Biocompatibilitate

LP 3 • Interactii organism gazda – biomaterial

• Teste de biocompatibilitate

Universitatea Politehnica BUCURESTI

Interactii organism gazda – biomaterial

Reacția ”gazdei” la implanturi

•Utilizarea de noi materiale si prepararea de implanturi reprezinta o mare provocare pentru stiinta si industrie, deoarece durata lor de viata este afectata de multi factori.

•In cazul unor implanturi care trebuie sa ramana in stare functionala in organismul uman perioade lungi de timp (coapse, genunchi) exista pericolul fisurarii si degradarii lor ceea ce poate conduce la eliminarea implantului, la eliberarea unor compusi toxici cu efecte nocive (uneori mutagene sau carcinogene) asupra tesutului gazda.

•Probabilitatea unui esec in implantare si aparitia unor reactii adverse uneori letale poate f i diminuata pr in studi i anter ioare privind biocompatibilitatea materialelor, proprietatile mecanice (rezistenta la compresie, elasticitatea), caracterul hidrofil, rezistenta la coroziune, etc

•Biocompatibilitatea materialelor dintr-un implant este conferita de tipul interactiilor lui cu ioni/molecule/formatiuni biologice din organism, de modul in care se integreaza in tesutul cu defect, etc. Ea este influentata de multi factori ca dimensiunea implantului, compozitia si forma materialului, caracteristicile suprafetei, capacitatea de umectare, rugozitatea, sarcina,etc.

Efectul implantului asupra corpului uman

• Local

– Interacția cu sângele

• Absorbția de proteine

• Coagularea

• Fibrinoliza

• Adeziunea, activarea și eliberarea trombocitelor

• Adeziunea și activarea leucocitelor

• Hemoliza

– Toxicitate

– Modificarea vindecării normale • Incapsulare

• Reacția la organisme străine

• Formațiuni PANNUS

– Infecții

– Tumori

• Sistemic – Embolizare

– Hipersensibilitate

– Eliberarea elementelor chimice din implant în sânge

– Transportul particulelor limfatice

Efectul organismului asupra implantului

• Fizice – efecte mecanice

– Uzură

– Oboseală

– Rezistență la coroziune, fisurare

– Coroziune

– Degenerare și solubilizare

• Efecte biologice

– Absorbția substanțelor din țesut

– Degradare enzimatică

– Calcifiere

Uzura facilitează Osteoliza

Particulele de uzură ce provin de la capul femural

poate induce: durere,pierdere osoasă,

revizie chirurgicală

Particule de uzură

Pierdere de os

Archibeck, MJ; Jacobs, JJ; Roebuck, KA; Glant, TT. Journal of Bone & Joint Surgery, 2000

Celule cancerose

Celule umane normale

Fibroblaste

keratinocite

Efectul tesutului asupra biomaterialului

Dupa implantare, tesutul poate afecta caracteristicile fizice si chimice ale biomaterialelor componente

• Tesuturile umane reprezinta un mediu dinamic (salin, bogat in enzime, uneori oxidant) care poate afecta implantul atat la suprafata lui cat si in profunzime; performanta implantului variind cu tipul si cantitatea produsilor de degradare

• Organismul gazda poate afecta implantul rezultand:

• modificari fizice in consistenta, duritate, elasticitate, calitatea suprafetei, etc: uzura abraziva, coroziune, fracturare mecanica, degenerare, dizolvare

• modificari chimice: absorbtia unor substante din tesut, hidroliza, oxidarea, calcifierea, etc

• In cazul implanturilor constituite din polimeri biodegradabili (sintetici si naturali) procesul de biodegradare este important deoarece permite indepartarea lor dupa ce s-a refacut tesutul lezat (pentru care s-a practicat implantarea) fara a fi necesara o noua interventie chirurgicala. In acest caz durata de viata a implantului polimer trebuie sa fie suficienta pentru a asigura finalizarea aplicatiei

In selectia unui polimer biodegradabil pentru o aplicatie biomedicala (medicina regenerativa) se tine cont de urmatoarele criterii, care depind de perioada de timp cat trebuie sa ramana functional implantul:

I. sa asigure o suprafata adecvata pentru aderarea si cresterea celulara;

II. proprietatile mecanice trebuie sa fie adecvate aplicatiei,

III. polimerul trebuie sa ramâna suficient de dur/elastic pâna la vindecarea tesutului din vecinatate;

IV. sa fie metabolizat in organism dupa indeplinirea rolului de „scaffold”, timpul de degradare trebuie sa permita repararea/formarea tesutului la locul leziunii fara sa fie necesara o noua interventie chirurgicala;

V. sa nu dezvolte un raspuns toxic;

VI. sa fie accesibil intr-o forma acceptabila aplicatiei si sa fie usor de sterilizat.

Acesti polimeri au la baza legaturi in structura de baza care pot fi hidrolizate cu viteze :

anhidrida > ester > carbonat sub actiunea conditiilor de mediu.

