MICROBIOLOGIELaborator 1/09.03.2012

MICROSCOPUL

Microscopul este un instrument optic utilizat pentru studierea obiectelor de dimensiuni reduse. Exista mai multe categori:

- microscop fotonic, cel mai des utilizat în laboratoarele de specialitate;- microscop cu fluorescenţă, utilizat pentru studiul virusurilor;- microscop cu câmp întunecat;

Microscopul fotonic

Include:A. Partea mecanică:1. Picior sau talpa microscopului, are forma ovală sau de potcoavă.2. Braţul sau coloana, are forma verticală sau încurbată, se articulează inferior cu

piciorul şi superior cu tubul microscopului.3. Tubul microscopului are formă cilindrica şi se articulează inferior cu braţul si

superior cu ocularele.4. Revolverul se articulează superior cu tubul şi este alcătuit din 2 calote hemisferice

– una fixă şi una mobilă.5. Măsuţa port obiect – are formă pătrată, dreptunghiulară sau ovală. În mijloc

prezintă un orificiu care facilitează pătrunderea razelor luminoase către preparatul de cercetat. Pe partea superioară există un sistem de fixare a preparatelor – cavaleri sau cărucior sau car mobil.

6. Vize – viza macrometrică care se utilizează atunci când se lucrează cu oculare cu putere redusă;

- viza micrometrică care se utilizează atunci când se lucrează cu oculare cu putere mare.

B. Partea optică:1. Sistemul de iluminat: - oglinda

- condensatori- diafragma- iris

2. Ocularele – au putere de 7x, 10x, 20x3. Obiectivele – au putere de 20x, 40x, 60x.

Grossisment = puterea de mărire a microscopului. Se notează cu G şi se calculează cu formula:

G = PO Po + aunde:

PO = putere de mărire a oculalelorPo = putere de mărire a obiectivelora = apertura

1

Apertura se calculează cu formula:

a = i ──── unde:

i = indice de refracţiesin = < microscopului

Instrumentar folosit pentru obţinerea preparatelor microbiologice

- Pipeta Pasteur- Ansa de însămânţare- Acul- Plăci Petri – de sticlă sau de plastic- Lame de sticla- Lamele- Etuva

2

MICROBIOLOGIELaborator 2/16.03.2012

STERILIZAREA ŞI DEZINFECŢIA

Sterilizarea reprezintă operaţia prin care se distrug microorganismele de pe diverse suprafeţe, obiecte sau substraturi nutritive.

Dezinfecţia reprezintă operatia prin care se distrug microorganismele de pe diferite suprafeţe, obiecte sau substraturi cu ajutorul substanţelor antiseptice sau dezinfectante.

Septic sau infectat înseamna contaminat cu microorganisme.Aseptic înseamna fără microorganisme.Asepsia reprezintă totalitatea metodelor şi mijloacelor prin care se previne

contaminarea cu microorganisme a diferitelor suprafeţe, obiecte, etc.

Clasificarea metodelor de sterilizare

1. Sterilizarea prin căldură uscată: - încalzire la roşu - flambare - incinerare - sterilizare cu aer cald2. Sterilizare prin caldură umedă: -fierbere - pasteurizare - ultrapasteurizare - tindalizare - autoclavare3. Sterilizare cu ajutorul factorilor mecanici: - filtrare - centrifugare4. Sterilizare cu ajutorul radiaţiilor: - radiaţii ionizante: , , , - radiaţii UV

Sterilizarea prin caldură uscatăÎncalzirea la roşu presupune ţinerea obiectelor de sterilizat în partea suprerioară a

flăcării becului de gaz timp de câteva secunde până la încălzirea la roşu. Este folosită pentru sterilizarea: acelor, anselor, spatulelor.

Flambarea reprezintă trecerea obiectelor de sterilizat prin partea superioară a flăcării timp de câteva secunde. Este folosită pentru sterilizarea: eprubetelor, pipetelor, lamelor, etc.

