1.3.Concepţia actuală despre citologie

Citologia este o ramură a ştiinţelor biologice, care studiază structurile funcţionale şi fenomenele biologice generale comune tuturor celulelor, evidenţiind legile generale de desfăşurare a proceselor vitale la nivelul celular şi molecular de organizare. Manifestându-se ca o ştiinţă integrativă, ea foloseşte noţiuni de morfologie, biochimie moleculară şi celulară, fiziolgie celulară şi genetică moleculară. Ultimul deceniu se remarcă prin intensificarea studierii nivelului molecular al proceselor celulare. Celula este considerată ,astfel, un microcosmos, în care structurile şi funcţiile interacţionează armonios, fiind determinate şi reglate genetic, încât să se realizeze o eficacitate maximă.

Dezvoltarea biologiei celulare şi moleculare se datorează pe de o parte perfecţionării tehnicilor de studiere a celulei, iar pe de altă parte progreselor teoretice (conceptuale).

1.4.1.Tehnicile de studiere a celulei.

Sunt reprezentate de tehnici de microscopie (optică sau electronică) şi de tehnici de cercetare ( fizice, biochimice, debiologie celulară şi moleculară , etc).

1.4.1. Tehnicile de microscopie optică şi electronică Microscopia optică foloseşte fotonii pentru realizarea imaginilor, asigurând măriri

de 1500-3000 de ori (în mod obişnuit de 1400 ori), cu o putere de rezoluţie de 0,2 micrometrii (µm).(Fig.1.1)

Fig.1.1 Formarea imaginii în microscopul optic1.Sursa de lumină; 2.Dispozitiv de uniformizare şi dozare a

luminii;3.Condensor;4.Preparat;5.Lentilă obictiv;6.Imagine formată în obiectiv;7.Lentilă ocular;8.Imagine finală.

Microscopia în contrast de fază, permite examinarea celulelor vii.

Utilizează: microscoape cu interferenţă, pentru aprecierea cantitativă a masei unor componente tisulare; - microscoape cu interferenţă diferenţiată, pentru studierea suprafeţei celulelor.

Microscopia de fluorescenţă evidenţiază moleculele cu fluorescenţă

naturală ( vitamina A, catecolaminele) sau fluorescenţa indusă. Se foloseşte în imunohistochimie pentru detectarea reacţiei antigen-anticorp.

Microscopia cu ultraviolete foloseşte lumina ultravioletă pentru detectarea unor amino acizi sau a acizilor nucleici.

Microscopia cu lumină polarizată pentru studierea formaţiunilor cristaline.

Microscopul confocalPermite obţinerea de imagini tridimensionale ale structurilor din

preparatele histologice. Principiul de funcţionare este asemănător cu cel al microscopului de

fluorescenţă. Sursa de lumină este reprezentată de un laser a cărei rază trece printr-o diafragmă cu deschidere punctiformă, după care este reflectată de o oglindă mobilă spre lentila obiectiv. Preparatul este situat la nivelul distanţei focale a obiectivului. In urma acţiunii razei laser asupra preparatului, acesta emite un fascicul de lumină (eventual fluorescentă) care este colectat de lentila obiectiv şi dirijat spre diafragma punctiformă a detectorului , situată confocal ( în focarul lentilei obiectiv, opus focarului în care este situat preparatul), rezultând o imagine finală, care este captată de un detector (similar ocularului).

Razele luminoase emise de formaţiuni situate în alte planuri nu vor fi captate de detector, încât se obţine o imagine foarte"curată", neestompată de imagini ale obiectelor situate proximal sau

1

distal faţă de planul focal. Prin deplasarea în plan vertical a focarului lentilei obiectiv, se pot obţine imagini ale unor planuri succesive, ca profunzime, realizând "secţiuni optice", fără a fi nevoie de o resecţionare a preparatului. Imaginile planurilor succesive sunt stocate în memoria unui computer, care le "ansamblează" obţinând o imagine tridimensională a preparatului examinat.

Microscopul confocal permite examinatorului să obţină "tomografia" unei structuri histologice, fiind folosit pentru studirea citoscheletului, a dispunerii cromozomilor în nucleu,etc. Dacă este dotat cu lumină flurescentă se pot obţine imagini confocale fluorescente. Microscopul electronic se bazează pe utilizarea fluxurilor de electroni pentru realizarea imaginilor, permiţând obţinerea unor grosismente teoretice mai puternice de 10.000 de ori decât în microscopia optică. Se ajunge la o putere de rezoluţie egală cu 0,1 nanometri (nm).Există două tipuri principale de microscoape electronice: - microscopul electronic de transmisie şi microscopul electronic de baleaj (scanning).(Fig.1.2)

Fig.1.2 Formarea imaginii în microscopul electronic 1-Catod; 2-Anod; 3-Lentila (bobina)condensator;4-Preparatul; 5-

Lentila (bobina) obiectiv; 6-Imaginea primară; 7-Lentila (bobina) de proiecţie; 8-Imagine finală.

Microscopul electronic de transmisie (Transmission electron microscope - TEM) poate fi: - convenţional (CTEM), când diferenţa de potenţial ajunge până la 100.000 volţi; sau - de înalt voltaj (HVEM), când diferenţa de potenţial ajunga la 800.000 volţi.

Componentele esenţiale ale unui microscop electronic de transmisie sunt:

Catodul sau sursa de electroni, reprezentat de un filament de tungsten

încălzit.

Anodul, care relizează diferenţa de potenţial. Un sistem de electromagneţi, care acţionează ca nişte lentile

condensator, lentile-obiectiv şi lentile de proiecţie. Un suport pentru preparat sau portobiect, reprezentat de o grilă

metalică fină pe care se fixează secţiunea de ţesut, inclusă în masă plastică. Un ecran pe care se captează imaginea. Un dispozitiv de fotografiere a imaginii.Puterea de rezoluţie este de 2 Angstromi(Å), în practică ajungându-se la 1,2 nanometri.

Fig.1.3 Formarea imaginii la microscopul de baleaj (scanning)1-Catod; 2-Anod; 3-Lentilă (bobină) condensator; 4-Bobină de scanare; 5-Preparat; 5'-Detector de electroni; 6-Amplificator electronic; 7-Ecran de proiecţie;8-Imagine finală.

Ca fixatori se folosesc glutaralaldehida, pentru constiutienţi proteici şi tetraoxidul de osmiu pentru lipide şi fosfolipide.

Se realizează secţiuni de ordinul nanometrilor cu ajutorul unor ultramicrotoame, înzestrate cu cuţite de diamant.

Ultrasecţiunile sunt incluse în mase plastice şi întise pe grile de cupru. Pentru realizarea contrastului între diferite ultrastructuri se folosesc substanţe precum citratul de plumb şi acetatul de uranil.

La examinare se observă că structurile cu densitate mare dispersează (împrăştie) electronii, apărând de culoare închisă, în timp ce structurile cu densitate mică, care permit trecerea electronilor fară a-i devia apar clare.

În cazul microscoapelor electronice de înalt voltaj ( HVEM ), diferenţa de potenţial atinge un milion de volţi. Electronii pot pătrunde prin

2

celule întregi sau preparate de câţiva microni (cca. 2 microni). Se obţine o imagine detaliată a organizării tridimensionale, permiţându-se vizualizarea texturii celulare interne şi a unor detalii de structură, cum arfi de exemplu elemntele citoscheletului.

Microscopul electronic de scanning (Scanning electron microscope – SEM ) se carcterizează prin faptul că electronii nu trec prin preparatul studiat, ci mătură (şterg) suprafaţa acestuia, încât se va obţine o imagine tridimensională a accidentelor de suprafaţă. Puterea de rezoluţie este de cca. 100 Angstromi.

Când electronii folosiţi de TEM sau SEM bombardează preparatul se produc radiaţii X cu lungimi de undă caracteristice elementelor lovite de electroni. Prin analiza acestor raze X cu aparate adecvate se pot obţine estimări calitative şi cantitative foarte exacte asupra elementelor cu numărul atomic mai mare de 12.

1.4.2.Tehnici fizice .biochimice,de biologie celulară şi moleculară

Tehnici fizice:- Fracţionarea celulei prin centrifugare diferenţiată permite obţinerea în stare pură a unor

componente celulare, precum complexul Golgi, aparatul mitotic, ribozomi, etc. O contribuţie deosebită la perfecţionare acestei tehnici a adus-o G.Em.Palade care a pus la

punct centrifugarea în gel de sucroză.- Criofracturarea permite despicarea membranelor celulare îngheţate, la nivelul planului

median al bistratului lipidic.- Autoradiografia localizează materialul radioactiv din ţesut.- Historadiografia realizează o microradiografie cu raze X a unui preparat histologic.- Difracţia razelor X, care a permis descifrarea structurii spaţiale a proteinelor şi a acizilor

nucleici.- Difracţia şi dispersia de neutroni, prin care s-a descifrat organizarea moleculară a

cromatinei.- Rezonanţa magnetică nucleară de înaltă rezoluţie, ce se utilizează pentru studierea

interacţiunilor moleculare în membranele biologice.- Rezonanţa magnetică în impulsuri, folosită la studiul permeabilităţii membranelor pentru apă

şi ioni.- Rezonanţa electronică de spin, ce foloseşte ca markeri specifici substanţe cu electroni

impari care se ataşează şi evidenţiază molecule de ADN, de proteine,etc.- Spectrofluorometria,ce permite studierea vâscozităţii membranelor, difuziunea, rotaţia

proteinelor.

Tehnici biochimiceÎn biologia moleculară se utilizează:- Electroforeza în gel de poliacrilamidă, pentru studiiul proteinelor şi acizilor nucleici.- Marcările bazate pe fotoafinitate a unor părţi din moleculelele integrate în structuri celulare.- Reconstituiri de structuri şi funcţii celulare din componentele purificate.- Imunocitochimia evidenţiază reacţiile dintre antigen şi anticorp.

Tehnici complexe de biologie celulară şi molecularăSunt reprezentate de:- Tehnica ADN-ului recombinat.- Producerea de anticorpi monoclonali cu ajutorul hibridoamelor, ce a permis descifrarea

mecanismelor care reglează exprimarea genei.- Sinteza artificială a genelor.- Manipulări de gene, etc.

1.5. Progrese conceptuale.Progresele teoretice sau conceptuale au permis îmbogăţirea, dezvoltarea şi aprofundarea

cunoştiinţelor de biologie celulară şi moleculară. Sunt reprezentate de: - Analiza şi sinteza informaţiilor obţinute de morfologia celulară, biochimia şi biofizica

celulară, fiziologia celulară, ►genetica moleculară, imunologia celulară şi moleculară, virusologie,etc. În acest concept se manifestă două tendinţe opuse: una de acentuare a sintezei şi alta de extindere a sferei de sinteză.

3

- Molecularizarea informaţiilor , care constă în descifrarea structurilor şi funcţiilor până la nivel molecular. Acest fapt a dus la schimbarea denumirii acestei ramuri a ştiinţelor biologice din "citologie generală" în "biologie celulară" şi apoi în "biologie celulară şi moleculară".

- Integrarea informaţiilor obţinute prin toate metodele şi de la toate nivelele într-un tot unitar, încât biologia celulară şi moleculară studiază în mod complex şi complet aspectele morfofuncţionale ale celululelor, observabile la microscopul optic, ultrastructurile relevate de microscopul electronic, organizarea şi fiziologia moleculară, realizând o imagine exhaustivă a nivelului celular de organizare a materiei vii.

2. CELULA CA SISTEM BIOLOGIC

Prin sistem biologic se înţelege un ansamblu de elemente (componente) interconectate într-o formaţiune complexă, relativ stabilă, formaţiune care se comportă ca un întreg, cu proprietăţi şi funcţii distincte cantitativ şi calitativ de proprietăţile elementelor componente. Există sisteme lipsite de viaţă (abiotice), precum particulele subatomice, atomii, moleculele şi sisteme dotate cu viaţă ( biotice )cum ar fi celulele, ţesuturile, organele, organismul, populaţia, biocenoza şi biosfera.

Celula (cellula) este primul sistem biologic care manifestă cea mai importantă caracteristică a materiei vii - capacitatea de auto reproducere. Formele de "viaţă moleculară", identificate până în prezent, ca "prionii" (microorganisme patogene, formate din particule proteice, fară acizi nucleici) şi virusurile (microorganisme ce conţin acizi nucleici şi proteine) sunt capabile să se reproducă numai în interiorul celulei.

Celula, ca sistem, prezintă următoarele caracteristici:►Este un sistem deschis, pentru că are în permanenţă schimburi de energie şi substanţă cu

mediul extracelular.► Are un caracter istoric, apărând la un anumit moment al evuluţiei materiei vii şi putând să

dispară, atunci când materia vie îşi va produce o altă formă mai eficientă de organizare decât celula.► Are caracter informaţional, deoarece recepţionează, acumulează, prelucrează şi transmite

informaţii cu ajutorul codului genetic.► Prezintă trei categorii de programe, legate de capacităţile sale structurale şi funcţionale: a-

programul " pentru sine", ce asigură autoconservarea celulei ( de expl. în culturile de celule); b- programe ale sistemelor componente, ca de exemplu programele organitelor sau ale complexelor moleculare; şi c- programe superioare care asigură existenţa sistemelor superioare ( ţesut, organ, organism).

► Echilibrul dinamic, ce se manifestă printr-o "pendulare" continuă, faţă de o stare morfofuncţională optimă, stabilă.

► Autoreglarea sau "feed back"-ul, prin care îşi controlează procesele interne, în funcţie de relaţiile cu mediul prin mecanisme de tip cibernetic.

► Heterogenitatea internă este însuşirea de a fi alcătuită din elemente componente mai mult sau mai puţin diferite ( de expl. mitocondrii, ribozomi, microfilamente, microtubului,etc.)

► Integralitatea, prin care celula ca sistem, nu se reduce la suma însuşirilor elementelor componente, ci prezintă însuşiri noi (structurale şi funcţionale) pe care nu le au aceste elemente considerate izolat. Această înşuşire permite desfăşurarea funcţiilor biologice fundamentale: metabolismul, reproducerea, adaptarea, menţinerea stării de stabilitatea diferenţiată,etc.

Pe baza acestor caracteristici, concepţia actuală despre celulă o defineşte ca fiind: unitatea elementară a lumii vii, produs al evoluţiei, cu structură complexă, în relaţie de autonomie şi echilibru dinamic cu mediul înconjurător, având ca proprietăţi esenţiale metabolismul, autoreproducerea, creşterea şi dezvoltarea.

2.1. Arhetipurile celulare Există două arhetipuri (arhetip = model primar, după G.E.Palade) celulare: procariotele (procariot =prenucleat, fără nucleu distinct) şi eucariotele (eukariot= cu nucleu distinct).

2.1.1. Procariotele Sunt reprezentate, în principal, de bacterii şi de algele albastre verzi (denumite şi

cianobacterii). Ele sunt mai mici (1-10 µm) decât celulele eucariote şi lipsite de membrane intracelulare.

Organitele celulare sunt puţine ( numai ribozomi) sau absente. Nucleul nu apare distinct, genomul (totalitatea genelor) nefiind separat de citoplasmă. Prezintă un cromozom unic, dispus în citoplasmă şi reprezentat de un AND circular neconjugat cu proteine. ARN-ul şi proteinele sunt sintetizate în acelaşi compartiment, în citoplasmă.

4

Nu au aparat mitotic, deoarece se înmulţesc prin sciziparitate. Îşi realizează locomoţia prin flageli simpli. Au metabolism aerob sau anaerob.

Sunt delimitate de o membrană plasmatică, ce trimite prelungiri endocelulare, denumite mezozomi, dublată la exterior de un perete celular.

Nu prezintă citoschelet, nu au curenţi citoplasmatici, iar endocitoza şi exocitoza sunt absente. De obicei sunt monocelulare.

2.1.2.EucarioteleSunt reprezentate de protiste, fungi, plante şi animale. Au dimesiuni mai mari (5-100 µm) decât procariotele.Prezintă un sistem complicat de membrane intracelulare, care delimitează unele

componenete intracelulare (nucleul) şi unele organite (mitocondriile, reticulul endoplasmic,complexul Golgi,etc).

Au un nucleu distinct, în care este situat genomul, ce cuprinde mai mulţi cromozomi. Molecula de AND este foarte lungă şi conjugată cu proteine.

ARN-ul este sintetizat şi procesat în nucleu, în timp ce proteinele sunt sintetizate în citoplasmă.

Au citoschelet compus din proteine filamentoase, curenţi citoplasmatici şi desfăşoară procese de endocitoză şi exocitoză.

Prezintă aparat mitotic.Se divid prin mitoză şi meioză.

2.2 Morfologia generală a celulelor eucariote

Dimensiunile celulelor eucariote sunt extrem de variate. Ele se exprimă în următoarele unităţi de măsură: micrometrul, nanometrul şi angstromul.

Unităţile de măsură folosite în morfologia microscopică

Denumire Simbol ValoareMicrometrul ( = micronul ) µm ( µ ) 1 µm =0,001 mm = 10 –6 m Nanometrul nm 1 nm = 0,001 µm = 10-9 mAngstrom A 1A=0.1nm=10-4um=10-10m

Limita practică de rezoluţie a ochiului uman este de cca. 0,1 mm, a microscopului optic de 0,2µm, iar a celui electronic de 2 angstromi( Å ).

Pentru fiecare categorie de celule, dimensiunile sunt relativ constante, indiferent de specie sau mărimea organului. Diferenţele de greutate a aceluiaşi organ la specii diferite sunt generate de numărul de celule pe care îl conţin şi nu de volumul celulelor.

De exemplu, nefrocitele şi celulele musculare cardiace au dimensiuni apropiate la hominide, ecvine şi canide.

Limitele de rezoluţie in morfologie

A. Cu ochiul liber 0,1 milimetri (mm) Ovocitul de pasăre Ovocitul umanAmoeba

B. Cu microscopul optic

0,2 micrometri sau microni (μ sau μm)

Celule,Hematii,NeuroniNucleiMitocondriiBacterii, etc

C. cu microscopul electronic

2 Angstromi (Ǻ) sau 0,2 nanometri (nm)

Ribozomi,Virusuri, Organite celulaereMacromolecule molecule

5

* Prin rezoluţie se înţelege distanţa minimă dintre două puncte în care acestea pot fi percepute ca imagini seperate

Fig.2.1.Diagrama unităţilor de lungime

Dimensiunile medii ale diametrului celulelor se încadrează între 10-30 µm, dar în organismul animalelor există şi celule mai mici, precum: neuronii din stratul molecular al scoarţei cerebrale ( de cca.4-4 µm), eritrocitele (5-7 µm), precum şi celule ce ajung la dimesiuni foarte mari, un exemplu constituindu-l ovulul ce atinge un diametru de 150-200 µm la mamifere, 3,5 cm la păsări şi 10 cm la struţ. Neuronii motori din coarnele ventrale ale măduvei spinării au un corp ce atinge un diametru de 200 µm, iar dacă se iau în considerare şi prelungirile ajung la o lungime de 1-1,5 m sau mai mult, în funcţie de talia animalului. Fibra musculară striată are un diametru de ordinul micronilor, dar lungimea

este foarte variată, de la 1 la 12 cm.

Volumul celulelor variază în limite foarte largi de la 200 la15000 micrometri cubi (µm3), menţându-se constant pentru un anumit tip de celulă, independent de mărimea organului, aspect cunoscut sub denumirea de "legea constanţei volumului".

Vârsta şi funcţia determină variaţii în mărimea celulelor. Se observă o reducere a volumului celular în cursul embriogenezei timpurii, în cursul îmbătrânirii şi o creştere volumetrică în timpul dezvoltării postnatale. Se stabileşte un raport nucleo/citoplasmatic optim, un raport al suprafeţei celulei faţă de volum şi un raport între metabolism şi volumul celulei.

Masa (greutatea) unei celule este de aproximativ 10-12 g, iar cea a unui ovocit uman de 10 -8

g.

6

Fig.2.2. Forma celulelor1-Ovula; 2-Hematie de mamifer; 3-Eritrocit de pasăre; 4-Neutrofil de mamifer; 5-

Spermatozoid; 6-Celule poliedrice;7-Celule pavimentoase; 8-Celule cubice; 9-Leiocit; 10-Neuron piramidal; 11-Neuron piriform; 12-Celulă mezenchimală; 13-Fibroblast;14-Melanocit,15-Adipocit alb; 16-Histiocit; 17-Celulă prismatică cu platou striat; 18-Celulă caliciformă.

Forma celulelor, inţial sferică se modifică în cursul diferenţierii şi maturării celulelor. Forma celulelor este controlată atât de factori externi ca presiunea şi vâscozitatea mediului, cât şi de factori interni ca activitatea funcţională, vârsta, vâscozitatea citoplasmei, structura internă şi caracteristicile suprafeţei.(Fig.2.2 )

Forma celulelor se adaptează la funcţie, respectându-se o lege generală a biologiei, conform căreia se obţine maximum de randament funcţional cu minimum de cheltuieli materiale şi energetice.Astfel,celulele contractile sunt fuziforme sau cilindrice, iar celulele specializate în conductibilitate prezintă numeroase prelungiri.

Numărul celulelor este extrem de mare, ajungând la ordinul de milioane de miliarde (1014). Celulele sanguine reprezintă populaţia cea mai numeroasă, reprezentată de mai multe zeci

de miliarde. Numărul hepatocitelor şi al neuronilor este de circa 100 de miliarde, iar cel al nevrogliilor este de aproximativ 10 ori mai mare decât numărul neuronilor.

Durata vieţii celulei sau ciclul celular reprezintă intervalul de la apariţia unei celule până îşi termină propria sa diviziune.

Variază de la 10-20 minute până la 109 minute. Celulele bacteriene trăiesc câteva zeci de minute, celulele epiteliale 1-2 zile, hematiile 127 zile, iar unele celule musculare şi nervoase toată viaţa individului. La om, în fiecare secundă au loc peste 4 milioane de diviziuni celulare, într-o zi au loc cca. 350 bilioane diviziuni, iar într-un an 1014 diviziuni, număr egal practic cu numărul total al celulelor ce alcătuiesc corpul omului adult.

2.3. Compartimentarea celulelor eucarioteCelula eucariotă prezintă trei componenete principale: membrana, nucleul şi citoplasma.

(Fig.2.3)Membrana poate fi situtată la periferie, realizând pe de o parte delimitarea celulei de mediul

extracelular, sau poate fi dispusă în citoplasmă, unde formează un sistem de membrane intracelulare cu o suprafaţă deosebit de activă biologic, de 10-20 ori mai mare decât cea a membranei periferice.

7

Fig.2.3. Schema unei celule eucariote ideale

1-Membrana celulară;2-Nucleul; 3-Citoplasmă; 4-Lizozom primar; 5-Poliribozomi liberi; 6-Reticul endoplasmic rugos; 7-Reticul endoplasmic neted; 8-Complex Golgi; 9-Microfilamente; 10-Microtubuli; 11-Centrioli; 12-Corpuscul bazal; 13-Microvili; 14-Cil; 15- Fagozom; 16-Peroxizom; 17-Caveolă acoperită; 19-Nucleoli; 20-eterocromatină; 21- Cisternă perinucleară; 22-Por nuclear; 23-Mitocondrie; 24-Corp rezidual; 25-Granule de secreţie; 26-Picătură de lipide; 27-Granule de glicogen; 28-Pseudopode.

Membranele intracelulare, endomembranele sau citomembranele diferă între ele prin structură, compoziţie

chimică şi funcţie. Ele împart celula în două compartimente: compartimentul matriceal sau plasmatic "P" şi

compartimentul intracisternal sau "E". Există şi un compartiment secundar sau de tip "C", reprezentat de matricea mitocondrială şi a cloroplastelor.

Totodată endomembranele delimitează nucleul şi unele organite celulare (lizozomii, reticulul endoplasmic,complexul Golgi). Există şi organite nedelimitate de membrane (ribozomii,centriolii, corpusculii bazali, microfilamentele, filamentele intermediare şi microtubulii).

3. Membranele celulare Membranele celulare (membrana celullaris) sunt structuri moleculare complexe care

marchează limita celulei sau a unui teritoriu intracelular.Există trei categorii principale de membrane celulare:1.Membrana plasmatică sau plasmalema, ce conferă individualitate celulei şi participă la

interacţiunile dintre celule sau la cele cu mediul extracelular.2.Citomembranele sau endomembranele, reprezentate de membrana nucleului,

membranele reticulului endoplasmic, membranele complexului Golgi, membranele mitocondriilor, lizozomilor şi peroxizomilor.

3. Membranele speciale reprezentate de membranele tecilor de mielină şi de membranele discurilor din segmentul extern al celulelor vizuale din retină.

3.1 Organizarea moleculară a membranelor În evoluţia cunoştiinţelor despre organizarea moleculară a membranelor se disting mai multe

modele: iniţial, paucimolecular, unit, mozaicul fluid şi modelul actual.

Fig.3.1 Modelul paucimolecular.1-Bistratul lipidic; 2-Stratul proteic extern; 3-Stratul proteic intern.

Modelul iniţial (elaborat de OVERTON în 1895) a sugerat prezenţa lipidelor în membranele celulare, observând că solvenţii organici difuzează mai rapid prin membrane decât în apă. Lipidele din membrane sunt dispuse în strat dublu ( în bistrat ), pentru că suprafaţa filmului lipidic din hematii este dublă faţă de suprafaţa acestora. ( după GÖRTER şi GRENDEL – 1925 )

Modelul paucimolecular a fost elaborat ( în 1930 de DANIELLI şi DAVSON ) , după măsurarea tensiunii

8

superficiale a membranelor celulare, când au găsit aproximativ o dină/cm2 , faţă de 5 dine cât reieşea din calcule.

Asfel, ei au dedus că bistratul lipidic (stratul lipidic dublu) este tapetat pe ambele feţe de straturi de proteine, care reduc tensiunea superficială. Totodată au demonstrat experimental acest fapt, adăugând proteine, ce au produs reducerea tensiunii superficiale. Tot ei au elaborat modelul paucimolecular (paucus = puţin numeros), după care membranele celulare au un centru lipoid "lamina intermedia", ( format din fosfolipide, dispuse în strat dublu, cu capetele polare orientate spre exterior ), tapetat cu proteine, care formează o lamină externă şi alta internă.(Fig.3.1)

Modelul "UNIT" a fost elaborat ( de ROBERTSON, între 1958-1960 ), după cercetări

efectuate la microscopul electronic ( cu grosisment de 100.000), efectuate pe membrana tecii de mielină. După acest model, membranele celulare au o ultrastructură trilaminară, prezentând două benzi dense (de 2,5 nm), ce delimitează între ele o bandă clară ( de 3 nm), formată dintr-un ax lipidic hidrofob.

Acest model confirmă modele anterioare şi le dezvoltă, adăugând două noi concepte: - universalitatea bistratului lipidic şi - asimetria chimică, după care glucidele sunt ataşate numai pe faţa externă, lipsind pe faţa internă. Modelul este incomplet pentru că ignoră dinamismul moleculelor componente.(Fig.3.2).

Fig.3.2 Organizarea moleculară a membranei periferice

Modelul"mozaicului fluid", (elaborat de SINGER şi NICOLSON în 1972 ) susţine că moleculele componente ( de lipide şi de protide) se mişcă în mod întâmplător în bistratul lipidic.

Cercetările ulterioare au arătat că mişcările moleculelor sunt controlate de citoschelet şi sunt limitate la anumite porţiuni ale suprafeţei membranei. Există şi zone ale feţei externe a bistratului lipidic neacoperite de proteine.

Modelul actual susţine că: - bistratul lipidic este asimetric, fluid şi reprezintă axul întregului edificiu molecular al membranelor; - pe feţele hidrofile, proteinele sunt distribuite asimetric, în aranjamente caracteristice.

3.2. Ultrastructura membranei periferice

9

Membrana periferică are trei componente ultrastructurale: plasmalema, glicolema,citoscheletul membranei.

Membrana periferică a celulei eucariote

Glicolema

Componenta internă 20 nm

Puţin densă la fluxul de elecroni

Conţine:GalactozaGalactozaminaManoza,Fucoza,Glucoza

(50 nm) Componenta externă

30 nm Mai densă la fluxul de electroni

Glucozamina, Acidul sialic

Lamina externa 2,5 nm

Bandă densă la fluxul de elecroni

Conţine:Grupările polare hidrofile ale fosfolipidelorProteine extriseci

Membrana celulară periferică

Plasmalema(7- 8 nm)

Lamina intermedia

3 nm Bandă clară la fluxul de electroni

Conţine:Fosfolipide –70%Colesterol-25%Glicolipide-5%

Lamina interna 2,5 nm

Bandă densă la fluxul de electroni

Conţine: Grupările polare hidrofile ale fosfolipidelor Proteine extrinseci

Citoscheletul membranei

5-9 nm

Conţine:ActinăAnchirinăSpectrinăProteina benzii 4-1

3.2.1. Plasmalema

Plasmalema (plasmalemma) reprezintă structura de bază a tuturor membranelor celulare ( periferice sau endomembrane), fiind alcătuită din bistratul lipidic asociat cu proteine. Are o grosime de cca. 7,5 nm.

La un grosisment redus (de 10.000 ori ) apare ca o linie unică elecronodensă. La o mărire de 100.000 ori, dacă planul secţiunii a căzut perpendicular pe membrană, plasmalema prezintă un aspect caracteristic, trilaminar, cu două benzi dense (de 2,5 nm), separate de o bandă clară ( de 3 nm).

Endomembranele au ,în general, acelaşi aspect electronomicroscopic, respectând modelul unit. (Fig.3.3)

10

Banda luminoasă, clară (lamina intermedia) corespunde radicalilor de acizi graşi hidrofobi din fosfolipidele bistratului, iar benzile dense (lamina externa et interna) cuprind grupările polare hidrofile ale fosfolipidelor şi parţial proteinele asociate membranei.

Fig.3.3 Componentele membranei celulare perifericeI-Glicolema; II-Plasmalema; III-Citoscheletul membranei

Compoziţia chimică a plasmalemei cuprinde: lipide complexe, proteine şi glucide.

LIPIDELE sunt conţinute în bistratul lipidic, fiind reprezentate de fosfolipide (70%), colesterol (25%) şi glicolipide (5%).

Fig.3.4. Tendinţa de organizare a moleculelor de fosfolipideA-Monostrat; B,C- Micelii1-Laţuri de acizi graşi; 2-Grup polar; 3-Apă; 4-Aer

Fosfolipidele şi glicolipidele sunt molecule complexe cu caracter amfofil (=amfipatice=bimodale), prezentând un "cap" hidrofil (sau grupare polară) şi o "coadă"hidrofobă, ce cuprinde fragmente de acizi graşi esterificaţi.Ele au tendinţa de a se organiza în « pelicule sau micelii » , deoarece cozile trebuie să se dispună în afara contactului cu apa.Menţinerea moleculelor în pelicule sau micelii se realizează prin legături hidrofobe ce nu implică cheltuieli de energie.

În cazul fosfolipidelor şi glicolipidelor din membrană, forma cea mai stabilă a miceliilor este reprezentată de stratul lipidic dublu în care grupările polare sunt dispuse la exterior în contact cu apa, iar lanţul de acizi graşi se află la interior. Asfel, se formează un bistrat sau continuum lipidic.

Fosfolipidele din plasmalemă sunt reprezentate de fosfogliceride (ca de exemplu: fosfatidilcolină, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinozitolul) şi de sfingolipide ( dintre care cea mai răspâdită este sfingomielina. Molecula de fosfatidilcolină, denumită şi lecitină, are aspectul unui "cui", în care "capul" (alcătuit din radicali de colină şi fosfat) este hidrofil, poartă sarcini electrice şi este numit grup polar. Radicalii de acizi graşi sunt hidrofobi şi formează segmentul apolar al moleculei.

11

Glicolipidele pot fi simple ( de expl. cerebrozidele) sau complexe (de expl.gangliozidele). Au asarcină electrică negativă. Gangliozidele conţin unul sau mai multi radicali de acid sialic (numit şi acid N-acetilneuraminic sau NANA) care le conferă sarcină electrică negativă.

Încărcătura electrică negativă a suprafeţelor celulare este conferită în mare parte de grupările polare ale fosfolipidelor, ale glicoproteinelor sulfatate şi îndeosebi de radicalii carboxilici ai acidului sialic.

Colesterolul se găseşte în proporţie mai mare în membranele la care predomină funcţia de barieră, dar scade în membranele intracelulare.

Există o asimetrie în dispunerea lipidelor în bistratul membranei eritrocitare. Astfel,glicolipidele se găsesc numai în stratul extern, la nivelul căruia este abundent şi colesterolul. În stratul intern al bistratului lipidic sunt mai frecvenţi acizii graşi nesaturaţi, în timp ce în stratul extern se întâlnesc în proporţie mai mare acizii graşi saturaţi cu lanţuri lungi.

Lipidele sunt repartizate neuniform pe suprafaţa membranei celulare, putându-se grupa în "petice" sau "calote", cu implicaţii funcţionale speciale, îndeplinind rol de receptori.

Fluiditatea lipidelor. La temperatura corpului, toate lipidele din membrană se găsesc în stare fluidă. Ele pot executa două tipuri de mişcări: 1- mişcări în interiorul unei molecule, precum mişcări ale atomilor de carbon în lanţurile de acizi graşi şi în gruparea polară; 2-mişcări ale întregii molecule, ce pot fi: - de translaţie sau de difuziune laterală; - de rotaţie în jurul axei longitudinale a moleculei şi c- mişcări de difuziune transversală (flip-flop).(Fig.3.5)

Fig.3.5.Mişcările lipidelor în bistrat1-Gruparea hidrofilă; 2-Gruparea hidrofobă; 3-Difuziune laterală; 4-Rotaţie; 5-Flip-flop;6-Flexie.

Moleculele de lipide se deplasează mai uşor prin mişcări laterale în acelaşi strat şi trec foarte greudintr-un strat în altul.

Unele lipide (expl. cardiolipina) sunt capabile, în prezenţa ionilor de calciu, să se detaşeze din straturile lipidice şi să se dispună în formă hexagonală, în cilindri de lipide, care delimitează canale, ce permit schimburi selective prin bistratul lipidic.

PROTEINELE plasmalemei formează două straturi asimetrice, ce tapetează bistratul lipidic sau pot traversa bistratul lipidic, unde execută mişcări de translaţie (difuziune laterală) şi de rotaţie. (Fig.3.6).

Prin electroforeză în gel de poliacrilamidă au fost identificate 15 proteine majore, cu greutăţi moleculare între 15.000-250.000 daltoni. Trei din aceste proteine (spectrina, glicoforina şi proteina benzii 3) ocupă mai mult de 60% din greutatea proteinelor membranare.

Fig.3.6.Formarea porilor hidrofili

1-Lipide - grupări hihrofobe; 2-Lipide - grupări hidrofile; 3-Proteine;4-Por hidrofil.

12

S-au identificat două grupuri de proteine ( prin metode de cogelare-fracţionare şi fracţionare - purificare ):

-a) proteine transmembranare (intriseci sau integrale), cuprinse în bistratul lipidic ca nişte cuburi de gheaţă, legate hidrofil şi hidrofob de lipide. Se extrag foarte greu şi servesc ca dispozitive de recepţie-transducţie.

-b) proteine membranare periferice (sau extrinseci), situate de o parte şi de alta a bistratului lipidic, de care se ataşează prin slabe legături hidrofile.(Fig.3.7)

Fig.3.7. Dispunerea proteinelor în plasmalemă 1-Bistratul lipidic; 2- Proteine extrinseci externe;

3-Proteine extrinseci interne; 4-Proteine intriseci transmembranare

Proteinele extrinseci sunt distribuite pe o faţă sau alta a bistratului lipidic şi şi se leagă de capatele hidrofile ale lipidelor.

Sunt mai numeroase pe faţă internă unde participă la realizarea citoscheletului membranei celulare.

Proteinele de pe faţa externă a bistratului lipidic sunt glicoproteine şi se prelungesc pe distanţe mai scurte sau mai lungi în glicolemă, ataşând pe lanţul lor polipeptidic fragmente de oligozaharide.

Compoziţia, ordinea moleculelor şi dispunerea lanţurilor de de oligozaharide faţă de proteinele transmembranare determină specificitatea funcţională şi identitatea fiecărui tip de celule.

3.2.2. Glicolema sau glicocalixulGlucidele plasmalemei sunt reprezentate de hexoze, hexozamine şi acid sialic. Fragmentele

de acid sialic ocupă întotdeuna extremităţile periferice ale lanţurilor de oligozaharide şi conferă sarcină electrică negativă suprafeţei celulelor eucariote.(Fig.3.8)

Fig.3.8. Organizarea glicocalixuluiA-Glicocalix; B-Bistratul lipidic.

1-Rest glucidic; 2-Glicolipidă; 3-Glicoproteină adsorbită; 4-Proteină transmembranară

Lanţurile de oligozaharide sunt ancorate pe versantul extern al plasmalemei, formând un înveliş al

13

suprafeţei celulare, numit glicocalix (înveliş dulce) sau glicolemă. Nu există o delimitare netă între glicocalix şi substanţa vie din spaţiul extracelular, cunoscută sub numele de matrice extracelulară.

Glicolema sau glicocalixul (glicocalyx) este o componenta externă, de natură glicoproteică a membranei celulare periferice (cu grosimea medie de 50 nm) .

Glicocalixul prezintă două zone: - o zonă internă, denumită şi înveliş de suprafaţă, mai puţin densă, (cu grosimea de 20 nm) şi o zonă externă mai densă ( cu grosimea de 30 nm).

Grosimea glicocalixului apare variată. Este mult redusă la celulele în culturi; - subţiat (pâna la 20-30 nm), când ocupă spaţiul dintre celulele învecinate; - crescut (până la 50 nm) la celulele libere sau pe polul apical al celulelor intestinale.

Din punct de vedere chimic, glicocalixul este alcătuit dintr-o ţesătură delicată de de lanţuri proteice, pe care sunt ancorate fragmente de glucide. Dintre monozaharide, în glicoproteinele şi glicolipidele de la nivelul membranelor şi din glicocalix, cele mai importante sunt: galactoza, galactozamina, manoza,fucoza, glucoza, glucozamina şi acidul sialic.

Raportul strâns, de continuitate, dintre glicolemă şi plasmalemă se datorează glicolipidelor şi glicoproteinelor componente, învelişul de suprafaţă devenând parte integrantă a membranei celulare.

Glicocalixul conferă individualitate biochimică celulei, comportându-se ca o "carte de identitate a celulei", datorită numeroaselor variante moleculare pe care le realizează cu ajutorul monozaharidelor componenete. Intre moleculele membranei, oligozaharidele induc o variabilitate periferică pronunţată, în contrast cu varibilitatea redusă a lanţului polipeptidc. Astfel, trei aminoacizi diferiţi pot da naştere la şase tripeptide, în timp ce trei monozaharide pot genera 1056 trizaharide diferite.

Funcţiile glicocalixului sunt :►Participă, alături de matricea extracelulară, la realizarea adezivităţii intercelulare;►Asigură specificitatea şi individualitatea biochimică tipului de celule.Astfel grupele sanguine

sunt determinate de grupările glucidice terminale aflate pe glicoproteinele şi glicolipidele din membrana eritrocitelor.

►Conţine grupările glucidice ale proteinelor-receptori din membrană, dar şi ale unor proteine implicate în fenomenele de transport.

►Depozitează ionii de calciu (Ca2+)datorită sarcinilor elctrice negative şi intervine în controlul schimburilor ionice transmembranare.

► Participă la transmiterea informaţiei despre celulă. Astfel, unele celule din ficat şi din splină recunosc cu ajutorul receptorilor de membrană

glicoproteinele şi glicolipidele de pe suprafaţa eritrocitelor uzate, care au pierdut acidul sialic şi prezintă descoperită galactoza, ce ocupă penultimul loc din lanţ. Galactoza este recunoscută de receptorii macrofagelor din ficat (celulele Kupffer), încât hematiile uzate sau îmbătrânite sunt imobilizate, fagocitate şi lizate.

3.2.3. CitoscheletulCitoscheletul (cytoscheleton) membranei celulare este o reţea de proteine extrinseci (cu

grosimea de 5-9 nm), situate pe faţa internă a membranei periferice. Citosheletul este legat de plasmalemă prin intermediul capătului intern al proteinelor transmembranare, iar spre interiorul celulei se continuă cu citoscheletul din matricea citoplasmatică.

La microscopul electronic, citoscheletul membranei apare ca o reţea de microfilamente proteice orientate neregulat, în nodurile reţelei fiind prezente proteine globulare. (Fig.3.9)

Datele referitoare la citoscheletul mebranei au fost obţinute în urma cercetărilor efectuate pe membranele globulelor roşii, ulterior fiind considerate valabile şi pentru membranele altor tipuri de celule.

În membrana hematiilor, citoscheletul înglobează circa 60% din masa proteinelor întregii membrane. Principalele tipuri de proteine citoscheletale sunt: spectrina,anchirina, actina,glicoforina şi o proteină care în cursul electroforezei în gel de poliacrilamidă migrează în banda 4-1. Mai sunt prezente şi alte proteine neidentificate, ce au mase moleculare diferite. Prin extragerea spectrinei şi actinei, citoscheletul membranei se dezintegrează, piezându-şi forma şi structura.

Spectrina (sau tectina) este proteina care predomină în citoschelet. Moleculele solitare de spectrină sunt foarte flexibile. Apare sub forma a doi dimeri (unul de 240.000daltoni şi altul de 220.000 daltoni). Dimerii de spectrină au o formă de bastonaş cu o lungime de 100 nm şi o grosime de 5 nm. Ei se pot lega cap la cap formând tetrameri, hexameri, octameri.

14

Fig.3.9.Schema citoscheletului membranei

A-Complexul spectrină, anchirină, proteină integrală;

B-Complexul spectrină, actină,proteina benzii 4-1;

1-Proteină transmembranară; 2-Anchirină; 3-Filamente scurte de actină; 4-Proteina benzii 4-1; 5-Spectrină.

.Anchirina (nectina sau

sindeina) este un polipeptid, cu formă sferică sau piramidală ce leagă spectrina la capătul citoplasmatic al proteinei benzii 4,1.

Are o greuate moleculară de 200.000 daltoni,. Intr-o hematie de la om există cca. 120.000 de molecule de anchirină, într-un neutrofil - 600.000, într-un trombocit - 3.000, iar într-un fibroblast - 30.000.

Actina se găseşte sub forma de mici fragmente de actină fibrilară, ce conţin 13 monomeri. Lungimea fragmentelor de actină variază în funcţie de numărul moleculelor de spectrină pe

care le leagă prin capetele lor, fapt ce poate explica plasticitatea citoscheletului membranei, in vivo şi aspectul lax al acestuia la microscopul electronic.

Proteina benzii 4-1 are aspect globular ( cu diametru de 6 nm) .Laturile ochiurilor din reţeaua citoscheletului membranar sunt alcătuite din dimeri de

spectrină, iar nodurile reţelei (complexele joncţionale) sunt formate din două tipuri de complexe moleculare: - un complex ce conţine spectrină, anchirină şi o proteină transmembranară, ce realizează legătura cu membrana plasmatică; - şi un alt complex format din spectrină, actină, proteina benzii 4-1 şi adducină, prezent în nodurile propiu zise ale reţelei. Proteinele citoscheletului membranei, împreună cu lipidele şi proteinele de pe faţa internă a plasmalemei prezintă numeroşi radicali hidrofili electronegativi, încât încărcătura electrică negativă este mai puternică decât pe faţa externă.

Totodată, în citoscheletul membranei, se găsesc unele proteine cu locusuri de legare a calciului, denumite calmoduline, ce joacă un rol important în reglarea proceselor intracelulare. Legăturile dintre diferitele tipuri de proteine din citoschelet sunt realizate prin procese de fosforilare, în care intervine o proteină reglatoare, gelsolina, dependentă de calciu.

Citoscheletul conferă membranei: -1) elasticitate, prin dispunerea în reţea a proteinelor; şi -2) rezistenţă, prin complexele proteice de la nivelul nodurilor.

3.3.Diferenţieri de suprafaţa ale membranei celulare periferice.Sunt neregularităţi ale citoplasmei periferice, cu caracter tranzitoriu sau permanent,

delimitate de membrană.

Diferenţieri ale membranei celulare periferice

InvaginăriCripteCanalicule intracelulare

Diferenţieritranzitorii Expansiuni sau

Pseudopode Filiforme

Digitiformeprocese Procese lamelare Văluri

Membrane ondulante

Diferenţieri Microvilozităţi Platou striat

Margine în perie

15

permanente Expansiuni CiliFlageli

Diferenţierile tranzitorii apar şi dispar în raport cu anumite momente funcţionale ale celulei, având aspectul unor învaginări (invaginatio

Fig.3.10. Diferenţeri ale membranei celulare1-Capilar sanguin; 2-Neutrofile; 3-Pseudopod; 4-Nucleu de histiocit; 5-Văluri ondulante; 6-

Macrofag cu văluri; 7-Enterocit;8 -Microvili; 9-Glicocalix; 10-Lumenul nefronului; 11- Margine în perie; 12-Celulă prismatică ciliată; 13-Cili; 14-Axonema; 15_Corpuscul bazal; 16-Rădăcina cilului; 17-Secţiune transversală prin tija cilului; 18-microtubuli centrali şi periferici; 19-Stereocili pe celule epiteliale din epididim; 20-Flagelul spermatozoidului

cellularis) ale plasmalemei (în endocitoză), sau al unor expansiuni (processus celularis), cum ar fi pseudopodele sau vălurile ondulante, prin care se realizează deplasarea celulelor.

Pseudopodele (processus amoeboideus) sunt expansiuni cu formă de conuri (processus filiformis) sau degete (processus digitiformis), cu ajutorul cărora leucocitele aderă de suporturi, deplasându-se în timpul diapedezei. Ele conţin organite celulare, precum mitocondrii, ribozomi, lizozomi.

Vălurile şi membranele ondulante (processus lamellosus) sunt expansiuni lamelare, foarte mobile, ce se formează în mediul lichid. Nu conţin organite şi nu aderă la suporturi. Apar în urma unor modificări ale tensiunii superficiale şi se întâlnesc la histiocitele implicate în fagocitoză.

16

Expansiunile permanente sunt reprezentate de microvili, cili şi flagel.

Fig.3.11.Dispunerea microfilamentelor în microvilul intestinal

1-Microvili;2-Microfilamente de actină; 3-Microfilamente de miozină; 4-Zonula adherens.

Microvilii (microvillus, i ) sunt expansiuni cilindrice, delimitate de membrana polului apical (apex cellularis).Ele intervin în procesele de absorbţie prin mărirea suprafeţei de contact a celulei cu substanţele ce vor fi absorbite şi prin concentrarea unui număr mare de receptori. Pot fi dispuse grupat sau solitar. Microvilii solitari sunt inegali, cu forme şi dimensiuni variabile, distanţate unele de altele, formând marginea în perie ( de expl.la nefrocite, din tubii contorţi ai nefronului).

Platoul striat cuprinde numeroşi microvili (300-3000/enterocit) uniformi ca lungime (0,6-0,8µm) şi diametru (200 nm), îmbracati în glicocalix. Plasmalema microvililor conţine ATP-ază şi un număr mare de transportori. Citoplasma microvililor cuprinde în zona centrală microfilamente (10-40) de actină, dispuse paralel cu axul lung al microvilului.(Fig.3.11)

Microfilamentele de actină se inseră cu un capăt pe plasmalema polului apical al microvilului, iar la polul bazal al acestuia se termină într-o reţea perpendiculară de filamente de actină şi miozină, denumită buton terminal, ce are rolul de a menţine poziţia microvilului. Mănunchiul de microfilamente din microvil este legat de plasmalemă, din loc în loc,printr-o proteină, denumită fimbrină. Aceste legături formează o scară, în spirală, de-a lungul microvilului.

17

Fig.3.12.Cili- aspect, structură şi ultrastructurăA-Epiteliu pseudostratificat prismatic cilat; B-Celule prismatice ciliate,polul apical;C-Secţiune transversală prin cil.

Cilii (cilium,a) pot fi mobili (sau vibratili) şi rigizi (sau stereocili).Cilii mobili (kinetocilii) sunt prezenţi la polul apical al celulelor epiteliale din mucoasa

aparatului respirator sau a oviductului. Au o lungime de 5-15 µm, o grosime de 0,2 µm. unt formaţi din trei porţiuni: - tija sau porţiunea liberă, -corpusculul bazal şi rădăcina.

Tija (pars extracellularis) conţine o matrice electrono -densă, plasată la periferie şi un complex filamentos axial (sau axonema)(filamentum axiale), format din 10 perechi de tubuli longitudinali: -o pereche centrală (microtubulus centralis) şi - nouă perechi periferice (diplomicrotubulus periphericus), dispuse în jurul perechii centrale.

Corpusculul bazal (corpusculum basale) are un aspect cilindric şi cuprinde în structura sa nouă dublete sau triplete (triplomicrotubulus) periferice de microtubuli, lipsându-i perechea centrală. Coordonează mişcarea cililor.(Fig.3.12)

Rădăcina (radix basalis) cilului este formată din dubletele sau tripletele periferice ale corpusculului bazal care ajung în citoplasma polului apical al celulei ciliate. Are rolul de a ancora cilul în citoplasmă, prezintă proprietăţi contractile şi participă la conducerea stimulilor recepţionaţi de porţiunea liberă.

Stereocilii sunt cili rigizi, în structura cărora lipseşte perechea de microtubuli centrali, având numai cele nouă dublete periferice. Se întâlnesc pe polul apical al celulelor din epiteliul epididimului.

18

Flagelul (flagellum) are în axonemă o pereche centrală şi nouă perechi periferice de microtubuli. Este prezent în alcătuirea spermatozoidului. (microtubulus centralis) şi - nouă perechi periferice (diplomicrotubulus periphericus), dispuse în jurul perechii centrale.

Corpusculul bazal (corpusculum basale) are un aspect cilindric şi cuprinde în structura sa nouă dublete sau triplete (triplomicrotubulus) periferice de microtubuli, lipsându-i perechea centrală. Coordonează mişcarea cililor.(Fig.3.12)

Rădăcina (radix basalis) cilului este formată din dubletele sau tripletele periferice ale corpusculului bazal care ajung în citoplasma polului apical al celulei ciliate. Are rolul de a ancora cilul în citoplasmă, prezintă proprietăţi contractile şi participă la conducerea stimulilor recepţionaţi de porţiunea liberă.

Stereocilii sunt cili rigizi, în structura cărora lipseşte perechea de microtubuli centrali, având numai cele nouă dublete periferice. Se întâlnesc pe polul apical al celulelor din epiteliul epididimului.

Flagelul (flagellum) are în axonemă o pereche centrală şi nouă perechi periferice de microtubuli. Este prezent în alcătuirea spermatozoidului.

3.4. Joncţiunile celulare

Joncţiunile celulare (junctio intercellulares) sunt structuri stabile prin care plasmalemele celulelor interacţionează specific.

Tipuri de joncţiuni celulare

Spaţii intercelulareA. Joncţiuni simple Joncţiuni denticulate

Joncţiuni digitiforme

Joncţiuni de adezivitateDesmozomi în patăDesmozomi în bandă Hemidesmozomi

B.Joncţiuni complexe Joncţiuni impermeabile Joncţiuni focaleJoncţiuni de comunicare

C. Complexe joncţionale

Fig.3.13.Tipuri de joncţiuni celulare

A-Joncţiuni impermeabile - zonula occludens; B-Desmozomi în bandă - zonula adherens; C-Desmozomi în pată - macula adherens; D-Joncţiuni permeabile -gap.

In raport cu structura lor, se descriu joncţiuni simple, joncţiuni complexe şi complexe joncţionale (jonctio intercellularis complex).

În cazul joncţiunilor simple (junctio intercelluaris simplex), între plasmaleme există un spaţiu (de cel puţin 30 nm) prin care pot trece toate tipurile de molecule existente în mediul intercelular. După aspectul lor, joncţiunile simple sunt de trei feluri : - spaţii

intercelulare, - joncţiuni intercelulare denticulate (junctio intercellularis denticulata), şi - joncţiuni intercelulare digitiforme (junctio intercelluaris digitiformes).

În raport cu funcţiile lor , se disting trei categorii de joncţiuni complexe: -de adezivitate, - impermeabile şi -de comunicare.(Fig.3.13)

19

3.4.1.Joncţiunile de adezivitate sau dezmozomii.Desmozomii (desmosoma) sunt joncţiuni ce conferă o mare rezistenţă mecanică unor ţesuturi

şi organe, solicitate în acest sens . Se prezintă sub trei forme, toate întâlnite în ţesuturile epiteliale: 1-desmozomi în pată; 2-desmozomi în bandă; 3-hemidesmozomi.

Desmozomii în pată (macula adherens) .Se mai numesc şi desmozomi în "spot", în "nit", sau macula adherens (macula = pată, în limba latină). Sunt prezenţi mai ales în ţesuturile epiteliale de acoperire. În alcătuirea lor intră următoarele componente: 1- plasmalemele adiacente, dispuse paralel, la o distanţă de 25-30 nm; 2-un material proteic, intercelular dens la fluxul de electroni, cu aspect filamentos, bisectat de o densificare centrală,bogată în glucide şi calciu; 3-densificări intracelulare, în formă de disc, ataşate de plasmalele joncţionate; 4-dispozitive de legătură sau linkeri, reprezentaţi de microfilamente, ce se detaşează din materialul dens intercelular, străbat plasmalemele şi apoi discurile intracelulare, pentru a se ancora la microfilamentele citoscheletului; 5-elemente citoscheletale, respectiv microfilamente de actină sau filamente intermediare de cheratină, care se numesc tonfilamente.(Fig.3.14)

Fig.3.14 Desmozom în pată-schemă1 - Plasmalemele adiacente; 2- Spaţiu şi material intercelular; 3-Discuri intracelulare; 4-Linkeri; 5-

Tonofilamente.

Desmozomii în bandă (zonula adherens) sau în panglică (zonula=panglică, în latină) sunt prezenţi la polul apical al celulelor epiteliale şi la nivelul segmentelor transversale ale discurilor intercalare cardiace.

Prezintă o structură asemănătoare cu cea a desmozomilor în pată, cu următoarele deosebiri: -spaţiul intercelular, de 15-25 nm este mai sărac în material electronodens; -densificările intracelulare, de pe faţa internă a plasmalemelor joncţionate, nu au formă de disc, ci de bandă sau panglică. (Fig.3.15)

Hemidesmozomii (sau semidesmozomii) (hemidesmosoma) reprezintă o variantă a desmozomilor în pată, prin care se leagă celulele epiteliale de membranele bazale. Prezintă numai

20

jumătate din structura desmozomului în pată, în sensul că, pe frotul citoplasmatic al plasmalemei există un disc, care se leagă de membrana bazală prin filamente.

Fig.3.15. Schema desmozomilor în bandă (zonula adherens)A-Densificări intracelulare în bandă; b-Spaţiul intracelular.

3.4.2.Joncţiunile impermeabile

Sunt dispuse în panglică, fapt pentru care se mai numesc zonula occludens ( sau joncţiuni strânse).

Se caracterizează prin obliterarea spaţiului intercelular, deoarece membranele adiacente se apropie complet sau se sudează pentru a forma structuri pentalaminate sau heptalaminate. La realizarea acestor joncţiuni participă proteine transmembranare, care se dispun în şiruri gemene pentru a construi dispozitive ce se conectează "în fermoar" pe feţele externe ale membranelor adiacente. Pe feţele interne , proteinele transmembranare sunt "ancorate" prin intermediul unor microfilamente la citoscheletul matricei.

21

Fig.3.16.Schema joncţiunilor impermeabileA-,B-Plasmalemele adiacente; C-Proteine transmembranare;D-Spaţiu intercelular; E-Enterocit; F-Citoscheletul matricei.

Aceste joncţiuni împiedică scurgerea fluidelor printre celule, inclusiv a micromoleculelor, care sunt obligate să treacă prin celulă. Sunt întâlnite la porţiunile apicale ale celulelor care delimitează lumenul intestinului. Astfel, glucoza este pompată activ din lumenul intestinal în celulă prin suprafaţa polului apical, după care trece în sânge prin difuziune facilitată mediată de transportorii situaţi în zonele bazo-laterale ale plasmalemei, pe care o polarizează funcţional într-un domeniuapical şi altul latero-bazal.Totodată, joncţiunile strânse împiedică Retrodifuziunea glucozei din spaţiul intercelular în lumenul intestinului.(Fig.3.16).

Joncţiunile strânse au aspecte diferite, în funcţie de ţesutul epitelial în care sunt prezente. Astfel, joncţiunile strânse de la polul apical al celulelor din tubul contort proximal al nefronului au o rezistenţă relativ scăzută, fiind formate numai din unul sau două şiruri de proteine transmembranare. La nivelul celulelor epiteliale din mucoasa vezicii urinare, joncţiunile strânse conţin şase sau mai multe şiruri de proteine transmembranare, încât se realizează o joncţiune puternică, extrem de greu de traversat. La nivelul barierei hematoencefalice, joncţiunile strânse existente între celulele endoteliale ale vaselor din encefal realizează o protecţie eficientă pentru ţesutul nervos, permiţând însă trecerea glucozei (principala sursă de energie) din sânge în creier şi trecerea, în sens invers a bioxidului de carbon, rezultat din respiraţia celulelor nervoase.

Joncţiunile celulare strânse se caracterizează prin: -flexibilitate şi siguranţă; - formarea unor bariere chimice şi fizice intercelulare; - conferirea unei polarităţi a celulelor angajate în joncţiuni; -apariţia de timpuriu, între celulele embrionare, iniţial sub formă de macule, care se extind treptat, luând formă de zonule.

Joncţiunile focale reprezintă o variantă a joncţiunilor strânse, în care membrana celulei se apropie de substratul de adezivitate până la 10-15 nm. Pe faţa extracelulară a membranei sunt prezente filamente glicoproteice de fibronectină, iar pe faţa intracelulară se aglomerează fascicule de microfilamente de actină şi vinculină, care se leagă de plasmalemă prin intermediul unor densificări adiacente membranei. Între filamentele de fibronectină şi microfilamentele de actină şi vinculină se realizează dispozitive transmembranare de legătură (de 8-20 nm), denumite fibronexuri.

22

3.4.3.Joncţiunile de comunicarePermit trecerea unor molecule mici dintr-o celulă în alta şi sunt de de două tipuri: joncţiunile

permeabile şi sinapsele.Joncţiunile permeabile, de tip gap, nexus sau macula comunicans sunt realizate prin

structuri proteice, denumite conexoni, ce străbat plasmalema, proeminând de o parte şi de alta a bistraturilor lipidice ale membranelor adiacente. Sunt răspândite în diferite tipuri de ţesuturi, reprezentând principala cale de comunicare intercelulară. Permit schimburi rapide de molecule, făcând posibilă o cooperare metabolică eficientă.Spaţiul intercelular (spatium intercellulare) este foarte îngust (2-4nm). În momentul realizării joncţiunii permeabile, conexonii din cele două plasmaleme se aşează cap la cap, formând canale directe de comunicare între citoplasmele celor două celule, fără deschideri în spaţiul intercelular.(fig.3.18).

Fig.3.17Schema joncţiunii permeabile (gap)1-Plasmalemele adiacente;2-Spaţiu intercelular; 3-Conexoni; 4-Canale intercelulare.

Fig.3.18.Diagrama schimburilor moleculare prin joncţiunile gap.

Un conexon are o formă de prismă hexagonală cu diametrul de 7-8 nm şi este alcătuit din 6 subunităţi proteice (oligomeri). Subunităţile delimitează un canal hidrofil cu diametrul reglabil. Ionii de calciu intracelular (Ca2+) modifică diametrul canalului, controlând astfel comunicarea intercelulară.Canalul hidrofil al joncţiunii gap permite trecerea dintr-o celulă în alta a ionilor şi a unor molecule cu

greutate sub 1.000-1500 daltoni, precum: glucide, aminoacizi, nucleotide, hormoni, vitamine,etc. Nu pot să treacă macromoleculele (proteine, acizi nucleici, etc.), dar sunt de 10.000 ori mai permeabile pentru ionii metalici decât restul suprafeţei membranei.

