Microbiologie Virusologie.inddG H
ID U
Tel./ Fax 0256 495 210
e-mail: evb@umft.ro
Referent tiinific: Prof. univ. dr. Andrei Motoc
Colecia: GHIDURI I ÎNDRUMTOARE DE LABORATOR
Coordonator colecie: Conf. univ. dr. Adrian Vlad
Indicativ CNCSIS: 324
© 2021 Toate drepturile asupra acestei ediii sunt rezervate.
Reproducerea parial sau integral a textului, pe orice suport, fr acordul scris al autorilor este
interzis i se va sanciona conform legilor în vigoare.
ISBN 978-606-786-238-6
3
Cuprins
1. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de coci Gram pozitivi ai
cavitii orale ........................................................................................................... 5
1.1. Genul Staphylococcus .................................................................................... 5
1.2. Genul Streptococcus ..................................................................................... 10
2. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de coci gram negativi i
bacili gram pozitivi aerobi ai cavitii orale ....................................................... 15
2.1. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de coci gram negativi ....... 15
2.2. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de bacili gram pozitivi
aerobi ................................................................................................................... 18
3. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de enterobacterii ............... 25
3.1. Genul Escherichia ........................................................................................ 30
3.2. Genul Klebsiella ........................................................................................... 33
3.3. Genul Proteus ............................................................................................... 35
4. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de bacili Gram negativi non
fermentativi i bacteriile anaerobe ...................................................................... 39
4.1. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de bacili Gram negativi non
fermentativi ......................................................................................................... 39
4.2. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de bacili Gram pozitivi
anaerobi sporulai i alte bacterii anaerobe ......................................................... 41
5. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de germeni din genurile
Treponema, Mycobacterium .................................................................................. 50
5.1. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de germeni din genurile
Treponema ........................................................................................................... 50
5.2. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de germeni din genurile
Mycobacterium .................................................................................................... 56
8. Diagnosticul de laborator în hepatite i SIDA ................................................ 68
8.1. Hepatita B ..................................................................................................... 68
8.2. Hepatita C ..................................................................................................... 73
Bibliografie ............................................................................................................ 83
coci Gram pozitivi ai cavitii orale
1.1. Genul Staphylococcus
Stafilococii sunt coci Gram pozitivi, aezai în ciorchine, imobili i nesporulai.
Genul Staphylococcus are 38 de specii, dintre care 18 specii se izoleaz de la om.
Stafilococii sunt ageni etiologici în peste 80% din infeciile supurative
întâlnite în practica medical. Manifest afinitate pentru esutul dermic i pentru
anexele pielii, fapt care explic de ce stafilococii provoac mai ales infecii la nivelul
tegumentelor i anexelor pielii, îns ei pot invada practic orice esut sau organ.
Principalele specii ale genului sunt: Staphylococcus aureus, S. epidermidis i
S. saprophyticus.
determin majoritatea infeciilor stafilococice umane.
Localizrile i manifestrile infeciei stafilococice:
1. Tegumente i esut celular subcutanat: foliculite, furuncule, hidrosadenite,
abcese, flegmoane.
3. Rinofaringe i caviti adiacente: faringite, angine, sinuzite, otite supurate,
mastoidite.
5. Aparat genital: mastite, metrite, anexite, septicemii postabortum.
6. Aparat urinar: prostatite, cistite, pielonefrite, abcese renale.
7. Aparat cardiovascular: flebite, pericardite, endocardite.
8. Sistem nervos central: meningit i abcese cerebrale.
9. Fanere: panariii i abcese.
10. Sindromul de oc toxicoseptic (TSST), cauzat de o toxin stafilococic
particular numit Toxic Shock Syndrome Toxin.
Infecia nosocomial care este condiionat de existena purttorului de
stafilococ coagulazo-pozitiv (la nivelul rinofaringelui) într-o colectivitate (spital).
Infeciile cu Staphylococcus aureus meticilino-rezistent, cu rezisten multipl
la antibiotice (betalactamine, macrolide, aminoglicozide, cotrimoxazol), sunt greu
de controlat în condiiile evoluiei în mediul spitalicesc.
Unii stafilococi coagulazo-negativi se încadreaz în categoria oportunitilor.
Acest aspect s-a conturat în relaie direct cu utilizarea pe scar larg a procedurilor
medicale invazive (sonde, catetere) i a inseriilor protetice (unturi, valve cardiace,
proteze vasculare i articulare). Staphylococcus epidermidis se constituie în cauz
major de infecii nosocomiale în seciile de nou-nscui i oncologie, dar i în
serviciile cardiologice (infecii de pacemaker, endocardita asociat cu valve
protetice). Staphylococcus saprophyticus constituie un agent etiologic implicat în
infecii urinare la femei tinere, iar la brbai în uretrite nespecifice i prostatite.
6
Recoltarea probelor patologice se face în funcie de localizarea infeciei. Examenul
direct din produsul patologic are valoare orientativ în anumite situaii i poate
evidenia în coloraia Gram, coci Gram pozitivi, aezai mai frecvent izolat i mai rar
sub aspectul caracteristic în ciorchine (este util din puroi, urin, LCR, sânge).
Izolarea: se efectueaz pe geloz-sânge iar în cazul probelor patologice
polimicrobiene sau pentru alimente se utilizeaz mediul Chapman (mediu
hiperclorurat cu manitol).
Identificarea : proprieti morfotinctoriale: în frotiul colorat Gram se pun în eviden coci
Gram pozitivi aezai în ciorchine.
proprieti de cultur: pe mediul Chapman, S. aureus degradeaz manitolul
i provoac virarea culorii mediului din roz-rou în galben; pe geloz sânge S. aureus
se dezvolt sub form de colonii S înconjurate de un halou de liz; pe geloz sânge
se pot observa colonii de tip S, frecvent pigmentate în galben-auriu.
proprieti biochimice: stafilococii produc catalaz; degradeaz glucoza pe
cale oxidativ i fermentativ; Staphylococcus aureus degradeaz manitolul pe
mediul Chapman, în timp ce S. epidermidis nu utilizeaz substratul amintit.
proprietile de patogenitate ale S. aureus se bazeaz pe capacita- tea
acestora de a elibera enzime i toxine, a cror activitate poate fi evideniat prin teste
de patogenitate “in vivo” sau “in vitro”.
Figura 1. Staphylococcus sp.: Examen microscopic din cultur-coloraie Gram
7
Figura 2. Colonii de Staphylococcus aureus – Mediu de cultur Chapman
Figura 3. Mediu Chapman a) stafilococi coagulazo-pozitivi i b) stafilococi
coagulazo-negativi
8
geloz sânge
Determinanii de patogenitate sunt enzime extracelulare i toxine stafilococice.
- Coagulaza, principalul factor de patogenitate la S.aureus, determin formarea
din plasm a unui coagul împiedicând aciunea în focarul infecios a factorilor de
aprare; la S.aureus este prezent coagulaza liber evideniabil prin reacia în tuburi
i coagulaza legat evideniabil prin reacia pe lam.
Figura 5. Testul coagulazei – S. aureus
9
progresia stafilococilor în esuturile învecinate; se poate pune în eviden folosind
un mediu de cultur preparat cu plasm uman oxalatat (mediul opac se va clarifica
în jurul coloniei).
- hemolizinele cu aciune hemolitic i dermonecrotic se pun în eviden
în culturi pe medii cu sânge.
- enterotoxinele, elaborate în mai multe variante antigenice, sunt identificabile
prin reacie de imunodifuzie în gel.
Lizogenie i lizotipie fagic. Susceptibilitatea tulpinilor de stafilococ la
aciunea litic a bacteriofagilor este important pentru caracterizarea anumitor
particulariti ale diferitelor sue (bacteriile din grupul 2 fagic au afinitate pentru
esutul dermic, cele din grupul 3 fagic sunt penicilino i meticilino rezisten- te).
Lizotipia fagic se urmrete pe agar nutritiv pe care s-a însmânat în pânz tulpina
de identificat, care a fost apoi supus aciunii diferiilor fagi.
Antibiograma - finalizeaz diagnosticul i este esenial pentru conturarea
unei scheme terapeutice eficiente. Administrarea la întâmplare a antibioticelor poate
conduce la selectarea unor tulpini multirezistente.
În cazul infeciilor tegumentare recidivante se poate indica prepararea i
administrarea autovaccinului.
10
1.2. Genul Streptococcus Genul Streptococcus cuprinde coci Gram pozitivi grupai în perechi sau lanuri
de dimensiuni variabile, catalazo-negativi, imobili, nesporulai. Streptococii sunt
prezeni în ap, aer, sol sau ca i comensali la nivelul tegumentelor sau mucoaselor
la om i la animale.
Clasificarea streptococilor se poate face dup mai multe criterii, cele mai
importante fiind: producerea sau nu a hemolizei pe geloz sânge i structura
antigenic determinat de antigenele din peretele bacterian.
Infecii streptococice Infecii cu streptococi de grup A (Streptococcus pyogenes):
• infecii acute: respiratorii i cutanate
infeciile respiratorii:
0 acute eruptive = scarlatina
ectima (un impetigo al adultului cu localizare la membrele inferioare), erizipelul (o
dermo-hipodermit acut localizat mai frecvent la membrele inferioare i caracte-
rizat prin febr - 39°C, frison, placarde cutanate eritematoase i adenopatie
regional).
pneumonii, mastoidite, otite, sinuzite.
• complicaii tardive nesupurative:
purpura reumatoid, eritem nodos, coreea Sydenham.
Infecii cu streptococi de grup B (Streptococcus agalactiae):
• infecii neonatale, la nou-nscuii din mame infectate sau urmare a
contaminrii nosocomiale.
• septicemia se asociaz frecvent cu avortul septic.
• alte infecii: otite, traheobronite, infecii urinare etc.
Infecii cu streptococi de grup D i cu Enterococcus spp:
• infecii urinare, genitale i perineale, endocardite, supuraii ale plgilor
chirurgicale, otite i sinuzite, apendicite i peritonite, infecii biliare.
Infecii cu streptococi de grup C i G (comensali ai faringelui):
• infecii ale tractului respirator superior, infecii cutanate, infecii genitale,
artrite purulente, meningite.
11
separat la capitolul Microbiologia cavitii orale).
Diagnosticul de laborator al infeciilor streptococice
Diagnosticul bacteriologic: Recoltarea probelor patologice se face în funcie de localizarea infeciei.
Examenul microscopic direct se face în frotiul colorat Gram. Uneori nu are
utilitate, alteori poate da informaii orientative, în timp ce în unele situaii poate avea
o mare valoare diagnostic (de exemplu – în cursul unei pneumonii, un frotiu din
sput care pune în eviden diplococi Gram pozitivi capsulai având form de vârf
de lance, ne orienteaz spre diagnosticul unei pneumonii pneumococice).
Izolarea • pe agar sânge - pentru majoritatea streptococilor.
• pe agar nutritiv pentru enterococi.
