3,4. Peretele bacterian

Peretele bacterian înconjoară membrana citoplasmatică. Lipseşte la bacteriile din genul Mycoplasma. Are o grosime de circa 15-30 nm.Bacteriile Gram-pozitive conţin aproximativ 80-90% mureină (peptidoglican, glicopeptid parietal). Mureina este un heteropolimer al cărui schelet este format din lanţuri polizaharidice. Aceste lanţuri sunt formate prin polimerizarea, alternantă, a 2 structuri zaharidice:- acidul N-acetil-muramic (NAM) şi- N-acetil-glucozamina (NAG).Fiecare moleculă de NAM are substituit un tetrapeptid alcătuit din D şi L-aminoacizi. Se consideră că aminoacizii în formă D conferă un grad de protecţie faţă de enzimele proteolitice. Între tetrapeptidele substituite, la lanţurile polizaharidice alăturate, se stabilesc legături peptidice prin gruparea terminală COOH a unui tetrapeptid şi grupări terminale libere ale tetrapeptidului vecin. Astfel se formează structuri bidimensionale, destul de complicate, sub forma unor straturi care înconjoară întreaga celulă bacteriană.Bacteriile Gram-pozitive reţin violetul de metil (violet de genţiană în coloraţia „clasică”) şi au culoare violet pe frotiul colorat Gram. La unele bacterii, reţeaua de bază este acoperită de reţele suplimentare cu specificitate antigenică, alcătuite de exemplu din acid teichoic (polimer de ribitol fosfat şi glicerol fosfat), legat de regulă covalent la peptidoglican. În cazul în care structurile fosfat se găsesc în cantităţi limitate sau nu pot fi sintetizate, la nivelul peretelui bacterian putem întâlni acidul teichuronic. Dintre bacteriile Gram-pozitive se pot aminti stafilococul, streptococul, enterococul, bacilul difteric, bacilul listeriozei, actinomicetele, bacilul antraxului, clostridiile etc.În cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular în general mai subţire dar mult mai complex. Peretele este alcătuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-20% din structura peretelui) care este acoperit de o membrană externă. Spaţiul dintre membrana citoplasmatică şi membrana externă (include peptidoglicanul) reprezintă spaţiul periplasmic. Din punct de vedere chimic, membrana externă este alcătuită din fosfolipide, proteine şi cantităţi variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se află la acest nivel sunt porinele. Lipopolizaharidul (endotoxina) are în componenţă două structuri esenţiale: lipidul A şi polizaharidul O. Bacteriile Gram-negative se decolorează cu alcool-acetonă şi se recolorează cu fucsină diluată (au culoare roşie la coloraţia Gram). Dintre bacteriile Gram-negative am putea aminti meningococul, gonococul, enterobacteriile, vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii Gram-negativi (ex. Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella abortus) etc.Bacteriile acid-alcool rezistente (de exemplu, mycobacteriile sau nocardiile) conţin o cantitate substanţială de lipide la nivel parietal. Rezistă decolorării cu acid-alcool (au culoare roşie pe fond albastru la coloraţia Ziehl-Neelsen); această coloraţie continuă să reprezinte o etapă esenţială în diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, indiferent de cele mai recente descoperiri privind tehnicile moderne de laborator (inclusiv utilizarea sondelor nucleotidice sau amplificarea genetică). În afară de mycobacterii (în special M. tuberculosis, dar şi numeroase mycobacterii „atipice” (non-tuberculous mycobacteria, NTM), ex. M. avium, M. intracellulare, M. kansasii), există şi alte specii bacteriene care pot apărea colorate asemănător după utilizarea metodei Ziehl-Neelsen, spre exemplu bacilul difteric (C. diphteriae).Rolurile peretelui bacterian:- prin rigiditate asigură forma caracteristică bacteriei (coci, bacili etc);- asigură rezistenţa bacteriei (de exemplu la variaţii ale presiunii osmotice şi la presiuni interioare care pot ajunge până la 20 atm.);

1

- flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicată atât prin flexibilitatea membranei cât şi prin grosimea redusă a peptidoglicanului;- are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic, în cazul bacteriilor Gram-negative etc);- prezintă receptori, de exemplu pentru bacteriofagi;- are rol în diviziunea bacteriană participând la formarea septului transversal;- la nivelul lui pot acţiona unele antibiotice (exemplu beta-lactaminele, vancomicina, D-cicloserina);- la bacteriile Gram-negative este asociat cu numeroase enzime (situate în spaţiul periplasmic şi la nivelul membranei externe).Protoplastul (formă rotundă înconjurată de membrana citoplasmatică) reprezintă bacteria Gram-pozitivă după îndepărtarea completă a peretelui, de exemplu sub acţiunea lizozimului care lizează mureina. În medii hipotone protoplastul se lizează. Este o structură care nu se poate multiplica.Sferoplastul reprezintă bacteria Gram-negativă după degradarea parţială a peretelui (conţine o cantitate mai mică de mureină). Lizozimul poate acţiona asupra peptidoglicanului numai după alterarea membranei externe (ex. după tratare cu EDTA). În medii hipotone sferoplastul se lizează. Spre deosebire de protoplast, se poate multiplica.Anumite bacterii produc autolizine (enzime hidrolitice care degradează peptidoglicanul, spre exemplu glicozidaze, amidaze, peptidaze). Este probabil ca aceste substanţe să aibă un rol în creşterea şi multiplicarea bacteriană.Formele LÎn 1935 s-a observat prezenţa unor germeni modificaţi structural. Au fost numite forme „L”, după numele Institutului Dr. Lister unde au fost descoperite. Nu sunt microorganisme noi, ci variante ale unor microorganisme cu peretele bacterian modificat. Utilizându-se lizozim sau penicilină ca agenţi inductori s-au putut obţine forme „L” de la majoritatea bacteriilor. Este posibil ca aceste forme „L” să explice, prin prezenţa lor în organism, anumite infecţii cronice (de exemplu infecţii ale aparatului urinar).