În culturile de celule, joncţiunile de tip gap se organizează foarte rapid, din proteinele existente în plasmalemă, care se grupează în conexoni. Ele permit schimbul unor molecule de mărimi medii, ca nucleotizii.

23

Joncţiunile gap sunt necesare mai ale în situaţiile în care celulele trebuie să acţioneze simultan, în grup, cum este cazul celulelor embrionare, pe cale de diferenţiere sau între celulele musculare (cardiace şi netede), nervoase şi endocrine.

3.4.4.Complexele joncţionaleCuprind joncţiuni strânse spre frontul luminal şi desmozomi spre frontul latero-bazal. Sunt

întâlnite, mai ales, între celulele din epiteliile intestinale şi renale. În complexele joncţionale sunt prezente toate tipurile de legături intercelulare necesare pentru îndeplinirea funcţiilor specifice ţesuturilor respective.(fig.3.19)

Fig.3.19. Complexe joncţionale în epiteliul intestinului subţire.A-Micvrovili;B-Joncţiuni impermeabile; C-Desmozomi în bandă; D-Desmozomi în pată;E-Filamente din citoschelet;F-Joncţiuni permeabile; G-Hemidesmozomi; H-Mebrana bazală.

24

3.5. Receptorii din membrane

Receptorii din membrane sunt dispozitive moleculare proteice intramembranare, cu ajutorul cărora se interceptează semnalele, ce sosesc pe cale nervoasă sau umorală.

Receptorii din membrane

Denumire

Liganzi = mesageri extracelulari (de ordinul I)

Receptori pentru:

Mediatori chimici locali Mediatori chimici locali

Hormoni hidrofili (insulina,glucagonul,etc)Hormoni

Hormoni hidrofobi (Hormoni steroizi sexuali)A. Receptori pentru substanţe endogene

Neurotransmitători

Acetil colinaAdrenalinaNoradrenalina Dopamina, serotonina GABA= Acidul gama aminobutiricAcidul aspartic

Subst. imunogeneAntigene endogeneAnticorpiComponentele complementului

B. Receptori pentru substanţe exogene

VirusuriAntigene non selfToxine microbieneLectine, etc

AdenovirusuriMixovirusuriAntigene nonslefToxine microbieneLectine,etc

Toate substanţele care se leagă de receptori şi modulează (modifică) funcţia celulară se numesc liganzi. Liganzii sunt substanţe, produse de celule specializate, care acţionează în mod specific asupra unui grup de celule "ţintă", producând-le modificări ale activităţii . Ei sunt denumiţi şi mesageri extracelulari sau mesageri de ordinul I, cei mai cunoscuţi fiind hormonii şi neurotransmiţătorii.

Liganzii acţionează în cantitate foarte mică (10-8 M), iar receptorii îi leagă cu o constantă de afinitate mare (K=108 litri/mol).

Există două mari categorii de receptori în membrane: receptori pentru substanţe endogene şi receptori pentru substanţe exogene.

3.5.1. Receptorii pentru substanţe endogeneSe cunosc mai multe categorii de molecule semnal (de liganzi) de natură endogenă (produse

de organism): 1-mediatori chimici locali; 2-hormoni; 3-neurotransmiţători; 4-substanţe imunogene.Mediatorii chimici locali sunt secretaţi de unele tipuri de celule şi acţionează numai asupra

celulelor din imediata lor vecinătate. Ei sunt rapid captaţi şi distruşi.(Fig.3.20).Hormonii sunt substanţe endogene produse de celulele glandelor endocrine. Pe cale

sanguină, ajung la celulele ţintă din diferite organe, acţionând la distanţe mari de locul de producere.Neurotransmiţătorii sunt substanţe endogene produse de neuroni şi eliberate la nivelul

sinapselor chimice. Ei acţionează numai asupra neuronilor agajaţi în sinapsă.Hormonii şi neurotransmiţătorii sunt consideraţi mesageri de ordinul I. Hormonii au o compoziţie chimică variată, putând fi substanţe steroide (hormonii sexuali) sau polipeptide ( ca de expl. hormonii pancreatici şi tiroidieni). Hormonii steroizi pătrund în celulă, traversând bistratul lipidic, pe când cei polipeptidici se cuplează cu receptorii specifici din membrană, acţionând de la acest nivel.

Substanţele imunogene sunt reprezentate de : -antigene endogene; - anticorpi; - componentele complementului.

Receptorii pentru neurotransmiţători sunt situaţi în membrana postsinaptică a celulelor nervoase, în membrana celulelor musculare sau a altor celule efectoare. Ei recepţionează

25

acetilcolina, noradrenalina, dopamina, serotonina, adrenalina, histamina, acidul gama-aminobutiric, acidul aspartic, encefalina,etc.

Fig.3.20. Molecule semnal endogene.

Receptorii pentru hormoni au o localizare diferită în celulă, în funcţie de tipul hormonului, hidrofil sau hidrofob. Hormonii hidrofili (insulina, glucagonul, adrenalina, hormonii hipofizari, parathormonul,etc.) se ataşează de receptorii din membrana periferică, transmiţând celulei informaţia necesară pentru a-şi modula activitatea. Dintre receptorii hidrofili, cei mai bine studiaţi sunt receptorii pentru insulină din membrana hepatocitelor şi adipocitelor. Ei au o masă moleculară de 300.000 daltoni, iar în membrana unei celule există circa 10.000 receptori pentru insulină. Hormonii hidrofobi (steroizi şi tiroidieni) traversează membrana celulei ţintă şi se leagă de receptorii membranelor intracelulare.

Receptorii pentru substanţele imunogene sunt de trei feluri: 1-pentru antigene endogene; 2- pentru anticorpi; 3- pentru complement.

Receptorii pentru antigene endogene sunt mai numeroşi pe membrana limfocitelor T, sunt codificaţi genetic şi au capacitatea să recunoască structurile moleculare "self" (proprii organismului respectiv).Ei pot fi prezenţi şi în membrana unor celule neimunogene (expl. în membrana enterocitelor.)

Receptorii pentru anticorpi sunt receptori Fc, pentru fracţiunea cristalizabilă a imunoglobulinei G. Ei sunt prezenţi în membrana celulelor din sistemul fagocitelor mononucleare. În membrana bazofilelor şi mastocitelor se găsesc receptori pentru imunoglobulina E.

Receptorii pentru complement leagă cea de a treia componentă a complementului de suprafaţa celulei, fiind caracteristici celulelor din sistemul fagocitelor mononucleare.

3.5.2.Receptorii pentru substanţe exogene Sunt receptori pentru:- virusuri, capabili să recunoască adenovirusuri, mixovirusuri,etc.;- antigene nonself (străine de organism); sunt prezenţi pe suprafaţa limfocitelor B şi au o

structură moleculară asemănătoare imunoglobulinelor.Aceşti receptori determină transformarea blastică a limfocitelor B, după contactul cu antigenul.

- toxine microbiene. Sunt prezenţi în membrana celulelor imunocompetente.- lectine. Lectinele sunt substanţe proteice sau glicoproteice, extrase din ţesuturi vegetale sau

animale, capabile să formeze punţi între glicoproteinele membranare.

3.5.3.Mecanismul de acţiune al receptorilor.

26

Receptorii din membranele de suprafaţă sunt activaţi în majoritatea cazurilor de molecule semnal (liganzi) hidrofile.

Moleculele semnal hidrofile nu pot străbate membrana celulară decât după ce se leagă de receptorii specifici. Sub influenţa diferiţilor liganzi se produc modificări metabolice în celulele ţintă. Ataşarea liganzilor de receptori se realizează prin legături hidrofobe şi legături de hidrogen ( ca de exemplu legarea insulinei de receptori ). Legăturile sunt labile şi strict dependente de concentraţia liganzilor din mediul extracelular.

Efectele acţiunii complexului ligand-receptor asupra celulelor constau în: modificări structurale ale membranei celulare şi modificări funcţionale ale membranelor.

Modificările structurale ale membranei celulare se manifestă prin redistribuirea receptorilor, răspândiţi la întâmplare înainte de interacţiunea ligand receptor. După contactul ligand-receptor, receptorii se grupează la suprafaţa membranei în zone delimitate sau "plaje".(Fig.3.21)

Acest lucru se poate realiza datorită fluidităţii bistratului lipidic, încât mai multe molecule de ligand pot acţiona asupra mai multor receptori învecinaţi. Astfel în limfocitele B, lectinele pot induce formarea unor agregate receptor-ligand de dimensiuni mari, denumite cupole, unde se declanşează un proces de endocitoză.

Fig. 3.21.

Redistribuirea receptorilor din membrana celulară

Modificările funcţionale ale membranelor constau în:1- Modificări de permeabilitate a membranei, caracteristice pentru liganzi de tipul

neurotransmiţătorilor. În acest sens, acetilcolina se leagă de receptorii din membranele postsinaptice ale fibrelor musculare, determinând creşterea permeabilităţii membranei pentru ionii din mediul extracelular.

2- Inducerea de endocitoză, care se produce când ligandul este o substanţă endogenă, vehiculată pe cale umorală.

3- Pătrunderea din mediul extracelular a unor ioni cu funcţie de mesageri de ordinul II. Astfel, ionii de calciu pătrund în celulă după ce neurotransmiţătorii se leagă de receptorii din membranele post sinaptice ale joncţiunii neuromusculare.

4- Activarea unor enzime din membrana celulară. Se produce când liganzii sunt hormoni hidrofili. Asfel se activează adenilat ciclaza ce va cataliza sinteza, pe faţa internă a membranei, a adenozin 3' - 5' monofosfatului ciclic (AMP-c) sau va determina fosforilarea proteinelor celulare. Activarea adenilat ciclazei se realizează cu ajutorul unor proteine reglatoare.(Fig.3.22)

După activarea adenilat ciclazei, în citosol creşte cantitatea de AMP-c (considerat mesager de ordinul II) , amplificându-se semnalul hormonal. Totodată se activează şi o proteinkinază care controlează fosforilarea mai multor molecule proteice, stimulând procesele metabolice din celulă. Sinteza de AMP-c poate fi blocată de unele prostaglandine care acţionează prin inhibarea acţiunii adenilat ciclazei.

În unele maladii este implicată, în mod direct disfuncţia receptorilor din membrană. Astfel, în "miasthenia gravis" este inactivat receptorul pentru acetilcolină de la nivelul plăcii neuromusculare, iar în hipercolesterolemia genetică sunt absenţi sau nefuncţionali receptorii pentru colesterol.

27

Fig.3.22. Activarea unor enzime din membrana celulară

Există afecţiuni ale receptorilor care constau în blocarea funcţiei autoimune prin autoanticorpi antireceptori.

Asfel, autoanticorpii pentru receptorii de insulină pot acţiona ca insulinomimetici (activând receptorii) sau ca blocanţi ai acestora (în diabetul insulinorezistent). Autoanticorpii care stimulează receptorii dopaminei pot constitui cauze ale scizofreniei, iar imunoautoanticorpii beta adrenergici sunt implicaţi în afecţiunile asmatice. În procesul de îmbătrânire şi în unele boli neuropsihice (la om) s-a observat o modificare a densităţii receptorilor.

3.6.Schimburile prin membrană

Prin membrana celulară se efectuează schimbul de substanţe, fie prin traversarea diferitelor structuri ale acesteia, sau pe calea transportului în masă, cu ajutorul veziculelor, furnizate de membrana celulară.

Bistratul lipidic funcţionează ca o barieră de difuziune pentru apă şi alte molecule hidrofile, în timp ce moleculele liposolubile, oxigenul şi bioxidul de carbon îl trec cu uşurinţă.

3.6.1.Transportul transmembranarRealizează schimburile de molecule mici şi ioni (de unde şi denumirea de microtransport)

între celulă şi mediul extracelular. Îndeplineşte următoarele funcţii:► Preia din mediul extracelular o serie de combustibili metabolici necesari menţinerii vieţii

celulei şi activităţilor ei metabolice;►Elimină în mediul extracelular compuşi fiziologici necesari organismului (substanţe

secretate), precum şi substanţe toxice toxice , rezultate din activitatea celulei; ►Reglează volumul celulelor;►Asigură menţinerea ph-ului intracelular şi compoziţia ionică la valori cât mai favorabile

desfăşurarii activităţii metabolice celularte;►Produce diferenţe de concentraţii (gradiente ionice), care permit desfăşurarea unor

activităţi biologice complexe, cum sânt excitabilitatea nervului şi a muşchiului.► Preia din mediul extracelular o serie de combustibili metabolici necesari menţinerii vieţii

celulei şi activităţilor ei metabolice;►Elimină în mediul extracelular compuşi fiziologici necesari organismului (substanţe

secretate), precum şi substanţe toxice toxice , rezultate din activitatea celulei; ►Reglează volumul celulelor;►Asigură menţinerea ph-ului intracelular şi compoziţia ionică la valori cât mai favorabile

desfăşurarii activităţii metabolice celularte;►Produce diferenţe de concentraţii (gradiente ionice), care permit desfăşurarea unor

activităţi biologice complexe, cum sânt excitabilitatea nervului şi a muşchiului.

Transportul prin membrane

28

Denumire Modalităţi Mecanisme

A.Transport pasivDifuziune simplă

PoriCanale moleculare transmembranare

Difuziune facilitată Cărăuşi proteici moleculariTransport prin pompe ionice Pompa de Na+- K+

Pompa de Ca 2+

B. Transport activ Transport cuplat Pompare molecularăTranslocare de grup

EndocitozaFagocitozaPinocitoza fără receptoriPinocitoza mediată de receptori

C. Transportul în masă

Exocitoza

TranscitozaTranscitoza distributivăTranscitoza conectivă

În funcţie de mecanismele care intervin în mişcarea moleculelor prin membrana celulară se deosebesc două forme de transport : a-transportul activ şi b- transportul pasiv. (Fig.3.23).

3.6.11.Transportul pasiv Realizează trecerea moleculelor mici în sensul gradientului de concentraţie, iar a ionilor în

sensul gradientului electrochimic. Se face fără consum de energie, fiind independent de metabolismul celular.

Există două modalităţi de realizare a transportului pasiv prin: difuziune simplă şi prin difuziune facilitată.

Transportul pasiv prin difuziune simplă. Se face lent, întrucât restructurarea permanentă a membranelor biologice este o dificultate pentru difuziune.Este supus legilor difuziunii şi osmozei, fiind dependent numai de forţe fizice.

Fig.3.23. Transportul transmembranar.

1-Bistrat lipidic;2-Proteine transmembranare;3-Molecule transportate;4-Difuziune simplă;5-Difuziune facilitată; 6-Transport activ;

7-Sensul gradientului electrochimic.

Moleculele mici liposolubile difuzează prin bistratul lipidic, iar cele hidrosolubile trec prin orificii mici canale sau pori hidrofili situati în bistrat, delimitaţi de proteine transmembranare. Canalele transmemebranare au un diametru de 1 nm, fiind specializate şi selective. Vasopresina stimulează transportul prin canale şi pori mărindu-le diametrul până la 2-3 nm. (Fig.3.24)

29

Fig.3.24. Transportul prin

canale şi pori.1-Por; 2-Bistrat lipidic; 3-Proteine

transmembranare; 4-Ion.Transportul prin difuziune faciliată.

Este mult mai rapid (de cca.100.000 ori) decât cel prin difuziune simplă, permiţând trecerea prin membrană a unor substanţe greu solubile în lipide şi cu o masă moleculară relativ mare.

Se întâlneşte frecvent la hepatocite,unde, în acest mod, se transportă glucoza,aminoacizi,etc.(Fig.3.25.)

Fig.3.25.Tranportori de tip canal şi cărăuş.1-Bistrat lipidic; 2-Canal; 3- Cărăuş sau tranportor mobil.

Se realizează cu ajutorul unor molecule proteice din compoziţia membranei cu rol de cărăuşi.

Astfel, pe membrana hepatocitului există 800.000 de cărăuşi, iar fiecare cărăuş transportă 100 molecule de glucoză pe secundă.

Transportul prin difuziune facilitată se efectuează în sensul gradientului de concentraţie şi duce la echilibrarea concentraţiilor pe ambele feţe ale membranei, însă viteza de transport este direct proporţională cu concentraţia lor. În raport cu numărul speciilor transportate există transport uniport, simport şi antiport. (Fig.3.26.)

Fig.3.26. Tipuri de transport, în funcţie de sens şi numărul speciilor transportate1-Bistrat lipidic; 2-Proteină transportor; 3-Molecule transportate; 4-Uniport: 5-Sinport;6-Antiport.

3.6.1.2.Transportul activ

Se realizează împotriva gradientelor de concentraţie sau a gradientelor electrochimice, producând o creştere a concentraţiei pe o faţă a membranei. Solicită cheltuială de energie, care este furnizată de metabolismul celular, fiind metabolic dependent. Unele celule înalt diferenţiate (fibre musculare, neuroni) îşi procură energia necesară transportului pe cale aerobă, prin producere de ATP. Hematiile îşi produc moleculele de ATP necesare pentru transport prin glicoliză.

Există mai multe tipuri de transport activ, în funcţie de modul în care este folosită energia:1-Tranportul activ prin pompe ionice, în care proteinele ce efectuiază transportul folosesc

direct energia din ATP, având proprietăţi ATP-azice ( de descompunere a ATP-ului).2-Trasportul cuplat (sau cotransportul), în care se foloseşte energia gradientelor ionice,

substanţele de transportat (glucide, aminoacizi) fiind cuplate cu unii ioni (Na+).3-Translocarea de grup, întâlnită la unele bacterii, care folosesc ca sursă de energie

fosfoenolpiruvatul.Transportul prin pompe ionice.

30

Pompele ionice sunt protein-enzime din compoziţia plasmalemei care transportă ionii într-o direcţie termodinamică nefavorabilă, împotriva gradientului electrochimic sau de concentraţie.

În organism se cunosc pompe transportoare pentru ioni sau cationi,existând pompe pentru un singur ion (Ca2+sau Mg2+) sau pentru doi ioni (pompa de Na+şi K+).

Pompa de Na+ - K+ este ce a mai bine cunoscută.(Fig.3.27)

Fig.3.27. Organizarea moleculară a pompei ionice de Na+ - K+

1-Plasmalema;α,ß-Proteine transmembranare

În condiţii normale, ionul de

potasiu (K+) se găseşte într-o concentraţie mai mare (de cca. 15 ori)intracelular, în timp ce ionul de sodiu (Na+) are o concentraţie mai mare extracelular. Gradientele ionice (diferenţele de concentraţii) sunt menţinute printr-un sistem special de transport, denumit pompa de Na+-K+.

Pompa de Na+-K+ a fost studiată pe membranele hematiilor, unde s-a constatat o deplasare concomitentă a Na+ extracelular (spre o concentraţie mai mare), iar a K+ intracelular (tot spre o concentraţie mai mare), contrar gradientelor de concentraţie. Energia necesară acestui transport se obţine prin hidroliza ATP-ului, care este realizată de către o enzimă din plasmalemă, denumită Na+-K+-ATP-ază, deoarece acţionează numai în prezenţa ionilor de Na+,K+ şi a unei concentraţii favorabile de Mg2+. Această enzimă este o glicoproteină mare, un tetramer cu o greutate moleculară de 270.000 daltoni.

Fig.3.28.Transportul cuplat prin pompare moleculară.

31

Pompa de Ca2+ sau Ca2+-ATP-aza asigură transportul ionilor de Ca2+ prin sistemul de membrane ale reticulului endoplasmic din fibrele musculare.

Există şi pompe pentru anioni, precum pompa de clor (Cl-) din celulele parietale ale glandelor gastrice sau pompa de iod (I-) din tiroidă.

Transportul cuplat (sau mecanismul de pompare moleculară) utilizează, pentru transportul unor molecule (glucoză, aminoacizi), energia care rezultă din mişcarea Na+ împotiva gradientului de concentraţie şi al gradientului electric. Această energie poate fi folosită pentru introducerea în celulă a unor substanţe nutritive. (Fig.3.28).

Glucoza este pompată din mediul extracelular în celule (enterocite sau nefrocite) odată cu ionii de Na + cu ajutorul unei unităţi proteice de transport. După pătrunderea în celulă, glucoza se decuplează de ionii de Na+ , care sunt pompaţi în afara celulei printr-o Na+-K+-ATP-ază.

3.6.2. Transportul în masăEste procesul prin care celulele preiau din mediul extracelular particule de natură diferită, prin

formarea de vezicule pe seama membranei celulare. În funcţie de direcţia în care se deplasează veziculele deosebim trei tipuri de transport în masă: 1-exocitoza; 2-endocitoza; şi 3-transcitoza.

3.6.2.1. ExocitozaExocitoza este procesul prin care celulele îşi descarcă în mediul extracelular produsele

secretate sau alte materiale pemtru export. Produsele pentru export se colectează în vezicule intracitoplasmatice (vesicula cytoplasmatica, care se deplasează dinspre complexul Golgi spre membrana celulară, fie în mod spontan, fie după stimularea celulei de către unii factori secretagogi (hormoni, neurotransmiţători, factori de eliberare). Deschiderea veziculelor şi eliminarea conţinutului în spaţiul extracelular se datoreşte contracţiei microfilamentelor, în prezenţa moleculelor de ATP , de AMP-c şia ionilor de Ca2+.În celulele exocrine, exocitoza este limitată la domeniul apical (luminal) al plasmalemei.

Fig.3.29.Transportul prin vezicule (în masă).A-Endocitoza; B-Exocitoza; C-Transcitoza.1-Plasmalema; 2-Fagozom; 3-Lizozom primar; 4-Lizozom secundar;5-Vezicule de secreţie; 6-Vezicule de transport.

Exocitoza este prezentă şi la nivelul sinapselor, unde veziculele ce conţin mediatori chimici (acetilcolină, noradrenalină) fuzionează cu membrana presinaptică. Mediatorii sunt eliberaţi în spaţiul sinaptic, după care se leagă de receptorii specifici din membrana postsinaptică, producând depolarizarea ei şi transmiterea influxului nervos.

3.6.2.2. EndocitozaEndocitoza este procesul prin care celulele preiau din mediul extracelular molecule mari ( cu

greutate moleculară mai mare de 10.000 daltoni), prin intermediul unor vezicule, care se formează din membrana celulară. În acest fel se poate realiza nutriţia celulei, purificarea mediului extracelular şi unele procese de apărare imunitară.

După natura materialului endocitat şi după modaliatea de ingestie se disting două tipuri de endocitoză: 1-fagocitoza (de la grecescul phagein = a mânca) sau endocitoza de molecule şi particule solide,microorganisme (bacteriene sau virale), macromolecule alterate, detritus celular, celule întregi,

32

etc. neînsoţite de fluid; 2- pinocitoza ( de la grecescul pinein = a bea) sau endocitoza de fluid, ce conţine molecule sau particule.

3.6.2.2.1.FagocitozaÎn condiţii normale şi patologice, pot participa la fagocitoză un mare număr de tipuri celulare,

denumite generic fagocite. În funcţie de mărimea particulelor pe care sunt capabile să le înglobeze, se disting microfage, care înglobează numai particule mici (exemplu neutrofilele) şi macrofage, care înglobează particule mari, existând macrofage mobile ( monocitele circulante) sau macrofage fixe (histiocitele din ţesutul conjunctiv, celulele Kupffer din ficat, celulele capilarelor sinusoide din splină, unele celule din măduva osoasă hematogenă, din limfonoduri, din pulmon,etc.).

Fagocitele prezintă pe suprafaţa membranei regiuni specializate purtătoare de receptori, cu ajutorul cărora recunosc ceea ce este "self" (macromoleculele proprii organismului) de ceea ce este ""non self", adică macromoleculele străine de organism, denumite generic antigen. Dintre macromoleculele self, receptorii pentru fagocitoză rercunosc ceea ce este sănătos de ceea ce este alterat ( self alterat: celule degenerate, celule maligne, celule îmbătrânite, resturi tisulare). În unele situaţii patologice, receptorii celulelor ce intervin în fagocitoză pierd capacitatea de a diferenţia self-ul de non-self , acţionând, asfel, împotriva proteinelor din organismul propriu şi determinând apariţia reacţiilor autoimune, care pot genera o serie de entităţi patologice.

Recunoaşterea antigenilor în organism este înlesnită de prezenţa în mediul extracelular a unor proteine, denumite opsonine. Opsoninele sunt proteine extracelulare care mediază şi facilitează legătura între receptorii membranei fagocitelor şi antigenele ce vor fi fagocitate, formând complexe antigen-opsonine.

Se cunosc mai multe tipuri de receptori ai complexelor antigen-opsonină, precum: - receptorii Fc, care leagă de suprafaţa membranei antigenele opsonizate cu imunoglobuline G ( Ig G), după ce au recunoscut fracţiunea cristalizabilă (Fc) a imunoglobulinei G.; - receptorii C3, care reconosc şi fixează antigenii opsonizaţi cu cel de al treilea component al complementului.

În membrana fagocitelor, în afară de receptoriii pentru complexe opsonizate, s-au mai descris receptori nespecifici care recunosc şi fixează selful alterat, reprezentat de resturi celulare sau celule maligne.

Fagocitoza se desfăşoara în patru etape:chemotaxia,opsonizarea, ingestia şi digestia.Chemotaxia este proprietatea unei celule mobile (în cazul de faţă a neutrofilelor) de a se

deplasa prin ţesuturi către particule ţintă, ca răspuns la diverşi stimulli după ce ţinta a fost recunoscută. Semnalele chemotactice sunt reprezentate de: substanţe bacteriene (proteine, lipide), proteine serice, componente ale complementului (15 proteine serice, care amplifică răspusul imun), produse ale limfocitelor (limfokine), factori eliberaţi de neutrofile.

Fig.3.30. Opsonizarea şi fagocitarea.

Opsonizarea constă în acoperirea bacteriilor sensibilizate de anticorpi pentru a fi fagocitate. Principalele opsonine sunt anticorpii, în special imunoglobuline (Ig1, Ig3) şi componente ale

33

complementului (C3, C5). Fracţiunea cristalizabilă (Fc) a imunoglobulinei G este recunoscută de receptorii Fc de pe suprafaţa neutrofilelor. (Fig.3.30)

Ingestia microorganismelor are loc după ce acestea au fost opsonizate. Complexul antigen-opsonine este recunoscut de receptorii de la suprafaţa fagocitelor şi legat de membrana celulară, determinând activarea receptorilor. În urma activării receptorilor, actina din citoscheletul membranei,se contractă, determinând emiterea de pseudopode. Pseudopodele înconjoară strâns particula şi în acest fel se realizează interacţiuni receptor- particulă pe toată suprafaţa ei. Mecanismul de fixare a particulei de membrana psedupodelor este comparat cu închiderea unui fermoar. Extremităţile pseudopodelor înconjoară particula şi formează o veziculă, denumită fagozom.(Fig.3.30.)

În citoplasmă, fagozomul se uneşte cu un lizozom , formându-se un fagolizozom, în care hidrolazele acide vor acţiona asupra particulei străine, producând digestia acesteia. În cazul neutrofilellor, contopirea granulelor azurofile primare (a lizozomilor) cu fagozomul şi eliberarea conţinutului lor în fagolizozom (sau vezicula digestivă) se manifestă prin dispariţia granulelor din citoplasmă,fenomen cunoscut ca degranularea neutrofilelor.

Fig.3.31.Mecanismele fagocitozei ;A-Mecanisme moleculare; Realizarea fagozomilor.

1-ImunoglobulinaG; 2-Receptor inactiv; 3-Receptor activat; 4-Proteină contractilă din citoschelet; 5-Pseudopode; 6-Fagozom

Digestia intracelulară a particulelor fagocitate are loc în lizozomi şi se produce prin: -sisteme dependente de oxigen, mediate de enzime (mieloperoxidază, superoxidismutază); şi - prin sisteme independente de oxigen ,ce presupun acţiunea lizozimului, a lactoferinei,etc..

3.6.2.2.2.Pinocitoza

34

Pinocitoza sau endocitoza particulelor în fază fluidă reprezintă procesul de transport în masă a unei cantităţi variabile de fluid tisular, împreună cu particulele pe care le conţine, prin intermediul unor vezicule (vezicula pinocitocica), denumite pinozomi.

Se întâlneşte la toate tipurile de celule, apărând ca o modaliatate împortantă prin care celulele captează din lichidul intercelular substanţele necesare metabolismului lor.

Se deosebesc două forme de pinocitoză în funcţie de mecanismele care intervin în procesul de preluare a sustanţelor: - pinocitoza fară receptori şi - pinocitoza mediată de receptori.

Pinocitoza fără receptori este endocitoza cea mai frecvent întâlnită la acele celule din organism, care folosesc pentru transport suprafeţe mari nespecializate din membrana plasmatică.. Preluarea substanţelor cu ajutorul veziculelor se face fără o legare prealabilă a lor de membrana celulară prin receptori.

Pinocitoza se desfăşoară în mai multe etape:1-Contactul particulelor din fluidul tisular produce activarea unor puncte de pe suprafaţa

celulei , denumite situsuri anionice. Acest proces induce agregarea microfilamentelor din citoscheletul membranei, producând creşterea flexibilităţii membranei celulare.

2-Membrana celulară se invaginează formând cripte sau canale intracelulare (invaginatio cellularis), în care intră lichid extracelular, împreună cu particulele prezente în el.

3-Membranele din vecinătatea extremităţii profunde a canalului se alipesc,fuzionează şi apar pinozomii (vesicula pinocytotica), vezicule ce se desprind de canal şi sunt antrenate de curenţii intracitoplasmatic.

4-Pinozomii fuzionează cu lizozomii, formând pinolizozomii, în care enzimele lizozomale produc digestia materialelor preluate din exteriorul celulei. În funcţie de mărimea particulelor înglobate prin pinocitoză se distinge o micropinocitoză şi o-macropinocitoză. Macropinocitoza este modalitatea de transport a unor particule mari vizibile la microscopul optic. Poate fi studiată prin injectarea “in vivo” de coloranţi vitali, care se fixează de proteinele serice. Complexele formate din proteine serice şi coloranţii vitali coloidali sunt introduse în citoplasmă împreună cu mici cantităţi de lichid extracelular, fiind utilizate ca indicator de recunoaştere a celulelor care manifestă proprietate de pinocitoză la nivelul organelor şi ţesuturilor.

Micropinocitoza reprezintă modalitatea de transport a moleculelor mici cu ajutorul veziculelor , vizibile numai la microscopul electronic.

Urmărindu-se soarta veziculelor pinocitate, s-a observat că acestea pot: 1- rămâne în citoplasmă, unde fuzionează cu lizozomii, în care sunt digerate, iar după ce şi-au descărcat conţinutul, membranele lizozomale sunt reintegrate în membrana celulară; 2- traversa citoplasma fără a fuziona cu lizozomii, descărcându-şi conţinutul pe cealaltă faţă a citoplasmei.

Pinocitoza mediată de receptori.Se mai numeşte şi pinocitoză absorbtivă, selectivă sau concentrativă. Este modalitatea de

preluare din mediul extracelular a unor materiale diferite, prin folosirea unor zone specializate ale membranei celulare, prevăzute cu receptori.

Receptorii recunosc şi leagă de membrană particule diferite. Fiind mobili receptorii se grupează la nivelul unor zone specializate ale membranei celulare, care se invaginează formând caveolele (vesicula superficialis s. caveola) acoperite, deoarece sunt acoperite pe versantul citoplasmatic de o reţea de microfilamente, formate dintr-o proteină, denumită clatrină. Reţeua de clatrină stabilizează poziţia receptorilor şi menţin caveolele în comunicare cu mediul extracelular.(Fig.3.32.)

Caveolele acoperite care fixează complexele particulă-receptor (sau ligand-receptor) sunt înglobate rapid împreună cu o cantitate mică de fluid extracelular sub formă de vezicule care pot să-şi păstreze mantaua de clatrină pe faţa lor externă (vezicule acoperite) sau microfilamentele de clatrină se desprind la nivelul membranei, în acest caz apărând vezicule netede sau receptozomi.

Particulele înglobate prin pinocitoza mediată de receptori pot fi degradate în lizozomi sau în unele cazuri, receptozomii traversează citoplasma fără să interacţioneze cu lizozomii, fiind eliminate pe cealaltă faţă a celulelor.

35

Fig.3.32. Pinocitoza mediată de receptori. 1-Plasmalema; 2-Receptori mobili;3-Ligand; 4-Complex ligand receptor; 5-Caveolă acoperită cu clatrină; 6-receptozom ; 7-Nucleu; 8-Complex Golgi; 9-Lizozom.

Spre deosebire de pinocitoza fără receptori, în care concentraţia substanţelor în veziculele endocitate este aceeaşi ca în lichidul extracelular, în veziculele acoperite , ce apar în pinocitoza mediată de receptori, concentraţia substanlţelor este mult mai mare decât în lichidul extracelular, datorită capacităţii receptorilor de a lega selectiv un număr mare de particule.

Implicaţii patologice. Pinocitoza mediată de receptori este o modalitate folosită pentru preluarea din lichidul extracelular şi din sânge a colesterolului, o lipoproteină cu densitate mică. În situaţii normale, celulele prevăzute cu receptori pentru proteine cu densitate mică preiau colesterolul din mediul extracelular. Lipsa acestor receptori, întâlnită în unele deficienţe genetice, face imposibilă preluarea moleculelor de colesterol din sânge, determinând o creştere a concentraţiei acestuia (hipercolesterolemie) şi apariţia de plăci aterosclerotice în peretele vascular.

36

Fig.3.33. Schematizarea modalităţilor de transport prin celula endotelială. (după SIMIONESCU-1981)

3.6.2.3.Transcitoza

Transcitoza sau citopemsis reprezintă o formă aparte a transportului prin vezicule, prin care se realizează transportul macromoleculelor prin celule endoteliului capilar. A fost studiată de Palade (1953), care a observat, cu ajutorul microscopului electronic, vezicule ce traversează celulele endoteliale, realizând schimburi între plasmă şi lichidul interstiţial.(Fig.3.33)

Transportul veziculelor pinocitate se poate realiza prin două modalităţi: 1-transcitoza distributivă, în care trecerea se face sub forma unor şiruri de vezicule intracitoplasmatice, ce se întind de la faţa luminală la faţa bazală, fără a ajunge în contact cu lizozomii; şi 2-transcitoza conectivă, în care transportul se face prin canale ce se formează fie prin fiziunea veziculelor, fie prin invaginarea plasmalemelor.

4. NUCLEULNucleul (lat. nucleus şi gr. karion = sâmbure) (nucleus) este o componentă esenţială

caracteristică celulelor eucariote. Îndeplineşte ca funcţii principale: -stocarea informaţiei genetice în ADN-ul nuclear , reglarea şi controlul tuturor activităţilor celulare. În organismele animale, există şi celule anucleate (hematiile, trombocitele), care sunt incapabile să sintetizeze proteine, activităţiile lor metabolice fiind foarte restrânse.

Componentele nucleului

Denumire Componente Formaţiuni ultrastructurale Membrana nucleară externă

A. Membrana nucleară

( învelişul nuclear)

Cisterna perinucleară Complexul por:Anulus externAnulus internGranulă centrală8 granule proteice periferice8 conuri de proteine fibrilare

Membrana nucleară internă

B. NucleoplasmaScheletul nuclear Matricea fibrilară (granule şi matrixin )

Lamina densă internăComplexul lamina porComponenta fibrilară a nucleolului

Fracţiune labilăCromatina Eucromatina

HeterocromatinaC. Nucleolul Componenta

filamentarăFilamente de 5 nm grosime/30-40 nm lungime

37

Componenta granulară Precursori ribozomialiComponenta amorfă

Cromozomială Cromatina perinucleolarăCromatina intranucleolară

Nucleul a fost descoperit de FONTANA, în 1831, care a observat o formaţiune ovoidă în celulele epidermice. Ulterior, BROWN (1833) a fost primul care a enunţat conceptul de celulă nucleată, ca unitate structurală, care intră în alcătuirea plantelor, concept ce a fost extins şi la alcăturiea corpului animalelor.

În alcătuirea nucleului intră: nucleolema sau membrana nucleară, nucleoplasma (matricea sau sucul nuclear), nucleolii şi cromatina sau cromozomii.

Nucleul reprezintă centrul de comandă, control şi de coordonare a celulei eucariote, funcţionând ca un computer chimic prevăzut cu un program (ADN-ul) şi o memorie (ARN-ul). În calitate de centru informaţional al celulei, nucleul coordonează toate reacţiile chimice legate de desfăşurarea proceselor vitale, contrlând atât sinteza proteinelor enzime din celulă, cât şi sinteza proteinelor de structură. (Fig.4.1.)

Fig.4.1. Rolul nucleului în circulaţia informaţiei genetice în celula eucariotă.

Nucleul conţine genomul (totalitatea genelor) celulei, format dintr-un număr precis de gene. O genă este o secvenţă de nucleotide (500-1500), care determină o secvenţă de aminoacizi, împreună cu elementele de control (un promotor, o secvenţă lider şi un terminator. La animalele domestice, gena ocupă un loc specific în molecula de ADN care întră în compoziţia cromozomului.

Într-o celulă umană, lungimea totală a moleculelor de ADN este de cca. 1,6 m conţinând un potenţial informaţional imens, estimat la aproximativ 9 X 1011 biţi, ce corespunde informaţiilor cuprinse într-o bibliotecă cu 180.000 volume (considerându-se că un cuvânt este evaluat în medie la 36 biţi, iar în fiecare volum se găsesc 150.000 cuvinte).

Totodată nucleul conţine echipamentul enzimatic necesar pentru: repararea genomului, replicarea sa, transcrierea mesajului în ARN şi prelucrarea ARN-ului ( în ARN mesager, ARN de transfer şi ARN ribozomal.

38

Fig.4.2. Forme de nuclei1-Veziculos (în neuron); 2-Multilobat (neutrofil); 3,11-Bilobat (eozinofil, pseudoeozinofil de

pasăre); 4-Aplatizat (adipocit); 5-Reniform (monocit); 6-Ovoidal (eritrocit); 7-Discoidal (celula caliciformă); 8-Alungit (leiocit); 9,10-Sferoidal sau ovoidal (limfocit)

4.1. Caracterele morfologice ale nucleului

Răspândire. Majorittea celulelor organismului prezintă nucleu. Există şi excepţii (hematiile,celulele cristaliniene, trombocitele), care reprezintă stadii finale, în evoluţia unui tip celular, cu existenţă limitată în timp, stadii specializate la funcţii pasive. Celulele fără nucleu nu pot creşte şi nu se mai divid.

Forma nucleilor este foarte variată,indicând, de regulă, pe cea a celulei. Nucleul apare: - sferic-ovoidal (nucleus sphericus- ovoideus), în celulele izodiametrice (sferice,cubice,poliedrice);- alungit (bacilliformis,fusiformis), în celulele fusiforme (musculare) sau columnare (prismatice); - turtit,aplatizat (planus) în celulele pavimentoase (endoteliale),în adipocite, în celulele caliciforme; lobat (segmentalis s. moniliformis)), în celulele care trebuie să se modeleze rapid.(Fig.4.2.)

39

Forma nucleului este influenţată de activitatea celulei. Devine neregulată în celulele foarte active. În acest mod se produce o creştere a suprafeţei prin care se realizează schimburile dintre nucleu şi citoplasmă. Totodată nucleul prezintă o oarecare plasticitate (deformabilitate) care îi permite ca, în anumite condiţii spaţiale intracelulare, să îşi modifice forma. Asfel, în monocite nucleul apare reniform (nucleus reniformis), deşi celula este sferică, deformarea datorându-se prezenţei centriolului.

Poziţia. În cele mai multe cazuri, nucleul ocupă o poziţie centrală, strategică pentru rolul de

coordonator al activităţii celulare. Totodată există numeroase excepţii, în care nucleul ocupă o poziţie: excentrică, în adipocite (celule care acumulează grăsimi în citoplasmă); medio-bazală, în celulele secretoare din pancreas sau parotidă; bazală, în secretoare de mucus, în celulele caliciforme. În general în celulele secretoare.(Fig.4.3.)

Număr. Ca regulă generală, o celulă prezintă un nucleu. Excepţiile sunt însă numeroase.

Fig.4.3. Poziţia nucleului în diferite celule.1-Centrală; 2-Periferică; 3-Mediobazală; 4,5-Bazală.

Astfel, hepatocitele sunt binucleate în proporţie de 7-8%, osteoclastele au 30-40 nuclei, iar fibra musculară striată (rabdocitul) prezintă între 20-40 nuclei pentru fiecare centimetru.

În condiţii patologice, mai mulţi nuclei apar în:- celulele gigante Langhans (prezente în tuberculoză, au câţva zeci de nuclei, dispuşi la periferia celulei, în coroană sau potcoavă); -celulele gigante de corp străin, care apar în cazul pătrunderii în organism a unor particule străine, nedigerabile de către celule; - celulele tumorale.

Multinuclearitatea se produce în două moduri: 1- prin multiplicare nucleară repetată (cariokineză), fără diviziunea citoplasmei (citodiereză),rezultând un plasmodiu; 2-prin fuzionarea mai multor celule mononucleate, rezultând un sinciţiu (cum este cazul osteoclastelor, rabdocitelor,celulelor Langhans,etc.)

Fig.4.4. Variaţia dimensiunilor nucleului în funcţie de gradul de poliploidie

Dimensiunile nucleului. Variază în limite mai strânse (între 5-15µ) decât dimensiunile celulelor, diversitatea dimensiunilor celulelor din organismul animal realizându-se pe baza variaţiei de volum a citoplasmelor.

Măsurarea dimensiunilor nucleului se numeşte cariometrie şi reprezintă un domeniu de mare interes pentru biologia şi patologia celulară. Nucleii prezintă variaţii dimensionale funcţionale şi patologice.

Variaţiile funcţionale ale dimensiunilor nucleului sunt în legătură cu: ►Vârsta, nucleul fiind mai mare în celula tânără, decât în celula îmbătrânită, în cazul aceluiaşi tip celular;

► Bioritmul, existând diferenţe de volum de până la 20%, între zi şi noapte, la hepatocite,neuroni, nefrocite,etc.;

► Gradul de poliploidie (numărul de seturi cromozomale prezente în nucleu). Cu cât gradul de poliploidie este mai mare cu atât nucleul este mai mare. Astfel, nucleii megacariocitelor sunt mult

40

mai voluminoşi decât cei a hepatocitelor. Din acest punct de vedere în hepatocite se pot întâlni : 1 - nuclei mici (cu diametru de 10 µm), diploizi (2n), întâlniţi la cca.80% din hepatocite; 2 - nuclei medii (cu diametru de 15 µm); - tetraploizi (4 n), întâlniţi la 16% din hepatocite şi uneori octaploizi. S-a constatat că suprafaţa nucleară creşte proporţional cu gradul de poliploidie, fapt ce explică înmugurirea nucleilor poliploizi.

În patologie, variaţii ale dimensiunilor nucleului se întâlnesc în toxicoze, în boala de iradiere şi în cancer. În celulele neoplazice, nucleii apar de talie mare, cu morfologie extrem de variată în acelaşi câmp microscopic, putând prezenta uneori aspect monstruos.+

Între volumul nucleului şi volumul citoplasmei se stabileşte un raport nucleo-citoplasmatic (N/C), a cărei valoare variază în limite foarte largi (1/3 - 1/20), de obicei situându-se între 1/7 - 1/10.

Atunci când volumul citoplasmei creşte mai mult decât volumul nucleului, raportul N/C va fi refăcut fie prin diviziune celulară, fie printr-o creştere a volumului nuclear. În cazul în care volumul nu poate fi refăcut, funcţionarea normală a celulei este perturbată. În condiţii patologice, raportul N/C poate fi complet modificat, ajungându-se la inversarea raportului, în celulele tumorale.

Vâscozitatea nucleoplasmei este mai mică decât a citoplasmei, excepţie făcând ovocitul. Greutatea specifică a nucleului este influenţată de conţinutul în apă şi de starea fiziologică a celulei, descrescând în următoarea ordine: nucleol, cromatină, nucleoplasmă.

Ph-ul nuclear este uşor alcalin (7,4-7,5). Totodată, în nucleu se realizează diferenţe de potenţial între membrana nucleară (cu sarcini electrice negative) şi nucleoli sau cromozomi, ce au sarcini electrice pozitive.

Componentele nucleului sunt: membrana nucleară, nucleoplasma,cromatina şi nucleolul.

4.2. Membrana nucleară

Membrana nucleară (nucleolema sau carioteca) (nucleolemma s. karyoteca) este o structură lipoproteică, cu o grosime de câţiva zeci de nanometri, caracteristică eucariotelor care împarte celula în două compartimente: - nucleul ce conţine genomul, structurile implicate în transcripţie şi în prelucrarea produsului transcriptic; - citoplasma ce cuprinde organitele celulare. În celulele vii, apare ca o peliculă fină, cu indice de refracţie şi densitate mai mare decât restul nucleului. În celulele fixate, se colorează bazofil, iar vizibilitatea cromatică se datoreşte condensării şi coagulării unor componente ale carioplasmei care se depozitează pe faţa internă a membranei.

La microscopul electronic, nucleolema apare formată din două foiţe (una internă şi alta externă), fiecare trilaminată, lipoproteică, groase de 60-100 Å, separate printr-un spaţiu perinuclear sau cisterna perinucleară, de 150 – 300 Å, plin cu o substanţă amorfă.

41

Fig.4.5.Membrana (MN) nucleară - reprezentare tridimesională1-MN şi relaţiile sale cu reticulul endoplasmic (RE); 2-MN, la microscopul electronic,cu grosisment redus; 3-Trilaminaritatea celor două MN; 4-Organizarea moleculară a MN;5-Ultrastructura MN .a-Nucleul; b-Membrana nucleară; c-Citoplasma; d-Por; e-Reticul endoplasmic; f-ribozomi.

Membrana nucleară externă (membrana nuclearis externa) prezintă o faţă citoplasmatică, ornată cu ribozomi, are un contur mai flexibil şi zone active de formare a veziculelor.

Membrana nucleară internă (mebrana nuclearis interna) este lipsită de ribozomi şi aderă fie la nucleoplasmă, care poate diferenţia o lamină densă, fie la cromatină.

Cisterna perinucleară (cisterna nucleolemmae) apare ca un spaţiu tridimensional, aflat în continuitate cu spaţiul reticulului endoplasmatic. În acest spaţiu s-au pus în evidenţă proteine, enzime.Ca2+.(Fig.4.5)

Nucleolema sau învelişul nuclear este întreruptă (fenestrată) de orificii circulare, denumite pori circulari, la nivelul cărora cele două membrane se află în raporturi de continuitate. Numărul de pori de pe o unitate de suprafaţă este legat de intensitatea schimburilor nucleo-citoplasmatice. Asfel, la celulele în creştere pot exista 10 pori/µm2. Se întâlnesc variaţii în numărul, frecvenţa şi distribuţia porilor de la un tip de nucleu la altul. Porii sunt în fapt "porţile" folosite de macromolecule şi de ansamblurile macromoleculare (proteine, ARN m, subunităţi ribozomale,etc.) pentru a intra sau ieşi din nucleu. (Fig.4.6)

Fig.4.6. Structura porului nuclear.

Porul (porus nuclearis) împreună cu structurile adiacente formează complexul porului.Complexul por (complexus pori) cuprinde: a - două inele sau anuli , asezate pe ambele feţe ale porului (nucleară şi citoplasmatică), fiecare inel (anulus pori) fiind compus din granule proteice sferoide cu diametrul de 10-25 nm, care sunt dispuse în formă de octagon; b - opt conuri, orientate dinspre peretele porului către lumenul său, considerate a fi agregate de fibrile; c - o particulă centrală, în formă de granulă sau bastonaş, inconstant prezentă; d - pachete de filamente nucleoplasmatice de 4-8 nm, care se inseră cu oextremitate de inelul intern, iar cu cealaltă extremitate se prinde pe formaţiuni intra nucleare (eventual pe nucleol).

După unii autori, diferitele structuri care apar în centrul porului (diafragma porului, granula centrală, filamentele) par a fi mai curând materiale surprinse în timpul trecerii prin por decât structuri pemanente.

42

Fig.4.7.Schema complexului por.1-MN externă; 2-MN-internă;3-Spaţiu cisternal; 4-Filament intern; 5-Formaţiune conică; 6-Granulă-anulus extern; 7-Granulă-anulus intern; 8-Granulă centrală.

Funcţiile membranei nucleare sunt: 1 - delimitează conţinutul nucleului de cel al citoplasmei;2 - reglează schimburile dintre nucleu şi citoplasmă; 3 - formează membranele reticulului endoplasmic, reprezentând rezerva de citomembrane în celule care se divid rapid; 4 - menţine şi stabilizează cromatina, care se ataşează de faţa sa internă; 5 - rol mecanic în susţinerea organitelor, acestea fiind legate de faţa sa externă prin fibrile de 18 nm.(Fig.4.8.)

Fig.4.8. Diagrama căilor de translocare a matrialului din nucleu (A) în citoplasmă (B). 1-Transport prin microvezicule; 2-Transport transmembranar3-Transport combinat; 4-Translocare prin pori; 5-Extruzare prin delimitarea unor saci din învelişul nuclear.

4.3.NucleoplasmaNucleoplasma, matricea nucleară sau sucul nuclear (nucleoplasma) reprezintă acea parte a

nucleului, aparent lipsită de structuri (la microscopul optic şi la cel electronic,de grosisment redus). La nivelul molecular apare structurată, încât denumirea de suc nuclear apare impropie, fiind mai adecvată denumirea de matrice nucleară. Nucleoplasma se prezintă ca un mediu de natură proteică care în care "plutesc" nucleolii şi cromatina. Are rol esenţial în organizarea nucleului, determinându-i forma, în sinteza de ADN şi ARN, în medierea semnalelor hormonale (ale steroizilor).Conţine diverse enzime, ce intervin în glicoliza anaerobă şi în realizarea unor legături macroergice.

43

Matricea nucleară cuprinde două componente: matricea nucleară propiu-zisă şi fracţiunea labilă a matricei.

Matricea nucleară propiu-zisă sau scheletul nuclear reprezintă echivalentul citoscheletului la nivel nuclear,fiind formată dintr-o reţea de proteine stabile cu greutatea moleculară mare.Se poate izola după extragerea cromatinei şi nucleolului. Este formată din trei componente: matricea fibrilară, componentele fibrilare (nemembranoase) ale învelişului nuclear şi componenta fibrilară a nucleolului.

Matricea fibrilară apare ca o reţea de fibrile intranucleare, întinsă în toată masa nucleului. Este formată din granule sau particule matriceale, electronodense, cu diametru de 15-20 nm şi din fibrile matriceale (sau matrixin), cu diametru de 5 nm,dispuse în pachete. Matricea fibrilară conţine proteine (20% din totalul proteinelor nucleare), ADN (1,2%), ARN (0,5%) şi fosfolipide, în cantitate redusă. Lipsesc proteinenele histonice, în timp ce proteinele nonhistonice ocupă 18,2%, predominând cele acide.

Componentele fibrilare (nemembranoase) ale învelişului nuclear sunt o formă specializată a citoscheletului nuclear,fiind reprezentate de lamina densă internă (sau lamina fibrosa) şi de complexul por.

Lamina densă internă este situată pe faţa nucleară a membranei interne a învelişului nuclear. Are aspectul unei reţele de fibrile legate pe de o parte la reţeaua matricei nucleare şi pe de altă parte la componentele fibrilare ale complexului por. Complexul por este format din structuri inelare (matricea anulară sau anulii), din granule centrale şi din filamente radiare.

Lamina densă internă împreună cu complexul por formează o componentă a scheletului nuclear, denumită complex lamina-por. Acest complex conţine 2-3% din totalul proteinelor din nucleu (95% din ele fiind nehistonice, predominent acide). Pe faţa internă a complexului lamina-por a fost identificată o nucleozid trifosfatază, implicată în transportul ARN către citoplasmă.

Componenta fibrilară nucleolară (matricea nucleolilor) este reprezentată de o reţea de filamente ce ocupă aria ce corespunde părţii fibroase şi părţii granuloase din nucleol.Este formată din polipeptide asemănătoare celor din scheletul nuclear şi are rol de suport pentru depozitarea granulelor ribozomale.

Funcţiile matricei nucleare sunt: 1- menţine forma nucleului şi stabilitatea acestuia în interfază; 2-asigură flexibilitatea nucleului, fapt ce permite realizarea unor modificări structurale legate de organizarea cromatinei, replicarea ADN, transcripţia şi transportul intranuclear de ARN; 3- contractilitatea, independentă de ATP, dar influenţată de ionii bivalenţi (Ca2+,Mg2+) ce permite realizarea unor variaţii ale volumlui nuclear; 4- suport pentru depozitarea granulelor ribozomale.

4.4. Cromatina

Cromatina nu este o substanţă chimică, ci o noţiune biologică, fiind reprezentată de materialul intranuclear care se evidenţiază cu coloranţi bazici. Este forma de existenţă a cromozomilor în interfază , în celula aflată între două diviziuni. Cromatina şi cromozomii sunt două forme de organizare ale unuia şi aceluiaşi material genetic (ADN-ul).

Compoziţia chimică a cromatinei cuprinde ADN, proteine histonice, mici cantităţi de ARN şi proteine nehistonice.

Cantitatea de ADN din nucleu este constantă pentru o anumită specie şi reprezintă genomul speciei respective. Este dată de numărul şi dimensiunile moleculelor de AND.

Histonele sunt proteine bazice, prezente numai în genomul eucariotelor. În funcţie de conţinutul în arginină şi lizină există cinci tipuri de histone, denumite H1, H2A, H2B, H3, H4. La rândul său fiecare tip prezintă mai multe subtipuri.

Histonele prezintă mai multe particularităţi: 1- au masă moleculară mică; 2- sunt puternic bazice, datorită conţinutului mare (10-20%) de aminoacizi bazici (lizine şi arginine); 3- sunt purtătoare de sarcini electrice pozitive, care le permit să se lege de sarcinile negative ale grupărilor fosfat din ADN; 4-sunt proteine cu evoluţie filogenetică moleculară definitivă.

Histonele îndeplinesc un rol major în împachetarea ADN-ului în nucleu, în realizarea organizării supramoleculare a ADN-ului sub formă de nucleozomi. În cursul ciclului celular, histonele suferă o serie de modificări chimice ( acetilări,fosforilări, metilări).

În spermatozoid, histonele sunt înlocuite de protamine. Protaminele au o greutate moleculară foarte mică (4200 daltoni), o lungime medie de numai 33 aminoacizi şi sunt foarte bazice, conţinând multă arginină. Înlocuirea histonelor are loc în timpul trecerii de la spermatidă la spermatozoid, permiţând realizarea unui înalt grad de condensare şi compactare a cromatinei, pentru împachetarea ADN-ului într-un volum foarte mic, cum este cel al capului spermatozoidului.

Fig.4.9. Aspecte ale cromatinei nucleareI. La microscopul optic: 1-Cruste; 2-Granule; 3-Nevuri; 4-Nucleu hipercromatic;

44

5-Nucleu hipocromatic.II. La microscopul electronic: 1- Cromatină periferică; 2-Cromatină insulară; 3- Cromatina asociată nucleolui; 4-Nucleol; 5-Membrană nucleară; 6-Spaţiu perinuclear; 7-Pori.

Aspectele histologice ale cromatinei. Datorită conţinutului bogat în ADN,complexat cu histone, cromatina se colorează întens cu coloranţi bazici (hematoxilină,albastru de tripan), putând prezenta aspecte variate: granule, grămezi neregulate, reţele de filamente, corpusculi cromocentrici (sau cariozomi). Aspectul morfologic al cromatinei este asemănător în nucleii aparţinând aceluiaşi tip celular, dar variază în funcţie de tipul celular şi de stadiul funcţional,fiind un criteriu important pentru identificarea celulelor la microscopul optic.

4.4.1. Eucromatina

Eucromatina (euchromatinum) reprezintă cromatina funcţională, activă, purtătoare de gene structurale, pe care se face transcripţia mesajului genetic. Poate fi de două feluri: 1- eucromatină activă, pecare transcripţia se efectuează continuu, asigurându-se deşfăşurarea normală a vieţii celulei; 2- eucromatină permisivă , potenţial activă, devenindactivă în momentul în care acţionează semnale specific modulatoare (de exemplu: hormonii).

Reglarea conformaţiei genetice se realizează pe eucromatină, prin intervenţia unor agenţi biochimici, în principal proteine nehistonice, ce pot acţiona ca represori sau derepresori, modulând transcriptibilitatea materialului genetic activ şi nu structura acestuia.

Raportul dintre eucromatină şi heterocromatină se exprimă funcţional prin raportul dintre transcriptibil şi netranscriptibil, permiţând, în fapt, realizarea relaţiei dintre genotip şi fenotip. Astfel, prin genotip se înţelege totalitatea materialului genetic cuprins în cromatina interfazică, deci eucromatina împreună cu heterocromatina. Fenotipul reprezintă expresia unei părţi din genotip, care a fost transcrisă din eucromatină în interfază, totalitatea trăsăturilor (însuşirilor morfologice,fiziologice,etc.) exprimate din noianul de informaţii înscrise în genotip.

4.4.2. Heterocromatina

Heterocromatina (heterochromatinum) este cromatina condensată, netranscriptibilă, inactivă metabolic.Există două tipuri de heterocromatină: constitutivă şi facultativă.

Heterocromatina constitutivă este genetic inactivă, lipsită de gene structurale. Pe ea nu se face transcripţie niciodată, rămânâd întotdeuna condensată în interfază. Conţine ADN repetitiv sau satelit, un ADN în care anumite secvenţe nucleotidice sunt repetate de un număr foarte mare de ori.

45

La mamifere, ADN-ul repetitiv reprezintă 15% din cantitatea totală de ADN. Există două tipuri de ADN repetitiv:1- ADN înalt repetitiv (10%), în care secvenţele se repetă de sute de mii de ori; 2-ADN mediu repetitiv (5 %), în care secvenţele se repetă de 100 ori, de 1000 ori sau de zeci de mii de ori.

Pe cromozomii omologi (care formează o pereche), heterocromatina constitutivă se localizează identic, de regulă, în imediata vecinătate a centromerului, putând fi detectată prin tehnica de bandare a cromozomilor.

Rolul heterocromatinei constitutive este incomplet elucidat, atribuindu-se o semnificaţie de "protecţie" sau de "suport", sugerându-se ipoteza că ea determină specificitatea centromerică, respectiv poziţia centromerului în cromozomi.

Heterocromatina facultativă este o cromatină condensată, care conţine gene structurale represate (inactive) pe care nu se face transcripţia. Pe aceste gene, transcripţia s-a efectuat sau nu într-o perioadă anterioară, sau se va putea efectua, dacă se transformă în eucromatină, sub influenţa unui agent derepresor. Astfel, transformarea unei părţi din heterocromatina autozomală în eucromatină determină sinteza de imunoglobuline şi transformarea limfoblastică a limfocitelor.

În funcţie de cromozomi în care se găseşte, heterocromatina poate fi: 1-autozomală (autosoma), prezentă în perechile de cromozomi autozomi, sub forma porţiunilor condensate, heterocromatice, ce conţin lanţuri de gene, inactive transcripţional; 2-gonozomală (gonosoma), prezentă numai în cromozomii ce determină sexul , reprezentată de cromatina X, la femelă şi de corpusculul Y, la mascul.

Fig.4.10. Aspectele cromatinei X

1-Satelit nucleolar; 2-Drumstick; 3-Corpuscul cromocentric

Cromatina X sau corpusculul Barr a fost descrisă de M.L.BARR şi de E.G.BERTRAM în 1949, în neuronii din nucleul nervului hipoglos la pisică. Este folosită ca marker genetic pentru recunoaşterea sexului genetic. In mod normal este prezentă numai în nucleii celulelor somatice ale femelelor sub forma unui corpuscul cromatidian, denumit corpuscul Barr. Acesta reprezintă condensarea interfazică a unuia din cei doi gonozomi X. Prin condensare, eucromatina se transformă în heterocromatină facultativă inactivă. În situaţia în care ambii gonozomi X ar fi activi (transcripţionabili), în celulele femelei ar trebui să existe o cantitate dublă de enzime, controlate de genele situate pe cromozomul X.