• pe agar chocolat (sau agar sânge), cu incubare în atmosfer cu 10% CO2,
pentru pneumococi.
variabile; pentru Streptococcus pyogenes aspectul frotiului este caracteristic din
culturile dezvoltate în bulion glucozat.
proprieti de cultur: Streptococcus pyogenes formeaz pe agar sânge
colonii de tip S, punctiforme, înconjurate de o zon de hemoliz complet (beta
hemoliz).
12
Streptococcus pneumoniae formeaz colonii de tip S (tulpinile încapsulate),
înconjurate de o zon de hemoliz α de culoare verzuie pe geloza sânge i respectiv
galben-verzuie pe geloza chocolat.
Enterococii formeaz colonii de tip S nehemolitice pe geloza sânge, în timp ce
pe mediul bil-esculin apar negre ca urmare a hidrolizei esculinei.
Figura 9. Streptococcus pyogenes – geloz sânge (SV); diferena între S. pyogenes
i S. aureus (SP)
proprieti biochimice: sunt lipsite de importan pentru identificarea
streptococilor piogeni; sunt utile pentru identificarea enterococilor i pneumococilor.
• enterococii (i streptococ grup D) se dezvolt la temperaturi între 10-
40°C, în timp ce pneumococii necesit temperatura de 37°C (cu
incubare în atmosfera cu 10% CO2).
• enterococii se dezvolt pe medii cu: 6, 5% NaCl, 40% bil i 0, 1%
albastru de metilen; pneumococii nu se dezvolt pe astfel de medii i în
plus se lizeaz în prezena bilei.
• pneumococii sunt extrem de sensibili la aciunea optochinului.
proprieti antigenice:
• grupele antigenice importante pentru patologia uman sunt: A, B, C,
D, F, G.
13
anigenic A;
testul CAMP pentru încadrarea în grupul antigenic B
(tulpinile streptococice din acest grup produc factorul CAMP i
mresc zona de hemoliz produs de o tulpin de stafilococ utilizat
la realizarea testului).
• pneumococii au peste 80 de tipuri antigenice identificabile prin reacii
de aglutinare sau prin testul de umflare a capsulei.
a)
b)
Figura 11. STREPTIC – a) streptococ de grup D i b) streptococ de grup A
14
Antibiograma este obligatorie pentru toi streptococii, în pofida faptului c
streptococii de grup A sunt întotdeauna sensibili la penicilina de grup G.
Figura 12. Antibiograme Streptococcus spp. pe geloz sânge
Diagnosticul serologic: Se face prin reacia ASLO care pune în eviden prezena anticorpilor
antistreptolizin O. Un titru care depete 200 uniti ASLO se va interpreta ca
infecie streptococic recent i va impune profilaxia complicaiilor.
15
coci gram negativi i bacili gram pozitivi aerobi ai
cavitii orale
gram negativi
Genul Neisseria Genul Neisseria cuprinde diplococi Gram negativi, imobili, de aspect reniform,
aezai în diplo. Sunt bacterii care produc catalaz i oxidaz.
Genul reunete atât specii patogene cât i specii comensale. Neisseriile
patogene sunt reprezentate prin Neisseria gonorhoeae (gonococul) i Neisseria
meningitidis (meningococul).
2.1.1. Neisseria gonorhoeae determin infecii cu transmitere sexual, care la
brbat se manifest ca i uretrit acut, care greit tratat sau netratat devine
subacut, i în evoluie se complic cu prostatit, epididimit i orhit. Pe termen
lung, urmare a diseminrii hematogene se poate instala artrita. La femeie cel mai
frecvent apare cervicita i colpita fr manifestri clinice evidente. În timp, infecia
se complic cu salpingit. i la femeie se poate instala artrita ca i complicaie
tardiv.
filierei pelvi-genitale materne, fapt care conduce la instalarea unei oftalmii purulente,
care are ca i consecin cecitatea.
Diagnosticul de laborator Recoltarea probelor patologice:
• la brbat se recolteaz secreie uretral dimineaa, înainte de miciune,
folosind fie ansa bacteriologic, fie tamponul uretral.
• la femeie recoltarea se face la nivelul colului uterin, din fundul de sac vaginal
posterior i de la nivelul orificiului de deschidere al glandelor Bartholin.
Examenul microscopic direct este util numai din secreia uretral. Se poate
face fie în coloraia simpl cu albastru de metilen, fie în coloraia Gram. Se pun în
eviden diplococi reniformi, Gram negativi (în coloraia Gram) i numeroase
polimorfonucleare. În infeciile subacute diplococii apar fagocitai, iar în infeciile
cronice lipsesc polinuclearele, i cu destul dificultate se pot pune în eviden
diplococii care colonizeaz celule sau fragmente de celule epiteliale.
16
Figura 13. Frotiu din produs patologic – Neisseria gonorhoeae
Izolarea se realizeaz pe geloz chocolat, se incubeaz în atmosfer cu 10%
CO2.
Identificarea se bazeaz pe proprietile morfotinctoriale (diplococi reniformi
Gram negativi), caracterele de cultur (colonii mici, de tip S, gri, transparente),
proprietile biochimice (produce oxidaz, catalaz, degradeaz glucoza dar nu i
maltoza), proprietile de patogenitate (cu prezena endotoxinei, a pililor care asigur
colonizarea mucoaselor, a capsulei polizaharidice).
Antibiograma este obligatorie pentru conturarea schemei terapeutice.
2.1.2. Neisseria meningitidis este un agent etiologic specific uman, izolabil
din rinofaringele purttorilor sntoi, iar în cazul bolii clinic manifeste de la nivelul
lichidului cefalorahidian.
Meningococii ptrund în organismul uman pe cale aerogen i determin iniial
o rinofaringit subclinic sau clinic manifest. Dac depesc bariera mucoas
ptrund în sânge i determin bacteriemie. Sub aciunea factorilor de aprare
17
nespecific - interferonii, sau specific - anticorpii antimeningocici infecia se poate
opri în acest stadiu. În condiii de scdere a rezistenei generale a organismului,
meningococii depesc bariera hemato-encefalic i se localizeaz la nivelul
înveliurilor meningeale, determinând meningita meningococic.
Diagnosticul de laborator se face pe baza examenului direct bacteriologic.
Recoltarea probelor patologice:
• se recolteaz LCR prin puncie lombar (înainte de instituirea tratamentului
chimioterapic),
• în meningitele bacteriene, în general, i în cea meningococic în special, LCR
este purulent (spre deosebire de meningitele virale în care LCR este clar i doar uor
hipertensiv - în meningita bacilar aspectul LCR este asemntor cu cel din
meningitele virale).
Examenul microscopic direct: • citologic preliminar realizeaz numrtoarea celulelor i folosete camere de
numrare care se folosesc i pentru leucocite (se face pe LCR necentrifugat).
• pe LCR centrifugat se completeaz examenul citologic în frotiuri colorate
Giemsa sau în coloraie simpl cu albastru de metilen (în meningitele bacteriene
predomin polimorfonuclearele, în timp ce în meningitele virale, dar i în meningita
bacilar, predomin limfocitele). Pentru exclude- rea definitiv a etiologiei bacilare
se face frotiu în coloraia Ziehl-Nielsen.
Informaii eseniale se obin în frotiul colorat Gram: în cazul infeciei
meningococice frotiul pune în eviden diplococi reniformi Gram negativi
predominant fagocitai.
Izolarea se face pe geloz Muller-Hinton sau geloz chocolat (medii
preînclzite la 37°C), incubându-se în atmosfer cu 10% CO2.
18
Identificarea se bazeaz pe cercetarea proprietilor morfotinctoriale (frotiul
colorat Gram evideniaz diplococii Gram negativi), cercetarea caracterelor de
cultur (colonii de tip S, nepigmentate i nehemolitice, de dimensiuni foarte mici
care se prezint sub aspectul picturilor de rou), pe proprietile biochimice (cu
producerea catalazei i a oxidazei, metabolizarea glucozei i maltozei) i a
proprietilor antigenice identificabile prin laex aglutinare i imunofluorescen
(serogrupele fiind notate cu litere majuscule - A, B, C, 29E, X, Y, Z, W135), i a
proprietilor de patogenitate (endotoxina, capsula, proteinele de membran extern
i pilii).
Antibiograma se realizeaz prin metoda difuzimetric pe Muller Hinton cu
sânge.
gram pozitivi aerobi
Genul Corynebacterium Genul Corynebacterium reunete un grup de bacterii care prezint urmtoarele
caracteristici sunt bacili Gram-pozitivi usor încurbai cu una sau ambele extremiti
mciucate, aezai în palisade, imobili, nesporulai, necapsulai aerobi, uneori
microaerofili sau facultativ anaerobi.
Corynebacterium diphteriae, agentul cauzal al difteriei, a fost acceptat ca i
specie tip, nu numai datorit importanei sale ca i agent patogen al difteriei, dar
i pentru caracteristicile sale bine definite, care-i contureaz biologia.
Diagnosticul bacteriologic: 1. Recoltarea probelor patologice.
Se face cu ajutorul a trei tampoane (se recolteaz exsudatul faringian).
19
2. Examenul microscopic direct
Din primul tampon faringian se fac dou frotiuri, unul fiind colorat Gram, iar
cellalt în coloraia special Neisser. Frotiul colorat Gram evideniaz bacili Gram
pozitivi, aezai în palisade. Frotiul colorat Neisser servete la evidenierea
corpusculilor metacromatici Babe-Ernst.
3. Izolarea
Produsul patologic se însmâneaz pe mediul Löffler, pe mediu cu telurit de
potasiu Tinsdale pe care bacilul difteric se dezvolt sub form de colonii mici, brune,
înconjurate de un halou negru. Pe mediul Löffler coloniile sunt de tip R cu contur
neregulat i au aspect de floare de margaret (pentru tipul gravis).
4. Identificarea
4.1. Caracterele morfotinctoriale: sunt reprezentative în frotiul efectuat de pe
mediul Löffler - bacili Gram pozitivi, drepi sau uor încurbai, cu una sau ambele
extremiti mciucate. În coloraia Neisser se evideniaz corpusculii metacromatici
Babe-Ernst (corpusculii se coloreaz în albastru violet iar corpul bacterian în galben
brun).
4.2. Caractere de cultur
În medii lichide tipul gravis las mediul limpede i formeaz pelicul, tipul
mittis tulbur uniform mediul, iar tipul intermedius formeaz un inel aderent i
sediment granular.
Pe mediul Gundel-Tietz: tipul gravis formeaz colonii de 1-2 nun cu marginea
crenelat cu suprafaa neregulat i de consisten friabil, care dau aspectul de floare
de margaret; tipul mittis formeaz colonii de mrimi variabile cu suprafa convex
i lucioas, conturul regulat i de consisten cremoas; tipul intermedius formeaz
colonii de talie variabil, ce prezint o suprafa uor acu- minat, marginile circulare
i de consisten semicremoas.
Pe mediul Tinsdale, diftericii formeaz colonii negre, înconjurate de un halou
brun, în timp ce pseudodiftericii formeaz tot colonii negre dar fr halou.
