ore putem observa arii cu celule lizate (transparente) pe un fond produs de cultura bacteriană (bacterii nelizate), aceste arii numindu-se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii virulenţi sunt clare, în comparaţie

14

cu plajele mai puţin clare produse de bacteriofagii temperaţi (fagii virulenţi sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua decât în ciclul litic)

Ciclul reductiv (de lizogenizare) are aceleaşi etape, iniţial.După adsorbţie şi penetrare, ADN-ul fagic:· fie se integrează liniar în cromozomul bacteriei gazdă şi se replică sincron cu aceasta,· fie se circularizează şi ataşat de membrana citoplasmatică se replică sincron cu diviziunea

bacteriei.Bacteria a devenit lizogenă, se reproduce şi transmite descendenţilor fagul latent (profag, fag

temperat). În anumite condiţii profagul poate deveni fag virulent. Fagul temperat cel mai bine studiat este bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat (K12).

Proprietăţile bacteriei lizogene:1. este imună faţă de un fag omolog profagului;2. pot apărea fenomene importante din punct de vedere genetic:· transducţia;· conversia genetică (cu producerea de exotoxine de către unele bacterii lizogenizate, cum ar

fi toxina difterică, toxina scarlatinoasă, toxina botulinică de tip C etc);· recombinarea genetică (atunci când o bacterie parazitată de doi fagi diferiţi, dar înrudiţi,

eliberează la sfârşitul ciclului litic pe lângă tipurile parentale şi tipuri de fagi care însumează unele din proprietăţile celor doi fagi parentali) etc.;

· inducţia fagică (sub influenţa unor agenţi inductori, de ex. raze UV, sau spontan, profagul îşi recâştigă virulenţa, devine fag virulent, şi produce liza bacteriei respective).

Bacteriile lizorezistente nu permit infecţia cu un fag fie datorită lipsei receptorilor specifici, fie datorită unei stări de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii virulenţi omologi profagului găzduit.

Fagul defectiv reprezintă profagul care persistă indefinit în stare latentă (nu se reactivează).Aplicaţii practice ale fenomenului de bacteriofagie:· fagii virulenţi sunt un element de echilibru ecologic în mediul natural de viaţă al bacteriilor

(în nişa ecologică respectivă);· fagii temperaţi pot avea un rol deosebit în reasortarea materialului genetic al bacteriilor,

întrucât atunci când se detaşează (inducţie) de cromozomul bacterian pot antrena porţiuni din ADN-ul bacterian;

· fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorită specificităţii relaţiei fag-bacterie);

· anumite mutante ale fagilor se folosesc în ingineria genetică drept vectori ai ADN recombinant (ex. fagii Charon Lambda);

· fagii reprezintă un model pentru studii teoretice şi practice privind virusurile şi oncogeneza, precum şi alte aspecte ale biologiei moleculare;

· s-au evidenţiat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic şi antigenic par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilităţii la un anumit tip fagic) este una dintre cele mai fine metode de diagnostic bacteriologic şi epidemiologic, pentru identificarea lanţurilor de transmisie a germenilor şi pentru determinarea originii unei epidemii.

24.Mutatiile la bacterii – Definitie.Tipuri.ClasificareBacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepţiile prezentate anterior), au un singur

cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesară transferarea de material genetic de la o tulpină („donoare”) la tulpina receptor („acceptoare”). În mod clasic poate

15

avea loc un transfer „pe orizontală” între tulpini care fie fac parte din aceeaşi specie fie fac parte din specii foarte înrudite, chiar dacă genotipic sunt diferite. Relativ recent a fost demonstrată posibilitatea unor schimburi genetice între tulpini din specii diferite (ex. în ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacteriană presupune modificarea la un moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenţilor ei şi pot exista în principiu două variante:

- variabilitatea fenotipică şi- variabilitatea genotipică;Variaţiile fenotipice reprezintă modificări morfologice sau fiziologice de tip adaptativ, care nu se

transmit ereditar. Genomul nu este afectat.Variaţiile genotipice reprezintă modificări definitive ale materialului genetic (cromozomial sau

extracromozomial) care se transmit descendenţilor.Mecanismele variaţiei genotipice sunt reprezentate de:- mutaţie;- transfer genetic urmat de recombinare genetică.MutaţiaMutaţia reprezintă o modificare accidentală în secvenţa nucleotidică a unei gene, ducând la

modificări ale mesajului genetic.Mutaţiile pot apărea la nivelul materialului genetic prin:- substituţii;- inversii;- inserţii;- deleţii.Mutaţia spontanăMutaţiile care apar în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil se

numesc mutaţii spontane.Mutaţia indusăMutaţiile care se produc sub acţiunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaţii ionizante

etc.) sau chimici (de exemplu agenţii alchilanţi), care acţionează ca agenţi mutageni, se numesc mutaţii induse.

Rata mutaţiilor induse este semnificativ mai mare decât rata mutaţiilor spontane.Mutaţia punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur

codon.Mutaţiile extinse reprezintă alterări care depăşesc limitele unui codon, putând afecta secvenţe

mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaţie poligenică).Mutaţiile regresive (retromutaţii) afectează celule mutante, determinând revenirea acestora la

tipul iniţial, restabilind secvenţa nucleotidică originară.Mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a genei, deşi o modificare a secvenţei

bazelor nucleotidice persistă.Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o bacterie

receptor sunt:- transformarea;- transferul mediat de bacteriofagi (transducţia);- conjugarea.TransformareaTransformarea este un transfer genetic realizat atunci când bacteria acceptă ADN liber provenit

de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie să fie „competentă” în a accepta ADN-ul de la bacteria donor.

16

Prima transformare a fost descrisă în 1928 de către Griffith, în experimente referitoare la virulenţa pneumococilor faţă de şoarecele alb.

Transformarea poate avea loc doar atunci când bacteriile intră în faza staţionară a ciclului celular. Pătruns în celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate înlocui (prin recombinare genetică) o secvenţă nucleotidică omologă, bacteria receptoare dobândind un caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice).

Unele bacterii sunt „competente” în mod natural. În cazul bacteriilor care nu sunt „natural competente”, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesară tratarea chimică a acestora, de ex. cu ioni de calciu.

Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin:- transducţie;- conversie lizogenică.Transducţia reprezintă transferul unui fragment genetic (cromozomial sau extracromozomial) de

la o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un fag temperat). Fagul se numeşte transductor. Bacteria receptoare se numeşte transductant.

Transducţia specializată (restrictivă) este caracteristică fagilor transductori care au proprietatea de a transfera numai un număr restrâns de gene bacteriene situate în imediata apropiere a situsului de legare a profagului în cromozomul bacterian.

Transducţia generalizată (nerestrictivă) presupune că teoretic, oricare din genele cromozomului bacterian, indiferent de poziţia lor în genom, pot fi încorporate în mod accidental în particula virală matură pentru a forma un fag transductor, care le poate transmite unor bacterii receptoare. Transducţia generalizată poate fi realizată de un mare număr de fagi neintegraţi în cromozomul bacterian atunci când aceştia intră în ciclul litic.

Conversia lizogenică reprezintă apariţia unui caracter nou la bacteriile care găzduiesc un profag, de exemplu producerea toxinei difterice este realizată numai de către C. diphtheriae purtător al fagului temperat (profagul β care deţine gena tox) iar producerea toxinei scarlatinoase este posibilă numai în cazul în careStreptococcus pyogenes de grup A este lizogenizat. Există şi fagi care sunt integraţi în regiuni care codifică un anumit produs din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integrează într-o genă care codifică leucina).

25.Conjugarea bacterianaConjugarea bacteriană reprezintă un proces de transfer de material genetic (cromozomial sau

extracromozomial) realizat prin intermediul unei legături intercelulare directe. Este condiţionată de prezenţa factorului F în celula donoare.

Receptorii specificiPentru realizarea legăturii intercelulare este necesară existenţa unor „receptori” de suprafaţă

atât la celula donoare, cât şi la celula receptoare. Aceştia vor permite „recunoaşterea reciprocă”.Fiziologia conjugării bacterieneDupă un număr de alipiri întâmplătoare, bacteriile F+ formează cu bacteriile F- „perechi de

recombinare” şi între celulele alăturate se formează un canal de conjugare. Prin canalul de conjugare se realizează transferulunidirecţional al materialului genetic. Fragmentul transferat poate fi apoi integrat parţial sau total în genomul celulei receptoare, ducând la apariţia unor proprietăţi noi ale acesteia, manifeste sau nu.

26.Clasificarea substantelor antimicrobiene dupa mecanismul de actiune.ExempleSubstanţele antiseptice şi dezinfectante se pot clasifica în funcţie de mecanismul de acţiune,

după cum urmează:

17

a). Substanţe care denaturează proteinele (au în general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii şi derivaţii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70º, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor).

b). Substanţe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de potasiu, KMnO7 1‰, util în antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, H2O2, soluţie 3% în apă, utilizat în antiseptizarea plăgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) şi derivaţii lor (hipocloriţi, cloramine, soluţii iodurate etc. Există şi diferite clase de compuşi halogenaţi cu potenţă mai mare, cum ar fi cei care au în componenţa lor radicalul benzil -C6H5. Indiferent de substanţa folosită este necesară realizarea concentraţiei corespunzătoare.

c). Substanţe care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele [sărurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ), sărurile de argint, compuşi de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide], grupările alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O) etc.

d). Substanţe care lezează membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizări limitate datorită proprietăţilor caustice şi toxicităţii sale; este etalonul faţă de care se măsoară activitatea antimicrobiană a antisepticelor şi dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc], detergenţii [anionici (săpunuri, perlan etc), cationici (săruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)].

e). Substanţe care alterează acizii nucleici: coloranţii bazici (violet de genţiană, albastru de metilen, fucsină bazică etc), derivaţii de acridină, de exemplu rivanolul.

Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70º, diferiţi derivaţi halogenaţi, hipermanganatul de potasiu 1‰, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substanţe antiseptice. Dorim să menţionăm şi să subliniem că atât în cazul antisepticelor cât şi în cazul dezinfectantelor este important ca substanţa utilizată să aibă concentraţia corespunzătoare, să fie aplicată pentru o durată de timp corespunzătoare, să se afle întermenul de garanţie. Aceeaşi substanţă chimică (de ex. cloramina) poate intra în categoria antisepticelor sau în categoria dezinfectantelor, în funcţie de concentraţie (concentraţia este mai mare în al doilea caz).

27.Antibiograma difuzimetrica – Principiu.InterpretareAntibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate. Reprezintă metoda de

laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii îmbogăţite, care să permită dezvoltarea optimă a microorganismului pentru care se efectuează testarea (de exemplu pe agar Mueller-Hinton).

Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină bacteriană), chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt:

· Tehnicile calitativeo antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)o antibiograma difuzimetrică comparativăo antibiograma difuzimetrică standardizatăo antibiogramele difuzimetrice rapide· Tehnicile cantitativeo metoda diluţiilor în mediu lichido metoda diluţiilor în agaro metoda microdiluţiilor în agaro metoda „punctelor de ruptură”

18

o testul „E”o metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.Antibiograma difuzimetrică comunăDin punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar Mueller-

Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu prin „inundarea” plăcii urmată de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă cu capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică microcomprimatele în care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată. Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau cu ajutorul unui aplicator „automat” (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm).

Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul unei pense le presăm uşor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm plăcile peste noapte în termostat, la 28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de multiplicare a microorganismului testat.

Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiţie în care coloniile microbiene nu se dezvoltă (Figura nr. 3).

Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent (Figura nr. 4).

Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor foarte active, pentru că tehnica nu este standardizată.

Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş)Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de referinţă, din

aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram-pozitivi putem alege pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. Tulpina de referinţă are o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm.

Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru microorganismul de referinţă şi pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprimă cu termenii: „sensibil”, „intermediar”, „rezistent”, în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie a multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi antibiotic (jumătăţile de cerc se examinează comparativ). În cazul în care cunoaştem CMI (concentraţia minimă inhibitorie) a microorganismului de referinţă, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru microorganismul testat.

Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma unui pătrat („împărţită” în 3 zone egale marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru care dorim să realizăm testarea. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă la apariţia după incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente. Plasăm microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Incubăm peste noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi să interpretăm rezultatele. (Figura nr. 5)

Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer, NCCLS)Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar este

standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, care permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite (Film nr. 1).

19

Elementele necesare standardizării sunt:· mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare nutritivă

corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)o există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor microorganisme

(ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci când este testată sensibilitatea la aminoglicozide);

o se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);o există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor microorganisme

pretenţioase;o grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);· inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să aibă o

turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 108 unităţi formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;

· timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de 2-3 plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;

· concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea microcomprimatelor (6 mm diametru);

· alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;· păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de

polietilenă, la +4°C);· utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;· interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară

rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de referinţă).Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace ale

antibioticului la nivelul focarului infecţios.

28.Definiti:CMI,CMAcest tip de metodă oferă informaţii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate, faţă de

microorganismul testat. CMI = concentraţia minimă inhibitorie, reprezintă cea mai mică concentraţie de agent antimicrobian, exprimată în micrograme/ml, care mai exercită o acţiune bacteriostatică asupra germenului testat.

Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu bulion Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la 16 micrograme/ml şi până la 0,125 micrograme/ml, în total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor, fără antibiotic (cantitatea finală va fi de 1 ml în fiecare tub). Preparăm un inocul standardizat turbidimetric şi în condiţii aseptice inoculăm toate cele 10 tuburi cu câte 1 ml de inocul. Agităm pentru a omogeniza. Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37°C iar al doilea tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă la temperatura frigiderului (Figura nr. 6). Pentru controlul de calitate utilizăm şi un şir de tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de referinţă corespunzătoare. În ziua următoare citim şi interpretăm rezultatele.

Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egală cu cantitatea de mediu, concentraţia finală de antibiotic se va înjumătăţi (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost de 16 mg/ml, diluţia finală va fi 8 mg/ml etc.). În tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu fie prezentă creşterea, în tubul martor menţinut la 35-37°C creşterea trebuie să fie prezentă (Figura nr. 7).

În tuburile inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatul corespunzător datelor pe care le cunoaştem privitor la respectiva tulpină.

20

În tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea microorganismului corespunde CMI. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în funcţie de specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este £ 3 mg/ml vor fi eficient inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.

CMI nu are aceeaşi valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la amoxicilină în cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus aureus, 0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentru Haemophilus influenzae, 2 mg/ml pentru E. coli, 16 mg ml (şi practic aceasta semnifică „rezistenţă in vivo”) pentru Bacteroides fragilis iar în cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa sauChlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente.

Este necesară o placă Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi împărţită în sectoare, numărul de sectoare fiind corespunzător numărului de tuburi fără creştere microbiană. Însămânţăm în condiţii aseptice din fiecare tub fără creştere microbiană, fiecare în sectorul de placă corespunzător (Figura nr. 9). Incubăm pentru 16-18 ore la 35-37°C. CMB va corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus microorganismele însămânţate (sectoare de placă fără apariţia culturii) (Figura nr. 10). Se consideră că antibioticul va fi eficient in vivo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de antibiotic care să depăşească de 4-8 ori CMB.

Determinarea CMI şi CMB este extrem de importantă pentru aprecierea eficacităţii antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infecţiilor severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc), precum şi la imunodeprimaţi, efectuarea acestei metode este indispensabilă.

29.Definiti notiunile de:simbioza,comensalism,parazitismSimbioza: asocierea de vieţuitoare din specii diferite care îşi duc viaţa în comun. Orice organism

viu poate deveni habitat pentru alte forme de viaţă mai mici.Cu o parte din microorganismele întâlnite organismul stabileşte relaţii de simbioză, convieţuirea

fiind folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la care participă unii coliformi intestinali).

Comensalismul: adăpost şi nutrienţi oferiţi de gazdă.Foarte multe din microorganismele care alcătuiesc microflora normală se află în relaţii de

comensualism cu organismul, germenii depinzând nutriţional de gazdă, căreia nu îi creează prejudicii. Această convieţuire exprimă însă un echilibru instabil, care poate fi uşor tulburat. Diferiţi factori (ai gazdei, din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor) pot modifica aceste relaţii, astfel încât unele microorganisme din flora normală pot manifesta aspecte patogene - este vorba de microorganismele condiţionat patogene.

Parazitismul: beneficiu unilateral al microorganismului în defavoarea gazdei.Relaţia de parazitism tipic apare însă doar atunci când microorganismele se dezvoltă în

detrimentul gazdei, cu manifestări clinice mai mult sau mai puţin evidente.Astfel, în cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta decât în

organismul gazdei (de exemplu Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae etc). Alte bacterii sunt facultativ parazite, putând trăi şi libere în natură, dar o dată pătrunse în organism stabilesc cu acesta relaţii de parazitism (de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).

21

30. Definiti notiunile de:contaminare,colonizare,infectieContaminare, este un termen utilizat în instituţiile sanitare (deosebit de contaminarea

radioactivă) care se referă, în general, la contactul cu microorganisme condiţionat patogene sau patogene (capabile să producă infecţii sauboli infecţioase ).

infectie - Invazie a unui organism viu de catre microorganisme patogene care actioneaza prin multiplicarea lor (virulenta) si eventual prin secretarea de toxine. Colonizarea reprezinta procesul de populare a unei anumite zone din organism de catre anumite microorganisme patogene. Rezultatul colonizarii bacteriene este infectia.

31.Definiti notiunile de :exotoxina,endotoxina,anatoxina,antitoxina.Exemple

Germenii se multiplică la poarta de intrare şi elaborează exotoxine care produc alterări celulare şi distrucţii tisulare la distanţă, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote („toxikon” era otrava în care erau înmuiate săgeţile luptătorilor greci).

Exotoxinele

Exotoxinele sunt elaborate în general de microbi Gram-pozitivi lizogenizaţi (de exemplu bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar şi de bacili Gram-negativi, prin mecanism cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli).

Au structură proteică, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar legării de receptorii celulei gazdă şi internalizării ulterioare a porţiuni enzimatice A (active). Exotoxina nu îşi exercită efectele toxice decât după ce porţiunea A este eliberată din structura iniţială. Sunt secretate în timpul vieţii germenilor. Sunt difuzibile la distanţă. Toxicitatea lor este foarte mare, doza letală fiind de circa 0,1 µg/kg corp (până la 1 ng/kg corp în cazul toxinei botulinice).