Cromatina X este prezentă şi detectabilă la toate femelele mamiferelor, cu excepţia femelei de opussum (mamifer marsupial), unde este prezentă la ambele sexe. Lipseşte la toţi masculii normali.

Corpusculul Barr are un diametru de cca. 1µm şi poate prezenta forme diferite: plan-convex, convex-concav, biconvex, triunghiular. Poziţia sa variază după tipul celular, apărând situtat adiacent membranei nucleare interne ( în celulele epidermale şi ale epiteliului mucoasei bucale) sau ataşat nucleolului (în unii neuroni). În neutrofilele femelelor este prezentă o formaţiune echivalentă corpusculului Barr, denumită, după aspectul său "băţ de tobă" (drumstick), formată dintr-un cap cu diametrul de 1,5µm, ataşat printr-un filament cromatic extrem de subţire la unul din lobii nucleului. Frecvenţa drumstick-ului est de 7/500 neutrofile, sau chiar mai mult.

Cromatina Y sau corpusculul F se poate observa în nucleii celulelor provenite de la masculii normali, examinate în lumină ultravioletă, după colorare cu fluorocrom. Are aspectul unui corpuscul intens fluorescent. A fost descpoperit de PEARSON, în 1970 şi reprezintă expresia citologică a cromozomului Y. La indivizii ce prezintă doi cromozomi Y se observă doi corpusculi F. În acest mod se pot diagnostica unele anomalii cromozomiale (trisomia XXY) la masculi, care predispun la un comportament dur, înrăit.

4.4.3. Cromozomii

46

Cromozomii (Chromosoma) sunt structuri celulare cu număr, forme şi mărimi caracteristice pentru fiecare specie. Ei devin vizibili la microscopul optic în celulele care se pregătesc pentru diviziune sub forma unor filamente lungi, cu mare afinitate pentru coloranţi bazici, de unde îşi trag denumirea, croma însemnând în limba greacă culoare, iar soma - corp. (Fig.4.11.)

În funcţie de posibilităţile de a fi observaţi la microscopul optic, cromozomii pot fi clasificaţi în : - cromozomi interfazici, necondensaţi şi neobservabili la microscop; -cromozomi mitotici, uşor observabili la microscop, mai ales în cursul metafazei şi de aceea denumiţi cromozomi metafazici. Structura cromozomilor metafazici cuprinde: cromatidele, centromerul, kinetocorii, constricţiile secundare şi sateliţii.

Cromatidele (chromatidea) sunt cele două jumătăţi longitudinale, genetic identice ce formează fiecare cromozom metafazic. Fiecare cromatidă corespunde unei molecule de ADN.

Fig.4.11. Cromozomi interfazici şi cromozomi mitotici

Extremităţile terminale ale cromatidelor se numesc telomere (telomerus) şi sunt absolut necesare pentru structura şi funcţionarea normală a cromozomilor, deoarece previn fuziunea şi menţin o anumită ordine a cromozomilor interfazici în interiorul nucleului prin ataşarea lor la membrana nucleară internă.Centromerul (centromerus ) sau constricţia primară este regiunea cea mai îngustă din lungimea cromozomului, unde cele două cromatide se unesc. Centromerul este slab colorat sau acromatic, având un conţinut scăzut de ADN. În vecinătatea centromerului se găseşte heterocromatina constitutivă. Cei mai mulţi cromozomi sunt monocentrici ( cromosoma monocentricum), prezentând un singur centromer. În cazul unor anomalii cromozomiale apar cromozomi dicentrici ( cromosoma dicentricum) sau policentrici (cromosoma polycentricum).

Kinetocorii (kinetocorus, i) sunt în număr de doi pentru un cromozom şi reprezintă locul prin care fiecare cromatidă se ataşează de microtubulii fusului de diviziune. La microscopul electronic un kinetocor are forma unui oval cu dimensiunile de 5/25 nm. (fig.4.12.)

47

Fig.4.12.Ultrastructura cromozomului1-Centromer; 2-Cromatide; 3-Cromoneme; 4-Cromomere.

Constricţiile secundare sunt zone ale cromozomilor ce nu reţin colorantul bazic. Servesc drept criteriu morfologic de indiviudalizare a cromozomilor. În comparaţie cu constricţiile primare, la nivelul costricţiilor secundare nuse produc deviaţii angulare ale segmentelor pe care le unesc. Unele din zonele de constricţie secundară sunt legate de formarea nucleolilor şi se numesc zone nucleolare sau organizatori nucleolari. iar cromozomii care participă la formarea nucleolilor sunt denumiţi cromozomi nucleolari (chromosoma nucleolare).

Satelitul (satelles chromosomalis) este un corpuscul sferic, cu diametrul egal cu al cromozomului sau mai mic, ataşat de restul cromozomului printr-un filament (filum satellitis) subţire de cromatină de lungime variabilă. Cromozomii ce prezintă satelit se numesc SAT-cromozomi (chromosoma satellitiferum).

În funcţie de poziţia centromerului, cromozomii se clasifică în: 1-telocentrici (chromosoma telocentricum), la care centromerul este situat la o extremitate a cromozomului,lipsindu-i braţele scurte; 2-acrocentrici (chromosoma acrocentricum), cu braţe scurte abia vizibile, centromerul fiind situat în apropierea extremităţii cromozomului;3-submetacentrici (chromosoma submetacentricum), la care centromerul este situat în apropierea mijlocului lungimii cromozomului, prezentând un braţ scurt şi un braţ lung; 4- metacentrici (chromosoma metacentricum), cu braţeleaproximativ egale, centromerul fiind situat la mijlocul lungimii cromozomului.

Fig.4.13. Schema unui cromozom.Tipuri de cromozomi.1-Centromer: 2-Constricţie secundară; 3-Satelit;

48

a-Cromozom telocentric; b-Cromozom acrocentric; c-Cromozom submetacentric;d-Cromozom metacentric.

Dimensiunile cromozomilor sunt cuprinse între 1,5-10 µm, lungime şi 0,2-2 µm diametru, putându-se întâlni cromozomi giganţi şi cromozomi pitici.

Numărul cromozomilor apare constant pentru aceiaşi specie, existând: 60 cromozomi la bovine, 54 la ovine, 38 la suine, 64 la cabaline, 63 la catâr, 38 la felide, 78 la canide şi 46 la primate.

Celulele sexuale sau gameţii sunt haploide (haplos= simplu), conţinând un singur set de cromozomi, notat cu "n",faţă de celulele somatice care sunt diploide (diplos=dublu) şi conţin două seturi (2n) de cromozomi (un set matern şi altul patern). Fiecare cromozom dintr-un set are în setul opus un cromozom complementar, identic structurat morfologic şi genetic, alcătuind o pereche de cromozomi omologi. Asfel, taurinele prezintă 58 cromozomi autozomi (29 perechi) şi 2 cromozomi de sex ( heterocromozomi sau gonozomi). Taurinele femele au în celulele somatice doi cromozomi X, ,iar formula cromozomială este 60,XX. Masculii taurinelor au formula cromozomială 60,XY şi prezintă în celulele somatice un cromozom X şi altul Y. În formula cromozomială, prima cifră indică numărul total de cromozomi, după virgulă fiind indicaţi cromozomii de sex (gonozomii). La taurine, fiecare din cele 29 perechi de cromozomi autosomi este formată din 2 cromozomi omologi, cu aceiaşi morfologie şi dispunere a genelor. Heterocromozomii ( gonozomii) nu sunt omologi. La taur, diferenţa de formă între cromozomul X şi cel Y este evidentă, cromozomul Y fiind un cromozom submetacentric mic. La vaci, cei doi cromozomi X submetacentrici nu sunt omologi, deoarece numai unul este activ genetic, iar celălalt este inactiv, rămâne condensat în interfază şi formează cromatina sexuală (corpusculul Barr). Diferenţierea celor doi cromozomi X în unul activ şi altul inert genetic se face într-un stadiu precoce al dezvoltării embrionare.

Compoziţia chimică a cromozomilor include ADN, proteine (histonice şi nonhistonice) şi o cantitate redusă de ARN.

Histonele sunt proteine cu greutate moleculară redusă (10.000- 20.000 dal), cu conţinut mare (10-20%) de aminoacizi bazici (lizină şi arginină), purtători de sarcini electrice pozitive, ce le permite să se lege de sarcinile negative ale grupărilor fosfat din ADN. La eucariote există cinci clase de histone, ce diferă după conţinutul lor în lizină şi arginină: H1, H2A, H2B, H3 şi H4.. În timp ce histonele H2A, H2B, H3 şi H4 sunt cele mai constante din punct de vedere al secvenţei aminoacizilor la diverse specii, histonele H1 prezintă o variabilitate a secvenţelor.

Proteinele nonhistonice sunt de foarte multe tipuri, de la proteine ce intră în structura cromozomilor sau care se leagă de ADN, intervenind în exprimarea genelor şi până la proteine enzime ce intervin în sinteza de ADN şi ARN sau în scindarea lor.

Proteinele ce intervin în reglarea exprimării genelor sunt rare, apărând într-un exemplar la 3000 de nucleozomi. Există, însă şi proteine nehistonice mult mai abundente, precum grupul de proteine cu mobilitate mare (HMG-higt mobility group), care fiind mici şi cu multe sarcini electrice migrează rapid în cursul electroforezei. Din acest grup, proteinele HMG14 şi HMG17 se găsesc în toate celulele de la mamifere, legându-se de nucleozomii asociaţi cu genele active.

ARN-ul se găseşte în cantitate redusă în cromozomi, fiind reprezentat de ARN-ul nascent, care se formează pe matriţa de ADN în procesul de transcriere.

4.4.3.1. Cariotipul

Cariotipul este reprezentat de totalitatea caracterelor morfologice (număr, mărime, formă, poziţia centromerului, constricţiile ) ale cromozomilordintr-o celulă diploidă. Grafic poate fi prezentat printr-o "hartă" numită cario- sau idiogramă, în care perechile de cromozomi omologi sunt aşezaţi în ordinea descrescândă a lungimii. Cromozomii sexuali sunt cromozomi X submetacentrici şi cromozomul Y, submetacentric mic.

Cariotipul unei specii se obţine prin fotografierea cromozomilor metafazici, obţinuţi din metafazele limfocitelor din culturi, stimulate să se dividă cu fitohemaglutinine şi blocate în metafază prin adaus de colchicină, un alcaloid ce împiedică asamblarea fusului de diviziune. Din fotografiile obţinute se decupează cromozomii şi se aranjează în cariotip, putându-se identifica grupele de cromozomi, făra a se putea preciza cu certitudine perechea. Identificarea fiecărei perechi se face prin folosirea tehnicilor de bandare, tehnici care permit punerea în evidenţă a unor benzi transversale de-a lungul cromozomilor, benzi care sunt caracteristice pentru fiecare cromozom.

Se folosesc două categorii de tehnici de bandare: 1- tehnici cu fluorescenţă prin care se obţin benzile "Q" ( de la quinacrină) fluorescente; 2 -tehnici bazate pe tratarea cromozomilor cu diferiţi agenţi fizici şi chimici, urmate de coloraţia Giemsa prin care se evidenţiază trei feluri de benzi : benzile G (Giemsa), care apar intens colorate şi corespund benzilor fluorescente Q; -benzile R

49

(reverse band), cu o dispunere inversă benzilor G, încât benzile R intens colorate, corespund benzilor G palide;- benzile C, apar numai în regiunea centromerului sau în apropiere ei şi corespund localizării heterocromatinei constitutive.

Determinarea cariotipului are o mare importanţă în practica medicală, pentru: a-diagnosticul unor boli congenitale, precum trisomia perechiii 21, care produce boala Down (idioţia mongoloidă); b- sfatul genetic şi dirijarea împerecherilor la animale; c-aprecierea statusului genetic la populaţiile cu mare risc genetic; d-diagnosticul diferenţial al unor anomalii sexuale, cu determinare genetică, precum sindromul Turner (XO, în loc de XX), ce produce sterilitate, ovare vestigiale şi sindromul Kleinfelter (XXX, în loc de XY), ce se manifestă prin testicule atrofiate, sterilitate, ginecomastie; e-diagnosticul unor boli ale sângelui, precum leucemia mieloidă, unde apare un cromozom marker anormal (cromozomul Ph-Philadelphia); f - pentru diagnosticul de paternitate, prin măsurarea lungimii cromozomului Y, care trebuie să fie aceiaşi la făt ca şi la presupusul tată; g- pentru diagnosticul diferenţial între unele tumori benigne şi alte maligne, ce modifică cariotipul. De asemenea stabilirea locusului pe care îl ocupă ogenă într-un cromozom permite realizarea hărţilor cromozomiale, un domeniu de cercetare de mare actualitate.

4.4.3.2. Organizarea moleculară şi supramoleculară a cromozomilor la eucariote.

La microcopul electronic, cromozomii metafazici apar ca nişte gheme de cromatină, înfăşurate foarte neregulat. Fiecare cromatidă conţine o singură moleculă de ADN ce se organizează sub forma unei fibre de cromatină, cu grosimea de 10 nm, foarte sinuoasă, împachetată compact, prezentând zone de eucromatină şi heterocromatină. Împachetarea ADN-ului şi a histonelor în cromozom este absolut necesară pentru ca o moleculă de AND co greutate moleculară de 6×1010

daltoni şi o lungime de 3 cm să încapă într-un cromozom lung de 5 µm ( 0,0005 cm). Împachetarea se facecu ajutoul nucleozomilor, care sunt unităţi fundamentale repetitive de organizare a complexului AND -histone, deci a cromatinei. (Fig.4.14).

Fig.4.14.Modalităţi de plicaturare a fibrei de cromatină în cromozom1-Plicaturare transversală; 2-Plicaturare longiutdinală; 3-Plicaturare combinată; 4-Structură cuaternară.

4.4.3.3. NucleozomiiConceptul de nucleozom a fost elaborat de KÖRNBERG, în anii 1975-1977. Un nucleozom

este un octamer histonic de forma unui cilindru scurt , cu un diametru de 11 nm şi o înălţime de 5,5 nm, pe care duplexul de AND îl înconjoară de două ori.(Fig.4.15.)

50

Fig.4.15.Alcătuirea nucleozomului Fig.4.16.Poziţia histonei H1

Octamerul histonic este format din opt molecule de histone, câte două molecule de H2A, H2B, H3 şi H4. Tetramerul de histone - (H3)×2 şi (H4)×2 - bogate în arginină formează miezul nucleozomului şi determină înfăşurarea duplexului de ADN. Cei doi dimeri de histone bogate în lizină, - (H2A)×2 şi (H2B)×2 - sunt ataşaţi miezului nucleozomului. Nucleozomul nu conţine proteine nonhistonice.

Histona H1 nu intră în structura nucleozomului, fiind siutată lateral de acesta, în contact cu intrarea sau ieşirea ADN-ului din nucleozom. Histona H1 se leagă de ADN-ul linker prin forţe ionice, prezentând o porţiune C (carboxil) terminală, legată direct de ADN şi o porţiune N (amino-), ce nu se ataşează de ADN, dar oferă locusuri de legare pentru proteinele nehistonice HMG1 şi HMG2. Histona H1 este implicată în spiralizarea Fibrei de cromatină.(Fig.4.16).

Molecula de ADN este continuă de-a lungul cromozomului, prezetând porţiuni înfăşurate pe nucleozomi şi porţiuni ce fac legătura dintre doi nucleozomi succesivi, denumite ADN-linker sau internucleozomic. De ADN-ul linker se leagă o moleculă de histonă H1, amplasată între doi nucleozomi. Se realizează, asfel, o înşiruire a nucleozomilor unul după altul, ca mărgele pe aţă, formându-se filamentul subţire de cromatină, cu diametrul de 11 nm, care se poate observa la microscopul electronic, numai dacă cromatina este "întinsă" în mod artificial. În celula vie, fibra de cromatină are un diametru de 30 nm, răsucită într-o structură helicoidală (un solenoid sau o bobină) cu pasul elicei de 11 nm. La fiecare tur de spiră se inseră şase nucleozomi. Rata de împerechere a ADN-ului pe nucleozom este de circa 10/1. aproximativ 60 nm de ADN fiind înfăşuraţi pe un cilindru nucleozomic înalt de 5,5 nm. Apoi, dispunerea nucleozomilor sub formă de bobină (solenoid) cu diametru de 30 nm permite realizarea unui raport de împachetare de cca. 50/1. Eucromatina corespunde filamentului de cromatină de 10 nm, iar heterocromatina corespunde solenoidului (bobinei) de 30 nm.(Fig.4.17)

51

Fig.4.17.Formarea filamentului subţire de cromatinăA-Histona H1; B-Nucleozom; C-Filamentul de cromatină;1-Porţiunea globulară a histonei.

Împachetarea duplexului de ADN pe nucleozom şi a nucleozomilor în fibra de cromatină de 30 nm ar permite ca într-un cromozom ipotetic de 1 mm lungime, să încapă un ADN lung de 3 cm. La rândul ei, fibra de cromatină de 30 nm se pliază formând bucle de mărimi variabile, ce permite să se reducă lungimea "firului" de ADN de la 1 mm la 100 µm.

Pentru a "încape" în cei 5 µm lungime ai unui cromozom metafazic sunt necesare încă două ordine de condensare a cromatinei, care se realizează probabil prin împachetarea elicoidală a buclelor de cromatină, încât aglomerarea lor în anumite zone determină apariţia benzilor vizibile în cromozomul metafazic. Se pare că superspiralizarea solenoidului se realizează cu ajutorul unor proteine nehistonice. Astfel, fosforilarea proteinelor nehistonice ar declanşa superspiralizarea solenoidului, în momentul trecerii de la G2 la mitoză, iar defosforilarea lor ar induce despiralizarea, în momentul trecerii de la mitoză la G1. Alături de histone, în procesele de împachetare a nucleozomilor în fibra de cromatină, întervine ionul de Mg2+.(Fig.4.18.)

Fig.4.18.Structura fibrei de cromatină de 30 nm (A) şi nucleozomului (B).1- Miezul histonic; 2- ADN linker.

In timpul diviziunii celulare, condensa-rea cromatinei corespunde împachetă-rii compacte în spaţiu a fibrei de cromatină de 30 nm, odată cu realizarea structurii cromozomului metafazic. (Fig.4.19.)

S-a calculat că, ADN-ul înfăşurat pe un nucleozom este prea scurt pentru a corespunde unei gene structurale, încât nu există o concordanţă între o genă, ca unitate de informaţie genetică şi un nucleozom, ca unitate de împachetare a ADN-ului.

52

Gena este formată din aproximativ 1000 perechi de nucleotide (perechi de baze), în timp ce ADN-ul înfăşurat pe un nucleozom are 200 perechi de baze. Unele gene de la eucariote apar discontinui, prezentând secvenţele din ADN care codifică aminoacizi (exoni), separate între ele prin secvenţe de ADN care nu codifică aminoacizi (introni).(fig. 4.19)

Fig.4.19.Eucromatina şi heterocromatina Fig.4.20.Etapele realizării structurilor cromozomilor eucariotici

1-ADN linker A-Duplex de ADN; 1+2–Eucromatină; B-Filament de cromatină; 3-Solenoid de 30 nm - heterocromatină C-Fibra de cromatină; D-Bucle de cromatină; E-Bandă condensată; F-Cromozom în metafază.

Există mai multe ipoteze asupra mecanismului prin care genele structurale din ADN-ul înfăşurat pe nucleozom sunt activate pentru transcripţie. Cea mai larg acceptată ipoteză (emisă în 1982) susţine că activarea genelor se face ca urmare a intervenţiei proteinelor nehistonice HMG14 şi HMG17, care fie că înlocuiesc proteinele HMG1 şi HMG2 de pe locurile lor de legare pe histona H1,fie că înlocuiesc însăşi histona H1 de pe ADN-ul linker internucleozomic.(Fig.4.20.)

In acest fel, regiunile din filamentul nucleozomic în care intervin proteinele HMG14 şi HMG17

îşi vor modifica conformaţia biochimică, devenind regiuni active transcripţional.

4.5. Nucleolul

53

Nucleolul (nucleolus) este o componentă intranucleară, cu aspect corpuscular (corpusculum

nucleare), prezentă în interfază, a cărei funcţie principală constă în biogeneza ribozomilor (cu excepţia ribozomilor mitocondriali. Ocupă o poziţie cheie în circuitul intracelular al informaţiei, fiind sediul unui considerabil trafic de molecule. În el se desfăşoară principalele procese care au loc în nucleu (replicare, transcripţie, transport), jucând rolul unui intermediar între cromozomi şi citoplasmă. Este prezent (vizibil sau nu ) în toate celulele eucariote. Nu există nucleu fără nucleol, iar celulele care îşi perd nucleolii nu mai sunt viabile.

În timpul diviziunii celulare se dezintegrează şi reapare după terminarea acesteia. În structurarea nucleolului, un rol deosebit revineorganizatorilor nucleolari, prezenţi în unii cromozomi, adiacent constricţiei secundare.

Deşi a fost observat încă din 1836 de către VALENTIN, ca o granulă densă în interiorul nucleului, rolul său a fost dezlegat mult mai târziu, abia în 1960, precizându-se rolul esenţial pe care îl are în biogeneza ribozomilor.

Examinat la microscopul prezintă un aspect omogen, puternic bazofil, bine delimitat. Prin impregnări argentice, au fost evidenţiate două componente în structura nucleolului: 1-nucleolonema (nucleolonema), o formaţiune filamentoasă, răsucită ca un ghem; şi 2- o componentă astructurată sau amorfă (pars amorpha). Nu este delimitat de o membrană.

În celulele vii, examinate în contrast de fază, nucleolul apare ca un corpuscul puternic refringent, datorită conţinutului redus de apă, heterogen şi cu contur neregulat.

Numărul nucleolilor. În nucleii celulelor somatice există, în mod obişnuit doi nucleoli, câte unul pentru ,fiecare set cromozomial. Numărul nucleolilor creşte în raport direct cu gradul de poliploidie. Astfel, în hepatocite există 2 nucleoli, în celulele diploide, 4 în cele tetraploide şi 8 în cele octaploide.

Dimesiunile nucleolilor sunt între 1-2 µm, ocupând circa 30% din volumul nucleului. Ele variază în funcţie de implicarea celulelor în sinteza de proteine. Celulele care sintetizează cantităţi mari de proteine (neuronii, celulele embrionare, limfocitele stimulate antigenic) au nevoie de mulţi ribozomi,ceea ce face ca nucleolii să aibă dimensiuni mari. În celule în care sinteza de proteine este redusă (în spermatozoizi), nucleolii au dimensiuni mai mici. Nucleolul apare hipertrofiat în anabolism, în perioada de diferenţiere embrionară şi se reduce în catabolism şi în inaniţie.

Raportul nucleolo / nuclear. Numărul şi volumul nucleolilor depind de starea funcţională a celulei. Cu cât celula este mai activă în sinteza proteinelor, cu atât raportul nucleolo/nuclear este mai mare. Acest raport este folosit drept criteriu pentru aprecierea vârstei celulelor. Astfel celula tânără prezintă un nucleu mare eucromatic, cu un nucleol mare, cu o citoplasmă redusă şi bazofilă, iar o celulă adultă prezintă un nucleu mai mic, hipercrom, cu nucleoli mici şi o citoplasmă abundentă.

Fig.4.21. Forma şi poziţia nucleoluluiA-Forma: 1-Sferoidal-ovoidală; 2-Discoidală; 3-Triunghiulară; 4-Neregulată.B-Poziţia: 1-Alipit membranei nucleolare; 2-Central; 3-Excentric.

Forma nucleolilor. Nucleolii prezintă, de cele mai multe ori, o formă sferic-ovoidală, care pe măsura îmbătrânirii celulei devine neregulată.

Densitatea nucleolilor este mare (1,35), nucleolul fiind cea mai densă structură din celulă, datorită concentraţiei ridicate în substanţă uscată şi a cantităţii foarte mici de apă.

Dispunerea nucleolilor în nucleu este în majoritatea cazurilor centrală sau paracentrală, putând varia în raport cu mometul funcţional. S-au observat şi descris mişcări ale nucleolului în interiorul nucleului şi stabilirea unor contacte cu învelişul nuclear, localizare eficientă pentru descărcarea de material biologic în citoplasmă.

4.5.1. Ultrastructura nucleoluluiUltrastructura nucleolului evidenţiază patru componente în alcătuirea nucleolului: componenta

filamentară (pars filamentosa), componenta granulară (pars granulosa), componenta cromozomială (pars cromosoma) şi componenta astructurată (pars amorpha).

54

Componenta filamentară cuprinde filamente de 5nm grosime şi 30-40nm lungime, dispuse în pachete întretăiate, formând o reţea. Conţine ADN-ul pe care se sintetizează ARN-ul ribozomal şi produsul primar al acestei sinteze (ARN de 45 S). (Fig.4.22.)

Componenta granulară este domi-nantă, fiindalcătuită din granule cu diametru de 15-20 nm, asemănătoare, dar nu identice cu ribozomii citoplasma-tici. Aceste granule reprezintă precursorii ribozomilor.

Componenta cromozomială, dispusă la periferia nucleolului (cromatina perinucleolară) sau avansând spre interiorul nucleolului sub formă de benzi (cromatină intranucleolară) este alcătuită din filamente de 10 nm.

Fig.4.22.Ultrastructura nucleolului.

1-Componenta filamentară;2-Componenta granulară;3-Componenta cromozomială;4-Componenta

astructurată.

Componenta astructurată apare omogenă şi cu densitate medie la fluxul de electroni. Umple spaţiul dintre granule şi fibre, fiind considerată, de unii autori, cariolimfă, iar de alţi autori un gen de matrice pentru celelalte componente nucleolare.

Cele patru componente nucleolare se pot distinge în acelaşi nucleol numai în cazuri rare. Raporturile cantitative şi topografice dintre ele variază în funcţie de tipul celulei şi de momentul funcţional al acesteia. Asfel, în hepatocitul uman, componentei filamentoase îi revine 15 %, celei granulare 70%, iar componentei cromozomiale 5% din volumul nucleolului. În celulele active, componenetele nucleolare pot segrega, dând naştere unui corpuscul nucleolar (corpusculum nucleare).

Nucleolul nu conţine membrane şi nu este delimitat de membrane.Componenta filamentoasă şi ce granulară se pot asocia formând benzi ce apar, la microscopul optic, ca nucleolemă. iar porţiunea periferică a componentei cromozomiale corespunde cromatinei asociate nucleolului.

În funcţie de criteriile ultrastructurale, există mai multe tipuri de nucleoli: nucleoli reticulari, cei mai comuni, cu cele patru componente distincte; nucleoli compacţi, în care nu se disting componentele, întîlniţi la câteva tipuri celulare, ca de exemplu la limfocite; nucleoli inelari, în care copmponenetele filamentoasă şi granulară formează un inel periferic, care înconjoară o lacună centrală.

Compoziţia chimică a nucleolului variază în funcţie de tipul celular şi de momentul funcţional, principalele componente chimice fiind: ADN-ul (3 %), ARN-ul (7%) şi proteinele (90% din greutatea uscată). La aceasta se mai adaugă cantităţi mici foarte mici de lipide şi minerale (magneziu, calciu, zinc, cobalt, etc.).

ADN-ul din nucleol este reprezentat de organizatorii nucleolari ce pătrund ca nişte bucle de ADN în nucleol.

ARN-ul din nucleol este în principal ARN ribozomal aflat în diverse faza de maturare. Se presupune că nucleolul este o staţie intermediară obligatorie în tranzitul spre citoplasmă al ARN-ului mesager şi al celui de transfer.În nucleol există diferite tipuri de ARN, ce diferă după coeficentul lor de

55

sedimentare (exprimat în unităţi Svedberg), precum ARN 45 S, ARN 41 S, ARN 20 S, ARN 28 S, ARN 32 S. Aceste tipuri corespund diferitelor etape de maturare a ARN-lui.

Proteinele nucleolare provin din citoplasmă şi sunt repezentate în cea mai mare parte de enzime implicate în sinteza şi maturarea ARN r (ribozomal), precum ARN-polimeraza-ADN dependentă (sau ARN-polimeraza I), convertaza, metilaza,etc.

Bazofilia nucleolului reprezintă principala sa caracteristică, vizibilă la microscopul optic şi se datoreşte conţinutului relativ mare de ARN şi AND.

4.5.2.Biogeneza nucleolilorNucleolul este vizibil numai în interfază,dispărând în profază şi reapărând în interfază. Un rol

esenţial în biogeneza nucleolului îi revine organizatorului nucleolar,care este o zonă cromozomială distinctă, slab colarabilă (heteropicnoză negativă), situată în vecinătatea constricţiei secundare, având un grad mai redus de înfăşurare a fibrei de cromatină. Numărul cromozomilor care prezintă organizatori nucleolari este limitat şi variabil în funcţie de specie. La hominide există cinci perechi de cromozomi autuzomi, purtători de organizatori nucleolari (perechile 13, 14, 15,21 şi 22 ). (Fig.4.23.)

La microscopul optic, organizatorii nucleolari corespund cromatinei asociată nucleolului, ce poate fi evidenţiată prin reacţia Feulgen, apărând colorată roşu-violaceu. La microscopul electronic, organizatorii nucleolari corespund componentei cromozomiale, iar funcţional cu ADN r (genele care codifică ARN r) ce cuprinde cistronii responsabili de transcripţia ARN r.

Fig.4.23. Organizatorii nucleolari.1-Învelişul nuclear; 2-Nucleol; 3- Cromozomi cu oranizatori nucleolari; 4-

Bucle de cromatină cu gene pentru ARN r.

Ipotezele clasice privind biogeneza nucleolului susţin: a- continuitatea sau persistenţa nucleolului în cursul diviziunii celulare sub formă de granule sau filamente fine (denumite corpusculi

nucleolari), ataşate de cromozomi, împreună cu care se repartizează în celulele fiice, după care sunt asamblaţi de organizatorii nucleolari; b-formarea de novo, deoarece materialul nucleolar se dezintegrează complet în cursul mitozei, fără a fi incorporat în noii nucleoli.

Concepţia actuală a realizat un compromis raţional din punct de vedere molecular, între ipotezele clasice (a continuităţii şi a formării de novo), în sensul că componeneta cromozomală respectă continuitatea, iar celelalte componente (filamentoasă, granulară şi amorfă) sunt neoformate rapid în faza G1 a ciclului celular, când cistronii sunt reactivaţi pentru transcripţie.

4.5.3. Funcţiile nucleoluluiNucleolul îndeplineşte funcţii legate de: - sinteza ARN r şi biogeneza ribozomilor; -reglarea

sintezei de ARN r; - transferul ARNm şi ARNs în citoplasmă; pregătirea mitozei.În sinteza de ARNr, ADN-ul nucleolar joacă rolul de matriţă, reprezentând organizatorul

nucleolar. ADN nucleolar conţine cistroni, denumiţi ADNr, responsabili pentru transcripţia ARNr, separaţi între ei prin segmente de spaţiere şi terminare, formate din ADN care nu codifică. ADNr este transcris prin intervenţia ARN-polimerazei I, rezultând un ARN de 45 S care reprezintă precursorul ARN-ribozomal. În nucleolii hepatocitelor se sintetizează 1000 de molecule de ARN-45S pe minut. O parte din molecula de ARN de 45 S este îndepărtată de o endonuclează şi apare un ARN de 41 S, care prin intervenţia unei convertaze este scindat în ARN de 20 S şi ARN de 32 S. (Fig.4.24.)

56

Fig.4.24.Rolul nucleolului în sinteza de ARNr şi în biogeneza ribozomilor

ARN-ul de 20 S suferă intervenţia unei metilaze, care îndepărtează un fragment molecular, transformându-se în forma matură de 18 S. ARN-ul de 18 S părăseşte nucleolul şi se combină cu proteine venite din citoplasmă, după care este trecut în citoplasmă prin porii membranei nucleare sub formă de particule ribonucleoproteice, care reprezintă subunitatea ribozomală mică de 40 S, ce apare în citoplasmă la 30 minute de la începerea sintezei.

ARN-ul de 32 S este şi el metilat şi se transformă în formamatură de ARN de 28 S, după ce a pierdut un fragment din moleculă. ARN-ul de 28 S împreună cu ARN-ul de 5 S ( de origine nucleară, dar extranucleolară) şi cu proteine formează o particulă ribonucleoproteică, care reprezintă subunitatea ribozomală mare (de 60 S). Subunitatea ribozomală mare trece prin porii învelişului nuclear, apărând în citoplasmă la o oră de la debutul sintezei. Cele două subunităţi ribozomale se ataşează de ARNm, în momentul începerii sintezei de proteine, formând ribozomii. Fibrilele din componenta filamentoasă sunt filamente de ARN de 45 S, iar granulele din componenta granulară sunt subunităţi ribozomale mari.

57

Biogeneza ribozomilorEtape Intervin: RezultatCopierea cistronilor ADNr ARN-polimeraza I Sinteza de ARN 45 SPrelucrarea ARN 45 S Endonucleaza ARN 41 SPrelucrarea ARN 41S Convertaze ARN 20 S

ARN 32 SPrelucrare ARN 20 S Metilaze ARN 18 SPrelucrare ARN 32 S Metilaze ARN 28 SPrelucrare ARN 18 S Proteine ribozomale Subunitatea ribozomala mica 40 SPrelucrare ARN 28 S Proteine ribozomale Subunitatea ribozomala mare 60 S

Reglarea sintezei de ARNr în nucleol se realizează printr-un mecanism de feed-back. Existeţa unui exces de ribozomii acţionează ca inhibitor al genelor ADN r, care determină sinteza de ARNr. Invers, distrugerea ribozomilor va declanşa încetarea inhibiţiei şi creşterea sintezei de ARNr, cu formarea de noi ribozomi.

Transferul de ARN mesager (ARN m), deci a mesajului genetic şi de ARN de transport (ARN t) din nucleu în citoplasmă nu poate avea loc decât în prezenţa unui nucleol funcţional, fapt demonstrat experimental rpin distrugerea selectivă anucleolului cu un fascicul laser. Se crede că nucleolul joacă rolul de staţie intermediară în tranzitul ARN m-ului şi ARN t-ului spre citoplasmă.

Pregătirea şi desfăşurarea mitozei nu pote avea loc fără prezenţa nucleolului în interfază. Distrugerea acestuia produce blocarea celulei în faza G2, care precede mitoza.

4.5.4. Implicarea nucleolului în citopatologie. Aspectul nucleolului poate fi folosit pentru recunoaşterea celulelor canceroase. În celulele

canceroase, nucleolul prezintă modificări de volum,număr şi formă, care sunt o consecinţă a malignizării şi nu cauza acesteia.

Hipertrofia nucleolară apare ca o caracteristică aproape constantă în celulele neoplazice (canceroase),iar creşterea numărului de nucleoli şi neregularităţile de formă sunt relativ frcvente. Hipertrofia nucleolară nu este acompaniată şi de o hipertrofie proporţională a nucleului încât valoarea raportului nucleolo-nuclear este mai ridicat în celulele neoplazice faţă de cele normale (depăşind valoarea de 1/3). Gradul de hipertrofie a nucleolului reflectă capacitatea proliferativă a celulei fiind proporţional cu gradul de malignitate a tumorii.

Numărul nucleolilor este mai mare în celulele maligne decât în celulele normale, fiind uneori proporţional cu gradul de malignitate a tumorii. Asfel, în unele adenocarcinoame din ovar, au putut fi observati 24 nucleoli într-o celulă.

Forma nucleolilor este neregulată în celulele maligne, ea putând varia de la o celulă la alta în cadrul aceleiaşi tumori.

5.CITOPLASMA

58

Citoplasma (cytoplasma) reprezintă acea componentă a celulei situată între plasmalemă şi nucleolemă. Cuprinde în volumul său : - o matrice citoplamatică ( hialoplasmă sau citoplasma fundamentală) ce corespunde părţii din citoplasmă, care nu este cuprinsă în compartimentele delimitate de membranele intracelulare; - organite celulare sau intracitoplasmatice (organellae cytoplasmaticae); şi - incluziuni (inclusiones cytoplasmaticae) celulare.

5.1. Matricea citoplasmatică

Matricea citoplasmatică (matrix cytoplasmae) se prezintă ca un mediu intern al celulei în care sunt "găzduite" organitele celulare. O lungă perioadă de timp s-a considerat că matricea citoplasmatică este omogenă, nestructurată (amorfă), fapt pentru care a fost denumită hialoplasmă.

Fig.5.1. Ultrastructura citoplasmei1-Membrana celulară; 2-Citoscheletul membranei; 3- Microtubuli; 4-Microtrabecule; 5-

Mitocondrie; 6-Reticul endoplasmic rugos; 7-Polizomi; 8-Fibre de stress; 9-Ribozomi.

Ultrastructura citoplasmei

Denumire Componente Ultrastructuri Observatii

59

A.Matricea citoplasmatica

I.Citoscheletul matriceal

a.Microfilamenteleb.Microfilamentele intermediarec.Microtrabeculed.Microtubuli

Faza solidă

II. Citosolul Citoplama astructurata Faza fluidă1.Microfilamentele de actina Contin:actina, tropomiozina,

troponinele (T,C,I)

I. Organitele miscarii celulare

2.Microfilamentele de miozina Contin:molecule de miozina

3.Microtubulii Contin: α si β tubuline, dineină

II. Organitele energetice

Mitocondriile Au : membrana externa, membrana interna cu criste, compartiment extern, matrice mitocondrială

a.Ribozomi Au: subunitate mica de 40S, subunitate mare de 60s

B.Organite citoplasmatice

III. Organitele de sinteza

b.Reticulul endoplasmatic Reticul endoplasmatic rugosReticul endoplsamatic neted

c.Complexul Golgi Compus din: microvezicule, cisterne golgiene si macrovezicule

IV. Organitele de digestie

1.Lizozomi Contin: hidrolaze acide

2.Peroxizomi (glioxizomi) Contin: uratoxidaza si catalaza

I.Incluziuni cu substante de rezerva

Vezicule delimitate de endomembrane

Conţin : proteine, lipide, glucide,vitamine, minerale

C.Incluziuni citoplasmatice

II.Incluziuni cu produsi de elaborare

Conţin : granule de zimogen,granule de mucigen,hormoni,etc.

III. Incluziuni cu produsi de dezasimilatie

Pigmenti cromolipoizi lipofuscina, hemofuscina

IV. Incluziuni cu pigmenti

1.Pigmenti endogeni

2.Pigmenti exogeni

-carotenoizi, melanici, cu nucleu tetrazolic-praf, pulberi,caroten

La microscopul optic apare astructurată, cu grade diferite de acidofilie sau bazofilie. În celula vie prezintă vâscoelasticitate, apărând mai frecvent cu aspect de gel decât de sol, în funcţie de echilibrul dinamic dintre procesele de polimerizare şi depolimerizare, echilibru determinat de momentul funcţional al celulei, de condiţiile mediului intracelular si extracelular.

Cu ajutorul microscopiei electronice (de transmisie şi de înalt voltaj) s-a observat, în hialoplasmă, citoscheletul matriceal, format din microfilamente şi microtubuli, precum şi dintr-o reţea de microtrabecule.În acest fel matricea citoplasmatică, prezintă două faze sau componente: -o componentă (fază) fluidă,denumită citosol, ce conţine apă, aminoacizi,enzime,electroliţi, ioni şi gaze; - o componentă (fază) solidă, polimerizată, sub forma unei reţele bogată în proteine structurale şi în enzime.(Fig.5.1.)

Matricea citoplasmatică îndeplineşte mai multe roluri: - menţine forma celulei şi o adaptează la necesităţile funcţionale ale celulei prin componentele citoscheletului; - este sediul de desfăşurare a unor procese metabolice, precum glicoliza, gluconeogeneza, glicogenoliza, glicogenogeneza, biosinteza acizilor graşi, a nucleotidelor, etc.; - conţine sau depozitează glicogen (în ficat şi muşchi), lipide (în corticosuprarenală), ioni, pigmenţi, ribozomi liberi, 15% din ARN-ul celular (sub formă de ARN mesager şi ARN de transport); adăposteşte organitele celulare şi incluziunile citoplasmatice.

Organitele citoplasmatice au diferite mărimi, unele de ordinul micrometrilor, fiind observabile la microscopul optic (complexul Golgi, mitocondriile, centrul celular,ergastoplasma) iar altele sunt mai

60

mici, de ordinul nanometrilor, putând fii observate numai la microscopul electronic (ribozomii, lizozomii, peroxizomii, reticulul endoplasmic neted şi rugos, microtubulii şi microfilamentele). Unele organite sunt delimitate de membrane (complexul Golgi, mitocondriile, peroxozomii, lizozomii, reticulul endoplasmic), în timp ce altele sunt lipsite de membrane (ribozomii, centriolii, microtubulii şi microfilamentele).

Organitele delimitate conţin în structura membranelor unele enzime caracteristice, denumite enzime marker, ce pot fi evidenţiate prin metode histochimice. De exemplu, mitocondria se caracterizează prin prezenţa monoaminoxidazei, citocromoxidazei şi a enzimelor ciclului Krebs.Lizozomii au ca enzime marker fosfataza acidă şi aril sulfataza, peroxizomii au catalaza şi urat oxidaza, iar reticulul endoplasmic glucozo-6-fosfataza.

Membranele ce aparţin reticulului endoplasmic, complexului Golgi şi învelişului nuclear se află în continuitate structurală şi funcţională, formând un sistem al endomembranelor. Acest sistem poate stabili conexiuni temporare cu unele organite ca mitocondriile, peroxizomii, unele vacuole şi cu membrana periferică.

Organitele celulare îndeplinesc diferite funcţii: 1- mişcarea intracelulară (microfilamentele, microtubulii, centriolii); 2- deplasarea celulei în mediu extracelular (cilii şi flagelul); 3- producerea de energie (mitocondriile); 4-digestia intracelululară (lizozomii, peroxizomii); 5-dezintoxicare (reticulul endoplasmic neted, peroxizomii); 6- sinteza de molecule necesare celulei sau destinate exportului (ribozomii, reticulul endoplasmic rugos şi neted, compexul Golgi); 7- unele funcţii speciale în celulele musculare (miofilamentele), în celulele epiteliale (tonofilamentele), în celulele nervoase (neurofilamentele) şi nevroglice (gliofilamentele).

5.2.Citoscheletul

Citoscleletul (cytoskeleton) este o reţea în spaţiu (tridimensională) de filamente proteice şi microtubuli care străbat întreaga matrice citoplasmatică, întretăindu-se în toate direcţiile.

Citoscheletul îndeplineşte funcţii variate: - menţine forma celulei şi o adaptează la necesităţile funcţionale; - participă la realizarea mişcărilor celulei; - ia parte la formarea citoscheletului membranei;- interacţionează cu nucleul şi cu organitele celulare (mitocondriile,veziculele sinaptice), participând la menţinerea lor în poziţie şi la deplasarea lor în celulă (mitocondriile şi lizozomii efectuând o mişcare saltatorie); - interacţionează cu macromoleculele din citosol, evidenţiindu-se enzime glicolitice legate de filamentele de actină; - participă la transportul proteinelor în lungul axonului.

Citoscheletul se modifică în celulele maligne. Astfel, fibroblastele transformate malign îşi pierd fibrele de stress din citoschelet şi devin sferice.

În compunerea citoscheletului intră microfilamentele, microtubulii, microfilamentele intermediare şi microtrabeculele.

5.2.1. Microfilamentele şi microtubulii

Microfilamentele (microfilamentum, a) sunt componente ale citoscheletului, prezente în citoplasma tuturor celulelor, apărând mai abundente în celulele care prezintă mişcări de deplasare în ţesuturi sau mişcări active intracitoplasmatice. Au lungimi variate şi un diametru de 5-7 nm, putând apare izolate sau grupate. Sunt orientate pe direcţii diferite şi formate din molecule proteice, în special din actină şi miozină, asemănătoare celor din celulele musculare.

Microtubulii (microtubulus,i) sunt componente ale citoscheletului cu aspect cilindric, cu diametrul cuprins între 20-30 nm, formaţi prin polimerizarea unor molecule proteice, denumite tubuline. Pot apare grupaţi sau izolaţi.

Microfilamentele şi microtubulii sunt ultrastructuri cu caracter dinamic, deoarece procesele de polimerizare şi depolimerizare se desfăşoară concomitent şi continuu. Ele se asamblează şi dezasamblează rapid în celulă, în citoplasmă existând un depozit permanent de monomeri de actină şi de dimeri de tubulină.

Microtubulii şi microfilamentele prezintă polaritate, încât polimerizarea şi depolimerizarea se desfăşoară cu viteze diferite la cele două extremităţi. La extremitatea pozitivă (notată cu +), viteza polimerizării este mult mai mare decât cea a depolimerizării, încât microfilamentul sau microtubulul se alungeşte. La extremitatea negativă (notată cu -), viteza de depolimerizare este mai mare, determinând scurtarea. Pentru o anumită concentraţie de monomeri liberi în citosol, microfilamentul sau microtubulul se află într-o stare de echilibru, în care la extremitatea negativă se pierd molecule, iar la extremitatea pozitivă se ataşează molecule. În acest fel, un grup de molecule ataşate la capătul pozitiv (+), se deplasează de-a lungul filamentului sau microtubulului, de la extremitatea pozitivă spre extremitatea negativă. (Fig.5.2.)

61

În cazul când se protejează capătul negativ (-) şi se împiedică depolimerizarea, se produce creşterea în lungime. Din acest motiv, microtubulii liberi au capătul negativ inserat în centrul celular sau în corpusculii bazali.

Fig.5.2.

Polilerizarea şi depolimerizarea microtubulului.

Dinamismul citosheletului este influenţat foarte mult de cationii bivalenţi. Astfel, modificarea concentraţiei ionilor de calciu ( Ca2+) induce polimerizarea sau depolimerizarea microtubulilor şi reglează interacţiunile dintre actină şi miozină. Ionul de calciu îşi exercită efectele sale prin intermediul unor proteine ce leagă calciul, ca de exemplul calmodulina, o proteină formată din 148 aminoacizi, cu secvenţe de aminoacizi asemănătoare cu troponina C. Calmodulina a fost detectată în toate celulele animale şi vegetale, încât este considerată a fi un receptor intracelular pentru calciu.

De asemenea unele proteine ca profilina,vilina, gelsolina, filamina, alfa-actinina, fibrina, miozina influenţează polimerizarea şi depolimerizarea microfilamentelor de actină. În polimerizarea şi depolimerizarea microtubulilor intervin proteinele tau (τ) şi proteinele asociate microtubulilor.

Un alt factor care modulează dinamismul citoscheletului îl reprezintă nucleotidele. Astfel, adenozin monofosfatul ciclic (AMPc) favorizează polimerizarea citoscheletului şi determină aglomerarea microfilamentelor şi a microtubulilor, modificând forma şi mobilitatea celulelor.

5.2.2.Microfilementele intermediareMicrofilamentele intermediare au fost descrise şi investigate intens după anul 1978. Sunt

denumite astfel, deoarece au diametrul de 10 nm, cuprins între cel al microfilamentelor de actină (6 nm) şi cel al microtubulilor (25 nm).

La microscopul electronic apar sub forma unor filamente rectilinii sau uşor curbate, prezente în endoplasmă, la periferia celulei (în desmozomi sau în prelungiri). Sunt structuri mult mai stabile decât filamentele de actină şi decât microtubulii, încât odată asamblate nu se mai depoliomerizează.

Sunt formate din molecule filiforme de proteine. Polimerizarea lor se face prin alăturarea şi împletirea monomerilor, ca într-o frâghie şi nu prin înşiruirea monomerilor. Rezultă astfel, structuri rezistente, ce pot fi întărite la nevoie şi prin legături covalente între subunităţi. Proteinele ce alcătuiesc filamentele intermediare variază după tipul de celulă în care apar şi după specie. În compoziţia unui filament intermediar pot intra mai multe polipeptide diferite, cu greutăţi moleculare ce variază în limite largi.

În funcţie de proteinele componenete, există următoarele tipuri de filamente intermediare: - filamentele de cheratină sau tonofilamentele, caracteristice pentru celula epitelială, formate din proteine (citokeratine) asemănătoare keratinei din păr şi ongloane; -neurofilamentele, caracteristice neuronului, prin asociere cu microtubulii strucutrează neurofibrilele ce au un diametru de 1-2 µm; - filamentele de vimentină, caracteristice celulelor de origine mezodermică (fibroblaste, condroblaste,

macrofage, celule endoteliale, leiocite, astrocite, celulele Sertoli).(Fig.5.3.)

62

Fig.5.3. TonofilamenteleA-Aspect la microscopul optic; B-Aspect la electronomicroscop:1-Material fibrilar; 2-Material granular.

Aplicaţii medicale. Identificarea tipului de filament intermediar cu ajutorul anticorpilor monoclonali, marcaţi prin fluorescenţă sau cuplaţi cu o enzimă capabilă să coloreze, permite diagnosticarea tumorilor maligne, deoarece: carcinoamele au filamente de cheratină, sarcoamele de vimentină, iar rabdomiosarcoamele de desmină. Glioamele au filamente gliale, iar neuroblastoamele au neurofilamente.

5.2.3.Microtrabeculele.

Microtrabeculele au fost descrise în celule examinate prin microscopie electronică de voltaj supraînalt, la măriri de 300.000 ori. Sunt structuri fibrilare mai subţiri de 4-6 nm, decât microfilamentele.

Microtrabeculele formează o reţea ce străbate întreaga citoplasmă, înterconectând microfilamentele,microtubulii, practic toate componentele subcelulare prezente în celula animală. Pot fi considerate ca fiind expresia fenomenului de gelificare, deşi uneori se contestă realitatea lor biologică, fiind considerate un artefact.

Microtrabeculele menţin poziţia în spaţiul intracelular a citoscheletului şi organitelor,fiind considerate suportul matricii biostructurate. De reţeaua microtrabeculară se leagă enzimele din citosol, asigurându-se trecerea substratului de la o enzimă la alta în mod coordonat. În ochiurile reţelei se găseşte apă şi ioni , încât microtrabeculele protejează celula în cazul fluctuaţilor conţinutului în apă. Atunci când apa pătrunde în celulă, spaţiile se dilată, în timp ce în cazul deshidratării celulei, spaţiile se contractă. Un alt rol al reţelei de microtrabecule constp în mişcarea intracelulară a granulelor de pigment.

5.3.Organitele mişcării celulare

Organitele mişcării celulare sunt: -microfilamentele de actină, microfilamentele de miozină şi microtubulii.

5.3.1.Microfilamentele de actină

Microfilamentele de actină sunt formate din molecule de actină şi au diametrul de 6 nm. La eucariote, actina ocupă 10% din totalul proteinelor din celulele nemusculare.

În citoplasmă, moleculele de actină se pot găsi fie sub formă monomerică ( actină globulară sau actină G), fie sub formă polimerizată, filamentoasă ( actină filamentoasă sau actină F).

Microfilamentele de actină (denumite, pe scurt , filamente) se formează prin polimerizarea actinei globulare. Un filament cuprinde două lanţuri de actină înfăşurate unul în jurul celuilalt, formând dublu helix răsucit spre dreapta având pasul spiralei de 70-80 nm.Fiecare moleculă de actină din microfilament este capabilă să lege câte un cap al moleculei de miozină.

În celulele eucariote, cu excepţia celulelor musculare, microfilementele se pot găsi izolate sau grupate în mănunchuri, dispuse la periferia citoplasmei, imediat sub plasmalemă, formând fibrele de stress în cazul celulelor în culturi sau intând în structura inelelor contractile. Inelul contractil poate fi: - tranzitoriu, când apare în telofaza diviziunii celulare indirecte, producând strangularea citoplasmei şi separarea celulelor fiice; - permanent, ca de exemplu în zona apicală a celulelor epiteliale, unde formează dezmozomul în bandă. Mănunchiuri de filamente de actină există şi în microvili, în stereocili, în prelungirile filiforme temporare ale celulelor din culturi.

În alte tipuri de celule decât cele musculare, microfilamentele de actină îndeplinesc atât un rol structural sau de susţinere, formând suportul prelungirilor (al microvililor, cât şi un rol dinamic în realizarea mişcărilor bazate pe mecanismul actină-miozină.

Există un echilibru dinamic între filamentele de actină şi monomerii de actină din citoplasmă, între polimerizare şi depolimerizarea actinei, echilibru ce joacă un rol esenţial în mişcările celulare. Polimerizarea actinei este însoţită de o creştere a vâscozităţii citoplasmei, iar depolimerizarea se asociază cu scăderea vâscozităţii.Ambele procese joacă un rol principal în trecerea de la starea de gel la cea de sol a citoplasmei.

Polimerizarea actinei este inhibată de unele substanţe (citocalazine) secretate de mucegaiuri, producându-se oprirea mişcării de locomoţie ameboidală.

În celulele musculare, moleculele de actină împreună cu proteinele reglatoare formează miofilamentele subţiri (miofilamentum tenue) din sarcomere. Astfel, pe toată lungimea miofilamentului

63

de actină se găseşte o proteină tropomiozina, pe care se înşiră 7 monomeri de actină. Tropomiozina are atât un rol structural, întărind flilamentul subţire, cât şi un rol funcţional în realizarea contracţiei. Din loc în loc, de-a lungul filamentului de actină se găseşte o altă proteină, troponina, care este un complex de trei polipetide - troponinele T,I şi C.Troponina T este strâns ataşată de tropomiozină, troponina C leagă ionii de calciu, iar troponina I inhibă interacţiunea actină-miozină. Tropomiozina are atât un rol structural, participând la structurarea filamentului subţire, cât şi un rol funcţional mediind reglarea contracţiei. (Fig.5.4).

Filamentele subţiri se găsesc numai în miofibrilele din muşchii scheletici şi muşchiul cardiac unde sunt dispuse ordonat, paralel cu filamentele groase de miozină.

Şi în alte tipuri de celule decât cele musculare au fost evidenţiate proteine reglatoare ale interacţiunii actină-miozină,asemănătoare tropomiozinei, dar acestea sunt mai scurte, permiţând ataşarea a numai 6 monomeri de actină, în loc de 7 cum apare în celulele musculare. În celulele nemusculare, nu a fost bine precizată existenţa troponinelor T şi I, dar au fost identificate proteine reglatoare, asemănăotare troponinei C, carer leagă ionii de calciu şi au fost denumite proteine modulatorii sau calmoduline.

În afara proteinelor reglatoare amintite (tropomiozina,troponinele şi calmodulina), în celule se mai pot găsi şi alte proteine reglatoare ce se leagă de actină, ca: -filamina, prezentă mai abundent în leiocite; -spectrina, ce se găseşte în citoscheletul membranei celulare.

64

Fig.5.4. Organizarea moleculară a filamentului subţire de actină

5.3.2.Microfilamentele de miozină

65

Formate prin polimerizarea proteinelor denumite miozine, miofilamentele de miozină au un diametru de 10 nm. Miozinele se găsesc în cantitate mai mică decât actinele în toate celulele eucariote, cu excepţia celulelor musculare.

Fig.5.5. Moleculele de miozină şi formarea filamentului gros.1-Coadă; 2-Cap; 3-Punte transversală.

Molecula de miozină are aspectul unui bastonaş lung (160 nm/2nm) şi subţire (coada),prevăzut la una din extremităţi cu o regiune globulară (capul). Capul moleculei de miozină(4-5 nm/15-20 nm) este bipartit (iar molecula este bicefală), fiind alcătuit din două subunităţi sau lobi. Polimerizarea se produce prin agregarea cozilor moleculelor de miozină, în timp ce capetele rămân la exterior. În acest fel, mio- filamentul de miozină prezintă o zonă "nudă" (netedă) la mijloc, unde se găsesc cozile şi două zone mai groase la extremităţi în care proemină de jur împrejurul filamentului capetele globulare ale miozinelor.(fig.5.5.)

În alte celule decât cele musculare, filamentele de miozină sunt agregate mici, labile greu observabile,

formate prin polimerizarea a 10-20 molecule. În celulele musculare, polimerizează câteva sute de molecule de miozină (200-500), formând

miofilamente groase (myofilamentum crassum) cu diametrul de 10-20 nm, ce se dispun paralel cu filamentele subţiri de actină.Miofilamentele sunt dispuse într-o reţea hexagonală, la un miofilament gros revenind 6 miofilamente subţiri.

66

Fig.5.6. Reprezentarea schematică a moleculei de miozinăLMM - L meromiozină; HMM - H meromiozină; S1 - Subfragmentul 1; S2 - Subfragmentul 2.

Alcătuirea moleculei de miozină cuprinde două lanţuri polipeptidice grele, fiecare cu greutate de cca. 200 kilodaltoni şi patru lanţuri uşoare cu greutăţi de 15-20 kilodaltoni. Lanţurile grele se întind pe toată lungimea moleculei, în timp ce lanţurile uşoare sunt localizate la capul moleculei de miozină, câte două pentru fiecare lob. Fiecare lanţ greu are două porţiuni: - o porţiune alungită alfa - helicoidală (coada) şi un cap globular. Porţiunile alungite ale lanţurilor grele sunt răsucite în spirală, pe cândcapetele globulare rămân separate. De fiecare cap sau lob se leagă câte o pereche de lanţuri uşoare.

Pentru studierea alcătuirii moleculei de miozină s-a efectuat proteoliza moleculei cu ajutorul tripsinei. Din molecula de miozină se formează două fragmente, denumite meromiozine: - o meromiozină uşoară, L meromiozina (de la light = uşor în engleză) şi o meromiozină grea, H - meromiozina (de la heavy = greu).

L meromiozina (LMM) are aspectul unui bastonaş cu lungimea de 80 nm şi grosimea de 2 nm, este lipsită de activitate ATP-azică şi nu interacţionează cu actina.

H meromiozina (HMM) are o porţiune lineară de 60 nm, care se termină cu o porţiune globulară de 20/5 nm. Sub acţiunea papainei, HMM poate fi scindată în două subunităţi, subfragmentul 1 şi subfragmentul 2.

Subfragmentul 1(S -1) are o greutate de 120 KD şi corespunde porţiunii globulare a H meromiozinei, prezintă activitate ATP-azică şi poate interacţiona cu actina.

Subfragmentul 2 (S - 2) are o greutate mileculară de 60 KD, îi lipseşte activitatea ATP-azică şi capacitaea de a interacţiona cu actina.

În întregul ei, porţiunea liniară a moleculei de miozină este formată din L meromiozină şi subfragmentul 2 al H meromiozinei, iar capul moleculei de miozină este reprezentat de subfragmentul 1 al H meromiozinei.

5.3.2.1.Funcţiile microfilamentelor de actină şi miozină.

Microfilamentele de actină şi miozină sunt implicate atât în mişcările celulare de locomoţie (deplasarea fibroblastelor în culturi, mişcarea ameboidală prin emiterea de pseudopode, mişcările morfogenetice din embrion), cât şi în mişcările intracitoplasmatice (migrarea granulelor de secreţie, a

67

granulelor pigmentare, deplasarea organitelor celulare, mobilitatea microvililor). Participarea microfilamentelor în aceste fenomene celulare este influenţată de concentraţia în citosol a ionilor de calciu, a moleculeor de ATP şi de AMP-ciclic, de ph, etc.

În celulele musculare, actina şi miozina intră în alcătuirea unor ultrastructuri stabile, denumite microfilamente sau miofilamente (myofilamentum) de actină şi de miozină. Miofilamentele se dispun ordonat, în sensul lungimii, paralele între ele şi formează miofibrilele, cu un diametru de 1-2 µm. Un miofilament de actină este alcătuit din 600 molecule de actină, în timp ce un miofilament de miozină conţine numai 200 molecule de miozină.