Incinerarea se realizează în cuptoare speciale numite crematorii, la temperaturi cuprinse între 300 – 50000C. Prin această metodă se ard cadavrele animalelor de experienţă, diverse materiale patologice: vată, tifon, etc.

Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă la temperaturi cuprinse între 100-1200C. Prin această metodă se sterilizează sticlăria care în prealabil se spală cu detergent, se clăteste, se lasă să se usuce şi se înveleşte în hârtie. Materialele se introduc în aparat, se reglează temperatura şi timpul, iar operaţiunea se considera încheiată atunci când se observă îngălbenirea hârtiei. Materialele se consideră sterile atâta timp cât hartia rămâne intactă.

3

Sterilizarea prin caldură umedăFierberea se realizează în aparate speciale – sterilizatoare, timp de 30 minute din

momentul începerii fierberii. Aceasta este o metodă incompletă de sterilizare, fiind distruse numai formele vegetative nu şi cele sporulate. Prin această metodă se sterilizează instrumentarul care se foloseşte ca steril imediat după încheierea operaţiunii.

Pasteurizarea este o metodă incompletă de sterilizare, fiind distruse numai formele vegetative nu şi cele sporulate. Are aplicaţii în industria alimentară, a cărnii, a laptelui, a vinului. Există 3 tipuri de pasteurizare:

- pasteurizare joasă – 600C timp de 30 minute- pasteurizare medie – 70-800C timp de 10-20 minute- pasteurizare înaltă - 100-1100C timp de câteva secunde.Ultrapasteurizarea constă în injectarea vaporilor de apă sub presiune în masa lichidelor

la 1300C.Tindalizarea este metoda completă de sterilizare. Se distrug atât formele vegetative cât

si cele sporulate. Se aplica pentru sterilizarea mediilor de culturî sau a amestecurilor de substanţe ale căror componente nu rezistă la temperaturi înalte. Constă în aplicarea a 3 tratamente termice la 56 – 1000C, timp de 3 ore, la interval de 24 ore.

4

MICROBIOLOGIELaborator 3/23.032012

Autoclavarea este metada de sterilizare completă fiind distruse atât formele vegetative cât şi cele sporulate. Se realizează în aparate speciale numite autoclave la temperatura de 1300C. Prin această metodă se sterilizează mediile de cultură şi sticlăria de laborator.

Sterilizarea cu ajutorul radiaţiilorSterilizarea cu ajutorul radiaţiilor UV Se folosesc radiaţii cu lungimea de unda =

2540 – 2800 Å. Se obţin prin descărcarea a doi electrozi amplasaţi în atmosferă de vapori de mercur la presiune joasă. Metoda se aplică pentru sterilizarea aerului din laboratoare.

Sterilizarea cu ajutorul radiaţiilor ionizante: , , Se folosesc în industria alimentară; prezintă efect de penetrare puternic, iar în microbiologie se aplică pentru sterilizarea plăcilor Petri.

Sterilizarea cu ajutorul factorilor mecaniciFiltrarea este operaţia de separare a fazei solide de faza lichidă sau gazoasă a unui

amestec la trecerea acestuia printr-un material poros. In acest scop se folosesc diferite tipuri de filtre: Sietz, Chamberland sau membrane.

Centrifugarea reprezintă operaţia de separare după densitate a componentelor unor suspensii sub acţiunea simultană a forţei centrifuge şi a gravitaţiei. Se utilizează pentru separarea vitaminelor, antibioticelor, toxinelor de microorganismele care le-au produs; pentru separarea virusurilor de substraturile pe care acestea s-au dezvoltat.