7. Ribozomii: structură, rol

Ribozomii au formă aproximativ sferică, pot fi văzuţi la microscopul electronic. Mărimea lor (circa 10-20 nm) depinde de concentraţia ionilor Mg2+ şi K+. Unii ribozomi sunt liberi în citoplasmă, în timp ce alţii apar legaţi de faţa internă a membranei citoplasmatice. Din punct de vedere chimic conţin circa 65% ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de 70 unităţi Swedberg dar sunt constituiţi din două subunităţi de câte 30S şi respectiv 50S. În subunitatea mică intră o singură moleculă de ARNr, 16S şi 21 de tipuri de proteine ribozomale. În subunitatea mare intră mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S). Între cele două subunităţi se formează canalul prin care trec moleculele de ARNm (mesager) în cursul sintezei proteice. Se apreciază că într-o bacterie cu dimensiuni medii, aflată în faza de creştere activă, se sintetizează circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens.Ribozomii au rol esenţial în procesul de biosinteză proteică. Au tendinţa de a se grupa în polisomi (poliribozomi) cu eficienţă sporită în biosinteza proteică. În aceste condiţii, la un moment dat pe aceeaşi moleculă de ARNm se află în scopul traducerii mesajului genetic mai mulţi ribozomi, care constituie un ansamblu care poartă numele de polisom.Biosinteza proteicăBiosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor.Cu toate că secvenţa de aminoacizi din structurile proteice este „dictată” de secvenţa de baze azotate din ADN, pentru că nu există afinitate şi posibilitate de cuplare între ADN şi

2

aminoacizi este necesar ca o altă structură să permită poziţionarea aminoacizilor în lanţul viitoarei proteine.Iniţial are loc transcrierea informaţiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta această informaţie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este segmentul de ADN care deţine informaţia genetică pentru sinteza unei proteine. Segmentul de ADN care controlează sinteza unui polipeptid poartă numele de cistron.ARNm care deţine informaţia genetică pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poartă numele de ARNm monocistronic.La bacterii, de obicei, o moleculă de ARNm trebuie să poarte informaţia necesară pentru sinteza mai multor catene diferite şi în acest caz ARNm poartă numele de ARNm policistronic. Această situaţia particulară este datorată dimensiunii mici a acestor procariote precum şi metabolismului intens care are loc în cursul procesului de creştere şi multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenţial 3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se află deţinut de o singură moleculă de ARNm policistronic.De regulă, numai o catenă de ADN este folosită drept matriţă pentru ARNm. Transcrierea mesajului genetic este selectivă (se desfăşoară între promotor şi semnalul de terminare) şi este controlată de ARN polimeraza ADN-dependentă.Pentru traducerea mesajului genetic este necesară intervenţia la nivel ribozomal a moleculelor de ARNt (de transfer). Acestea au o dublă specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi există una sau mai multe molecule de ARNt; în acelaşi timp există enzime specifice fiecărui tip de aminoacid care controlează legarea corectă a aminoacizilor activaţi pe ARNt corespunzător). La nivelul fiecărui ARNt există trei nucleotide (anticodon) complementar codonului care corespunde aminoacidului.ARNt nu are niciodată la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU şi în aceste condiţii ne putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG şi UGA sunt codoni stop.Succesiunea specifică a nucleotidelor este transpusă într-o secvenţă specifică de aminoacizi care intră în constituţia lanţului polipeptidic din proteina în curs de formare.

8. Flagelii: structură, rol, localizare

Cilii sau flagelii conferă mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evidenţiată în preparatul proaspăt (între lamă şi lamelă) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU). Mobilitatea germenilor din genul Proteus este observată pe orice mediu de cultură solid pe care acest microorganism foarte mobil se dezvoltă (fenomenul de „invazie”).Flagelii sunt formaţiuni fine, alungite, flexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal. Acesta este alcătuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate ca două perechi pe o structură care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este plasat în perete şi membrana citoplasmatică. Din punct de vedere chimic flagelul este de natură proteică (flagelina).Roluri:- în mobilitate (cu o viteză de circa 50 µm / secundă); cilul are o mişcare de rotaţie, asemănătoare unei înşurubări în mediu şi ca atare corpul bacterian este împins în direcţia opusă; „motorul” rotaţiei e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obţinută din ATP;- antigenic (datorită structurii proteice - antigenul H, specific de tip);- în clasificarea bacteriilor (prin număr şi distribuţie), bacteriile putând fi- monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa;

3

- lofotriche (cu un mănunchi de flageli dispus la o extremitate);- peritriche (cu mai mulţi flageli dispuşi de-a lungul suprafeţei bacteriene), de exemplu E. coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi.