Cea mai precisă organizare şi dispunerea a moleculeor de actină şi miozină se întâlneşte în miofilamentele şi miofibrilele muşchiului striat (scheletic şi cardiac), care sunt orientate paralel cu axul mare al fibrei musculare. (Fig.5.7.) În rabdocit (fibra musculară scheletică) există cca. 1000 miofibrile ,dispuse în pachete longitudinale (colonete Leydig), ce apar pe secţiune transversală sub forma unor grupări de 30-50 miofibrile ( câmpurile Cohnheim).

La microscopul optic, miofibrilele apar striate,prezentând o succesiune alternantă de benzi sau discuri. O bandă A (stria A), denumită şi disc întunecat, de 1,5 nm, anizotropă (discus anizotropicus) în lumină polarizată, întunecată în contrast de fază, mai intens colorabilă, alternează cu o bandă clară (stria I) de 0.8 nm, izotropă (discus isotropicus) în lumină polarizată, clară în contrast de fază, mai slab colorabilă.

Fig.5.7.Organizarea dispozitivului contractil în fibra musculară striată

Discul întunecat (banda A) este transversat prin mijlocul lui de zonă clară (zona lucida s. stria H) care este străbătută de o linie întunecată, numită linia M (linea M) sau mesofragmă (mesophragma).

68

Discul clar (banda I) este şi el traversat de o linie intunecată, denumită linia Z (linea Z), telofragmă (telophragma) sau stria AMICI, ce se prelungeşte transversal, de o parte şi de alta, în toate miofibrilele dintr-un rabdocit. În unele fibre musculare mai intens solicitate, discurile clare (I) pot fi traversate, în plus, şi de o fina linie accesorie, linia N.

Între două telofragme (strii Amici sau linii Z) sucesive se delimitează un sarcomer sau un miomer (myomerrum), care reprezintă unitatea fundamentală de structură şi funcţie a miofibrilei. Un sarcomer are o lungime de 2,5 µm şi cuprinde un disc întunecat ( o bandă A) şi cele două jumătăţi de benzi clare (I) adiacente. Într-o mifobrilă se găsesc câteva zeci de mii de sarcomere aşezate cap la cap. De exemplu, într-un rabdocit cu lungimea de 5 cm sunt 20.000 de sarcomere, încât 20.000 x 2,5 µm = 50.000 = 5 cm.

Fig.5.8. Organizarea ultrastructurilor din banda M

a.Secţiune transversalăb. Reprezentare tridimensionala, FG-filament gros de miozină;FM-filamente M ale

citoscheletului endosarcometric enodsarcomeric; PM-punţi M

Ultrastructura sarcomerului a fost investigată prin studii de microscopie electronică încă din anul 1953, reprezentând primele aplicaţii ale electronomicroscopiei în biologie. S-a constatat că filamentele groase, de miozină (cu diametrul de 15 nm şi lungimea de 1,6 nm) sunt dispuse în mijlocul sarcomerului în zona ocupată de discul întunecat ( banda A) în timp ce la nivelul discului clar (banda I) se găsesc numai filamente subţiri, de actină (cu diametrul de 6 nm şi lungimea de 1nm), care pornesc de o parte şi de alta a benzii Z şi pătrund în discul întunecat (A) până în apropierea zonei H, în care se găsesc numai filamente groase. În restul discului întunecat (A) se produce o interdigitare a filamentelor groase şi subţiri, încât pe o secţiune transversală la acest nivel, ficare filament gros are în jurul său 6 filamente subţiri, realizându-se un model hexagonal. (Fig.5.8.)

Pe suprafaţa filamentelor groase proemină capetele moleculelor de miozină sub forma unor punţi transversale. Pe imaginile electronomicroscopice, punţile transversale apar ca proeminenţe laterale, perpendiculare pe axa filamentelor groase, extinse spre filamentele subţiri pe care tind să le atingă. S-au numărat 200-220 punţi transversale pentru un filament gros, dispuse regulat urmând un traiect spiralat de-a lungul filamentului. Punţile transversale conţin HMM (H meromiozină) ce are activitate ATP-azică şi interacţionează cu actina.(Fig.5.9)

Fig.5.9. Dispunerea punţilor transversale la nivelul filamentului

69

5.3.2.2. Mişcări celulare bazate pe sistemul actină-miozină

Pe baza sistemului molecular actină-miozină se realizaeză mai multe categorii de mişcări celulare: -mişcările din timpul contracţiei musculare; -mişcarea de locomoţie ameboidală; - mişcările din microvili; şi curenţii citoplasmatici.

Interacţiunile actină-miozină se desfăşoară după acelaşi mecanism molecular atât în celulele musculare, cât şi în cele nemusculare: Ele se stabilesc între filamentele subţiri de actină şi capete globulare ale moleculelor de miozină din punţile tranversale. Mişcarea se produce prin alunecarea filamentelor de actină şi miozină, unul peste altul. Pentru aceasta se desface puntea dintre miozină şi actină şi se restabileşte puntea cu monomerul următor din filamentul de actină, antrenând deplasarea filamentului. Energia necesară este furnizată de hidroliza ATP-ului, iar deplasarea se face după mecaniosmul "roţii cu clicheţi" de la ceasornicele mecanice.Relaxarea se produce prin desfacerea simultană a tuturor punţilor dintre filamentele de actină şi miozină, ceea ce permite glisarea filamentelor.(fig.5.10).

Fig.5.10. Schema modului de acţiune a punţilor transversale.a-În relaxare; b-La începutul contracţiei; c-detaşarea de filamentul de actină; d-Reataşarea pe monomerul următor de actină;1,2,3,4,5,6,7-Monomeri de actină.

5.3.2.2.1. Contracţia fibrelor musculare striate

Contracţia musculară reprezintă forma cea mai perfecţionată de mişcare bazată pe sistemul actină-miozină. Se produce prin alunecarea (glisarea) filamentelor de actină printre cele de miozină, fără a se modifica lungimile lor. Mecanismul glisării a fost propus de HUXLEY în 1954 şi apoi demonstrat experimental. Ca rezultat al glisării se scurtează lungimea sarcomerului, iar prin însumarea scurtării tuturor sarcomerelor se ajunge la scurtarea fibrei musculare în întregul ei. De exemplu, o scurtare a sarcomerului de la 2,5 la 2 µm (deci cu 20%), însumată pentru 20.000de sarcomere produce o scurtare de la 5 cm la 4 cm. În timpul contracţiei, discul întunecat (banda A) nu se modifică, scurtându-se doar discul clar (banda I) (fig.5.11.)

70

Fig.5.11. Aspectul sarcomerului

a-în muşchiul contractat; b- în muşchiul relaxat; c-în muşchiul întins.

Glisarea se datorează faptului că fiecare cap al moleculelor de miozină "păşeşte" în lungul filamentului de actină, de pe un monomer pe următorul "trăgând" filamentul de actină pas cu pas.

Contracţia muşchiului scheletic se declanşează în momentul în care excitarea nervului motor al muşchiului determină apariţia unui potenţial de acţiune în sarcolemă ( plasmalema fibrei musculare striate), la nivelul joncţiunii neuromusculare. Semnalul electric se transmite rapid în jurul fiecărei miofibrile prin tubii transverşi (T) ce se întind de la sarcolemă la miofibrilă. În acest fel, semnalul electric ajunge la reticulul sarcoplamic ( o formă specifică a reticulului endoplasmic în fibra musculară), producând eliberarea din cisternele reticulului în citosol, a unei cantităţi mari de ioni de calciu ( Ca2+), ce se află stocaţi în lumenul cisternelor. Creşterea bruscă a concentraţiei de ioni de calciu declanşează contracţia miofibrilei, datorită efectului pe care Ca2+ îl produc asupra troponinei şi tropomiozinei, proteine asociate cu actina în filamentul subţire. În repaus, tropomiozina se interpune între actină şi capul miozinei, blocând interacţiunea dintre ele. Troponina C leagă ionul de calciu şi prin aceasta modifică poziţia tropomiozinei, făcând posibilă interacţiunea actinei cu miozina. (Fig.5.12).

Fig.5.12. Relaţiile actină- miozină- tropomiozinăa - în repaus; b- în activitate;1- miozina; 2- actina; 3 – tropomiozina

71

În momentul în care capul miozinei atinge actina este eliberat ADP şi gruparea fostfat, ceia ce determină o flexare a capului miozinei care trage de filamentul de actină, rezultând glisarea filamentului şi contracţia musculară. După acest moment, de capul miozinei se leagă o moleculă de ATP, producându-se desprinderea miozinei de actină.Miozina hidrolizează ATP-ul în ADP şi gruparea fosfat, iar capul miozinei îşi recapătă conformaţia iniţială, după capul se repetă.

Mişcările de "păşire" a capetelor de miozină (din filamentele groase) în lungul filamentelor subţiri (de actină) sunt efectuate de către fiecare moleculă şi de către fiecare lob al capului. În acest fel, într-un muşchi în contracţie, la un moment dat există capete ale moleculelor de miozină care sunt ataşate de actină, iar altele sunt detaşate. Într-o contracţie rapidă, fiecare din cele 500 capete de miozină ale unui filament gros parcurge ciclul de 5 ori într-o secundă.

După terminarea contracţiei, ionii de calciu sunt recaptaţi în cisternele reticulului sarcoplasmic printr-o enzimă (Ca2+ - ATP - ază), ceea ce produce relaxarea muşchiului.

Pe lângă actină şi miozină, în miofibrile se mai găsesc proteine accesorii cu rolstructural. Astfel, în stria Z, se găsesc proteine (α-actina şi desmina) ce ancorează filamentele de actină şi aliniază miofibrilele adiacente, asigurând contracţia sincronizată a miofibrilelor. Alte proteine accesorii îndeplinesc un rol funcţional mediind efectul pe care Ca2+ îl are în contracţia musculară.

În muşchiul cardiac, filamentele de actină şi miozină prezintă o dispunere asemănătoare cu din muşchiul scheletic, fiind evidente striaţiile.

Muşchiul neted este lipsit de striaţii, iar filamentele de miozină şi de actină nu formează miofibrile, nefiind dispuse strict ordonat ca în muşchii striaţi, deşi, în general, sunt orintate paralel cu axul lung al celulei. Miozina din celulele musculare netede (leiocite) se deosebeşte de cea din fibrele musculare striate (rabdocite) prin două caractere: 1-activitatea ATP-azică este de zece ori mai mică, fiind mult mai direct legată de ionii de calciu; 2- în leiocite, miozina poate interacţiona cu actina numai dacă lanţuriile uşoare sunt fosforilate.

Fig.5.14. Diagrama activării kinazei1-Calmodulina; 2-Ioni de calciu; 3-Complexul Ca2+ - calmodulină; 4- Kinază inactivă; 5-Kinază activată.

Fosforilarea şi defosforilarea lanţurilor uşoare ale miozinei din leiocit sunt efectuate de enzime specifice. Astfel. enzima de fosforilare se numeşte kinaza lanţurilor uşoare şi este activată de complexul Ca2+- calmodulină. Kinaza activată fosforilează lanţurile uşoare din molecula de miozină, permiţând interacţiunea cu actina. (Fig.5.14.)

Kinaza miozinei poate fi activată de influxul de Ca2+, rezultat în urma excitării sistemului neurovegetativ, dar şi prin AMP-ul cicclic al cărui nivel în celulă este legat de hormoni. În acest fel contracţia muşchiului neted poate fi produsă prin acţiune nervoasă sau hormonală. Contracţia muşchiului neted este mai lentă deoarece şi activarea miozinei prin sistemul calmodulinei este lentă. În muşchiul striat, unde se realizează o contracţie rapidă este prezentă o formă specializată a calmodulinei, troponina C.

În toate celulele nemusculare, miozina se aseamănă cu cea din muşchiul neted prin faptul că activarea ei (dobândirea capacităţii de a se lega de actină) depinde de fosforilarea lanţurilor uşoare. care la rândul ei este stimulată de complexul Ca2+-calmodulină.Fosforilarea induce asamblarea miozinei în agregate mici bipolare, formate din 10-20 molecule de miozină, legate prin cozile lor. Aceste agregate pot produce deplasarea filamentelor de actină prin mecanismul interacţiunii actină-miozină. Contracţia complexului acto-miozinic produce trecerea citoplasmei în starea de gel, iar relaxarea determină trecerea în stare fluidă, cum se întâmplă în mişcarea ameboidală şi în motilitatea microvililor. (Fig.5.15.)

72

Fig.5.15. Agregarea miozinei în celulele nemusculare.1-Molecule de miozină; 2-Agregate moleculare.

Alte mişcări bazate pe sistemul actină-miozină sunt mişcarea ameboidală, mişcările din

microvili şi curenţii citoplasmatici.

5.3.2.2.2. Mişcarea de locomoţie ameboidală

Mişcarea de locomoţie ameboidală prezintă o importanţă deosebită pentru organisme, deoarece prin acest mecanism leucocitele ies din vasele sanguine şi se deplasează la locul infecţiilor, iar fibroblastele se deplasează pe suprafaţa rănilor depunând colagen, cu rol în formarea cicatricei.

73

Fig.5.16.Mişcarea ameboidală a fibroblastelor.1-Nucleu; 2-Coadă; 3-Ondulaţii de suprafaţă; 4-Microvârfuri; 5-Lamelipode;

6-Plăci de adeziune; 7,8-Extensie; 9-Adeziune; 10-Contracţie.

În cazul animalelor domestice, emiterea de pseudopode mici se întâlneşte la deplasarea leucocitelor, care se face lent. Fibroblastul emite pe direcţia mişcării prelungiri lăţite, lamelipode, care formează o muchie de înaintare. Procesul de emitere a acestor prelungiri este continuu, unele prelungiri aderând la substrat prin una din feţele lor cu plăci de adeziune, în timp ce alte prelungiri, desprinse de pe faţa opusă, se reîntorc spre corpul celulei, formând ondulaţii de suprafaţă. Pe măsură ce are loc înaintarea celulei, rămâne o coadă în interiorul căreia se găsesc fibre de retracţie, iar din această coadă se desprind fragmente pe care celula le lasă în urmă. La mişcarea fibroblastelor se produc treceri succesive şi reversibile ale citoplasmei din starea de gel în cea de sol, ajungându-se la o viteză de 40 nm/oră.

Mişcarea ameboidală nu se face la întâmplare, fibroblastele manifestând o preferinţă pentru suprafeţele pe care pot adera. Este posibil ca prelungirile subţiri, ţepii observaţi pe lamelipode să acţioneze ca nişte antene de exploatare a suprafeţei. Forma suprafeţei influenţează mişcarea ameboidală, fibroblastele migrând pe direcţia curburii minime ( în sensul lungimii cilindrului de sticlă). (Fig.5.16)

Emiterea pseudopodelor şi deplasarea celulei se face spre un stimul chimic, fenomen cunoscut sub denumirea de chemotactism.S-a dovedit că leucocitele sunt atrase de molecule "atractante" eliberate în focarul inflamator. Aceste molecule produc metilarea unor grupări carboxil din proteinele din membrană. Dacă metilarea este blocată, chemotactismul este inhibat.

5.3.2.2.3. Mişcările din microvili

În alcătuirea unui microvil (microvillus) există filamente de actină (cca.40), dispuse longitudinal şi paralele între ele, având toate aceeaşi polaritate. O extremitate a filamentelor ajunge al vârful microvilului, într-o regiune amorfă, cu o compoziţie chimică insuficient precizată, ce ancorează filamentele de membrană. Extremitatea opusă ajunge la polul bazal al microvilului, terminându-se într-o reţea perpendiculară de filamente de actină, denumită buton terminal, ce conţine şi miozină, având rolul de a menţine în poziţie microvilul. Mănunchiul de filamente din microvil este legat, din loc în loc, între ele şi cu plasmalema prin fimbrină, ce realizează o "scară " în spirală în lungul microvilului. (Fig.5.16.)

74

Fig.5.16.Diagrama ultrastructurii microvililor

Polaritatea filamentelor de actină din microvil este similară cu a filamentelor subţiri din sarcomer, producând scurtarea ritmică a microvililor şi împingerea substanţelor absorbite spre interiorul celulei. (Fig.5.18.)

Fig.5.19.Polaritatea filamentelor de actină A - în microvil

B în sarcomer

5.3.2.2.4. Curenţii citoplasmatici

Curenţii citoplasmatici sunt mişcări ce realizează o deplasare a organitelor şi componenetelor în interiorul celulei. Se manifestă sub formă de: 1 - scurgere a citoplasmei fluidifiate în prelungirile celulere în timpul mişcării ameboidale; 2 - mişcare saltatorie a

organitelor, în care pe filamentele de actină situate la periferia celulei se deplasează filamente de miozină pe care sunt ancorate organite celulare; 3 -cicloza, o mişcare în jurul nucleului, vizibilă în celule vegetale sau în algele verzi unicelulare.

Curenţii citoplasmatici sunt caracteristici celulelor eucariote vii, dispărând odată cu moartea acestora. Transportul axoplasmatic din neuroni reprezintă o formă specializată de curenţi citoplasmatici în care intervin microtubulii.

5.3.3. Microtubulii şi mişcările bazate pe sistemulmicrotubul - dineină

5.3.3.1. Microtubulii

75

Microtubulii (microtubulus, i) sunt formaţiuni rectiliniii cu lungimi variabile (până la câţiva micrometri) şi cu un diametru mediu de 25 nm. Pot apare grupaţi sau singulari în citoplasmă. Peretele microtubulului este format din 13 şiruri lineare, drepte sau spiralate, formate din molecule proteice globulare, cu diametru de 5nm, cu o greutate moleculară de 50-60 Kdal., denumite tubuline.

Tubulinele polimerizează rezultând dimeri de tubulină, alcătuiţi dintr-o alfa-tubulină şi o beta-tubulină, legate prin interacţiuni necovalente şi dispuse alternant în peretele microtubulului.

În peretele microtubulilor, dimerii de tubuline formează protofilamente sau protofibrile (protofibrila) cu diametrul de 5 nm. În protofibrile, dimerii formează se dispun în aşa fel, încât alfa-tubulina de la un dimer de leagă de beta-tubulina de la de la dimerul din rândul vecin. Protofibrilele, în număr de 13 se dispun sub forma unui cilindru, structurând un microtubul cu diametrul de 25 nm constant în toate cazurile.Energia necesară asamblării microtubulilor este furnizată de moleculele de guanizin-trifosfat (G.T.P.) şi nu de cele de A.T.P.

Microtubulii prezintă polaritate, adaugarea de dimeri, având lo intensitate mai mare la capătul pozitiv, producându-se creşterea, în în timp ce la capătul opus (negativ) predomină pierdera de dimeri, având loc scurtarea. Există un echilibru dinamic între microtubuli şi dimerii de tubulină din citosol. Polimerizarea se petrece spontan la temperatura de 370 C, în timp ce depolimerizarea are loc la 00 . Cationii bivalenţi de calciu şi magneziu în concentraţie mică (micromolară) sunt necesari pentru polimerizare, care este mult accelerată în prezenţa proteinelor asociate microtubulilor (MPAs), care pot fi: - proteine cu greutate moleculară mare (HMW = Hight Molecular Weight ) şi proteine tau (τ). De asemenea, calmodulina controlează procesul de asamblare - dezasamblare, iar colchicina, un alcaloid blochează polimerizarea tubulinelor, prin legarea unei molecule de colchicină de un dimer de tubulină. Pe această proprietate se bazează folosirea colchicinei la blocarea metafazelor în culturile de celule, pentru studierea cromozomilor. Unele medicamente,folosite ca citostatice (vinblastina, vincristina) distrug fusul de diviziune şi oară celulelele maligne, care se divid intens.

Fig.5.20.Formarea protofibrilelor din dimeri de tubulină şi asamblarea unui microtubul

A.Secţiune transversală prin microtubul 1-Alfa-tubulină; 2-Beta-tubulină; 3-Dimer; 4-Asamblare;

5- Blocarea asamblării prin colchicină; 6-Protofibrilă; 7-Dezasamblare.În celulă, microtubulii îndeplinesc atât un rol structural, cât şi un rol dinamic.Rolul strucutural constă în: 1- menţinerea formei celulelor şi a prelungirilor sale (axon,dentrite,

cili, flageli); 2-determinarea şi păstrarea dispunerii spaţiale a organitelor; 3- organizarea citosheletului, determinând distribuţia filamentelor intermediare în celulă; 4- dispunerea filamentelor de actină, ce structurează inelul contractil, între cei doi poli ai celulei; 5- formarea unor "schele temporare" pe care celula să-şi dispună unele componente, ca de exemplu în cursul spermatogenezei, când microtubulii formează o "schelă" în spirală pe care se sprijină mitocondriile.

Rolul dinamic constă în: 1- participă la realizarea mişcărilor celulare ce au la bază mecanismul microtubul-dineină, precum mişcarea cililor şi flagelilor; 2- asigură o serie de mişcări intracitoplasmatice, precum mişcarea granulelor de melanină în melanocite; 4- asigură transportul

76

unor molecule şi substanţe; 5- realizează transportul axonal rapid (200 nm/ 24 ore) şi lent (24 nm/ 24ore); 5- participă la eliberarea proteinelor şi lipoproteinelor sintetizate în hepatocite.În citoplasmă, microtubulii sunt prezenţi în alcătuirea unor structuri stabile, cum sunt centriolii, fusul de diviziune, cilii şi flagelii.

5.3.3.2. Centriolii

Centriolul (centriolum) este o structură microtubulară stabilă ce intră în componenţa centrului celular ( cytocentrum).

În majoritatea celulelor, centrul celular este situat juxta nuclear, în apropierea complexullui Golgi şi conţine unul sau doi centrioli, ce sunt înconjuraţi de o zonă citoplamatică clară, denumită material pericentriolar.

Centrul celular lipseşte în celulele înalt specializate (eritrocit, rabdocit, neuron), iar când este prezent coordonează mobilitatea celulară în timpul diviziunii. (Fig.5.20.)

Fig.5.21.Aspectul centrului celular la microscopul optic A- În intercineză; B- În timpul diviziunii.

La microscopul electronic, fiecare centriol apare ca o structură cilindrică (în lungimre de 0,5 µm şi cu diametrul de 0,11 µm), dispusă perpendicular pe congenerul său. Fiecare centriol este format din 9 triplete (triplomicrotubulus) de microtubuli, notaţi de la interior spre exterior cu A,B,C şi îmbrăcaţi într-o masă de substanţă densă. Centrul cilindrului este lipsit de microtubuli, realizându-se o structură de tipul "9+0", diferită de structura axonemei cililor şi flagelului, care este de tipul "9+2".(Fig.5.22)

77

Fig.5.22.Ultrastructura centriolilor1-Tripletă de microtubuli

Centrul celular (sau centrozomul ) joacă rolul de organizator al microtubulilor, datorită faptului că materialul pericentriolar format din proteine şi ARN, determină polimerizarea tubulinelor şi asamblarea microtubulilor, care au capătul negativ ( - ) în materialul pericentriolar din centrazom, în timp ce capătul pozitiv ( + ) dispus distal prezintă o creştere intensă.

Datorită funcţiei sale de organizator temporar, spaţial şi vectorial al microtubulilor, centrul celular este implicat în toate procesele în care aceştia apar ca organizatori ai citoscheletului. Centrul celular intervine şi în direcţionarea mişcărilor de locomoţie ameboidală ( a fibroblastelor şi leucocitelor), situându-se înaintea nucleului pe direcţia mişcarii celulelor.Tot odată, centrul celular participă şi definirea polarităţii celulei, dispunându-se ca şi complexul Golgi, apical faţă de nucleu în celulele epiteliale.

5.3.3.3. Fusul de diviziuneFusul de diviziune (fusus mitoticus) este o structură intra celulară, formată din microtubuli

(microtubuli fusalis) ce realizează o legătură între centriolii care se despart şi migrază la cei doi poli ai celulei, în timpul diviziunii celulare.

În interfază, centrozomul este situat în vecinătatea nucleului şi din el pleacă microtubuli în toată citoplasma. În timpul fazei "S" a ciclului celular începe dublarea centrului celular prin separarea centriolilor, în vecinătatea fiecăruia din centriolii vechi producându-se asamblarea unui centriol, nou perpendicular pe cel vechi. Concomitent cu deplasarea spre polii celulei a centrilor celulari, microtubulii formează filamente ce se dispun sub forma unui fus de diviziune.Fiecare filament este alcătuit din circa 100 microtubuli şi proteinele asociate lor.Între microtubuli din fus şi moleculele de tubulină din citosol se stabileşte un echilibru dinamic.(Fig.5.22)

Fig.5.22.Participarea microtubulilor la formarea fusului de diviziune3-Centrioli; 2-Microtubuli;3-Fibrele fusului de diviziune; 4-Cromozomi.

78

5.3.3.4. Cilii şi flagelulCilii (cilium,a) şi flagelul (flagellum) sunt expansiuni celulare permanente, formate din

citoplasmă şi membrană celulară, dispuse la polul apical al celulei.În structura lor, microtubulii sunt prezenţi, în axul citoplasmatic ciliar, denumit axonemă

(axonema), fiind dispuşi ordonat, paraleli între ei şi cu axul longiutudinal al formaţiunii. La baza fiecărei axoneme se află câte un corpuscul bazal (corpusculum basale), ce are organizarea unui centriol.

Cilii pot fi vibratili ( sau kinetocili) şi nevibratili (sau stereocili).La cilii vibratili (din mucoasa traheală, nasală), axonema este formată din doi microtubuli

axiali, înconjuraţi, la periferie de nouă dublete de microtubuli. Fiecare dublet cuprinde un microtubul complet sau subfibra A, formată din 13 protofilamente şi un microtubul incomplet sau subfibra B, formată din 10 sau 11protofilamente. Tubulinele alfa (α) şi beta (β) ce formează subfibra A sunt diferite de tubulinele omoloage din subfibra B.

Fig.5.24. Ultrastructura cililor

De la fiecare subfibră A pornesc înspre subfibra B din dubletul vecin două braţe simetrice în formă de cleşte formate din molecule de dineină, care este o protein-enzimă bogată în ATP-ază. Braţele de dineină sunt dispuse în lungul microtubulului la intervale regulate de 24 nm. La intervale mai mari de 24 nm există, din loc în loc, la o distanţă de 86,5 nm legături elastice, formate dintr-o altă proteină, denumită nexină.

De la subfibra A pleacă spre centrul axonemei câte un braţ de legătură (sau spiţă), ce se termină printr-o porţiune globulară, în vecinătatea tecii interne ce înconjoară cei doi microtubuli centrali.(Fig.5.25).

Flagelul (flagellum), de obicei, unul singur pentru fiecare celulă (expl. la spermatozoid) prezintă o structură asemănătoare cu a cilului, dar mai complexă. Axonema sa este structurată după tipul "9+2", prezentând în jurul său o coroană de mitocondrii ce a asigură ATP-ul necesar mişcării.

Cilii nevibratili sau stereocilii ( de exempl. cei din epididim şi din urechea internă) au aceiaşi structură ca şi cilii mobili, cu deosebirea că lipsesc cei doi microtubuli centrali din axonemă.

Mişcările celulare ce au la bază sistemul microtubul-dineină sunt pe deoparte mişcările caracteristice cililor şi flagelilor, iar pe de altă parte sunt mişcările cromozomilor din cursul diviziunii celulare.

79

Fig.5.25.Secţiune transversală prin axonema unui cilA - Subfibra A.; B - Subfibra B.

a-Braţe de dineină; b-Legături de nexină; c-Spiţă; d-Teaca internă; e-Microtubuli centrali; f-Tija cilului; g-Rădăcina cilului.

Mişcarea cililor şi flagelilor se realizează prin alunecarea unui dublet periferic în raport cu dubletul vecin lui.Alunecarea depinde de legarea ciclică a dineinei subfibrei A dintr-un dublet de subfibra B a dubletului vecin, încât braţele de dineină "păşesc " de-a lungul dubletelor, producând energia necesară bătăilor cilului sau a flagelului.Se realizează astfel glisarea dubletelor unul peste altulşi încovăierea cilului şi flagelului.

Dineina prezintă o funcţie similară cu a miozinei, prezentând activitate ATP-azică, încât prin scindarea ATP-ului furnizează energia necesară mişcării. ATP-ul provine din glicoliză şi difuzează prin citoplasmă în axonema cililor, pe când, în flageli, ATP-ul este generat de mitocondriile ce înconjoară axonema.

Legăturile radiare (spiţele) dintre teaca internă şi dubletele periferice, precum şi teaca internă au rolul de a controla activitatea braţelor de dineină, încât să se producă o undă coerentă de mişcări de la bază spre vârf. Astfel cilii au mişcări ciclice în doi timpi (bătaie - revenire), ce durează 0,1-0,2 secunde, în timp ce flagelul are o mişcare ondulatorie sinusoidală sau elicoidală.(Fig.5.26).

80

Fig.5.26. Schema mişcării flagelului (A) şi a cililor. a-Bătaie; b-Revenire

În condiţii patologice, pot apărea tulburări funcţionale ale cililor datorită unor anomalii localizate fie la nivelul corpuisculului bazal (centriol incomplet), fie la nivelul axonemei (complexe tubulare supranumerare, sau cu aranjament dezorganizat) ,fie în părţi componente ale cilului.

De asemenea, absenţa dineinei produce sindromul cililor imobili (o boală genetică), care se caracterizează prin infecţii respiratorii cronice (datorită incapacităţii cililor de a curăţii căile respiratorii sau prin sterilitate (spermatozoizii fiind imobili).

5.4.Mitocondriile - organite generatoare de energie

Mitocondriile (mitochondrion gr.= filament,granulă) sunt organite specializate în producerea de energie necesară activităţii celulelor eucariote, comportându-se ca nişte “centrale energetice”, in care energia este eliberată prin oxidarea unor substrate şi transformată în energie chimică (ATP) prin procesul de fosforilare oxidativă. Sunt “fabricile” de energie ale celulei.

Mitocondriile sunt prezente în toate tipurile de celule cu excepţia eritrocitului adult, în care lipsesc. Au fost observate la microscopul optic în a II-a jumătate a secolului XIX de către ALTMAN-1890, prin coloraţie cu verde Janus şi de BENDA-1897, care afolosit coloraţia cu hematoxilină ferică Regaud.

Enzimele marker pentru mitocondrii sunt: monoaminoxidaza, citrocromoxidaza şi enzimele ciclului Krebs.

Numărul mitocondriilor diferă de la o celulă la alta în funcţie de intensitatea activităţii acestora, fiind mai mare în celulele mai active. Astfel, în hepatocite există 1000-3000 de mitocondrii în citosol, în nefrocite-300, în spematozoizi 20-24, în timp ce în eritrocite lipsesc.Numărul mitocondriilor este mai redus în celulele cu activitate metabolică redusă.

Poziţia mitocondriilor în celulă este diferită.Ele pot fi răspâdite, reletiv uniform, în întreaga citoplasmă ( de expl. în hepatocit) sau localizate în celulă, în locurile unde ATP-ul este necesar în cantitate mai mare. Astfel: - în muşchiul scheletic, mitocondriile sunt dispuse între miofibrile; -în spermatozoid, sunt aranjate helicoidal în jurul axonemei flagelului; - în neuroni, în regiunea sinaptică; - în panceasul endocrin, mitocondriile sunt alăturate reticulului endoplasmic rugos, generând ATP-ul necesar biosintezei proteinelor. Mitocondriile se concentrează la polii activi ai celulelor polarizate funcţional: - la polul bazal, în nefrocite; - la polul apical, în enterocite;- perinuclear, în momentele de intensă activitate de sinteză, după care se răspâdesc în citoplasmă. Mitocondriile îşi schimbă mereu poziţia, putându-se alătura temporar unor organite aflate în intensă activitate, în special reticulului endoplasmic.

5.4.1.Morfologie,structură şi ultrastructură Dimensiunile mitocondriilor sunt variabile de la o celulă la alta, ajungând până la 7 µm

lungime şi 0,5 µm grosime. În general, cu cât o celulă este mai activă, cu atât mitocondriile sunt mai mari. În celule aflate în repaus, dimesiunile sunt mai mici.

La microscopul optic, mitocondria se poate prezenta sub trei aspecte:-granule ( granulum mitochondriale),mitocondrii individualizate , diseminate în citoplasmă; -granule înşirate ca nişte mărgele pe aţă (condriomite)şi filamente (filamentum mitochondriale) sau virgule (condrioconţi ) (Fig.5.27).

81

Fig.5.27. MitocondriileA. Aspecte la microscopul optic: 1-Condrioconte; 2-Bastonaşe Heidenhein;3-Mitocondrii; 4-Condriomite; 5-Condrioconţi, localizaţi bipolar.B.Aspecte la microscopul electronic: 6-Organizarea spaţială a mitocondriei; 7-Ultrastructura membranelor; 8-Aspecte ale cristelor; 9-Ultrastructura cristelor; 10-Secţiune transversală printr-o cristă.

Ultrastructura mitocondriilor a fost elucidată de PALADE şi SJÖSTRAND-1952, pe secţiuni de ficat examinate electronomicroscopic. În ultrastructura mitocondriei intră două membrane (membrana mitochondrialis), cu grosimea de 6 nm fiecare, ce delimitează două compartimente.Membrana externă (membrana mitochondrialis externa) este netedă, în timp ce membrana internă (membrana mitocondrialis interna) deşi urmăreşte conturul celei externe prezintă din loc în loc pliuri sau invaginări denumite criste (latinescul crista= creastă) mitocondriale cu grosimea de 25 nm, de forme variate. Numărul, dispoziţia şi dimensiunea cristelor variază în raport cu tipul activităţii metabolice şi necesităţile energetice ale celulei. Numărul cristelor este mai mare atunci când activitatea celulelor este mai intensă. Cristele mitocondriale au forme variate, putând apărea

lamelate sau septate (sub formă de foiţe sau septe) şi tubulare ( t ubulus),sub formă de cilindri sau veziculare (vesicula). Cristele pot fi

orientate perpendicular sau paralel cu axul longitudinal al mitocondriei. Ele pot fi rectilinii,ramificate sau încrucişate în reţea, compartimentând matricea mitocondriei. (Fig.5.28).

Fig.5.28.Ultrastructura mitocondriei1-Cristă; 2-ADN-mitocondrial;3-F1-ATP-ază; 4-Membrana externă; 5-Membrana internă;6-Spaţiul intermembranar; 7-Ribozomi; 8-Incluziuni; 9-Matrice; 10-Particulă elementară(F1): a-piesa bazală,b-piesa intermediară,c-piesa superioară.

82

Între cele două membrane (externă şi internă) se delimitează un compartiment extern (spatium intermembranosum) de 7-8nm. Membrana internă delimitează un compartiment intern sau matricea mitocondrială (matrix mitochondrialis). La nivelul membranei interne, prin tehnici adecvate (coloraţie negativă cu acid fosfotungtic, pentru a obţine un contrast mai mare la microscopul electronic) s-au evidenţiat subunităţi de membrană sau particule elementare (particule F1) (particula elementaria s. spherula s.sphaerula membrane).

O particulă elementară apare ca o proeminenţă de 10 nm, formată din trei piese: bazală, intermediară şi superioară. Particulele elementare conţin o enzimă, F1 - ATP-ază, ce face parte din complexul enzimatic ce participă la sinteza ATP-ului.(Fig.5.29)

Membrana mitocondrială internă este mai puţin permeabilă decât membrana mitocondrială externă, comportându-se ca unfel de barieră între matricea mitocondrială şi restul mitocondriei. Prin ea trec spre spaţiul intern: -ioni de calciu (Ca 2+) şi magneziu (Mg2+), necesari activităţii enzimelor cuprinse în matricea mitocondrială; - molecule de ADP şi ATP, necesare desfăşurării procesului de fosforilare activă; -acizi graşi şi unii aminoacizi (glutamatul şi apartatul). Transportul prin membrană a acestor produşi se realizează cu ajutorul unor proteine din membrană,care servesc ca transportori

sau cărăuşi (translocazele şi permeazele).

Fig.5.29. Organizarea particulelor elementare1-Factorul de cuplare; 2-Citocromi;

3-Succinat dehidrogenaza.

5.4.2. Matricea mitocondrială. Matricea mitocondrială conţine enzime, vitamine (B,A,C), acizi nucleici (ADN şi ARN), ioni

( K+, Na+, Ca 2+, Mg2+) şi granule de glicogen, lipide, riboproteine (ribozomi). Enzimele matricei aparţin la următoarele sisteme: -sistemul enzimatic al ciclului acidului citric

(Krebs); - sistemul enzimatic al beta oxidării acizilor graşi; -sistemul enzimatic de fosforilare oxidativă; enzime care intervin în sinteze specifice; -enzime proteolitice.

Acizii nucleici mitocondriali sunt reprezentaţi de ARN ribozomal, ARN mesager, ARN de transfer şi ADN. Molecula de ADN mitocondrial (cu lungimea de 20µm) este circulară, asemănătoare cu cea a procariotelor. Replicarea ADN-ului mitocondrial nu se produce sincron cu replicarea ADN-ului nuclear şi nici în mod continuu. Sinteza ADN-ului mitocondrial se produce mai lent decât în cazul ADN-ului nuclear şi independent de acesta. ADN-ul mitocondrial este sintetizat independent în matricea mitocondrială,fapt demonstrat prin evidenţierea în matrice a enzimei care catalizează biosinteza ADN-ului, enzimă denumită ADN-polimeraza.

Ribozomii mitocondriali au diametrul de 15 nm şi sunt asemănători celor de la procariote, de tip 70 S, cu cele două subunităţi: mare, de 50S şi mică, de 30S. Mitocondria are autonomie genetică parţială, întrucât posedă un cromosom (cromosoma mitochondrialis) ce conţine programul genetic (ADN-ul mitocondrial), şi este capabilă să-şi sintetizeze singură, fără ajutorul nucleului unele protein-enzime (datorită înzestrării cu ribozomi proprii, ce biosintetizează proteine).Codul genetic folosit de mitocondrie diferă parţial de codul genetic nuclear.

5.4.3.Procesele metabolice mitocondriale

Aparţin pe de o parte metabolismului energetic, iar pe de altă parte metabolismului sintetetic.Mitocondria este sediul metabolismului celular aerob, dependent de oxigen, care include: 1-

ciclul acidului citric (KREBS); 2- oxidarea acizilor graşi şi 3-fosforilarea oxidativă. Prin aceste procese, în mitocondrii se produce întreaga cantitate de energie (sub formă de ATP) necesară creşterii,funcţionării şi vieţii celulei, încât mitocondriile se comportă ca nişte centrale energetice celulare.

Într-un caz ipotetic, în care celulele animale ar fi lipsite de mitocondrii, producerea de energie ar depinde de glicoliza anaerobă, în care fiecare moleculă de glucoză generează două molecule de

83

ATP. În realitate, în mitocondrii, metabolismul glucozei este complet, oxidarea mergând pănă la CO2 şi H2O, încât fiecare moleculă de glucoză produce 36 molecule de ATP.Prin hidroliza ATP-ului se eliberează o cantitate importantă de energie (8.000-10.000 Kcal/mol) necesară proceselor metabolice.

În cazul acizilor graşi, aceştia trec din citosol în matricea mitocondrială, unde intră în ciclul beta-oxidării,pierzând în mod repetat câte doi atomi de carbon de la capătul carboxil şi rezultând o moleculă de acetil-coenzimă A. Totodată, în urma glicolizei ce are loc în citosol,rezultă două molecule de piruvat, care în matricea mitocondrială este convertit de către complexul piruvat dehidrogenază în acetil coenzima A.

Acetil coenzima A, rezultată din acizii graşi sau din glucoză intră în ciclul acidului citric (ciclul KREBS), ce are loc în matricea mitocondrială.La acest nivel cu ajutorul oxigenului molecular, produs de respiraţia celulară, au loc oxidări în urma cărora rezultă energie ce este folosită pentru sinteza de ATP, de către complexul ATP- sintetazei, prezent în membrana mitocondrială internă.

Celulele dispun de depozite de lipide (trigliceride) în ţesutul adipos şi de glucide (glicogen), în ficat şi muşchi, prin care se asigură o sursă continuă de piruvat.

Participarea mitocondriilor la efectuarea unor procese metabolice este posibilă datorită existenţei unui mozaic complex de enzime,localizate în diferite structuri mitocondriale, precum membrana externă, membrana internă cu criste şi particule elementare, compartimentul extern (sau spaţiul intermembranar) şi compartimentul intern (sau matricea mitocondrială).Astfel, enzimele care intervin în ciclul acidului citric şi în beta -oxidarea acizilor graşi sunt localizate în membrana externă şi în matricea mitocondriilor.Enzimele şi alţi factori care participă la procesul de fosforilare oxidativă (generatoare de ATP) sunt localizate în membrana internă,respectiv în criste.În particulele elementare ale membranei interne se află localizată enzima denumită factorul de cuplare F1, care posedă activitate ATP-azică şi catalizează ultima etapă a formării ATP-ului.

Procesele metabolice biosintetice pot avea loc, datorită faptului că mitocondriile conţin ADN, ARN, ribozomi şi toate enzimele necesare exprimării genelor mitocondriale.În mitocondrii se desfăşoară unele etape din sinteza hemului şi a hormonilor steroizi, ca de exemplu în celulele interstiţiale din ovar şi testicul, în corticosuprarenală.

Structura chimică a mitocondriilor cuprinde 65-70% proteine (din care 30% structurale şi 70% enzime), 25-28% lipide (fosfolipide, lecitine, trigliceride, cardiolipin), 0,5% ARN, AND (în cantitate mică),glucide,ioni,apă şi uneori vitaminac. Într-o mitocondrie, toate proteinele, ca şi toate lipidele sunt în locuite la aproximativ 20 de zile, încât mitocondria se reînoieşte continuu, iar când iese din funcţie, este îndepărtată prin autofagie cu ajutorul lizozomilor.

5.4.4. Originea mitocondriilor

În celulă, noile mitocondrii apar prin condrodiereză (clivaj,despicare), încât dintr-o mitocondrie funcţională rezultă două organite asemănătoare. Se menţioneaz şi posibilitatea de formare a mitocondriilor din molecule proteice şi lipidice sintetizate în celulă sau din alte citomembrane, în special din cele ale reticulului endoplasmic.

În filogeneză, primele mitocondrii au apărut în celulele animale prin transformarea unor bacterii care, odată pătrunse în celulă animală şi-au pierdut virulenţa, şi-au structurat o a doua membrană (membrana mitocondrială externă), şi-au adoptata metabolismul la celula gazdă, devenind un organit endo-simbiont. Mitocondria,ca şi bacteriile prezintă o moleculă de AND circular, iar unele enzime sunt prezente atât în bacterii, cât şi în mitocondrii.

5.4.5. Funcţiile mitocondriilor

Mitocondriile îndeplinesc un rol esenţial în metabolismul energetic al celulelor vii, producând energia necesară desfăşurării oricărei activităţi celulare (diviziune,diferenţiere,secreţie, contracţie musculară, transmitere nervoasă).Energia este generată prin acţiunea enzimelor oxido-reductorii mitocondriale şi prin procesul fosforilării active sub forma molecelor macroergice de ATP.Enzima denumită ATP-ază, scindează molecule de ATP şi eliberează energia pe care acestea o conţin.

În cursul desfăşurării reacţiilor enzimatice oxidative şi ale cuplării oxidării cu fosforilarea, mitocondria suferă o serie de modificări de formă şi strucutură, ce formează un ciclu fiziologic de umflare contracţie. În acest ciclu, membrana externă rămâne nemodificată, în timp ce membrana internă permite mişcări ale apei şi ionilor cu ajutorul translocatorilor specifici.(Fig.5.30)

Fig.5.30. Ciclu fiziologic de balonare-contracţie al mitocondriei.

84

1-Mitocondrie nemodificată; 2-Mitocondrie condensată; 3-Mitocondrie balonată.

În stare de contracţie,datorită proteinelor contractile pe care le conţine, mitocondria îşi micşorează mult volumul, spaţiul intermembranar se reduce, iar cristele mitocondriale se tasează, organitul, în totalitatea sa, apărând electronodens.

În starea de balonare, mitocondria acumulează o cantitate mărită de apă, îşi măreşte volumul, se sterg cresteler mitocondriale, iar cele două membrane ajung în contact una cu cealaltă. Aceste modificări pot fi fiziologice şi reversibile. Balonarea se datoreşte pe de o parte modificării raportului ATP/ADP de la suprafaţa externă a mitocondriei, cât şi datorită acumulării peste normal a unor ioni.

5.5.Organitele de sinteză şi secreţie ale celulei

Sunt reprezentate de ribozomi,reticulul endoplasmic şi complexul Golgi.

5.5.1. Ribozomii

Ribozomii (ribosoma) sau granulele Palade sunt organite celulare intracitoplasmatice prezente în toate celulele cu excepţia eritrocitelor . (Fig.5.31).

Fig.5.31. Ribozomii - aspect, ultrastructură şi biogeneză:1-Ribozomi liberi;2-Ribozomi ataşaţi la RE;3-Poliribozomi;4-Subunitate mică;5-Subunitate mare;6-Ribozom funcţional;7-Dimer;8-Proteină ribozomală structurală;

9-ARN ribozomal dublu elicoidal;10-ARN ribozomal monocatenar;11-Nucleu; 12-Nucleol;13-Ribozom;14-citoplasmă,15-membrană celulară.

Ribozomii pot fi liberi în citoplasmă , solitari sau grupaţi sub formă de poliribozomi (polyribosoma). De asemenea,se pot ataşa de membranele reticulului endoplasmatic (structurând reticulul endoplasmic granular) sau de faţa externă a membranei nucleare. Numărul ribozomilor variază în funcţie de tipul celulei şi de momentele funcţionale ale acesteia , fiind foarte mare şi ataşaţi reticulului endoplasmic în celulele care sintetizează proteine de export (celulele acinoase, limfocit şi plasmocit). În celulele care secretă hormoni steroizi (din glandele suprarenale , din gonade ) numărul este foarte mic, ribozomii apărând liberi, în citoplasmă (Fig.5.32). Diametrul ribozomilor este de 15-30nm, având aspectul unor granule sferice, cu constanţa de sedimentare de 80S la eucariote şi de 70S (unităţi Svedberg) la procariote.

85

Fig.5.32.Aspecte ale ribozomilor examinaţi cu microscopul optic1-Ergastoplasmă; 2-Corpusculi Nissl; 3-Grupări bazofile în celulele secretorii din glanda

mamară; 4-Corpi Berg în hepatocit. Organizarea ultrastructurală. La eucariote, un ribozom este format din două subunităţi inegale, ca dimensiuni asimetrice: a) o subunitate mare (cu diametrul de aproximativ 30nm), de formă sferoidală, cu constanţă de sedimentare de 60S. ; b) o subunitate mică, alungită, cu o constantă de sedimentare de 40S.(Fig.5.33).

Fig.5.33.Schema ribozomilor şi a formelor lor de organizare1-Subunitatea mică; 2-Subunitatea mare; 3-Ribozomi; 4-Dimer; 5-Poliribozomi.

Ribozomul de la procariote este asemănător cu ribozomul mitocondrial de la eucariote, având o constantă de sedimentare de 70S, cu o subunitate mică, de 30S şi o subunitate mare, de 50S.

Cele două subunităţi ribozomale sunt separate atunci când nu participă la sinteza de proteine sau când, în citoplasmă, concentraţia ionilor de magneziu (Mg2+) scade sub 10-3 sau în prezenţa unor inhibitori ai sintezei de proteine ca puromicina sau etionina. Atunci, când concentraţia ionilor de magneziu creşte peste 10-3 se produce agregarea ribozomilor în grupuri denumite polimeri (di, tri, tetra) care nu au o funcţie specială în celulă. Odată cu revenirea la normal a concentraţiei ionilor de magneziu în citoplasmă se produce desfacerea polimerilor şi individualizarea ribozomilor.

În cursul proceselor de biosinteză a proteinelor mai mulţi ribozomi se dispun de-a lungul unei molecule de ARN mesager (ARNm), formând cu un poliribozom (polirybozoma), sau un polizom. ARNm se amplasează în spaţiul dintre cele două subunităţi ale ribozomului şi introduce mesajul genetic în secvenţa de aminoacizi a proteinelor ce se sintetizează. Numărul de ribozomi ce se grupează variază în funcţie de mărimea moleculei proteice ce urmează a fi sintetizată, fiind necesari 100 ribozomi pentru o moleculă de colagen şi de 5 ribozomi pentru o moleculă de globină din hemoglobină. Molecula de ARN mesager are forma unui filament sinuos, gros de 2nm, ce înşiră ribozomii, precum mărgelele pe aţă, trecând prin fiecare ribozom, printre subunitatea mică şi cea mare. După ce proteina a fost sintetizată, lanţul poliribozomal se rupe, iar ribozomii se dispersează în citoplasmă.

Compoziţia chimică a ribozomilor cuprinde ARN ribozomal (ARNr) şi proteine în părţi aproximativ egale, cantităţi mici de apă şi diferiţi ioni metalici (de magneziu şi calciu).

86

Fig.5.34. Proteine de structură (1) şi ARN ribozomal (2)

Molecula de ARN ribozomal prezintă segmente bicatenare elicoidale, dispuse la suprafaţa subunităţilor ribozomale, ce alternează cu segmente monocatenare nespiralate, dispuse în interiorul subunităţilor, unde sunt situate şi proteinele ribozomale. Prin conţinutul lor în ARNr, ribozomi

conferă bazofilia celulelor. (Fig.5.34).În subunitatea mare de 60S sunt prezente 3 specii de ARNr (de 5,8S, de 28S şi de 5S), în

timp ce, subunitatea mică conţine numai o singură specie de ARNr (de 18S). În moleculele de ARNr, bazele apar asimetrice, fiind reprezentate de baze purinice (guanină şi adenină) mai abundente şi de baze pirimidinice (uracil şi citozină).

Proteinele ribozomale sunt legate mai strâns sau mai lax de ARNr şi îndeplinesc un rol structural, unele intervenind în asamblarea unităţilor ribozomale, iar altele sunt implicate în realizarea funcţiilor specifice ribozomilor. Proteinele ribozomale sunt bogate în radicali specifici de tipul argininei şi lizinei în subunitatea mare existând 45 proteine şi în subunitatea mică 33 proteine (Fig.5.35).

Fig.5.35. Diagrama componentelor ribozomului la eucariote.1-Ribozom; 2-Subunitate ribozomală mică; 3-Subunitate ribozomală mare.Biogeneza ribozomilor începe în nucleol, la nivelul moleculelor de AND nucleolar din

componenta cromozomală, unde pe o porţiune a cromozomului denumită organizator nuclear se găsesc genele pentru producerea ARNr. Iniţial se produce un precursor al ARNr cu constantă de 45S ce se localizează în componenta fibrilară a nucleolului. O parte din ARNr 45S dă naştere la ARNr 28S şi ARNr 18S, care trece în componenta granulară a nucleolului, iar cealaltă parte de ARN 41S se transformă sub acţiunea exonucleazelor în ARNr 28S şi ARNr 20S (din care rezultă rapid un ARNr 18S). ARNr 28S şi ARNr 18S, împreună cu o parte din proteinele ribozomale venite în nucleu din citoplasmă, migrează separat în citoplasmă prin porii membranei nucleare. ARNr 58S se sintetizează în afara nucleolului în nucleoplasmă după tiparul ADN-ului, iar ARNr 5S şi ARNr 5,8S migrează în citoplasmă ataşaţi de molecula de ARNr 28S. Odată trecute în citoplasmă, cele două subunităţi, încă imature se maturează foarte repede, se asamblează şi se asociază cu proteine citoplasmatice specifice ribozomului, structurând în final ribozomii.

87

Funcţia ribozomilor constă în sinteza proteinelor. Ribozomii ataşaţi membranelor reticulului endoplasmic sintetizează proteinele de export (enzime, hormoni, anticorpi, tropocolageni- ca în cazul celulelor seroase din pancreas, limfocitelor, plasmocitelor şi fibroblastelor), în timp ce poliribozomii liberi neataşaţi sintetizează proteine de structură (ce se consumă în diviziune şi creştere, în înlocuirea organitelor uzate), precum şi unele proteine speciale (proteine contractile, proteinele din mioglobină şi hemoglobină).

5.5.2.RETICULUL ENDOPLASMIC

Reticulul endoplasmic (reticulum endoplasmaticum s.cytoplasmaticum) este un organit intracelular implicat în activităţile de sinteză şi secreţie celulară, format dintr-un complex de membrane intracelulare ce delimitează un sistem de canalicule (tuburi, cisterne) care străbat întreaga citoploasmă a celulei eucariote. Este prezent în toate tipurile de celule, cu excepţia eritrocitului adult. (Fig.5.36).

Fig.5.36. Reticulul endoplasmatic - aspect şi organizare tridimensională.1-Reticul endoplasmic rugos; 2-Reticul endoplasmic neted; 3-Organizare tridimensională a REN; 4-Ergastoplasmă în celula seroasă din pancreas; 5- Corpusculii

Nissl în neuron.

A fost observat în secolul trecut la microscopul optic sub forma unor granulaţii bazofile în neuron (unde formează substanţa tigroidă sau corpusculii Nissl), în hepatocit (sub forma unor zone sferice, corpii Berg) şi în pancreas (unde formează o zonă bazofilă cu striaţii longitudinale numită ergastoplasmă).

Reticulul endoplasmic este mai bine reprezentat în celulele active în sinteze (de proteine, de glucide, de lipide) şi foarte dezvoltat în celulele secretorii exo- şi endocrine. În interiorul celulei este situat cu precădere în zona internă şi mijlocie a citoplasmei, ce formează endoplasma (endoplasma) şi mai puţin în zona externă. Este separat de plasmalemă printr-un strat subţire de ectoplasmă, ce conţine infrastructurile fibrilare ale citoscheletului. Contactul cu plasmalema sau continuitatea membranei reticulului cu plasmalema este extrem de rar şi poate fi considerat accidental (sau artefacte datorită preparării).

Ultrastructura reticulului endoplasmic cuprinde saci (sacculus), cisterne (cisterna) , tubi (tubulus) şi vezicule anastomozate între ele şi delimitate de o endomembrană groasă de 6 nm, cu

88

organizare moleculară , comună tuturor membranelor interne. Lumenul formaţiunilor reticulului endoplasmic variază între 25-500 nm, în raport de momentul funcţional al celulei, iar conţinutul lor poate apare la M.E. clar sau întunecat, mai des omogen şi amorf decât heterogen.

Unele porţiuni ale reticulului endoplasmic prezintă ribozomi ataşaţi de endomembrane şi poartă numele de reticul endoplasmic rugos (RER) sau granulos (reticulum endoplasmaticum granulosum), în timp ce alte porţiuni sunt lipsite de ribozomi şi formează reticulul endoplasmic neted (REN) (reticulum endoplasmaticum nongranulosum).

Membrana REN se continuă cu membrana RER, dar în RER predomină cisternele, pe când în REN sunt mai frecvente tuburile şi canalele interconectate în reţea. Membrana RER se continuă cu foiţa externă a învelişului nuclear, iar lumenul RER comunică cu spaţiul perinuclear. REN se întinde spre periferia celulei fără a atinge plasmalema. Cele două porţiuni ale reticulului endoplasmic, rugos şi neted, prezintă interconexiuni morfologice şi funcţionale.

Reticulul endoplasmic rugos prezintă pe faţa externă a endomembranei sale ribozomi individualizaţi sau grupaţi în poliribozomi. Ribozomii se leagă de membranele reticulului prin subunitatea mare, care este străbătută de un canal ce se deschide în lumenul reticulului şi prin care trec lanţurile polipeptidice, ce se formează în ribozomi. Legarea ribozomilor se face cu ajutorul unor glicoproteine transmembranare denumite riboforine (I şi II). Ribozomii ataşaţi conferă o puternică bazofilie celulei respective.

R.E.R. prezintă o mare plasticitate şi o mare putere de adoptare în raport cu vârsta sau starea funcţională a celulei. În situaţii patologice ale celulei se observă mari variaţii morfologice ale organitului, precum: fragmentări, dilatări, acumulări de materiale în cisterne şi vezicule, proliferări ale formaţiunilor reticulului.

R.E.R. este specializat în sinteza proteinelor.Reticulul endoplasmic neted (R.E.N.) nu prezintă ribozomi pe membrana sa limitantă.

Este alcătuit mai mult din formaţiuni tubulare cu diametrul de 30nm, ce comunică prin canale de legătură cu R.E.R. Este prezent în citoplasma tuturor celulelor, dar mai puţin reprezentat cantitativ decât cel rugos.

REN apare mai dezvoltat în celulele care: - sintetizeaza hormoni steroizi (glandele suprarenale, celulele interstitiale din ovar si testicul); - produc glucide în cantitate mare (hepatocite, celule musculare); - formeaza pigment (melanoblaste) si - elaborează acid clorhidric (parietale din glandele fundice).

În celula musculara, REN se numeste reticul sarcoplasmic prezentând un aspect morfologic si functional particular si îndeplinind un rol esential în cuplarea excitatiei cu contractia. În celulele pigmentare ale retinei, REN apare si sub forma unor corpi nucleoizi, biconvexi, PAS pozitivi cu rol în procesele de fotoreceptie.

Compoziţia chimica a reticulului endoplasmic a fost studiată dupa centrifugarea diferentiata a omogenatului celular, când s-au obtinut microzomii.

Microzomii nu sunt organite celulare, ci fractiuni subcelulare, ce cuprind portiuni de reticul endoplasmic,membrane golgiene şi fragmente de membrane celulare. Se pot obtine şi separa microzomii rugosi si netezi, atunci când se desprind ribozomii de RER. În microzomi se pastreaza orientarea membranei reticulului endoplasmic din celula, prezentând o fata externa, ce corespunde fetei citoplasmatice a reticulului endoplasmic, iar continutul lor este identic cu cel din lumenul reticulului endoplasmic.

In compozitia chimica a reticulului endoplasmic intra proteine (60%) si lipide (40%). O parte din proteine sunt incluse în structurile organitului (proteine structurale), iar alta parte sunt proteine de export (hormoni, enzime). Dintre lipide, predomina fosfolipidele, lecitinele si cefalinele, iar colesterolul este în cantitate mica (mai ales în RER). Acizii grasi din fosfolipide sunt foarte nesaturati, ceea ce confera o mare fluiditate membranei reticulului endoplasmic.

Enzima marker pentru reticulul endoplasmic este glucozo-6-fosfataza, dar în membranele reticulului endoplasmic se mai gasesc si alte enzime legate de transferul de electroni, precum si enzime hidrolitice sau de dezaminare.

Originea reticulului endoplasmic este înca discutabila, el parând sa se formeze fie din membranele nucleare, fie “de novo” prin sinteza macromoleculelor caracteristice în membrane si asamblarea lor. Membranele reticulului endoplasmic se reînnoiesc cu viteze diferite de la un segment la altul (unele dupa 40-60 de ore, iar altele dupa 16 zile).

Functiile comune ale reticulului endoplasmic sunt:1) RE realizeaza un vast sistem microcirculator intracitoplasmatic, prin care sunt vehiculate

în permanentă substante în toata citoplasma sau în alte structuri cu care RE comunica (precum complexul golgian sau spatiul perinuclear).

2) RE formeaza un suport intracitoplasmatic atât pentru celelalte organite, cât si pentru mentinerea formei celulei.

89

3) RE participa prin citomembranele sale, dotate cu permeabilitate selectiva, la realizarea unor schimburi active între continutul formatiunilor componente si citosol.

Fig.5.37 - Participarea RER la sinteza proteinelor

Functiile specifice difera la RER la REN.