20
4.3. Caractere biochimice
Sunt utile pentru diferenierea diftericului de pseudodifterici dar i pentru
identificarea tipurilor de difterici (se urmrete fermentarea amidonului,
glicogenului i a dextrinei).
Bacilul difteric (toate tipurile) produce hidrogen sulfurat i nu scindeaz ureea.
Pseudodiftericii scindeaz ureea, în schimb nu produc hidrogen sulfurat.
4.4. Proprieti de patogenitate.
Factorul de patogenitate este reprezentat de toxina difteric. Toxina difteric
acioneaz prin blocarea sintezei proteice.
Testele de patogenitate pot fi realizate in vitro (testul Elek), sau in vivo prin
inocularea la cobai. Inocularea la cobai se realizeaz prin administrarea subcutanat
a unei culturi de 48 h de bacil difteric. Se folosesc animale protejate i neprotejate.
Cobaiul neprotejat (prin ser antidifteric) moare în 1-4 zile de la inoculare prezentând
ca i leziuni caracteristice : edem gelatinos la locul inoculrii, revrsate
sanguinolente în seroase i congestia suprarenalelor (cu aspect de cirea).
21
Figura 19. Testul Elek
Inocularea toxinei la cobai a permis stabilirea unitii de msur in vivo pentru
toxina difteric, care este reprezentat de doza limit mortal (DLM). Un DLM de
toxin difteric reprezint acea cantitate de toxin care omoar un cobai în greutate
de 250 g în timp de 4 zile cu leziunile caracteristice descrise anterior.
Diagnosticul serologic- se realizeaz prin reacia de hemaglutinare pasiv.
Biologic- este utilizat pentru testarea strii de imunitate în colectiviti. Const
în IDR Shick: se inoculeaz intradermic toxina i se citete reacia dup 24 de ore.
Apariia unui eritem la locul inoculrii este o reacie pozitiv care dovedete lipsa
anticorpilor antitoxici i deci susceptibilitatea persoanei respective la infecie; aceste
persoane se vaccineaz cu anatoxin difteric. Lipsa eritemului (reacie negativ)
este datorat neutralizrii toxinei de ctre anticorpi specifici, fapt ce indic prezena
imunitii.
2.2.2. Bacili gram pozitivi aerobi sporulai
Genul Bacillus Bacteriile din genul Bacillus sunt bacterii Gram pozitive, cu capetele tiate
drept, dispuse în lanuri, aerobe, în general mobile (Bacillus anthracis este
întotdeauna mobil, sporulate (diametrul sporului, care are o localizare central, este
mai mic decât diametrul bacteriei, astfel c celula bacterian nu este deformat).
22
Toi reprezentanii acestui gen sunt foarte rspândii în natur datorit sporului
care le confer rezisten în mediul exterior; sunt germeni telurici gsindu-se în
special în sol, dar numeroase specii de Bacillus pot fi gsite în ap, aer sau pe
materiale de origine animal i vegetal.
Bacillus subtilis - de regul este o specie saprofit, îns a fost izolat în
conjunctivite, iridociclite, sinuzite cronice i al infeciilor urinare.
Bacillus cereus - în cazul în care se înmulete excesiv în alimente se poate
constitui în agent etiologic al unor toxiinfecii alimentare (fosfolipaza C hidrolizeaz
lecitina din alimente i produce fosforilcolin activ). Specia a mai fost izolat în
cursul bacteriemiilor cu localizri meningeale i pulmonare.
Bacillus anthracis este agentul etiologic al antraxului- o antropozoonoz, care
poate îmbrca diferite forme clinice:
– antrax cutanat - pustula malign (96% din cazuri), cu localizare predilect la
nivelul feei i a membrelor; la locul de inoculare apare o vezicul cu coninut
serosanguinolent, urmat de o ulceraie-mic care se usuc i d natere unei cruste
de culoare neagr, de unde i denumirea de crbune cutanat. Regiunea subiacent
leziunii prezint un edem gelatinos, nedureros.
Edemul malign este forma cea mai grav de manifestare a crbunelui
cutanat i se caracterizeaz printr-un edem extins, febr ridicat i stare
toxic.
Diagnosticul este bacteriologic
1. Recoltarea: în formele cutanate se recolteaz serozitate din vezicule; în
infecia pulmonar se recolteaz sput; în infeciile digestive se recolteaz materii
fecale i în meningit- LCR. De la animalele moarte, suspecte de infecie crbunoas,
se recolteaz esuturi.
3. Izolarea. Bacteria este puin pretenioas, dezvoltându-se uor pe medii
uzuale. Probele patologice se însmâneaz pe geloza sânge pe care Bacillus
anthracis se dezvolt sub form de colonii rugoase (de tip R) cu margini neregulate,
care au aspect de cap de meduz sau coam de leu (pe mediile cu sânge coloniile
sunt nehemolitice).
4. Identificarea:
4.1. Proprieti morfotinctoriale: în frotiu colorat Gram se evideniaz bacili
Gram pozitivi cu capetele tiate drept, prezentând aspectul beelor de bambus.
23
Dispoziia sporului este central, iar diametrul mai mic decât al celulei vegetative
face ca aceasta s nu fie deformat.
Figura 20. Frotiu colorat Gram - Bacillus anthracis
În colorat cu safranin i verde malachit se pot pune în eviden sporangiile
(formele vegetative) colorate în rou precum i sporii colorai în verde.
4.2. Caractere de cultur - crete bine pe medii uzuale în condiii de aerobioz.
agar nutritiv - colonii mari, alb-cenuii, cu suprafa rugoas, margini
neregulate i prezentând prelungiri laterale ca nite uvie de pr care
confer coloniilor un aspect caracteristic; sunt coloniile de tip R; în
culturile atenuate la 42, 5°C pot s apar colonii de tip S (tulpini
atenuate).
agar sânge - acelai aspect al coloniilor, nehemolitice.
Figura 21. Bacillus anthracis – colonii caracteristice, cu aspect de „cap de meduz”
bulion nutritiv – tulpinile de tip R las mediul de cultur limpede i
formeaz un depozit floconos.
4.4. Proprieti antigenice – prezint un antigen capsular de natur
polipeptidic i dou antigene de perete celular.
4.5. Caractere de patogenitate
Toxina este format din antigenul protectiv (PA) i din: fie factorul letal LF fie
factorul edemaiant (EF); antigenul protectiv se leag de receptori i transloc în
citosol LF sau EF.
In vitro demonstrarea patogenitii unei sue de Bacillus anthracis se poate
realiza prin teste imunocromatografice.
6. Tratamentul chimioterapie folosete betalactamine i quinolone.
25
enterobacterii
Familia Enterobacteriaceae cuprinde bacili Gram negativi fermentativi
(degradeaz glucoza pe cale oxidativ i fermentativ) i include 44 genuri, dintre
care 25 au fost implicate în patologia uman.
Sunt bacili cu capetele rotunjite, de dimensiuni medii, cu dispoziie în general
necaracteristic. La Klebsiella bacilii sunt dispui în diplo, în sensul lungimii.
Speciile de Yersinia sunt mai frecvent cocobacilare, colorate bipolar, E. coli sunt
pleiomorfi, iar speciile de Proteus sunt uneori extrem de polimorfe. Pot fi mobili sau
imobili. Nu sporuleaz. Majoritatea enterobacteriilor sunt necapsulate. Unele pot
avea o capsul proeminent (Klebsiella), iar altele (Salmonella, E. coli) pot fi învelite
de un material capsular.
nutritiv.
Semnificaia clinic: sunt germeni ubicuitari, iar majoritatea (Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis etc.) fac parte din flora normal a
organismului i pot produce infecii oportuniste. Unele specii, ca de pild Salmonella
Typhi, Shigella spp. - au habitat exclusiv uman.
În funcie de patogenitate, enterobacteriile se împart în: înalt patogene
(Salmonella, Shigella, Yersinia), condiionat-patogene (E. coli, Klebsiella,
Enterobacter, Proteus, Serratia, Citrobacter) sau lipsite de importan în patologia
uman.
Enterobacteriile produc infecii intestinale i extraintestinale, sau mai rar,
pot aprea infecii generalizate pe un fond de rezisten sczut a organismului,
reprezentând 80% din totalitatea bacililor gram negativi izolai i peste 50% din
totalul germenilor izolai. De asemenea, sunt implicate în etiologia a 30-35% din
septicemii, în peste 70% din infeciile urinare i în majoritatea toxiinfeciilor
alimentare. Sunt cauz frecvent a infeciilor nosocomiale – infecii asociate
asistenei medicale.
localizarea infeciei. În infeciile intestinale se recolteaz materii fecale. Acestea
trebuie recoltate cât mai aproape de debutul infeciei, preferabil din scaunele
spontane
deoarece materiile fecale purulente i muco-sanguinolente orienteaz diagnosticul
spre o infecie cu Shigella (dizenterie). Examenul direct microscopic nu intr în
rutina laboratoarelor.
Izolarea. Sunt germeni nepretenioai nutritiv, care se dezvolt cu uurin pe
mediile uzuale (bulion, geloz, geloz-sânge), dar i pe mediile selective lactozate
(Mac Conkey, AABTL, ADCL, XLD, Istrati-Meitert), pe care putem diferenia
enterobacteriile lactozo-pozitive de cele lactozo-negative.
26
Tulbur uniform mediile lichide (bulionul). Pe medii solide se dezvolt sub
form de colonii S sau R. Între cele dou tipuri pot exista i forme intermediare, sau
uneori colonii mucoase de tip M (Klebsiella, unele tulpini de E. coli). Genul Proteus
prezint fenomenul de invazie pe medii neselective solide (geloz, geloz-sânge).
Coloniile de Yersinia se dezvolt mai lent, fiind minuscule dup 18 ore de incubare.
Produsele extraintestinale care în mod normal sunt sterile, se însmâneaz pe
medii obinuite cum este geloza sânge. Produsele puin contaminate, cum sunt puroiul,
sputa se însmâneaz i pe un mediu selectiv lactozat, cum este mediul MacConkey.
Materiile fecale se însmâneaz în mod obligatoriu pe mai multe medii de cultur:
un mediu de îmbogire - bulion cu selenit acid de sodiu (Leifson),
bulion cu tetrationat (Muller-Kauffmann),
un mediu moderat selectiv – ADCL (Leifson), agar Hectoen, agar
XLD, agar SS (Salmonella–Shigella agar),
eventual un mediu foarte selectiv, ca de pild, mediul Wilson-Blair
pentru salmonele.
Enterobacteriile prezint unele caractere biochimice comune, care le permit
încadrarea în familia Enterobacteriaceae: fermenteaz glucoza, reduc nitraii la
nitrii, sunt catalazo-pozitivi i oxidazo-negativi.