Etapele degradarii: 1) absorbtia apei; 2) reducerea rezistentei mecanice; 3) reducerea masei moleculare; 4) pierderea in greutate

Eroziunea are loc:

1. la suprafata [(poli (orto), esteri si polianhidride] cand pierderea de masa este mai rapida decat patrunderea apei în bloc;

2. in bloc (PLA, PGA, PLGA, PCL) cand patrunderea apei este mai rapida decat rata degradarii

Degradarea polimerilor

•Viteza hidrolizei creste cu 1. cresterea caracterului hidrofil;

2. scaderea cristalinitatii;

3. scaderea legaturilor intermoleculare (cross- linking)

4. cresterea raportului suprafata/volum

copolimer poli-lactic-co-glicolic acid hidroliza are loc in organism la 37oC si pH 7,4 Ionii (H+, Cl-, (PO4)

-3, Ca2+) pot fi catalizatori Infectarea micromediului (pH 4)

Viteza de hidroliza creste cu caracterul hidrofil, cand pot actiona catalitic enzimele organismului gazda

In cazul polimerilor naturali: fibrina, colagenul, chitosanul, gelatina, hialuronanul – predomina hidroliza enzimatica

Hidroliza afecteaza performantele implantului in vivo:

Degradarea polimerilor

Ex. Degradarea rapida a poliester uretanilor din reconstructiile ortopedice, produsii de degradare a

poli-uretanilor fiind suspecti de actiune tumorigena,

Ex. degradarea fibrelor PET (poli-etilen tereftalat) din aplicatiile cardiovasculare- (nu mai pot fi

folosite);

•Degradarea polimerilor prin oxidare

2 tipuri: sub actiunea mediului extern; de catre organismul gazda – mecanism radicalic (initiere, propagare,terminare)

Viteza reactiei de oxidare creste cu: 1) cresterea caracterului hidrofil;

2) scaderea cristalinitatii;

3) scaderea legaturilor intermoleculare (cross-linking) si

4) cresterea raportului suprafata/volum

Ca raspuns la implantare, organismul gazda dezvolta mecanisme de aparare prin intermediul celulelor fagocitare: neutrofilele si macrofagele.

Neutrofilele sunt leucocite cu rol major in apararea anti-infectioasa primara a organismului. In momentul aparitiei infectiei sunt produsi agenti chemotactici care determina migrarea neutrofilelor la locul infectiei, are loc degranularea si generarea de specii reactive de oxigen (ROS) care distrug agentii infectiosi

•

•Fagocitarea biomaterialelor

•10/30/2012

• Mecanismul fagocitozei

polimer termoplastic versatil, modelabil la momentul interventiei chirurgicale pentru aplicatii personalizate: ca material de umplere, in artroplastia totala de sold, de fixare a fracturilor vertebrale, substitut permanent de os, în tratamentul fracturilor patologice; iar in forma sa complet amorfa (cand este solid) utilizat in implanturile oftalmice, etc - numit "ciment acrilic",

Complicatii

• monomerul are MM mica, este extrem de lipofil, difuzand prin manusile de cauciuc chirurgicale intacte, putand pune in pericol sanatatea medicilor sau a personalului din camera de operatie;

• eliberarea monomerului în circulatie are efecte toxice directe, ca scaderea tensiunii arteriale pana la deces. Monomerul induce complicatii cardiovasculare si respiratorii, precum si efecte marcante asupra sistemului nervos periferic si central; materialul poate induce reactii de hipersensibilitate de contact la unii pacienti;

• in cazul protezelor dentare monomerul dizolvat afecteaza mucoasa orala, putand conduce si la aparitia unor tumori.

Polimetil metacrilatul (PMMA)

In mediul intern al organismului: ceramicele manifesta o susceptibilitate variata in functie de

structura si solubilitate.

Ex. fosfatii de calciu extrem de insolubili (corespunzatori apatitelor) sunt teoretic nebiodegradabili.

• Degradarea pasiva sub actiunea fluidelor biologice – eliberare de particule de la suprafata implantului (poate conduce la efecte inflamatorii)

• Degradarea mecanica – apare in cazul implanturilor supuse frecarii (proteze de sold) pot conduce chiar la pierderea implantului

• Degradarea celulara – reactii oxidative datorita speciilor active de oxigen eliberate de neutrofile, macrofage

• Unele impuritati din ceramice (As, Pb, Hg, Cd) eliberate in mediu pot da nastere la efecte toxice.