9. Sporii: structură, compoziţie chimică, rol, localizare

Fenomenul de sporogeneză este mai des întâlnit la Bacillaceae (genurile Clostridium şi Bacillus). Pe sol, în condiţii de uscăciune, la adăpost de lumina solară directă, endosporii persistă zeci şi poate sute de ani.Materialul genetic este concentrat şi, împreună cu apa legată, lipide, Ca++, Mg++, este înconjurat de un strat protector (membrana sporală, cortexul sporal, învelişurile sporale). „Sâmburele” sporal împreună cu membrana citoplasmatică formează protoplastul sporal.Roluri:- formă de rezistenţă şi conservare a speciei (în condiţii favorabile un spor se poate transforma într-o bacterie / forma vegetativă; procesul de formare a sporului ar putea fi considerată una dintre cele mai primitive forme de diferenţiere, dar nu este un proces de reproducere celulară aşa cum se întâmplă la fungi sau paraziţi);- rezistă la căldură, uscăciune, la anumite substanţe chimice şi antibiotice, raze UV etc.Sporul poate fi localizat:- central sau subterminal, mai mic decât celula (ex. la Bacillus anthracis);- central sau subterminal, mai mare decât celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc);- terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de „băţ de chibrit”).Poate fi evidenţiat prin coloraţii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraţia Gram (locul sporului rămâne necolorat).Este sensibil la formol, propiolactonă etc. Este distrus prin autoclavare.

10. Nutriţia bacteriană

Nutriţia bacteriană reprezintă suma proceselor metabolice care conduc la producerea de materiale convertibile în energie şi în diferite componente celulare. Nutrienţii sunt substanţe ale căror soluţii pot traversa membrana citoplasmatică pentru a fi antrenaţi în reacţiile metabolice care asigură creşterea şi multiplicarea celulară.În raport cu sursa de energie, bacteriile se împart în:·         bacterii care folosesc energie luminoasă şi trăiesc la lumină (photobacterii) şi·         bacterii care îşi procură energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic şi trăiesc la întuneric (scotobacterii, chimiosintetizante).În raport cu sursele folosite ca material de sinteză în ambele diviziuni se diferenţiază:·          bacterii autotrofe, capabile să-şi sintetizeze toţi compuşii organici din materie anorganică şi·          bacterii heterotrofe, dependente de prezenţa unor compuşi organici. Nutriţia principalelor bacterii studiateMajoritatea bacteriilor comensale, condiţionat patogene sau patogene importante pentru om, sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se diferenţiază în funcţie de tipul respirator. Există şi bacteriile paratrofe, a căror energie trebuie oferită de gazdă. Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu microorganismele din genurile Rickettsia şi Chlamydia, care depind nutriţional de o gazdă vie).Creşterea microbiană necesită polimerizarea unor substanţe mai simple pentru a forma: proteine, acizi nucleici, polizaharide şi lipide. Aceste substanţe se obţin fie din mediul de

4

cultură, fie sunt sintetizate de către celulele în creştere (sunt necesare diferite coenzime şi legături macroergice de tipul celor din ATP). Substanţele necesare şi coenzimele implicate se pot obţine dintr-un număr relativ redus de precursori metabolici.Dacă o celulă bacteriană primeşte substanţele necesare, va sintetiza diferite macromolecule, iar secvenţa aranjării componentelor în aceste macromolecule este determinată fie după un model ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidraţi şi lipide.După ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansamblează, formând structuri supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor şi activitatea căilor metabolice sunt foarte bine reglate (există o permanentă balanţă a biosintezei).Microorganismele reprezintă un grup de celule vii care utilizează o mare diversitate de căi metabolice; de exemplu, mai multe căi diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur compus simplu, benzoatul, iar o singură cale metabolică pentru benzoat poate fi reglată de mai multe sisteme de control. Principiul determinant pentru căile metabolice este acela al organizării unui număr relativ mic de tipuri de reacţii biochimice, într-o ordine specifică. Multe dintre căile biosintetice se pot deduce având în vedere structura chimică de la care se porneşte, produsul final şi eventual unul sau doi metaboliţi intermediari. Principiul determinant al reglării metabolismului este acela că enzimele par a fi „chemate” în joc numai când activitatea lor este necesară. Activitatea unei enzime poate fi modificată variind fie cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acţionează.În unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuată prin cuplarea unor efectori specifici (metaboliţi care modulează activitatea enzimatică).De multe ori, activitatea unei enzime care catalizează o etapă metabolică iniţială este (poate fi) inhibată de produsul final al căii respective. O astfel de inhibiţie nu poate depinde de competiţia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiţia depinde de faptul că enzimele reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzimă are atât un situs catalitic de legare cu substratul, cât şi unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori). Legarea unui efector de situsul său duce la o modificare conformaţională a enzimei, astfel încât afinitatea situsului catalitic scade (inhibiţie allosterică) sau creşte (activare allosterică).Când o bacterie peritriche se mişcă, flagelii se asociază şi se mişcă împreună, rezultând o deplasare liniară. La diferite intervale de timp, bacteria îşi schimbă direcţia (flagelii „se dau peste cap”). Acest comportament face posibilă chemotaxia: o celulă care se îndepărtează de sursa atractantului chimic îşi schimbă sensul de mişcare mult mai frecvent în comparaţie cu una care se apropie de atractant şi ca o însumare, bacteria se va deplasa înspre atractant. Spre exemplu, prezenţa unui zahar sau a unui aminoacid este sesizată de receptori specifici localizaţi pe membrana celulară (de multe ori acelaşi receptor participă şi la transportul membranar al acelei substanţe). Celula bacteriană este prea mică pentru a fi capabilă să detecteze existenţa unui gradient chimic (în spaţiu), dar s-a demonstrat experimental că detectează gradienţii în timp (de exemplu, concentraţia unei substanţe scade în timp ce bacteria se îndepărtează de sursă şi creşte în timp ce aceasta se apropie de sursă).Anumiţi compuşi acţionează ca respingători (R), iar alţii ca atractanţi (A). Un mecanism care ar explica răspunsul celulei faţă de A/R ar implica metilarea şi respectiv demetilarea unei proteine specifice din membrană, care depinde de GMPc. Atractanţii produc o inhibiţie tranzitorie a demetilării acestei proteine. Respingătorii stimulează demetilarea.Mecanismul prin care o modificare în comportamentul celular se produce ca răspuns la o modificare de mediu poartă numele de transducţie senzorială. Aceasta pare să fie responsabilă de:·         chemotaxie;

5

·         aerotaxie (deplasarea către concentraţia optimă de O2);·         fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe către lumină);·         deplasarea spre acceptorul de electroni etc. 