Reticulul endoplasmic rugos (RER) are ca functie de baza sinteza proteinelor de export, dar si sinteza proteinelor

de membrana destinate diferitelor membrane ale organitelor si plasmalemei. Astfel, RER apare foarte bine dezvoltat în: a) celulele seroase ale pancreasului exocrin ce

secreta enzime digestive; b) în plasmocitele ce sintetizeaza imunoglobuline; c) în hepatocite care produc albumine si alte proteine serice; d) în neuroni, unde îndeplineste rolul unei “fabrici de membrane”, care produce si întretine o suprafata mare de membrane, datorita prelungirilor. În general, RER este fabrica de membrane a celulei eucariote. (Fig.5.37)

Reticulul endoplasmic neted îndeplineste mai multe functii specifice în celule:1) participa la sinteza hormonilor steroizi (în celulele corticosuprarenalei, precum si în celulele

glandei interstitiale din ovar si testicul;2) participa la metabolismul glucidelor, intervin atât în glicogeneza (în hepatocite), cât si în

glicogenolliza (prin glucozo-6-fosfataza pe care o contine);3) intervine în metabolismul lipidelor, participând la sinteza unor lipoproteine (trigliceride sau

complexe lipoproteice). Astfel, în celulele intestinale, REN este foarte dezvoltat şi sintetizeaza trigliceride (din substante absorbite), ce pot fi evidentiate în REN sub forma de chilimicroni (picaturi de grasime);

4) intervine în procesele de detoxifiere, prin metabolizarea unor substante toxice endo- si extracelulare, datorita enzimelor localizate în citomembranele sale (de exemplu, metabolizeaza sarurile biliare, hormonii steroizi, colesterolul, hemoglobina, precum si unele medicamente);

5) participa la realizarea contractiei musculare, conducând, prin sistemul tubilor transversi, excitatia de la suprafata plasmalemei la miofilamentele contractile;

6) intervine în biosinteza acidului clorhidric în celulele parietale ale glandelor fundice;7) participa la fotoreceptie, în celulele pigmentare din retina.

5.5.3.complexul golgi

Complexul Golgi (complexus golgiensis s. apparatus reticulatus internus) este un organit celular comun, prezent în toate tipurile de celule, cu exceptia hematiei adulte. A fost descoperit în 1898 de catre Camillo Golgi, în neuronii piriformi din cerebel. La microscopul optic, în celula proaspata poate fi evidentiat prin colorare cu rosu neutru, iar în celula fixata prin impregnare cu saruri de metale grele (osmiu, argint etc.), aparând sub forma unei retele, formata din canalicule anastomozate, vacuole de diverse marimi sau bastonase (dictiozomi). (Fig.5.38)

90

Fig.5.38 - Aparatul Golgi - aspecte la microscopul optic1 - Retea perinucleara; 2 - Vezicule; 3 - Ramificat printre granule de secretie (a); 4 - Retea terminata în cârlig în celulele foliculului tiroidian; 5 - Coarda rasucita; 6 - Imagine Golgi negativa.

Pozitia complexului Golgi în celula variaza dupa tipul si activitatea celulei. Astfel, în neuroni este dispus perinuclear, pe când în celulele secretorii exocrine (de exemplu în celulele acinilor serosi din pancreas) ocupa o pozitie supranucleara, fiind situat între nucleu si polul apical al celulei. În celulele cu dubla polaritate functionala (exemplu celula tiroidiana si adamantoblastul), complexul Golgi se deplaseaza frecvent între cei doi poli, în functie de activitatea metabolica predominanta a unuia sau altuia.

În celule, complexul Golgi se poate gasi în mai multe exemplare distincte.Organizarea ultrastructurala a complexului Golgi cuprinde trei elemente componente: a)

pachete de saci turtiti sau cisterne asezate în stiva; b) microvezicule si c) macrovezicule. Aceste elemente componente sunt delimitate de endomembrane (citomembrane), groase de 6-8 nm, netede, fara ribozomi atasati de suprafetele lor.

Sacii sau cisternele golgiene sunt polarizate morfologic si functional, prezentând:a) o fata cis sau proximala sau convexa sau imatura, formatoare, în strânsa relatie cu RER.

(Fig.5.39)

Fig.5.39 - Complexul Golgi - ultrastructura si relatii cu alte componente celulare

91

b) o fata trans sau distala, concava sau matura, îndreptata catre membrana celulara, unde se formeaza veziculele de secretie. Membrana sacilor si veziculelor este mai subtire (6 nm, ca la RE) pe fata “CIS” si mai groasa (10 nm, ca la plasmalema), pe fata “TRANS”, tranzitia de la un tip de membrana la altul fac^andu-se la nivelul cisternelor.

Structurile complexului Golgi se găsesc în mişcare continuă, în sensul migrarii lor de la fata imatura spre fata de maturare a organitului, încât microveziculele vor forma sacii Golgieni, iar din acestia vor lua nastere macroveziculele si apoi veziculele secretorii.

Microveziculele (sau veziculele de transfer) (vesicula) sunt cavitati sferoidale (de 20-80 nm), delimitate de o membrana de 6 nm, sunt dispuse de obicei pe fata imatura “CIS” sau se găsesc între RER si sacii Golgieni. Se formeaza prin gâtuirea capetelor dilatate ale RER, de care se desprind pierzându-si ribozomii de pe fata externa. Unele dintre microvezicule prezinta o membrana mai groasa decât a primilor saci golgieni si sunt pozitive la reactia pentru fosfataza acida, încât sunt interpretate a fi lizozomi primari formati în complexul GERL (Golgi - endoplasmic reticulum - lysosome). Restul microveziculelor fuzioneaza, formând astfel noi saci golgieni. (Fig.5.40)

Cisternele (sacii) golgieni (sacculus lamelliformis) formeaza componenta majoră a complexului Golgi, având un aspect de saci turtiţi, usor curbati si dispusi paralel unii fata de altii si separati între ei prin spatii regulate de 20-30 nm. Fiecare sac (cisterna) se aseamana cu o farfurie, având regiunea centrala mai subtire (1-7 nm) si periferia mai groasa. Numarul sacilor este variat (între 3-12) putând sa ajunga în unele celule secretorii pâna la 20. Extremitatile laterale ale sacilor pot prezenta pori sau prelungiri care sa anastomozeze sacii între ei sau sa-i lege de RE.

Fig.5.40. Formarea veziculelor de transfer

Macroveziculele sunt cavitati sferoidale sau ovoidale, cu diametrul între 200-600 nm, delimitate de o citomembrana groasa (8 nm), cu un continut amorf sau granular-heterogen, cu material mai condensat si inegal la fluxul de electroni. Ele sunt situate de obicei pe fata de maturare - TRANS - a complexului Golgi si sunt interpretate ca fiind vacuole de secretie sau corpi de condensare a produsului secretat de celula.

Macroveziculele se formeaza din dilatatiile laterale ale sacilor golgieni, de care se desprind si se individualizeaza.

Numarul veziculelor de secretie difera de la un tip de celula la altul, fiind mai numeroase în faza de maxima activitate a celulelor secretorii exocrine si endocrine.

Compozitia chimica a complexului Golgi contine 60% proteine de structura si protein-enzime si 40% fosfolipide si colesterol.

Enzimele marker pentru complexul Golgi sunt: a) tiaminpirofosfataza (TPP), localizata mai ales în interiorul sacilor golgieni de pe fata trans; b) nucleoziddifosfataza (NDP) prezenta în interiorul sacilor golgieni intermediari si c) unele glicoziltransferaze. Totodata complexul Golgi este bogat în sulfatotransferaza, care intervine activ în sulfatarea polizaharidelor. De asemenea mai contine: citocrom-reductaza (ca si RE) 5-nucleotidaza (ca si membrana plasmatica), adenilat ciclaza, fosfataza acida (în veziculele sistemului GERL), ubiquinona, vitamina A si vitamina K.

92

Originea complexului Golgi. Structurile complexului Golgi se formeaza din membranele preexistente ale sacilor golgieni. Nucleul controleaza sinteza proteinelor specifice din endomembrane si deci indirect influenteaza formarea complexului Golgi.

Functiile complexului Golgi sunt multiple, fiind reprezentate de:1) Functii legate de procesul de secreţie intracelulară, aparatul Golgi fiind implicat în: a)

concentrarea produsilor sintetizati în RE; b) prelucrarea produsilor sintetizati în RE prin procese biochimice; c) sinteza de noi componente; d) stocarea si segregarea produsilor de secretie; e) ambalarea produsilor sub forma de vezicule; f) livrarea produsilor spre plasmalema. Produsul de secretie elaborat în RE ajunge la formatiunile golgiene prin microvezicule ce se detaseaza din capetele reticulului endoplasmic rugos, functionând ca o naveta (suveica) cu frecvente deplasari dus-întors între RE si sacii golgieni. (Fig.5.41).

Fig.5.41 - Functiile complexului Golgi

2) Fabricarea de endomembrane pentru veziculele secretorii si din acestea mai departe pentru plasmalema. În acest mod, membrana veziculelor de secretie se încorporeaza în plasmalema, compensând astfel pierderile de plasmalema prin endocitoza. Complexul Golgi participa la reciclarea (reutilizarea) membranelor veziculelor secretoare, ale veziculelor sinaptice si ale veziculelor de endocitoza. Prin acest proces, unele componente ale plasmalemei ca receptori, enzime sau unele molecule informationale din mediul extracelular (hormoni peptidici, cotecolamine) sunt introduse în celula pe calea complexului Golgi, unde sunt modificate (glicozilate, sulfatate, fosforilate) sau reparate. În acest mod, complexul Golgi îndeplineste rolul de a fi principala statie de reînnoire a endomembranelor si a plasmalemei.

Actiunea unor virusuri sau transformarea maligna a celulelor poate altera fluxul membranelor, atât în ceea ce priveste conexiunile dintre formatiunile delimitate de endomembrane, cât si în ceea ce priveste manifestarile functionale ale acestora.

3) Sinteza complexelor hidratilor de carbon. Complexul Golgi participa la sinteza glicoproteinelor prin faptul ca în structurile golgiene componenta primita de la RER se uneste cu moleculele de hidrati de carbon, cu ajutorul unor enzime aflate în organit (transferaze, glucozaminidaze). În complexul Golgi se desavârseste procesul de glicozilare a glicoproteinelor. Glicoproteinele sintetizate pot ramâne intracelular ca enzime lizozomale sau pot forma continutul veziculelor secretorii, care prin exocitoza ajung extracelular.

4) Formarea proteoglicanilor sulfatati (condroitin sulfatatilor) si a glicoproteinelor sulfatate (mucina) se realizeaza prin procesul enzimatic de sulfatare a glicoproteinelor cu ajutorul sulfotransferazei golgiene.

93

5) Maturarea lipoproteinelor si a albuminelor. Lipidele sintetizate la nivelul reticulului endoplasmic neted sunt transportate la complexul Golgian, unde are loc procesul de maturare si complexare cu proteinele.

6) Formarea lizozomilor primari are loc pe fata “cis” - imatura - sub forma unor microvezicule pozitive pentru fosfataza acida. Enzimele lizozomale sintetizate în RER sunt transportate si împachetate fie în sistemul GERL, fie în vezicule de condensare.

7) Formarea acrozomului. În spermiogeneza, complexul Golgi ocupa o pozitie supranucleara, îsi modifica forma si realizeaza acrozomul, care elibereaza enzime litice la contactul cu ovulul.

5.5.4.Ciclul secretor

Ciclul secretor sau procesul secretor reprezinta o succesiune de etape pe care le parcurg proteinele de export din momentul sintezei si pâna la eliberarea lor în mediul extracelular. Se descriu cinci etape obligatorii:

Fig.5.42. Desfasurarea ciclului secretor

1. Sinteza si segregarea proteinelor de export la nivelul RER. Initial proteinele sunt sintetizate pe polizomii neatasati membranelor RE, formati din ribozomi dispusi de-a lungul unei molecule de ARNm la distante de 100 nucleotide. Într-un polizom, fiecare ribozom sintetizeaza independent câte un lant polipeptidic, care este adapostit în tunelul subunitatii ribozomale mari. Atunci când lantul polipeptidic a atind un anumit stadiu de formare, ribozomii se ataseaza de membrana reticulului endoplasmic într-o anumita pozitie care recunoaste o secventa specifica fiecarei proteine, denumita secventa semnal, situata pe capatul terminal amino al peptidei care ia nastere. Acest semnal este interceptat de proteine specifice din membrana reticulului (denumite riboforine). În momentul atasarii polizomilor se formeaza un orificiu în membranele RER, în continuarea celui din subunitatea ribozomala mare. Prin acest tunel trec în spatiul endoplasmic lanturile polipeptidice nou-formate. (Fig.5.42)

2. Transportul intracelular al proteinelor prin formatiunile reticulului endoplasmic rugos la complexul Golgi se realizeaza cu ajutorul microveziculelor, care sunt încarcate cu proteine sintetizate de polizomi si se îndreapta spre sacii golgieni.

3. Condensarea si maturarea proteinelor în structurile golgiene. Procesul de maturare sau condensare (cu durata de circa 1 ora) desavârseste conformatia cuaternara a proteinelor, realizându-se prin interactiunea proteinelor cu un peptidoglican sulfatat sintetizat în complexul Golgi. Din aceasta interactiune se formeaza agregate osmotic inactive însotite de eliberarea unor molecule de apa din proteinele nou formate (deci de o concentrare a lor).

94

4. Depozitarea intracelulara se face sub forma veziculelor secretorii, care ramân un timp în citoplasma, dupa care sunt trecute în ectoplasma si mai departe în mediul extracelular, sub actiunea unor hormoni sau neurotransmitatori.

5. Exocitoza este procesul prin care veziculele secretorii sunt trecute în mediul extracelular. Este influentat de concentratia intracelulara a ionilor de calciu, de prezenta moleculelor de ATP si AMP-ciclic care provoaca contractia microfilamentelor care determina deschiderea veziculelor si eliminarea continutului în spatiul extracelular.

Prin exocitoza sunt eliberati din celula: hormonii, enzime, imunoglobuline, lipoproteine, neurotransmitatori, constituenti ai serului si laptelui, componente ale membranei celulare, glicocalixului sau alti produsi sintetizati în reticulul endoplasmic si condensati în complexul Golgi. Prin acelasi mecanism al exocitozei sunt eliminati si unii produsi terminali, metabolic inerti, nefolositori sau daunatori pentru celula.5.6. ORGANITELE DIGESTIEI INTRACELULARE

Digestia intracelulară cuprinde totalitatea fenomenelor care produc degradarea biochimică a moleculelor pătrunse în citoplasmă prin endocitoză, a unor organite uzate, a unor fragmente de celulă sau structuri celulare.

La procesul de digestie intracelulară participă două tipuri de organite: lizozomii şi peroxizomii.

5.61. Lizozomii

Lizozomii (lysosoma) sunt organite celulare de formă sferică sau ovoidală (de 0,2 - 1 nm diametru), prezenţi în citoplasma tuturor celulelor animale, cu excepţia hematiilor adulte.

Lizozomii au fost descoperiţi în 1950, de către DE DUVE prin tehnici de fracţionare celulară, ca particule ce sedimentează între mitocondrii şi microzomi şi conţin enzime hidrolitice cu pH optim de acţiune acid. Organizarea lor ultrastructurală a fost descrisă de către NOVIKOFF în 1956. Au mai fost denumiţi corpi litici, saci de sinucidere sau stomacul celulei.

Organizarea ultrastructurală a lizozomilor cuprinde o membrană lizozomală şi matricea lizozomală (Fig 5.43).

Fig. 5.43. Schema imaginii electronooptice a lizozomilor

1- Membrană lizozomală; 2- Matrice lizozomală.

Membrana lizozomală delimitează lizozomii, prezentând o structură comună endomembranelor, lipoproteică, mozaicată, cu o grosime medie de 6-8 nm. Membrana lizozomală poate fi dublă sau unică, prevăzută la exterior cu mici prelungiri numite spiculi. Ea acţionează ca o barieră între enzimele digestive şi

citosol, împiedicând pătrunderea acestor hidrolaze în matricea citoplasmatică. Hormonii glucocorticoizi (cortizon, cortizol) şi colchicina activează ca stabilizatori ai membranei lizozomale, în timp ce vitaminele A, E, radiaţiile X şi ultraviolete, endotoxinele, hormonii steroizi sexuali (testosteron, progesteron), dezoxicorticosteronul, şocul osmotic, hipoxia, anoxia etc. acţionează ca destabilizatori ai membranei.

Matricea lizozomală prezintă aspecte diferite la microscopul electronic, putând apărea omogenă, fin granulară sau heterogenă încât se recunosc două tipuri majore de lizozomi: primari şi secundari.

Lizozomii primari sunt de talie mică şi au matricea omogenă sau fin granulară fiind dotată cu un set incomplet de hidrolaze acide. Sunt lizozomi tineri, cu o viaţă scurtă (de 24-48 ore), neangajaţi încă în activităţile de digestie intracelulară. Conţinutul enzimatic variază în raport cu specia, starea funcţională şi tipul celulei. Astfel, lizozomii primari ai polimorfonuclearelor neutrofile (microfage mobile) conţin o mare cantitate de neuroaminidază, care distruge membrana bacteriilor; - lizozomii macrofagelor conţin multe fosfataze acide.

Lizozomii secundari sunt heterogeni, conţinând în matrice structuri granulare şi membranoase şi desfăşurând activităţi enzimatice digestive. Au o viaţă mai lungă (de la câteva zile la câteva

95

săptămâni), talia mai mare şi un set enzimatic complet. Se formează din fuziunea lizozomilor primari, cu veziculele de endocitoză ce conţin substanţe fagocitate, endocitate sau degradate din celule. În funcţie de modul în care s-au format, există mai multe tipuri de fagozomi secundari: heterofagolizozomi (heterophagosoma s. phagolysosoma), autofagolizozomi (autophagosoma), crinofagolizozomi, corpusculi reziduali (corpusculum residuale) şi corpi multiveziculari (corpus multivesiculare).

Organizarea chimică a lizozomilor cuprinde un număr mare de hidrolaze acide (peste 50 enzime), care pot degrada orice componentă a celulei: acizi nucleici (prin ribonuclează acidă), proteinele (prin colagenază, catepsină), glicogenul (prin alfa-glicozidază), mucopolizaharidele (prin alfa-monozidază).

Enzimele lizozomale sunt active numai la pH acid (4-6).

Fig. 5.44. Conţinutul enzimatic lizozomal şi acţiunile sale

Enzimele marker pentru identificarea lizozomilor pe secţiuni de ţesuturi sunt fosfataza acidă şi arilsulfataza, iar în timpul fracţionării celulare: fosfataza acidă, catepsina C, N-acetil-beta-glucozaminidaza. Niciodată un lizozom nu conţine întreg setul de enzime hidrolitice, încât heterogenitatea lizozomilor este dată atât de numărul, cât şi de concentraţia unor enzime din matrice şi membrana lizozomală. Cea mai mare parte a enzimelor e localizată în matricea lizozomală, existând însă enzime localizate numai pe membrana lizozomală, cât şi enzime cu dublă localizare în matrice şi în membrană. (Fig. 5.44)

În afară de hidrolaze acide, lizozomii mai conţin conponente de origine extra sau intracelulară, supuse digestiei şi aflate în diferite stadii de degradare. Datorită acestui aspect pentru identificarea lizozomilor trebuie avute în vedere enzimele marker, atât la examinarea la microscopul electronic, cât şi la examinarea prin fracţionare celulară.

Lizozomii pot fi comparaţi cu nişte “saci de sinucidere” ce conţin enzime (hidrolaze acide) care sunt eliberate în mediul intracelular, fie prin modificarea membranei lizozomale de către diferiţi agenţi toxici, chimici sau fizici (ca de exemplu: temperaturi foarte joase, raze ultraviolete, vitamina K), fie de către detergenţi care rup membrana. Odată eliberate în citoplasmă enzimele produc liza celulei. Eliberarea poate avea loc şi în mod normal în timpul unor fenomene de involuţie fiziologică (ca în evoluţia uterină post partum, în glanda mamară în perioada de post-lactaţie).

96

Fig.5.43. Lizozomi primari şi formarea lizozomilor secundari

1- Lzozom primar: a-membrană, b- halou, c-matrice; 2- Corp multivezicular; 3- Fagozom; 4- Heterolizozom (heterofagolizozom); 5- Hetero lizozom cu material digerat; 6- Corp rezidual; 7- Mitocondrie; 8- Autofagozom; 9- Membrana nucleară.

Ph-ul optim (acid) pentru activitatea enzimelor lizozomale este asigurat de membrana lizozomilor care conţine o proteină ce grupează ionii de hidrogen în lumenul lizozomilor folosind energia rezultată din hidroliza ATP. Alături de enzimele hidrolitice acide, în lizozomi se mai găsesc în cantităţi reduse lipide şi proteine de structură, iar în proporţii foarte reduse glicolipide, flavine, acid hialuronic.

În funcţie de natura (substratul) materialului asupra căruia acţionează lizozomii există trei tipuri de “digestie lizozomală”: a) heterofagia, când lizozomii acţionează asupra materialelor exogene înglobate prin endocitoză; b) autofagia, când lizozomii acţionează asupra propriilor constituenţi citoplasmatici (exemplu: organite degenerate), segregaţi în “focare de citoliză”; c) crinofagia, când lizozomii digeră unele materiale de secreţie celulară. (Fig. 5.45).

În heterofagie se digeră intracelular, cu ajutorul lizozomilor substanţele nutritive, bacteriile, virusurile introduse prin endocitoză (fagocitoză, pinocitoză). În urma proceselor de endocitoză se formează: fagozomi (phagosoma) (sau heterofagozomi), în cazul fagocitozei, pinozomi în procesul de pinocitoză fără receptori şi receptozomi în pinocitoza mediată de receptori. (Fig.5.46)

97

Fig. 5.46. Schemă privind participarea lizozomilor la procesul de digestie intracelulară

Fagozomii, pinozomii şi receptozomii sunt antrenaţi prin mişcările din citoplasmă, către interiorul celulei. Spre ei se îndreaptă chimiotactil lizozomii primari şi prin fuzionare, rezultă o singură vacuolă, denumită lizozom-secundar sau heterolizozom sau heterolizom.

În interiorul lizozomilor secundari, enzimele hidrolitice lizozomale produc digestia în funcţie de complexitatea materialului endocitat. Ca urmare a acţiunii enzimelor lizozomale se obţin produşi de digestie micromoleculari (aminoacizi, nucleotide, hidraţi de carbon, lipide) ce vor traversa membrana lizozomală, ajungând în citoplasmă, unde sunt folosite ca materie primă pentru procesele biosintetice sau ca sursă de energie. Pe măsură ce produşii de digestie părăsesc lizozomul secundar, acesta îşi micşorează volumul, producându-se simultan o invaginare a membranei lizozomale cu formarea unor vezicule (ca la pinocitoză), care vor fi şi ele digerate. Prezenţa acestor vezicule mici în interiorul unui lizozom secundari dă aspectul de corp multivezicular (corpus multiveziculare), observabill electro-microscopic.

AUTOFAGIA este procesul de digestie intracelulară, cu ajutorul enzimelor lizozomale, a organitelor celulare epuizate sau uzate. În acest mod, mitocondriile uzate, peroxizomii, porţiuni uzate de reticul endoplasmic sunt iniţial înconjurate cu o membrană, denumită înveliş de izolare provenit din reticulul endoplasmic sau din aparatul Golgi. Se formează astfel vezicule (autofagozomi) sau vacuole autofagice, ce conţin materialul intracelular ce trebuie îndepărtat. Autofagozomii fuzionează cu lizozomii primari, rezultând lizozomi secundari în care se produce digestia materialelor incluse. O parte din produsele rezultate din digestie sunt eliberate în citoplasmă pentru a fi reutilizate, iar ceea ce rămâne formează corpii reziduali. Prin autofagie, lizozomii asigură reînnoirea (turn-over-ul) componentelor citoplasmei, deoarece mitocondriile au o viaţă de circa 12 zile, peroxizomii de 2-3 zile,

98

iar ribozomii de 10 zile. În ficat se distrug mai mult de un miliard de mitocondrii pe un gram de ţesut într-o oră.

Procesele de autofagie sunt accelerate: a) în inaniţie când se remarcă o creştere a numărului de vacuole autofagice (de exemplu în ficat) sau b) în inactivitate ( în muşchi). De asemenea, se intensifică funcţia de autofagie în timpul morfogenezei ori de câte ori are loc involuţia unor ţesuturi.

În unele situaţii, enzimele lizozomale sunt deversate în afara celulei, producând efecte litice, prin acest mecanism osteoclastele digerând ţesutul osos.

CRINOFAGIA reprezintă un aspect particular de autofagie observat în celulele secretorii exocrine şi endocrine, prin care lizozomii intervin în reglarea cantităţii de produşi de secreţie ai celulei. În cazul în care în celulă se acumulează un surplus de vezicule secretorii, care nu

ajung să fie exocitate, acest surplus va fi digerat cu ajutorul lizozomilor primari care vor fuziona cu veziculele secretorii, formând crinofagolizozomii. Moleculele mici rezultate în urma digestiei sunt trecute în citosol unde sunt reutilizate (Fig. 5.47).

Fig.5.47. Participarea lizozomilor la crinofagie

1-Hormon sintetizat pe ribozom; 2- Segregare şi transport prin R.E.; 3-Vezicule Golgi cu hormon; 5- Vezicule de secreţie; 6- Fuzionarea veziculei cu lizozomul.

Digestia în heterolizozomi şi în autolizozomi este incompletă, unele materiale nefiind digerabile. Lizozomii care, deşi şi-au terminat funcţia digestivă, conţin încă resturi nedigerabile se numesc lizozomi terţiari, telolizomi sau corpi reziduali şi vor fi eliminaţi în cea mai mare parte prin procesul de exocitoză. În cazul celulelor care nu se divid (neuronii, celulele musculare) corpii reziduali se pot întâlni în celulele în vârstă, formând granule de lipofuscină. În corpii reziduali se mai pot întâlni: figuri mielinice, ce reprezintă produşi de degradare a fosfolipidelor, pigmenţi hemoglobinici sub forma granulelor de

hemosiderină, substanţe injectate.Biogeneza lizozomilor începe în reticulul endoplasmic rugos, unde sunt sintetizate proteinele

componente (structurale şi enzimatice) ale lizozomilor. Microveziculele formate în RER şi care transportă hidrolazele acide pot fi împachetate în sistemul GERL (scurtcircuitând structurile golgiene) sau în veziculele de condensare. (Fig. 5.48)

Fig.5.48. Formarea lizozomilor

1- Complexul Golgi; 2-Reticul endoplasmic neted; 3-Reticul endoplasmic granular; 4- Veziculă autofagică; 6- Veziculă de fagocitoză; 7- Corp dens; 8- Corp multivezicular; 9- Endocitoză; 10-Exocitoză

Implicarea lizozomilor în patologie

Lizozomii pot fi implicaţi într-o serie de procese patologice determinate de diverse substanţe (medicamente, toxine microbiene), introduse în celulă prin endocitoză, sau de unele boli congenitale. Sunt descrise în aceste condiţii modificări ale structurii şi funcţiei lizozomilor precum: a) alterări morfologice şi funcţionale (creşteri în volum,

intensificarea sau reducerea funcţiei datorită acumulării în exces a substanţelor toxice endocitate); b)

99

alterări ale activităţii, prin activarea sau inhibarea mai multor hidrolaze acide; c) alterări ale stabilităţii membranei, cu eliberarea enzimelor lizozomale în citoplasmă sau extracelular, provocând distrugerea matricei ţesuturilor.

Astfel, vitamina K şi expunerea prelungită la soare produc ruperea membranelor lizozomale cu distrugerea celulelor epidermice. Unele bacterii vii (bacilul turbeculozei, al leprei) sau toxoplasma (un protozoor parazit) inhibă fuziunea lizozomilor primari cu veziculele de endocitoză, permiţând acestor microorganisme să distrugă celulele care le-au fagocitat. Uneori fuziunea lizozomilor primari cu veziculele endocitate are loc prematur, înainte ca membrana plasmatică să fi închis complet vezicula, încât conţinutul enzimatic lizozomal este eliminat în spaţiul extracelular, producând inflamaţii (exemplu: în reumatism, în artrita gutoasă), afecţiuni în care se foloseşte colchicina, care inhibă fuziunea lizozomilor cu veziculele de endocitoză, împiedicând trecerea enzimelor lizozomale în mediul extracelular. În mucolipidoza II (sau boala cu celule I), enzimele lizozomale sunt lipsite de “semnalul de recunoaştere” (manoză-6-P) şi din acest motiv sunt eliminate şi nu mai pot fi recaptate, nefiind recunoscute.

Lipsa unei enzime din setul de hidrolaze acide se datorează unui defect genetic şi determină apariţia bolilor de depozit, denumite şi tezaurimoze lizozomice, care se manifestă prin acumularea, în lizozomii deficienţi, a substanţelor ce nu pot fi digerate din lipsa unei enzimei sau mai multor enzime. Astfel se acumulează lipide sau poliozide nedigerate, care, în final, ocupă celula şi compromit funcţia ei, afectând organe precum creierul, ficatul, splina.

În ultimii ani se foloseşte terapia lizozomotropică, care constă în administrarea unor medicamente legate de un vehicul transportor. Lizozomii desfac legătura dintre medicament şi vehiculul transportor, medicamentul trecând în citoplasma celulei bolnave, în timp ce transportorul este digerat.

În orice necroză celulară se distrug şi lizozomii încât trec în sânge unele enzime, care permit precizarea diagnosticului (exemplu în necroză hepatică sau miocardică).5.6.2. PEROXIZOMII

Peroxizomii (peroxysoma) sunt organite celulare comune şi permanente, care se caracterizează printr-un bogat conţinut în peroxidaze, enzime care catalizează reacţia de formare (oxidaza) şi de descompunere (catalaza) a peroxidului de hidrogen (sau a apei oxigenate H2O2).

Au fost observaţi la microscopul electronic în 1954, în rinichi de către RHODIN şi denumiţi “microbodies”. Mai târziu, DE DUVE şi colaboratorii, în urma unor cercetări de fracţionare a hepatocitului, le-au considerat ca organite distincte, ce au ca enzime marker: uratoxidaza, catalaza şi D-aminoacidoxidaza. În celulele din cotiledoanele plantelor au fost descrişi sub denumirea de glioxizomi, deoarece conţin glioxilat şi participă la transformarea lipidelor în carbohidraţi. Denumirea de glioxizomi este acceptată şi în cazul celulelor animale, pentru acei peroxizomi care, pe lângă alte enzime peroxizomale, mai conţin cel puţin două enzime ale ciclului glioxilat (malat-sintetaza sau izocitrat-liaza).

Forma, dimensiuni şi număr. Peroxizomii au o formă sferică sau ovală, uneori neregulată cu prelungiri. Au dimensiuni de 0,5 - 1 nm, variabile de la o celulă la alta. În funcţie de talia lor se deosebesc două categorii de peroxizomi: macroperoxizomi, cu diametrul de o,5 - 1,5 nm şi microperoxizomi, cu diametrul de 0,1 - 0,4 nm.

Numărul peroxizomilor apare diferit de la un tip de celulă la altul, iar în aceeaşi celulă, în funcţie de momentul ei de activitate. În unele celule (exemplu celula hepatică), numărul peroxizomilor depăşeşte cu mult pe cel al lizozomilor.

Fig.5. 49. Organizarea ultrastructurală a peroxizomului

1- Reticul endoplasmatic rugos; 2- Reticul endoplasmatic neted;2- Mitocondrie; 4- Peroxizom: a- membrană, b- matrice, c- cristaloid

Organizarea ultrastructurală a peroxizomilor cuprinde: o endomembrană, de 6,5 - 8 nm grosime şi o matrice fin granulară, mai densă la fluxul de electroni decât matricea lizozomală. La unii peroxizomi, în matrice se observă o zonă centrală densă, numită miez sau cristaloid, care la un grosisment puternic apare format dintr-un mănunchi de tubuli paraleli şi denşi la fluxul de

100

electroni, care pe secţiune transversală dau imaginea unui fagure de miere. La unii peroxizomi se mai observă în matrice prezenţa unei plăci marginale, cu aspect de regiune densă, îngroşată la periferie, cu funcţie încă neelucidată. Cristaloidul nu apare decât la unele specii şi conţine uratoxidaza. (Fig. 5. 49)

Endomembrana peroxizomală, deşi prezintă o compoziţie asemănătoare cu a membranei reticulului endoplasmic, diferă de aceasta prin unele polipeptide şi enzime din structura sa. S-a putut observa, în unele cazuri atât o continuitate între membrana microperoxizomilor şi a reticulului endoplasmic neted, dar şi o continuitate a membranei de la un peroxizom la altul, formând un “reticul peroxizomal”, diferit de reticulul endoplasmic.

Biogeneza peroxizomilor se poate realiza direct din reticulul endoplasmic prin dilatarea şi desprinderea unor părţi terminale ale cisternelor, care sunt pozitive pentru catalază. Mai frecvent, peroxizomii se formează prin reticulul endoplasmic - complexul Golgi, unele enzime peroxizomale sintetizându-se în reticulul endoplasmic rugos, iar altele (catalaza, uricaza) în ribozomii liberi, după care sunt dirijate spre peroxizomi direct prin citosol.

În compoziţia chimică a peroxizomilor sunt prezente proteine, lipide şi enzime speciale, precum: catalaza (33% din proteinele peroxizomale, enzimă marker), uratoxidaza (uricaza), enzimele ciclului glioxilat, D-aminoacidoxidaza. Aceste enzime diferă ca număr şi specificitate de la un peroxizom la altul. Astfel, peroxizomii renali nu conţin sistemul enzimatic al beta-oxidării.

Funcţţiile peroxizomilor sunt :1. Intervin în metabolismul peroxidului de hidrogen, într-o primă etapă în producerea

acestuia, cu ajutorul oxidazelor, care folosesc oxigenul molecular pentru oxidarea unor substraturi variate, producând peroxidul de hidrogen ( H2O2 ), un produs toxic pentru celule. În etapa următoare, peroxidul de hidrogen este descompus, cu ajutorul catalazei, în oxigen şi apă.

2. Intervin în metabolismul acizilor nucleici deoarece prin uratoxidază, participă la degradarea purinelor (adenina şi guanina).

3. Participă la reglarea metabolismului glucozei, prin enzima denumită alfa-hidroxiacidoxidaza, care catalizează oxidarea lactatului la piruvat. Prin alfa-hidroxiacid-oxidaza şi D-amino-acidoxidaza (sau aminotransferaza), peroxizomii participă şi la procesul de gluconeogeneză (prin care se sintetizează glucoză pe seama unor precursori neglucidici). Cu ajutorul acestor enzime se realizează transferul ireversibil al grupărilor amino de la unii aminoacizi (leucina, fenilalanina) formându-se în acest fel alfa-cetoacizii care reprezintă substratul pentru gluconeogeneză.

4. Participă la beta-oxidarea acizilor graşi, împărţind această funcţie cu mitocondria, fiind însă mai puţin activi, încât numai 1/4 - 1/5 din totalul oxidării acizilor graşi are loc în peroxizomi. Caracteristic apare faptul că peroxizomii oxidează acizii graşi, cu lanţ lung de atomi de carbon până când lanţul s-a scurtat la 6 atomi de carbon, după care oxidarea este realizată de mitocondrii.

5. Produc acetil coenzima A şi reduc NAD+ la NADH, ambele substanţe fiind utilizate de mitocondrie pentru producerea de ATP.

6. Participă la detoxificarea unor molecule deoarece membrana peroxizomilor este foarte permeabilă pentru ioni şi moleculele cu greutate moleculară mică. Astfel, jumătate din etanolul consumat este oxidat în acetaldehidă.

7. Sintetizează plasmalogenii (substanţe asemănătoare cu fosfolipidele), care intră în proporţie de 10% în componenţa unor membrane.

8. Produc căldură, intervenind în termogeneză. Astfel numărul lor e crescut în ţesutul adipos brun.

Implicaţii medicale. Peroxizomii sunt afectaţi în unele boli congenitale, fie prin absenţa catalazei ( acatalasemie), fie prin reducere numerică şi alterarea conţinutului enzimatic, în sindromul cerebro-hepato-renal (Zellwegar). Este descrisă o reducere a funcţiei de oxidare a acizilor graşi cu lanţ lung de atomi de carbon în adreno-leuco-distrofii, boli genetice letale caracterizate prin distrugerea progresivă a substanţei albe din creier şi a corticosuprarenalei.

S-a observat o relaţie între peroxizomi şi cancer, peroxizomii lipsind total în tumorile cu proliferare rapidă.

Peroxizomii cresc numeric şi în dimensiuni în unele infecţii virale (exemplu, în hepatită) sau după administrarea de medicamente ce scad lipemia. Hipertiroidia determină o proliferare hepatică a peroxizomilor şi în consecinţă o creştere remarcabilă a activităţii catalazei şi a beta-oxidării acizilor graşi cu lanţ lung de atomi de carbon.

5.7.Incluziunile celulare

101

Incluziunile (sau pseudoincluziile) celulare, sau citoplasmice (inclusiones cytoplasmicae) sunt formaţiuni prezente în matricea citoplasmatică în care pot fi depozitaţi temporar sau definitiv diferiţi produşi ai metabolismului. Aceste depuneri, denumite incluziuni pot conţine: a) substanţe de rezervă (proteine, glucide, lipide, vitamine, minerale, cristale şi cristaloizi); b) produşi de elaborare (granule de zimogen, granule de mucus, de pigment, hormoni); c) produşi de dezasimilaţie (pigmentul lipofuscinic).

Proteinele se depozitează ca substanţe de rezervă în fibrele musculare, hepatocite şi în vitelusul oului, putându-se prezenta ca granule fine sau mase omogene. Se pot evidenţia prin reacţia MILLON (când apar roşii), prin reacţia xantoproteică ( când apar galbene) şi prin impregnări argentice (când apar brune). (Fig.5.50)

Lipidele se prezintă sub forma unor picături sferice de diferite mărimi. Ele se evidenţiază în secţiuni, obţinute la criostat, unde se pot colora în galben (cu Sudan III), în roşu (cu SARLACH), în negru (cu Sudan negru). Lipidele sunt frecvente în: hepatocite (în cantităţi diferite în funcţie de diverse stări fiziologice şi patologice); - în celulele producătoare de hormoni steroizi din corticosuprarenală, ovar, corp galben, testicul, unde formează substratul în steroidogeneză. În lipocitele din ţesutul adipos alb, lipidele formează o bulă mare, ce ocupă aproape în întregime celula, pe când, în ţesutul adipos brun apar forme de picături mici, dispersate în citoplasmă.

Fig.5.50. Incluziuni celulare1- Granule; 2-Bocuri; 3- Depozite perinucleare; 4—Granule de cherato-hialină şi eleidină (în

celulele epiteliale); 5- Mucopoliozide neutre (în glandele uterine); 6- Mucopoliozide acide în celulele cervixului); 7- Adipocit alb; 8-9 Vezicule cu lipide (în celula luteinică); 10-Cristale Reinke ( în celula Leydig, din testicul); 11- Granule de zimogen (în celulele seroase); 12-Hemoglobină (în hematie);13-Melanină (în melanocite); 14- Vitamina C; 15- Cristale de colesterol

102

Glucidele se depozitează sub formă de glicogen, în special în hepatocite şi în fibrele musculare. Histochimic se evidenţiază prin metoda PAS (periodic acid SCHIFF) sau prin colorare cu carmin BEST, când apar sub formă de roşu violaceu, grupate în grămezi sau plaje. La electronomicroscop, glicogenul poate apare: a) sub formă de particule mari, neregulate sau în formă de rozetă cu diametrul de 150 nm (particule alfa); b) cu aspect de particule mici, cu formă de bastonaşe lungi de 20 - 30 nm (particule beta). În unele boli de depozit sau în diabet, glucidele pot apare şi în nucleu.

Incluziuni citoplasmatice

Denumire Conţin :Incluziuni cu substante de rezervă proteine,lipide, glucide,vitamine, mineraleIncluziuni cu produsi de elaborare hormoni,granule de zimogen, granule de mucigen, vezicule

de secreţie, etc.

Incluziuni cu pigmenti endogeni

a.Carotenoizi : lipocromi, luiteina, caroten protidele (iodopsina, rodopsina, caroten-albumina) ;

b.Cromolipozi (de dezasimilaţie): lipofuscina, hemofuscina ;

c.melanici : melanina

d. cu nucleu tetrazolic : hemoglobina, mioglobina, hemosiderina ;

Pigmenti exogeniParticule de cărbune (în antracoză) ;Particule de fier (în sideroză) ;Particule de siliciu (în sideroză)

Vitaminele se pot evidenţia în epitelii prin fluorescenţă naturală (vitamina A), sau prin impregnaţie argentică (metoda Cater) în corticosuprarenală, gonade, hepatocite şi fibre musculare.

Incluziile minerale de fier, cupru, potasiu, calciu se prezintă cu aspect de granule, ce pot fi evidenţţiate prin metode citochimice specifice.

Incluziile cristaloide sunt prezente în citoplasma celulelor interstiţiale din testicul sub forma cristalelor REINKE, fine, polimorfe.

Produşii de elaborare apar sub forma unor incluzii diferite precum: granulele de zimogen (la polul apical al celulelor seroase din pancreas); granulele de mucigen (la polul apical al celulelor mucoase şi în celulele caliciforme); hormonii (în celulele glandelor endocrine); pigmenţi (melanina în melanocite). Aceste incluzii se evidenţiază prin diferite metode histochimice: cu roşu Magenta (zimogenul), cu mucicarmin (mucusul) sau prin colorare naturală proprie în cazul pigmenţilor.

Pigmenţii pot fi de origine endogenă sau exogenă.Pigmenţii endogeni sunt reprezentaţi de: carotenoizi, cromolipoizi, pigmenţi melanici şi

pigmenţi cu nucleu tetrazolic.Carotenoizii sunt de obicei asociaţi cu lipidele şi sunt reprezentaţi de: lipocrom (pigmentul

ţesutului adipos, la cabaline), luteina (în celulele corpului galben din ovarul mamiferelor), carotenproteidele (carotenalbumine, iodopsina şi rodopsina din celulele cu conuri şi bastonaş din retină).

Cromolipoizii sunt: pigmenţi de culoare brună sau neagră (lipofuscina), rezultaţi în urma dezasimilaţiei în neuroni, hepatocite, zona reticulară a corticosuprarenalei, miocard, celulele interstiţiale Leydig, sau hemofuscina întâlnită în focare hemoragice.

Pigmenţii melanici sunt de culori diferite: neagră, brună sau galbenă. Cel mai cunoscut este melanina, prezentă în melanocitele pielii, coroidei, proceselor ciliare, irisului şi stratului pigmentar din retină.

Pigmenţii cu nucleu tetrazolic sunt reprezentaţi de: hemoglobină (în eritrocite), mioglobina (în muşchi), hemosiderina (în celulele sistemului macrofagic monocitar din măduva hematogenă, ficat, pulmoni).

Pigmenţii de origine exogenă provin din mediul extern şi sunt încorporaţi prin aer sau prin furaje, producând impregnarea ţesuturilor cărora le imprimă devieri de la coloraţia naturală specifică. Astfel, impregnarea cu particule de praf (cărbune) produce antracoza, cu localizări mai frecvente în pulmoni la carnasiere, în limfocentrul bronşic, la rumegătoare şi în mucoasa duodenală la păsări; - impregnarea cu pulberi de fier produce sideroza cu localizare predominant pulmonară; impregnarea cu pulberi de siliciu (nisip) produce silicoza, frecventă la ovinele ce pasc pe terenuri cu nisipuri foarte

103

fine; furajele bogate în caroten (exemplu morcovul) imprimă o coloraţie gălbuie ţesuturilor la suine şi la păsări datorită carotenilor din vitelus.

6. Reproducerea celulara

Reproducerea celulară este fenomenul prin care se asigură continuitatea în timp a celulelor şi constă în esenţă în faptul că dintr-o celulă se obţin două celule. Acest proces are loc în cursul diviziunii celulare, care devine posibilă numai după ce a avut loc o reproducere biochimică sau moleculară, care necesită atât materiale nutritive şi energie, cât şi informaţie genetică.

Reproducerea biochimică se produce în cel puţin 4 faze: 1) acumularea de substanţe anorganice; 2) sinteza enzimatică a unor substanţe organice simple (aminoacizi, monozaharide etc.); 3) sinteza proteinelor şi 4) sinteza (sau replicarea) ADN-ului, care este esenţială pentru declanşarea diviziunii.

În cursul reproducerii biochimice are loc dublarea masei celulare, duplicarea componentelor şi se produce un complex de evenimente ce se succed ciclic, realizându-se un ciclu celular.

6.1. Ciclul celular

Ciclul celular(cyclus cellularis) sau ciclul de viaţă al unei celule este perioada de timp cuprinsă între momentul apariţiei unei celule şi momentul terminării propriei diviziuni. Ciclul vieţii celulare cuprinde două mari perioade sau faze: a) diviziunea celulară (notată cu M de la mitoză) (periodus mitoticus) şi b) interfaza sau intercineza (periodus intermitoticus), perioada dintre două diviziuni succesive sau perioada ce precede diviziunea. Mult timp s-a considerat în mod greşit că în interfază (în perioada situată în afara diviziunii) “celula se odihneşte”. Prin folosirea metodelor biologiei celulare, s-a observat că interfaza este perioada din viaţa celulei cu maximă activitate metabolică, deoarece în cursul ei se produce sinteza ADN-ului, ARN-ului şi a proteinelor din celulă.

Etapele ciclului celular

Faze Perioade Puncte de restricţiePerioada presintetică (G1)

Interfaza Punct de restricţie (R 1)Perioada sintetică (S)Perioda Postsintetica (G2)

Punct de restricţie (R2)ProfazaPrometafaza

Mitoza MetafazaAnafazaTelofaza

În timp ce sinteza ARN şi a proteinelor are loc în toată interfaza, sinteza ADN are loc numai într-o anumită perioadă, numită perioada sintetică (şi notată cu S) care este precedată de o perioadă presintetică (notată cu G1) şi succedată de o perioadă postsintetică (notată cu G2).

Un ciclu celular complet (cu durata de circa 16 ore) cuprinde patru perioade: 1) G1 (intervallum ambiguum s.postmitoticum))- intervalul de timp de 5 ore de la sfârşitul mitozei până la începutul sintezei de ADN; 2) S - perioada sintezei de AND( synthesis genomica) de circa 7 ore; 3) G2 (intervallum premitoticum) - intervalul de timp de la sfârşitul sintezei de ADN şi începutul diviziunii de circa 3 ore şi 4) M - diviziunea celulară de circa 1 oră.

La celulele eucariote ciclul celular durează 10-25 ore. Durata lui variază în funcţie de specie, tip celular şi chiar de la o celulă la alta în cadrul aceluiaşi ţesut. Dintre perioadele ciclului, perioada G1

are durata cea mai variabilă, putând să difere, la unele celule, în timp ce perioada S sau G2 este cea mai constantă pentru un anumit tip celular. Astfel există celule care se divid foarte rapid, parcurgând ciclul în 8 ore, în timp ce altele se divid mai rar, având ciclul de 100 zile sau mai mult. (Fig.6.1)

104

Fig.6.1. Diagrama ciclului celular

G0_- Perioada de repausG1 –Peroada presinteticăS – perioada sinteticăG2 – Perioada postsintetică

Există două momente denumite puncte de restricţie a căror depăşire permite parcurgerea etapelor următoare. Primul şi cel mai important punct de restricţie este între perioadele G1 şi S1, iar cel de-al doilea este între perioadele G2 şi M. Într-o populaţie de celule, momentul depăşirii punctului de restricţie (punctul R) diferă de la o celulă la alta, încât nu toate celulele parcurg în acelaşi timp etapele ciclului celular, găsindu-se în diferite etape. Datorită acestui aspect populaţiile celulare sunt asincrome.

Nu se cunoaşte precis care este factorul care determină trecerea unei celule de mamifer dincolo de punctul R. Practic se consideră că depăşirea punctului de restricţie G1/S depinde de realizarea unei concentraţii prag a unei proteine instabile, denumită proteina U de la “unstable”. Într-o celulă, proteina U poate trece pragul concentraţiei numai când este sintetizată rapid. În momentul realizării pragului de concentraţie, proteina U determină începerea replicării ADN şi în consecinţă trecerea celulei din faza G1 în S. Inhibarea sintezei proteinelor şi în mod implicit a sintezei proteinei U poate explica prelungirea fazei G1.

Existenţa punctului de restricţie G1/S constituie o rezervă de supravieţuire a celulei, care în condiţii vitrege, sintetizează în primul rând “proteine de întreţinere”, iar sinteza proteinei U va fi redusă, încât deşi celula nu se divide, ea rămâne vie pentru perioade lungi de timp, chiar şi în condiţii de “inaniţie severă”. În condiţii în care celula este lipsită de aport nutritiv în alte perioade ale ciclului celular, ea nu va supravieţui. În acest mod, punctul de restricţie G1/S apare ca un “punct de odihnă” sigur pentru celulele care din cauza condiţiilor de creştere sau interacţiunilor cu alte celule trebuie să-şi oprească diviziunile. Celulele care se află oprite în această stare stabilă se află în faza “G0” a ciclului celular.

Un alt punct de restricţie se află la sfârşitul perioadei G2. Inhibarea sintezei proteinelor în această fază împiedică intrarea celulei în diviziune. Se consideră că la sfârşitul perioadei G2 este activată o proteinkinază solubilă, care catalizează fosforilarea proteinelor din membrana nucleară şi a histonelor H1. Fosforilarea proteinelor din membrana nucleară induce dezasamblarea învelişului nuclear, iar fosforilarea histonelor H1 produce condensarea cromozomilor, fenomen caracteristic diviziunii.

În raport cu modul în care parcurg ciclul celular, se disting trei categorii de celule:I - Celulele care şi-au pierdut capacitatea de a se divide, după parturiţie, fiind oprite în faza

G1, ca de exemplu: neuronii, celulele musculare.II - Celulele care au o capacitate scăzută de a se divide (hepatocitele, unele celule

endocrine), dar care în condiţii speciale se pot divide rapid. Astfel, hepatocitele se divid rapid după hepatectomie, refăcând celulele pierdute.

III - Celulele care se divid rapid, ca de exemplu celulele măduvei osoase hematogene, din epiderm, din epiteliul mucoasei intestinale, celulele liniei germinative spermatogene. Aceste celule se pot găsi în ţesuturi în două compartimente (grupe) celulare: a) un compartiment proliferativ, ce cuprinde celulele care se divid rapid şi b) un compartiment neproliferativ, ce cuprind celule care nu se divid decât în anumite condiţii. Astfel, se petrec fenomenele în ţesuturile în care o parte din celulele materne se pierd în mod fiziologic, ca de exemplu celulele din epiteliul mucoasei intestinale, care se

105

descuamează după 3-5 zile; hematiile care se distrug după 120 zile de viaţă. Pierderile de celule mature sunt compensate prin trecerea constantă a unor celule de rezervă, numite şi celule sursă, sau celule stem, aflate în faza G0, din compartimentul neproliferator în compartimentul proliferator. Trecerea din faza G0 se face sub acţiunea unor stimuli specifici, reprezentaţi de substanţele mitogene, adică de cele ce induc mitoza, precum: eritropoietina, factorii de creştere ai unor celule (ai nervilor, ai fibroblastelor), poliamina (exemplu putrescina), hormoni (estrogeni). Pot acţiona însă şi factori tisulari, cum sunt chalonele (peptide sau glicoproteine), care inhibă diviziunile celulare.

Tip Modalitati Faze Etape StadiiInmugurire

Diviziunea Clivajdirectă (amitoza)

Sciziparitate

ProfazaMitoza Prometafaza(Diviziunea Metafazanereducţională) Anafaza

Telofaza

Meioza I(reductională)

Profaza I LeptonemaZigonemaPachinemaDiplonemaDiachineza

Prometafaza IDiviziunea Meioza Metafaza Iindirectă (Diviziunea Anafaza I

reducţională) Telofaza IInterfaza

Meioza II(nereducţională)

Profaza IIPrometafaza IIMetafaza IIAnafaza IITelofaza II

6.2. Diviziunea celularĂ

Diviziunea celulară (divisio cellularis) este acea perioadă a ciclului celular în care se realizează distribuirea materialului genetic la cele două celule fiice. Există două modalităţi de realizare a diviziunii celulare: a) diviziunea directă (sau amitoza) şi b) diviziunea indirectă, care poate fi de două feluri: mitoză sau meioză.

6.2.1.Diviziunea directă

Diviziunea directă sau amitoza (amitosis) reprezintă forma inferioară de reproducere celulară, caracteristică organismelor unicelulare. La metazoare apare fie în procesele de regenerare, fie în condiţii patologice în unele procese tumorale. Se caracterizează prin lipsa aparatului mitotic, iar materialul genetic este inegal distribuit, putându- se produce erori în distribuţie. Cele mai frecvente modalităţi de diviziune directă sunt: înmugurirea, sciziparitatea, clivajul.(Fig.6.2.)

106

Fig.6.2. Diviziunea directă - amitoza

6.2.2.Diviziunea indirectă

Se caracterizează prin procese mai complexe, ce constau în modificări sincrone în citoplasmă (cytokinesis) şi nucleu (nucleokinesis), ce realizează o distribuire egală a materialului genetic la celulele fiice.

Există două tipuri de diviziune indirectă: a) mitoza sau diviziunea ecuaţională, întâlnită la celulele somatice şi produce celule diploide; b) meioza sau diviziunea reducţională, întâlnită numai la celulele gametogene şi produc celule haploide.

107

Fig. 6.3. Mitoza1- Centrul celular; 2- Spirem; 3- fusul de diviziune;4- Cromozom; 5-Placă

metafazică; 6- Inel contractil

108

6.2.2.1.Mitoza

Mitosa (mitosis) are o durată totală de circa 60 minute la om şi se desfăşoară în patru faze: a) profaza (prophasis), împreună cu o fază intermediară - prometafaza (30 minute sau 50% din durata totală); b) metafaza (metaphsis) (8 minute sau 13,4%); c) anafaza (anaphasis) (4 minute sau 6,6%); d) telofaza (telophasis)(18 minute sau 30%).

ProfazaSe remarcă printr-o serie de fenomene caracteristice, ce se desfăşoară atât în citoplasmă,

cât şi în nucleu. (Fig.6.3.)În citoplasmă: 1) Devine vizibil cel de-al II-lea centru celular (centrozom), dublarea centriolilor realizându-se

prin asamblarea unui centriol nou (centriolum filiale), din depozitul de tubuline al citoplasmei. Polimerizarea tubulinelor are loc începând din faza “S”.

2) Separarea şi îndepărtarea centriolilor centrosomului spre polul celulei, între ei realizându-se un fus de diviziune (fusus mitoticus), format din filamente structurate pe seama microtubulilor.

În nucleu: 1) dispare nucleolul; 2) se condensează cromatina nucleară sub forma unui spirem (sau ghem) (glomus), iniţial compact (glomus compactum) şi apoi lax (glomus dispersum) din care se desprind cromozomii sub formă de bastonaşe.

În nucleol - componenta amorfă se desprinde şi se amestecă cu sucul nuclear, iar restul structurii se ataşează pe fragmentele cromozomilor SAT.

În prometafază: 1) dispare nucleolema (membrana nucleară) prin acţiunea proteinkinazei solubile (conţinute în lizozomi) care produce fosforilarea proteinelor din membrană; 2) cromozomii încep să interacţioneze cu fibrele fusului de diviziune. Ei execută mişcări oscilatorii agitate, iar datorită contracţiei tubulinei, cromozomii se deplasează spre mijlocul fusului de diviziune. Viteza lor de deplasare variază de la un cromozom la altul, ultimul ajungând cromozomul X.

În metafază:1) Cromozomii sunt dispuşi la nivelul ecuatorului fusului(equator fusi) de diviziune, cu axul lor

lung perpendicular pe axul fusului, realizând o placă metafazică (lamina equatorialis).2) În placa metafazică, cromozomii se despică (clivează) longitudinal, încât cele două

cromatide surori se despart. În urma acestei clivări longitudinale se dublează numărul de cromozomi (exemplu la taurine, din 60 rezultă 120 cromozomi monocromatidici), iar materialul genetic se distribuie în mod egal la celulele fiice.

Fiecare din fibrele fusului de diviziune este alcătuit dintr-un mănunchi de circa 100 microtubuli şi proteinele asociate lor. În structura fusului de diviziune (fusus mirtoticus) se disting două categorii de fibre, în funcţie de modul lor de ancorare la capete: a) fibre polare (centrozom-centrozom) (microtubulus continuus), cele mai numeroase, dispuse de la un pol la altul; b) fibre cinetocorice (centrozom-kenetocor) sau fibre de jumătate de fus (microtubulus chromosomaticus), ancorate cu un capăt pe centrozom şi cu celălalt pe cinetocorii cromatidelor (câte doi pentru fiecare centromer al unui cromozom). Fibrele cinetocorice sunt alcătuite din mănunchiuri de microtubuli ce radiază în direcţie opusă de pe cea cinetocori ai fiecărui cromozom. Ele servesc la aşezarea cromozomilor în placa metafazică, având capetele pozitive (+) blocate în cinetocori, iar capetele negative (-) libere. (Fig.6.4.)

Fig.6.4. Schema fusului de diviziune

A-Începutul metafazei; B – Sfârşitul metafazei1- Centrozom; 2- Cromozom; 3- Fibră polară; 4- Fibră cinetocorică

109

Dacă fusul este distrus nu se mai produce diviziunea celulară, pe acest fapt bazându-se utilizarea unor medicamente citostatice (ca vinblastina sau vincristina).

Anafaza

Se caracterizează prin deplasarea cromatidelor devenite cromozomii fii spre cei doi poli ai celulei. Deplasarea spre polii celulei este rezultatul a două evenimente independente: a) mişcarea spre poli a fibrelor cinetocorice prin depolimerizarea capetelor libere (negative) ale microtubulilor şi antrenarea cu ele a cromatidelor ataşate; b) alungirea prin polimerizare la capătul pozitiv (+) a fibrelor polare, producându-se distanţarea celor doi poli. Alunecarea fibrelor polare are la bază sistemul motil microtubul-dineină.

Telofaza

Începe în momentul în care cele două grupe cromozomiale au ajuns la cei doi poli celulari şi fuzionează aparent formând câte un spirem. În jurul spiremului se reface învelişul nuclear prin defosforilarea proteinelor laminare. Totodată se refac nucleolii, datorită acţiunii cromozomilor SAT, iar nucleul îşi recapătă structura din interfază, cromatina luându-şi aspectul de reţea şi granule.

Clivarea citoplasmei la nivelul plăcii ecuatoriale, în cursul fenomenului denumit citodiereză sau citokineză (cytokinesis), începe prin apariţia unui şanţ pe suprafaţa celulei (constrictio cytoplasmatica), datorită activităţii unui inel contractil, prezent sub plasmalemă.

Inelul contractil (anulus equatorialis) este format dintr-un mănunchi de filamente de actină, ce începe să fie asamblat încă de la începutul anafazei. Inelul îşi micşorează diametrul prin depolimerizarea filamentelor sale, necesitând prezenţa ionilor de calciu.

Suprafaţa totală a celor două celule fiice este mai mare decât a celulei mamă, fapt ce necesită o biogeneză de plasmalemă. Se constată că biogeneza plasmalemei începe înaintea diviziunii, observându-se prin microscopia de baleaj că pe măsură ce celula trece din faza G1 în faza S şi apoi în faza G2, suprafaţa ei devine din ce în ce mai “păroasă” prezentând microvilozităţi care reprezintă rezerva de membrană necesară pentru învelirea celulelor fiice, ce au foarte puţini microvili.

În urma mitozei, dintr-o celulă mamă rezultă două celule fiice având aceeaşi cantitate de ADN şi acelaşi număr de cromozomi ca şi celula mamă. Gradul de asemănare al celulelor fiice cu celula mamă permite să se distingă patru forme de mitoză: homotipică, heterotipică, asimetrică şi de întinerire.

În mitoza homotipică ( sau homoplastică ) celulele fiice sunt asemănătoare între ele şi cu celula mamă. Este întâlnită la celulele nediferenţiate (foarte tinere).

În mitoza heterotipică ( sau heteroplastică ), celulele fiice sunt asemănătoare între ele, dar sunt mai mature, mai diferenţiate decât celula mamă, fapt pentru care se mai numeşte şi mitoză de diferenţiere.

