Identificarea spirochetelor. Diagnosticul de laborator al leptospirozei

Obiective:1. Cunoasterea principalelor caractere utilizate pentru identificarea spirochetelor2. Cunoasterea metodelor de diagnostic direct in leptospiroza3. Cunoasterea metodelor de diagnostic serologic in leptospiroza

1. Identificarea spirochetelor

Treponema Borrelia Leptospira

Caractere microscopice

bacterii Gram-negative spiralate, mobile

subtiri, capete efilate

groase fine, unul sau ambele capete indoite in carlig

spire regulate spire laxe si neregulate spire regulate, stranse, putin adanci

- pot fi observate in microscopie pe fond intunecat si pe preparate colorate prin impregnare argentica - nu pot fi observate pe preparate colorate Gram sau Giemsa

- pot fi observate pe frotiu colorat Giemsa sau Wright si in microscopie pe fond intunecat

- pot fi observate in microscopie pe fond intunecat - nu pot fi observate pe preparate colorate Gram sau prin impregnare argentica

- Mobilitate fibre axiale periplasmice inrulate in jurul protoplastului

fibre axiale periplasmice

axistil format din 2 flageli periplasmici in jurul carora se inruleaza protoplastul

Caractere de cultura

strict anaerobe sau microaerofile

microaerofile - strict aerobe

- foarte pretentioase nutritiv – speciile patogene nu cultiva pe medii acelulare

- pretentioase nutritiv- cultiva lent

- pretentioase nutritiv - temperatura optima 28-30ºC

2. Diagnosticul direct in leptospiroza:

Clasificarea leptospirelor:- tulpinile patogene sunt reunite în specia Leptospira interrogans (e.g. serovaruri Icterohaemorrhagiae,

Autumnalis, Canicola, Pomona)- tulpinile nepatogene au fost plasate în specia Leptospira biflexa (e.g. serovar Patoc )

Produse patologice: - sânge- LCR- urină- postmortem: microfragmente de ficat, corticală renală, plămâni, suprarenale.

Examen microscopic:a. Microscopia pe fond întunecat:

→ indicată pentru sedimentul urinar şi LCR→ în sânge expansiunile fibrilare ale hematiilor pot fi confundate cu leptospirele→ leptospirele = filamente regulat spiralate, luminiscente, foarte mobile, descriind mişcări de „sfredel”→ metodă lipsită de sensibilitate şi nespecifică

b. Imunofluorescenţa directă = metodă specifică

Cultivarea:→ Izolare din sânge sau LCR în primele 10 zile de boală;→ Izolare din urină după prima săptămână de boală, timp de 3 luni;→ Sunt necesare mai multe probe deoarece concentraţia leptospirelor poate fi scăzută;→ Cultivă optim la 28-30 ºC, în aerobioză, pe mediu de cultură lichid Korthof îmbogăţit cu ser de iepure;→ Culturile se urmăresc până la 30 de zile prin microscopie pe fond întunecat la intervale de 5 zile.

Tehnici de biologie moleculară- PCR - Metode de hibridizare directă

3. Diagnosticul serologic in leptospiroza

Reacţia de aglutinare microscopică = metoda de referinţă- măsoară capacitatea serului pacientului de a aglutina leptospire vii;- utilizează antigene specifice de tip preparate din tulpini patogene;- practicată doar în laboratoarele de referinţă.

Aglutininele apar în a doua săptămână de boală.Titrul la pacienţii infectaţi este > 100

Teste alternative:- hemaglutinarea indirectă- aglutinarea pe lamă- ELISA

→ mai puţin sensibile sau specifice→ folosesc antigene preparate din tulpini saprofite

În sală se găsesc:- microscop cu fond întunecat, ulei de cedru;- suspensie de leptospire vii nepatogene;- pipetă, vârfuri;- lame de microscop şi lamele;- cristalizor cu soluţie dezinfectantă.