Sterilizarea cu ajutorul substanţelor chimiceSe folosesc substanţe dezinfectante sau antiseptice care acţioneaza diferit în funcţie de

concentraţia în care se găsesc.Dacă sunt în concentraţie mică şi dacă acţionează asupra întregii flore efectul se

numeşte microbiostatic (microorganismele sunt inactivate, urmând ca atunci când se reiau condiţiile normale acestea să-şi reia metabolismul). Efectul se numeşte bacteriostatic dacă se acţioneaza numai asupra bacteriilor care sunt “inactivate”, dacă se acţionează asupra fungilor se numeşte fungistatic, iar dacă se acţioneaza asupra virusurilor – virulistatic.

Dacă sunt în concentraţie mare efectul se numeşte microbicid şi se acţionează asupra întregii flore. Microorganismele sunt distruse urmând ca atunci cînd se reiau condiţiile normale, acestea nu mai sunt capabile să-şi reia metabolismul. Dacă se acţioneaza numai asupra bacteriilor efectul se numeste bactericid, virusurilor – virulicid şi fungilor – fungicid.

Recoltarea, ambalarea şi expedierea probelor în vederea efectuării examenului microbiologic

Probă înseamna orice produs trimis către laborator în vederea executării unor analize.Pentru obţinerea unor rezultate corecte este necesar să se respecte urmatoarele:- probele se recoltează în condiţii de strictă asepsie (în recipiente sterile cu

instrumentar steril);- după recoltare probele se sigilează, se etichetează şi se completează nota de

însoţire. Recoltarea probelor de sânge se realizează diferit, în funcţie de talia animalelor, din

vena safenă, auriculară, axilară sau jugurală – o cantitate de 15 – 20 ml.

5

Recoltare secreţie excreţii – nazale, oculare, etc – se folosesc tampoane de vată sterile fixate pe tije metalice sau de lemn.

Recoltare LCR (lichid cefalorahidian) – oferă informaţii privind existenta eventualelor infecţii cu localizare meningienă (meningeală) – se face prin puncţie în zona lombară sau occipitală.

Recoltarea materialului purulent (puroi) – din leziuni închise sau din leziuni deschise. Se prefera recoltarea din leziuni închise recent (cele vechi pot fi sterile). Se realizează după dezinfecţia zonei cu o pipetă Pasteur sau seringa cu ac. Recoltarea din leziuni deschise se face prin raclare pe lama bisturiului.

Recoltarea probelor de lapte se realizează după o prealabilă igienizare a ugerului, din toate cele 4 sferturi diferit, funcţie de scopul urmărit. Primul jet se îndepartează datorită încărcării microbiene ridicate.

Dacă se suspectează mamita streptococica recoltarea se va realiza la începutul mulsorii. Dacă se suspectează prezenta Mycobacterium tuberculosis recoltarea se realizează de la sfârşitul mulsorii, iar dacă se suspectează existenta germenilor din genul Brucella se va preleva proba de la mijlocul mulsorii.

Recoltarea probelor de urină se realizează în timpul micţiunii ăn recipiente sterile sau prin cateterismul uretrei.

Recoltarea probelor de fecale se realizează după eliminare, în recipiente sterile sau cu ajutorul tampoanelor de vată sterile direct din rect în cazul scaunelor moi.

Recoltarea organelor se realizează înainte de deschiderea tubului digestiv pentru a se evita contaminarea.

Recoltarea os lung se realizează în funcţie de talia animalului: de la animale de talie mică se recoltează femurul, iar la cele de talie mare – metacarpul, metatarsul.

Recoltarea probelor de carne – probele trebuie a aibă forma de cub cu latura de 8 – 10 cm – obligatoriu trebuie să includă toate tipurile de ţesut (pentru că repartizarea germenilor este inegală).

Dacă se suspicioneaza prezenta anumitor germeni se vor recolta probe din locul în care aceştia se localizează cu predilecţie (splina în cazul antraxului la rumegătoare).

Recoltarea probelor de apă – se alege un robinet branşat la reţeaua centrală, se flambează gura robinetului şi se recoltează 5 – 10 ml într-un recipient steril.