Au afinitate diferită în funcţie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard, SNC, rinichi în cazul bacilului difteric). Manifestările clinice apar după o perioadă de latenţă (când toxina este deja fixată pe celulele ţintă).

Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecţii şi reprezintă urgenţe medicale, toxina putând fi neutralizată numai dacă este liberă în circulaţie.

Au putere antigenică mare, faţă de ele apărând anticorpi antitoxină.

Antitoxinele

Având structură proteică, exotoxinele sunt imunogene şi determină apariţia de anticorpi specifici (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxică prin cuplare specifică cu toxina. Se pot obţine astfel seruri imune utile în seroterapia specifică. De regulă aceste seruri sunt preparate pe cal şi sunt utile în neutralizarea exotoxinelor (ex. în tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului).

Administrarea antitoxinelor trebuie făcută cu precauţie datorită faptului că anticorpii preparaţi pe cal reprezintă în acelaşi timp şi antigene pentru gazda umană, dar în acelaşi timp cât mai curând posibil.

22

Tratamentul acestor entităţi clinice este complex şi nu reprezintă subiectul acestui manual. Administrarea antitoxinelor trebuie făcută după o testare a unei eventuale hipersensibilităţi şi în cazul că aceasta există se recurge la desensibilizare şi abia ulterior la seroterapie (administrarea de antitoxină). O alternativă ar fi administrarea de imunoglobuline umane specifice, dacă acestea sunt disponibile.

Anatoxinele

Exotoxinele pot fi detoxifiate într-un anumit interval de timp sub acţiunea conjugată a temperaturii şi formolului. Prin acest procedeu îşi pierd puterea toxică, dar îşi menţin puterea imunogenă şi devin anatoxine. Anatoxinele se utilizează în profilaxia bolilor produse de germenii respectivi (în cadrul vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum şi pentru hiperimunizarea animalelor în scopul obţinerii de seruri antitoxice (antidifteric, antitetanic, antibotulinic etc).

Endotoxinele

Endotoxinele au fost evidenţiate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei externe. Sunt elaborate de aceştia şi apoi incluse în peretele bacterian, eliberându-se în urma distrugerii germenilor. Au structură lipopolizaharidică (LPZ sau LOZ), în constituţia lor intrând acizi graşi, un lipid A şi lanţuri de polizaharide.

Au efecte toxice la nivelul celulelor majorităţii mamiferelor; aceste efecte sunt similare indiferent de specia bacteriană care le eliberează. Toxicitatea lor este ceva mai redusă (în comparaţie cu exotoxinele), dar pot acţiona la mai multe nivele inducând apariţia febrei, leucopeniei, hiperpermeabilităţii vasculare, hipotensiunii arteriale până la colaps, sindromului de coagulare intravasculară diseminată etc. Sunt implicate între altele în apariţia şocului endotoxic (se eliberează o cantitate de endotoxină proporţională cu numărul germenilor distruşi). Studiile arată că mortalitatea în şocul endotoxic este în relaţie destul de directă cu cantitatea de endotoxină / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se identifică 100 unităţi endotoxină / ml de plasmă.

Aşa cum am menţionat în capitolul privind structura bacteriană, componenta toxică este reprezentată de lipidul A; totuşi, şi polizaharidul O (structură antigenică) contribuie la patogenitate – s-a dovedit că bacteriile de la care s-a extras polizaharidul O sunt mai uşor distruse prin mecanisme care implică sistemul complement. LPZ aflat în circulaţie se cuplează cu proteine plasmatice (LPS-binding plasma proteins) şi apoi este recunoscut prin intermediul receptorilor CD14 de către monocite şi macrofage. Se activează răspunsul inflamator, coagularea intravasculară, apariţia de hemoragii şi în final poate rezulta şocul. Sunt implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 şi TNF-α care la rândul lor stimulează „cutia Pandorei” şi respectiv producţia de leucotriene şi prostaglandine (cu efect de creştere a fenomenelor inflamaţiei). Sunt activate atât sistemele de coagulare cât şi sistemul complement iar cascadele de reacţii care apar sunt rareori reversibile în urma tratamentului.

Puterea antigenică şi imunogenă este mai redusă faţă de exotoxine. LPZ în calitate de mitogen stimulează o activare policlonală a LB, cu secreţia de IgG şi IgM.

În afara LPZ sau LOZ, mai sunt şi alte endotoxine, prezente la bacteriile Gram-pozitive:

- delta endotoxina prezentă la Bacillus thuringiensis, toxină care nu afectează omul, deoarece acesta nu prezintă enzime şi receptori care să o proceseze;

- Listeria monocytogenes produce o substanţă “endotoxin-like” etc.

23

32.Inflamatia – Definitie.Factori ce o determina.Etape

Inflamaţia este un proces fiziopatologic complex ce include: fenomene alterative, fenomene de tip reactiv, vasculo-exudative şi proliferative şi fenomene reparatorii. Inflamaţia are drept principal scop limitarea acţiunii şi eventual neutralizarea „agentului agresor” (indiferent de natura acestuia). Cu alte cuvinte, discutăm despre fenomenul inflamator şi în cadrul unor „agresiuni” microbiene (bacteriene, fungice, parazitare, virale, prionice), dar inflamaţia reprezintă un concept mult mai complex (apare în mult mai multe circumstanţe, decât în cele infecţioase)..

Inflamaţia poate interesa ţesuturi, organe, sisteme sau chiar întregul organism şi are drept semne / simptome clasice, următoarele: tumor (umflare, edem), rubor (eritem, înroşire locală), calor(temperatură crescută în zona în care evoluează fenomenul inflamator), dolor(durere), însoţite sau nu de „functio laesa” (tulburări funcţionale mai ample sau mai puţin ample, mergând până la impotenţă funcţională, de ex. imposibilitatea deplasării membrului inferior datorită unei inflamaţii la articulaţia genunchiului, în cadrul unei infecţii diseminate cu Neisseria gonorrhoeae).

Există o mare diversitate de „agenţi determinanţi” ai unui proces inflamator, printre aceştia putând fi enumeraţi:- diferiţii agenţi fizici (radiaţii, frig, căldură, curent electric, traumatisme etc.);- microorganismele (prioni, virusuri, bacterii, fungi, paraziţi);- agenţii chimici exogeni, (ex. ulei de croton, terebentină, caolin, dextran etc) şi / sau -endogene (uree, acizi biliari etc.), care produc leziuni la nivelul sediului eliminării lor din organism pe alte căi decât cele fiziologice (de exemplu în situaţia apariţiei unui reflux bilio-gastric).În rezumat, inflamaţia reprezintă reactivitatea diferitelor structuri ale organismului, structuri care aparţin diferitelor reţele informaţionale (de exemplu reţeaua imună ce include organe ale sistemului imun, celule ale sistemului imun, substanţe sintetizate şi eliberate în cursul reacţiilor imune, inter-relaţii mediate celular sau umoral etc) ce declanşează diferite tipuri de răspunsuri care urmăresc, cel puţin în stadiile iniţiale, să realizeze o reechilibrare şi „aducere la normal”, la situaţia anterioară intrării în contact cu „agentul agresor”.

Salmonella enteritidis serotipul typhimurium produce inflamaţii proliferative la nivelul sistemului limfatic şi respectiv inflamaţii exsudative în parenchimul pulmonar. Mycobacterium tuberculosis, agentul etiologic al tuberculozei, produce inflamaţii alterative (la nivel pulmonar), inflamaţii exsudative (la nivel pleural) sau inflamaţii proliferative (la nivel dermic).

Din punct de vedere didactic, etapele inflamaţiei sunt următoarele:1.Etapa de declanşare, în care „agentul determinant” produce modificări la nivelul ţesutului interstiţial şi în celulele parenchimatoase. Rezultatul detectabil prin metode de laborator este eliberarea unor factori chemotactici, a unor proteaze şi kinaze.Factorii eliberaţi conduc la apariţia răspunsului inflamator acut, respectiv:- vasodilataţie capilară (eritem, înroşire),- exsudare de proteine plasmatice (edem, umflare) şi- acumulare de leucocite PMN.Principalele proteine care apar în această etapă sunt componentele sistemului complement, dar şi diferite citokine. Elementele celulare importante în realizarea procesului inflamator sunt

24

reprezentate de sistemul monocit-macrofag (sistemul mononuclear fagocitar), colagenul vascular şi celulele endoteliale. 2.Etapa efectoare, care la rândul ei se subîmparte în trei subetape:A) Subetapa moleculară, în care se activează:- cascada complementului;- sistemul de coagulare-fibrinoliză;- diferitele căi de metabolizare ale acidului arahidonic (care provine din peretele bacterian în urma scindării date de fosfolipază), respectiv

B) Subetapa vasculară, în care au loc modificări ale calibrului vaselor mici, ale vitezei de circulaţie a sângelui, ale permeabilităţii vaselor mici din aria tisulară lezată. Iniţial se produce vasoconstricţie, în decurs de secunde / minute (are loc un aflux masiv de celule sanguine proinflamatorii - neutrofile, monocite, eozinofile - sub acţiunea unor mediatori solubili eliberaţi din zona tisulară afectată, care produc două categorii de efecte:a) vasculare (dilataţie arteriolocapilară cu creşterea numărului de capilare active, hiperemie, stimularea expresiei pe celulele endoteliale din zonă a unor receptori de adeziune intercelulară astfel încât celulele sangiune recrutate vor adera la endoteliul vascular prin cuplaj receptorial şi în final o fază de stază vasculară pasivă, cu hipoxie şi creşterea permeabilităţii vaselor mici) şib) chemotactice (celulele proinflamatorii sunt atrase către ţesutul lezionat şi activate metabolic)..