Unele enterobacterii fermenteaz lactoza, altele nu, fermentarea lactozei fiind
un criteriu practic de difereniere preliminar a lor. Astfel, utilizarea mediilor
selective lactozate permite diferenierea enterobacteriilor lactozo-pozitive (E. coli,
Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia) de cele lactozo-negative
(Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia).
- caractere morfologice. se evideniaz bacili gram-negativi, cu dimensiuni de
2-3 μm, cu dispoziie necaracteristic.
- caractere culturale: colonii S lactozo-negative
- caractere biochimice: fermenteaz glucoza (G+), nu fermenteaz lactoza (L),
produce H2S, citrat +,
a) b)
Figura 23. Salmonella spp. pe a) geloz sânge i b) mediu cromogenic UTI
Figura 24. Salmonella spp. pe mediu SS
28
iar cei din genul Shigella :
- caractere morfotinctoriale : bacili G-, imobili
- caractere culturale. colonii S lactozo-negative
- caractere biochimice: coloniile lactozo-negative vor fi identificate pe baza
testelor biochimice, care permit încadrarea lor în genul Shigella: G+, L-, H2S-, citrat-
etc.
Testele biochimice se efectueaz pe medii turnate în eprubete mici, care dup
însmânare se termostateaz 24 de ore. Exist i produse comerciale gata preparate
ca, de pild, sistemele microtest – API 10E, sistem automat Vitek, MicroScan sau
spectrometria de mas MALDI-TOF. Mediile minimale pentru identificarea
biochimic a enterobacteriilor sunt:
• geloza TSI-pe care se testeaz fermentarea glucozei, lactozei, precum i
producerea de H2S i gaz. • mediul MIU pentru cercetarea mobilitii, prezenei indolului i ureazei. • reacia rou metil (RM)
• utilizarea citratului de sodiu ca surs unic de carbon
•testul fenilalanindezaminazei (FAD) – pozitiv la tulpinile de Proteus/
Providencia/Morganella spp.
Figura 26. Shigella spp. a) mediu XLD i b) MacConkey
Sensibilitatea la antibiotice. Determinarea sensibilitii la antibiotice este
obligatorie, deoarece enterobacteriile au dobândit, relativ repede, rezisten la o serie
de antibiotice, cel mai frecvent prin transfer de plasmide. Dac nu este posibil
antibiograma, medicul care prescrie antibioticul trebuie s cunoasc rezistena
natural, genetic a enterobacteriilor i s fie orientat asupra rezistenei dobândite la
tulpinile circulante în acea zon.
Dintre enterobacteriile frecvent întâlnite în practica medicala studiem mai în
detaliu urmtoarele :
30
3.1. Genul Escherichia Genul Escherichia include mai multe specii, dintre care, singura de interes
medical este Escherichia coli.
E. coli este un bacil gram negativ, scurt, cu capetele rotunjite, nesporulat,
necapsulat, în general mobil (cu cili peritrichi). Este aerob, facultativ anaerob. Face
parte din flora normal a intestinului la om i animale, reprezentând aproximativ
80% din flora rezident, aerob, a colonului. Are un cu rol important în sinteza unor
vitamine din grupul B i K i în meninerea unui echilibru în biocenoza intestinului.
Semnificaia clinic. Sunt germeni condiionat-patogeni, fiind cei mai izolai
microbi în laboratorul de bacteriologie. În anumite condiii, mai ales când scade
rezistena local sau general a organismului, produc infecii cu localizare i
gravitate diferit, grupate în:
a. infecii enterale b. infecii extraenterale.
a. Infeciile enterale - se realizeaz prin consumul unor alimente în care E.
coli s-a multiplicat (toxiinfecii alimentare) sau prin consum de ap cu contaminare
fecal intens (infecii hidrice).
Sunt produse de 6 patotipuri diareigene de E. coli: enterotoxigen (ETEC),
enteroinvaziv (EIEC), enteropatogen (EPEC), enterohemoragic (EHEC)
enteroagregativ (EAggEC) i enteroaderent difuz (DAEC).
Recoltarea. Se recolteaz materiile fecale i se trimit imediat la laborator
pentru a fi prelucrate.
Izolarea. Materiile fecale se însmâneaz pe cel puin 2 medii selective: un
mediu slab selectiv – MacConkey i un mediu moderat selectiv - ADCL sau XLD.
Pe aceste medii, care toate conin lactoz i un indicator de pH, bacilul coli dezvolt
colonii lactozo pozitive, a cror culoare este în funcie de pH.
Astfel:
• pe mediul MacConkey, pe mediul ADCL - E. coli d colonii rotunde, lucioase
de tip S, de culoare roie, cu un diametru de 2-3 mm,
• pe mediul AABTL, pe mediul Istrati-Meitert, bacilul coli dezvolt colonii cu
aceleai caractere, dar de culoare galben.
Este de reinut faptul c din 100 de tulpini de E. coli, 95 fermenteaz lactoza,
dar 5 nu.
a) b)
c)
Figura 28. E. coli pe a) geloz sânge, b) UTI, c) MacConkey
32
Figura 29. Test API 10S
Identificarea speciei se face pe baza caracterelor biochimice: G+, L+, H2S –,
citrat –, Bacilii coli care aparin grupelor cu patogenitate intestinal nu se deosebesc
din punct de vedere cultural i biochimic de tulpinile care se gsesc în mod normal
în flora intestinal, de aceea trebuie urmrit structura antigenic.
b. Infeciile extraenterale produse de E.coli sunt numeroase :infecii ale
tractului urinar, infecii biliare, infecii respiratorii, infecii ORL, suprainfecii ale
plgilor i arsurilor, septicemii, meningite, mai ales la nou-nscui etc. Unele din
infeciile enumerate - urinare, ale plgilor chirurgicale - pot lua caracter nosocomial
(infecii asociate asistenei medicale).
Ne vom referi în continuare la diagnosticul infeciilor urinare, al cror
principal agent etiologic este E. coli.
Urocultura cantitativ este singura metod care stabilete cu certitudine
diagnosticul de infecie a tractului urinar.
Recoltarea: urina
Examenul direct. Urina se centrifugheaz 10 minute la 3000 turaii/minut.
Din sediment se face un frotiu colorat Gram pe care, într-o infecie urinar, se vd în
mod obligatoriu PMN i bacili gram negativi.
Însmânarea:
Tehnica anselor calibrate. Se utilizeaz dou anse calibrate (una cu diametrul
interior de 5 mm i cealalt de 2,5 mm) astfel încât volumul încrcat de urin
omogenizat (nediluat) s reprezinte 0,01 ml, respectiv 0,001 ml. Cu ansa mic
33
urina se însmâneaz pe geloz sânge i cu cea mare pe mediu Mac Conkey. Plcile
se incubeaz la termostat la 37°C pân a doua zi. Numrul de germeni/ ml urin se
obine prin înmulirea numrului de colonii cu 100 (respectiv 1000) i apoi se face
media aritmetic.
Interpretarea rezultatelor:
nesemnificativ
inferioare, se recomand repetarea uroculturii,
• 104 – 105 UFC/ml (între 10.000 - 100.000 germeni/ml urin), suspiciune
de ITU, rezultatul este discutabil în funcie de context i germeni
identificai, urocultura se poate repeta
• (≥ 105 UFC/ml (≥ 100.000 germeni/ml urin), infecia urinar este cert,
daca se izoleaz o singur specie microbian.
NOT: Pragul semnificativ pentru o ITU este pentru enterobacterii,
Pseudomonas, enterococi, de 105 UFC/ml, pentru stafilococi de 5 x 104 UFC/ ml,
iar pentru Candida de 104 UFC/ml. Identificarea mai multor specii microbiene
presupune contaminarea probei i se indic repetarea uroculturii.
Sensibilitatea la antibiotice. E. coli este sensibil, în mod natural, la
majoritatea antibioticelor, dar foarte multe tulpini au dobândit rezistena la
chimioterapice antiinfecioase prin transferul de plasmide. Antibiograma este, deci,
obligatorie pentru toate tulpinile izolate.
3.2. Genul Klebsiella Genul Klebsiella cuprinde bacili gram negativi, scuri, cu capete rotunjite,
imobili, capsulai, dispui în diplo în sensul lungimii.
Semnificaia clinic. Din cele 10 specii ale genului, 4 sunt importante în
patologia uman: K. pneumoniae, K. oxytoca, K. ozenae i K. rhinoscleromatis.
Sunt germeni condiionat-patogeni, componeni ai florei intestinale la om i
animale, iar în numr redus se gsesc i la nivelul mucoasei tractului respirator. Se
pot izola din ap, sol, plante.
K. pneumoniae este specia cel mai frecvent izolat din cadrul genului. În cazul
scderii rezistenei antiinfecioase a organismului (la prematuri i la vârstnici).
Klebsiella poate cauza infecii grave - pneumonii, septicemii i meningite. Este
agentul etiologic important al unor infecii nosocomiale (suprainfecia plgilor
chirurgicale, infecii urinare, septicemii). K. oxytoca produce infecii similare.
Recoltarea produselor este în funcie de localizarea infeciei.
Examenul direct. Prezena PMN i a unor bacili scuri, gram negativi, colorai
bipolar, capsulai dispui în diplo în sensul lungimii sau în lanuri scurte.
34
Figura 30. Frotiu – Klebsiella pneumoniae
Izolarea. Produsele normal sterile se însmâneaz pe medii simple cum este
geloza sânge.
MacConkey, ADCL (Leifson), XLD
Caractere culturale. Pe geloz sânge dezvolt colonii mari, alb-cenuii,
mucoase (aspect de cultur ce curge pe suprafaa mediului), colonii care, prin
învechire, devin cafenii.
Pe mediul Istrati-Meitert se dezvolt colonii mari, mucoide, iniial lactozo-
pozitive (galbene), apoi, dup 24 de ore, “lactozo-negative” (verzi), datorit
fenomenul de “cameleonaj” prin alcalinizarea mediului.
Pe mediul Mac Conkey dezvolt colonii mari, roii, lactozo-pozitive, cu
apariia fenomenului de “cameleonaj”.
a) b)
Figura 31. Klebsiella pneumoniae: a) pe MacConkey i b) pe UTI
35
Caracterele biochimice. Bacilii din genul Klebsiella : G+, L+, H2S -, imobili,
ureaza +, indol-, etc.
Figura 33. Test API 10S Sensibilitatea la antibiotice: antibiograma este obligatorie pentru orice
tulpin izolat.
3.3. Genul Proteus Genul Proteus cuprinde 8 specii, dintre care 3 se întâlnesc în patologia uman:
P. vulgaris, P. mirabilis i P. penneri. Sunt bacili scuri, cu capetele rotunjite, gram
negativi, cu polimorfism accentuat, foarte mobili (cili peritrichi), nesporulai,
necapsulai, cu dispoziie necaracteristic, aerobi i facultativ anaerobi.
36
Semnificaia clinic. La om i animale bacilul proteus face parte din
microflora tubului digestiv. Sunt germeni condiionat patogeni, putând produce
diferite infecii, în condiiile scderii rezistenei organismului.