• Ex. alumina (A2O3) - ceramica bioinerta sufera o scadere a consistentei in timp dupa implantare - datorita dizolvarii preferentiale a impuritatilor ce rezulta in propagarea unei fisuri

• Ex. Ceramicele pe baza de fosfati de calciu pot fi resorbite de osteoclaste datorita similaritatii cu componenta minerala a tesutului osos

Degradarea materialelor ceramice

Coroziunea metalelor

proces de distrugere al unui metal prin reactii electochimice, ce au loc intre metal si mediul biologic

Proces redox datorat conductivitatii metalelor, in care electronii sunt transportati de la regiuni anodice spre regiuni catodice. Pentru transportul ionilor este necesara prezenta apei (un fi lm subtire de umiditate adsorbita).

•La anod: Fe(s) → Fe2+(aq) + 2 e–

•La catod: O2 + 2 H2O + 4e– → 4 OH– •Formarea ruginii: Fe2+ + 2OH- → Fe(OH)2

Hidroxidul precipita pe suprafata metalului, previne avansarea procesului, pasivare

Coroziunea metalelor

metalele implantate sufera coroziune cu consecinte grave locale si sistemice pentru organismul uman

Uzual utilizate: otel inox, aur, aliaje Co/Cr, Ti, Ta; Nitinol (55% Ni + 45% Ti; Shape-memory alloy; Super-elasticity

Coroziunea apare in cazul unui mediu hidratat si oxigenat, cand atomii metalelor devin ioni, se hidrateaza, se combina cu oxigenul si se dizolva

Doua tipuri de efecte ale coroziunii:

• Pierderea integritatii structurale si functionale a implantului;

• Eliberarea unor produsi ai coroziunii cu actiune nociva pentru

tesut/organism

In selectarea unui metal pentru o aplicatie biomedicala trebuie avut in vedere proprietatile mecanice/rezistenta la coroziune:

• metalele nobile sunt rar utilizate in aplicatii biomedicale datorita slabelor proprietati mecanice;

• liajele metalice cu potential de pasivare (otelul inox si Ti) sunt preferate datorita proprietatilor fizice si mecanice superioare

Produsii de coroziune ai otelului inoxidabil

• Fierul - eliberat prin coroziune se depune intra- sau extracelular, in reactie cu apa formeaza oxizi ce genereaza inflamatie si/sau necroza tisulara; in sange este transportat de transferina; utilizat pentru sinteza Hb; eliminat pe cale renala

• Nichelul - la coroziune se oxideaza la Ni2+, ce formeaza complexe anorganice insolubile generatoare de reactii alergice, tumefactii locale dureroase, eczeme, urticarie; are un mare potential carcinogenetic; prezinta o mare afinitate pentru albumina care transporta Ni2+ la distanta interferand cu metabolismul;

• Cromul - in mediu seric Cr3+ sau Cr6+ (mai toxic); reactii alergice, proprietati mutagene, cancerigene, concentrare in plamani, splina, rinichi; se combina cu macroglobulinele, eliminare prin rinichi, bila

• Cobaltul - in mediu seric Co2+ ce formeaza complexe cu albuminele, localizari la distanta

• Molibdenul - interfera cu metabolismul calciului si fosforului

Sterilizarea implanturilor medicale

•Toate implanturile trebuie să fie sterile inaintea utilizării lor, implantarea lor in conditii nesterile putand provoca infectii majore, cu consecinţe grave pentru pacient. 3 metode clasice se sterilizare, alegere in functie de proprietatile implantului si de aspecte economice

•Sterilizarea in vapori de apa (autoclavarea): • autoclave: 120oC, 15-30 min

• sub presiune

• unii polimeri se inmoaie/,topesc

• Sterilizarea cu oxid de etilena – 30-50oC, un ciclu dureaza 2- 48 ore; tratament cu EtO pur sau cu amestec de gaze (EtO + CO2, sau alt gaz diluant); se preteaza pentru sterilizarea unei game largi de Implanturi: suturi chirurgicale, lentile intraoculare, dispozitive pt reparare ligamente si tendoane, tesut osos, valve cardiace, grefe vasculare

• Principalul dezavantaj – EtO toxic (ochi, inhalare), suspect carcinogen uman

• Radiatiile gamma – capacitate mare de penetrare, doze de 25-40 kGy; utilizate pentru implanturi metalice pentru tesut osos, genunchi, proteze coapsa; pentru polimeri (poli-etilena, poli-esteri, poli-stiren, poli-sulfone, poli-carbonati)

