microbiologie alimentară

of 29 /29
MICROBIOLOGIE ALIMENTARĂ CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL ALIMENTELOR Curs: Conf. Dr. Mihai MAREȘ Laborator: Conf. Dr. Mihai MAREȘ Dr. Ramona MORARU

Author: andranechifor

Post on 28-Jan-2016

83 views

Category:

Documents


8 download

Embed Size (px)

DESCRIPTION

lp

TRANSCRIPT

  • MICROBIOLOGIE ALIMENTAR CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL

    ALIMENTELOR

    Curs: Conf. Dr. Mihai MARE Laborator: Conf. Dr. Mihai MARE

    Dr. Ramona MORARU

  • Microbiologia alimentar

    Permite realizarea diferitelor analize i a controalelor indispensabile pentru:

    determinarea calitii/siguranei produselor alimentare

    dar i calitatea igienei mediului de producie i distribuie

  • Domeniul de interes al

    microbiologiei

    alimentare

    Controlul calitii microbiologice - a alimentelor, limitat la controlul produsului finit prin raportare la o norm de calitate microbiologic (igienic).

    -- realizat printr-un ansamblu de activiti ce urmresc controlul materiilor prime brute, n curs de transformare sau a alimentului finit,

    -- al respectrii normelor de fabricaie prin identificarea principalelor puncte critice ale sistemului de producie/distribuie, (activitatea HACCP controlul procesului tehnologic de producie trebuie s permit determinarea punctelor critice).

  • Microbiologie alimentar

    Metodele de analiz aplicate trebuie s fie rapide, fiabile, reproductibile i simple pe ct posibil (s implice costuri sczute).

    Acestea trebuie s consiste n studierea sau determinarea principalilor germeni microbieni ntlnii n alimentele de consum, absena sau prezena n cazul celor patogeni sau responsabili de boli infecioase, numrul germenilor cu risc mai sczut, contaminani sau din flora normala a materiilor prime din compoziie

    Trebuie garantata securitatea consumatorului prin detecia microorganismelor periculoase sau a eventualilor metabolii toxici sau a toxinelor bacteriene i asigurarea unui produs de bun calitate (inclusiv printr-o bun conservare).

    Planul sanitar cuprinde lista bacteriilor periculoase responsabile de mbolnviri dup consumul alimentelor contaminate, ce are tendina de a se mri: Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus enterotoxigenic i Clostridium perfringens la care s-au adugat Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli enteropatogenic sau alte bacterii din genurile Streptococcus, Listeria, Campylobacter, Yersinia, Brucella etc.

  • RISCURILE N LABORATOARELE DE MICROBIOLOGIE

    Riscul manipulrii microorganismelor a cror identitate i patogenitate sunt necunoscute

    Tehnicianul trebuie s cunoasc:

    - germenii manipulai sau cercetai;

    - cile de acces ale acestui germen n organism;

    - cele mai bune metode de manipulare pentru diminuarea acestui risc.

    Microorganismele sunt clasificate n 4 grupe dup riscul potenial pe care l exprim

    Grupa 1. cuprinde microorganisme puin periculoase pentru microbiolog i mediul de lucru;

    Grupa 2. corespunde germenilor cu riscuri moderate pentru manipulator i limitate la spaiul de lucru;

    Grupa 3. este constituit de microorganisme cu nalt risc pentru manipulator i risc moderat pentru spaiul de lucru;

    Grupa 4. corespunde microorganismelor foarte periculoase pentru manipulator i mediul acestuia.

    Cile de ptrundere a germenilor sunt:

    - bucal (ingestie) : pipetare, apropierea de gur a degetelor sau a obiectelor contaminate (igri, stilou, alimente etc.) manipulare aseptic incorect.

    - pe cale respiratorie (trahee,pulmoni) de ctre aerosoli (particule lichide sau nu n suspensie n aer) acetia pot fi generai de omogenizare, centrifugare etc.

    - prin contact cutanat (Brucella, Staphylococcus sau Pseudomonas) sau la nivelul mucoaselor sau organelor precum ochii.

    - prin penetrare subcutanata accidental (prin neptur sau existena unei plgi).

  • C. LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

    SE REALIZEAZ ANALIZELE DE RUTIN (controlul calitativ conform unei norme, evaluarea calitii materiilor prime), dar care s permit evaluarea operaiunilor de transformare sau de preparare

    Cercetarea i depistarea eventualelor puncte critice (HACCP), evaluarea eficacitii tratamentelor antimicrobiene de conservare, ambalaj i igien etc.