În mitoza asimetrică ( homo-heteroplastică ), una din celulele fiice seamănă cu celula mamă, iar cealaltă este diferită.

În mitoza de întinerire (sau de dediferenţiere), celula mamă dă naştere la celule „mai tinere” (active), cu potenţialităţi biologice caracteristice formelor tinere (active) ale celulei mamă. Se întâlneşte la limfocit, care prin diviziune dă naştere la două limfoblaste.

Factorii care determină mitozele sunt încă insuficient precizaţi. Mitoza apare ca o fază obligatorie a ciclului celular ( în situaţia în care s-au depăşit punctele de restricţie) şi ca o consecinţă a dublării masei şi componentelor celulei, fiind declanşaţi de o serie de factori ce pot fi încadraţi în trei grupe: a) factori generali, ca: temperatura, lumina, hormonii (tiroidieni, hipofizari), vitamine; b) factori intracelulari, ca: modificarea raportului nucleo-citoplasmatic şi nucleolo-nuclear (ca şi cum volumul crescut al citoplasmei nu ar mai putea fi controlat de nucleu, făcând necesară diviziunea celulei); c) factori intercelulari, precum raportul care trebuie să existe, în fiecare ţesut, între celulele uzate şi cele care se divid. Sunt cei mai importanţi în cazul în care un grup de celule moare, se declanşează diviziunea unui alt grup de celule printr-un mecanism de retro-acţiune (“feed-back”), încât raportul între cele trei categorii de celule să rămână aproximativ acelaşi.

6.2.2.2. Meioza

110

Meioza (meyosis s. cyclus meioticus) se caracterizează prin faptul că reduce la jumătate numărul de cromozomi ( deci materialul genetic), încât plecându-se de la celule diploide, se ajunge la celule haploide, care conţin numai câte un cromozom din fiecare pereche de omologi şi

Fig.6.5. Comparaţie între mitoză şi meioză

111

numai un cromozom de sex. Este prezentă în procesul de maturare al gameţilor. Permite ca, prin procesul fecundării, din două celule haploide să rezulte o celulă diploidă, din care se poate dezvolta în mod normal întregul organism (Fig.6.5).

Meioza este alcătuită din două diviziuni indirecte care se succed fără ca între ele să se mai producă sinteza de ADN. Prima diviziune se numeşte meioza I şi este reducţională, în timp ce a doua diviziune se numeşte meioza II şi este nereducţională, apărând ca o mitoză homoplastică.

Meioza I apare mai complicată, cu o profază specifică în care se petrec fenomene caracteristice. Poate dura zile, luni şi ani de zile (în funcţie de specie), iar profaza este foarte lungă, ocupând 90% din această durată. Astfel, ovocitele primare rămân în profaza I până la pubertate, iar spermatogoniile intră în meioză numai la pubertate.

Profaza I (prophasis I) cuprinde 5 faze (etape, stadii) succesive: leptonema, zigonema, pachinema, diplonema şi diachinezis.

1) În leptonemă (leptonema), se produce condensarea cromatinei, încât cromozomii devin vizibili cu aspect de filamente lungi, cu diametrul neuniform. Ei se ataşează cu ambele capete de învelişul nuclear la nivelul unor structuri denumite plăci de ataşare . Fiecare cromozom deci este duplicat şi format din 2 cromatide surori, intim ataşate una de alta încât în lungul cromozomului se formează o lamă proteică, denumită axă. (Fig.6.6).

Fig. 6.6. Modificarea cromozomilor în profaza I a meiozei - schemă

A- Interfază; B-Leptoten; C-zigoten; D-Pahiten; E- Diploten şi daicinezisA, b, c, d - cromatide

2) În zigonemă (zygonema), caracteristic este fenomenul de sinapsă sau conjugarea (conjugatio) cromozomilor, care constă în faptul că, cromozomii omologi (chromosoma homologum)( din aceeaşi pereche), unul din setul matern şi altul din setul patern se apropie şi se alipesc, dar nu funzionează. Cromozomii omologi sunt legaţi unul de altul printr-o reţea proteică, denumită complex sinaptolemal (complexus synaptonematicus), ce se întinde pe întreaga lungime a cromozomilor, ancorându-se la cele două capete de învelişul nuclear. Complexul sinaptolemal realizează alinierea perfectă a celor doi cromozomi, încât genele alele să fie situate faţă în faţă. (Fig.6.7.)

112

Fig.6.7. Structura complexului sinaptolemal din cromozomul bivalent

1- Modul de recombinare; 2- Element central; 3-Elemente laterale;

a-b şi c-d – cromatide surori.

3) În pachinemă (pachynema), cromozomii sunt mai condensaţi. Pachinema începe în momentul în care sinapsa (synapsis) este completă şi are drept caracteristică fenomenul de crossing-over (decussatio), ce constă în ruperea unei cromatide materne şi a unei cromatide paterne în acelaşi punct din lungimea

cromozomului şi sudarea încrucişată a fragmentelor, încât un fragment situat iniţial pe un cromozom patern ajunge pe cromozomul matern şi invers.

Fiecare pereche de cromozomi omologi este denumită cromozom bivalent (chromosoma bivalens) sau tetradă (chromosoma tetravalens), deoarece fiecare cromozom omolog este clivat în două cromatide surori, încât într-o pereche există patru cromatide. (Fig.6.8)

Fig.6.8. Schema tetradei şi a fenomenului de crossing-over

113

1- Centromere; 2- Chiasma; a-b şi c-d –cromatide surori

Prin schimbul de fragmente între cromozomi omologi se realizează un schimb de gene, cu un rol extrem de important în ereditate, încât gametul unui individ va avea în final gene ce provin de la cromozomul patern, cât şi gene ce provin de la cromozomul matern. În acest fel, un cromozom bivalent, va cuprinde tot patru cromatide, din care una este paternă pură, alta maternă pură, iar cele două cromatide între care s-a efectuat schimbul de material genetic sunt mixte.

Acest schimb de gene între cromozomii omologi (chromosoma homologicum), denumit şi recombinare genetică sau fenomen de crossing-over este universal şi are importanţă foarte mare în transmiterea caracterelor ereditare.

Fig.-6.9. Comparaţie între mecanismele alinierii şi separarii cromozomilor în meioza I şi meioza II

4) În diplonemă (diplonema), cromozomii rezultaţi după crossing over (cromosoma meioticum) încep să se despartă (să realizeze desinapsa ). Ei rămân, însă, legaţi în punctele numite chiasme, în care s-a produs crossing-overul.

La ovocite, diplonema poate dura luni sau ani de zile, deoarece cromozomii se decondensează şi începe sinteza de ARN.

5) În diachinesis (diakinesis), încetează sinteza ARN-ului, cromozomii se condensează, se îngroaşă şi se detaşează de învelişul nuclear. Fiecare cromozom bivalent conţine patru cromatide, din care cromatidele surori sunt unite la nivelul centromerilor, iar cele nesurori, mixte, între care s-a produs crossing-overul sunt unite la nivelul chiasmelor.

În concluzie, în profaza I au loc trei importante fenomene caracteristice: 1) condensarea cromozomilor; 2) conjugarea sau sinapsa ( în zigonemă ) şi 3) schimbul de gene între cromatidele nesurori (sau crossing-overul ).

În prometafaza I ( prometaphasis I ) se produce dispariţia învelişului nuclear şi formarea fusului de diviziune.

În metafaza I ( metaphasis I ) cromozomii se ataşează de fibrele fusului de diviziune şi formează placa metafazică .

114

În anafaza I ( anaphasis I ) se produce deplasarea câte unui cromozom întreg (bicromatidic,cu două cromatide) din fiecare cromozom bivalent către un pol al celulei, pe când celălalt cromozom, tot bicromatidic, se deplasează spre polul opus. Diferenţa esenţială faţă de anafaza din mitoză constă în faptul că nu se despart şi nu migrează separat cromatidele fiecărui cromozom, ele rămânând legate la nivelul centromerului. (Fig.6.9)

Fig.6.10. Diagrama meiozei

Meioza II se realizează ca o mitoză obişnuită, având cele patru faze: profaza II cu prometafaza II (prometaphasis II), metafaza II (metaphasis II), anafaza II (anaphasis), telofaza II

115

(telophasis) . În metafaza II se despart cromatidele fiecărui cromozom, după care are loc deplasarea lor spre polii celulei, în timpul anafazei II. (Fig.6.10)

În concluzie, în cursul diviziunii reducţionale (a meiozei), celula se divide de 2 ori, în timp ce cromozomii se divid (despărţindu-şi cromatidele) numai o singură dată, în timpul metafazei II.

6.3.BAZELE MOLECULARE ALE REPRODUCERII CELULARE

Bazele moleculare ale reproducerii celulare se referă la trei fenomene esenţiale: 1) replicarea ADN; 2) transcrierea mesajului genetic şi 3) traducerea mesajului genetic în biosinteza proteinelor.

6.3.1. Structura şi replicarea ADN

Acidul deoxiribonucleic (ADN) constituie materialul genetic al tuturor vieţuitoarelor, care au în compoziţia lor acest acid nucleic.

Replicarea (sau duplicarea sau autoreplicarea) ADN-ului cromozomial şi distribuirea lui în mod egal în celulele fiice formează baza mecanismelor moleculare de transmitere a informaţiei genetice.

Replicarea ADN este procesul molecular prin care se realizează o copiere fidelă a moleculelor de ADN (a secvenţelor de nucleotide) în timpul duplicării cromozomilor. Dublarea cantităţii de ADN are loc în cursul biosintezei de ADN în faza S a ciclului celular, biosinteză care se numeşte replicare.

Structura ADN-ului

ADN-ul este o macromoleculă, compusă din două lanţuri de nucleotide foarte lungi, răsucite unul în jurul celuilalt într-o structură dublu-elicoidală (numită dublu-helix sau duplex de ADN).

Fiecare lanţ are: a) o parte constantă (ce poate fi asemănată cu coloana vertebrală) formată din dezoxiriboze, situate pe latura externă şi legate prin punţi diesterice şi b) o parte variabilă, reprezentată de secvenţa bazelor. Bazele sunt situate pe latura internă (între lanţuri) şi sunt reprezentate de două baze purinice (adenina — A şi guanina — G) şi două baze pirimidinice (timina — T şi citozina — C) (fig.6.11).

Fiecare lanţ este polarizat, deoarece la un capăt prezintă hidroxilul 5’ liber, iar la capătul opus hidroxilul 3’ liber. În mod convenţional se consideră că secvenţa în lanţ este „scrisă” de la 5’ spre 3’, aşa cum în proteine secvenţa este „scrisă” în direcţia amino-carboxil. Cele două lanţuri sunt antiparalele, având direcţia legăturilor fosfo-diesterice opusă, pe unul este de la 5’ la 3’, iar pe lanţul pereche de la 3’ la 5’.

Cele două lanţuri polinucleotidice sunt menţinute împreună prin legături de hidrogen între baze, existând două legături între adenină şi timină şi trei între guanină şi citozină.

Fig.6.11. Structura ADN-ului

Aranjarea bazelor în perechi este specifică, încât adenina este legată, în pereche, întotdeauna cu timina, iar guanina cu citozina. Această specificitate este determinată de factori spaţiali (sterici) şi de legăturile de hidrogen. Astfel, diametrul constant al duplexului de ADN (de 2 nm) face ca spaţiul dintre cele două lanţuri să fie de 1,1 nm, atât cât ocupă o

116

bază pirimidinică aranjată în pereche cu o bază purinică. Două baze purinice ar ocupa prea mult spaţiu, iar două baze pirimidinice prea puţin.

Pasul helixului este de 3,4 nm şi reprezintă intervalul la care se repetă structura helicoidală. Pe această distanţă se află zece nucleotide, deci 10 perechi de baze. Numărul de perechi de baze dintr-o moleculă de ADN variază de la câteva mii până la câteva milioane ( de exemplu, la E. colli molecula de ADN cuprinde 3,4 milioane perechi de baze).

Pe un lanţ polinucleotidic, considerat izolat, secvenţa bazelor nu este expusă nici unei restricţii; dar pe lanţul pereche secvenţa va fi strict determinată de specificitatea aranjării bazelor în perechi, încât lanţurile sunt complementare. Astfel, un lanţ este complementul celuilalt, la secvenţa GCTAG corespunzând pe lanţul opus secvenţa CGATC.

Complementaritatea lanţurilor polinucleotidice a permis lui WATSON şi CRICK (1953), descoperitorii structurilor în dublu helix a ADN-ului, să sugereze mecanismul replicării şi al transmiterii informaţiei genetice. Astfel fiecare lanţ acţionează ca o matriţă pentru formarea unui lanţ nou complementar cu el însuşi. În acest fel se poate replica ADN-ul (dubla cantitate de ADN), iar pentru că molecula de ADN funcţionează ca matriţă pentru propria sa formare, procesul a fost denumit autoreplicare. (fig. 6.12).

Fig.6.12. Autoreplicarea AND-ului

În biologia moleculară prin matriţă se înţelege o macromoleculă ce prezintă o suprafaţă de legare cu o anumită configuraţie spaţială. Pe fiecare loc de matriţă se poate lega în mod specific un singur fel de monomer, cel care are o configuraţie complementară cu a matriţei (fig. 124).

Replicarea ADN-ului

Replicarea ADN-ului prezintă următoarele caracteristici: 1) este semiconservativă, încât în fiecare moleculă de ADN nou formată, unul din lanţuri provine din molecula mamă (iniţială); 2) începe întotdeauna în acelaşi punct numit origine, din care pleacă pe fiecare lanţ câte o furculiţă de replicare, ce reprezintă locul în care se produce simultan dezrăsucirea ADN-ului parental şi în care din două lanţuri se formează patru lanţuri polinucleotidice.

Replicarea ADN-ului începe odată cu dezrăsucirea celor două lanţuri polinucleotidice din dublul helix al ADN parental. Dezrăsucirea este favorizată de ruperea unuia din cele două lanţuri la nivelul “coloanei vertebrale” de riboză-fosfat, la distanţă de circa 30 Å de furculiţa de replicare, cu ajutorul unei enzime. În continuare dezrăsucirea este uşurată de unele proteine specifice de dezrăsucire, care se leagă una după alta de ADN monocatenar, împiedicând răsucirea lui. Concomitent cu dezrăsucirea, pe fiecare din cele două lanţuri polinucleotidice se sintetizează un lanţ nou (o replică) cu secvenţă complementară de

nucleotide. Astfel pe fiecare din lanţurile parentale este sintetizat un ADN nou sub formă de fragmente mici (fragmente OKAZAKI) de circa 1000 nucleotide. În procesul sintezei ADN-ului intervin următoarele enzime:

1. ARN-polimeraza, ce sintetizează câte un fragment scurt de ARN (de circa 100 nucleotide) pe fiecare din lanţurile de ADN parental ce serveşte ca matriţă. Rezultă astfel un primer de ARN, necesar pentru începerea sintezei propriu-zise de ADN cu ajutorul polimerazelor.(Fig. 6.13)

117

Fig.6.13. Reprezentarea schematică a biosintezei de ADN

2. ADN-polimerazele denumite ADN-polimeraza I, II şi III în ordinea descoperirii lor la E coli, catalizează polimerizarea deoxiribonucleotidelor.

3. ADN-ligaza, ce leagă câte două capete ale unor fragmente de ADN ce fac parte dintr-un duplex, prin formarea unor legături fosfo-diesterice între cele două capete (unul cu OH în 3’, iar celălalt cu un fosfat la 5’). Se închid astfel discontinuităţile („spărturile”) din ADN. Reacţia este endergonică, energia fiind donată de către ATP.

4. ADN-topoizomerazele ( I şi II ) scindează reversibil dublexul de ADN, permiţând astfel rotaţia şi îndepărtarea tensiunii acumulate în timpul dezrăsucirii lanţurilor polinucleotidice.

Mecanismul molecular al biosintezei (replicării) de ADN cuprinde următoarele etape: 1) desprinderea (desperecherea) lanţurilor de ADN din molecula parentală; 2) sintetizarea, pe fiecare lanţ, prin acţiunea ARN-polimerazei, a câte unui primer de ARN; 3) sintetizarea, în continuarea primerului, a lanţurilor de ADN complementare matriţei, cu ajutorul ADN-polimerazei; 4) fragmentele OKAZAKI - se formează în direcţia 5’ - 3’ pe ambele lanţuri; 5) excizia fragmentului de ARN sub acţiunea ARN-polimerazei I încât pe măsură ce se îndepărtează câte un ribonucleotid, se adaugă imediat dezoxiribonucleotidul corespunzător; 6) legarea fragmentelor de ADN nou formate prin acţiunea ADN-ligazei.

6.3.1.1. Particularităţile replicării la eucariote

Diferenţele care există între replicarea de la procariote şi cea de la eucariote se datoresc complexităţii organizării cromatinei la eucariote, unde ADN-ul este complexat cu histone în nucleozomi, care se succed la intervale de circa 200 perechi baze în lungul ADN, încât fragmentele de ADN nou formate (OKAZAKI) sunt mai mici ca la procariote având 100-200 nucleotide, iar primerul de ARN numai 10-20 nucleotide.

Viteza replicării la eucariote este de 10 ori mai mică decât la procariote (de exemplu se replică 50 nucleotide pe secundă faţă de 500 la procariote). Astfel pentru întreaga replicare a unui cromozom uman, o singură furculiţă de replicare ar avea nevoie de 800 de ore, depăşind de circa 10 ori perioada S a ciclului celular.

Fig.6.14. Replicarea ADN-ului la eucariote

1- Puncte de origine; 2- Furculiţe de replicare; 3- Bule de replicare

Pentru a se putea încadra în faza S, replicarea începe pe fiecare cromozom în mai multe puncte de origine (circa 100 pentru fiecare cromozom uman). Pentru fiecare punct de origine apar două furculiţe de replicare, ce se deplasează pe direcţii opuse în lungul cromozomului generând nişte structuri denumite bule de replicare (fig. 6.14).

Originile furculiţelor de replicare apar în grupe (de 20-80) situate toate într-o anumită zonă. Fiecare grupă se numeşte unitate de replicare (sau replicon). Repliconii se activează treptat în faza S a ciclului, zonele de heterocromatină fiind ultimele activate. Furculiţele de replicare se deplasează cu aceeaşi viteză în tot cursul fazei S. Când ajung să se întâlnească pe tot cromozomul, replicarea se termină, iar cei doi cromozomi se despart.

Replicarea ADN-ului se produce paralel cu sinteza de histone, care are loc numai în faza S a ciclului celular. Odată sintetizate şi asamblate în nucleozomi, histonele nu mai părăsesc ADN-ul de care s-au legat încât miezurile nucleozomilor vechi trec numai pe unul din duplexuri, în timp ce pe celălalt duplex de ADN se leagă numai de miezurile nucleozomilor noi sintetizaţi.

Implicaţiile şi aplicaţiile medicale ale replicării ADN-ului constau în: a) apariţia mutaţiilor; b) sinteza reparatoare a ADN-lui şi c) inhibarea sintezei de ADN.

Apariţia mutaţiilor este rezultatul unor greşeli care apar în procesul de replicare a ADN-ului. Un anumit nivel de apariţie a mutaţiilor (de obicei scăzut) a fost necesar şi util în evoluţia speciilor, dar atunci când depăşesc acest nivel fac imposibilă supravieţuirea celulei, majoritatea mutaţiilor fiind dăunătoare. Din această cauză celulele au numeroase sisteme enzimatice de reparare a erorilor care

118

pot apare în ADN spontan sau induse de agenţi mutageni (fizici sau chimici). Mecanismele reparatorii sunt eficace, încât o mutaţie spontană apare la un milion de replicări ale genelor.

Pot să apară mutaţii punctiforme (prin înlocuirea unui singur nucleotid) sau mutaţii mari complexe, ca: deleţii (lipsa unor secvenţe din ADN), inserţii (secvenţe în plus de nucleotide). Frecvenţa mutaţiilor poate creşte foarte mult în urma acţiunii unor substanţe, denumite mutagene, precum: a) unele substanţe chimice (ce modifică direct bazele din ADN), agenţii alchilanţi (care fixează radicalii metil, etil etc.) actiflavinele, cofeina; b) radiaţiile ultraviolete; c) radiaţiile ionizante (ce produc ruperea unuia sau a ambelor lanţuri de ADN, pierderi de baze, modificări ale bazelor).

Unii din aceşti agenţi pot fi folosiţi în terapia cancerului, întrucât celulele maligne sunt mai sensibile la acţiunea lor (ca de exemplu, unii agenţi alchilanţi, radiaţiile ionizante).

Sinteza reparatorie a ADN-lui se produce într-o anumită perioadă de timp, încât există posibilitatea (în cazul celulelor care proliferează foarte rapid) ca să înceapă un nou ciclu de replicare înainte ca reparaţia să fie completă. În acest fel, celulele care proliferează foarte rapid sunt foarte sensibile la radiaţii, fapt ce permite folosirea radiaţiilor ionizante în tratamentul cancerelor.

Inhibarea sintezei de ADN este produsă de o serie de substanţe chimice, care pot fi folosite în practica medicală curentă - ca substanţe antimicrobiene, antivirale şi antitumorale (citostatice). Astfel: acidul nalidixic, un antibiotic, inhibă biosinteza ADN-ului; acidul fosfonoacetic, un agent antiviral, inhibă selectiv ADN-polimerazele virale şi din celula gazdă. Unele substanţe antitumorale (arabinozilcitozina, arabinoziladenina) inhibă sinteza de ADN, iar altele (neocarcinostatina - o proteină formată din 109 aminoacizi) produc rupturi în molecula de ADN.

6.3.2.Transcrierea mesajului genetic

În exprimarea informaţiei genetice (a mesajului genetic) există două etape: 1) transcrierea (copierea) informaţiei din ADN în ARN şi 2) traducerea informaţiei conţinută în ARN în sinteza de proteine. Sub formă prescurtată transmiterea informaţiei genetice este cuprinsă în dogma centrală a biologiei moleculare care se exprimă în formula:autoreplicare ADN transcriere ARN traducere proteine → →

Astfel, genele din ADN determină sinteza de proteine de către celulă, dar nu ADN-ul este matricea pe care se sintetizează proteinele, ci moleculele de ARN (Fig. 6.15).

Moleculele de ARN care poartă informaţia genetică necesară pentru biosinteza proteinelor se numesc ARN mesager (ARN-m).

ARN-ul mesager

Conceptul de ARN mesager (ARN-m) a fost introdus în biologia moleculară în 1961 de către JACOB şi MONOD care au presupus existenţa unui ARN care este sintetizat şi degradat foarte rapid, ce serveşte ca mesager al genei (aflată în nucleu), transferând informaţia de la nucleu la sediul sintezei proteinelor (ribozomi) - aflaţi în citoplasmă.

ARN mesager este o moleculă sintetizată pe matriţa de ADN, având o secvenţă a bazelor complementară ADN-matriţă. Pentru fiecare genă se sintetizează câte o moleculă de ARN-m, care va servi la rândul ei ca matriţă pentru sinteza proteinei codificată de gena respectivă.

119

Fig. 6.15. Reprezentarea schematică a transmiterii informaţiei genetice

În celulă, pe lângă ARN-ul mesager, mai există încă două categorii de ARN, implicate direct în biosinteza proteinelor: ARN-l de transfer şi ARN-ul ribozomal.

ARN-ul de transfer (ARNt) transportă aminoacizii activaţi la ribozomi, unde se realizează formarea legăturilor polipeptidice în secvenţa dictată de matriţa de ARNm.

ARN-ul ribozomal (ARNr) intră în componenţa ribozomilor, fără a i se cunoaşte precis rolul lui în biosinteza proteinelor.

6.3.3.1. Mecanismul molecular al biosintezei de ARN

ARN-ul este o macromoleculă lungă formată din ribonucleotide legate prin legături 3’-5’ fosfodiesterice. Numărul de nucleotide variază între 75 (în ARNt) şi câteva mii (în ARNm).

Toate tipurile de ARN sunt biosintetizate printr-un mecanism molecular asemănător, sinteza de ARN pe matriţă de ADN fiind catalizată de enzima denumită ARN-polimerază-ADN-dependentă (transcriptază).

Pentru realizarea sintezei de ARN sunt necesare următoarele elemente: 1) matriţa de ADN dublu helicoidal; 2) precursori activaţi, ca ribonucleozid-trifosfaţi (ATP, GTP, UTP, CTP); 3) ioni de magneziu sau alte metale bivalente. Sinteza de ARN se aseamănă cu sinteza de ADN prin: a) direcţia de sinteză (de la 5’ la 3’, care este antiparalelă lanţului de ADN); b) mecanismul de alungire, care produce eliberarea de acid pirofosforic (din ribonucleozid-trifosfat), ce este hidrolizat, eliberându-se energie.

Diferenţele între biosinteza de ARN şi biosinteza de ADN constau în: 1) conservarea integrală a matriţei de ADN în procesul de sinteză de ARN (în timp ce în sinteza de ADN matriţa este semiconservată); 2) ARN-polimeraza nu necesită un primer; 3) ARN-polimeraza nu desfăşoară activitate nucleazică.

La eucariote, există mai multe ARN-polimeraze, încât cele din clasa A produc ARNr, cele din clasa B produc ARNm, iar cele din clasa C produc ARNt.

În timpul procesului de transcriere se parcurg mai multe etape după cum urmează:

120

1) Legarea ARN-polimerazei de matriţa de ADN în regiunile promotoare care sunt recunoscute în mod specific, producându-se dezrăsuciri locale ale helixului.

2) Iniţierea formării lanţului de ARN prin formarea primei legături diesterice la nivelul regiunii dezrăsucite.

3) Alungirea lanţului de ARN se face în direcţia de la 3’ la 5’ a matriţei de ADN, în timp ce lanţul de ARN creşte în direcţia 5’ la 3’. Matriţa de ADN transcrisă îşi reia conformaţia dublu helicoidală, în timp ce porţiunea următoare se dezrăsuceşte.

4) terminarea lanţului de ARN are loc în momentul în care pe matriţa de ADN se recunosc unele puncte de terminare, cu ajutorul unei proteine specifice.

5) maturarea sau prelucrarea are loc numai după desprinderea de pe matriţă de ADN şi este suferită numai de unele molecule de ARN. Maturarea constă în: a) clivarea (ruperea) lanţului de ARN (de 45 S) în lanţuri mai mici (de 28 S şi 18 S); b) metilarea unor grupări OH din riboză sau din bazele purinice şi pirimidinice.

La eucariote, trecerea ARNm din nucleu în citoplasmă se face prin porii nucleeari sub forma unor precursori ribozomali.

S-a demonstrat că, pentru fiecare genă (care are două lanţuri ADN), numai unul din cele două lanţuri de ADN este copiat, încât o genă codifică o singură proteină.

Aplicaţiile medicale legate de transcrierea mesajului genetic constau în folosirea unor inhibitori şi a transcrierii în combaterea unor infecţii microbiene sau virale. Astfel, rifampicina (extrasă din Streptomyces) şi rifampicina (un derivat semisintetic) inhibă în mod specific iniţierea sintezei de ARNm. Actinomicina D inhibă în mod specific transcrierea fără a inhiba replicarea ADN sau biosinteza proteinelor.

6.3.3.Traducerea mesajului genetic în biosinteza proteinelor

În conformitate cu dogma centrală a biologiei moleculare, informaţia genetică stocată sub forma secvenţei de baze în ADN este transcrisă (copiată) în secvenţa de baze din ARNm şi apoi este tradusă (concretizată) în secvenţa ( dispunerea ) aminoacizilor din proteine.

Întrucât în acizii nucleici există numai patru baze azotate diferite, iar în proteine există 20 aminoacizi diferiţi, apare necesitatea existenţei unui cod genetic (o formă cifrată) care să permită legarea în proteine a acestor aminoacizi.

Codul genetic reprezintă, astfel, relaţia care există între secvenţa bazelor în ADN (sau în ARNm) şi secvenţa aminoacizilor în proteine. El cuprinde 64 secvenţe (grupuri) de câte 3 nucleotide denumite codoni, care determină legarea unui aminoacid într-o proteină, jucând rolul unor “cuvinte” în traducerea informaţiei genetice în sinteza proteinelor. Astfel, codonul U-U-U determină legarea fenilalaninei într-o proteină.

Codul genetic prezintă următoarele caracteristici:a) este degenerat, deoarece legarea unui aminoacid (specificarea lui) într-o proteină este

determinată de mai mulţi codoni;b) prezintă 3 codoni nonsens, care nu specifică (leagă) nici un acid, ci determină terminarea

lanţului polipeptidic;c) este universal, fiind acelaşi în toate celulele de la bacterii până la om.Sinteza unei molecule de proteină, prin asamblarea aminoacizilor, se face la nivelul

ribozomilor, unde se citeşte informaţia genetică de pe ARNm, participând şi o serie de proteine solubile, precum şi aminoacizi activaţi legaţi de ARNt ce prezintă: 1) un loc de punct de legare a aminoacidului şi 2) un loc de recunoaştere a matriţei de ARNm, reprezentat de o secvenţă de 3 baze, denumit anticodon.

Anticodonul de pe ARNt recunoaşte secvenţa complementară de 3 baze din codonul de pe ARNm permiţând legarea specifică a aminoacidului de matriţă. Pentru un aminoacid (din cei 20 existenţi în proteine) pot exista mai multe molecule diferite de ARNt, legată de faptul că mai mulţi codoni pot specifica (lega) mai mulţi aminoacizi. (Fig. 6.16)

121

Fig.6.16. Schema moleculei de ARN t

Moleculele de ARNt prezintă: a) patru regiuni cu baze complementare dispuse în dublu helix, denumite tulpini (tulpina acceptor, tulpina D, tulpina T şi tulpina anticodon) şi b) 4 regiuni fără baze complementare denumite bucle (o buclă anticodon, o buclă D, o buclă T şi o buclă variabilă).(Fig. 6.16)

Datorită apariţiei structurii de dublu helix la nivelul tulpinilor, molecula de ARNt are o dispunere spaţială în forma literei “L”, cu două braţe: a) un braţ lung ce cuprinde tulpinile T şi acceptor. Regiunile dublu helicoidale sunt perpendiculare una pe alta şi conţin fiecare câte 10 perechi de baze, ce corespund la o tură de dublu helix. Formarea regiunilor de dublu helix asigură moleculei o mare stabilitate, iar buclele ce proemină pot interacţiona specific cu alte grupări de atomi. Astfel, anticodonul este situat la capătul braţului lung din “L”, iar aminoacidul este legat la capătul braţului scurt din “L”.

Rolul ARNt este de a lega specific aminoacizii liberi din citoplasmă şi de a-i transporta în ribozomi, permiţând legarea lor în lanţul polipeptidic în secvenţa dictată de ARNm. (Fig.6.17)

122

Fig.6. 17. Aspectul tridimensional al moleculei de ARN-t

Legarea aminoacidului de ARNt este catalizată de o enzimă, denumită aminoacil-ARN-sintetază existând câte o enzimă specifică pentru fiecare din cei 20 aminoacizi, care poate lega aminoacidul de ARNt diferiţi.

Aminoacidul ARNt-sintetaza catalizează două reacţii succesive: 1) activează aminoacidul legându-l de AMP, formând un compus intermediar, denumit

aminoaciladenilat (aminoacil~AMP), care rămâne legat de enzimă până întâlneşte o moleculă de ARNt specifică pentru aminoacidul respectiv;

AA + ATP = AA ~ AMP + ADP

2) transferă aminoacidul pe ARNt formând complexul ARNt încărcat ( aminoacil-ARNt ). Energia legăturii macroergice din complexul aminoacil-ARNt poate fi utilizată ulterior în ribozomi pentru formarea legăturii macroergice;

AA~AMP + ARN t = AA~ ARN t + AMP

Molecula de ARNt prezintă la toate vieţuitoarele o structură asemănătoare, perfect adaptată funcţiei sale, fiind o moleculă universală ca şi codul genetic.

Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr) este reprezentat de mai multe specii cu constante de sedimentare diferite. ARNr este sintetizat în nucleu şi intră în constituţia celor două subunităţi ribozomale: a) subunitatea mică (40 S) şi b) subunitatea mare (60 S), care se angrenează, în citoplasmă, cu subunitatea mică, realizând ribozomul.

6.3.3.1.Mecanismul molecular al biosintezei proteinelor

Formarea legăturilor peptidice între aminoacizii care compun proteina are loc în ribozom, sinteza lanţului polipeptidic având loc în direcţia aminocarboxil. Ribozomul devine funcţional numai atunci când are loc asocierea celor două subunităţi. (Fig. 6.18)

123

Fig.6.18. Schema sintezei proteinelor în celula eucariotăMecanismul sintezei de proteine, mai bine studiat la E.coli, este acelaşi în toate celulele şi

cuprinde trei faze: 1) faza de iniţiere, 2) faza de elongare şi 3) faza de terminare (la fel ca şi la sinteza de ADN şi de ARN).

Faza de iniţiere începe odată cu formarea compusului formil-metionil-ARNt prin legarea metioninei de un ARNt specific şi prin blocarea grupării amino prin formilare. În continuare se formează Complexul de iniţiere 30 S la care participă formil-metionil-ARNt, subunitatea mică 30 S, ARNm şi unele proteine solubile din citosol, denumite factori de iniţiere (IF1, IF2, IF3), precum şi GTP. Subunitatea mică (30 S) se leagă de ARNm pe un loc specific situat la circa 10 nucleotide de la capătul 5’ al ARNm (factorul IF3 intervenind în această legare).

Biosinteza proteinelor la procariote

Faze Timpi FenomeneA.Iniţiere Formarea compusului formil

metionil - ARNt- se leagă metionina de ARNt-se blocheză gruparea amino prin formilare-se formează complexul de iniţiere

1.Inserţia unui AA-ARNt -pe locul A se inseră un AA ~ ARNtB. Elongare

2.Formarea legăturii peptidice-se transferă formil metionina de pe locul P pe gruparea aminoacil ~ ARNt de pe locul A-pe locul P rămâne un ARNt descărcat-pe locul A se găseşte un dipeptidil ~ ARNt

-ARNt descăcat părăseşţ locul P3.Translocarea -dipeptidil ~ ARNt se mută de pe locu lA pe

locul P-ARNm se deplasează spre capătul 3!

C.Terminare

Terminarea sintezei lanţului polipeptidic

-în dreptul locusului A, pe ARNm apareun codon nonsens

De complexul 30 S se leagă apoi subunitatea mare (50 S) a ribozomului, folosind pentru legare energia rezultată din hidroliza GTP-ului. S-a format astfel, complexul de iniţiere (70 S), în care

124

pe ribozom există două locuri de legare: a) un loc P (de la peptidil) care este ocupat de formil-metionil-ARNt şi b) un loc A (de la aminoacid) neocupat în complexul de iniţiere.

Faza de elongare se realizează în trei timpi (subfaze): a) inserţia unui aminoacid; b) formarea legăturii peptidice şi c) translocarea.

Inserţia constă în legarea pe locul A din ribozom a unui aminoacid-ARNt, ce corespunde codonului din ARNm, aflat în dreptul locului A. Codonul din ARNm este recunoscut de anticodonul ce transportă aminoacidul cerut (specificat) de cele trei nucleotide ale codonului (din ARNm). Pentru inserţie sunt necesare: o moleculă de GTP şi o proteină din citosol numită primul factor al elongării. În urma inserţiei a rezultat un complex în care pe locul P se află formilmetionil-ARNt-ul, iar pe locul A se află un aminoacil-ARNt.

Formarea legăturii peptidice se produce cu ajutorul unei enzime denumită peptidil transferază, existentă în subunitatea 50 S a ribozomului, prin transferul formilmetioninei (de pe locul P) pe gruparea amino din animoacil-ARNt (aflat pe locul A). În urma formării legăturii peptidice pe locul P rămâne un ARNt descărcat, în timp ce pe locul A se găseşte un dipeptidil-ARNt.

Translocarea cuprinde trei fenomene: a) ARNt descărcat părăseşte locul P; b) dipeptidil-ARNt se mută (translocă) de pe locul A pe locul P şi c) ARNm se deplasează cu trei nucleotide spre capătul 3’. Datorită acestui fapt, codonul următor de pe ARNm este pregătit pentru a fi ”citit” de către anticodonul unui nou aminoacid-ARNt corespunzător.

Translocarea necesită hidroliza celei de-a treia molecule de GTP şi intervenţia celui de al treilea factor al elongării, denumit translocază.

Odată încheiată translocarea, ciclul elongării se poate repeta, fiindcă locul A a devenit vacant, iar în dreptul său se află un alt codon, care poate fi recunoscut de aminoacidul ce prezintă anticodonul complementar. În acest fel un alt aminoacid este legat în locul polipeptidic (P), iar mesajul genetic “înscris” în ARNm este “citit” de către anticodonii de pe ARNt şi “tradus” în formarea unei legături peptidice între aminoacizi în conformitate cu secvenţa “dictată” (specificată) de codoni.

Faza de terminare a sintezei lanţului polipeptidic se declanşează în momentul când la sfârşitul fazei de elongare, în dreptul locului A din ribozom ajunge unul dintre cei trei codoni nonsens (UAA, UGA şi UAG); în citoplasma celulelor normale nu se găsesc molecule de ARN cu anticodoni camplementari acestor codoni. Dar aceşti codoni nonsens sunt recunoscuţi de o proteină, denumită factor de eliberare (existând doi factori de eliberare RF1 şi RF2). Factorii de eliberare se leagă de locul A şi determină hidroliza legăturii dintre polipeptid şi ARNt de pe locul P, eliberând lanţul polipeptidic terminat care părăseşte ribozomul. În continuare, ribozomul se disociază în cele două subunităţi, care se desprind de ARNm, iar ARNt-ul este pus în libertate.

Compoziţia lanţului polipeptidic sintetizat de un ribozom este determinat în mod exclusiv de ARNm şi nu de felul ribozomului. În acest mod, aceiaşi ribozomi pot sintetiza lanţuri polipeptidice diferite în funcţie de matriţa de ARNm pe care sunt legaţi.

6.3.3.2.Particularităţi ale biosintezei proteinelor la eucariote

La eucariote, sinteza proteinelor are loc în ribozomii 80 S din citosol, iar iniţierea sintezei lanţului polipeptidic se face prin metionil-ARNt care nu este formilat ca la bacterii. Factorii de iniţiere sunt mai numeroşi şi mai complecşi la eucariote, ei controlând viteza sintezei proteinelor.Viteza cu care se sintetizează proteinele este foarte mare, atât datorită elongării foarte rapide, cât şi datorită faptului că o molecul~a de ARNm este tradusă simultan de mai mulţi ribozomi. Grupul de ribozomi legat de o moleculă de ARNm se numeşte poliribozom sau polizom. Într-un polizom ribozomii sunt dispuşi la distanţe de circa 100 nucleotide unul de altul şi fiecare ribozom sintetizează câte un

lanţ polipeptidic. (Fig. 6.19)

125

Fig.6. 19. Schema poliribozomului la eucariote1- Subunitate mică; 2- Subunitate mare; 3- ARN m; 5-Începerea sintezei;6- Terminarea sintezei lanţului polipeptidic.

În lanţul polipeptidic, aminoacizii sunt legaţi în mod strict în ordinea (secvenţa) codificată de genă, încât codul genetic (limbajul bazelor nucleotidice din ADN şi ARNm) este tradus în ordonarea (aşezarea) aminoacizilor din molecula de proteină.

Numărul de lanţuri polipeptidice care pot fi sintetizate pe o moleculă de ARNm este diferit la procariote, de eucariote. Astfel, la eucariote pe fiecare moleculă de ARNm se sintetizează un singur lanţ polipeptidic, în timp ce la procariote o moleculă de ARNm sintetizează mai multe lanţuri polipeptidice. Porţiunea din ARNm care codifică un lanţ polipeptidic se numeşte cistron şi începe cu un codon de iniţiere (unde se leagă ribozomii) şi se termină cu un codon nonsens.

La eucariote ARNm este întotdeauna monocistronic, pe când la bacterii este de obicei policistronic.

Prin adăugarea sau prin delecţia (înlăturarea) unei baze din ARNm apar mutaţii, deoarece din acel punct de vedere citirea codonilor este greşită, defazată faţă de mesajul original, rezultând alte “cuvinte”.

La eucariote unele gene apar discontinui. Până în prezent gena este definită ca o regiune a cromozomului (ca un fragment de ADN) care este copiată (transcrisă) într-o moleculă de ARNm, iar aceasta este tradusă într-un lanţ polipeptidic. La eucariote secvenţele de ADN (denumite exoni) care codifică aminoacizii sunt separate prin segmente de ADN (denumite introni) care nu codifică. Din moleculele de ARNm precursor (ce apare prin transcrierea genei) sunt îndepărtate porţiunile ce corespund intronilor, fragmentele rămase fiind legate cap la cap printr-un proces de “înădire” (splicing) ce se pot produce în nucleu în cursul maturării ARNm. (Fig.6.20)

Fig. 6.20. Schema procesului de splicing a ARN-ului mesager

Şi la eucariote există posibilitatea ca unele secvenţe de ADN să producă cel puţin două molecule diferite de ARNm, datorită unor variaţii în fenomenul de “înădire”. De asemenea, nu toate genele codifică proteine.

Influenţarea biosintezei proteinelor cu ajutorul unor antibiotice sau prin acţiunea unor toxine stă la baza unor aplicaţii sau implicaţii medicale.

Aplicaţii medicaleÎn practica medicală sunt folosite antibiotice care inhibă biosinteza proteinelor, acţionând pe

subunitatea mică sau mare şi pe ribozomi de tipuri diferite (70 S sau 80 S). Streptomicina şi tetraciclinele acţionează pe subunitatea 30 S, producând citirea greşită a ARNm (streptomicina) sau blocând legarea aminoacil-ARNt pe locul A din ribozomi (tetraciclinele).

Cloramfenicolul şi ciclohexinida acţionează pe subunitatea mare, blocând activitatea peptidil transferazei. Eritromicina acţionează pe subunitatea mare (50 S) a ribozomului procariotic, împiedicând translocarea.

Puromicina acţionează pe ambele tipuri de ribozomi producând terminarea prematură a sintezei lanţului polipeptidic.

Unele toxine microbiene inhibă biosinteza proteinelor la eucariote. Astfel, toxina difterică produsă de Corynebacterium dyphteriae, blochează faza de elongare la eucariote, inactivând translocaza.

126

7.Diferentierea si evolutia celulelor

Diferenţierea celulară este procesul biologic, în care, pornindu-se de la o singură celulă, se constituie tipuri celulare stabile, deosebite morfofuncţional între ele.

În biologie, diferenţierea este un proces esenţial, de el depinzând însăşi apariţia şi existenţa organismelor individuale. Prin diferenţiere se realizează: 1) reproducerea, în urma căreia se formează noi indivizi într-o specie; 2) creşterea şi dezvoltarea organismelor; 3) regenerarea celulelor sau a ţesuturilor lezate sau uzate; 4) evoluţia speciilor şi adaptarea organismelor la mediu.

Diferenţierea celulară are caracter universal în lumea vie, fiind prezentă la toate speciile de plante sau animale. Nefiind limitată în timp, diferenţierea celulară se desfăşoară pe tot parcursul vieţii individului, din momentul concepţiei şi până în momentul morţii organismului. Intensitatea şi amploarea diferenţierii sunt variabile în timpul diverselor perioade ale vieţii organismului, înregistrând o intensitate maximă în embriogeneză. La mamifere, diferenţierea celulară are un caracter ireversibil, încât nici o celulă diferenţiată nu-şi mai poate redobândi caracterele embrionare.

7.1.Mecanismele diferenţierii celulare

La mamifere, diferenţierea celulară debutează în momentul fecundării, când se formează zigotul. Atât zigotul, cât şi celulele rezultate din primele diviziuni se pot diferenţia în oricare din tipurile celulare funcţionale ale adultului. Aceste celule care au potenţial maxim de diferenţiere sunt denumite celule totipotente sau pluripotente şi se caracterizează din punct de vedere genetic că au toate genele active (derepresate) încât acceptă orice mesaj genetic, putând urma orice traseu evolutiv. Ele se pot integra în oricare din regiunile unui embrion avansat, la care soarta celulelor este definitivă, generând structuri specializate în funcţie de indicaţia primită de la regiunea suport.

O serie de factori extracelulari denumiţi factori determinanţi, obligă fiecare celulă pluripotentă să aleagă un anumit traseu evolutiv, transformându-se în celule determinate ( direcţionate ).

Determinarea reduce progresiv numărul de tipuri celulare specializate care pot lua naştere din celule embrionare. Astfel, celulele pluripotente pot genera prin diferenţiere toate tipurile de celule adulte, dar mai târziu, odată cu apari,tia celor trei foiţe embrionare, din fiecare foiţă rezultă un număr limitat de celule, ca de exemplu: celule nervoase din ectoderm; celule conjunctive, musculare din mezoderm etc.

Deşi cantitativ şi calitativ genotipul celulelor pluripotente şi determinate este identic, determinarea şi diferenţierea celulară represează (inactivează) un număr variabil de gene, mereu altele în funcţie de tipul de celule specializate. Cu cât vârsta embrionului este mai avansată, numărul genelor represate este mai mare, iar starea de celulă determinată este ireversibilă la mamifere.

Factorii care impun alegerea unui anumit parcurs şi deci diferenţierea spre un anumit tip de celulă specializată se numesc inductori. Inductorii acţionează asupra unor celule “ţintă”, iar acţiunea lor este posibilă numai dacă celulele ţintă devin permisive, în urma primirii unor mesaje sau influenţe directoare.

Etapele diferenţierii celulelor

Etapă Denumirea celulei

Exemple Caracteristici Asupra lor acţioneză:

Iniţială Celula totipotentă(pluripotentă)

Zigotul şi primele 8-16 blastomere

Toate genele sunt active(derepresate)

Factori determinanţi

Determinării Celule determinate (direcţionate)

Celule foiţelor embrionare

Au gene active şi gene inactive (represate)

Factori inductori

Apariţia celulelor permisive

Celule stem multipoten -ţiale

Celule mezenchi - maleHemohistio - blast Hemocitoblast

Sunt permisiveCreşte numărul genelor represate

Factori inductori

Apariţia celulelor progeni-toare

Celule stemdirecţionate(formatoare de colonii)

Celule multipoten -ţiale limfoideCelule multipoten -ţiale mieloide

Creşte numărul genelor represate

Factori inductori

127

Apariţia celuleor precursoare

Celule tinere(blaşti)

Proeritro-blastMieloblastMonoblastLimfoblast

Creşte numărul genelor represate

Factori inductori

Apariţia celulelor specializate

Celulele mature Neuroni,celule musculare, eritrocite, leucocite

Numărul de gene active este caracteristic fiecărui tip celular

Permisivitatea apare ca urmare a unor modificări genetice şi structurale ce au loc la nivelul membranei celulare, modificări determinate de acţiunea unui alt inductor anterior. Se remarcă faptul că permisivitatea pentru un anumit inductor este limitată în timp.

Diferenţierea celulară se realizează prin intervenţia unui grup heterogen de factori inductori, care iniţial acţionează asupra unei populaţii de celule pluripotente, iar mai apoi, asupra unor celule determinate (direcţionate). Astfel, în ontogeneză numărul determinărilor succesive coincide cu numărul inductorilor.

În urma acţiunii inductorilor şi determinării rezultă celulele STEM, celule de origine, din care vor lua naştere anumite tipuri de celule specializate. Astfel, celulele stem din măduva osoasă hematogenă sunt capăt de serie pentru hematii, leucocite şi trombocite, iar celulele nediferenţiarte din epiteliu sunt capăt de serie pentru diverse tipuri de epitelii.

În organismul adult nu mai există celule pluripotente, dar fiecare ţesut şi fiecare organ mai are încă rezerve de celule stem incomplet diferenţiate (excepţie făcând ţesutul nervos şi muscular cardiac). Aceste celule stem îşi pot continua programul de diferenţiere, putând reface celulele specializate adulte, lezate sau uzate.

La mamifere, celula diferenţiată îşi păstrează aceeaşi cantitate de ADN ca şi celula pluripotentă, iar caracterele generale ale celulelor diferenţiate sunt expresia fnotipică a numărului de gene nerepresate din genotip.

Diferenţierea celulară se realizează în două etape: a) o etapă a diferenţierii intracelulară şi b) o etapă a diferenţierii intercelulară.

În etapa diferenţierii intracelulare, în interiorul celulei se produc modificări structurale succesive care determină apariţia formei şi structurilor specifice celulei diferenţiate, ca de exemplu modificarea formei spermatogoniei şi apariţia flagelului.

În etapa diferenţierii intercelulare, modificările structurale suferite de un grup restrâns de celule dintr-o populaţie mai mare determină apariţia unor diferenţe între caracterele celulelor iniţiale şi caracterele celulelor provenite din celulele iniţiale.

Sub raport biochimic, diferenţierea s-a realizat în momentul în care în celulă s-a acumulat o substanţă specifică, de regulă o proteină cu funcţie enzimatică, ca de exemplu hemoglobina în hematii, actina şi miozina în celulele musculare.

Ca rezultat al diferenţierii celulare apar funcţii specifice fiecărui tip celular constituit, precum contractilitatea celulelor musculare, mobilitatea spermatozoidului, transportul de oxigen şi bioxid de carbon.

7.2. Caracteristicile celulelor diferenţiate

Caracterele celulelor diferenţiate sunt reprezentate de:1) Specializarea funcţională, care reprezintă principalul obiectiv al diferenţierii celulare, fără a

se contrapune cooperării cu alte tipuri celulare.2) Morfologia (forma şi structura) celulelor diferenţiate este specifică în sensul dezvoltării mai

accentuate a organitelor celulare necesare îndeplinirii funcţiilor specifice. Astfel, reticulul endoplasmic rugos şi complexul Golgi sunt foarte dezvoltate în celulele implicate în sinteza de proteine, iar aparatul de contracţie, respectiv filamentele de actină şi miozină, apare foarte dezvoltat în celulele musculare.

3) Compoziţia chimică apare specifică, datorită acumulării unor proteine specifice sau datorită desfăşurării unor activităţi enzimatice specifice.

4) Adezivitatea pe substrat, care permite formarea ţesuturilor şi organelor.5) Interrelaţia cu alte celule sau joncţiunea, prin care se realizează solidarizarea între ele în

cadrul unui ţesut. Prin joncţiunile permeabile, de tip gap pot trece anumite molecule cu rol în reglarea funcţională, permiţând funcţionarea sincronă a celulelor din ţesuturi.

6) Inhibiţia capacităţii de diviziune. Celulele diferenţiate sunt greu divizibile sau indivizibile (ca neuronul, hematia, celula musculară cardiacă etc). Celulele diferenţiate divizibile îşi pot regla ritmul de

128

diviziune în funcţie de necesităţi (ca în cazul hepatocitelor). Capacitatea de diviziune este mai întârziată sau inhibată în cazul celulelor cu grad de specializare avansat. De asemenea, în cazul unor ţesuturi în care celulele specializate au o durată de viaţă foarte scurtă, ca urmare a solicitărilor func,tionale intense (exemplu în epiteliu interstiţial) se întâlnesc celule tinere, incomplet diferenţiate, capabile să se dividă pentru refacerea populaţiei de celule adulte specializate, epuizate.

7) Inhibiţia de contact, care apare atunci când densitatea celulelor atinge un anumit grad într-un ţesut (ca, de exemplu în regenerarea epiteliilor după lezionare) sau în culturile de celule. Prin această proprietate celulele sunt oprite din migrare şi proliferare.

Celule specializate

7.3. Caracteristicele celulelor nediferenţiate

Celulele nediferenţiate prezintă următoarele caracteristici.1) Nu au funcţii specifice, celulele nediferenţiate pot îndeplini un singur rol, acela de a genera

diverse tipuri de celule specializate în urma determinărilor succesive.2) Nu au structuri specifice, toate celulele nediferenţiate sau parţial diferenţiate sunt

asemănătoare prezentând: nucleul mare, eucromatic, citoplasma redusă cantitativ, slab bazofilă datorită numărului scăzut de ribozomi.

3) Nu au compoziţii chimice specifice.4) Prezintă adezivitate pe substrat, încât atunci când vin în contact se recunosc, aderă şi

formează ţesuturi sau organe.5) Joncţionarea cu alte celule se poate realiza prin joncţiuni de tip gap, cu un diametrul mai

mic decât în cazul celulelor diferenţiate. Aceste joncţiuni prezintă un mare dinamism desfăcându-se şi refăcându-se cu rapiditate.

6) Prezintă o mare capacitate de diviziune, ceea ce permite unui număr redus de molecule inductoare care acţionează iniţial asupra unui număr foarte mic de celule să genereze un număr mare de celule.

7) Prezintă inhibiţie de contact, ca şi în cazul celulelor diferenţiate. În momentul în care iau contact cu alte tipuri de celule, celulele nediferenţiate se opresc din migrare, putând să realizeze ţesuturi şi organe.

Celulele mature pot suferi fenomenul de modulaţie şi de metaplazie.Modulaţia este fenomenul prin care în celulele mature, în anumite condiţii fiziologice sau

patologice, pot să apară modificări structurale şi funcţionale, minore şi pasagere, reversibile, care le fac să semene cu celula tânără din care au provenit. Astfel, fibrocitele se pot transforma în fibroblaste în culturile de celule, datorită condiţiilor de mediu.

Metaplazia este fenomenul de transformare a unei celule diferenţiată într-o celulă diferenţiată de alt tip. Metaplazia apare exclusiv la ţesutul epitelial şi conjunctiv.7.4.ÎmbĂtrÂnirea Şi moartea celulelor

În viaţa sa, celula parcurge următoarele stadii (sau faze): 1) un stadiu de funcţionare normală; 2) îmbătrânirea (sau senescenţa); 3) agonia; 4) moartea celulară.

Celule îmbătrânite suferă o serie de modificări morfologice precum: a) scăderea volumului celular; b) scăderea ritmului mitotic şi creşterea procentului de celule moarte, într-o populaţie de celule; c) modificări ale nuceului şi d) modificări ale citoplasmei.

Denumirea celulelor Specializarea funcţionalăEritrocite Transport de oxigen şi dioxid de carbonMiocite ContracţieEnterocite Absorbţie şi metabolismCelule caliciforme Sinteză de substanţe mucoase Exocrinocitele pancreatice Sinteză şi secreţie de enzimeEndocrinocitele pancreatice Sinteză de hormoni pancreaticiEndocrinocitele din gonade Sinteză de hormoni steroiziNefrocitele Transport de ioniNeuroni Generare şi conducere de impulsuri nervoaseMacrofage Digestie intracelulară

129

Fig.7.1. Modificări ale nucleului în timpul înbătrânirii şi morţii celulelor1-Picnoza; 2- Cariorexis; 3- Carioliză

Modificările nucleului sunt reprezentate de: a) picnoza nucleară, care constă în retractarea şi condensarea nucleilor, colorare intensă (hipercromie) şi dispariţia detaliilor de structură; b) cariorexis sau fragmentarea nucleului; c) carioliza sau dispariţia (dizolvarea) nucleului.

Modificările citoplasmei constau în: scăderea bazofiliei, vacuolizarea citoplasmei, acumularea de pigmenţi de uzură şi lipide ca urmare a scindării moleculelor lipoproteice. (Fig.7.1)

În celulele în agonie se observă: a) modificări nucleare asemănătoare celor întâlnite în celulele îmbătrânite; b) modificări ale organitelor citoplasmatice, cu eliberare de fosfolipide şi formarea de figuri mielinice; c) modificarea stării coloidale a citoplasmei (fluidificare sau gelificare) şi modificări ale curenţilor citoplasmatici.

Ipotezele şi teoriile privind îmbătrânirea şi moartea celulelor se pot grupa în două categorii: a) o teorie a erorilor şi b) o teorie a morţii programate a celulelor.

Teoria erorilor consideră că senescenţa celulară (îmbătrânirea) este o consecinţă a acumulării defectelor genetice în urma acţiunii radiaţiilor, agenţilor mutageni sau radicallor liberi din mediu asupra ADN-ului sau asupra diferitelor etape din transcrierea şi traducerea informaţiei genetice. Rezultatul acestei acţiuni este producerea unor “erori” în sinteza unor proteine şi în funcţionalitatea lor. O variantă a teoriei erorilor o reprezintă teoria invaziei virale care consideră senescenţa celulară ca fiiind o consecinţă a încorporării ADN-ului viral în genomul celulei. Prin teoria erorilor nu se poate explica însă variabilitatea duratei de viaţă a diferitelor tipuri de celule.

Teoria morţii programate, recent elaborată, susţine că fiecare tip de celulă are înscris în programul genetic o anumită durată de viaţă, după care celula moare. Această teorie este sprijinită de rezultatele experimentale obţinute de HAYFLICK (1986), care, în culturi de celule, a observat că fibroblastele provenite din ţesutul embrionar se divid de 50 de ori, în timp ce la fibroblastele provenite de la persoane de diferite vârste, numărul diviziunilor scade treptat cu vârsta. Dacă culturile de celule sunt îngheţate mai mulţi ani, la dezgheţare, culturile se divid exact de atâtea ori, ca şi celulele de aceeaşi generaţie neîngheţate. Descifrarea mecanismului programării morţii în celulele normale poate oferi cheia vindecării cancerului şi prelungirea vieţii.

Îmbătrânirea celulară apare ca un proces cu semnificaţii structurale şi funcţionale variate pentru diferitele tipuri de celule existente în organism. Astfel, celulele cu ritm rapid de diviziune au un proces de îmbătrânire cu un mecanism de producere diferit faţă de unele celule nedivizibile. Orice tip celular diferenţiat divizibil parcurge în cursul viaţii organismului un număr precis de diviziuni programate genetic, încât îmbătrânirea poate să se traducă prin scăderea ritmului sau chiar oprirea completă a procesului de diviziune. În cazul celulelor nedivizibile în cursul vieţii organismului (neuronul, celulele musculare) îmbătrânirea se traduce prin acumularea de macromolecule cu proprietăţi diferite de cele iniţiale sau prin acumularea de substanţe nedegradabile (ca lipofuscină etc.).

Între senescenţa celulară şi îmbătrânirea organismului întreg este o mare diferenţă, organismul animal fiind format din mai multe sisteme. Astfel îmbătrânirea organismului este rezultatul îmbătrânirii fiecărui sistem în parte şi mai ales rezultatul îmbătrânirii moleculelor, celulelor, ţesuturilor şi organelor, fiecare dintre acestea îmbătrânind într-un mod specific, diferit.

Moartea celuleiStudierea mecanismelor şi a cauzelor care produc moartea celulei constiuie obiectul de

studiu al tanatologiei celulare.

130

Moartea celulei se produce instantaneu, încât post mortem se poate observa: a) retractarea pseudopodelor şi adoptarea unei forme sferice; b) o colorare difuză a nucleului şi citoplasmei cu coloranţi vitali; c) balonarea şi dispariţia mitocondrilor; d) picnoză, cariorexis şi carioliză nucleară. Aceste modificări sunt rezultatul eliberării enzimelor din lizozomii alteraţi, ca urmare a încetării circulaţiei sanguine şi constituie un semn cert al morţii organismului animal.

Sunt descrise trei tipuri de moarte a celulelor: moartea celulară programată, apoptoza şi necroza.

Moartea celulară programată sau oncoza constă în autodistrugerea celului prin activarea unui program genetic propriu şi specific. Se întâlneşte în cursul dezvoltării ontogenetice embrio-foetale, pe parcursul dezvoltării sau funcţionării unor organe (de exemplu: in- voluţia glandei mamare, la încheierea unui ciclu de lactaţie sau involuţia uerului la încetarea stării de gestaţie.