• Nu pot fi sterilizate cu radiatii γ: poli-tetrafluoretilena (in general polimerii cu fluor) si UHMWPE (ultra-high molecular weight polyethylene). Implanturile UHMWPE sunt utilizate pentru inlocuiri totale de articulatii – radiatiile γ furnizeaza un mediu oxidant care induce degradarea oxidativa a implantului – cresterea densitatii si cristalinitatii, pierderea proprietatilor mecanice. Se incearca utilizarea unui mediu inert: argon, azot, vacuum in locul aerului – pret de cost ridicat

Alte metode de sterilizare: cu plasma gazoasa la temp. scazute, iradiere UVC

• LEE (Low-energy electrons) realizeaza sterilizarea suprafetei implanturilor in timp scurt milisecunde-secunde

• Tehnica permite mentinerea formei si proprietatilor suprafetei si poate fi adaptata si pentru sterilizarea in profunzime Se aplica la mase plastice, ceramice, componente electronice

•Sterilizarea cu electroni accelerati

Poli-etilen tereftalatul (PET)

s-au pus in evidenta mecanisme de degradare termica, oxidativa, hidrolitice, induse de radiatii – cand PET este stocat, sterilizat si implantat

Mediul de stocare

afecteaza calitatile implantului si succesul implantarii

multe variabile: area de stocare (sterila), conditii de stocare (lumina, umiditate, temperatura), chiar conditii de impachetare a implanturilor

In cazul sterilizarii cu vapori de apa: apare pericolul unor degradari hidrolitice; la 135oC si 24 ore are loc un atac hidrolitic masiv, chiar la 70o-100oC un grad de hidroliza a legaturilor esterice se observa in 15-20 min cu oxid de etilena – implantul trebuie stocat perioade mai lungi (cateva zile) pentru indepartarea urmelor de gaz

prin iradiere γ – se observa reactii complexe de degradare dependente de doza si timpul expunerii

•A II Efectele implantului asupra tesutului/organismului

•Formarea unei leziuni • Interactii sange-material • Formarea unei matrice provizorii • Inflamatia: acuta si cronica • Formarea tesut de granulatie • Reactia la corpi straini • Dezvoltarea unei capsule fibroase/fibroza

Secventa evenimentelor locale datorita implantarii

•Secunde/minute

•ore

•zile

•saptamani

Reactia organismului gazda

•timp

•Interactii sange - material

•Formarea matricei provizorii

•Inflamatie acuta

•Inflamatia cronica

•Tesutul de granulatie

•Reactie corp strain

•Formarea capsulei fibroase

leziune

•

• Intravscular

• Neutrofile

• Monocite

• Eozinofile

• Limfocite

• Bazofile

• plachete

Celulele tesutului conjunctiv

• Mastocite

• Fibroblaste

• Macrofage

• Limfocite

Componente ECM

• Colagen

• Elastina

• Proteoglicani

• Laminina

Parteneri implicati in raspunsul la ranire

Inflamatia

Reactie complexa a sistemului imun innascut ce implica tesutul

vascularizat

Caracteristici: Cresterea permeabilitatii vasculare; infiltrarea

proteinelor plasmatice si a leucocitelor; organizarea si

fagocitoza materialului strain

Simptome: tumefiere, edeme, febra, durere

Implanturi necompatibile: vindecare incompleta si incorecta,

dereglarea procesului inflamator, lezarea tesutului, esecul

implantarii

Inflamația • Reacția unui țesut vascularizat la o rană locală

• Impiedică, neutralizează și diminuează procesul sau agentul de

• Pune în mișcare o serie de evenimente care duc la vindecarea și refacerea zonei rănite prin înlocuirea țesutului lezat cu:

– Regenerarea celulelor paranchimale natice

– Formarea unei cicatrici fibroblastice

– Sau o combinație a celor de mai sus

Simtomele si

mediatorii inflamatiei

Permeabilitate vasculara crescuta

HistaminaSerotonina

Componente sistem complement C3a, C5a

Leucocite C4,D4, E4,

PAF, ROS

Febra Proglandine PGE,

Citokine II – 1, IL-16, TNF

Lezarea tesutuli

Enzime lisosomale din neutrofile si

macrofage

ROS

NOS

Chemotaxie

C5a, leucotriena B4, IL – 8,

produsi bacterieni

Durere

Proglandine PGE2,

Bradikinina

Vasodilatare

Prostaglandine E2D2, F20I2,

oxidul nitric

Evenimentele locale postimplantare

• Rana (datorată plasării dispozitivului, manipularea țesutului)