C) Subetapa exsudativă, în care se formează exsudatul inflamator (plasma exsudată, bogată în proteine şi LDH) la care se adaugă elementele figurate extravazate, elementele celulare mobilizate local şi produşi rezultaţi din diferite modificări locale. Prin constituenţii săi celulari şi moleculari, exsudatul asanează focarul inflamator şi tinde să blocheze procesul infecţios la poarta de intrare, constituind bariera fibrino-imuno-leucocitară.Consecinţele activării mecanismelor implicate în procesul inflamatorÎn funcţie de cascadele activate poate rezulta un anumit tip de inflamaţie. Putem lua în discuţie diferitele forme clinice evolutive (acută, subacută, cronică) precum şi formele anatomoclinice.Evoluţia spre cronicizare se datorează agenţilor inflamatori care au proprietatea de a stimula în special sistemul efector timodependent, autoantigenelor sau persistenţei stimulului inflamator.Inflamaţia cronică este din ce în ce mai mult privită nu numai ca o consecinţă a unui risc infecţios continuu, dar şi ca o parte integrantă a multor boli neinfecţioase, cum ar fi disfuncţiile autoimune, diabetul sau bolile cardiovasculare etc.Astfel, nu este surprinzător că unele sisteme hormonale, cum ar fi sistemul renină-angiotensină (SRA), care a fost descris prima dată în contextul bolilor cardiovasculare, s-a dovedit a fi factorul major de reglare a răspunsului inflamator. (4) (Figura nr. 8).Evoluţia spre vindecare presupune:- asanarea focarului inflamator (începe concomitent cu constituirea barierei fibrino-leucocitare şi cu îndepărtarea resturilor celulare şi a eventualelor microorganisme care sunt „agenţi determinanţi”); devine maximă după acumularea de leucocite PMN şi macrofage.- vindecarea propriu-zisă începe relativ rapid în cursul procesului inflamator; vindecarea începe aproape concomitent cu fenomenele distructive, pe care tinde să le înlocuiască pentru a conduce la una dintre variantele evolutive menţionate anterior..

25

33.Organele centrale si periferice ale sistemului imun

Organele limfoide primare

organele limfoide primare, numite şi centrale, sunt situate în afara căilor de acces şi circulaţie antigenică. În aceste organe diferenţierea apare precoce, în viaţa embrionară, înaintea celor secundare. Proliferarea limfocitară este intensă şi independentă de stimularea antigenică.

Organele limfoide primare au următoarele roluri:

· permit multiplicarea limfocitelor T (timodependente) şi B (dependente de măduva roşie hematogenă / bone marrow - la mamifere).

· găzduiesc primele stadii de diferenţiere, până la limfocitele T sau B mature, apte să recunoască structurile antigenice şi să fie stimulate de antigene.

· efectorii imuni „învaţă” la acest nivel să recunoască şi să tolereze constituenţii propriului organism (auto-recunoaştere şi toleranţă faţă de „self”).

Un limfocit T sau B matur care a părăsit timusul, respectiv măduva osoasă hematogenă, nu mai revine niciodată la acest nivel, cele două organe fiind în afara căilor de recirculare a limfocitelor antigen-specifice din organele limfoide secundare.

Timusul

Timusul se formează în perioada de dezvoltare a celui de-al treilea arc branchial.

Încă din stadiul de dezvoltare fetală, timusul este prezent în cavitatea toracică, fiind dispus retrosternal, ca un organ bine diferenţiat, deja funcţional. Agenezia acestei regiuni duce la apariţia unui deficit congenital rar, sindromul Di George(aplazia congenitală timică sau boala „pipernicirii”), caracterizat prin tulburări ale imunităţii celulare şi implicit prin susceptibilitate crescută la infecţii (respiratorii, digestive şi cutanate, produse în special de fungi şi virusuri şi mai rar de către bacterii), tetanie neonatală (datorată absenţei paratiroidelor) şi malformaţii congenitale diverse (arc aortic dublu, tetralogie Fallot, micrognatism, atrezie de esofag etc).

Timusul este un organ situat în mediastinul anterior şi superior, retrosternal, format din doi lobi uniţi printr-un istm median. Fiecare lob este format din lobuli compartimentaţi de septuri derivate din capsula organului. Lobulul timic este alcătuit din 2 zone: corticală (la exterior) şi medulară (la interior). Iniţial se dezvoltă zona corticală.

Greutatea sa variază cu vârsta (este bine dezvoltat la făt, greutatea creşte până la pubertate - dezvoltarea maximă se realizează la vârsta de 10-12 ani, apoi suferă o involuţie lentă, fără să dispară total).

În zona corticală, trama de-a lungul căreia se plasează protimocitele (sosite în timus de la MOH) cuprinde celule epiteliale, celule dendritice intratimice şi macrofage. Limfocitele mici, denumite şi timocite corticale, sunt numeroase, grupate în grămezi, în jurul celulelor epiteliale. Ele se divid activ, dar nu se structurează în noduli limfatici.

În zona medulară, celulele epiteliale sunt izolate sau grupate formând corpusculii lui Hassal (formaţiuni de celule epiteliale care degenerează, fiind mereu înlocuite cu alte celule similare),

26

caracteristici timusului. Se consideră că au rol fagocitar. Cresc atât numeric cât şi ca dimensiuni, probabil datorită contactului cu microorganismele din flora normală, dar şi contaminării cu alte microorganisme. Medulara mai conţine şi celule dendritice, macrofage şi timocite. Timocitele medulare sunt mult mai dispersate decât cele din zona corticală. La acest nivel are loc selecţia negativă a timocitelor.

Timusul are capacitatea de a elimina prin selecţie pozitivă celulele care, odată eliberate în circulaţie, nu ar fi putut produce efectul scontat, deoarece nu ar fi recunoscut structurile non-self şi prin selecţie negativă celulele care ar fi dat reacţii autoimune.

Populaţia limfocitară aflată în proces de multiplicare în timus, este foarte sensibilă la acţiunea corticosteroizilor, 95% din limfocite fiind distruse. Restul de 5% din limfocitele cortico-rezistente sunt cele care, la finalul maturaţiei, trec în circulaţie. Se pare că iniţial are loc distrugerea a 80% dintre limfocite, 20% ajung la nivel medular şi dintre acestea supravieţuiesc cele 1-5% limfocite cortico-rezistente. Timocitele ajunse în zona medulară sunt mai rezistente la acţiunea cortizolului decât cele din zona corticală. (Figura nr. 1)

Rolul timusului se manifestă local şi la distanţă:

· rolul local, constă în transformarea limfocitelor nediferenţiate în limfocite T mature, cu achiziţia de receptori pentru antigene . Procesul de multiplicare şi diferenţiere are loc, în principal, în regiunea corticală. Celulele achiziţionează progresiv markeri ai limfocitului T adult. Urmează o dublă selecţie, pozitivă şi negativă. În selecţia pozitivă, timocitele care recunosc antigenele străine fixate pe moleculele MHC pot prolifera în timp ce acele limfocite care nu şi-au dezvoltat receptori pentru antigene sunt distruse. În selecţia negativă, timocitele care recunosc structurile self sunt distruse, eliminându-se astfel timocitele puternic autoreactive, care ar conduce la apariţia unor fenomene autoimune imediat după naştere. În timus are loc multiplicarea, diferenţierea şi selecţia limfocitelor T. Tot la nivel timic are loc producerea celulelor de control, cu rol în prevenirea bolilor autoimune (experienţele realizate prin înlocuirea limfocitelor proprii cu limfocite de la persoane sănătoase a dus, pentru un timp, la dispariţia semnelor de boală, dovedind astfel existenţa acestor celule timice).

· rolul la distanţă se realizează prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina, timopoietinele, timozinele, factorul umoral timic etc). Aceşti factori au funcţii diverse, unii dintre ei influenţând diferenţierea limfocitelor T în ariile timodependente din organele limfoide periferice. Acţionează atât la nivelul timusului cât şi la distanţă.

Măduva osoasă hematogenă la mamifere

Transformarea celulei stem în limfocit B matur are loc în măduva osoasă hematogenă (bone marrow, LB). La copii, rolul de organ limfoid primar este asigurat atât de măduva din oasele late cât şi din oasele lungi; ulterior, măduva de la nivelul oaselor lungi este înlocuită cu ţesut adipos, care mai târziu se fibrozează, iar măduva activă rămâne la nivelul oaselor late (stern, coxal, coaste, vertebre). Cazurile cu deficit imunitar selectiv pentru limfocite B (ex. maladia Bruton), confirmă existenţa unei autonomii a acestei populaţii. Transplantul de măduvă osoasă hematogenărestaurează imunitatea umorală, ducând la dispariţia perturbărilor.

Dintre funcţiile măduvei osoase hematogenă în imunitate amintim:

1. menţinerea unui procent de celule stem cu diferenţiere spre linia limfocitară şi primele stadii ale seriei T şi B;

2. maturarea şi diferenţierea completă a limfocitelor B în celule B mature, apte să colonizeze organele limfoide secundare.