    Microorganismele regsite aparin n majoritate grupelor 1, 2 i 3

    Laboratorul trebuie s fie compus din 3 pri principale:

    - laboratorul propriu-zis sau unde se vor realiza analizele

    - sala de preparare a mediilor de cultur

    - sala cu maina de splat materialele din sticl i plastic utilizate pentru analize i unde se depoziteaz materialul curat i steril. Aceast ncpere poate constitui o singur camer mpreun cu cea de preparare a mediilor.

  • Dotrile laboratoarelor de analize: - un spaiu suficient cu o circulaie limitat, cu dou sau trei ncperi; - pereii, plafonul i podeaua uniforme dar fr pericol de alunecare, s nu rein umezeala, uor de curat i dezinfectat; - s fie luminate natural sau lumin artificial de bun calitate. Ferestrele culisate cu montur din aluminium echipate cu draperii rulante; - mese de lucru netede i rezistente;

    - lmpi U.V. dispuse pe plafon i echipate cu temporizator n sala de lucru.

    A se reine c buna funcionare a laboratorului necesit, n special la nivelul manipulrilor, un personal calificat!

    Regulile de igien strict i bun cretere trebuie s fie respectate!

  • D. MATERIALE I ECHIPAMENTE DIN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

    Frecvena i diversitatea studiilor cantitative i calitative necesit:

    1 . Sisteme de sterilizare / dezinfectare i zone sterile

    a) Autoclavul vertical sau orizontal pentru sterilizarea cu vapori a mediilor de cultur, a deeurilor i a materialelor contaminate. Sterilizarea se realizeaz n general la 115 sau 121C timp de 10-30 de minute.

    b) Etuva Pasteur permite sterilizarea uscat a materialului din sticl sau din metal i trebuie s ating o temperatur de 170 - 180C.

    c) Sistemele de micro sau ultrafiltrare prin membrane se utilizeaz pentru medii de cultur, lichide ce nu se pot autoclava sau pentru analiza lichidelor (ex. apa).

    d) Lmpi U.V. prevzute cu temporizator, instalate n ncperi precum i n hote. Personalul trebuie s se protejeze!

    e) Recipiente cu hipoclorit de sodiu. Mediul contaminat, dup citire, se depoziteaz n saci speciali care se autoclaveaz.

    f) zonele de lucru sunt situate n apropiata protecie a becurilor Bunsen sau n hota cu flux laminar care dup funcionare protejeaz fie produsul, fie operatorul, fie ambii. Hotele cu flux laminar sunt clasate n 3 categorii dup funcionare.

  • D. MATERIALE I ECHIPAMENTE DIN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

  • D . 2 . Materiale folosite pentru incubare i prepararea mediilor de cultur

    Termostate ce pot fi reglate la temperaturi ntre 25 i 55 C.

    Pahare anaerobe i echipament necesar pentru controlul atmosferei (catalizator, generator de hidrogen sau de dioxid de carbon, indicator albastru de metilen) pentru studiul germenilor

    strict anaerobi.

    Bains-marie pentru reconstituirea mediului de cultur (100 C) i meninerea n stare lichid (45 - 47 C).

    Un cuptor cu microunde pentru reducerea tratamentelor termice a mediilor.

    Balane (de la 1 -2 kg la 1/10 g i de la 200 g la 1/10 mg) indispensabile pentru prepararea mediilor i a eantioanelor.

    Eprubete de sticl de 16 x 160 sau 18 x 180 mm, tuburi de hemoliz de unic folosin i de recipiente cu volume variabile ce pot fi sterilizate (flacoane Erlenmeyer, )

    Pipete sterile de unic folosin i sisteme de pipetaj automatic.

    Magnei pentru agitarea mediului la nclzire i un repartitor volumetric pentru prepararea i distribuirea mediului de cultur.

  • D . 3 . PREPARAREA EANTIOANELOR I A CULTURILOR MICROBIENE

    Eantioanele sunt aduse n ambalajul de origine (produsele finite), n flacoane sau recipiente sterile (produse la vrac sau prelevate);

    - flacoane, sticle, cutii tetrapack sau instrumente de prelevare a alimentelor solide (tampoane exsudat faringian, pipete harpon etc);

    Prima etap de tratament al eantioanelor, dup prelevare:

    - distribuirea n pri egale n recipiente;

    - omogenizare (punerea n suspensie omogen a microorganismelor) mojar cu pistil, stomacher;

    - centrifugare n tuburi cu capac la 3 pn la 4000 g (va permite decantarea microorganismelor din lichide n scurt timp)

    - Vortex-area permite omogenizarea suspensiei bacteriene n momentul diluiilor seriate.

    Materiale consumabile:

    - plci Petri de policarbonat de diametru 90 mm;

    - tuburi de hemoliz;

    - pipete sterile gradate (1 i 10 ml) sau de pipete automate (de 0,1 sau

    1 ml) pentru vrfuri de polipropilen;

    - pipete Pasteur;

    - pahare de sticl;

    - anse din platin etc.;

    - un aparat pentru numrtoarea coloniilor;

    - echipament de filtrare.