11. În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:- mezofile, cu temperatura optimă de 30-37ºC;- psichrofile, cu temperatura optimă în jur de 20ºC (unele acceptând temperaturi apropiate de 0ºC; Listeria spp. poate supravieţui sau se poate chiar şi multiplica la temperatura din frigider). Ele sunt adaptate la acest mediu prin numărul mare de acizi graşi nesaturaţi conţinuţi de membrana plasmatică. Gradul de nesaturare al unui acid gras se corelează cu timpul de solidificare sau stadiul de tranziţie termică (temperatura la care se topeşte sau se solidifică lipidul). Acizii graşi nesaturaţi rămân în fază lichidă la temperaturi joase, dar sunt denaturaţi la temperaturi moderate. Fie că acizii graşi din membrană se află în fază lichidă sau solidă, ei afectează fluiditatea membranei, care afectează în mod direct capacitatea de a funcţiona.- termofile, cu temperatura optimă de 50-60ºC (unele putând să se multiplice şi la temperaturi apropiate de 95ºC, ca de ex. Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt adaptate să reziste la temperaturi de peste 60°C printr-o varietate de modalități. Acizii graşi din membrana bacteriilor termofile sunt acizi grași saturaţi, permiţând membranelor să rămână stabile şi funcţionale la temperaturi ridicate.- extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optimă de 80°C sau mai mare şi o temperatură de dezvoltare maximă de 115°C. (2) Nu sunt patogene.Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în marea lor majoritate mezofile.

12. Mediu selectiv, electiv si de imbogatire – definitii

Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite bacterii (de exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric).

Prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea altor bacterii decât cea a cărei izolare se urmăreşte. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii în care includem antibiotice (faţă de care bacteria care se doreşte a fi izolată este rezistentă).Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând dezvoltarea florei de asociaţie dintr-un produs patologic. Funcţionează concomitent ca mediu selectiv şi ca mediu electiv.

13. Mediul diferenţial

conţine un indicator de pH şi un anumit substrat (de exemplu un zahar) care poate fi sau nu metabolizat, determinând modificarea pH-ului şi a culorii indicatorului sau modificarea aspectului culturii. De exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) permite diferenţierea bacteriilor lactozo-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactozo negative (Shigella, Salmonella etc).

6

Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3 zaharuri şi fier), MIU (mobilitate indol uree).

Sub 16 – 20. Definiţii de bazăSterilizarea reprezintă distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafaţă sau dintr-un mediu (lichid sau solid).Septic înseamnă contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecţia unei plăgi).Aseptic înseamnă lipsit de microbi, indiferent dacă microbii sunt patogeni sau nepatogeni.Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediului ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menţine “sterilitatea” ţesuturilor, mediilor de cultură, medicamentelor injectabile etc.Dezinfecţia reprezintă distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori şi a sporilor) din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafeţe. Se realizează cu ajutorul unor agenţi fizici sau cu ajutorul substanţelor dezinfectante.Antisepsia reprezintă înlăturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente, mucoase sau din plăgi. Se realizează cu ajutorul substanţelor antiseptice.

SterilizareaToate materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie să fie sterile înainte de utilizare. Există o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel încât şi metodele de sterilizare sunt destul de variate, după cum urmează:1.      Metode de sterilizare prin căldură·         căldura uscată·         căldura umedă2.      Metode de sterilizare prin filtrare3.      Metode de sterilizare utilizând radiaţiile4.      Metode chimice de sterilizare.Metodele de sterilizare care utilizează radiaţiile (cu excepţia radiaţiilor ultraviolete) şi metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul de microbiologie.Sterilizarea va fi întotdeauna precedată de pregătirea materialului care urmează să fie sterilizat:·         spălare, uscare, ambalare / în cazul materialelor curate, necontaminate·         autoclavare, spălare, uscare, ambalare / în cazul materialelor contaminate refolosibileExistă o serie de metode pentru a controla eficienţa sterilizării, prin indicatorii fizici (ex. termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus stearotermophilus).

Sterilizarea prin căldură uscatăSterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene.1. Sterilizarea prin încălzire la incandescenţă (“la roşu”) reprezintă introducerea şi menţinerea în flacăra becului Bunsen până la înroşire, pe toată lungimea, a obiectului care urmează a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologică (cu buclă sau fir) sau pentru spatulă.

7

Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge temperatura de incandescenţă. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient de sticlă (tub, eprubetă, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur.2. Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur). Etuva este o cutie metalică cu pereţi dubli. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui termostat se obţine şi menţine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii în interiorul aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem de ventilaţie.Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă trebuie să atingă 180ºC, pentru o durată de 1 oră. În unele situaţii timpul de sterilizare poate depăşi 60 de minute (ex. pentru ambalaje de dimensiuni mari).Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan, pulberi inerte şi termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menţionat faptul că repetarea sterilizării, în timp, conduce la decălirea oţelului) etc. Nu se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vată, bumbac, fibră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.3. Incinerarea reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă. Există anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare.În cazul spitalelor, de multe ori sunt prevăzute incineratoare în structura unităţii sanitare respective. De regulă, în vederea incinerării se încheie un contract de prestări servicii cu o firmă de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerării materiale de unică folosinţă din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experienţă etc.