Recoltarea se face în raport cu localizarea infeciei (urin, materii fecale,
puroi, sput, LCR, sânge).
Examenul microscopic direct. Are valoare orientativ i se aplic doar
produselor natural sterile (LCR, de pild). Pe frotiuri colorate Gram, se evideniaz
bacili gram negativi cu dispoziie necaracteristic.
Izolarea i identificarea. Produsele monomicrobiene se însmâneaz pe
medii simple, cum este geloza sânge, unde, bacilul proteus este uor de recunoscut,
prin mirosul de putrefacie degajat, precum si prin producerea fenomenului de
invazie. El crete sub forma unor valuri concentrice care invadeaz toat placa. Dac
se repic pe geloz înclinat, mobilitatea apare sub forma fenomenului de crare.
Figura 34. Proteus spp. – pe geloz sânge – prezena fenomenului de invazie
(valuri)
Produsele patologice, în care exist i alt flor, se însmâneaz, în mod
obligatoriu, pe mediile selective, pentru a obliga bacilul proteus s creasc sub forma
unor colonii izolate i s nu invadeze ceilali microbi, care astfel nu mai pot fi
identificai.
Bacilul proteus crete sub forma unor colonii rotunde, de culoarea mediului,
transparente la periferie i negre la centru datorit H2S pe care îl produce. Ele au
fost comparate cu un “ochi de pisic”.
37
Figura 35. Proteus spp. – colonii negre datorit producerii de H2S
Testele biochimice definesc genul (G+, L-, H2S, Mobilitate +, Uree +, citrat+),
dar difereniaz i speciile de Proteus între ele. Toate speciile de Proteus sunt mobile
(fenomenul de crare, de invazie), produc ureaz i secret fenilalanin- dezaminaz
(FAD).
Sensibilitatea la antibiotice. Antibiograma este obligatorie pentru fiecare
tulpin izolat, sunt natural rezisteni la colistin.
38
39
bacili Gram negativi non fermentativi i bacteriile
anaerobe
4.1. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de bacili
Gram negativi non fermentativi Pseudomonas aeruginosa, cel mai reprezentativ bacil Gram-negativ non
fermentativ, cunoscut i sub denumirea de bacil piocianic este rspândit în natur,
în ape de suprafa, pe vegetale i în alimente. A fost izolat din mediul
spitalicesc
în: ap distilat, soluii saline, soluii antiseptice i dezinfectante, soluii pentru
irigaii, soluii perfuzabile, instalaii i obiecte sanitare, instrumentar medical.
Cel mai frecvent sunt implicai în producerea infeciilor oportuniste sau
nosocomiale, la pacieni spitalizai sau cu imunodepresie, cu arsuri extinse,
traumatisme ale pielii, catetere sau alte manevre medicale în zona aparatului genito-
urinar, fibroz chistic.
Cile de transmitere sunt: mâinile murdare, aparatele de respiraie artificial,
fluidele intravenoase (infecii nosocomiale).
dispoziie pleiomorf, necapsulai, nesporulai, mobili datorit unui cil dispuns la
unul dintre poli bacilului. Secret pigmeni difuzibili cu ar fi: piocianin (culo- are
albastr), pioverdin (galben-verde), piorubin (culoare roie), piomelanin (brun,
brun-negru).
culoare verde), urin, LCR, sput, soluie antiseptic slab, spun
Examenul microscopic: se realizeaz un frotiu colorat Gram pe care se
evideniaz bacili Gram negativi, subiri.
Însmânarea pentru izolare pe geloz- sânge, mediul lactozat (cel mai
utilizat- mediul Mac Conkey). De asemenea se pot utiliza i medii
lichide simple (bulion nutritiv).
Caracterelor culturale: pe geloz sânge dezvolt colonii mari,
hemolitice cu hemoliz de tip beta, tip S, rotunde, cu producerea de
pigment- mediul devine verde sau albastru, cu reflexe metalice, care
eman un miros aromat. Uneori coloniile pot fi mucoase, cu tendin
de confluare (izolate de la pacienii cu fibroz chistic). Pe mediul
lichid formeaz o pelicul la suprafa. Pe mediul lactozat dezvolt
colonii lactozo-negative, aderente la mediu.
40
Figura 38. Pseudomonas aeruginosa – producerea pigmentului verzui
Caractere morfo-tinctoriale: bacili Gram-negativi, subiri, cu dispoziie
pleiomorf.
catalaz, formeaz glucoz, reduce nitraii la nitrii, folosete citratul
ca unic surs de carbon.
41
Figura 39. Testul oxidazei - pozitiv
Identificarea se poate realiza pe teste API 20 NE sau API 10S. De asemenea
este posibil i identificarea automat pe sistem Vitek 2.
Figura 40. Test API 10S
Testarea sensibilitii la chimioterapice antiinfecioase este obligatorie
pentru c aceste bacterii dobândesc rezisten la o mare varietate de
chimioterapice antiinfecioase.
Gram pozitivi anaerobi sporulai i alte bacterii anaerobe Bacteriile strict anaerobe sunt microorganisme care nu se dezvolt decât în
absena oxigenului, prezena acestuia fiind foarte toxic culturii, chiar la o presiune
de numai 10-5 atm. Aceste bacterii folosesc ca reacie energogenetic exclusiv
fermentaia, în condiii anaerobe, deci oxidaia de substrat. Dac fermentaia se
produce în prezena oxigenului, se formeaz radicali de superoxid (O2) foarte toxici.
Bacteriile strict anaerobe, spre deosebire de cele aerobe, sunt lipsite de
superoxiddismutaz (care transform radicalul superoxid în ap oxigenat) i
catalaz (care descompune apa oxigenat - peroxidul de hidrogen=H2O2).
42
Bacteriile anaerobe sunt implicate în etiologia unor infecii umane severe dar,
în acelai timp, sunt cele mai frecvente microorganisme care colonizeaz organismul
uman, având un rol important în meninerea echilibrului ecologic al florei normale.
Numeroase specii bacteriene anaerobe fac parte din flora normal a
tegumentului, mucoaselor tractului respirator superior, tractului gastro-intestinal i
tractului uro-genital (mai frecvent colonizeaz uretra i vaginul).
Cunoaterea bacteriilor anaerobe ce colonizeaz diferite situsuri ale
organismului este esenial, deoarece majoritatea infeciilor anaerobe sunt endogene,
cu bacterii ce fac parte din flora normal.
Exist dou grupe principale de germeni anaerobi:
1. Germeni anaerobi exogeni, sporulai, toxigeni, care aparin genului
Clostridium i au ca habitat natural solul dar pot fi întâlnii i în intestinul unor
animale i chiar al omului, mai ales sub form de spori i care în condiii favorabile
au capacitatea de a germina.
Infeciile exogene cauzate de germeni anaerobi includ infecii alimentare,
gangrena gazoas, fasceita necrozant, celulita crepitant, botulismul, tetanosul,
gastroenterit i enterit necrotic (determinat de Clostridium perfringens).
2. Germeni anaerobi endogeni, nesporulai, netoxigeni. Anaerobii
nesporulai domin speciile aerobe la nivelul cilor aeriene i digestive superioare, a
colonului, vaginului i a unitilor pilosebacee. Anaerobii nesporulai sunt atât coci
cât i bacili, Gram pozitivi i Gram negativi:
bacili Gram pozitivi nesporulai din genurile Actinomyces,
Bifidobacterium, Eubacterium, Propionibacterium, Lactobacillus
Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium,
Peptostreptococcus
Astfel de anaerobi nesporulai sunt implicai în general în producerea
infeciilor de vecintate (corelate cu localizarea acestora la nivelul diferitelor caviti
ale organismului).
Diagnosticul infeciilor produse de germenii anaerobi nu este uor, presupune
experien i dotare corespunztoare a laboratorului.
În acest capitol vom insista asupra seleciei, recoltrii i transportului
produselor patologice, deoarece acestea sunt problemele cu care se confrunt
medicul practician. Nerespectarea normelor de conduit în recoltarea produselor
patologice, destinate cultivrii anaerobe compromite, mai mult decât în orice
infecie, ansele unui diagnostic etiologic.
43
Recoltarea. Germenii anaerobi pot iniia infecii cu localizri foarte variate.
La recoltare trebuie evitat, în msura posibilitilor, contaminarea produsului cu
flora anaerob endogen. În aceast categorie intr exudatul faringian, sputa
expectorat, materiile fecale (cu excepia cazurilor când se urmrete izolarea Cl.
difficile, Cl. perfringens sau Cl. botulinum), urina prin miciune spontan sau
cateterism, secreii vaginale i cervicale, secreii purulente de pe suprafaa pielii.
Cultivarea acestor produse va demonstra întotdeauna prezena germenilor anaerobi
endogeni.
Transportul probelor. Oxigenul atmosferic este foarte toxic pentru bacteriile
strict anaerobe, ceea ce impune obligativitatea însmânrii cât mai rapide a
produsului biologic. În cazul în care se recolteaz o cantitate redus de produs, exist
posibilitatea ca germenii s fie distrui în contact cu aerul. De aceea se recomand
însmânarea produsului în cel mult 10 minute. Dac produsul este în cantitate mare,
intervalul poate atinge o or.
Pentru transport se utilizeaz, cu rezultate foarte bune, tuburi anaerobe care
conin mediu de transport (Cary - Blair modificat sau Stuart).
Examenul macroscopic direct al produselor patologice poate da informaii
cu privire la natura i calitatea produsului recoltat. Cele mai semnificative semne ale
unei infecii cu germeni anaerobi sunt mirosul fetid, aspectul purulent, esuturi
necrozate, gaz în esuturi, prezena de granule sulfurate.
Examenul microscopic direct pe preparatele colorate Gram este util în
identificarea caracterelor morfologice i tinctoriale ale bacteriilor anaerobe din
produsul patologic. Acest examen este esenial mai ales din punct de vedere clinic,
întrucât majoritatea bacteriilor anaerobe necesit 48 de ore (sau mai mult) pentru
creterea pe mediile de cultur
Izolarea germenilor anaerobi. Pentru izolarea primar a bacteriilor anaerobe
din produsele biologice pot fi utilizate medii neselective i selective. Mediile
neselective cel mai frecvent utilizate sunt medii nutritive pe baz de agar-sânge,
suplimentate cu vitamina K1 i hemin. Mediile selective asigur izolarea tuturor
germenilor anaerobi cu importan în patologia uman.
Izolarea germenilor are loc în anaerobioz strict, realizat cu ajutorul Genbag
anaerobic (pung cu reactiv care elimin oxigenul).
Mediile neselective însmânate vor fi incubate în anaerobioz pentru o
perioad de cel puin 48 de ore înainte de expunerea la oxigen (se protejeaz astfel
bacteriile aflate în faza logaritmic de cretere, de aciunea toxic a oxigenului).
Identificarea. Infeciile cu germeni anaerobi sunt, în general, polimicrobiene,
izolarea diverselor specii fiind dificil i de durat. Pentru identificare sunt utilizate
caracterele culturale, morfotinctoriale, metabolice, precum i testele de patogenitate.