27

Dezvoltarea organelor limfoide secundare, numite şi periferice sau efectoare, este tardivă faţă de cea a organelor limfoide primare, atingând dezvoltarea deplină numai după stimularea antigenică. Amintim ca exemple de organe limfoide secundare: ganglionii limfatici, splina şi organele limfoide ataşate sistemului digestiv (apendice, amigdale, plăci Peyer) etc. La nivelul acestor organe se cantonează limfocitele T provenite din timus şi limfocitele B provenite din măduva osoasă hematogenă, migrate pe calea torentului circulator. În organele limfoide secundare, aceste celule se vor activa în urma contactului cu antigenele.

În anumite zone ale organelor limfoide secundare, precum cele din ganglionii limfatici sau din splină, se găsesc grupuri de celule, constituite în special din limfocite B, denumite foliculi sau noduli limfatici. Înaintea stimulării antigenice, aceşti foliculi primari sunt în repaus, cu limfocite mici apropiate unele de altele, determinând un aspect dens, caracteristic. Aceste limfocite mature sunt denumite „naive”, deoarece nu au avut contact cu antigenul. După circa 3-6 zile de la stimularea antigenică, foliculii primari se transformă în foliculi secundari, cu un centru germinativ clar, înconjurat de o zonă mai întunecată. În jurul foliculului există o zonă marginală puţin vizibilă, constituită din limfocite B cu memorie. Foliculul secundar persistă câteva săptămâni după care redevine folicul primar.

Organele limfoide secundare cuprind următoarele grupe:

Ganglionii limfatici

Ganglionii limfatici (nodulii limfatici) reprezintă structuri imune, organizate, situate la „intersecţiile” traseelor limfatice. Au următoarele roluri:

· colectează structurile antigenice care traversează teritoriul vaselor limfatice aferente (libere sau captate de macrofage şi/sau de celulele dendritice);

· induc un răspuns imun faţă de antigenele de tip celular, în regiunea paracorticală (dând naştere la limfocite T specifice) sau faţă de antigene de tip umoral, în foliculii limfatici cu limfocite B active, maturate în măduva osoasă hematogenă şi

· stochează informaţiile imune datorită limfocitelor cu memorie dar au rol şi în diseminarea răspunsului imun prin circulaţia limfocitelor pe calea traseelor limfatice eferente, către torentul circulator şi ulterior spre alte teritorii ganglionare, splenice, digestive sau respiratorii.

În secţiune anatomo-patologică transversală remarcăm la exterior o zonă corticală (cuprinde în special limfocite B, „instruite” la nivel medular, aglomerate sub formă de noduli limfatici. În mijlocul nodulilor se află centrii germinativi. Foliculii cresc mult în dimensiuni după infecţie, iar ganglionii limfatici devin palpabili şi dureroşi.

Sub zona corticală se află zona paracorticală (cuprinde în special limfocite T). În mijloc se află zona medulară, în care se găsesc atât limfocite B cât şi limfocite T. În ganglionii limfatici se mai găsesc macrofage, celule dendritice etc. (Figura nr. 2)

Splina

Splina este cel mai mare organ limfoid secundar, având însă şi alte funcţii:

· joacă rolul unui „filtru” care în mod nespecific îndepărtează/elimină complexele antigen-anticorp circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex. cu Plasmodium spp., Babesia microti);

28

· are o eficienţă remarcabilă în îndepărtarea/eliminarea microorganismelor slab opsonizate precum şi celor capsulate (ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Capnocytophaga spp.);

· eliminarea hematiilor degradate, îmbătrânite;

· reglarea volumului sângelui etc.

Pe secţiune, splina are o culoare roşie, cu formaţiuni albe diseminate, numite corpusculii Malpighi (foliculi splenici).

Splina este compusă din două tipuri de ţesuturi: pulpa roşie implicată în distrugerea hematiilor şi pulpa albă, corespunzătoare ţesutului limfoid. Aceasta din urmă este organizată sub forma unor grupări de limfocite T dispuse în imediata vecinătate a arteriolelor (manşoane de limfocite T - teaca limfatică periarterială), iar spre periferia acestora se găsesc cordoane de limfocite B (zona marginală). Se consideră că zona bogată în limfocite T este zona timo-dependentă, în timp ce zona cu limfocite B este zona medulo-dependentă.

Vascularizaţia splinei are o serie de particularităţi. Artera splenică intră prin hilul splenic iar ramificaţiile sale, arterele trabeculare, urmează cloazoanele conjunctive. Din aceste artere se nasc ramificaţii, arterele centrale înconjurate de manşoane de limfocite T, vase care asigură irigaţia foliculilor limfatici şi artere penicilate care intră direct în contact cu sinusurile venoase ale pulpei roşii. Din arteriole se nasc capilarele, apoi venulele postcapilare situate în zona sinusului marginal.

la nivelul zonei marginale are loc captarea antigenelor de către celulele reticulare. După 24 de ore, antigenul se regăseşte la nivelul centrului germinativ al foliculului sau în zona timo-dependentă.

La periferia foliculilor splenici se găsesc plasmocite. La acest nivel are loc sinteză de anticorpi (în special după stimuli antigenici „solubili”, veniţi pe calea torentului circulator). După sinteză, moleculele de anticorpi sunt antrenate sanguin şi pot ajunge în tot organismul. Splina reprezintă un organ în care are loc sinteza anticorpilor de tip IgM şi diferenţierea spre LB cu memorie în cadrul RI primar.

Splina are şi rol în sinteza unei enzime care desprinde tuftsina (tetrapeptid rezultat din clivarea enzimatică a porţiunii Fc din molecula de IgG) de pe molecula de IgG (tuftsina la rândul ei are rol în creşterea funcţiei fagocitare a PMN şi în chemotactism).

Hipofuncţia splenică şi în special splenectomia favorizează apariţia unor infecţii grave, inclusiv sepsis, cu microorganisme capsulate şi microorganisme care parazitează eritrocitele. Este necesară aplicarea unei strategii de prevenire a infecţiilor, incluzând vaccinarea şi uneori profilaxia cu antibiotice şi chimioterapice.

Sistemul limfoid asociat mucoaselor (MALT - mucous associated lymphoid tissue)

Căile respiratorii, tractul digestiv şi cel uro-genital sunt înconjurate pe toată lungimea lor de ţesut limfoid difuz (sau nodular), bogat în limfocite B şi plasmocite care secretă sIgA. Datorită particularităţilor funcţionale, MALT se subdivide în:

· Sistemul imunitar nazo-faringian (NALT - nasopharynx associated lymphoid tissue) reprezentat de inelul lui Waldeyer cu diferitele amigdale (palatine, faringiană, linguale) şi structuri adenoide. Amigdalele sunt constituite din foliculi limfoizi agregaţi şi ţesut limfoid difuz în strânsă asociere cu epiteliul faringian. Amigdalele sunt lipsite de vase limfatice, la fel ca şi splina. Amigdalele au un rol protector important în regiunea esofagiană, faringiană şi a arborelui traheobronşic, constituind un prim obstacol împotriva infecţiilor. Cu toate că după amigdalectomie nu rezultă infecţii severe, decizia privind această operaţie trebuie luată numai după o analiză critică, punând în

29

balanţă atât beneficiile cât şi posibilele urmări negative. Structurile adenoide se inflamează frecvent în timpul copilăriei (după diferitele şi frecventele infecţii respiratorii) şi deseori, crescând în dimensiuni, trebuie extirpate;

· Sistemul imunitar asociat tubului digestiv (GALT - gut associated lymphoid tissue) cuprinde plăcile Peyer şi formaţiunile limfoide ale apendicelui (secretă IgA), limfocitele intra-epiteliale şi limfocitele sub-epiteliale. Plăcile Peyer reprezintă aglomerări de celule limfoide (la nivelul jejunului, duodenului şi ileonului). După infecţii bacteriene se măresc şi se pot uni în adevărate „cordoane” limfoide. Nu au vase limfatice proprii;

· Sistemul imunitar asociat arborelui bronşic (BALT - bronchus associated lymphoid tissue);

· Sistemul imunitar asociat căilor uro-genitale, prezent în special la nivelul vaginului;

· Sistemul imunitar asociat glandelor mamare (mammary associated lymphoid tissue).

Laptele matern conţine IgA secretorie (sIgA) cu rol protector pentru noul născut faţă de infecţiile digestive. IgA nu poate trece prin bariera hemato-placentară, dar sIgA poate fi primit în timpul alăptării, asigurând protecţia nou-născutului şi sugarului faţă de o serie de patogeni, în primele luni de viaţă.

În organele limfoide secundare, distribuţia limfocitelor şi a celorlalte celule imune este controlată de citokine şi chemokine. Membrii familiei TNF (tumour necrosis factors) (citokine implicate în reacţii inflamatorii) au un rol deosebit de important în dezvoltarea normală a organelor limfoide. Celulele imune au receptori pentru aceşti mediatori, acest lucru fiind demonstrat pe cobai la care s-au distrus o serie de receptori pentru a se pune în evidenţă care este rolul lor.