Sterilizarea prin căldură umedăSterilizarea prin căldură umedă este cea mai eficientă metodă de sterilizare şi are ca mecanism coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor.1. Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât şi pentru unităţile sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă realizează la 0,5 atmosfere o temperatură de 115ºC, la 1 atmosferă o temperatură de 121ºC şi respectiv 134ºC la 2 atmosfere.Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu un capac prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă sunt comprimaţi la presiunea necesară în vederea sterilizării. Există mai multe tipuri de autoclave:·         autoclave cu perete simplu·         verticale·         orizontale·         autoclave cu manta de aburi·         verticale·         orizontale.În continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung în camera de sterilizare de jos în sus. Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru. Pentru punerea în funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete: unul superior (robinetul de aer şi vapori, care permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele există o supapă de siguranţă care se deschide şi permite evacuarea vaporilor atunci când, accidental, presiunea vaporilor depăşeşte limita de siguranţă. În momentul de faţă pentru evitarea riscului de a veni în contact cu vapori de apă fierbinţi aflaţi sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului până când presiunea din interior nu o egalizează pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un spaţiu în care se află sursa de căldură.

8

În partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă de metal perforată. Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa este perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea apei. În vederea sterilizării se procedează astfel:·         verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie până la o distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează (recomandabil se va utiliza apă distilată)·         aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate corespunzător·         închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care este dotat autoclavul pe care îl avem la dispoziţie·         conectăm sursa de căldură·         deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în cazanul cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai uşori, vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului)·         închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori·         presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul manometrului; atunci când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldură în aşa fel încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30 minute)·         după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să se răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice·         deschidem lent robinetul de vapori·         deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului·         lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis·         atunci când temperatura ajunge la circa 80ºC putem scoate materialele sterilizate.Prin autoclavare putem steriliza diferite substanţe în soluţie, sticlărie (cu excepţia pipetelor şi lamelor), materiale contaminate din laborator, instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultură, aparate de filtrat etc.2. Tindalizarea (sterilizarea fracţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură umedă care evită depăşirea unei temperaturi de 100ºC. Substanţele de sterilizat se menţin la 56-100°C timp de 30-60 minute, 3 până la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care permit germinarea, după prima încălzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar după răcire are loc germinarea sporilor. În ziua următoare sunt distruse prin încălzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după răcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat în prima zi etc.Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va menţine permanent deschis robinetul de vapori (şi astfel nu se va depăşi în interior temperatura de 100º C), băi de apă sau băi de nisip.Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultură etc.Pasteurizarea şi fierberea nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate în anumite situaţii. Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii în conservarea pentru scurtă durată a unor alimente (lapte, bere etc). Există o pasteurizare joasă (30 minute la 56-65°C), o pasteurizare medie (15 minute la 65-75°C) şi o pasteurizare înaltă (2-5 minute la 85-90°C). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii. Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare. Fierberea timp de 30 minute distruge bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile, dar nu şi sporii bacterieni. Timpul se înregistrează după ce apa a început să fiarbă. Eficienţa acestei metode poate fi crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-2%.

9

Subiecte 21-23.

Bacteriofagul

Bacteriofagii sunt virusuri care parazitează bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7 cu specificitate pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperiţi în 1915. Prof. Mihai Ciucă obţine în anul 1921 primele tulpini lizogene. În 1949 se înfiinţează în România un Centru naţional pentru bacteriofagi. Fagii au o structură mai complexă decât cea a virusurilor obişnuite. Se descriu (Figura nr. 14):1. capul fagului are formă de prismă hexagonală bipiramidală. Conţine ADN dublu catenar helicoidal sau ARN înconjurat de capsida formată din capsomere (înveliş proteic); fagii ARN pot avea un număr mic de gene (ex. 3) în timp ce fagii ADN pot avea până la 150 gene;2. coada fagului are structură proteică, simetrie helicoidală; are rol de adsorbţie, ajutând fagul să penetreze bacteria. Se descriu următoarele formaţiuni:- cilindrul axial;- teaca cozii;- placa bazală (cu croşetele de fixare);- fibrele cozii (formând un strat în jurul tecii cozii).Toate proteinele fagice pot conduce la apariţia de anticorpi, descoperire utilizată în studierea înrudirii dintre diferiţi bacteriofagi.Relaţii bacteriofag-bacterieÎntre bacteriofag şi bacteria gazdă se pot stabili două tipuri de relaţii:- de tip litic sau productiv (Figura nr. 15);- de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16).Relaţiile sunt strict specifice şi sunt mediate de receptori.