Orice tulpin anaerob izolat din produse normal sterile trebuie identificat.
Identificarea anaerobilor, la nivel de specie, se face pe baza proprietilor
biochimice.
folosirea testelor E.
Genul Clostridium Bacteriile din genul Clostridium sunt bacili Gram pozitivi, sporulai având
spori ovali sau sferici, terminali sau subterminali, care deformeaz bacteria; sunt
anaerobi strici, mobili sau imobili.
Bacteriile strict anaerobe sunt bacterii sensibile la aciunea oxigenului, acesta
fiind toxic pentru ele. În genul Clostridium sunt clasificate specii patogene care
sintetizeaz exotoxine care reprezint principalii factori de patogenitate:
A) Clostridium tetani Este un bacil Gram pozitiv, sporulat, cu sporul dispus terminal, ceea ce-i
confer un aspect de b de chibrit. Exist mai multe tipuri antigenice, îns toate
sintetizeaz acelai tip de toxin. Aciunea toxinei tetanice se manifest la nivelul
sistemului nervos central, unde blocheaz sinapsele inhibitorii i determin
contractura muscular (tetanosul complet).
Profilaxia tetanosului se face prin vaccinare cu anatoxin tetanic (trivaccinul
DTP sau divaccinul DT, intr în schema de vaccinri obligatorii). În prezena plgilor
cu potenial tetanigen se procedeaz la toaleta chirurgical i la rapel cu ATPA
(anatoxina tetanic purificat i adsorbit).
Pentru diagnosticul de laborator se recolteaz puroi din plag, care se
însmâneaz pe medii pentru anaerobi (agar sânge). Frotiul colorat Gram
evideniaz bacili Gram pozitivi cu sporul dispus terminal. Formeaz colonii glbui-
cenuii care au tendina de confluare dac concentraia de agar a mediu- lui este mai
mic de 4%. În mediile lichide formeaz sediment (datorat sporilor), iar culturile
degaj un miros caracteristic de corn ars. Este hemolitic i slab proteolitic i
zaharolitic.
Antibiograma, efectuat prin metoda difuzimetric în dublu strat de agar,
finalizeaz diagnosticul.
45
B) Clostridium botulinum Este un bacii Gram pozitiv mobil datorit cililor peritrichi, cu sporul dispus
subterminal.
Este o bacterie rspândit în solul tuturor regiunilor geografice. Are mai multe
tipuri antigenice, fiecare dintre tipurile antigenice sintetizând i eliberând o toxin
proprie. Tipurile antigenice A, B, E i F produc botulismul la om. Toxina botulinic
are neurotropism, iar mecanismul su de aciune const în blocarea transmiterii
nervoase, prin inhibarea secreiei de acetilcolin.
Figura 42. Frotiu - Clostridium botulinum
Clostridium botulinum se prezint ca i bacili Gram pozitivi cu spori dispui
subterminal.
Pe mediile solide (pentru anaerobi) formeaz colonii neregulate cu suprafaa
granular i cu o margine în extensie continu. Exercit hemoliz pe
mediile cu sânge. De regul, îns diagnosticul intoxicaiei botulinice se face
prin evidenierea toxinei i determinarea tipului acesteia. Toxina se caut în lichidul
de spltur gastric sau de vrstur în coninutul intestinal sau în lichidul din
conserva incriminat. Pentru aceasta se procedeaz la o reacie de neutralizare in
vivo, prin inocularea la oareci de laborator. Se folosete 10 oareci, din care 2 rmân
ca i martori i nu se protejeaz cu ser antibotulinic. Ceilali vor forma 4 perechi,
fiecare dintre aceste perechi urmând a se proteja cu un alt ser anti- botulinic specific
de tip (A, B, E i F). Fiecare animal se inoculeaz cu filtratul alimentului incriminat.
Animalele protejate prin serul antibotulinic specific de tip antigenic supravieuiesc,
în timp ce celelalte animale, inclusiv martorii, mor. Dac mor toate animalele se
poate exclude botulismul.
C) Clostridiile gangrenei gazoase Gangrena gazoas apare ca o complicaie a plgilor contaminate cu pmânt
unde se realizeaz condiii de anaerobioz necesare germinrii sporilor i se
caracterizeaz prin necroza i putrefacia esuturilor afectate, la aceste semne locale
adugându-se i semne generale. Infecia este, de fapt, polimicrobian, la producerea
ei participând specii anaerobe, aerob-anaerob facultative i chiar aerobe.
46
sânge, puroi.
Examenul microscopic direct din produsul patologic are o mare valoare
diagnostic. Pe frotiul colorat Gram se remarc un polimorfism bacterian accentuat,
evideniindu-se bacili mari Gram pozitivi, izolai, în perechi sau lanuri scurte, cu
spor central, subterminal sau fr spori (Clostridium perfringens sporuleaz numai
în culturi vechi), unii dintre ei capsulai (Clostridium perfringens).
Izolarea se face pe medii pentru anaerobi i este necesar ca fiecare specie s
fie izolat în cultur pur pentru a se putea trece la etapa urmtoare. Pentru izolare
se folosesc medii pentru anaerobi (Nagler, Willis-Hobbs).
Identificarea necesit parcurgerea tuturor etapelor (pe geloz glucozat cu
glbenu de ou - mediul Nagler, Clostridium perfringens produce reacia Nagler,
datorit alfa toxinei, o lecitinaz, care difuzeaz în jurul coloniilor i descompune
lecitino-vitelina din ou producând un precipitat care opacific mediul).
Antibiograma se execut prin tehnica difuzimetric în condiii de anaerobioz
(în dublu strat).
Tratamentul gangrenei gazoase trebuie instituit de urgen i const în
administrarea de ser antigangrenos polivalent, antibiotice i desigur, îngrijirea
chirurgical a plgii (eliminarea esuturilor necrozate, drenarea coleciilor închise).
4.2.2. Germeni anaerobi endogeni, nesporulai
Acetia reprezint un al doilea grup de microorganisme, anaerobe, patogene
pentru om. Ele cuprind un ansamblu de bacterii foarte diferite din punct de vedere
morfologic i funcional, dar care au ca trsturi comune anaerobioza,
comensalismul cutaneomucos i potenialul patogen.
Frecvena infeciilor cu germeni anaerobi nesporulai este în continu cretere,
acestea fiind prin excelen bacterii “oportuniste”. Cel mai frecvent dau infecii în
asociaie cu alte specii microbiene.
Nu vom insista asupra diagnosticului de laborator, care urmeaz principiile
generale de izolare i identificare a germenilor anaerobi, dar vom prezenta în linii
generale taxonomia acestor germeni, care a suferit mari modificri în ultimul deceniu
i semnificaia lor clinic.
A. Bacili gram negativi anaeorbi Bacilii gram negativi strict anaerobi sunt cuprini în familia Bacteroidaceae.
Ei fac parte din flora comensal a mucoasei respiratorii, a tractului digestiv i a
tractului genital. Din cele 20 de genuri, importante în patologia uman sunt genurile
Bacteroides, Prevotella, Prophyromonas i Fusobacterium.
47
Diagnosticul infeciilor produse de bacilii gram negativi anaerobi const în
izolarea i identificarea lor din produsele biologice. Întrucât fac parte din flora
normal a organismului, produsele contaminate cu aceast flor nu pot fi prelucrate.
Diagnosticul este foarte laborios i implicaia lor etiologic trebuie corelat cu
realitile clinice. Izolarea lor din produse normal sterile are întotdeauna semnificaie
patologic.
B. Bacili gram pozitivi anaerobi Propionibacterium acnes este agentul etiologic al acneei juvenile în asociaie
cu alte microorganisme. Are o morfologie similar corynebacteriilor.
Actinomicetele sunt bacili gram pozitivi anaerobi, nesporulai care cresc sub
form de filamente. Ele fac parte din flora normal a cavitii bucale de unde pot
iniia, în anumite condiii infecii endogene. Specia cel mai frecvent întâlnit în
patologia uman este Actinomyces israelii, în asociaie cu alte microorganisme
anaerobe ale cavitii bucale (Bacteroides spp). Dintre infecii menionm
actinomicoza cervicofacial, toracal, abdominal, parodontit etc.
Diagnosticul este bacteriologic. Examenul microscopic direct al puroiului
recoltat din abcese este de mare valoare, deoarece morfologia filamentoas,
ramificat a actinomicetelor este caracteristic. Din puroiul recoltat, care este grunjos
se zdrobesc 2-3 grunji (formai prin agregarea filamentelor germenilor ramificai)
48
între 2 lame. Lamele se despart, i fiecare se coloreaz Gram. Cultivarea se face pe
medii complexe în condiii de anaerobioz i dureaz mult.
Figura 45. Frotiu - Propionibacterium acnes
Figura 46. Actinomyces israelii colonii
Figura 47. Frotiu - Actynomices israelii
49
C. Cocii gram pozitivi anaerobi Cocii gram pozitivi strict anaerobi sunt cuprini în genurile Peptococcus i
Peptostreptococcus. Ei fac parte din flora normal a cavitii orale i produc infecii
numai în asociere cu ali anaerobi. Ptrund prin soluii de continuitate ale pielii în
profunzime, unde produc împreun cu alte specii, infecii purulente subacute de tipul
abceselor cerebrale, otitelor, sinuzitelor. Pot participa de asemenea în infecii ale
tractului respirator inferior i ale regiunii abdominale (peritonit, apendicit, abces
hepatic).
Ca i în cazul celorlali germeni anaerobi endogeni nesporulai, diagnosticul
este dificil i de durat.
D. Cocii gram negativi anaerobi Sunt reprezentai de genul Veillonella care face parte din flora normal a
cavitii orale. Poate produce pioree alveolara.
Figura 49. Frotiu - Veillonella
germeni din genurile Treponema, Mycobacterium
5.1. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de
germeni din genurile Treponema
Treponema pallidum agentul etiologic al sifilisului este descris în 1905 de ctre
profesorul de zoologie Schaudin i medicul dermatolog Hoffman. Treponemele (din
limba greac Trepo = a învârti, Nema = fir) sunt bacteria strict anaerobe sau
microaerofile.
Dei sunt cunoscute gram negative, nu se coloreaz Gram, ci sunt
utilizate coloraii speciale.
cultivate pe medii de cultur.
Sunt meninute în via prin inoculare la animale susceptibile.(intra-
testicular la iepure care va dezvolta orhit sifilitic)
În acest fel s-a reuit pstrarea în via a unei tulpini de referin de T.
pallidum, izolat de la un pacient decedat de neurosifilis în 1912,
numit tulpina Nichols.
Aceast tulpin este folosit la prepararea antigenelor de T. pallidum
necesare diagnosticului serologic.
O hapten lipidic, comun treponemelor nepatogene i esuturilor ani-
male (cardiolipin). Acest antigen determin în organism formarea de
anticorpi antilipoidici (Wassermann).
fixare a complementului.