Molecula MIP-3β face parte din categoria chemokinelor pentru care limfocitele T prezintă receptori. Datorită acestei substanţe, limfocitele T se localizează cu stricteţe în zonele timodependente. Receptorul pentru MIP-3β se numeşte CCR7, iar la cobaii la care receptorii CCR7 au fost distruşi s-a observat absenţa marcată a zonelor timodependente şi un răspuns imun primar extrem de slab. Celulele dendritice interdigitate produc chemokina MIP-3β şi pentru că sunt prezente în zonele timodependente, atrag acolo limfocite T mature. Receptorul CCR7 este prezent în proporţie mică şi la nivelul limfocitelor B, lucru care explică migrarea acestora prin zonele timodependente către foliculii limfatici.

34. Sistemul complement

Complementul, un complex multienzimatic format din circa 30 de componente, reprezintă unul dintre principalii constituenţi ai apărării naturale, ai imunităţii umorale şi respectiv un element important al reacţiei imune survenite ca urmare a formării complexelor antigen-anticorp (are rol esenţial în răspunsul inflamator).

Sistemul complement are o serie de funcţii importante: apărarea nespecifică împotriva infecţiei (liza virusurilor, liza bacteriilor, liza celulelor străine) eliminarea complexelor imune şi a celulelor apoptotice; reglarea fiziologică a RI, dar participă şi la creşterea permeabilităţii capilarelor, stimularea contractilităţii musculaturii netede etc. În cele mai multe împrejurări, sistemul complement are efecte benefice; totuşi sunt de menţionat şi unele efecte negative (ex. participă la reacţiile anafilactice, este implicat în hipersensibilitatea citolitică-citotoxică etc).Componentele C' se găsesc în ser, în stare inactivă. Pentru a declanşa activarea lor este necesar un stimul. Pentru calea clasică, punctul de pornire este reprezentat de către complexele antigen-anticorp unde anticorpii sunt de tip IgM sau de tip IgG

30

35.Raspunsul imun I si II – Caractere principale

Răspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc după introducerea unui Ag, şi anume:

· activarea limfocitelor,

· eliberarea a diverse molecule,

· multiplicarea celulelor specifice,

· producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili să se fixeze pe Ag şi să participe la

· eliminarea acestuia (direct sau indirect).

După acest prim contact (ca şi în cursul imunizării consecutive), sistemul imun produce limfocitele T şi B dememorie, capabile să reacţioneze mai rapid, mai amplu, cu ocazia unei reintroduceri ulterioare a aceluiaşi antigen.

Aşa cum a fost menţionat anterior, principala caracteristică a imunităţii este specificitatea. Pentru a sugera cât de specific este răspunsul imun, o modalitate este de a discuta despre „potrivirea dintre cheie şi broască”, între structurile Ag şi Ac.

O altă caracteristică foarte importantă a RI, în condiţii fiziologice, este capacitatea de a discerne între self şi non-self şi de a reacţiona numai faţă de moleculele care îndeplinesc definiţia de antigen

Raspunsul imun primar

Înaintea primului contact cu un anumit antigen, nu există anticorpi „potriviţi” faţă de acesta. Stimulul antigenic primar „selectează” LB care au receptori pentru respectivul Ag. După primul contact cu Ag se dezvoltă RIP, cu următoarele caracteristici:

· Latenţa: reprezintă perioada de la contactul cu Ag până la prezentarea structurilor Ag către LB; variază în funcţie de natura antigenului, calea de administrare şi doza administrată; durează între 2 şi 3 zile;

· Creşterea logaritmică: (sinteză activă de Ac, de către plasmocite) durează circa 3 zile; în timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacţii Ag-Ac; urmează o fază de stagnare (câteva zile), timp în care titrul anticorpilor serici se menţine relativ constant;

· Ulterior are loc scăderea progresivă a titrului anticorpilor serici.

De regulă, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac după 5-14 zile de la stimulul antigenic primar.

Natura anticorpilor:

· examinarea claselor de anticorpi produşi arată că primii anticorpi care apar sunt de tip IgM (cei din clasa IgG apar câteva zile mai târziu iar nivelul lor creşte pe măsură ce nivelul IgM scade);

· în următoarele 2-3 săptămâni, în ser predomină anticorpii de tip IgG;

31

· în următoarele luni, eventualii anticorpi care persistă sunt de tip IgG.

Raspunsul imun secundar

Răspunsul imun secundar apare după al doilea contact cu acelaşi antigen (sau după contacte ulterioare). RIS are următoarele caracteristici:

· poate apărea chiar şi după administrarea unor doze destul de mici de antigen;

· latenţa este redusă la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de creştere logaritmică;

· anticorpii sunt de tip IgG;

· titrul Ac produşi este mult mai înalt;

· persistenţa acestora este mai lungă (Ac produşi se menţin timp mai îndelungat, luni de zile).

Diferenţa dintre RIP şi RIS este datorată în primul rând existenţei limfocitelor cu memorie. După eliminarea Ag, în organism continuă să „circule” celule cu memorie, reacţia imună la al doilea contact cu acelaşi Ag având caracteristicile de mai sus. Memoria imună se stabileşte din timpul RIP şi este specifică.

Determinarea claselor IgM şi IgG are o dublă importanţă practică:

· face posibilă distincţia între o afecţiune recentă şi una mai veche şi

· permite recunoaşterea unei infecţii congenitale (cu anumite excepţii).

Cunoaşterea caracteristicile RIP şi RIS are importanţă practică. Ne permite să înţelegem şi motivul pentru care reacţiile Ag-Ac trebuie făcute, de regulă, „în dinamică”.

36.Tipuri de Ig

Exista cinci tipuri de imunoglobuline in sange: IgG, IgA, IgM, IgE si IgD.

Ig A

IgA reprezinta 10-15 % din totalul imunoglobulinelor. IgA sunt anticorpii secretori majori; se gasesc in lacrimi, saliva, secretii respiratorii, gastrointestinale si urogenitale. In forma dimerica (IgA2) contin suplimentar 2 lanturi oligopeptice: unul jonctional si altul secretor (o glicoproteina). IgA2 este rezistenta la actiunea proteolitica si are rol in aglutinarea bacteriilor, impiedicand astfel penetrarea mucoaselor.Concentratii crescute de IgA monoclonale apar in afectiuni limfoproliferative, in special mielomul multiplu IgA si limfomul mediteranean cu localizare intestinala. Un varf monoclonal > 2g/dL constituie un criteriu major de diagnostic pentru mielomul multiplu. Cresteri ale IgA pot fi intalnite in numeroase afectiuni ale suprafetelor mucoase. Scaderi ale IgA se inregistreaza la pacientii cu boala sinopulmonara cronica, ataxie-telangiectazie si deficit congenital. Unele deficite clinic semnificative de IgA sunt insotite de un deficit concomitent de IgG2 si IgG4. Pacientii cu deficit congenital de IgA sunt predispusi la afectiuni autoimune si pot dezvolta anticorpi fata de IgA, avand risc de anafilaxie daca sunt transfuzati cu sange ce contine IgA.

Ig G

32

IgG reprezinta 75 % din imunoglobulinele plasmatice. Sunt anticorpii majori produsi ca raspuns la un contact secundar cu un antigen. Strabat endoteliile si placenta si induc pasiv imunitatea la nou nascut. Neutralizeaza toxinele bacteriene si functioneaza ca opsonine (se leaga de suprafata bacteriana favorizand fagocitoza). Scaderile semnificative de IgG, de cauza congenitala sau dobandita, cresc susceptibilitatea individuala pentru infectii bacteriene. Astfel, in cazul pacientilor cu infectii repetate trebuie verificat nivelul imunoglobulinelor serice deoarece, in cazul unui deficit, pot beneficia de tratament cu gamaglobuline.Pe de alta parte, niveluri crescute de IgG se intalnesc la persoanele imunocompetente, ca raspuns la o mare varietate de procese infectioase sau inflamatorii. Prezenta anticorpilor IgG specifici a fost demonstrata pentru numeroase organisme; impreuna cu determinarea IgM specifice contribuie la diagnosticul serologic de infectie acuta sau cronica. O cauza majora de crestere policlonala a IgG o reprezinta sindromul imunodeficientei dobandite. Cresteri policlonale ale IgG se inregistreaza de asemenea in scleroza multipla si in unele hepatite cronice. Cresteri monoclonale ale IgG se intalnesc in multe cazuri de mielom multiplu, un nivel > 3 g/dL constituind un criteriu major de diagnostic.

Ig M

IgM sunt anticorpii majori produsi in timpul raspunsului imun primar. Au o structura pentamerica, 5 molecule de IgM fiind legate printr-un oligopeptid jonctional. Factorul reumatoid (majoritatea cazurilor) si izoaglutininele (alfa si beta) de grupa sanguina ABO apartin acestei clase. IgM reprezinta tipul de anticorpi produsi initial in cursul raspunsului imun si prima clasa de imunoglobuline sintetizate de fat sau nou-nascut. IgM nu traverseaza placenta. Din aceste motive demonstrarea anticorpilor IgM specifici este utila in evaluarea stadiului infectiei (infectie acuta: sunt prezenti anticorpii IgM; infectie cronica: predomina anticorpii IgG) si a probabilitatii infectiei congenitale (un nou-nascut cu anticorpi IgM este infectat; un nou-nascut cu anticorpi IgG a dobandit pasiv, transplacentar, anticorpi materni). Sindromul imunodeficientei hiper-IgM se caracterizeaza prin absenta IgG si IgA din ser, asociata cu o crestere marcata a IgM.Macroglobulinele produse in boala Waldenström apartin clasei IgM si pot induce un sindrom de hipervascozitate a serului. Un nivel monoclonal > 2 g/dL reprezinta un criteriu major de diagnostic.Cresteri policlonale ale IgM se intalnesc in diverse conditii infectioase sau inflamatorii. Nivelul IgM este tipic crescut in ciroza biliara primitiva. Scaderi ale IgM se inregistreaza in hipogamaglobulinemia congenitala sau dobandita, caracterizata clinic prin infectii recurente.