Ciclul litic are mai multe etape şi anume:1. Adsorbţia: Ataşarea este specifică. Există receptori strict specifici la nivelul bacteriofagului, ce recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este iniţial reversibilă (prin fibrele cozii), apoi ireversibilă (prin croşetele plăcii bazale). Adsorbţia fagică modifică permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene.2. Penetrarea: Fagul eliberează muramidaza care lizează mureina din peretele bacterian. Teaca cozii se contractă şi antrenează cilindrul axial prin peretele bacterian, ducând apoi la injectarea ADN-ului fagic în citoplasma bacteriană;3. Multiplicarea: După aproximativ 4-5 minute, funcţia ADN-ului bacterian este blocată şi preluată de ADN-ul fagic ce coordonează sinteza componentelor proprii. Se sintetizează un număr însemnat de proteine virale.4. Maturarea (ansamblarea) fagului5. Liza bacteriei (ex. datorită sintezei unor enzime asemănătoare lizozimului) şi eliberarea bacteriofagului matur, virulent.Bacteriile lizosensibile permit adsorbţia, penetrarea şi multiplicarea fagilor virulenţi până la realizarea lizei celulei bacteriene.Evidenţierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene·         în mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunzător duce după câteva zeci de minute (uneori chiar şi câteva zile) la limpezirea mediului;·         pe mediu solid, însămânţat uniform, inocularea fagului litic duce la apariţia unei zone de liză, clară, bine circumscrisă (spotul de bacteriofagie), metodă utilizată în lizotipie;·         dacă se amestecă o suspensie de fagi cu o picătură de cultură (pură) bacteriană, iar tulpina respectivă are receptori potriviţi bacteriofagilor și această suspensie se amestecă cu geloză încălzită putem transfera suspensia într-o placă Petri;

10

·         bacteriofagii infectează bacteriile; după circa 30 minute bacteriile sunt lizate şi eliberează fagii; aceştia difuzează prin geloză şi infectează bacteriile situate în apropiere şi ciclul se reia;·          o parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potriviţi) nu sunt infectate şi în timp se multiplică iar cultura bacteriană opacizează mediul; după circa 18-24 de ore putem observa arii cu celule lizate (transparente) pe un fond produs de cultura bacteriană (bacterii nelizate), aceste arii numindu-se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii virulenţi sunt clare, în comparaţie cu plajele mai puţin clare produse de bacteriofagii temperaţi (fagii virulenţi sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua decât în ciclul litic) Ciclul reductiv (de lizogenizare) are aceleaşi etape, iniţial.După adsorbţie şi penetrare, ADN-ul fagic:·         fie se integrează liniar în cromozomul bacteriei gazdă şi se replică sincron cu aceasta,·         fie se circularizează şi ataşat de membrana citoplasmatică se replică sincron cu diviziunea bacteriei.Bacteria a devenit lizogenă, se reproduce şi transmite descendenţilor fagul latent (profag, fag temperat). În anumite condiţii profagul poate deveni fag virulent. Fagul temperat cel mai bine studiat este bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat (K12).Proprietăţile bacteriei lizogene:1. este imună faţă de un fag omolog profagului;2. pot apărea fenomene importante din punct de vedere genetic:·         transducţia;·         conversia genetică (cu producerea de exotoxine de către unele bacterii lizogenizate, cum ar fi toxina difterică, toxina scarlatinoasă, toxina botulinică de tip C etc);·         recombinarea genetică (atunci când o bacterie parazitată de doi fagi diferiţi, dar înrudiţi, eliberează la sfârşitul ciclului litic pe lângă tipurile parentale şi tipuri de fagi care însumează unele din proprietăţile celor doi fagi parentali) etc.;·         inducţia fagică (sub influenţa unor agenţi inductori, de ex. raze UV, sau spontan, profagul îşi recâştigă virulenţa, devine fag virulent, şi produce liza bacteriei respective).Bacteriile lizorezistente nu permit infecţia cu un fag fie datorită lipsei receptorilor specifici, fie datorită unei stări de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii virulenţi omologi profagului găzduit.Fagul defectiv reprezintă profagul care persistă indefinit în stare latentă (nu se reactivează).Aplicaţii practice ale fenomenului de bacteriofagie:·         fagii virulenţi sunt un element de echilibru ecologic în mediul natural de viaţă al bacteriilor (în nişa ecologică respectivă);·         fagii temperaţi pot avea un rol deosebit în reasortarea materialului genetic al bacteriilor, întrucât atunci când se detaşează (inducţie) de cromozomul bacterian pot antrena porţiuni din ADN-ul bacterian;·         fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorită specificităţii relaţiei fag-bacterie);·         anumite mutante ale fagilor se folosesc în ingineria genetică drept vectori ai ADN recombinant (ex. fagii Charon Lambda);·         fagii reprezintă un model pentru studii teoretice şi practice privind virusurile şi oncogeneza, precum şi alte aspecte ale biologiei moleculare;·         s-au evidenţiat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic şi antigenic par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilităţii la un anumit tip fagic) este una dintre cele mai fine metode de diagnostic bacteriologic şi epidemiologic, pentru identificarea lanţurilor de transmisie a germenilor şi pentru determinarea originii unei epidemii.

11

24. MutaţiaMutaţia reprezintă o modificare accidentală în secvenţa nucleotidică a unei gene, ducând la modificări ale mesajului genetic.Mutaţiile pot apărea la nivelul materialului genetic prin:- substituţii;- inversii;- inserţii;- deleţii.Mutaţia spontanăMutaţiile care apar în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil se numesc mutaţii spontane.Mutaţia indusăMutaţiile care se produc sub acţiunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaţii ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenţii alchilanţi), care acţionează ca agenţi mutageni, se numesc mutaţii induse.Rata mutaţiilor induse este semnificativ mai mare decât rata mutaţiilor spontane.Mutaţia punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur codon.Mutaţiile extinse reprezintă alterări care depăşesc limitele unui codon, putând afecta secvenţe mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaţie poligenică).Mutaţiile regresive (retromutaţii) afectează celule mutante, determinând revenirea acestora la tipul iniţial, restabilind secvenţa nucleotidică originară.Mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a genei, deşi o modificare a secvenţei bazelor nucleotidice persistă.