Apoptoza este o moarte celulară lentă, care intervine după primirea unor semnale intrinseci şi se realizează prin mecanisme proprii. Prin acest tip de moarte celulară, organismul se eliberează de anumite celule care nu-i mai sunt utile (celule lezate, celule în exces, celule cu ADN-ul modificat şi nereparat, etc) În producerea apoptozei se pot distinge patru stadii evulutive : un stadiu molecular, un stadiu de contractare, un stadiu de clivaj şi un stadiu de fagocitoză. În stadiul molecular sau de preangajare apar modificări ale membranei şi citoplasmei care îi permit celulei să recepţioneze semnale (de obicei chimice: AMP-c, inozitol trifosfatul, ioni de calciu, etc), ce produc modificarea permeabilităţii membranelor celulare, dispariţia microvililor , dispariţia joncţiunilor şi pierderea contactului cu celulele adiacente. Ca o consecinţă a acestor fenomene se produce activarea unor „gene de liză” sau „gene letale” (protooncogene c-fos, c-myc, antioncogena P 53). Aceste gene induc sinteza de macromolecule efectoare sau activatoare ale apoptozei (proteina de stress hsp 70, catepsina D etc.) Celulele părăsesc angrenajul tisular, citosolul se condensează, plasmalema prezintă invaginaţii adânci, iar în nucleu apare o hipercromatoză marginală, datorită dispunerii periferice a eucromatinei nucleare. În acest stadiu ribozomii şi mitocondriile nu sunt modificate,iar celula este încă capabilă să elimine colranţii vitali

În stadiul următor, de clivaj în corpi apoptotici, cisternele reticulului endoplasmic şi unii saci golgieni se vacuolizează, iar fibra de cromatină este fragmentată, sub acţiunea unor endonucleaze, dependente de calciu şi sensibile la zinc. Apar „ corpii apototici ” cu aspectul fragmente celulare delimitate de plamalemă şi conţinând citosol, organite şi oligonucleozomi. Stadiul de fagocitoză şi de eliminare a corpilor apoptotici este de scurtă durată, deoarece corpii apoptotici sunt recunoscuţi imediat de lectine şi receptorii macrofagelor şi eliminaţi prin fagocitoză.

Citonecroza sau necroza sau necrobioza este o moarte celulară violentă. Se produce sub o acţiune patogenă intensă ce depăseşte posibităţile de adaptare ale celulei şi cuprinde un număr mai mare de celule. Într-o primă fază celula se tumefiază, apoi lizozomii eliberează hidrolazele acide, încât celulele se lizează în totalitate,generând o reacţie inflamatorie în teritorillie învecinate. Nucleul trece prin modificări profunde (picnoză, carirexis şi carioliză).Celulele necrozate îşi măresc volumul, contrar faţă de ceea ce se întâmplă în apoptoză.

7.5. Recunoaşterea celulară

Celula posedă capacitatea de a se recunoaşte unele pe altele în mod specific. Astfel, dacă un embrion de găină este disociat în celule independente, prin tratament cu tripsină, după câteva ore celulele aflate în suspensie se agregă (se grupează) din nou. Dacă se amestecă celule ectodermice şi mezodermice, iniţial se formează un conglomerat sferic, dar după 1-2 zile, celulele se separă după tip, cele mezodermice dispunându-se la interior, iar cele ectodermice la exterior. Fenomenul se datorează glicoproteinelor prezente în membrana citoplasmatică, care formează molecule specifice, capabile să transmită informaţia genetică. În cultură fenomenul recunoaşterii celulare se manifestă în cazul celulelor normale prin inhibiţia de contact încât contactul cu peretele lateral al vasului şi cu celulele vecine oferă celulei informaţia necesară pentru oprirea diviziunii.

Inhibiţia de contact este absentă în cazul celulelor maligne şi a unor celule transformate, care apar spontan în culturile de celule normale.

Pierderea inhibiţiei de contact nu este însă un criteriu suficient pentru a defini o celulă malignă sau o celulă transformată. Astfel în 1960, AUB a descoperit că celulele maligne şi transformate au un plus încă o proprietate care le deosebeşte de celulele normale, ele fiind aglutinate de lectine (sau fit - hemaglutinine) care sunt proteine vegetale ce se leagă de glicolipidele şi glicoproteinele din membranele celulelor transformate şi tumorale.

131

7.6.ONCOGENELE

Oncogenele sunt o categorie de gene, care pot să determine transformarea unei celule normale într-o celulă canceroasă. Sunt considerate o formă mutantă a unei gene normale (proto-oncogenă) implicată în creşterea şi diviziunea celulelor.

Modificările de membrană ale celulelor maligne se datoresc modificărilor intervenite în exprimarea unor gene, care determină compoziţia şi proprietăţile membranei celulare periferice, ceeace face ca celulele maligne să aibă o capacitate de creştere autonomă, ele reproducându-se şi proliferând independent de mecanismele normale de reglare.

Un model al genezei cancerelor (cancerogenezei) propus de HUEBNER şi TODARO (1969) susţine că în toate celulele normale există un virus integrat în cromozomi (un provirus). La un moment dat se produce activarea uneia din genele virale (denumită oncogenă) care codifică proteine ce pot să transforme o celulă normală într-o celulă malignă.

S-a constatat că, în cromozomii umani, există gene care au secvenţe foarte asemănătoare cu oncogenele virusurilor cu ARN (denumite v-oncogene). Astăzi se ştie că nu oncogenele celulare provin din cele virale (deci nu sunt virusuri integrate), ci dimpotrivă virusurile au preluat din celulele normale aceste gene.

Oncogenele celulare au fost denumite şi proto-oncogene şi se pare că s-au conservat, în evoluţie, un timp foarte îndelungat, îndeplinind funcţii foarte importante. Până în prezent nu se cunoaşte ce rol au în celula normală şi nici ce este modificat, atunci când se produce cancerul, determinând perturbări în exprimarea oncogenelor. În cancer s-au descris modificări ale cromozomilor ca ruperi de cromozomi şi transferuri ale fragmentelor pe alţi cromozomi, oncogenele fiind localizate tocmai în locul în care se rup cromozomii sau în fragmentele translocate.

Sunt cunoscute 18 proto-oncogene, care se pot clasifica în două clase: a) myc şi b) ras.Oncogenele myc intervin în codificarea proteinelor nucleare, reglează transcrierea şi induc

transcrierea unor gene esenţiale, critice pentru proliferarea celulară. Oncogenele ras codifică o serie de proteine ce se localizează în citoplasmă şi determină

modificări de formă, de adezivitate şi de recepţionare a unor semnale de creştere. Se pare că o celulă devine transformată malignă întrucât secretă în exces un factor stimulator al creşterii celulare, care printr-un mecanism “autocin” suprastimulează însăşi creşterea celulei care l-a produs.

Date recente par a indica că o singură oncogenă nu poate produce cancer, fiind necesară colaborarea mai multor oncogene care intră în activitate în fiecare din etapele carcicogenezei. Cunoscându-se mecanismele moleculare ale malignizării se pot identifica punctele unde aceasta va putea fi întreruptă încât se speră că biologia moleculară va contribui la adoptarea unei adevărate terapii a cancerelor.

8.MATRICEA EXTRACELULARĂ

Matricea extracelulară sau intercelulară este mediul în care trăiesc şi îşi desfăşoară activitatea diferitele tipuri de celule ale organismelor pluricelulare. În acest mod, celulele se află în contact cu o reţea de macromolecule, denumită matricea extracelulară, care ocupă spaţiul intercelular continuându-se cu glicocalixul.

Matricea extracelulară

132

Matricea extracelulară este compusă dintr-o mare diversitate de molecule de proteine şi de poliglucide,care sunt asamblate într-o reţea, ce menţine strânse raporturi cu suprafaţa celulelor, care le sintetizează.Este bogată în polimeri fibrilari, în special de colagen, care rezistă mai mult decât celulele la diferite solicitări mecanice.

Există mari diferenţe în cantitatea, tipul de molecule şi modul de organizare a matricei extracelulare, fiecare formă de organizare fiind adaptată la solicitările funcţionale ale ţesutului.Astfel,matricea extracelulară se calcifică în ţesutul osos şi în dinţi, este transparentă în cornee.În ţesutul conjunctiv, matricea este mai abundentă decât în alte tipuri de ţesuturi, încât celulele apar relativ mai rare.

Matricea extracelulară participă la realizarea unor structuri specializate precum: membranele bazale, cartilagiile şi tendoanele. iar împreună cu depunerea cristalelor de fosfat de calciu participă la formarea oaselor şi dinţilor.

Funcţiile matricei extracelulare sunt multiple: a) stabilizează structura fizică a ţesuturilor; b) lubrefiază, amortizează şocurile mecanice şi asigură elasticitatea ţesuturilor şi organelor; c) asigură şi controlează adezivitatea celulară, acţionând ca un “clei intercelular universal”; d) influenţează şi controlează creşterea, diferenţierea, proliferarea şi migrarea celulelor; e) îndeplineşte un rol metabolic activ.

În alcătuirea matricei extracelulare intră trei componente: a) membrana bazală; b) fibrele intercelulare (colagene, elastice şi reticulare) şi c) substanţa fundamentală a matricei.

8.1.Membrana bazală

Membrana bazală (membrana basalis) sau lamina bazală este o structură specială situată sub celulele epiteliale (pe care le separă de ţesutul conjunctiv subiacent) sau în jurul unor celule individuale (musculare, adipoase, celula Schwann).

În histologia clasică, termenul de membrană bazală a fost atribuit structurilor alcătuite dintr-o lamă fină polizaharidică, ce îndeplinea rolul de a cimenta baza epiteliilor şi care se asociază cu o tramă reticulară fină, în contact cu ţesutul conjunctiv.

Lama poliglucidică a fost evidenţiată selectiv prin impregnări cu săruri de argint sau prin reacţia PAS când se colorează în roşu purpuriu.

Epiteliile în marea lor majoritate, prezintă membrane bazale de formă lamelară, cu o grosime de ordinul zecilor de nanometri (40-120, în epiderm, epiteliul căilor respiratorii, glandele exocrine). Membrane bazale mai groase (de câţiva micrometri) sunt prezente la nivelul epiteliilor corneei (anterior şi posterior), cristalinului. În alte cazuri, ca în epiteliul vezicii urinare, existenţa membranei bazale a fost pusă la îndoială în histologia clasică, grosimea ei fiind sub puterea de rezoluţie a microscopului optic. În glomerulul renal (în foiţa viscerală a capsulei Browmann) sau în epiteliul alveolar, membrana bazală este singura care se interpune între epiteliul respectiv şi endoteliul capilarelor sanguine, acţionând ca un filtru foarte selectiv. (Fig.8.1)

Componente Ultrastructuri Compoziţie moleculară

Membrana bazală

A.Lamina bazală (lamina lucida + lamina reticularis)B. Lamina reticulară

colagen IVproteoglicani (perlecan)fibronectinălaminină

Fibre de colagen colagen fibrilar (I, II, III )colageni asociaţi fibrilelor ( IX, XII)

Fibre intercelulare

Fibre elastice (oxitalanice, de elaunină)

elastinafibrilinaelaunina

Fibre de reticulină colagen III

Substanţă fundamentală

astructurată

- Glicozaminaglicani: acidul hialuronic,condroitin sulfaţii, keratan sulfaţii,heparina- Proteoglicanii : agrecan,sindecan, betaglican)- Glicoproteinele structurale : fibronectina,laminina,condronectina, uvomorulina, glicoproteina 115

Lichid tisular astrucuturat apă, ioni, micromolecule de proteine

133

Fig.8.1.Ultrastructura membranei bazale1- Nucleu; 2- Citoplasmă; 3-Plasmalemă; 4- Membrana bazală; 5- Fibre conjunctive;

6.Lamina lucida; 7- Lamina densa; 8- Lamina reticularis; 9- Colagen

La microscopul electronic, membrana bazală se prezintă ca o structură matriceală fină care se interpune între ţesuturile epiteliale şi ţesutul conjunctiv subiacent. Membrana bazală prezintă în alcătuirea sa trei structuri lamelare suprapuse: 1) lamina lucidă (lamina lucida), cu grosime de 10 nm, adiacentă plasmalemei bazale a celulelor epiteliale, omogenă şi traversată de rare filamente fine; 2) o lamină densă (lamina densa s.basalis), cu grosime de 20-30 nm formată din filamente fine, abundente, cuprinse într-o matrice amorfă, densă şi 3) o lamină reticulată (lamina fibroreticularis), care face trecerea la matricea ţesutului consjunctiv.

Membrana bazală este produsă, prin secreţie, de către celulele ce se sprijină pe ea şi se leagă prin dispozitive joncţionale speciale de adezivitate, denumite hemidesmozomi. În epiteliul stratificat pavimentos cornificat al epidermului, lamina basalis este ancorată de ţesutul conjunctiv subiacent prin fibrile de ancorare (anchoring fibrils), formate colagen VII.

Compoziţia chimică a membranelor bazale variază de la un ţesut la altul, de la o regiune la alta a aceleiaşi lamine şi cuprinde: colagen (de tipul IV ), proteoglicani (precum un mare heparan sulfat, denumit perlecan), fibronectină, entactina şi laminina.

Laminina este una din primele proteine ale matricei extracelulare, sintetizată de celulele embrionare. În stadiile timpuriii ale structurării, lamina bazală este formată dintr-o reţea de laminină, colagenul IV lipsind sau fiind redus cantitativ.

134

Fig.8.2. Componentele membranei bazale

Laminina este o macromoleculă (850.000 daltoni), complexă flexibilă, formată din trei lanţuri polipeptidice foarte lungi, legate între ele prin legături disulfidice şi dispuse în fomă de cruce asimetrică. Are mai multe domenii funcţionale care leagă colagenul IV, heparan sulfatul, entactina, iar unul sau mai multe domenii se leagă de unele de pe suprafaţa celulei proteine receptori. Asemănător colagenului IV, moleculele de laminină pot forma, in vitro, o reţea prin stabilirea de interacţiuni între capetele braţelor moleculei de laminină.

Entactina, o moleculă proteică cu aspect de halteră, se leagă strâns de braţul scurt al fiecărei moleculă de laminină. totodată entactina se mai leagă de colagenul IV, jucând rolul unei punţii de legătură între colagenul IV şi reţeua de laminină din membrana bazală.

Funcţiile membranei bazale sunt multiple şi complexe: 1) Acţionează ca un filtru semipermeabil selectiv, reglând trecerea macromoleculelor

(exemplu, din sânge în urină, la nivelul glomerulilor renali). Heparan sulfatul joacă un rol împortant în realizarea acestei funcţii, încât atunci când lanţurile de glicozaminoglicani sunt distruse enzimatic, funcţia de filtru selectiv este distrusă. (Fig. 8.2) 2) Acţionează ca o barieră celulară în epitelii, oprind trecerea fibroblastelor,încât acestea nu ajung în contact direct cu celulele epiteliale, dar permite trecerea macrofagelor, limfocitelor şi a prelungirilor nervoase. 3) Participă la regenerarea ţesuturilor lezionate (epitelii, muşchi, nervi), funcţionând ca un suport pentru deplasarea celulelor în cursul regenerării ţesuturilor epiteliale, a joncţiunilor neuromusculare.

În cazul joncţiunii neuromusculare, membrana bazală care înconjoară celula musculară prezintă o porţiune joncţională care se interpune între terminaţiile neuronului motor şi plasmalema celulei musculare. Această porţiune joncţională joacă un rol central în refacerea sinapsei după lezarea nervului sau a muşchiului.Astfel, membrana bazală joncţională ghidează terminaţiile nervoase motorii şi controlează localizarea receptorilor pentru acetilcolină în plasmalem celulei musculare.

În extractele obţinute din membrana bazală joncţională s-a identificat o nouă proteină matriceală, denumită agrină, care adaugată la culturile de celule musculare, inţiază apariţia de structuri sinaptice în plasmalemă. Agrina este produsă nu numai de neuronii motori şi pare a avea rolul în configurarea ansamblului de receptori şi de alte macromolecule postsinaptice.

4) Participă la recunoaşterea intercelulară şi la ghidarea celulelor, în timpul dezvoltarii embrionului. Astfel, s-a observat că mutaţia unei gene care codifică o proteină asemănătoare lamininei perturbă căile pe care unele celule mezodermice şi axoni nervoşi se deplasează pe memebrana bazală ce susţine epidermul.

135

5) Membranele bazale sunt capabile să: inducă diferenţierea celulară, să determine polaritatea celulară, să influenţeze metabolismul celular, să organizeze proteinele din membrana plasmatică adiacentă şi să constituie o cale specifică pentru migrarea celulelor.

8.2. Fibrele intercelulare

Fibrele intercelulare sunt reprezentate de: a) fibrele de colagen; b) fibrele elastice cu varianta lor fibrele oxitalanice şi c) fibrele de reticulină.

8.2.1. Fibrele de colagen

Fibrele de colagen (Fibrae collagenosae) sunt alcătuite din proteine fibroase (sau scleroproteine), constituite din molecule de colagen, care reprezintă aproximativ 25-30% din totalul proteinelor din organism.

Molecula de colagen are o lungime de 300 nm şi un diametru de 1,5 nm, fiind formată din trei lanţuri polipeptidice numite lanţuri alfa, răsucite în triplu helix. Configuraţia de triplu helix a moleculei de colagen este stabilizată prin punţi de hidrogen şi legături bisulfidice, realizate între cele trei lanţuri, din care două lanţuri alfa 1 (α1) sunt asemănătoare între ele prin frecvenţa aminoacizilor, dar diferă de cel de al treilea lanţ, denumit lanţ alfa 2 (α2).

Lanţurile alfa pot fi de 25 tipuri diferite, fiecare fiind codificat de câte o genă proprie. Un lanţ conţine 1000 radicali de aminoacizi, este răsucit în helix spre dreapta, pe fiecare tură existând o tripletă de aminoaci ( glicină -prolină -hidroxiprolină). Prolina are o formă sferică, stabilizează conformaţia helicoidală în fiecare lanţ α.Glicina, cel mai mic aminoacid din lanţ (având numai un atom de hidrogen în lanţ) permite împacetarea strânsă a celor trei lanţuri pentru a forma în final triplu helixul de colagen. Genele care codifică lanţurile α sunt foarte mari, ajungând la o lungime de 44 Kilobaze şi conţin în jur de 50 exoni. Multi exoni au o lungime de 54 (sau un multiplu de 54) de nucleotide, ceea ce sugerează că colagenii iau naştere prin multiple duplicaţii ale unei gene primordiale ce conţine 54 nucleotide şi codifică tripleta Gly-X-Y (glicină-prolină-hidroxiprolină).

Fig.8.3. Schema moleculei de colagen IVA-Domeniu necolagenic 1 (globulus); B- Domeniu necolagenic 2; C- Fragment 7 S; D-Segment major; E- Zona mobilă a moleculei.

Există 25 lanţuri α care pot fi asamblate în mai mult de 10.000 tipuri de molecule de colagen, dintre care numai 15 sunt mai bine cunoscute. Principalele tipuri de colagen din ţesutul conjuctiv sunt colagenul de tip I, II, III,IV, V şi XI (Fig.8.3).

Colagenul de tip I, fibrilar, este cel mai comun,fiind principalul colagen din piele, tendoane, oase şi capsule. Prezintă o structură moleculară tipică, în triplu helix (Fig.8.4).

Colagenii de tip IV şi VII formează reţele (network-forming collagens).Moleculele de colagen IV formează o ţesătură care ocupă o parte importantă din membrana bazală. Moleculele de colgen de tip VII formează dimeri, care întră în structura fibrilelor de ancorare (anchoring fibrils), mai abundente în piele şi care ajută la ancorarea membranei bazale a epidermului la ţesutul conjunctiv subiacent. Colagenii de tip IX şi XII, denumiţi colageni asociaţi fibrilelor (fibril-associated collagens) acoperă suprafaţa acestora şi participă la legarea fibrilelor atât între ele, cât şi de alţi componenţi ai matricei extracelulare.

136

Fig.8.4. Lanţurile polipeptidice ale moleculei de colagen

Colagenul de tip I, II şi III polimerizează sub formă de fibrile de colagen şi organizează colagenul fibrilar care intră în alcătuirea fibrelor de colagen şi reticulină.

Colagenul de tip IV şi V nu formează fibrile, fiind colagen afibrilar şi intrând în structura membranelor bazale şi învelitorilor fetale.

În mediul extracelular, moleculele de colagen polimerizează, formând microfibrile de colagen (microfibrilla colagenoidea), cu diametrul de 10-300 nm, lungi de mai multe sute de microni, observabile în electronomicrografii. Fiecare microfibrilă de colagen prezintă o alternanţă regulată de benzi clare şi întunecate, ce se succed cu o periodicitate de 67 nm, datorită dispunerii ordonate a moleculelor. În microfibrile, moleculele de colagen (sau tropocolagen) sunt dispuse paralel între ele şi “în scară”, apărând astfel, de-a lungul microfibrilei, zone lacunare (gap) de 35 nm ce alternează regulat cu zone de suprapunere. Zonele sau benzile lacunare apar negre la microscopul electronic, deoarece au mai mulţi radicali liberi care fixează mai uşor colorantul negativ. Mărimea gap-ului este astfel aranjată, încât se repetă după 5 molecule de colagen. (Fig.8.5)

Fig.8.5. Dispunerea microfibrilelor în fibra de colagen

Microfibrilele de colagen se leagă între ele, prin interacţiuni covalente transversale, ce se stabilesc între radicalii de lizină din moleculele constituiente, formând fibrilele de colagen (fibrilla colagenosa), groase de 0,2 - 0,5 µm. Dacă legăturile transversale sunt inhibate, rezistenţa la întindere este foarte redusă, iar formaţiunile colagenoase din piele,tendoane şi vase devin fragile, rupându-se. În unele structuri (tendonul Ahile), legăturile transversale sunt foarte dese, asigurând o foarte mare rezistenţă la intindere.

Fibrilele au diametre variate şi se organizează diferit. În pielea mamiferelor se dispun în reţele pentru a rezista la tracţiuni pe mai multe direcţii.În tendoane, se dispun în benzi parale, orientate în axul major al tensiunii. În osul matur şi în cornee, se dispun în lamele,iar fibrlele dintr-o lamelă sunt paralele între ele, dar perpendiculare pe cele din lamela învecinată.

Celulele conjunctive regla mărimea şi dispunerea fibrilelor de colagen, prin ghidarea dispunerii moleculelor de colagen după secreţie în strânsă asociere cu plasmalemma. În plus, organizarea spaţială a fibrilelor de colagen este influenţată şi de interacţiunile cu alte molecule din matricea extracelulară. Astfel, molecule de colagen de tip IX şi XII sunt produse de însuşi celule conjunctive locale şi devin colageni asociaţi fibrilelor.

Colagenii asociaţi fibrilelor diferă de colagenii fibrilari prin mai multe particularităţi: - au structura triplu helicoidală întreruptă de unul sau două domenii nonhelicoidale, ceea ce le conferă mai multă flexibilitate; - reţin propeptidele după secreţie; - nu se grupează pentru a forma fibrile;- se leagă periodic de suprafaţa fibrilelor din colagenii fibrilar. Astfel, colagenul de tip IX se leagă de colagenul II,

137

conţinut în cartilagii, cornee şi corpul vitros.Clagenul de tip XII se leagă de colagenul I din tendoane şi din alte ţesuturi. Colagenii asociaţi fibrilelor au rolul să medieze atât interacţiunile fibrelor între ele, cât şi cu alte molecule din matrice, jucând un rol deosebit în dispunere fibrilelor.

Un număr variabil de fibrile de colagen se asociază şi formează fibre de colagen(fibra collagenosa), cu grosimi între 1 şi 20 µm. La rândul lor, fibrele sunt unite între ele prin ca hexoze, care conferă o reacţie PAS-pozitivă fibrelor de colagen.

Fibrele de colagen sunt cilindrice lungi şi sinuoase cu capete care se pierd în matricea extracelulară. Sunt denumite şi fibre albe şi nu se anastomozează între ele, dar se pot grupa în benzi, în unele ţesuturi conjunctive. Sunt foarte rezistente şi apar birefringente la microscopul de polarizare. Fiind acidofile se colorează în roz cu eozina, în albastru prin coloraţia tricromică Mallory şi în verde cu coloraţia tricromică Masson. Pot fi degradate sub acţiunea colagenazeiă, care eliberează molecula de tropocolagen la un anumit nivel şi împarte triplul helix în două fragmente inegale, unul reprezentând 75% din moleculă, iar celălalt 25%. Numai în cazuri rare se reuşeste să separe unul de altul cele trei lanţuri ale moleculei de colagen.

Formarea (geneza) fibrelor de colagenColagenul este produs (sintetizat şi secretat) de către fibroblaste (în ţesuturile conjunctive),

condroblaste (în cartilaj), osteoblaste (în ţesuturile osos). Producerea colagenului are loc în două etape: o etapă intracelulară şi alta extracelulară.(Fig.8.6)

Fig.8.6. Etapele producerii fibrei de colage

138

În etapa intracelulară are loc:- copierea genelor (transcripţia) care codifică sinteza moleculelor de colagen; - traducerea mesajului genetic în sinteza lanţurilor pro α ; - hidroxilarea radicalilor de prolină şi lizină, precum şi glicozilarea radicalilor de hidroxilizină; - elaborarea lanţurilor polipeptidice, formarea legăturilor bisulfidice şi asamblarea lanţurilor polipeptidice cu formarea de triplu helix; - împachetarea procolagenului în complexul Golgi şi eliberarea acestuia în mediul extracelular.

Lanturile polipeptidice de colagen sintetizate de ribozomii ataşati membranele reticulului endoplasmic sunt injectate în lumenul acestuia ca precursori, denumiţi lanţuri pro-α. Aceşti precursori prezintă la ambele capete ( amino- şi carboxil-) aminoacizi adiţionali, denumiţi propeptide. Propeptidele ghidează formarea intracelulară a moleculeor de procolagen triplu răsucite, prevenind, totodată, apariţia intracelulară a unor fibrile mari,care ar putea fi nocive pentru celule. În lumenul RE, radicalii de prolină şi lizină sunt hidroxilaţi, formând hidroxiproline şi hidroxilizine, iar unele hidroxilizine sunt glicozilate. Fiecare lanţ pro-α se leagă de alte două lanţuri prin punţi de hidrogen, rezultând o moleculă triplu răsucită helicoidal, denumită procolagen.

În etapa extracelulară, procolagenul este transformat în molecule de colagen ( tropocolagen ) prin înlăturarea enzimatică a propeptidelor (numai în cazul formelor de colagen fibrilar), după care are loc polimerizarea moleculelor şi formarea fibrilelor de colagen.

În moleculele de colagen, gupurile hidroxil din hidroxiprolină şi hidroxilizină au rolul să formeze legături de hidrogen între lanţuri, care stabilizează conformaţia spaţială de triplu helix şi previn hidroxilarea prolinei, cum se întâmplă în deficienţa de acid ascorbic (scorbut). Înlocuirea (turnoverul) moleculelor de colagen are loc după o perioadă destul de lungă, ce ajunge în os până la 10 ani.

Fibrilele de colagen se depun pe suprafaţa celulei care le-a produs, ocupând cu predilecţie înfundările plasmalemei, formate prin fuziunea veziculelor secretorii cu suprafaţa celulei. Citoscheletul din citoplasma periferică influentează poziţia, numărul şi orientarea ansamblului de fibrile.

8.2.2.Fibrele elastice

Fibrele elastice (fibrae elasticae) sau fibrele galbene sunt mai subţiri decât cele de colagen având diametrul de numai 1 nm. Ele sunt monofibrilare, se ramifică şi se anastomozează formând reţele neregulate. Sunt de cel puţin cinci ori mai extensibile decât o fibră de cauciuc de aceeaşi secţiune transversală. Se pot colora electiv cu orceină ( în roşu brun întunecat ), cu rezorcin fuxină WEIGERT (în roşu aprins), cu aldehidfuxină GÖMÖRI (în negru) şi cu hematoxilină-eozină (când se colorează slab şi inconstant). Sunt rezistente şi extensibile (cu 100-200%), revenind la lungimea iniţială, după ce tracţiunea asupra lor a încetat. Se găsesc în pereţii vaselor sanguine, în pulmon, în piele şi în ţesutul conjunctiv lax. Odată cu înaintarea în vârstă se răresc provocând disfuncţia organelor respective. Au o compoziţie în amino-acizi asemănătoare cu a fibrelor de colagen. Fibrele

elastice sunt de trei feluri: oxitalanice, de elaunină şi elastice propiu-zise.(Fig.8.7)

Fig.8.7. Contracţia şi relaxarea moleculelor de elastină

Componentul principal al fibelor elastice este elastina, o proteină foarte hidrofilă cu o lungime de circa 750 resturi (radicali) de amino acizi. Asemănător colagenului este bogată în prolină şi glicină, dar spre deosebire de acesta nu este glicozilată şi conţine puţină hidroxiprolină şi hidroxilizină.

La microscopul electronic, fibrele elastice prezintă în centru o masă amorfă, astructurată, ce conţine elastina, înconjurată de o teacă de microtubuli, orientată în axul longitudinal al fibrei şi

dispuşi în benzi. Microtubulii sunt formaţi din glicoproteine, apar primii în cursul elaborării fibrei de către fibroblast şi au rolul de a orienta depunerea elastinei în regiunea amorfă centrală.

Formarea (geneza) fibrelor elastice. Elastina este sintetizată ca precursor (proelastina) de către fibroblastele din piele şi tendoane

sau de către celulele musculare netede din pereţii vaselor mari. Proelastina, o moleculă globulară cu masa de 70 kDa este eliminată în matricea extracelulară, unde pe suprafaţa membranei plasmatice

139

(în înfundăturile acesteia) are loc polimerizarea în fibre elastice. Sub formă nefibrilară, elastina este prezentă în lamele elastice din pereţii unor vase sanguine.

Elastina conţine doi amino acizi, desmosina şi isodesmozina, fiind compusă din două tipuri de segmente scurte, care alternează dealungul lanţurilor polipeptidice:- segmente hidrofobe, care îi conferă proprietăţi elasticitate şi semente α-helicoidale,bogate în alanină şi lizină, care formează legături transversale între moleculele adiacente. Fiecare segment este codificat de un exon separat.

Elastina este rezistentă la fierbere, la extracţia cu acizi şi baze diluate şi la acţiunea tripsinei. În schimb, este hidrolizată de o enzimă, elastaza, secretată de pancreas.

Moleculele de elastină, sinuoase şi polimorfe, sunt legate între ele prin punţi necovalente slabe, ca şi prin punţi covalente distanţate, care permit reţelei să fie elastică. În organism, elastina poate servi ca matrice pentru calcifiere, explicându-se astfel formarea plăcilor ateromatoase şi calcifierea unor ţesuturi.

Miezul de elastină este acoperit de o teacă de microfibrile, care au un diametru de 10 nm. Microfibrilele sunt compuse dintr-un număr de glicoproteine, dintre care fibrilina pare a fi esenţială pentru integritatea lor. Microfibrilele joacă un rol important în asmblarea fibrelo elastice. Ele apar înaintea elastinei în timpul dezvoltării fibrelor elastice şi formează o “schelă” pe care se depun moleculele de elastină.

Fibrele oxitalanice sunt o varietate de fibre elastice, foarte rezistente la acizi. Sunt mai groase şi mai rigide decât fibrele elastice. Ele se pot colora cu coloranţii fibrelor elastice (orceina, fucsina) numai după o prealabilă tratare cu acid peracetic, acid permanganic sau acid performic. Rezistă la digestia cu elastază, dar sunt degradate imediat prin tratare cu acid peracetic. Se găsesc în număr mare în ligamentele alveolo-dentare, dispersate printre fibrele de colagen şi reticulină. Numărul lor creşte în bolile paradonţiului sau în chisturile radiculare dentare.

O formă aparte de fibre elasice sunt fibrele de elaunină, care se găsesc în jurul glandelor sudoripare şi în derm.

8.2.3.Fibrele de reticulină

Fibrele de reticulină se caracterizează printr-un diametru mai redus (între 0,5 şi 2 µm), apărând foarte subţiri. Nu sunt grupate în fascicule, dar sunt ramificate şi formează reţele, în mod frecvent. Pot fi observate în contrast de fază şi în microscopul de polarizaţie, după colorare cu roşu Sirius. Pe preparatele fixate, se colorează ca şi cele de colagen (cu albastru de anilină). Fiind fibre argirofile, se pot evidenţia în condiţii bune cu săruri de argint. Datorită conţinutului mai mare în glicoproteine, fibrele de reticulină sunt PAS-pozitive. Astfel, hexozele sunt în procent de 6-12% în fibrele de reticulină, faţă de 1% în fibrele de colagen.

Fibrele de reticulină conţin, în principal, molecule de colagen de tip III, asociat cu glicoproteine, proteoglicani şi alte tipuri de colagen. La microscopul electronic apar formate din fibrile groase de 35 nm, strâns împachetate şi legate între ele prin punţi de proteoglicani şi glicoproteine. Fibrele de reticulină iau naştere, ca şi celelalte două tipuri de fibre conjunctive, în fibroblaste, unde are loc sinteza de molecule de colagen tip III, ce vor fi exocitate şi polimerizate extracelular.

Sunt răspândite în: muşchii netezei, în ţesuturile hematopoetice şi limfopoetice (măduva osoasă, splină şi organele limfoide), în jurul capilarelor, în membranele bazale, în glandele endocrine, în ficat, în rinichi, iar,în condiţii patologice, apar în ţesuturi după lezionări.Diametru redus şi dispunerea în reţea laxă şi flexibilă a fibrelor reticulare permite modificări de formă şi volum a unor organe,precum splina, ficatul, arteerele, musculatura uterină şi intestinală. În cursul embriogenezei, în procesele inflamatorii şi de cicatrizare, firbrele de reticulină pot fi înlocuite de fibre de colagen.

8.3Substanţa fundamentală a matricei extracelulare.

Substanţa fundamentală (substantia fundamentalis), interfibrilară sau intercelulară, apare amorfă, incoloră, transparentă, omogenă şi vâscoasă. Din punct de vedere chimic, conţine diferite molecule de glicozaminoglicani, de obicei legaţi covalent de o proteină, formând proteoglicani şi proteine fibroase, care sunt de două feluri: structurale (colagen, elastină) şi glicoproteine structurale adezive (fibronectina şi laminina).

8.3.1.Glicozaminoglicanii

140

Denumiţi, în trecut, mucopoliglucide sau mucopolizaharide, glicozaminoglicanii (GAG) sunt complexe poliglucidice neramificate, compuse din unităţi repetitive de diglucide, în care unul din cele două resturi de glucid care se repetă este un aminoglucid ( N-acetil glucozamina sau N-acetil-galactozamina ).Cel de al doilea glucid este, de obicei un acid uronic (glucoronic sau iduronic).

Fig.8.8. Proteoglicani în monomer şi în agregat1-Miez proteic; 2-Heparan sulfat; Condroitin sulfat; 4Keratan sulfat;5-Proteine de legătură

Glicozaminoglicanii sunt intens încărcaţi negativ, din cauza grupărilor (terminaţiilor) sulfat sau carboxil existente pe resturile de glucide. După radicalii de glucide, tipul de legături între acestea, numărul şi dispunerea grupărilor sulfat se disting mai multe tipuri principale de glicozaminoglicani:-acidul hialuronic sau hialuranul;- condroitin sulfatul şi dermatan sulfatul;- heparan sulfatul şi heparina; -keratan sulfatul (Fig. 8.8).

Lanţurile de poliglucide sunt intens hidrofile şi inflexibile, încât nu se pot plia în structuri globulare. De aceia, glicozaminoglicanii au o conformaţie foarte extinsă, ocupând un volum imens faţă de masa lor, formând geluri şi la concentraţii foarte mici.

Sarcinile negative, foarte numeroase, atrag o mulţime de cationi (Na+), sunt osmotic active şi reţin o mare cantitate de apă în matricea extracelulară, făcând-o turgescentă, capabilă să reziste la compresiuni, în contradicţie cu fibrele de colagen care rezistă la tracţiuni. Prin acest mecanism, matricea cartilajului articular poate rezista la presiuni de sute de atmosfere.

În ţesutul conjunctiv, glicozaminoglicanii ocupă mai puţin de 10% din cantitatea de proteine fibroase. Dar, pentru că ei formează geluri hidratate "poroase", glicozaminoglicanii ocupă mult din spaţiul extracelular, oferind suport mecanic pentru ţesuturi şi permiţând o rapidă difuziune a moleculelor solubile în apă (nutrienţi, metaboliţi, hormoni) sau deplasarea celulelor.

În fibrele de colagen şi elastice şi sunt reprezentati de: acidul hialuronic (singurul nesulfatat), condroitin-sulfaţii, heparan-sulfaţii, keratan-sulfaţii şi heparina. Excepţie făcând acidul hialuronic, toţi ceilalţi glicozaminoglicani se leagă covalent de o proteină formând molecule de proteoglicani (PG), în care glicozaminoglicanii ocupă 95%, iar proteinele 5%. În ţesutul conjunctiv, glicozaminoglicanii şi proteoglicanii formează un gel foarte hidratat, rezistent la compresiuni, în care sunt cuprinse proteinele fibroase. (Fig.8.9)

Acidul hialuronic ( sau hialuronanul sau hialuronatul ) este format dintr-o repetare secvenţială a peste 25.000 de unităţi diglucidice nesulfatate. Se găseşte în cantităţi variabile în toate ţesuturile, fiind mai abundent la embrionii timpurii. Este cea mai simplă formă de glicozaminoglicani.

Producerea acidului hialuronic se realizează direct pe suprafaţa celulei, cu ajutorul unui complex de enzime, cuprinse în membrana plasmatică, nefiind nevoie de exocitoză.

Faţă de ceilalţi glicozaminoglicani, acidul hialuronic nu conţine dizaharide sulfatate, secvenţele sunt mai simple,iar lanţurile mai scurte (mai puţin de 300 resturi glucidice).

141

Acidul hialuronic îndeplineşte multiple roluri: - asigură rezistenţa mecanică în ţesuturi şi articulaţii; - ocupă spaţiile libere în timpul dezvoltării embrionare, permiţând modificarea formelor şi structurilor ;- fiind produs de zona bazală a epiteliilor, seveşte la crearea unui spaţiu liber, în care celulele vor migra , ca în cazul formării cordului, corneei etc. Când migrarea celulelor s-a încheiat, excesul de hialuronan este degradat de hialuronidază. Hialuronanul este produs în cantităţi mari în timpul cicatrizării leziunilor şi constituie un “lubrefiant” al lichidului articular.Îndeplinirea acestor roluri este condiţionată de legarea hialuronanului de proteinele sau proteoglicanii din matricea extracelulară sau de pe suprafaţa celulelor. Unele din aceste molecule, denumite hialaderine prezintă domenii omoloage pentru legare de acidul hialuronic, conţinând grupe de radicali aminoacizi, încărcate pozitiv.

Fig.8.9.Relaţiile proteoglicanilor cu acidul hialuronic.

8.3.2.Proteoglicanii

Proteoglicanii (PG) sunt compuşi din lanţuri de glicozaminoglicani legate covalent de un miez proteic. Ca şi în cazul altor glicoproteine, lanţul de polipeptide sau miezul proteic este sintetizat în reticulul endoplasmic rugos, iar lanţurile de polizaharide sunt asamblate pe acesta în complexul Golgi.

Proteoglicanii se deosebesc de celelalte glicoproteine prin felul, cantitatea şi aranjamentul lanţurilor de glucide. Apar foarte heterogeni, în ceea ce priveşte conţinutul proteic, mărimea moleculei şi număr, dar prezintă o repetare a diglucidelor similare.

Miezul proteic al unui proteoglican este de obicei o glicoproteină. În el, carbohidraţii pot ocupa mai mult de 95% din greutatea sa, cel mai adesea având forma de lanţuri lungi neramificate, cu 80 radicali de glucide.

De obicei, proteoglicanii sunt mult mai mari decât glicoproteinele. Astfel, agrecanul care este o componentă majoră a cartilajului are o masă de 3 x 106 daltoni, peste 100 lanţuri de GAG, câte unul

142

la fiecare 20 resturi de aminoacizi. Există, însă şi proteoglicani mici, cu 1-10 lanţuri de GAG, ca de exemplu decorinul, care este secretat de fiboblaste şi are numai un lanţ de GAG.

În principiu, proteoglicanii au o heterogenitate fără limită. Greutatea moleculară a miezului proteic variază de la 10.000 la 600.000 daltoni, de el putându-se ataşa un mare număr şi tipuri diferite de GAG. În plus, modelul de repetare a diglucidelor în fiecare GAG poate varia în funcţie de grupările –SH, încât se obţine o heterogenitate enormă, ce face dificilă identificarea şi clasificarea proteoglicanilor în funcţie de glucidele lor. Secvenţa proteinelor din miezul proteic, determinată prin tehnici de ADN recombinat apare, de asemenea extrem de diversă. Deşi au fost identificate câteva familii mici, nu există un aspect structural comun care să distingă clar proteinele din miezul proteic de alte proteine, iar mulţi PG au unul sau mai multe domenii care sunt omoloage cu domeniile existente în alte proteine din matricea extracelulară şi din membrană. Se consideră (Hardungham, Fosang –1992) că proteoglicanii sunt un grup aparte de glicoproteine glicosilate, a căror funcţii sunt mediate atât de miezul proteic, cât şi de lanţurile de GAG.

Funcţiile proteoglicanilor.Rolul PG nu poate fi limitat la menţinerea hidratării spaţiului intercelular. Lanţurile de GAG formează geluri cu pori de mărimi variate,încât servesc ca site selective ce

reglează traficul de molecule în funcţie de mărime şi încărcătura electrică. Astfel, perlecanul, un PG heparan sulfat, joacă acest rol în membrana bazală a glomerulului renal.

PG intervin în comunicarea chimică dintre celule. Ei leagă diferite molecule semnal produse de celule, ca de exemplu unii factori de creştere, modificându-le activitatea. Astfel, factorul de creştere a fibroblastelor (FGF) se leagă de lanţurile de heparan sulfat ale PG, atât în ţesuturi, cât şi in vitro. Pentru unele celule această legare reprezintă un pas necesar pentru activarea receptorilor de suprafaţă.

În majoritatea cazurilor, moleculele semnal se leagă de lanţurile de GAG ale PG, existând diferenţe între molecule: - factorul β de transformare a creşterii ( transforming growth factor β =TGF-β ) se leagă de miezul proteic al mai multor PG din matrice ( de decorin) încetându-şi activitatea. PG se leagă şi reglează activitatea proteazelor şi a inhibitorilor de protease.

Legarea de un PG controleză activitatea unei proteine prin următoarele mecanisme:- îi limitează sfera de acţiune, imobilizând proteina la locul de producere; - îi blochează activitatea; - crează un rezervor de proteine, în vederea unei eliberări ulterioare; - protezează o proteină faţă de o degradare proteolitică;- modifică sau concentreză proteina pentru o mai eficientă prezentare la receptorii de suprafaţă.

Glicozaminoglicanii şi proteoglicanii se asociază pentru a forma complexe polimerice imense în matricea extracelulară, Astfel, molecula de aggrecan ( un PG important din ţesutul cartilaginos) formează împreună cu acidul hialuronic un complex mai mare decât o bacterie.

Totodată GAG şi PG se asociază cu proteinele fibroase din matrice (cu colagenul),rezultând structuri extrem de complexe. Dispunerea spaţială a moleculelor de PG este intens determinată în ţesuturile vii.

Exită şi PG intracelulari. Astfel, serglycina este un constituient al veziculelor secretorii intracelulare, unde ajută la împachetarea şi stocarea moleculelor secretate.

Alţi PG sunt componenete integrate în membranele plasmatice, având miezul proteic inserat transversal în bistratul lipidic sau ataşat la bistrat prin glicosil-fosfatidil-inozitol (GPI). Asfel, syndecanii au un miez proteic ce traversează membrana. De domeniul lor extracelular se leagă un număr variabil de lanţuri GAG (condroitin sulfat şi heparan sulfat), în timp ce domeniul lor intracelular interacţionează cu actina citoscheletului din cortexul celular.

Sindecanii se găsesc pe suprafaţa mai multor tipuri de celule (fibroblaste, celule epiteliale), unde îndeplinesc, alături de integrine, rolul de receptori pentru colagen, fibronectină şi alte proteine matriceale , de care ei se leagă.Sindecanii se mai leagă factorul de creştere a fibroblastelor (FGF), fiind prezenţi în receptorii pentru FGF. Betaglicanul se leagă de TGF-β (factorul de transformare a creşterii), fiind prezent în receptorii pentru TGF-β. În acest mod, proteoglicanii din membranele plasmatice acţionează ca şi coreceptori care colaborează cu receptorii convenţionali ai suprafeţei celulare, atât în legarea celulelor de matricea extracelulară, cât şi în iniţierea răspunsului celular la factorii de creştere.

Sindecanii sunt organizaţi în gel hidratat, încât lanţul de GAG difuzează repede între celule, facilitând migrarea celulelor şi formarea prelungirilor celulare.

Proteoglicanii se leagă covalent de o parte şi de alta a unui ax polipeptidic, denumit “miez proteic”, încât formează subunităţi şi complexe moleculare mari.

Mai multe subunităţi se leagă necovalent pe un lung filament de acid hialuronic (AH) prin intermediul unor mici “linkeri proteici”, ajungând la o masă de 105 Kdal şi o lungime de ordinul micrometrilor. În majoritatea proteoglicanilor, miezul proteic este asociat cu dermatan-sulfatul,

143

condritin-sulfatul sau heparan-sulfatul. În unele cazuri proteoglicanii se pot lega unii de alţii sau de alte macromolecule locale cum ar fi colagenul, elastina şi fibronectina.

La microscopul electronic, proteoglicanii pot fi evidenţiaţi cu ajutorul roşului de ruteniu, care se leagă selectiv la polimerii acizi şi devin electronodenşi după combinarea lor cu oxidul de osmiu (OsO4). Astfel proteoglicanii au fost identificaţi în glicocalix (sub formă de filamente subţiri de 3-5 nm), în matricea extracelulară (sub formă de granule mari de 20-50 nm) şi în membranele bazale (sub formă de granule mici de 10-20 nm).

În concluzie, proteoglicanii îndeplinesc multiple roluri, dintre care subliniem : 1) participă la realizarea adezivităţii celulare faţă de matrice; 2) conferă vâsco-elasticitate şi rezistenţă la presiune populaţiilor celulare; 3) reglează deplasarea moleculelor (mari şi mici) prin spaţiul interstiţial; 4) modelează homeostazia tisulară; 5) interacţionează cu lipoproteinele sanguine.

Sinteza glicozaminoglicanilor şi proteoglicanilor se realizează în fibroblaste printr-un mecanism de sinteză comun glicoproteinelor. Astfel componenta proteică se sintetizează la nivelul ribozomilor reticulului endoplasmic rugos (RER), unde începe şi glicolizarea, care va fi completată în structurile golgiene, unde se desfăşoară şi sulfatarea, după care sunt eliminaţi în matricea extracelulară. După o funcţionare de 2-4 zile (pentru proteoglicani) ei sunt degradaţi de macrofage prin sistemul lor de hidrolaze acide lizozomale.

8.3.3.Glicoproteinele structurale

Sunt formate dintr-un miez proteic la care se ataşează glucide cu structură ramificată. În contrast cu PG, în glicoproteinele structurale (GS) predomină miezul proteic, iar glicoproteinele structurale nu conţin poliglucide lineare formate din diglucide repetitive ce au glucozamine. Ele joacă un rol important în funcţionalitatea matricei extracelulare, cum ar fi relaţiile intercelulare, adezivitatea celulelor.

Sunt reprezentate de fibronectine (prezente în matricea tuturor tipurilor de ţesuturi conjunctive) şi în cele mai multe membrane bazale, condronectine (prezente în matricea cartilaginoasă) şi laminine (prezente în membranele bazale).

Fibronectina este o glicoproteină, cu o greutate medie de 222-240 kDa, compusă din două subunităţi legate prin punţi bisulfidice, în apropierea terminaţiei carboxil. Fiecare subunitate prezintă o serie de domenii funcţionale distincte, despărţite prin domenii polipetidice flexibile. (Fig.8.10)

Fig.8.10. Adezivitatea celulelor la colagenul intercelular cu ajutorul fibronectinei şi proteoglicanilor

144

Domeniile sunt constituite din mici module repetabile, codificate de codoni separaţi deoarece gena fibronectinei prezintă multiple duplicaţii ale exonilor, asemănându-se cu genele colagenului. Un domeniu leagă colagenul, altul heparina, iar altul se leagă de diverşi receptori specifici de pe suprafaţa unor variate tipuri de celule.Îndată ce un domeniu cu activitate de legare a fost identificat de receptori, secvenţa sa de aminoacizi determină sinteza unor peptide care îi corespund. Aceste peptide sunt folosite pentru găsirea regiunii principale pentru legarea celulei, fiind identificată o secveţă specifică de tripeptide (Arg-Gly-Asp sau RDG). Fiecare peptidă foarte scurtă conţine secvenţa RDG şi concură cu fibronectina pe situsul de legare al celulei, putând să inhibe ataşarea celulelor la fibronectină. Dacă aceste peptide sunt prezente pe o suprafaţă solidă, ele determină aderenţa celulelor la aceasta.

Tipul principal de modul, numit repetiţia fibronectinei de tip III (type III fibronectin repeat) are o lungime de circa 90 radicali de aminoacizi şi se găseşte de cel puţin 15 ori în fiecare subunitate. Acest modul mai este întâlnit şi în alte proteine matriceale, în unele proteine ale membranei plasmatice şi citoplasmei.

Există mai multe forme ( izoforme ) de fibronectină:- fibronectina plasmatică, solubilă,prezentă în sânge şi alte lichide din corp, intervine în coagularea sângelui , în vindecarea rănilor şi în fagocitoză; - fibronectina filamentoasă, asamblată pe suprafaţa celulelor şi depozitată în matrice. Toate formele de fibronectină sunt codificate de o singură genă mare, lungă de 50 kilobase şi formată din circa 50 exoni cu mărimi similare. Transcrierea AND-ului produce o singură moleculă mare deARN, care pote fi sudată alternativ în trei regiuni în funcţie de tipul de celulă şi de stadiu de dezvoltare. La om se produc 20 tipuri de ARN mesageri, fiecare fiind capabil să codifice cel puţin o subunitate diferită de fibronectină. Sudarea alternativă permite celulei să producă tipul de fibronectină cel mai potrivit cu necesităţile ţesutului.

Astfel, formele de fibronectină produse în timpul dezvoltării embrionare diferă de cele întâlnite în fazele târzii. Dar dacă cutisul adult este lezat se revine la fibrovectina embrionară. În vindecarea rănilor, fibronectina permite migrarea celulelor şi proliferările cerute de dezvoltare sau repararea ţesuturilor. Prin experienţe de inginerie genetică,efectuate pe şoareci, s-au inactivat genele fibronectinei, fapt ce a generat o serie de defecte morfologice ce au produs anomalii în dezvoltarea notocordului, somitelor, cordului, vaselor sanguine, tubului neural şi anexelor extraembrionare.

Fibronectina este produsă de fibroblaste, de celulele endoteliale şi în cantitate mai mică şi de unele celule epiteliale şi mediază aderarea celulelor la colagen sau la alte componente ale matricei extracelulare, acţiune la care pot contribui şi alte molecule locale ca laminina, condronectina etc. Alte roluri ale fibronectinelor constau în: a) organizarea spaţială a citoscheletului; b) intervenţia lor în migrarea celulelor în cursul diferenţierii embrionare, în fagocitoză, în hemostază şi în malignizarea celulelor (când lipsa lor favorizează malignizarea); c) pot înlocui unii factori de competenţă (ca de exemplu: factorul de creştere al fibroblastelor şi al plachetelor sanguine, factorul de creştere epidermic).

În timpul dezvoltării embrionare, fibronectina ghidează deplasarea celulelor, ajutând celulele să se ataşeze de matrice, fără să fie imobilizate în ea.

Mai există şi alte tipuri de molecule adezive din matrice, care joacă un rol în ghidarea celulelor în cursul deplasărilor morfogenetice. Astfel,este tenascina – un complex glicoproteic cu şase lanţuri polipeptidice, care se desprind dintr-un centru.

Fiecare din lanţuri este pliat şi compus din diferite secvenţe scurte de aminoacizi, care se repetă de mai multe ori. Pe fiecare lanţ se găsesc un număr de domenii funcţionale distincte, din care unul se leagă de suprafaţa celulei prin syndecan ( un proteoglican transmemebranar), iar altul de fibronectină. Tenascina este mai abundentă în matricea a ţesuturilor embrionare. Ea poate să favorizeze, sau să inhibe adeziunea celulară, în funcţie de tipul de celulă şi de medierea unor domenii proteice, jucând un rol în ghidarea deplasărilor celulare.

Laminina este o glicoproteină a membranelor bazale, fiind localizată în lamina rara, în imediata apropiere a celulelor epiteliale cu membrana bazală, mediind ataşarea acestora de colagenul de tip IV al membranelor bazale. Nu prezintă o specificitate absolută încât poate facilita şi ataşarea fibroblastelor la un substrat de sticlă. Este compusă din trei lanţuri alfa (sau A) şi un lanţ beta (sau B) ce formează o moleculă foarte mare cu o greutate de 1 milion daltoni, ce posedă locuri specifice de legare. (Fig.8.11)

145

Fig. 8.11. Laminina –domenii structurale şi funcţionaleA şi B –lanţuri alfa şi beta; Regiunile haşurate sunt rezistente la proteaze.

Condronectina este o glicoproteină serică ce mediază specific ataşarea condrocitelor de colagenul de tip II din cartilaj. Este sintetizată de condrocite.

În matricea extracelulară din aproape toate ţesuturile conjunctive s-a identificat glicoproteina 115 (necolagenă), cu o greutate moleculară de aproape 115.000, care este prezentă în cantitate mai mare în vasele sanguine, în fibrele musculare netede, şi în unele membrane bazale, având o funcţie asemănătoare fibronectinei şi lamininei.

La embrion, în faza de morulă, se întâlneşte o glicoproteină denumită uvomorulina implicată în adezivitatea celulelor embrionare. Ea a putut fi identificată şi la adult în spaţiul intercelular al epiteliului intestinal, în jurul domeniului laterobazal al celulelor. Uvomorulina este distribuită uniform la suprafaţa celulelor maligne în carcinomul nediferenţiat. Tot în matricea extracelulară a unui tip de carcinom a fost izolat epinectina, o proteină cu greutatea moleculară de 70.000 daltoni.

În serul sanguin, în afară de condronectină şi fibronectină se mai întâlnesc şi alte glicoproteine cu importanţă majoră în adezivitatea celulelor de colagen şi în etalarea celulelor în vitro, ca de exemplu: factorul de etalare a fibroblaştilor şi a celulelor epiteliale, epibolina (ce favorizează etalarea celulelor epiteliale).

Tot în matricea extracelulară a ţesuturilor conjunctive este prezent şi lichidul tisular care are o compoziţie asemănătoare plasmei sanguine, conţinând apă, molecule mici (inclusiv proteine) şi diferiţi ioni (în special de sodiu şi clor şi mai puţin magneziu, calciu şi potasiu).

Unele moleculele din matricea extracelulară pot să regleze cantitatea altor molecule extracelulare. Astfel, fibronectina stimulează sinteza colagenului de către hepatocite în urma efectelor pe care fibronectina le are asupra fosforilării proteinelor. La fel factorul de creştere epidermică, AMP-ul ciclic, vitamina A stimulează acumularea fibronectinei în diferite linii celulare.

Refacerea (turnoverul) moleculelor matricei extracelulare este continuă şi prezintă o mare importaţă pentru multe procese biologice. Se realizează un echilibru între degradare şi resinteză.

Astfel, o degradare rapidă se produce în timpul involuţiei uterine post partum. Degradări localizate sunt necesare atunci când unele celule ( leucocitele) trec prin memebrana bazală în ţesuturi, iar celulele canceroase migrează la distanţă, dând metastaze. Componentele matricei sunt degradate prin enzime proteolitice care sunt produse şi eliberate local de celule, precum:- unele metaloproteaze, ce depind de ionii de Ca2+ şi de Zn2+, iar altele sunt proteaze serice. Ele cooperează pentru a degrada proteinele matriceale (colagenul, laminina, fibronectina). Colagenaza (o protează serică) ore o specificitate restrânsă, modificând integritatea matricei pe zone limitate şi facilitând migrarea celulelor. O importantă protează serică este un activator de tip plasminogen al urokinazei (urokinase-type plasminogen activator) (U-PA). Ea transformă plasminogenul într-o protează activă plasmina, care degradează fibrina, fibronjectina şi laminina.

Degradarea componentelor matriceale este controlată strâns prin mai multe mecanisme ca: - secreţia unor proteaze ca precursori inactivi;- activitatea proteazelor este limitată la anumite arii de inhibitori specifici; -inhibitorii sunt produşi de celulele de la marginea ariilor cu degradări active, având

146

scopul de a conserva matricea neimplicată. Ei protejează de asemenea şi proteinele de pe suprafaţa celulelor, care sunt necesare pentru adeziune şi migrare. Multe celulele au receptori de memebrană care leagă U-PA, limitând acţiunea acesteia la zonele unde este necesară. Astfel, un receptor pentru U-PA a fost detectat pe conul de creştere al neuronului, la marginea de înaintare a leucocitelor şi la unele tipuri de celule canceroase, care metastazează.

8.4. Integrinele sau receptorii celulari pentru matricea extracelulară Integrinele sunt o familie de proteine transmembranare care leagă colagenul, fibronectina şi

laminina. Spre deosebire de alţi receptori de membrană, integrinele prezintă o constantă de afinitate

relativ joasă (Ka =106 – 109 litri/ mol), permiţând celulelor să exploreze ambianţa fără să se ataşeze de matrice. Interginele sunt heterodimeri, compusi din două subunităţi (α şi β) necovalente asociate cu glicoproteine transmembranare.

Integrinele îndeplinesc un rol crucial pentru adeziunea şi cooperarea celulelor cu matricea extracelulară. În timp ce unele integrine leagă numai o macromoleculă din matrice (fibronectina sau laminina), altele pot lega mai multe. Astfel, o integrină prezentă pe suprafaţa fibroblastelor leagă colagenul, fibronectina şi laminina. Mai mult aceiaşi moleculă de integrină, în diferite tipuri de celule, poate lega diferite molecule. O subfamilie de integrine recunoaşte şi leagă secvenţa de aminoacizi arginină-glicină-aspartat, care este prezentă în fibronectină şi în alte proteine matriceale.Se pare că unii factori celulari specifici interacţionează cu integrinele şi le modulează activitatea.

Datorită prezenţei a 3 sau 4 domenii de legare existente pe partea extracelulară a catenei α, legarea integrinelor depinde de unii cationi extracelulari bivalenţi(Ca2+, Mg2+).

La vertebrate, unele proteine matriceale pot fi recunoscute şi ataşate de mai multe integrine. Astfel, fibronectina este legată de 8 integrine, iar laminina de 5 fibronectine.Integrinele sunt foarte diverse, deoarece cei 20 heterodimeri pot forma 9 tipuri de subunităţi β şi 14 tipuri de subunităţi α. Catenele β1 care formează dimeri cu cel puţin 9 catene α există la aproape toate celuele de la vertebrate. Astfel, α5 β1 este receptor pentru fibronectină, iar α6 β1 leagă laminina. Lanţurile β2 care formează dimeri cu 3 tipuri de lanţuri α se găsesec pe suprafaţa leucocitelor şi joacă un rol esenţial în activarea lor. Astfel, integrina α1β2 este un factor asociat limfocitelor (LAF-1), iar integrina αMβ2 este asociată macrofagelor (Mac-1). Integrinele β2 mediază în principal interacţiunile dintre celule şi mai puţin pe cele dintre celulă şi matrice. Ele premit leucocitelor să se ataşeze de endoteliul vascular şi să-l traverseze. Integrinele funcţionează ca linkeri transmembranari (sau integratori) care mediază interacţiunea dintre citoschelet şi matricea extracelulară. Cele mai multe intergine se leagă de filamentele de actină, excepţie făcând integrina α6β4, existentă în hemidesmozomi, care se leagă de filamentele intermediare. În timpul ataşării integrinei de un ligand extracelular, capătul intracelular al catenei β se leagă la filamentele de actină din citoschelet. Ataşarea transmembranară la citoschelet este o cerinţă importantă atât pentru adeziunea celelelor la matrice, cât şi pentru adeziunile intercelulare, deoarece în lipsa unei ancorări interne adeziunile sunt slabe, nerezistente, aşa cum s-a observat în cazul unei integrine mutante fară domeniu intracelular, obţinută prin tehnici de AND recombinat.