• Inflamație acută

• Inflamație cronică

• Țesut granular

• Reacții la organism străin

• Fibroză

• Reacțiile organismului la implant depind de:

– dimensiuni, formă, proprietățile chimice și fizice ale materialului

– Gradul de leziune al țesutului

– Țesut

– Organ

Inflamatia acuta

— raspunsul initial al organismului la stimuli nocivi - minute-zile

— realizat prin deplasarea crescanda a plasmei si leucocitelor (in special

granulocitele polimorfonucleare PMN) din sange la situsul leziunii

— exudatul - lichid ce contine electroliti si proteine > 30 g/l (în special

fibrinogen si imunoglobuline ); mediatori chimici si PMN

Mediatorii chimici produc manifestari specifice :

— vasodilatatie (ex.: prostaglandinele , oxidul nitric),

— cresc permeabilitatea vasculara ( histamina, radikinina)

— sunt chemotactici (factorul C5a si leucotriena B4).

— febra (IL1, TNF),

— durere ( prostaglandine , bradikinina)

— necroza tesuturilor ( enzime lizozomale , radicali liberi de oxigen).

Variația în timp a răspunsului inflamator

• Activat de către țesutul conectiv vascularizat lezat

•

• O serie de reacții

• Diferite tipuri de celule

• Controlate prin mediatori endogeni

Inflamație acută

• Durată relativ scurtă de timp – minute sau zile

• Secreția fluidelor și a proteinelor plasmatice

• Emigrarea leukocitelor (in special neutrofile) – Adeziune – Emigrare – Fagocitoză – Eliberarea produșilor de leukocite

Chemotaxia

• Migrarea unidirecțională a celulelor de-a lungului unui gradient chimic

• Varietate de substanțe endogene și exogene identificate ca fiind agenți chemotactici

• Fenomen de mediere a receptorilor

Mobilitatea aleatorie

Chemotaxia

Modele de predicție a răspunsului celular D

ensi

tate

cel

ula

ră

Poziția spațială

• Fagocitoza neutrofila a materialelor si organismelor straine

– Recunoastere (IgG and C3b)

– Atasare

– Acapararea de către Neutrofile

– Degradare, liză

• În functie de proprietățiile materialului- degradarea poate sau nu să apară – ”impiedicarea facitozei”

• Release of neutrophil products to degrade product – Ezime lizozomale – Metaboliti activi derivati din oxigen

• Extruziune directa sau exocitoza

• Cantitatea de enzime eliberate depinde de

dimensiunea particulelor de polimer – particule mari – eliberarea crescuta

Complement

• 20 de proteine

• Mediaza p serie de reacții biologice - apărare impotriva agenților microbieni

– Creste permeabilitat vascularizatiei

– Chemotaxa

– Opsonizarea

– Liza oraganismului tinta

Macrofage

• Datoriă productiei unui numar mare de produsi activi, celulele macrofage sunt cele mai importante celule din procesul inflamator – Proteaze neutre

– Factori chemotactici

– Metabolitii acidului arahidonic

– Metaboliti recativi la oxigen

– Componentele complementului

– Factori de coagulare

– Factori de creștere sau citokine

• Inițiarea răspunsului de vindecare

Tesut granular • Raspuns normal la vindecare din partea țesutului“ la

biomateriale

• A 3-5 zile de la implantarea dispozitivului

• Initiata prin actiunea monocitelor si a macrofagelor

• Proliferarea fibroblastelor si a celulelor endoteliale in zona lezata

• Tesut de culoare roz, aparent granular

• Celulele endoteliale – produc noi vase de sange

• Fibroblaste – sinteza coleganului si proteoglicanilor

• Formarea capsulelor fibroase

Reactie la corpul strain

• Celulele straine gigant

• Componente ale tesutului granular

• Forma si topografia materialuui determina compozitia reacției la corpul strain

apare cand organismul nu poate indeparta cauza inflamatiei:

— infectii persistente

— expunerea prelungita la agenti toxici iritanti

— reactie imuna persistenta

— deplasarea implantului

caracterizata prin:

— infiltrarea crescuta de celule mononucleare (monocite, macrofage,

limfocite)