25. Conjugarea bacteriană

Reprezintă transferul de material genetic de la o bacterie donatoare la una receptoare, realizat prin intermediul unei legături intercelulare directe şi condiţionat de prezenţa în celula receptoare a unui element genetic specializat, cu funcţie de plasmidă desex sau conjugon.Conjugarea este un mecanism de transfer de material genetic frecvent întâlnit la bacteriile Gram negative ( Escherichia, Salmonella, Shigella) şi mai puţin frecvent la celeGram pozitive. Fazele procesului de conjugare bacteriană:-faza de formare a cuplurilor de perechi specific, vizibile la microscopul electronic,instabile la o agitare uşoară; faza implică legarea extremităţii libere a pilului de sex dela celula donatoare F+ (de tip ♂) de un receptor celular situat pe suprafaţa bacterieiacceptoare F- (♀);-în a doua fază cele două celule sunt aduse într-un contact strâns perete la perete, dar şiacest contact este fragil şi se desface prin forţe uşoare de agitare;- faza de formare a unor contacte stabile între pereţii celor două celule, cu formarea deperechi eficiente, rezistente la agitări uşoare.Conjugarea între bacterii F+ şi bacterii F- După formarea cuplului de conjugare apare o incizie monocatenară în structura plasmidei F de sex, produsă de o endonuclează. Semnalul care declanşează această incizie este determinat de interacţiunea dintre extremitatea liberă a pilului şi suprafaţaliberă a celulei receptoare. ADN-ul este transferat în formă monocatenară, începând cuextremitatea 5’. Prin sinteză se reface plasmida cu ADN dublu catenar atât în celuladonoare, cât şi în cea receptoare. Proporţia de celule F- scade rapid într-o popuzlaţie bacteriană.

12

26. Clasificarea substantelor antimicrobiene după mecanismul de acţiune

a). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei peretelui celular; au efect bactericid şi sunt reprezentaţi de antibioticele beta-lactamice (peniciline, cefalosporine, carbapeneme etc), glicopeptidele (vancomicina, teicoplanina), bacitracina, cicloserina, fosfomicina, izoniazida etc;b). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea funcţiei membranei celulare; au efect bactericid şi sunt reprezentaţi de polimixine (polimixină B, colistin), gramicidină, tirocidină, imidazoli, nistatină, amfotericină B etc (ultimele trei fiind medicamente antifungice);c). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei proteice la nivelul ribozomilor; de exemplu aminoglicozidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele (lincomicina, clindamicina), acidul fusidic, streptograminele etc;d). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, de exemplu rifampicina, chinolonele, sulfonamidele, trimetoprimul, pirimetamina, novobiocina etc.

29. Simbioza, comensalism, parazitism

Cu o parte din microorganismele întâlnite organismul stabileşte relaţii de simbioză, convieţuirea fiind folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la care participă unii coliformi intestinali).

Foarte multe din microorganismele care alcătuiesc microflora normală se află în relaţii de comensualism cu organismul, germenii depinzând nutriţional de gazdă, căreia nu îi creează prejudicii. Această convieţuire exprimă însă un echilibru instabil, care poate fi uşor tulburat. Diferiţi factori (ai gazdei, din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor) pot modifica aceste relaţii, astfel încât unele microorganisme din flora normală pot manifesta aspecte patogene - este vorba de microorganismele condiţionat patogene.Relaţia de parazitism tipic apare însă doar atunci când microorganismele se dezvoltă în detrimentul gazdei, cu manifestări clinice mai mult sau mai puţin evidente.Astfel, în cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta decât în organismul gazdei (de exemplu Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae etc). Alte bacterii sunt facultativ parazite, putând trăi şi libere în natură, dar o dată pătrunse în organism stabilesc cu acesta relaţii de parazitism (de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).

31. Exo, endo, anti, ana – toxina. Def, exemeple.

Germenii se multiplică la poarta de intrare şi elaborează exotoxine care produc alterări celulare şi distrucţii tisulare la distanţă, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote şi prin „functio laesa” („toxikon” era otrava în care erau înmuiate săgeţile luptătorilor greci). Din punct de vedere didactic trebuie menţionate următoarele noţiuni:9. 2. 2. 1. ExotoxineleExotoxinele sunt elaborate în general de microbi Gram-pozitivi lizogenizaţi (de exemplu bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat

13

plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar şi de bacili Gram-negativi, prin mecanism cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli). (Tabelul nr. 2)Au structură proteică, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar legării de receptorii celulei gazdă şi internalizării ulterioare a porţiuni enzimatice A (active). Exotoxina nu îşi exercită efectele toxice decât după ce porţiunea A este eliberată din structura iniţială. Sunt secretate în timpul vieţii germenilor. Sunt difuzibile la distanţă. Toxicitatea lor este foarte mare, doza letală fiind de circa 0,1 µg/kg corp (până la 1 ng/kg corp în cazul toxinei botulinice).Au afinitate diferită în funcţie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard, SNC, rinichi în cazul bacilului difteric). Manifestările clinice apar după o perioadă de latenţă (când toxina este deja fixată pe celulele ţintă).Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecţii şi reprezintă urgenţe medicale, toxina putând fi neutralizată numai dacă este liberă în circulaţie.Au putere antigenică mare, faţă de ele apărând anticorpi antitoxină.Un alt exemplu important privind exotoxinele se referă la Tcd A şi Tcd B, produse de Clostridium difficile și care acţionează asupra celulelor intestinului gros, fiind responsabile de o boală diareică uşoară, până la colită fulminantă. Ele produc la acest nivel leziuni microscopice, dar şi leziuni mari, asemănătoare unor plăgi; endoscopic, se vor identifica noduli.Prin degradarea proteinelor Rho, Rac şi Cdc 42, responsabile de reglarea proceselor structurale dependente de polimerizarea actinei, se poate observa la microscopul electronic alterarea microfilamentelor de actină, rezultând marginalizarea nucleului, schimbări în morfologia citoscheletului, dar şi alte modificări (alterarea suprafeţei celulare şi rearanjarea microvililor). (Figura nr. 5)Astfel, modificările produse de toxinele Tcd A şi Tcd B sunt: inflamaţia, creşterea permeabilităţii ţesutului epitelial intestinal, stimularea producerii de chemokine şi citokine, acumularea de neutrofile, producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului, activarea mastocitelor, producerea substanţei P, distrugerea directă a mucoasei intestinale, ruperea joncţiunilor strânse (Zonula occludens), degradarea actinei F. Substanţa P este responsabilă de: activarea neuronilor din submucoasă, eliberarea TNF-α, activarea macrofagelor din lamina propria; este implicată în diareea inflamatorie.9. 2. 2. 2. AntitoxineleAvând structură proteică, exotoxinele sunt imunogene şi determină apariţia de anticorpi specifici (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxică prin cuplare specifică cu toxina. (Tabelul nr. 3) Se pot obţine astfel seruri imune utile în seroterapia specifică. De regulă aceste seruri sunt preparate pe cal şi sunt utile în neutralizarea exotoxinelor (ex. în tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului).Administrarea antitoxinelor trebuie făcută cu precauţie datorită faptului că anticorpii preparaţi pe cal reprezintă în acelaşi timp şi antigene pentru gazda umană, dar în acelaşi timp cât mai curând posibil.Tratamentul acestor entităţi clinice este complex şi nu reprezintă subiectul acestui manual. Administrarea antitoxinelor trebuie făcută după o testare a unei eventuale hipersensibilităţi şi în cazul că aceasta există se recurge la desensibilizare şi abia ulterior la seroterapie (administrarea de antitoxină). O alternativă ar fi administrarea de imunoglobuline umane specifice, dacă acestea sunt disponibile.9. 2. 2. 3. AnatoxineleExotoxinele pot fi detoxifiate într-un anumit interval de timp sub acţiunea conjugată a temperaturii şi formolului. Prin acest procedeu îşi pierd puterea toxică, dar îşi menţin puterea imunogenă şi devin anatoxine. Anatoxinele se utilizează în profilaxia bolilor produse de

14

germenii respectivi (în cadrul vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum şi pentru hiperimunizarea animalelor în scopul obţinerii de seruri antitoxice (antidifteric, antitetanic, antibotulinic etc).9. 2. 2. 4. EndotoxineleEndotoxinele au fost evidenţiate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei externe. Sunt elaborate de aceştia şi apoi incluse în peretele bacterian, eliberându-se în urma distrugerii germenilor. Au structură lipopolizaharidică (LPZ sau LOZ), în constituţia lor intrând acizi graşi, un lipid A şi lanţuri de polizaharide. (Figura nr. 6)Au efecte toxice la nivelul celulelor majorităţii mamiferelor; aceste efecte sunt similare indiferent de specia bacteriană care le eliberează. Toxicitatea lor este ceva mai redusă (în comparaţie cu exotoxinele), dar pot acţiona la mai multe nivele inducând apariţia febrei, leucopeniei, hiperpermeabilităţii vasculare, hipotensiunii arteriale până la colaps, sindromului de coagulare intravasculară diseminată etc. Sunt implicate între altele în apariţia şocului endotoxic (se eliberează o cantitate de endotoxină proporţională cu numărul germenilor distruşi). Studiile arată că mortalitatea în şocul endotoxic este în relaţie destul de directă cu cantitatea de endotoxină / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se identifică 100 unităţi endotoxină / ml de plasmă.Aşa cum am menţionat în capitolul privind structura bacteriană, componenta toxică este reprezentată de lipidul A; totuşi, şi polizaharidul O (structură antigenică) contribuie la patogenitate – s-a dovedit că bacteriile de la care s-a extras polizaharidul O sunt mai uşor distruse prin mecanisme care implică sistemul complement. LPZ aflat în circulaţie se cuplează cu proteine plasmatice (LPS-binding plasma proteins) şi apoi este recunoscut prin intermediul receptorilor CD14 de către monocite şi macrofage. Se activează răspunsul inflamator, coagularea intravasculară, apariţia de hemoragii şi în final poate rezulta şocul. Sunt implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 şi TNF-α care la rândul lor stimulează „cutia Pandorei” şi respectiv producţia de leucotriene şi prostaglandine (cu efect de creştere a fenomenelor inflamaţiei). Sunt activate atât sistemele de coagulare cât şi sistemul complement iar cascadele de reacţii care apar sunt rareori reversibile în urma tratamentului.Puterea antigenică şi imunogenă este mai redusă faţă de exotoxine. LPZ în calitate de mitogen stimulează o activare policlonală a LB, cu secreţia de IgG şi IgM.În afara LPZ sau LOZ, mai sunt şi alte endotoxine, prezente la bacteriile Gram-pozitive:- delta endotoxina prezentă la Bacillus thuringiensis, toxină care nu afectează omul, deoarece acesta nu prezintă enzime şi receptori care să o proceseze;- Listeria monocytogenes produce o substanţă “endotoxin-like” etc.

15