Antigene specifice, numai pentru treponemele patogene.
Anticorpii ce se formeaz în organism fa de aceste antigene, cum sunt
anticorpii antiproteici, antipolizaharidici i imobilizinele se evideniaz prin mai
multe reacii serologice, strict specifice pentru Treponema pallidum. Cile de
transmitere a agentului etiologic:
sexual (ancrul sifilitic genital i anal reprezint 99% din cazurile de
sifilis primar)
iatrogent (transfuzii )
supravieuirea la 4ºC timp de 24 de ore a Treponemei pallidum în sânge
explic transmiterea posttransfuzional
Punerea în eviden a Treponemei pallidum prin examen direct (diagnostic
bacteriologic). În funcie de stadiul evolutiv al bolii se recolteaz:
în sifilisul primar: exudat din ancru, aspirat ganglionar, biopsii
în sifilisul secundar: exudat din leziuni, biopsii
în sifilisul teriar: LCR, piese bioptice sau necroptice
în sifilisul congenital precoce: prelevate din cordon ombilical, placent,
secreii nazale, leziuni cutanate
Evidenierea microscopic a treponemelor
Avantaje: rapiditate
Avantaje:
Experien
Preparate fixate i colorate
Cu tu de India
Figura 50. Imunoflorescen cu anticorpi monoclonali marcai cu a) izotiocianat de
fluorescein i b) rodamin.
Figura 51. Treponema pallidum - Microscopie cu fond întunecat
Diagnosticul serologic const în evidenierea Ac în sânge i LCR. Se realizeaz
prin teste nespecifice i teste specifice.
TESTE NESPECIFICE: RFC
VDRL
RPR
VDRL - Test screening ce are la baz o reacie de floculare care utilizeaz
antigenul cardiolipinic.
mare sensibilitate
lipsa de specificitate, dând cel mai mare procent de rezultate
biologic fals pozitive, la persoane care nu aveau sifilis,
53
RPR - O reacie de floculare ca i VDRL care utilizeaz antigen cardiolopinic
la care s-au adugat particule fine de crbune
Avantaje:
Se poate citi cu ochiul liber
Dezavantaje
Nu poate fi folosit pentru LCR
ART (test RPR AUTOMAT) Se practic pe scar larg din 1968
TRUST (test RPR) care utilizeaz în loc de particule de crbune, rou de
toluidin.
USR (unheated serum reagin)- Cu acelai principiu ca i RPR dar citirea se
face la microscop
RFC cu antigen Wassermann (1906) care astzi nu mai este utilizat.
REACIA BORDET- WASSERMANN
Utilizeaz ca antigen un extract de ficat de fetus cu sifilis congenital.
Avantaje: specificitate mai mare decât la reaciile de floculare
Dezavantaje: sensibilitate mai mic, tehnic laborioas
TESTE SPECIFICE Se utilizeaz pentru confirmarea testelor standard nespecifice
Pentru diagnosticul sifilisului latent i tardiv
Teste cu specificitate de grup treponemic RFC cu extract din tulpina Reiter (Treponema phagedenis)
Sensibilitate i specificitate mai mic decât a testelor specifice
Teste specifice treponemelor patogene Teste de imobilizare a treponemelor (NELSON) care utilizeaz treponeme
vii tulpina Nichols.
Cu toate c este cel mai specific test, se efectueaz rar astzi, deoarece este
nevoie de treponeme vii i de iepuri infectai i tehnica este dificil.
Dac se imobilizeaz peste 50% din treponeme reacia este pozitiv, iar dac
imobilizarea este sub 20% reacia este negativ.
Teste specifice cu treponeme inactive- TP-PA (Treponema pallidum particle
agglutination)
Teste de aglutinare corpuscular a Treponemei pallidum: reacie de aglutinare
pasiv care utilizeaz suspensie de treponeme inactivate cu formol i puse în contact
cu ser de pacient.
Figura 52. Serologie sifilis
Test de referin standard, care este o imunofluorescen indirect. Se folosete
tulpina Reiter pentru a fixa anticorpii nespecfici, comuni, determinai de treponeme
atât patogene, cât i comensale.
Pe lame sunt depuse tulpini de Treponema Nichols/pallidum, pe care se fixeaz
anticorpii specifici, rmai în serul sau plasma de bolnav, dup îndeprtarea celor
nespecifici, formând complexe antigen- anticorp. Se adaug conjugat fluorescent
anti-Ig umane. La examinarea la microscopul cu fluorescen, treponemele din
complexele marcate fluorescent, apar galben-verzui.
Avantaje:
Valabil i pentru LCR
Se aplic i în diagnosticul sifilisului congenital dar utilizeaz
antiimunoglobulin uman de tip IgM
Dezavantaje:
Foarte costisitor
Test cu extract treponemic - TPHA are la baz reacia de hemaglutinare care
utilizeaz pentru evidenierea macroscopic a reaciei hematii de berbec
îmbrcate cu extract de Treponema pallidum care se pun în contact cu ser
de pacient. Aglutinarea reacie pozitiv, iar depunerea în buton reacie
negativ.
55
Avantaje:
Disponibilitatea kiturilor
Uor de efectuat
La fel de sensibil ca FTA-ABS în stadiile tardive ale sifilis
Dezavantaje:
Test cu extract treponemic-EIA
Reacie imunoenzimatic, utilizat ca test screening în laborator cu o dotare
corespunztoare, dar i în determinarea Ac de tip IgG i IgM anti-treponemici în
sifilisul congenital
INNO-LIA SYPHILIS
Test relativ nou de confirmare a AC anti-treponemici. Folosete un polipeptid
sintetic i recombinat din proteine extrase din Treponema pallidum pentru
determinarea Ac intratecali. Se utilizeaz pentru diagnosticul neurosifilis latent.
Figura 53. Kit Inno-Lia Syphilis
CONCLUZII
Diagnosticul de laborator al sifilisului presupune teste standard cu
specificitate mai mic dar sensibilitate mai mare, i care sunt primele
necesare atât în diagnosticul cazurilor izolate cât i în screening.
(VDRL)
56
confirmate cu testul FTA-ABS sau TPHA
Pentru diagnosticul neurosifilisului latent se recomand testul INNO-
LIA. Acest test are o specificitate i sensibilitate net superioar
celorlalte teste specifice
Algoritmul de diagnostic se va schimba curând testele nespecifice fiind
înlocuite cu screening imunoenzimatic de tip EIA i INNO-LIA, fapt ce va scurta
timpul de diagnostic i va îmbuntii calitativ rezultatele.
5.2. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de
germeni din genurile Mycobacterium Mycobacterim tuberculosis (bacilul Koch) este agentul etiologic al
tuberculozei, care este o boal infecioas. Transmiterea infeciei se realizeaz cel
mai frecvent pe cale aerian, dar i pe cale digestiv, cutanat. Suspiciunea de
infecie este clinic i radiologic iar confirmarea este bacteriologic.
Timpul de diagnostic
Examenul microscopic pentru
Cultura în mediul LJ 3-8 sptmâni
Cultura în mediul lichid 1-3 sptmâni (6 sptmâni pentru
rezultatele negative)
ABG mediul lichid 14 zile de la data culturii pozitive
ABG linia întâi, mediul solid 30 zile de la data culturii pozitive
ABG linia a doua 4 sptmâni de la data culturii pozitive
Testele de biologie molecular pentru
diagnostic 24-48 ore
Recoltarea produselor patologice Sputa se recolteaz dimineaa, sub supravegherea personalului instruit,
2 eantioane, la cel puin 8 ore interval între dou eantioane. Cantitate
3-5 ml.
Aspirat gastric – se recolteaz la bolnavi care nu expectoreaz, copii,
aduli >60 ani. Dezavantaj: trebuie prelucrat imediat
57
LCR. Cantitate minim 2 ml - 50 ml. Sunt produse patologice
paucibacilare
urocultur pentru non-Tb. Cantitatea este de 10-50 ml
Piese de biopsie, puroi din fistul, sânge se recolteaz pe sisteme
speciale de colectare, fr conservani. Pentru puroi nu se accept
recoltare pe tampon faringian, totui, acceptat pe mediul Amies
Materiile fecale necesit prelucrare imediat. Cantitatea recoltat
necesar este de 5-10 ml. Limite: erori la microscopie, culturi
contaminate
Examenul microscopic • 1882: Robert Koch descoper bacilul tuberculozei
• 1883: Ziehl i Nielsen -metoda de colorare cu fuxin la cald
Coninutul bogat în acizi micolici din structura peretelui micobacteriilor face
ca ele s fixeze la cald compuii de anilin (fuxin), sau substane fluorescente- fr
înclzire (auramina, auramina - rhodamina) coloranii respectivi rezistând la
decolorarea cu alcool acidulat, de aici i denumirea de bacili acido-alcoolo-rezisteni
(BAAR).
(albastru de metilen).
albastru de metilen sau permanganat de potasiu).
Microscopia cu LED UV (light-emitting diodes) a fost recomandata de OMS
în 2009. Permite citirea unui numr mai mare de frotiuri (peste 35/zi).
COLORAIA ZIEHL NIELSEN 1. Se pun lamele cu frotiurile fixate pe suportul de colorare -s nu se ating !
2. Se acoper complet frotiurile cu soluie 0.3% de fuxin fenicat
3. Se trece pe sub frotiuri flacra unui bec de gaz pân la emiterea de vapori, fr s
fiarb colorantul. Se repet aciunea de 3-4 ori în primele 3 minute. Se
completeaz cu fuxin. Se las pân la 10 minute.
4. Se spal cu jet slab de ap de robinet i scurge apa.
5. Se acoper frotiul cu alcool-acidulat 3% i las-l pentru decolorare maxim 3 min.
Se repet decolorarea dac frotiul rmâne rou.
6. Se spal din nou cu jet slab de ap de robinet i se scurge apa.
7. Se acoper frotiul cu albastru de metilen 0,3% timp de 30 sec- max 1 min
8. Se spal blând sub jet de ap de robinet i scurge apa.
9. Se terge colorantul de pe dosul lamei cu ervet îmbibat în alcool medicinal.
10. Se usuc frotiurile în poziie înclinat în suport de lame la temperatura camerei.
Nu înclzi lamele pentru grbirea uscrii!
58
Se examineaz la microscop optic: ocular 10x, obiectiv cu imersie 100x
(mrire 1000x), dup uscare complet.
Figura 54. Bacilul Koch – coloraia Ziehl – Nielsen
Cultivarea: 1932: Lowenstein Jensen- mediul solid pe baza de ou
1977: Middlebrook si col: sistem radiometric (BACTEC 460)
- sistem colorimetric (Bact-Alert/MB-BacT)
Figura 55. Sistem fluorimetic Bactec MGIT 960
Citirea culturilor se face diferit:
Mediul Lowenstein Jensen (LJ) se face manual la 21, 30, 45, 60 zile.
Dac volumul de lucru permite, se poate citi sptmânal.