Ig E

IgE sunt imunoglobuline fixate prin fragmentul Fc pe suprafata mastocitelor; cuplarea lor cu antigenul produce degranularea mastocitului cu declansarea reactiei alergice (tip I, imediat, anafilactic). In serul persoanelor normale concentratia IgE reprezinta mai putin de 0.001 % din totalul imunoglobulinelor. IgE detin un rol important in medierea reactiilor alergice care se produc in urma expunerii la alergeni a indivizilor susceptibili (atopici). IgE au o structura similara cu a celorlalte imunoglobuline, fiind alcatuite din 2 lanturi usoare si 2 lanturi grele. Lanturile grele ale fiecarei molecule de IgE contin o regiune variabila responsabila de specificitatea antigenica.Deoarece mielomul IgE este extrem de rar, utilitatea clinica a determinarii IgE se rezuma in general la rolul sau de mediator al raspunsului alergic. Majoritatea moleculelor de IgE din ser sunt fixate pe suprafata mastocitelor si a granulocitelor bazofile. Interactiunea alergenilor cu IgE specifice de pe

33

suprafata acestor celule determina eliberararea de histamina si a altor substante vasoactive, initiand astfel reactia alergica. Aproximativ jumatate din indivizii cu rinita alergica sau astm prezinta niveluri crescute de IgE; restul, desi au concentratii crescute de IgE alergen specifice, prezinta niveluri normale de IgE totale. Studiile au indicat ca nivelul IgE totale este adesea crescut la pacientii cu dermatita atopica, iar nivelul IgE tinde sa se coreleze cu severitatea eczemei. Concentratia IgE este de asemenea crescuta la pacientii cu infestari parazitare, aspergiloza bronhopulmonara alergica si intr-un anumit tip de imunodeficienta (sindromul Job)

Ig D

Imunoglobulina D (IgD) este o proteina cu masa moleculara de 180 kDa, ce reprezinta 0.25% din totalul imunoglobulinelor serice. Este o componenta importanta a proteinelor membranare de pe suprafata limfocitelor B la nou-nascuti, fiind de obicei co-exprimata cu o alta categorie de anticorpi (IgM). Rolul IgD membranare nu este pe deplin cunoscut, dar se crede ca aceasta este implicata in modularea diferentierii si proliferarii clonale a limfocitelor B. Forma serica este un monomer cu doua lanturi grele din clasa delta (δ) si doua lanturi usoare (k sau λ), ce devine detectabila abia dupa varsta de 6 luni. Concentratia serica a imunoglobulinei D prezinta valori crescute ca urmare a unor proliferari clonale inregistrate in boli hepatice, infectii acute sau cronice, afectiuni autoimune sau la nou-nascutii cu infectii in utero.

37. Ig M si Ig G – Structura.Rol

Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele există în plasmă, lichid interstiţial şi secreţii şi au capacitatea de a recunoaşte şi de a se combina specific cu antigenul inductor al răspunsului imun. Imunoglobulinele sunt diferite de alte structuri proteice:

- recunosc şi reacţionează specific cu structura antigenică din cauza căreia au apărut;

- au funcţie de anticorp, dar dacă sunt inoculate la un individ dintr-o specie diferită vor avea rolul de antigene pentru respectivul individ;

- sunt singurele structuri proteice care sunt sintetizate după un stimul antigenic;

- pot activa sistemul complement etc.

IgG

IgG (prototipul de Ac) reprezintă circa 75% din totalul imunoglobulinelor din ser şi are o distribuţie aproximativ egală în vase şi ţesuturi. Există patru subclase de IgG (molecule cu termorezistenţă mai mare), cu structură asemănătoare, o masă moleculară de 146.000 (excepţie făcând IgG3 cu o masă de 170.000), 3 domenii constante pentru lanţul greu şi un procentaj de hidraţi de carbon de 2-3 %. Concentraţia sanguină a IgG este de ordinul 11 g/l, din care IgG1 - 66 %, IgG2 - 23 %, IgG3 - 7% şi IgG4 - 4 %. IgG are receptori pentru sistemul complement. Poate trece prin bariera hemato-placentară (după a 20-a săptămână de viaţă intra uterină). Apare în RI secundar.

IgM

Sunt anticorpi aglutinanţi şi reprezintă cei mai eficace activatori ai complementului. Ac IgM sunt caracteristici pentru RI primar, producţia lor fiind stimulată de către IL-4, care nu activează mecanismul de switch izotipic.

IgM membranară (IgMm) este exprimată pe suprafaţa LB. Are structură monomerică şi se termină prin aminoacizii 556-597, cuprinzând în mod particular o parte intramembranară hidrofobă

34

şi 3 aminoacizi intracitoplasmatici. Fiecare moleculă de IgMm este asociată cu 2 lanţuri Iga şi 2 lanţuri Igβ. Ansamblul formează BCR (B cell receptor), comparabil cu TCR-ul limfocitului T.

IgM serică (IgMs) cuprinde un lanţ greu cu un domeniu variabil VH, 4 domenii constante Cm1 - Cm4 şi un procent ridicat de hidraţi de carbon (12 %). Molecula însăşi este un pentamer cu un prim inel al punţii disulfurice la sfârşitul lui Cm3, un al doilea la terminarea lui Cm4 şi un lanţ J (joining chain). Masa moleculară este foarte mare (circa 970.000 D), cu un coeficient de sedimentare de 19 S. Concentraţia serică este de 1,2 g / l. Reprezintă circa 5-10% din totalul imunoglobulinelor din ser. Are 10 situsuri combinative dintre care numai 5 sunt funcţionale. IgM are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-placentară. Apare în RI primar.

38.Ce sunt Ag?Definitie.Tipuri.Exemple

Antigenul se defineşte drept o substanţă recunoscută specific de către sistemul imun. Alţi autori consideră că antigenul este o substanţă capabilă să inducă un răspuns imun (imunogenicitate) şi să fie recunoscută de către sistemul imun (specificitate). Răspunsul imun (RI) tinde să neutralizeze şi să elimine antigenul din cauza căruia s-a declanşat. Antigenele (Ag) care pot declanşa RI sunt definite drept substanţe imunogene.

Haptenele reprezintă Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declanşa activarea limfocitelor (fără de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene numai dacă se combină cu macromolecule „carrier”. Aşadar, haptena este un antigen incomplet, are specificitate dar nu are imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic rezultat prin degradarea moleculei de penicilină este o haptenă. Pot apărea reacţii de hipersensibilitate după cel puţin al doilea contact cu această structură şi numai în condiţiile în care gazda întră în categoria persoanelor „atopice”, având structura genetică de codificare pentru o proteină „carrier”, care cuplează acidul penicilinoic stimulând astfel RI.Tolerogenele sunt Ag care declanşează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat activ, imediat.Orice bacterie trebuie văzută ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt imunogene (unele pot fihaptene altele tolerogene).

Clasificare:

a)În relaţie cu subiectul în care are loc RI:

-Heteroantigenele sunt substanţe diferite de antigenele proprii animalului imunizat, provenite de la o altă specie.

-Alloantigenele sunt prezente la unii indivizi din aceeaşi specie

-Autoantigenele sunt substanţe recunoscute prin răspunsul imun şi prezente la animalul imunizat sau la om în contextul unei afecţiuni autoimune.

b) În relaţie cu tipul de răspuns imun:

35

-Antigenele timodependente-Antigenele timodependente sunt în general de natură proteică dar pot fi şi de natură glucidică. Ele induc un răspuns primar iniţial slab, de izotip IgM, cu memorie, urmat de un răspuns secundar specific, cu IgG, IgA sau IgE.

-Antigenele timoindependente- Cele mai importante exemple sunt polizaharidele bacteriene care au aceeaşi structură glucidică repetitivă dispusă de-a lungul peretelui celular. flagelina, antigen proteic cu determinanţi antigenici repetitivi, face parte din antigenele timoindependente.

c) În funcţie de repartiţia antigenelor în natură:

-Antigene ubicuitare(Antigenele ABH ale grupului sanguin ABO)

-Antigene restrânse(un exemplu fiind antigenele sanguine Rh)

d) În funcţie de natura chimică:

-Polizaharidele ca şi partea glucidică a glicoproteinelor sunt în general antigene. Exemplele sunt antigenele care definesc grupele sanguine şi antigenele clasice ale diferitelor microorganisme.

-Antigenele lipidice

-Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ubicuitare; sunt antigene şi imunogene.