  • D . 4 . Microscopie

    Echipamente de microscopie:

    - microscopul cu accesoriile sale;

    - lame i lamele;

    - colorani i reactivi diveri;

    Ocularele x10 sunt cele mai comune iar microscopul s dispun de obiective x10, x 40 i x100 la imersie;

    - microscopul adaptat cu epifluorescen tehnicile de imuno-microbiologie

    Reactivii colorani cei mai utilizai sunt cei folosii pentru coloraia GRAM (violet de genian, lgol, etanol, fucsin) sau pentru coloraii simple (albastru de metilen).

  • E . TEHNICI GENERALE

    Calitatea produsului alimentar depinde de controlul florei prezente prin mijloace:

    - fizice: temperatur, pH, Wa (water activity);

    - chimice: aditivi cu efecte antimicrobiene;

    - regulile de bun fabricaie (ghiduri de microbiologie GLP good laboratory practice): igiena aparatelor i a personalului lucrtor, calitatea i prospeimea materiilor prime, respectarea normelor i specificaiilor microbiologice,

    Calitatea, dpdv igienic, depinde n special de natura i cantitatea microbiotei bacteriene din produs!

    1) studiul cantitativ al microbiotei bacteriene determinarea proprietilor comune: bacteriile aerobe mezofile ce cresc pe mediu geloz nutritiv, determinarea levurilor i a fungilor filamentoi i a anaerobilor sulfito-reductori.

    - determinarea bacteriilor de origine fecaloid sau teluric;

    - identificarea unui grup de bacterii ce corespunde unei contaminri determinate: coliformi termotolerani i/sau enterococi, stafilococi ce evideniaz contaminarea de origine cutanat etc.

    2) cercetarea orientat pe identificarea bacteriilor patogene: Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Mycobacterium, Listeria, Brucella, Campylobacter, Yersinia , etc.

    Metoda necesit utilizarea metodelor specifice de selectivitate.

    Analizele realizate n mod normal sunt determinarea coliformilor sau a microbiotei totale.

    Microbiologul trebuie s fac diferena ntre noiunea cantitativ i calitativ a microbiotei normale a produsului sau a materiilor prime (microoganisme obinuite) i o microbiot contaminant definit prin riscul pe care l presupune unei anumite categorii de consumatori.

  • E.1. Prelevarea probelor

    Eantioanele sunt separate n 5 probe de 100g, prelevate steril i identificate.

    Din alimentele solide se recolteaz de pe suprafa i din profunzime, iar din lichide dup

    omogenizare.

    n cazurile de TIA, microbiologul va identifica germenii de risc (patogeni, toxigeni) i toxinele

    acestora la suprafaa produsului.

    Eantionarea - se face reprezentativ pentru a identifica prezena germenilor patogeni sau a

    toxinelor distribuite omogen n aliment sau atunci cnd comercializarea produsului depinde de

    calitatea microbiologic n relaie cu normele impuse de legislaie.

    Principiul metodelor de eantionare dup International Commission on Microbiological

    Specifications for Foods: un eantion are rezultate nesatisfctoare dac conine microorganisme

    periculoase sau germeni n numr superior unei limite, de unde pot deveni cu potenial de risc.

    n metod simbolul m reprezint ce permite repartizarea eantioanelor n 2 grupe: cele acceptabile

    (valori m) i inacceptabile (valori m). Pentru unele microorganisme periculoase m poate fi egal

    cu 0.

    Cnd un microorganism dat este tolerat ntr-un aliment 3 categorii de eantioane sunt definite:

    - categoria 1 (acceptabil fr rezerve)

    - categria 2 (acceptabil dar cu restricii)

    - categoria 3 (inacceptabil).

  • m separ 1 categorie de a 2-a categorie i M a 2-a de a 3-a

  • Germenii sunt clasai n funcie de riscul pe care l exercit asupra consumatorului:

    - germeni cu risc sever (Clostridium botulinum, Salmonella typhi, S. paratyphi,Shigella dysenteriae, Vibrio parahaemolyticus , Brucella

    melitensis, Listeria monocytogenes , Clostridium perfringens type C, virusul

    hepatitei A).

    - germeni cu risc sczut, dar cu putere mare de difuzare (Staphylococul

    enterotoxinogen,Salmonella typhimurium i alte serotipuri, Shigella spp., Vibrio parahaemolyticus , Escherichia coli enteropatogenic, Streptococul beta hemolitic).