Mediul lichid se face automat, indiferent de sistemul de cultivare, cu
raportare pozitiv (la 1-42 zile) sau negativ (la 42 zile).
59
Rezultatele culturilor pe mediul LJ se exprim semicantitativ iar cele ale
culturilor în mediul lichid, calitativ: pozitiv/negativ.
Identificarea: Examen morfologic macroscopic al culturilor pe mediul LJ
M.tuberculosis – colonii R (Rough) colorate crem-glbui
M.bovis/M. canetti – colonii S (Smooth) alb-glbui
NTM – colonii S sau R, albe, glbui, portocalii, gri, roz.
Figura 56. Colonii de M. tuberculosis
Figura 57. Colonii de M. bovis
Examen morfologic macroscopic al culturilor pe mediul lichid Middlebrook
Grunji resuspendai prin agitare uoar- MTB, streptococi, uneori fungi
Tulbure uniform- NTM, coci, bacili, uneori fungi
Frotiurile din culturi se coloreaz exclusiv ZN (se coloreaz i microbii de
contaminare). Culturile pentru care frotiul indic prezena BAAR se testeaz
obligatoriu pentru confirmarea apartenenei la complexul M. tuberculosis. Se
folosete test rapid imunocromatografic Ag MPT64.Culturile cu rezultat negativ Ag
MPT64 se trimit pentru identificare de specie.
Antibiograma (ABG) este necesar pentru confirmarea/excluderea rezistenei.
60
ABG linia 1 - pentru toate cazurile TB cu > de 10 colonii în cultura
primar
ABG linia 2 - pentru toate cazurile MDR > de 10 colonii în cultura
primar
ABG ]n mediu lichid in sisteme automate este standardul de aur recomandat
pentru ABG L 2 în acest moment.
Metode de biologie molecular:
MTBDRsl)
RT-PCR: amplificare AND (PCR, PCR in timp real) – GeneXpert
Aceste teste reduc timpul de confirmare a TB sau/i a TB MDR la 24-48,
respectiv 2 ore.
Figura 58. Teste identificare Complex Mycobacterium tuberculosis
61
Fungii sunt organisme eucariote, microscopice, uni sau pluricelulare. În
micologia medical cel mai utilizat criteriu de clasificare a fungilor este cel
morfologic. Din aceste punct de vedere avem:
Fungi filamentoi sunt microorganisme pluricelulare care prezint
filamente tubulare septate sau neseptate denumite hife. Ansamblul de
hife este denumit miceliu care este vizibil macroscopic sub forma unor
colonii.
Levuri care sunt microorganisme unicelulare, cu form ovalar sau
rotund, ce se multiplic în principal prin blastospor (blastoconidie),
care se poate desprinde de celula mam printr-un proces de fuziune, fie
rmâne ataat de aceasta si genereaz succesiv noi indivizi, sub forma
unor agregate liniare denumite pseudohife
Fungi dimorfici, care prezint o dualitate morfologic în funcie de
condiiile de dezvoltare. Ei pot s fie levuri în esuturile organismelor
parazitate sau la 37ºC in vitro pe mediile speciale i sub form de
filamente când sunt cultivai la temperatura camerei sau la 30ºC, pe
mediile uzuale.
Diagnosticul de laborator parcurge urmtoarele etape: de la prelevarea i
transportul probelor, examen microscopic direct sau în funcie de caz examen
histopatologic, cultivarea în vederea izolrii agentului etiologic, identificarea pân
la nivel de specie i în final testarea sensibilitii la substanele antifungice.
Recoltarea s fie realizat de ctre personal medical instruit în acest scop.
Cantitatea de prelevat trebuie s fie suficient de mare pentru a permite efectuarea
examenului microscopic direct, cultivarea i eventual examenul histopatologic.
Prelucrarea probelor va începe cât mai curând posibil dup recoltare, fr a depi
timpul maxim de ateptare (2 ore la temperatura camerei).
Produsele patologice de la nivelul mucoasei orale se recolteaz cu un tampon
steril, prin trecerea repetat a acestuia de cel puin 10 ori, peste zonele cu leziuni. În
cazul leziunilor ulcerate sau pseudo-membranoase, se poate recurge la raclarea
uoar a acestora cu ajutorul unei chiurete sterile sau a unei lame de sticl pentru
microscopie. În cazul aparatelor protetice, prelevarea probelor se realizeaz de pe
faa mucozal a acestora, zon predilect a acestora pentru apariia biofilmelor
levurice. Din pungile parodontale, prelevarea probelor se realizeaz cu sonda
parodontal, în zonele vestibular, oral, vestibulo-distal, vestibulo-mezial, oro-
distal i oro-mezial. În endodontite prelevarea probelor se realizeaz cu ajutorul
conurilor de hârtie sterile, de dimensiuni diferite în funcie de dimensiunea canalelor
radiculare.
Conurile de hârtie i produsul patologic din pungile parodontale s se trimit
în laborator, pentru evitarea desicrii pe medii de transport.
62
Examenul microscopic direct orienteaz uneori diagnosticul ctre o infecie
levuric i uneori poate oferi indicii privind etiologia acesteia.
Produsele patologice pentru care exist suspiciunea c ar conine levuri se pot
examina microscopic prin:
Este metoda optim de detecie a fungilor în prelevate datorit
sensibilitii i specificitii excelente, doar c necesit microscopie în
lumin ultraviolet;
Frotiu colorat Gram pe care se evideniaz cu uurin filamentele,
pseudohifele, blastosporii îns este inadecvat pentru evidenierea
celulelor levurice de dimensiuni mici (ex. Candida glabrata);
Frotiu colorat May-Grünwald-Giemsa este coloraia de rutin pentru
evidenierea levurilor intracelulare (ex. Histoplasma) dar i pentru
microscopie direct.
Pe parcursul examenului microscopic se urmrete cu atenie prezena, forma
i dimensiunile formaiunilor caracteristice levurilor: blastospor, pseudo-hife, hife
(filamente).
Figura 60. Frotiu - Candida albicans Gram
63
Însmânarea se face prin epuizare pe medii solide fie în plci Petri fie în
tuburi. Se asigur astfel separarea fungilor cu semnificaie clinic de cei
contaminani i se inhib prin diluare eventualele substane antimicrobiene cu rol
antifungic.
Mediul utilizat este agar Sabouraud aditivat cu cloramfenicol. Acest mediu
permite o bun dezvoltare i supreseaz multiplicarea eventualelor bacterii
contaminante. Dezavantajul acestui mediu este c nu reuete discriminarea culturi-
lor mixte. De aceea, ideal ar fi ca însmânarea produselor patologice s se fac pe
un mediu cromogen, care pe lâng discriminarea între speciile levurice, poate aduce
informaii eseniale în identificarea agentului etiologic. Astfel într-o singur etap se
poate face atât izolarea cât i identificarea levurilor incriminate.
Numrul speciilor identificabile prin cultivarea pe medii cromogene este
variabil în funcie de compoziia mediului.
Figura 61. Candida albicans pe mediu Sabouraud
Figura 62. Specii diferite de Candida pe mediu cromogen
64
Dup izolarea tulpinilor fungice i precizarea semnificaiei clinice (peste 50
colonii/tampon i prezena reaciei inflamatorii), se trece la identificarea specie
folosind teste de rutin. Se vor utiliza doar tulpini purificate, oricare contaminare
bacterian sau fungic anulând rezultatul identificrii.
Testele biochimice sunt utilizate pentru identificarea levurilor de interes
medical, în laboratorul clinic. Aceste teste nu reuesc s elucideze de fiecare dat
apartenena taxonomic a unei tulpini i sunt necesare teste suplimentare, în principal
de biologie molecular, pentru identificarea acesteia.
Deoarece testele de biologie molecular bazate pe analiza ADN-ului sunt
accesibile doar unor laboratoare, utilizarea testelor biochimice i a caracterelor
morfologice este soluia acceptabil pentru laboratoarele clinice.
Aceste teste pot identifica un numr diferit de specii, cum ar fi:
O singur specie: Candida albicans Screen (Remel), RTT Glabrata
(Fumouze);
(OXOID);
(Remel)
65
7. Diagnosticul de laborator al infeciilor virale
Diagnosticul de laborator al infeciilor virale se poate efectua prin numeroase
metode, cele mai utilizate fiind izolarea i identificarea agentului viral (metode
directe), fie prin teste serologice (diagnostic serologic).
Diagnosticul direct Virusurile datorit dimensiunilor foarte mici (20-300 nm) nu pot fi observate
la microscopul optic, ci doar la microscopul electronic.
Infeciile virale pot fi diagnosticate ocazional utilizând microscopia electronic
prin vizualizarea direct a particulelor virale. Metoda prezint avantajul de a putea fi
vizualizate mai multe tipuri de particule virale. Dezavantajele includ costul i
complexitatea întreinerii microscopului electronic.
obinute prin biopsie sau necropsie.
Prin imunofluorescen se utilizeaz anticorpi marcai fluorescent care
detecteaz antigenele virale la nivelul esuturilor (virus herpes simplex 1 i 2, virusul
varicella-zoster). Este aplicabil ca metod de diagnostic în laboratoare care dispun
de microscop cu fluorescen.
De obicei în laboratoarele de cercetare virusologic se face examinarea
electronomicroscopic, deoarece aceste laboratoare au în dotare microscop
electronic. Se face de obicei examinarea lichidelor veziculare.
Recoltarea probelor biologice în scopul diagnosticului direct virusologic se
face pe medii aseptice tamponate care vor fi decontaminate bacterian fie prin
adugare de antibiotice, fie prin centrifugare sau filtrare.
Virusurile supravieuiesc, triesc i se multiplic doar în interiorul unei celule
vii (culturi de celule, animale de experien, ou embrionate). Prezena virusurilor în
structurile vii, utilizate pentru izolare, este pus în eviden prin modificri
histologice caracteristice sau prin evidenierea unor ageni virali hemaglutinani.
Identificarea virusurilor odat cultivate se face prin RFC (reacie de fixare a
complementului) sau HAI (reacie de hemaglutinoinhibare)
Inocularea pe animale de experien se face subcutan, intavenos,
intraperitoneal, intranazal, intracerebral, prin scarificare corneean sau
cutanat. Dup inoculare, animalul prezint semne de boal, iar virusul
replicat va fi identificat în sânge i esuturi.
Inocularea pe ou embrionate a suspensiilor virale se face pe ou de
gin, la care se verific prin transluminare la ovoscop viabilitatea i
dezvoltarea embrionului. Se poate face inoculare intravitelin,
intraalantoidian sau intraamniotic. Cu acelai produs patologic se
inoculeaz întotdeauna 2-3 ou, care se incubeaz la temperatura de 34-
35ºC, timp de 2-3 zile. Dup incubare se sacrific embrionul i se
67
macroscopice i/sau microscopice. Lichidele embrionare pot prezenta
proprieti caracteristice virusului replicat (capacitate hemaglutinant).
Reacia HAI permite evidenierea virusurilor hemaglutinante.
Inoculare