-Superantigenele . Se consideră că superantigenele pot avea un rol în inducerea bolilor autoimune.

e) În funcţie de potenţialul de a stimula RI şi de a reacţiona cu Ac formaţi în cadrul acestui RI, antigenele pot fi:

- Ag complete (majoritatea) care pot declanşa RI şi pot reacţiona cu Ac apăruţi;- Ag incomplete care nu pot declanşa RI dar pot reacţiona (in vitro) cu Ac; sunt de ex. epitopi izolaţi, nelegaţi de grupări purtătoare (pot fi haptene).

f) În funcţie de specia microorganismului implicat

-Antigenele bacteriene

-Antigenele virale sunt localizate la nivelul capsidei, fac parte din învelişul extern (ex. hemaglutinine) sau constituie proteine şi glicoproteine structurale.

-Antigenele parazitare -La o singură specie parazitară pot fi evidenţiate mai multe tipuri de antigene (ex. 20 de antigene la Plasmodium falciparum). 39.Reactiile de precipitare in mediu lichid – Exemple.Utilizari

39.Reactiile de precipitare in mediu lichid – Exemple.Utilizari

A. Reacţii de precipitare în mediu lichid

36

· Reacţii de precipitare în amestec, reacţii de floculareo titrarea toxinei difterice (metoda Ramon), determinarea titrului Ac antitoxici etc.,o VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), USR (Unheated Serum Reagin),o RPR (Rapid Plasma Reagin) etc, în diagnosticul serologic al sifilisului

-Reacţia de precipitare între Ag şi Ac se poate cuantifica şi este foarte utilă pentru a demonstra prezenţa şi respectiv absenţa precipitatului în funcţie de concentraţiile relative de Ag şi Ac.

·

Reacţii de precipitare în inel reacţia Ascoli, determinarea grupului streptococic etc.

Se utilizează pentru identificarea originii petelor de sânge (reacţia Uhlenhut, în medicina legală) şi pentru identificarea provenienţei unor preparate pe bază de carne (în industria alimentară).

· Reacţii de precipitare în tub capilaro determinarea prezenţei proteinei C reactive,

determinarea prezenţei tipului M streptococic (streptococi de grup A) etc.

Reacţia de precipitare în tub capilar a fost utilizată pentru evidenţierea prezenţei proteinei C reactive (CRP).

· Dozajul nefelometric etc.

Nefelometria se utilizează curent şi determină cantitativ proteine specifice din ser şi urină

40.Reactiile de precipitare in gel – Exemple.Utilizari

B. Reacţii de precipitare în mediu gelifiat

· Imunodifuzia radială simplă (ex. metoda Mancini)Metoda permite determinarea cantitativă a imunoglobulinelor (IgG, IgM, IgA), fracţiunii C3 a complementului, alfa1-antitripsinei, siderofilinei etc.

· Difuzia dublă

metoda Elek,Această metodă permite depistarea capacităţii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae.

difuzia dublă radială (Ouchterlony)Această metodă este încă frecvent utilizată pentru determinarea specificităţii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi în patologia umană.

41.Reactiile de aglutinare – Principiu.Tipuri.Exemple

37

În reacţia de aglutinare antigenele sunt de natură corpusculară. Reacţia de aglutinare constă în reacţia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafaţa unor particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol etc), determinând aglutinarea acestora prin scăderea forţelor electrostatice de repulsie dintre particule şi formarea unor punţi de legătură.Aglutinareaeste mai sensibilă decât precipitarea, Ag fiind o particulă şi nu o moleculă solubilă. Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinanţi decât Ac de tip IgG (pentru că au mai multe valenţe). Există şi Ac neaglutinanţi (incompleţi / blocanţi) sau care aglutinează numai la rece.

Tipuri:

-1. Aglutinarea directă:

2. Aglutinarea indirectă sau pasivă

3. Inhibarea aglutinării

4. Aglutinarea în coloană

5. Aglutinarea mediată de Ac anti-imunoglobuline

42.Reactiile de fixare ale complementului – Principiu.Etape.Utilizari.Exemple

Face parte dintre reacţiile al căror rezultat nu poate fi vizualizat fără un artificiu tehnic, în acest caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar acest sistem indicator se datorează faptului că Ag este fie sub formă macromoleculară fie este reprezentat de corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu devine vizibil cu ochiul liber. În diagnosticul serologic, cea mai cunoscută metodă rămâne încă RFC Bordet-Wasserman, utilizată încă în diagnosticul serologic al sifilisului.

Principiul RFC:RFC se bazează pe proprietatea sistemului C' de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac.În prima fază a reacţiei se introduce serul de cercetat iar dacă acest ser conţine Ac specifici faţă de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fixarea C', care se va activa pe calea clasică şi nu va mai fi „disponibil” pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac-antihematie). În cazul în care serul de cercetat nu conţine Ac specifici faţă de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac în prima etapă a RFC.După introducerea în reacţie a sistemului hemolitic indicator, hematiile şi Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun iar C' „liber” se va fixa pe acesta. După fixare va urma activarea C' şi respectiv liza hematiilor, hemoliza putând fi examinată cu ochiul liber.

Serul de cercetat se va menţine 30 minute la 56°C, în baia de apă, pentru inactivarea C' propriu.

Aşa cum am menţionat anterior, principial, RFC are loc în 2 etape :o în prima etapă se pun în reacţie C', serul de cercetat şi Ag cunoscut; există 2 posibilităţi: a. în serul de cercetat există Ac specifici, rezultând un complex Ag-Ac pe care se va fixa C'; b. în serul de cercetat nu există Ac specifici, nu se formează complex Ag-Ac, C' rămâne liber;

38

o în a doua etapă se introduce în reacţie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-hematie); există 2 posibilităţi: a. C' nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C' se fixează pe sistemul hemolitic, lizează hematiile şi observăm apariţia hemolizei.

În RFC utilizată în diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales în funcţie de suspiciunea de diagnostic. RFC cantitativă se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infecţiilor produse de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp., diferite virusuri etc.

43.Reactiile de seroneutralizare – Principiu.Tipuri.Utilizari.Exemple

Reacţia ASLO

Această reacţie poate fi utilizată în diagnosticul retrospectiv al unei infecţii streptococice sau pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (împreună cu criteriile minore şi majore de diagnostic). Reacţia ASLO determină titrul Ac anti streptolizină O (SLO).Principiu:Titrarea Ac anti-SLO se bazează pe faptul că SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. În cazul în care în serul de cercetat există Ac anti-SLO, acţiunea hemolitică a SLO este neutralizată. Combinând diluţii din serul de cercetat cu o cantitate constantă de SLO vom putea determina titrul ASLO.

Reacţiile de seroneutralizare ar putea fi utilizate în mai multe împrejurări, spre exemplu în:· diagnosticul microbiologic directo identificarea Clostridium perfringens prin metoda plăcilor semineutralizate (o testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de seroprotecţie, vezi anexa nr. 2);o toxinotipia în cazul suspicionării unei toxi-infecţii alimentare cu Clostridium botulinum (vezi anexa nr. 2 şi capitolul 50);· diagnosticul serologico reacţia ASLO (vezi şi capitolul 28);· prevenirea unor boli infecţioase prevenibile prin vaccinare şi evaluarea eficacităţii vaccinaleo vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, dT, ATPA, ADPA; vezi şi anexa nr. 4);o titrarea prezenţei Ac anti-toxine (difterică, tetanică etc);o testarea prin IDR (intra-dermo-reacţie) a susceptibilităţii faţă de o anumită boală infecţioasă care are la bază drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine. Intradermoreacţiile Schick sau Dick, pentru a dovedi susceptibilitatea persoanei testate faţă de o infecţie difterică sau scarlatinoasă au intrat în istoria medicinii.· tratamentul / profilaxia unor boli infecţioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe.

44.Hipersensibilitatea – Definitie.Tipuri.Exemple

În mod clasic, HS reprezintă o stare de reactivitate crescută a organismului, pe baza unui mecanism imunologic, indusă de expunerea (repetată) la anumite structuri antigenice (sau haptene). Cuvȃntul

39

alergen a fost pentru prima oară utilizat de Riquet; desemnează un antigen care dă naştere unei reacţii de hipersensibilitate.

HS se poate clasifica în funcţie de tipul de răspuns imun în:· HS mediată prin mecanism imun umoral (rol primordial LB şi anticorpii) -HS de tip I (anafilactică, atopică), aşa cum se înregistrează în cazul şocului anafilactic, edemului Quincke, conjunctivitelor sau rinitelor alergice, astmului alergic, urticariei, eczemei atopice etc; -HS de tip II (citotoxică), aşa cum se întâmplă în liza celulară prin anticorpi, complement dependentă sau în citotoxicitatea anticorp dependentă, complement independentă (mecanisme ce pot fi implicate de ex. în patogenia reumatismului articular acut, în anemii hemolitice inclusiv după infecţii cu Mycoplasma pneumoniae, reacţii posttransfuzionale, sindromul Goodpasture etc); -HS de tip III (prin complexe antigen-anticorp), aşa cum se înregistrează în reacţia Arthus, boala serului, boala plămânului de fermier, glomerulonefrita extramembranară, lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă, glomerulonefrita şi periarterita poststreptococică etc.

· HS de tip IV mediată prin mecanism imun celular (rol primordial LT şi citokinele), spre exemplu în-HS tuberculinică sau-HS în testările intradermice care utilizează lepromină, candidină, histoplasmină, tricofitină etc şi-HS în multe dintre infecţiile virale.

40