— distrugerea tesutului indusa de celulele inflamatoare

— proliferarea fibroblastelor si productia de tesut conjunctiv

— angiogeneza

Inflamatia cronica

Introducerea unui implant se realizeaza printr-o operatie,

deci este urmata de un proces de vindecare normala daca

chirurgicala implantul este biocompatibil

Procesul de vindecare al unei rani – complicat , contine mai

multe faze care se suprapun partial, implica mai multe tipuri celulare

Inflamator

• 2 – 5 zile

• Stoparea sangerarii

• Dezvoltarea unui proces inflamator

Celulele tesutului conjunctiv

• 5 zile – 3 saptamani

• Formarea tesutului de granulatie

• Contractia ranii

• Epitelizarea

Componente ECM

• 3 sapt – 2 ani

• Se formeaza colagen, cresterea rezistentei tensile la rani

• Tesutul ciatriceal are 80% rezistenta din tesutul original

Fazele procesului de vindecare

Tesutul de granulatie

• caracteristic procesului de vindecare

• apare la 3 -5 zile dupa implantare

• aspect moale granular, roz pe suprafata ranii datorat noilor vase de sange care inmuguresc – proces numit angiogeneza sau neovascularizatie —

• contine clustere de capilare nou formate, fragile

• sangereaza usor

• de natura fibroasa

• poate incapsula implantul in tesut fibros care devine inert

•a b c

a. Tesut de granulatie neinfectat; b. Rana aproape vindecata;

c.Omfalocel- mal-ormatie congenitala - defect in inchiderea peretelui abdominal in reg. ombilicala

Complicatii in vindecarea ranilor

Vindecarea ranii in jurul implantului poate fi afectata de:

• coroziunea metalelor –

• eliberare de ioni degradarea polimerilor –

• eliberare de monomeri

• modificari in topografia si chimia suprafetei

Deplasari si frictiuni la interfata implant-tesut

• pot genera reactii inflamatorii, alergice , etc

Desi rar, unele implanturi pot induce tumori

• Cr, Ni, Co, monomeri ( clorura de benzil ), substante plastice , compusi eliberati

din materiale dentare restaurative

• Cancere ale tesutului conjunctiv – predominant sarcoame caracterizate prin

crestere infiltrativa locala si rapida , in urma unor implanturi ortopedice si grefe

vasculare

• Rareori – carcinoame – cancere ale epiteliului

Cicatricele – suprafete de tesut fibros care inlocuiesc tesutul normal (pielea) dupa lezare – apar dupa accidente boli sau interventii chirurgicale

Tesut cicatriceal format pe o grefa

Testele de biocompatibilitate stabilite de ISO (International Organization for Standardization) si FDA (Food Drug Administration) care permit predictii

privind modul în care un biomaterial va reactiona la contactul cu un tesut viu

Teste de biocompatibilitate

Consiliul Comunitatii Europene a prezentat directivele privind caracteristicile de siguranta, de protectie a sanatatii si de performanta ale dispozitivelor medicale, procedurile de certificare si de control aplicabile de toate tarile UE de la 1 ianuarie 1995 pentru facilitatea schimburilor comerciale in interiorul Comunitatii

Dispozitivele medicale sunt reglementate de trei directive:

Council Directive 90/385 EEC on Active Implantable Medical Devices (1990)

Council Directive 93/42 EEC on Medical Devices (1993)

Council Directive 98/79/EC on In vitro Diagnostic Medical Devices (1998)

Matricea testelor de biocompatibilitate

Pe orizontal: tipul de contact cu

organismul; Durata contactului: A-

limitata <24 h;B- prelungita 24 h-30

zile si C- permanenta >30 zile;

Testul:

1.Citotoxicitate

2.Sensibilizarea

3.Irritarea/Intracutanat

4.Toxicitatea sistemica acuta

5.Toxicitatea subcronica

6.Genotoxicitatea

7.Implantarea

8. Hemocompatibilitatea

9. Toxicitatea cronica

10.Carcinogenicitatea

11.Reproductivitatea

12.Biodegradarea

Pe vertical la Contactul cu organismul:

Dispozitiv superficial

• piele • membrane/mucoase

• supeafata afectata

Dispozitiv care comunica cu • tesuturi

• sangele circulant

Dispozitiv implant • intr-un tesut

• in sistemul sangvin

un DM destinat unui contact superficial, o perioada limitata

de timp nu trebuie sa îndeplineasca aceiasi

parametri de biocompatibilitate cu un DM permanent fabricat din acelasi

biomaterial.

Reglementarea conditiilor de testare

The three R's of alternatives : replacement, reduction, and refinement -

alternativa reductiva – scaderea numarului de animale utilizate alternativa

rafinata – imbunatatirea design si/sau a preciziei testului , alternativa de

inlocuire a studiilor pe animale cu studii in vitro pe culturi de celule

•R

•R

•R

Capacitatea potentiala a unui DM de a induce efecte subletale sau letale la nivel

celular ;

3 tipuri de dozari pe culturi de celule : • testul elutiei,

• testul contactului direct si • testul difuziei în agar (substanta gelatinoasa extrasa din unele alge rosii marine: geloza.)