    - germeni cu risc sczut, dar fr putere de difuzare (Bacillus cereus, Brucella abortus,Clostridium perfringens,Salmonella arizonae, Francisella

    tularensis,Yersinia enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa ,

    Campylobacter jejuni , etc...).

  • Conservele trebuie s ndeplineasc condiiile la probele de verificare a stabilitii / sterilitii:

    - se incubeaz 5 eantioane la 37C timp de 7 zile (sau la 30C timp de 10 zile) i la 55C timp de 7 zile. Dac dup expirarea timpului se observ bombarea sau deteriorarea, se va face frotiu (pH-ul nu trebuie s depeasc 0,5 ntre probele incubate i cele martor).

    Prin microscopie (dup etalarea unui volum de 10 l de produs fixat i colorat cu albastru de metilen) se observ n 20 de cmpuri , plecnd de la cutia incubat (n) i la cea martor (n1), n / n1 trebuie sa fie inferior la 100 .

  • 3) metoda de eantionare pentru identificarea unui numr sczut de microorganisme

    Se poate determina numrul eantioanelor de analizat dintr-un lot n funcie de gradul de siguran cercetat:

    n = log ( 1 - p )

    log ( 1 - d)

    p - este probabilitate de decelare a microorganismului (n general p = 0,95)

    d - este procentajul de erori permis la lotul ntreg (inferior la 0,05).

    Se poate realiza o prelevare de eantioane satisfctoare dpdv statistic cu

    n- numrul de eantioane de analizat iar N numrul total de diviziuni al produsului de analizat. Aceast metod duce la un numr prea mare de analize, n special cnd n este superior de 10. 10.

    E - 1 - b. Frecvena eantionrii

    Probele trebuie repatizate n timp i n funcie de nivelul de producie i riscurile de contaminare.

  • E - 1 - c. Condiiile de prelevare

    - Probele trebuie prelevate respectnd condiiile de sterilitate; - probele se aduc n condiiile iniiale fr contaminare aditiv; - din lichide se prelev proba de la diferite nivele, dup omogenizare; - se utilizeaz instrumentar steril; - flacoanele din sticl, metal sau plastic, sterilizate, trebuie adaptate la dimensiunile probei i se nchid cu capac ermetic.

    Prelevarea de la suprafa i nsmnarea n sol. salin sau bulion tripton-soia salin 10 ml.

  • 2) Prelevarea produselor lichide

    Tehnica variaz n funcie de produs, volumul i forma coninutului.

    Se omogenizeaz bine nainte de prelevarea cu pipeta a volumului necesar de analiz

    3) Prelevarea produselor solide

    n funcie de produs, prelevarea se face cu cuitul, cu sonda n cazul brnzeturilor sau cu pipeta. Se ndeprteaz coaja/membrana i se asigura c proba este reprezentativ pentru produs.

  • E . 2. Tratamentul eantioanelor E - 2 - a. Transferul eantioanelor n laborator

    E - 2 - b. Prepararea eantioanelor

    Din prelevatul solid sau lichid se prepar o suspensie din care se vor face analizele microbiologice.

    Proba se omogenizeaz sau se obine broiajul ntr-un volum de diluant prima diluie.

  • Prepararea eantioanelor din brnzeturi omogenizarea, triturarea

  • Din broiajul obinut, prima diluie, se va proceda la diluiile seriate (9ml de sol. salin cu 1 ml de broiaj)

  • E - 3. Soluiile folosite pentru diluii seriate

    Se folosesc soluii care s nu inhibe sau s altereze microorganismele

  • E - 4. Reanimarea microorganismelor

    Pe parcursul proceselor tehnologice microorganismele sufer modificri ale proprietilor fiziologice (deshidratate, cldur, frig etc.);

    Se impune o etap de reanimare nainte de trecerea pe medii selective care conin diveri inhibitori.

    E - 4 - a. Reanimarea n mediu lichid

    - se poate realiza n prima etap de analiz, cnd probei i se adaug soluia de diluie.

    Dac perioada de reanimare este mai mare dect cea de laten, se va produce o multiplicare a germenilor nealterai ce va determina, n funcie de tehnica de numrare, la o supraevaluare a numrului de germeni.

    Se folosesc medii lichide neselective, n diferite diluii apoi se nsmneaz n medii selective.

    E - 4 - b. Reanimarea pe mediu solid

    Cnd numrtoarea se face pe mediu solid, reanimarea poate fi obinut printr-o precultur pe un mediu agar neutru favorabil cu un timp de incubare superior timpului de laten, dar fr formarea coloniilor macroscopice vizibile.

    Dup reanimare, se toarn al doilea strat de agar selectiv.

  • E - 5. Tehnici de diluie

    - eprubete/tuburi cu cel puin 9 ml de soluie steril