Recoltarea probelor de furaje – probele trebuie să reprezinte cât mai fidel lotul din care fac parte. Se recoltează în recipiente sterile.

6

MICROBIOLOGIELaborator 4/04.05.2012

Mediile de cultură

Prin mediu de cultură se înţelege un amestec de substanţe care facilitează dezvoltarea celulei bacterine în afara nişelor ecologice naturale.

Condiţii de utilizare:-să prezinte un anumit pH;-să prezinte o anumită umiditate;-să asigure necesarul energetic pentru desfăşurarea reacţiilor de creştere, sinteză,

mobilitate;-să conţină ioni de Na, K, Ca, Mg, Fe, Co, etc;-să prezinte un anumit conţinut în substanţe minerale, vitamine, o anumită concentraţie

de NaCl (sare);-să fie sterile şi protejate de acţiunea luminii;-să asigure condiţii de aerobioză necesare dezvoltării bacteriilor aerobe şi anaerobioză

– pentru dezvoltarea anaerobienilor.ClasificareExistă mai multe criterii de clasificare:1. Funcţie de consistenţă: -medii lichide: bulionul (din carne); -medii solide: agar (geloza) – plăci Petri sau eprubete; -medii semisolide: agar moale; -medii bifazice: cartof glicerinat.2. Funcţie de tipul respirator al bacteriilor care se cultivă: -medii aerobe: bulion, agar; -medii anaerobe – pot fi aceleaşi cu cele aerobe, cu condiţia

adăugării în compoziţia lor a unor substanţe capabile să reducă oxigenul: bulionul VF (bulion cu ficat care conţine cisteină care reduce oxigenul).

3. Funcţie de compoziţia chimică: -medii naturale: lapte turnesolat; -medii sintetice care prezintă în compoziţie un

substrat cu structură chimică cunoscută; -medii semisintetice.4. Funcţie de frecvenţa şi scopul utilizării în laborator: -medii uzuale – folosite frecvent; -medii speciale: -medii de identificare – care permit

identificarea speciilor bacteriene pe baza unor caractere biochimice sau de patogenitate; -medii de izolare: -medii elective; -medii selective; -medii de diagnostic diferenţial; -medii de îmbogăţire. -medii de conservare; -medii de transport.Mediile elective sunt sărace în substanţe nutritive şi nu conţin inhibitori de creştere.Mediile selective conţin inhibitori de creştere şi permit diferenţierea speciilor patogene

pe baza caracterelor de patogenitate.

7

Mediile de diagnostic diferenţial permit identificarea speciilor bacteriene pe baza unor caractere biochimice. Exemplu: mediul cu acetat de plumb – hidrogenul sulfurat produs de bacterii reacţionează cu acetatul de plumb din mediu şi rezultă sulfura de plumb de culoare neagră.

Mediile de îmbogăţire se folosesc pentru identificarea unei specii bacteriene din cadrul unui amestec heterogen cu număr de germeni redus: Müller-Kauffmannn pentru salmonella şi Löwenstein pentru tuberculosis.

Mediile de conservare sunt sărace în substanţe nutritive.Mediile de transport sunt sărace în substanţe nutritive şi menţin raportul numeric

existent între germeni.

Examen bacterioscopic

Pentru vizualizarea celulelor bacteriene şi a caracterelor morfologice ale acestora la microscop, se execută 2 tipuri de preparate: preparate proaspete şi preparate uscate (frotiuri).

Preparatele proaspete se obţin prin doua tehnici:a) examinare între lamă şi lamelă – se execută din diverse lichide patologice şi

constă în depunerea unei cantităţi reduse de probă pe suprafaţa unei lame curate, uscate şi degresate peste care se aplică o lamelă;

b) examinare în picatură suspendată – se folosesc lamele cu godeu. Este o metodă pentru studierea mobilităţii bacteriene. Se aplică aceea tehnică ca la examinarea între lamă şi lamelă.

8