• Testul elutiei, este preparat un extract (eluat) din biomaterialul testat si adaugat în

diferite concentratii la culturile de celule. Se monitorizeaza inhibitia cresterii celulelor

• Testul contactului direct, piese din materialul de testat sunt plasate direct pe

suprafata stratului de celule, care este acoperit cu o pelicula din mediul de cultura.

Substantele toxice eliberate din materialul testat pot scadea viteza cresterii celulelor

sau pot provoca diferite leziuni

• Testul difuziei în agar, o piesa din materialul testat este plasata pe un strat de

agar ce acopera un monostrat confluent de celule. Substantele toxice solubilizate din

material difuzeaza prin stratul subtire de agar si vor omorî sau leza celulele din monostrat

In prezent, determinarile de citotoxicitate in vitro trebuie folosite ca teste screening si

considerate în principal ca evaluari suplimentare fata de diferitele testein vivo

1. Citotoxicitatea (in vitro)

•10/30/2012

Textul cu Trypan Blue (TB) – colorant ce patrunde

in celula cand membrana este lezata . Celule moarte colorate în albastru , cele vii incolore.

Testul MTT – sare de tetrazoliu galbena

redusa de enzime mitocondriale la un formazan

albastru – aprecierea proliferarii, viabilitatii si

citotoxicitatii celulare

Testul cu Rosu Neutru (NR) – colorant cationic ce penetreaza membranele celulare (difuzie) si se acumuleaza intracelular în lisosomi, in matricea lisosomala. Celulele vii incorporeaza NR, citotoxiocitate = o scadere în preluarea si legarea NR

Modificari morfologice

Bromura de 3-(4,5-dimetil tiazol-2- il=2,5-difenil tetrazoliu) MTT galben

Formazan purpuriu

Dozare pe suspensii celulare obtinute prin tripsinizare care sunt însamantate pe o

placa multi-well la o densitate celulara de 1000- 100.000 celule/well si incubate într-o

atmosfera umeda cu 5% CO2 s i 95% O2 la 37°C.

Dupa diferite perioade detimp (6-24 ore) - în mediul de crestere se introduc 200

l/well solutie MTT (0,5mg/ml) si suspensie celulara cu MTT se incubeaza timp de 3 ore

la 37°C într-o a umeda cu 5 % CO2 .

Apoi se î ndepa rteaza mediul cu MTT si de adauga atmosfera 200 l/well izopropanol

sau dimetilsulfoxid pentru a dizolva cristalele de formazan

Densitatea optica este citita la 570 nm.

• necesar pt toate categoriile de dispozitive prin ISO 10993-1 standard, consta

intr-o reactie de sensibilizare potentiala indusa de un DM,

• testul consta in investigarea daca DM ca atare sau extracte ale lui induce o reactie

a sistemului imun la expuneri repetate;

• o faza de inductie (sensibilizare), când alergenul potential este prezentat

organismului, urmata de o faza de repaus si o faza decisiva în care

sensibilizarea are loc sau nu pe animale, cobaii albi, reactiile de sensibilizare se manifesta

prin înrosirea (eriteme) si umflarea (edeme) pielei

Cel mai utilizat testul GPMT (guinea pig

maximization test): – se aplica o injectie

intradermala cu solutia DM, se urmareste

reactia 1-2 sapt, se poate realiza fie o

evaluare gradata a unui raspuns puternic,

mediu sau absent, f ie se evalueaza EC50

– concentratia administrata intracutanat ce

sensibilizeaza 50 % din animale

2. Testul de sensibilizare

• Iritarea pielii = modificari reversibile în piele ca urmare a aplicarii unei

substante; coroziunea dermica = leziuni ireversibile (formarea de escare) în piele

• specii animale preferate sunt iepurii albi (albino), cu o înalta

sensibilitate la lumina

• testele de iritare a pielii - realizate pe extracte obtinute cu solventi polari

si nepolari sau cu DM însusi

• teste de iritare a pielii pentru o singura expunere sau expuneri

cumulative la DM

• in testul cu o singura expunere, iepurii sunt tratati câteva ore, în testul

cumulativ acelasi procedeu este repetat câteva zile

• extractele si agentii extractanti sunt aplicati pe piele – este evaluata reactia

pielii (înrosire sau umflare) gradat conform unui sistem de clasificare specific

3. Iritarea pielii

•GLP – good laboratory practice

4. Toxicitatea sistemica

• teste pentru alegerea diferitelor rute de administrare a probei: topic - dermic -

inhalare - intravenos - intraperitoneal – oral pot fi evidentiate efecte adverse

acute, subacute, subcronice si cronice

• Ex. efectele acute apar in 24 ore dupa aplicarea unei singure doze sau a

unor doze repetate animalelor de laborator;

• efectele subacute – in 14-28 zile;

• studiile long-term cel putin 90 zile

• Practic - extracte saline sau uleioase din materialul DM (dispozitiv

medical) preparat in conditii standard si administrat intr-o singura doza (50-

ml/kg) sau in mai multe doze, administrate prin injectii intravenoase (saline) sau

intraperitoneale (ulei) la un grup de 5 soareci, care sunt apoi cantariti.

• Soarecii control

– injectati cu lichidul de extractie.

– Urmatoarele 3 zile – sunt observate semnele adverse:

• convulsii,

• adoptare pozitie orizontala (culcat),

• modificari in greutate

In terapia cancerului prin chimioterapie – toxicitatea

medicamentelor utilizate variaza cu doza, ruta de administrare, durata

tratamentului, etc.

• Efectele citotoxice ale acestor medicamente sunt maxime fata de celulele

care prolifereaza rapid (canceroase dar si din maduva osoasa, tractul

digestiv, foliculii de par si gonade). Exista si toxicitati particulare. Ex.

vincristine-produce efecte neurologice (disparitia reflexelor, neuropatii),

doxorubicin–produce efecte cardiace cumulative ca stopul cardiac si

methotrexate ce produce leziuni renale si hepatice

Vincristine – alcaloid inhibitor mitotic

Doxorubicin – utilizat in regresia unor tumori canceroase

Metotrexatul– antime- tabolit, antifolat,

• O mutatie - alterare in structura DNA ce are ca rezultat modificari permanente

ereditare, in functie celulara propagate in generatiile ulterioare ale celulelor

realizate de agenti genotoxici Exista mutatii genice si mutatii cromozomale.

• Testele mutatiilor genice realizate in vitro si in vivo se aplica tuturor

DM care intra în contact permanent (>30 zile) cu corpul, cu exceptia DM

superficiale aplicate pe piele utilizeaza bacterii, culturi de celule mamaliene

, dar s i studii in vivo

5. Genotoxicitatea

Testul Ames – cel mai comun – reverse mutation assay – utilizeaza tulpini de Salmonella typhimurium, defective in His, deci sunt histidin – dependente. Sub actiunea unui agent mutagen are loc o mutatie inversa - recastigarea genei lipsa (recastiga capacitatea de a creste pe un mediu fara His) Problema -Salmonella (procariot) – nu este un model perfect pentru om – s-a adaptat un model pentru celulele eucariote (drojdie)

6. Implantare cu histologie

• Testele de implantare – mimeaza conditiile în care exista

materialul implantat - destinate evaluarii efectelor localizate produse de

un DM care urmeaza a fi introdus în corpul uman

• Se prefera iepurele si implantarea în muschii paravertebrali

• Implantarea se poate realiza chirurgical - crearea unei fose în muschi în

care este plasat implantul

• Examinarea macroscopica poate da unele informatii

• Analiza microscopica arata reactia tesutului la implant - masura a

biocompatibilitatii

• Teste ce investigheaza posibile modificari negative la nivelul sângelui cauzate

direct de DM sau de substante chimice eliberate din el: hemoliza, alterari în parametrii

coagularii, formarea trombusului, si/sau modificari imunologice

• Testele de hemocompatibilitate: investigheaza tromboza, coagularea, starea plachetelor

sangvine, parametri hematologici si imunologici

• Conform ISO 10993-4 (EN 30993-4), DM ce intra într-un contact scurt cu sângele circulant

(lansete, ace hipodermice sau tuburi capilare) nu necesita acest test.

Neutrofile si limfocite Fragmentarea nucleilor celulari ca normale urmare a expunerii la un DM pozitiv

7. Hemocompatibilitatea

• Testele dureaza mult timp si presupun observarea animalelor pe

parcursul unei perioade mari din viata lor administrarea produsului de testat: oral

pentru medicamente sau intravenos - pentru extracte de implanturi si DM

• soarecii sau sobolanii primesc doze zilnic timp de 18 - 24 luni

• in cazul extractelor obtinute din DM - o singura doza - la sfârsitul

perioadei, toate animalele sunt sacrificate, examinarea la microscop a

organelor/tesuturilor pentru prezenta tumorilor

• in cazul expunerii la diferite doze din substanta de testat – detectarea si

dezvoltarea unor leziuni neoplazice (inductia de tumori) în timpul sau dupa

expunere

8. Carcinogenicitatea