Integrinele mediază, interacţiuni transmembranare, între citoschelet şi matricea extracelulară jucând un rol important în orientarea celulelor şi matricei în ţesuturi.

La rândul său, matricea extracelulară poate influenţa organizarea citoscheletului, determinând în fibroblastele transformate (cancer like) din culturi apariţia intracelulară a fibrelor de stres, prin organizarea filamentelor de actină şi producerea unei cantităţi mai reduse de fibronectină. Citoscheletul exercită forţe care orientează moleculele matricei pe care celulele o produc, iar acestea influenţează organizarea citoscheletului.

Celulele regleză activitatea integrinelor pe care le produc. Astfel, integrinele celulelor sanguine trebuie să fie activate pentru a media adeziunea celulară. Acest fapt permite celulelor sanguine să circule nestânjenite până când sunt activate rapid de un stimul specific, deoarece integrinele lor nu trebuie sintetizate, ele existând deja sub formă inactivă.

Trombocitele sunt activate de contactul cu peretele lezat al vasului sanguin sau de unele molecule semnal solubile. Acestea determină activarea integrinei β3 din membrana trombocitelor, încât aceasta recepţionează şi leagă proteinele coagulării, determinând agregarea trombocitelor şi formarea coagulilor.

În mod asemănător, legarea de limfocitul T a unui antigen de suprafaţă specific blocheză calea de semnalizare intracelulară, ceea ce duce la o activare rapidă, dar trecătoare a integrinei (LFA -1). Integrina activată permite limfocitului T să adere puternic şi pentru un timp suficient de lung

147

la celula ţintă, până de vine stimulat. După aceia integrina revine la starea sa inactivă, permiţând limfocitului T să se desprindă.

Şi alte evenimente intracelulare pot determina activarea integrinelor. Astfel, fosforilarea serinei de pe capătul citoplasmatic a integrinei β1 , în timpul mitozei celulelor din culturi diminuează capacitatea integrinei de a lega fibronectina, încât celulele îşi modifică forma şi se detaşează de substrat.

Moleculele matricei extracelulare influenţează puternic comportaea celulelor în culturi, modificându-le forma, mişcarea, metabolisnmul, dezvoltarea şi diferite funcţii. Integrinele mediază multe din aceste evenimente. Asfel , integrinele de locul de contact cu matricea sau cu altă celulă pot activa mai multe căi de semnalizare intracelulară. ( pe cea a fosfolipid inozitolului, a tirozin kinazei,etc). Se produce,astfel un semnal complex pe faţa internă a membranei, care determină intrarea in activitate a unor receptori intracelulari . În urma acestor evenimente, numai celulele ataşate prin integrine la moleculele matricei extracelulare reacţionează, declaşând o cascadă de semnale care se traduc prin mnodificări în comportamentul celulelor şi prin proliferări celulare.9.Embriologia GENERALĂ

Embriologia este disciplina biologică care se ocupă cu studiul dezvoltării ontogenetice a organismelor, din momentul producerii gameţilori si până în momentul parturitiei sau ecloziunii.

Ontogeneza (ontogenesis) parcurge mai multe etape sau faze: 1) gametogeneza; 2) fecundaţia; 3) segmentarea; 4) gastrularea; 5) histogeneza; 6) organogeneza si 7) creşterea şi dezvoltarea postnatală sau post eclozională.

Etapele ontogenezei

Perioade ETAPE FAZEGametogeneza multiplicare

creştere maturare

Fecundaţia apropierepenetrareamfimixie

Dezvoltarea intramaternală(preeclozionala)

Embriogeneza(segmentaţia)

morulăblastulăgastrulă

Histogeneza(formarea ţesuturilor)

Neurulă

Organogeneza

Dezvoltarea fetală (preeclozională)Dezvoltarea postpartum(posteclozională)

Perinatală (perieclozională)Tinereţe MaturitateImbătrânire

În cazul mamiferelor, unele din aceste faze sunt parcurse în organismul matern, alcătuind dezvoltarea intrauterină, ce cuprinde: fecundaţia, segmentarea, gastrularea, histogeneza şi organogeneza.

Dezvoltarea intrauterină (genesis praenatalis) se continuă dupa actul parturiţiei (parturitio), în afara organismului matern cu o perioada denumita extrauterină sau postnatală.

În cazul păsărilor, perioada dezvoltării în organismul matern este înlocuită, aproape în totalitatea sa (exceptând fecundatia) de perioada dezvoltării în ou, iar după ecloziune se continua cu o perioada posteclozionala.

148

Fig.9.1. Formarea şi evoluţia gameţilor în cursul unei generaţii1- Ovul; 2-Spermatozoid; 3-Zigot; 4 – Celule somatice; 5- Celulă sexuală primordială; 6- Gonocite; 7- Ovogonii; 8- Ovocit I, 9- Ovocit II; 10- Globuli polari; 11- Ovocit matur; 12- Spermatogonii; 13- Spermatocit I, 14- Spermatocit II; 15- Spermatidă.

Dezvoltarea intrauterină sau preeclozională se desfasoară în trei etape:

1) o perioada embrionară sau embriogeneza (embryogenesis), care ţine până la apariţia celor trei foiţe embrionare şi a anexelor embrionare;

2) o perioada de histogeneză (histogenesis) şi organogeneză (organogenesis);

3) o perioada fetală (fetogenesis) - în care se continuă dezvoltarea organelor pâna la fatare (parturiţio) sau ecloziune.

Embriogeneza constituie obiectul de studiu al embriologiei generale, iar histogeneza, organogeneza şi perioada fetală sunt studiate de embriologia specială (ce va fi prezentată odată cu histologia ţesuturilor şi organelor).

9.1. Gametogeneza

Gametogeneza (gametogenesis) cuprinde ansamblul de transformari prin care trec celulele germinale primordiale (cellulae germinales promordial)sau gonocitele primordiale pâna la stadiul de celula sexuala matura. (Fig.9.1)

Procesul de gametogeneza parcurge trei perioade, asemanatoare la ambele sexe: 1) perioada germinativa (de multiplicare sau de înmultire); 2) perioada de crestere; si 3) perioada de maturare.

Gametogeneza

Perioade Spermatogeneza OvogenezaPerioada germinativă Spermatogonii (prăfoase-A

↓ intermediare-I ↓crustoase-B)

Ovogonii

Perioada de creştere Spermatocit primar I Ovocit primar I

Perioada de maturare

Speramatocit secundar II↓Spermatidie (faza Golgi → faza cap → faza acrozomică → faza de maturare)↓Spermatozoid

Ovocit secundar II( + polocit primar) ↓ Ovul (+polocit secundar)

149

9.1.1. Spermatogeneza

Spermatogeneza (spermatogenesis) cuprinde totalitatea proceselor pe care le parcurg spermatogoniile (gonocite primordiale mascule) până devin celule sexuale mature (spermatozoizi), apte pentru fecundaţie. Se desfasoară la nivelul epiteliului seminal din tubii seminiferi ai testiculului. (Fig.9.2)

1) Perioada germinativă (de multiplicare sau de înmultire) este parcursa în timpul prepubertatii, când gonocitele primordiale se divid mitotic, generând doua categorii de spermatogonii: a) unele mici, identice cu gonocitele primordiale; b) altele mai mari, spermatogoniile prafoase (de tip A) (spermatogonium A), care se vor divide mitotic, în mod repetat, trecând spritr-un stadiu intermediar (spermatogonium intermedium) şi generând spermatogoniile crustoase (de tip B) (spermatogonium B), care vor continua linia seminala.

Fig. 9.2. Epiteliul tubului seminal 1-Spermatogonie; 2- Spermatocit I; 3- Spermatocit II, 4, 5, 6 – Spermatide în evoluţie; 7-

Spermatozoizi; 8- Celulă Sertoli; 9 – Membrană bazală.

2) Perioada de creştere se declansează odată cu pubertatea şi constă în creşterea (dublarea în volum) a spermatogoniilor, transformându-se în spermatocite de ordinul I (spermatocytus primarius).

Fig.9.3. Spermatogeneza

I-Perioada germinativă; II-Perioada de creştere;III-Perioda de maturare.1-Gonocit; 2- Spermatogonii;3-Spermatocit I; 4-Spermatocit II; 5-Spermatide; 6-Spermatozoizi

3) Perioada de maturare se remarcă prin faptul ca spermatocitul de ordinul I se divide reducţional (meiotic) generând doua spermatide de ordinul II (spermatocytus secundarius) (cu set haploid de cromozomi), care se divid imediat (în mod mitotic), rezultând în final 4 spermatide dintr-un spermatocit de ordinul I sau două spermatide dintr-un spermatocit de ordinul II. (Fig.9. 3)

150

Spermatidele (spermatidium,a) parcurg o metamorfoză celulară, denumită spermiogeneza (spermiogenesis) , fiecare spermatidă devenind un spermatozoid (spermatozoon s. spermium).

Spermiogeneza are loc în căile genitale intratesticulare.Spermatida apare ca o celula poliedrică, în citoplasma careia se găseşte un nucleol situat

central. Complexul Golgi şi mitocondriile sunt dezvoltate, iar centrul celular este reprezentat de doi centrioli. Elementele reticulului endoplasmic neted sunt numeroase şi asociate cu lipide. Enzimele hidrolitice sunt active.

Transformarea spermatidei în spermatozoid, spermiogeneza, se realizează în patru perioade succesive: a) perioada Golgi; b) perioada cap; c) perioada acrozom; d) perioada de maturare. (Fig.9.4)

Fig. 9.4. Spermiogeneza1-Nucleu; 2- Complex Golgi; 3- Mitocondrii; 4- Centrioli; 5- Vacuolă acrozomală;6- Gâtul spermatozoidului; 7- Centriol proximal; 8- Porţiunea proximală a centriolului distal; 9- Piesa intermediară; 10- Porţiunea distală a centriolului distal; 11 –Piesa principală a cozii.

a) În perioada Golgi: 1. - nucleul spermatidei se deplasează în sens axial, către un pol al celulei, se alungeşte şi se aplatizează uşor; 2. - complexul Golgi, cuprinzând în interiorul sau granule proacrozomice (granulum proacrosomaticum) şi vezicule proacrozomiale (vezicula proacrosomatica), se deplaseaza, în cadrul citoplasmei, către polul anterior al nucleului; 3. - centriolii se despart, dispunându-se unul lângă polul caudal al nucleului (centriolul proximal), iar celălalt la o distanţă de 1-2 µm (centriolul distal), de nucleu - de la el desprinzându-se filamentul axial al viitoarei cozi.

b) În perioada cap: 1. – proacrozomul (proacrosoma) sau vezicula crozomală se detaşează de complexul Golgi, se aplatizează şi ia forma unui capişon ce îmbracă jumatatea anterioară a nucleului; 2. - complexul Golgi migrează spre periferia citoplasmei; 3. - microtubulii din citoplasmă se grupează între cei doi centrioli şi structurează filamentul axial, din care se va constitui viitoarea axonemă a spermatozoidului.

c) În perioada acrozomică: 1. - nucleul spermatidei se alungeşte, devenind ovoidal; 2. – vezicula acrozomală se transformă în acrozom şi acoperă jumătatea anterioară a nucleului; 3. nucleul devine compact, pierde o parte din apă, iar cromatina se condensează; 4. - citoplasma se deplasează spre polul posterior al nucleului; 5.-axonema creşte în lungime, structurând piesa de conjugare şi piesa intermediară; 6.- centriolul distal se desparte într-o jumătate proximală, cu aspect discoidal, situată între piesa de conjugare şi piesa intermediară, si o jumătate distală, cu aspect inelar, ce înconjoară axonema cozii, fiind situată între piesa intermediară şi piesa principală.

d) În perioada de maturare a spermiogenezei: 1. - jumătatea inelară a centriolului distal (denumită si “inelul Jensen”) se îndepărtează, delimitând lungimea piesei intermediare; 2. - citoplasma spermatidei se reduce; 3. – mitocondriile, în număr de 15-25, se dispun în helix (cu 14 ture), în jurul filamentului axial al cozii; 4. - se conturează aspectul morfologic al spermatozoizilor maturi, care au capul înfundat în faldurile membranei apicale a celulelor de susţinere (Sertoli); 5. - pe măsură ce se realizează maturarea, spermatozoizii încep să secrete hialuronidaza şi se desprind de celulele de sustinere, devenind liberi.

Nucleul spermatidei suferă o serie de modificări, precum:

151

– condensarea cromatinei, formând în stadiile iniţiale fibre paralele cu axul lung al nucleului, fibre care mai târziu se grupează în lamele;– membrana nucleară îsi măreşte suprafaţa, formând falduri care sunt mai numeroase spre polul posterior (caudal) al nucleului, unde şi porii membranei sunt mai numeroşi;– la polul anterior, cromatina nucleară aderă la membrana nucleului, iar la polul posterior se dispune sub aspectul unui material filamentos între cutele membranei.

Citoplasma spermatidei este mai hialină şi conţine ribozomi, lipide, glicogen şi puţine mitocondrii. Se realizează un trazit intens între nucleu şi citoplasmă.Odată cu maturarea completă se acumulează spre polul posterior al nucleului, sub forma unei picături, denumită relicvat citoplasmatic (sau corp rezidual), ce va fi fagocitat de celule Sertoli. În viitorul spermatozoid, rămâne numai o fină peliculă citoplasmatică acoperită de plasmalemă.

9.1.1.1.Morfologia spermatozoidului

Evidenţiat în 1667 la om, de Ham din Leyda şi în 1679, la animale, de van Leeuwenhoek, spermatozoidul (spermatozoon s. spermium) este format din: cap şi flagel (coadă).

Fig. 9. 5. Structura şi ultrastructura spermatozoidului la taurine

A- Aspect la microscopul optic; B – Aspecte electronomicroscopice.

I – Capul spermatozoidului; II – Gâtul; III – Piesa intermediară; IV – Piesa principală; V – Peisa terminală.1- Plasmalema; 2- Acrozom; 3- Membrana nucleară; 4 – Nucleu; 5- Protuberanţe bazale; 6- Placa bazală; 7- Capitelul; 8- Coloanele segmentate; 9- Centriolul proximal; 10-Mitocondrii; 11- Perechea centrală de microtubuli; 11- Perechile periferice de microtubuli; 13- Fibre dense.

Capul spermatozoidului

152

Capul (caput) prezintă forme şi dimensiuni diferite, în funcţie de specie, apărând ovalar (la hominide, armăsar, taur, berbec, ţap, vier) sau cu formă de: pară (la iepure şi câine), seceră (la cocoş şi şobolan), cu lungimi medii între 5 µm (la băbat) şi 9 µm (la berbec), grosimile medii atingând între 2-5 µm.

Nucleul spermatozoidului este înconjurat de un strat subţire de citoplasmă şi de o plasmalemă periferică foarte delicată.

În componenţa capului intră: nucleul, acrozomul, capişonul cefalic, perforatorul, protuberanţele bazale şi membrana periferică.

Nucleul (nucleus) conţine cromatina deshidratată şi condensată, în care ADN-ul (43%) este strâns combinat cu protamine bazice (57%). Ocupă cea mai mare parte din capul spermatozoidului. Cromatina apare mai condensată la baza nucleului, granulară în partea apexială şi cu aspect clar, în regiunea ecuatorială. Cantitatea de cromatină reprezintă o caracteristică de specie. Din cromatină se formează cromozomii autosomi şi un heterozom. Deoarece spermatozoizii sunt celule haploide conţin numai jumătate din numărul de cromozomi al unei specii ( n cromozomi ). Se acceptă că, aproximativ, jumătate din numărul total de spermatozoizi dintr-un testicul conţin cromozomul sexual X, iar cealaltă jumătate cromozomul Y.(Fig.9.5)

Acrozomul este situat supranuclear, interpus între membrană şi nucleu, pe care îl acoperă până în zona inelului ecuatorial. Se formeză din complexul Golgi în timpul spermiogenezei. Cuprinde în structura sa: o membrana acrozomică internă (membrana acrosomatica interna),o membrană acrozomică externă ( membrana acrosomatica externa) şi o substanţa acrozomică (substantia crosomatica), în care se disting granulele acrozomice (granulum acrosomale). Este considerat un lizozom specializat ce conţine multe enzime hidrolitice (ex: fosfataza acidă, hialuronidaza) si o proteină înrudită cu tripsina. Aceste enzime depolimerizează acidul hialuronic ce cimentează celulele foliculare din coroana radiată a ovocitului, dispersându-le . Joacă un rol hotărâtor în fecundaţie şi fiind prezent la toate speciile de animale.

Capişonul cefalic reprezintă o peliculă foarte fină de citoplasmă condensată, ce se interpune între membrana periferică şi acrozomul pe care îl acoperă. Conţine glicoproteine.

Perforatorul este situat între acrozom şi membrana nuclerară, având rolul să perforeze plamalema ovocitului. Formeză un canal în citoplasmă, prin care se transferă conţinutul nucleului spermatozoidului.

153

Structura şi ultrastructura spermatozoidului

Protuberanţele bazale apar ca două formaţiuni osmiofile semicirculare, formate din citoplasmă condensată, dispuse la polul caudal (bazal) al capului. Delimitează între ele fosa de implantare. Fosa de implantare (fosulla articularis) apare ca o escavaţie redusă ce serveşte pentru inserţia extremităţii proximale a filamentului axial al cozii spermatozoidului.

Membrana periferică, trilaminată, foarte delicată şi transparentă, acoperă capişonul cefalic şi acrozomul, delimitând capul spermatozoidului. Prezintă receptori specifici.

Coada spermatozoidului sau flagelul Flagelul (flagellum) cuprinde (dupa “Nomina Histologica” – 1994) următoarele parti: gâtul,

piesa intermediară, piesa principală şi piesa terminală.a) Gâtul spermatozoidului (pars conjungens) apare foarte scurt, circa 0,4 µm, fiind delimitat

între nucleu şi jumătatea proximală a centriolului distal.Conţine placa bazală, capitelul, coloanele segmentate, centriolul proximal, mitocondriile şi

dispozitivul fibrilar, fiind delimitat la periferie de o membrană fină de natura lipoproteică. Este foarte fragil, rupându-se deseori.

Parţi componente

Structuri Ultrastructuri Observaţii

Nucleulvezicule nuclearesaci nucleari

CAP

Acrosomul Membrană acrosomică internăMembrană acrosomică externăSubstanţă acrosomicăGranule acrosomice

Capişonul cefalic citoplasma dintre plasmalemă şi acrozom

Perforatorul Waldeyer

ctoplasma dintre acrozom şi membrana nucleară

Protuberanţele bazale

delimitează foseta de implantaţie

Plasmalemamembrana periferică

Piesa de conjugare (gâtul)

placa bazalăcapitelulcoloanele segmentarecentriolul proximaldispozitivul fibrilarplasmalema

FLAGEL

Piesa intermediară

jumătate proximală a centriolului distalaxonema (filamentul axial)dispozitivul fibrilarteaca mitocondrilăjumătatea distală a centriolului distal -inelul

9 fibrile proteice dense

Piesa principală

axonema (filamentul axial)dispozitivul fibrilarteaca fibroasă

plasmalemafibre circumferenţiale + 2 coloane longitudinale

Piesa terminalăFilamentul axialplasmalema

154

Placa bazală (patella basalis) este o lamă fixă de citoplasmă osmiofilă, dispusă în fosa de implantare. Delimitează capul spermatozoidului de gât, interpunându-se între membrana nucleară şi capitel.

Capitelul (capitulum) este segmentul proximal al complexului centriolar şi reprezintă zona de unire a bazelor coloanelor segmentate (basis columnaris), care vine în contact cu faţa distală a plăcii bazale.

Coloanele segmentate sau striate (columna striata), sunt considerate ca fiind rădăcinile axonemei flagelului. Apar formate din elemente proteice fibroase, cu o structură periodică (perioada este de 650 Å). Sunt sintetizate în ribozomii spermatidei şi polimerizate radial în jurul centriolului proximal.

Dupa constituirea coloanelor segmentate, centriolul proximal devine centriol cinetic al cozii spermatozoidului.

Centriolul proximal (centriolum proximale), situat sub capitel, prezintă o forma de cilindru (cu o lungime de 500nm şi un diametru de 250nm) şi o înclinaţie de 70°, în raport cu axa lungă a cozii. Are peretele format din 9 triplete (A,B,C) de microtubuli.

Mitocondriile sunt alungite şi dispuse în partea distală a gâtului, înconjurând dispozitivul fibrilar.

Dispozitivul fibrilar este compus din 9 fibrile dense (aflate în continuarea coloanelor segmentare), care înconjoară un complex filamentos axial (axonema), alcătuit din 10 perechi de microtubuli, din care o pereche este centrală, iar celelalte 9 perechi sunt dispuse periferic. (Fig. 9.6)

Fig.9.6. Secţiuni transversale prin coada spermatozoiduluiA – Piesa intermediară; B- piesa principală; C Piesa terminală.a- Filament axial; b –Fibre externe; c – Fibre satelit; d- Teaca mitocondrială; e-Teaca fibroasă; f- coloane longitudinale; g – Plasmalema.

Spermatozoizii imaturi prezintă la limita dintre piesa de comjugare şi piesa inmtermediară o picătură citoplasmatică, care va fi fagocitată de celulele Sertoli până la maturarea completă.

b) Piesa intermediara (pars intermedia), cu lungimi variabile (5-10 µm), este delimitată între cele două jumatăţi (proximală şi distală) ale centriolului distal. Cuprinde în structura sa: 1. o membrana plasmatică periferică, ce prezintă o margine inelară (annulus) - la limita cu piesa principală; 2. o pelicula de citoplasmă, în care se găsesc particule mici ce formează rezerva de glicogen a spermatozoidului; 3. mitocondriile - dispuse helicoidal într-un filament dublu spiral (cu circa 25 de ture a 3-4 mitocondrii fiecare), ce formează o “teacă mitocondrială” (vagina mitochondrialis); 4. fibre externe dense (fibra densa), groase si masive, în numar de nouă, inegal dezvoltate şi în contact cu fibrele satelite axolemei, plasate central; 5. filamentul axial (filamentum axiale s. axonema), compus din 9 dublete periferice (diplomicrotubulus periphericus) si o pereche de filamente centrale (microtubulus centralis).

Piesa intermediară joacă rolul de centrală energetică a spermatozoidului.

c) Piesa principală apare de aproximativ 9 ori mai lungă decât piesa intermediară. Cuprinde: 1. - filamentul axial (axonema), format din cele 10 perechi (9+1) de microtubuli ; 2. – nouă fibre dense (fibra densa) externe, groase; 3. - teaca fibroasă (vagina fibrosa) formată din fibre circumferenţiale (costa fibrosa), care se prind prin capetele lor în două coloane longitudinale (columna longitudinalis) ce reprezintă îngroşări ale tecii, diametral opuse; 4. - membrana plasmatică.

155

d) Piesa terminală (pars terminalis), cu o lungime de 3-4 µm cuprinde numai membrana plasmatică şi complexul filamentos axial (axonema), care îsi pierde aranjarea tipică a dubletelor.

Ciclul spermatogenetic (spermatogenesis) are o durată variabilă la diverse specii (13,5 zile la taur, 10,4 la berbec, 8 zile la vier), iar dintr-o spermatogonie rezultă un numar variabil de spermatide (112 la şoarece, 96 la hamster şi 64 la taur şi berbec).

Desfăşurarea spermatogenezei este influenţată de numeroşi factori fizici, fiziologici, farmacologici, umorali. Astfel, temperatura ridicată, aplicată local sau în condiţii generale produce oligospermie, iar razele X şi gama atacă spermatogoniile si cromozomii spermatidelor. Alimentaţia deficitară în proteine sau vitamine (A, E), unii hormoni (FSH, LH) şi sistemul nervos pot interveni, modificând funcţia spermatogenetică.

Pentru a-si îndeplini functia de reproducere, spermatozoizii trebuie să prezinte: mobilitate, putere fecundantă şi vitalitate.

Mobilitatea se datorează prezenţei tubulilor în organizarea flagelului (cozii) spermatozoidului. Suprimarea mobilitaţii împiedică, în mod ireversibil fecundaţia. Viteza de deplasare diferă în funcţie de specie, atingând: 6-7 mm/minut la taur; 5-10 mm/minut la berbec; 4-6 mm/minut la armasar; 3-6 mm/minut la vier.

Puterea fecundanta sau capacitatea vitală (capacitaţia) este o însuşire pe care spermatozoizii o dobândesc când ajung în căile genitale femele, după o perioadă de aclimatizare. Această însuşire se dobândeşte prin pierderea unei calităţi antagoniste (decapacitaţia) pe care spermatozoizii o folosesc ca protecţie în drumul lor prin căile genitale mascule. Ea permite spermatozoidului să pătrundă în ovul sau în mucoasa uterină.

Vitalitatea este proprietatea spermatozoizilor de a-şi păstra mobilitatea şi puterea fecundantă în condiţii de conservare.

9.1.2. Ovogeneza

Ovogeneza (ovogenesis) cuprinde complexul de transformări prin care trece ovogonia (celula germinativă iniţială) până devine ovul (ovocit) apt de fecundare.

Se petrece în zona corticală a ovarului, în interiorul unor formaţiuni histologice complexe, denumite foliculi ovarieni.

În ovogeneză sunt parcurse trei perioade: germinativă, de creştere şi de maturare.1. Perioada germinativă (de înmulţire) se desfăşoară în timpul vieţii embrionare, având ca

punct de plecare ovogoniile din ovarul embrionar. În perioada embrio-fetală, în ovar se formează întreaga rezervă de celule sexuale femele, pentru toată viaţa (ce cuprinde circa 60.000 - 100.000 ovocite de ordinul I). Ovocitele de ordinul I (ovocytus primarius) rămân în stare de latenţă biologică (status quiescent) până la pubertate, fiind blocate în profaza diviziunii meiotice (reducţionale).

2. Perioada de creştere variază foarte mult ca durată, începând imediat dupa naştere şi ajungând să se întindă pe ani de zile (exemplu: la hominide până la 20-30 de ani). În cursul acestei perioade se produce şi se acumulează vitelus.

La păsări, perioada de vitelogeneza cuprinde două intervale: a) unul lung de circa 180 de zile, la găină, în care se realizează 5-10% din rezervă de vitelus şi b) altul mai scurt, de circa 5 -12 zile, în care se sintetizează 90-95% din vitelus.

Vitelogeneza constă în formarea de plăcuţe de vitelus în citoplasma ovociţilor primari. Vitelusul este format din substanţe nutritive (glicogen, lipide, fosfolipide) care sunt produse în ficat (vitelus exogen) apoi sunt vehiculate de sânge şi pinocitate în ovocite prin microvilozităţile care apar la suprafaţa membranei acestor celule.

3. Perioada de maturare a ovocitelor începe la pubertatea animalului. Cuprinde cele două diviziuni de maturare: a) prima diviziune, care este meiotică (reducţionala), din ovocitul de ordinul I rezultând două celule inegale: una de talie mare (haploidă) - ovocitul de ordinul II (ovocytus secundarius) şi alta de talie mică - primul globul (polocytus primarius), ce se poate divide; b) a doua diviziune de maturare este mitotică, din ovocitul secundar (ovocit de ordinul II) rezultând ovulul (ovocitul) matur şi al doilea globul polar (polocytus secundarius).

În acest fel, la sfârşitul perioadei de maturare, dintr-un ovocit primar, rezultă un ovocit cu set haploid de cromozomi şi trei globuli polari. (Fig. 9.7)

156

Fig.9.7. Ovogeneza1- Ovogonie; 2- Ovocit I; 3-

Ovocit II; 4- Primul globul polar; 5- Spermatozoid; 6_ Ovul matur; 7- Globuli polari secundari.

Dehiscenţa (ruperea) foliculară şi eliberarea ovocitelor are loc în momentul în care ovocitul primar (ovocitul de ordinul I) îsi formează fusul de diviziune, intrând în prima diviziune de maturare (meiotica), încât pavilionul oviductului captează deja ovocitul secundar (ovocitul de ordinul II). Posibilităţile de supravieţuire ale ovocitului secundar (ovocitul de ordinul II) sunt de 24-48 de ore, iar a două diviziune de maturare se finalizează numai dacă a avut loc penetraţia zonei pelucide de către spermatozoizi. În caz contrar, ovocitul secundar (de ordinul II) rămâne blocat în metafaza celei de-a doua diviziuni de maturare.

În momentul dehiscenţei, ovocitul secundar (ovocitul de ordinul II) este înconjurat de ovolemă, zona pelucida şi coroana radiata.

Ovolema (ovolema sau membrana vitelină) este o membrana citoplasmatică cu numeroşi microvili.

Zona pelucidă (zona pellucida) este o zonă mucopoliglucidică, traversată de microvili lungi ai celulelor foliculare, ce ajung la microvilii ovolemei.

Coroana radiata (corona radiata) este formată din 1-2 rânduri de celule foliculare.

9.1.2.1. Morfologia ovulei

Ovula sau ovocitul matur (ovum) reprezintă celula sexuală femelă matură, haploidă, cu o formă sferică şi cu un diametru de până la 200 µm. Conţine, pe lângă materialul genetic inclus în cromozomi şi material nutritiv necesar pentru perioada iniţială de dezvoltare a embrionului.

a) Nucleul celulei apare sferic, veziculos, nucleolat, cu cromatina fin granulară, situat central sau excentric şi delimitat de o membrană dublă cu pori, în al căror lumen este prezent un material electronodens, ce intervine selectiv în reglarea tranzitului nucleo-citoplasmatic. Prin porii membranei nucleare trec în citoplasmă granule electronodense de 350Å.(Fig.9. 8)

157

Fig. 9.8. Structura şi ultrastructura ovocituluiA- Aspect la microscopul optic; B- Aspect electronomicroscopic.1- Citoplasma ovocitului; 2- Nucleu; 3- Reticul endoplasmic neted; 4- Reticul endoplasmic

rugos; 5- Mitocondrii; 6- Plăcuţe viteline; 7- Ovolema; 8-Zona pelucida; 9- Celule foliculare.

b) Citoplasma ovulei (ovoplasma) este acidofilă şi fin granulară. Conţine, pe lângă organitele comune, aglomerate în zona perinucleară, mult ARN liber şi “nucleul vitelin” (Balbiani) (deuteroplasma s. vitellus), o formaţiune ovoidă formată din mitocondrii, dictiozomi şi lamele inelare. Mitocondriile alcătuiesc o coroană perinucleară incompletă. La bovidee, mitocondriile au o prelungire în forma de “glugă”, ce cuprinde în concavitatea ei o picatură lipidică. Cristele mitocondriale lipsesc în prelungire dar se menţin în restul mitocondriei. (Fig.8.9)

Fig. 8.9. Aspectul mitocondriei în ovocitul de la bovidee1- Matrice mitocondrială; 2- Criste mitocondriale; 3- Prelungire în formă de glugă; 4- Picătură în formă de lipide.

c) Complexul Golgi se extinde şi în zona corticală a citoplasmei, unde este constituit din granule corticale, înconjurate de endomembrane. Granulele corticale participă la formarea lichidului perivitelin, îndeplinind un rol important în fecundaţie. Complexul Golgi participă activ la concentrarea vitelusului şi la sinteza lipidelor, procese în care sunt implicate şi mitocondriile.Reticulul endoplasmic este de tip neted, cu elemente dispuse lax.

Ribozomii sunt liberi sau ataşaţi reticulului endoplasmic. De asemenea, sunt prezenţi în citoplasmă: lizozomi primari, corpi multiveziculari (ca urmare a pinocitozei intense) şi numeroase granule (plăcuţe de vitelus).

d) Membrana vitelina a ovocitului ( ovolemma s.plamalemma) este de natura lipoproteică trilaminată şi prezintă numeroase prelungiri - sub forma de microvilozităţi fine, care se angrenează cu prelungirile rare şi groase ale celulelor foliculare. Se pare că formaţiunile microviloase nu sunt permanente, apariţia lor fiind legată de stadiul funcţional al celulei. La nivelul membranei viteline se observă numeroase vezicule pinocitice, ceea ce demonstrează schimbul intens de substanţe ce se efectuează între celulele foliculare ale coroanei radiata şi ovul. (Fig.9.10)

Fig. 9.10. Relaţia dintre ovocit şi celulele foliculare

1- Prelungirile celulelor foliculare; 2- Microvilii ovocitului; 3- Zona pelucida; 4- Desmozomi; 5- Vezicule de pinocitoză

Zona pelucida (zona pellucida) prezintă un aspect striat, datorat microvilozităţilor membranei viteline şi ale celulelor foliculare, în care se realizează joncţiuni celulare de tipul “zonulei adherens”.

Capacitatea vitală a gametului femel diferă, în raport cu specia şi se menţine: 10 ore la iapă, 20 ore la vacă, 5 ore la oaie, 12 ore la scroafă şi 6 ore la iepuroaică.

Clasificarea ovocitelor se face în funcţie de cantitatea de vitelus pe care o conţin, existând următoarele tipuri: oligolecite, lecite, telolecite şi centrolecite.

158

Ovulele oligolecite conţin vitelus în cantitate mică, iar segmentaţia lor este totală şi inegală. Sunt prezente la cefalocordate (la amfioxus)si la mamifere. (Fig.9.11)

9.11. Tipuri de ovociteA- Ovocit oligolecit; B- Ovocit centrolecit; C- Ovocit mezolecit (lecit); D-Ovocit telolecit; 1-Disc germinativ; 2- Latebră Purkinje; 3- Vitelus nutritiv.

Ovulele lecite sau mezolecite se întâlnesc la batracieni şi cuprind mai mult vitelus decât cele oligolecite. Vitelusul se aglomerează la polul vitelin sau vegetativ al celulei, în timp ce polul vitelin al celulei este sărac în vitelus şi conţine nucleul. Segmentaţia este totală, rezultând blastomere inegale.

Ovulele telolecite sunt caracteristice peştilor, reptilelor şi păsaărilor. Vitelusul, în cantitate mare, ocupă aproape întreaga masă a ovulei, în timp ce nucleul (sau vezicula germinativă) împreună cu o cantitate redusă de citoplasmă formeaza discul germinativ. Segmentaţia este parţială şi discoidală interesând numai

Ovulele centrolecite sunt caracteristice artropodelor. Vitelusul nutritiv ocupa centrul ovulei, în timp ce vitelusul formativ (hialoplasma) formează un strat periferic subţire. Segmentaţia interesează numai vitelusul formativ, apărând de tip superficial.

159

9.2.FECUNDAŢIA

Fecundatia este un proces biologic complex, format dintr-o succesiune de fenomene interdependente prin care, cei doi gameţi de sex opus (spermatozoidul şi ovula) se contopesc şi se asimilează reciproc, rezultând zigotul (sau oul), prima celula a unui viitor organism.Fazele fecundaţiei

Faze Intervin: Se produce: Observaţii:Faza de apropiere

-fertilizina ( ginogamon)-antifertilizina(androgamon)

-disociere celulelor foliculare -este nespecifică

Faza de penetraţie

-acrozina (=hialuronidaza)

-penetraţia membranei pelucida-eliberarea polocitului secundar- pătrunderea spermatozoidului în ovula

- la homonide şi rozătoare penetraţia este totală

Faza de amfimixie

-rotaţia capului spermatozoidului-formarea asterului spermatic-cariogamia-singamia-refacerea setului diploiddeterminarea sexului

Fecundaţia se realizează în trei faze succesive: de apropiere, de penetraţie şi de amfimixie.a) Faza de apropiere are loc datorită atracţiei reciproce dintre cei doi gameţi întrucât

membrana pelucida a ovocitului conţine o glicoproteină denumită fertilizină sau ginogamon, care reacţionează cu o proteină acidă de pe suprafaţa spermatozoizilor, denumită antifertilizină sau androgamon. În felul acesta se produce o reacţie similară reacţiei dintre antigen şi anticorp.

S-a demonstrat ca anticorpii IgG pot impiedica ataşarea spermatozoizilor şi penetrarea zonei pelucide (denumită şi membrană pelucida). Pot apărea autoanticorpi pentru zona pellucida care să genereze infecunditate.

Spermatozoizii care au capacitate fecundantă (capacitatio) produc disocierea celulelor foliculare din “coroana radiata” cu ajutorul hialuronidazei, deschizând drumul spre membrana (zona) pelucida. La vacă, oaie, capră disocierea are loc imediat după ovulaţie. Disocierea celulelor foliculare nu este specifică, realizându-se şi sub acţiunea enzimelor eliberate de spermatozoizii altor specii.

Apropierea celor doi gameti are loc în treimea superioara oviductului. Ataşarea spermatozoidului de zona pelulucida are loc în urma formării unor legături între o glicoproteină din membrana plamatică a spermatozoidului (o galactosyltransferază) şi receptorii pentru aceasta din zona pellucida .(Fig.9.12)

Fig. 9.12. Etapele realizării fecundaţiei

A- Penetrarea zonei pelucide, a speţiului perivitelin şi a membranei viteline;

B- Pătrunderea spermatozoidului în ovul;

C- C-Formarea pronucleilor mascul şi femel;

D-Amfimixia; E- Metafaza primei

diviziuni1- Ovocitul; 2- Nucleul; 3- Ovolema; 4- Spaţiul perivitelin; 5- Zona pelucidă

cu spermatozoizi.

160

b) Faza de penetraţie (penetratio spermii) constă în pătrunderea câtorva spermatozoizi,

numai din aceeaşi specie sau din specii foarte apropiate, ca de exemplu: cal-măgar. Spermatozoizii trec prin zona (membrana) pelucida şi ajung în spaţiul perivitelin (spatium perivitellinum), plin cu lichid perivitelin (liquor perivitellinus).

În urma contactului dintre acrozom şi membrana (zona) pelucida, se rupe membrana acrozomului (reactio acxrosomalis), eliberându-se acrozina (sau hialuronidaza), ce produce o hidroliză localizată, realizând un canal (via spermatica) tangenţial la ovolemă. Mişcările spermatozoizilor (motus spermii) de traversare a zonei pelucide durează circa 5 minute.

Ovocita reacţionează la pătrunderea unui număr redus de spermatozoizi în zona pelucida, prin realizarea celei de-a doua diviziuni de maturare, rezultând al doilea globul polar (polocitul secundar), celulă care va fi eliminată şi ovula, aptă pentru fecundare. Dupa ce primii spermatozoizi au pătruns în zona pelucidă se produce reacţia zonei pelucide, adică: granulele corticale din ovocit îşi varsă conţinutul în spatiul perivitelin, ceea ce face ca din acest moment zona pelucida să devină impermeabilă şi rezistentă faţă de acrozina altor spermatozoizi. Impermeabilizarea se poate realiza lent, in circa 60 secunde (la vacă, iapă, oaie, scroafă, căţea, hamster), sau rapid în1-2 secunde (la iepuroaică). În felul acesta se asigura fecundaţia monospermică (monospermia) şi se evită polispermia (polyspermia).

Spermatozoizii cei mai viguroşi se orientează spre orificiul membranei viteline prin care a fost expulzat cel de-al doilea globul polar. Numai un singur spermatozoid, denumit spermatozoid privilegiat pătrunde în ovulă.

La taurine, ovine, canide şi leporide, în ovulă pătrunde numai capul spermatozoidului, gâtul şi coada rămânând în zona pelucida. La hominide şi la unele rozătoare ( şoarece, cobai) penetraţia este totală.

La mamifere, producerea contactului dintre cei doi gameţi şi realizarea fecundaţiei depinde de supravieţuirea spermatozoizilor, depuşi în căile genitale femele. Supravietuirea variază în funcţie de specie, fiind de: 44 ore la armăsar, 25-30 ore la taur, 30-35 ore la berbec, 8 -12 ore la iepure.

c) Faza de amfimixie sau concepţie (conceptio) are loc după pătrunderea spermatozoidului în ovulă. În această fază se produc următoarele fenomene: 1. capul spermatozoidului migrează spre centrul ovulului, unde se afla nucleul, suferind o rotaţie de 180°, încât acrozomul se orientează spre membrana vitelină, iar gâtul spermatozoidului se orientează spre nucleul ovulului; 2. centriolul proximal se detaşează de baza capului, formând spermocentrul, iar citoplasma ovulei se condensează în jurul spermocentrului sub formă de “raze” citoplasmatice, dând naştere la “asterul spermatic” (aster spermaticus); 3. capul spermatozoidului, respectiv nucleul, începe sa asimileze foarte repede citoplasma ovulei, creşte în volum şi devine pronucleu mascul (pronucleus masculinus); 4. nucleul ovulei suferă modificări infrastructurale şi mai ales biochimice, transformându-se în pronucleu femel(pronucleus femininus); 5. cei doi pronuclei se apropie reciproc, membranele lor vin în contact, se alipesc (realizând cariogamia), se dizolvă în acest punct şi se formeaza o singură membrană nucleară, în interiorul căreia se asimilează reciproc (realizând singamia ) componentele infrastructurale şi biochimice ale celor doi pronuclei, obţinându-se astfel o celula nouă, zigotul (zygota s. conceptus) sau oul fertilizat (ovum fertilizatum s.spermovium).

În timpul amfimixiei se reface setul diploid al zigotului, realizându-se setul de cromozomi caracteristic speciei şi stabilindu-se bazele eredităţii ale noului organism. Se determină sexul şi se declanşează segmentaţia.

Durata totală a fecundaţiei variază în funcţie de specie, fiind în medie de 12-16 ore, la animalele domestice. Cel mai mare număr de ore (10-12 ore) este ocupat de fenomenele care au loc la nivelul pronucleilor. Există unle specii de animale nevertebrate (albine,furnici, purici de plante) sau vertebrate (o specie de şopârlă, Lacerta saxatilis), la care dezvoltarea ovulei se poate produce fără a fi avut loc fecundaţia, prin fenomenul de partenogeneză. De asemenea, la unele specii de peşti (la caras - Carassius auratus gibelio), a fost observat fenomenul de pseudogamie sau ginogeneză , o formă de fecundaţie incompletă, când nu se produce amfimixia, deşi spermatozoidul pătrunde în ovul. Puii rezultaţi au moştenit şi unele caractere de la taţi, ceea ce demonstreză influenţa substanţelor din spermatozoizi asupra metabolismului şi dezvoltării oului,chiar şi în cazul, în care nu s-a produs amfimixia.

În patologia fecundaţiei se întâlnesc aspecte precum: a) himerismul - când are loc o fecundaţie dispermică: un spermatozoid face amfimixie cu nucleul ovulei, iar celălalt spermatozoid face amfimixie cu nucleul globulului polar, antrenându-se într-o dezvoltare anarhică; b) aberaţiile cromozomiale, datorate greşelilor din meioză şi mitoză, ce pot interesa atât gonozomii, cât şi autozomii, producându-se diferite malformaţii cromozomiale.

161

9.3. Segmentatia

Prin segmentaţie se înţelege ansamblul diviziunilor pe care le urmează zigotul şi în urma cărora se realizează edificii pluricelulare. Se declanşează la un interval variabil de timp după fecundare (la circa 30 de ore la hominide).La sfârşitul ei embrionul este schiţat, fiind constituit din primele două foiţe embrionare. Se desfaşoară în timp ce zigotul coboară prin oviduct în uter şi cuprinde următoarele stadii embrionare: morula, blastula, gastrula şi neurula.

Ca model didactic pentru explicarea segmentaţiei, se prezintă segmentaţia la amfioxus (de la grecescul amphi = dublu; oxys = ascuţit), Branchiostoma lanceolatum, un cefalocordat. Este cea mai simplă segmentaţie şi prezintă asemănări cu cea de la pasăre şi mamifere.

9.3.1.Segmentaţia la amfioxus

Amfioxus are ovul de tip oligolecit, care va realiza o segmentaţie totală holoblastică (fissio holoblastica s. fissio totalis) şi inegală ( fissio inequalis) , parcurgând fazele de: morulă, blastulă, gastrulă şi neurulă. (Fig. 9.13)

Fig. 9.13.

Segmentaţia la amfioxusA- Zigot; E,C,D – Apariţia blastomerelor; E- Morula; F- Invaginarea blastulei; G- Formarea gastrulei.1- Polul animal; 2- Polul vegetal;

9.3.1.1.. Faza de morula

Faza de morulă (morulatio) începe la câteva ore după fecundare, când zigotul (zygota s. conceptus) sau celula ou intră în diviziune. Prima diviziune se realizează după un plan vertical, meridional (planul fissionis meridionalis), rezultând două blastomere (blastomerus) egale, al căror volum total nu depăseşte volumul zigotului (a celulei ou). A doua diviziune este tot meridională (verticală), însă perpendiculară pe planul primei diviziuni, rezultând patru blastomere. A treia diviziune este transversală, planul de diviziune fiind paralel cu ecuatorul, dar situat supraecuatorial (planum fissionis tangentiale). Rezultă opt blastomere inegale: patru blastomere mici, micromere (micromerus), în emisfera polului animal şi patru blastomere mai mari, macromere (macromerus), situate în emisfera polului vegetativ. Prin diviziunile ulterioare, numărul blastomerelor creşte în proporţie geometrică (16, 32, 64, 128) atât în cazul micromerelor cât şi în al macromerelor. Celulele rezultate în urma acestor diviziuni vor genera o formaţiune sferoidală (spheroideum s. sphaeroideum), plină de celule cu aspect muriform, denumită morula (morula).

Morula este mai mare, ca volum, decât celula ou din care s-a format. În cadrul ei, micromerele se dispun spre polul animal, iar macromerele spre polul vegetal al morulei.

Se consideră că, până în stadiul de câteva (8-10) blastomere, toate celelele sunt omnipotente (cellula omnipotens) sau pluripotente (cellula pluripotents), având aceeaşi valoare în diferenţiere. În acest stadiu celulele sunt nedeterminate (cellula indetermniata) şi indiferent de poziţia lor, dacă sunt

162

detaşate şi puse în condiţii propice, evoluează până la sfârşitul dezvoltării embrionare, putând generând un organism întreg.

9.3.1.2. Faza de blastula (blastulatio)

Blastomerele din interiorul morulei încep să producă un lichid blastocelic ce le împinge la periferie, unde se dispun sub forma unui singur strat de celule, ce delimitează cavitatea blastocelică (cavum blastocystis). Rezultă, astfel, stadiul monoblastic (blastocystis unilaminaris) sau blastula (blastula) s.blastocystis).

Blastula sau blastocistul (blastocystis) cuprinde circa 128 blastomere, Este sferoidală şi nu depăseşte, la amfiox, volumul iniţial al zigotului. În cazul acestei formaţiuni, micromerele au mai puţin vitelus şi formează peretele emisferei animale, iar macromerele sunt mai bogate în vitelus, alcătuind peretele emisferei vegetale.

În aceasta fază se produce determinarea (determinatio) prin poziţie, blastomerele ocupând prin diviziuni repetate, anumite poziţii. Blastomerele vor evolua diferit,în funcţie de factorii de mediu ambiant şi în raport cu interrelatiile intercelulare. Aceasta fază este denumita şi “preludiul diferenţierii”, pentru ca, după intrarea celulelor în faza de determinare, conform poziţiilor şi relaţiilor intercelulare noi, în fiecare celulă sau într-un grup de celule să înceapă sinteze specifice. În acest fel sunt activate anumite protein-enzime, care vor iniţia sinteza unei proteine specifice sau a unui anumit teritoriu morfogenetic din care fac parte celulele respective.

9.3.1.3. Faza de gastrulă (gastrulatio)

Faza de gastrulă (gastrulatio) se caracterizează printr-o proliferare intensă, o creştere volumetrică şi prin deplasări morfogenetice (motus morphogenetici) ample de celule sau grupuri de celule, în urma cărora rezultă foiţele embrionare (strata germinalia).

Micromerele se divid mai rapid şi alunecă (immigratio) la suprafaţa blastulei prin epibolie (epibolia), realizând foiţa celulară externă (epiblastus) sau ectoblastul (ectoblastus). Macromerele care conţin vitelusul se divid mai puţin intens şi se invaginează (invaginatio), prin embolie, realizând foiţa internă (endoderma) sau endoblastul (endoblastus). Embolia constă într-o invaginanare în cavitatea blastocelică a macromerelor. Cavitatea formată în urma invaginării se numeşte arhenteron şi comunică cu exteriorul prin blastopor, care marchează extremitatea caudală a corpului viitorului animal, fiind delimitat de două buze, una superioară, alta inferioară. Spre sfârşitul fazei are loc o alungire (elongatio) a gastrulei, în sensul axului antero-posterior.

Factorii ce intervin în diferenţierea şi dezvoltarea embrionului.În evenimentele complexe ale diferenţierii şi dezvoltării embrionare, un rol important, în afara

controlului genetic permanent, îl au influenţele din mediul extracelular, interacţiunea celulelor învecinate, mişcarile celulare morfogenetice şi adezivitatea celulară.

Astfel, accesibilitatea diferită la factorii din mediul extracelular, determină potenţialităţi evolutive diferite. Acţionează un gradient de mediu, care se referă la faptul că lichidul extracelular este mai bogat în substanţe nutritive la periferia masei de celule, în timp ce în centrul masei de celule este mai sărac în substante nutritive şi mai bogat în produşi de excreţie ai celulelor.

Interacţiunile celulare cu rol inductiv apar foarte de timpuriu în embriogeneză, încă din faza de 8 blastomere. În etapa de morulă, celulele sunt cuplate electric, membranele celulare având o foarte mare permeabilitate ionică. Curentul electric realizează un cuplaj, chiar în absenţa joncţiunilor specializate. Într-o fază mai avansată, permeabilitatea pentru ioni scade foarte mult, rămânând nealterate la nivelul joncţiunilor de tip gap, care apar imediat dupa primele determinări.

Mişcările celulare (motus morphogenetici) sunt foarte intense în embriogeneză, fiind determinate de factori greu de definit, asemănători, ca efect, cu factorii chimio-tactici pentru leucocite. Mişcările celulare încep în faza de gastrulă şi permit celulelor să ajungă în contact cu un alt tip de celule cu care pot stabili interacţiuni cu rol inductiv.

Adezivitatea celulară joacă un rol deosebit în evenimentele complexe ale diferenţierii şi dezvoltării embrionare, fiind mediată de molecule de proteine, denumite molecule de adezivitate (în limba engleza: “cell adhesion molecules”, prescurtat: CAM). Acestea aparţin membranei celulare şi matricei extracelulare. (Fig.9.14)

163

Fig.9.14. Regiunile blastocistului în funcţie de prezenţa moleculelor adezivităţii celulare (CAM)

A-Regiuni cu N-CAM; B- Regiuni cu L-CAM; C-Regiuni fără CAM.

1-Linia primitivă; 2- Ectoderm; 3- Sistem nervos; 4- Notocord; 5- Somite;6- Cord;7- Aparat urinar; 8-Muşchi neted; 9- Endoderm; 10- Tesuturi hematoformatoare.

Moleculele adezivităţii celulare activează selectiv în cursul desfăşurării proceselor dinamice care au loc, modificând comportamentul celulelor angajate în mişcari morfogenetice. Ele au fost identificate sau izolate prin metode ale imunologiei şi au fost

definite după celulele pe care au fost depistate, astfel, existând: molecule de adezivitate interneuronale ( N-CAM ), molecule ale adezivitatii celulelor hepatice ( L-CAM ) şi molecule ale adezivitatii dintre neuron şi nevroglie ( NG-CAM ). Ele sunt glicoproteine, iar N-CAM conţin cantitţti foarte mari de acid sialic. N-CAM, L-CAM si NG-CAM nu au specificitate încrucişată, deoarece nu se leagă între ele pentru a media adezivitatea dintre celule.

În funcţie de repartiţia moleculelor adezivităţii celulare (CAM), embriologii au conceput hărti ce indică ţesuturile şi structurile care se vor forma din fiecare regiune. Astfel, regiunile blastocistului care exprimă N-CAM vor da naştere plăcii neurale, notocordului şi somitelor, iar cele care exprimă L-CAM vor genera ectodermul non-neural şi endodermul. Cu ajutorul metodelor de imunofluorescenţă s-a observat că 2/3 din suprafaţa blastomerului este pozitivă pentru cele două tipuri de molecule ale adezivităţii.

9.3.1.4. Faza de neurulă

Faza de neurulă (neurulatio) sau perioada iniţială a şanţului neural (periodus sulci neuralis initialis) se caracterizează prin formarea din ectoblast, în mod succesiv a plăcii neurale (lamina neuralis), a canalului şi a tubului neural . Astfel, faza neurulării marchează constituirea tubului nervos, dar, totodată şi începutul histogenezei, precum şi a diferenţierii primordiilor de organe. În această fază se petrec două evenimente morfogenetice majore: a) formarea tubului neural si b) cordomezoblastului.

a) Formarea tubului neuralMicromerele ectoblastice din zona dorso-centrală a embrionului devin mai înalte decât

ectoblastul, se îngroaşă, formându-se placa sau lama neurală (neuroectoblastul) orientată în axul longitudinal al embrionului.

Fig. 9.15. Neurulaţia la Amfioxus – Etape iniţialeA,B,C – Secţiuni transversale1-Ectoderm, 2-Endoderm, 3- Arhenteron, 4- Şanţ şi tub neural; 5-Notocord; 6-Diverticuli mezoblastici.

164

Celulele plăcii neurale se divid în continuare cu mare intensitate, încât placa neurală se îndoaie şi se invaginează puţin, formând jgheabul (sulcus neuralis) şi canalul neural (canalis neuralis) cu forma literei “U” sau “V” (pe secţiune transversală) delimitat de crestele neurale (crista neuralis). Ulterior, jgheabul neural se închide prin apropierea şi sudarea marginilor sale superioare, realizându-se tubul neural (tubus neuralis) .

Neurulaţia la Amfioxus

b) Formarea cordomezoblastuluiSe desfăşoară concomitent cu formarea tubului neural şi constă în formarea coardei dorsale

şi a mezoblastului primar.Coarda dorsală sau notocordul (notochorda) se formează în axul sagital dorsal al

endoblastului prin diviziuni rapide şi proliferări puternice, după care se detaşează de endoblast şi se dispune ventral de tubul neural.

Concomitent, paramedian se produce o îngroşare a celor două margini laterale ale jumătăţii dorsale a endoblastului, realizându-se două creste paramediane cu aspect triunghiular, care se vor detaşa de endoblast şi vor forma, pe ambele laturi, mezoblastul primar.

Mezoblastul primar sau mesodermul paraaxial (mesoderma paraaxiale) se dezvoltă, pătrunzând, pe fiecare parte, printre ectoblast şi endoblast, constituind cea de-a treia foiţă embrionară, ce marchează apariţia stadiului triblastic (tridermic), care încheie embriogeneza, marcând trecerea spre histogeneză şi organogeneză.(fig.9.16)

Evenimente Etape Formaţiuni specifice

Formaţiniterminale

Observaţii:

Placa neurala La păsări şi mamifere, în ectoblast, în aria pelucidă apar: linia primară, nodulul anterior, prelungirea cefalică, semiluna gonocitară, nodulul posterior

Fomarea tubului neural(origine în ectoblast)

Jgheab neural Creste neurale Ganglionii nervoşiNervii

Tub neural

Vezicula cerebrală primară (encefalul)

TelencefalDiencefalMezencefalMielencefalMetencefal

Tubul neural Măduva spinării

Coarda dorsală Notocordul Coloana vertebrală

La pasări si mamifere se dezvoltă din ectoblast-prelungirea cefalică

Formarea cordomezo-blastului(origine în endoblast)

Mezoblastul primar

SomiteleNefrotomulHipoblastul

MiotoameleSclerotoa-meleHipoblastul (somatopleura şi splanchno-pleura)

La păsări şi mamifere se dezvoltă din ectoblast de pe laturile liniei primitive şi din prelungirea cefalică

165

Fig.9.16. Neurulaţia la Amfioxus –Etape finaleA,B,C – Secţiuni transversale1- Tub neural; 2- Coardă dorsală; 3- Saci celomici; 4- Intestin; 5- Cavitate celomică; 6-

Splanchnopleura; 7- Somatopleura.

Prin dezvoltarea mezoblastului, vor rezulta trei formaţiuni (somitele, nefrotomul şi hipoblastul) dispuse dorso-ventral şi iniţial legate între ele. Tot din mezoblast derivă şi mezenchimul.

Somitele(somiti) apar ca două mase celulare, triunghiulare pe secţiune transversală ce flanchează lateral tubul neural şi coarda dorsală. Ele se vor segmenta transversal, printr-un proces denumit metamerizare. Din somite se vor diferenţia: a) miotoamele (myotomi),din partea dorso-laterală a somitelor, formate din mioblaşti, care se vor transforma în fibre musculare; b) sclerotoamele (sclerotomi),din partea medială a somitelor, din care se vor dezvolta oasele.

Nefrotomul (nephfrotomi) se segmentează transversal (se metamerizează) generând primordiile (primordia) sau mugurii embrionari ai aparatului urinar.

Hipoblastul nu se metamerizează, ci se delaminează (delaminatio) (despică) longitudinal, generând splanchnopleura şi somatopleura, ce vor delimita cavitatea celomică primară (celoma s. coeloma) şi vor da naştere membranelor seroase ale cavităţilor (pleura, peritoneul, pericardul). (Fig.9.16)

Splanchnopleura (splanchnopleura) sau foiţa viscerală va acoperi intestinul primitiv şi toate organele ce se vor forma din el. Somatopleura (somatopleura) sau foiţa parietală va căptuşi ectoblastul care delimitează embrionul.

Mezenchimul (mesenchyma) este un derivat mezoblastic ce se formează din celulele migrate de pe faţa internă a somitelor şi a splanchnopleurei. El va da naştere: sângelui, ţesutului conjunctiv propriu-zis, sistemului macrofagic monocitar şi muşchilor netezi.

După încheierea stadiului de morulă, în locul termenilor de “ectoblast”, “endoblast” şi “mezoblast”, se vor folosi termenii de “ectoderm”, “endoderm” şi “mezoderm”. Din foiţele embrionare se vor diferenţia ţesuturile, sistemele şi aparatele organismului.

Din ectoderm (ectoderma) se formează: epiderma, epiteliul mucoasei bucale şi anale, sistemul nervos, hipofiza, epifiza, medulosuprarenala, epiteliul cornean şi cristalinian, epiteliul senzorial auditiv, retina şi epiteliul olfactiv. Se remarcă apariţia unor îngroşări ectoblastice denumite placode: placoda olfactivă, placoda cristaliniană şi placoda auditivă.

Placoda olfactivă (placoda olfactoria) diferenţiază, prin evoluţie, neuronii olfactivi şi celulele de susţinere din mucoasa olfactivă. Placoda cristalinului (placoda lentis) va genera cristalinul, iar din placoda auditivă (placoda otica)se va diferenţia vezicula auditivă din care se va dezvolta labirintul membranos.

Din mezoderm (mesoderma) se diferenţiază: epiteliile rinichilor şi gonadelor, mezoteliile cavităţilor pleurale, pericardiace şi peritoneale; endoteliile vaselor sanguine şi limfatice; celulele corticosuprarenalei; celulele Leydig din testicul, celulele luteale ale ovarului; ţesuturile conjunctive, sistemul macrofagic monocitar; scheletul osos; sângele, muşchii; vasele; aparatul urinar; unele porţiuni ale aparatelor genitale.

Din endoderm (endoderma) se diferenţiază: epiteliile aparatului respirator (cu excepţia mucoasei nazale); epiteliul tubului digestiv (exceptând epiteliile cavităţii bucale şi canalului anal);

166

ficatul, pancreasul şi vezica biliară; glandele tiroidă şi paratiroidă; epiteliul cavităţii timpanice şi ale tubei auditive; timusul.

Histogeneza şi organogeneza

Foiţa embrionară

Ţesuturi Aparate sau sisteme

Organe

Ectoderm EpidermulEpiteliul mucoasei bucale şi nazale Epiteliul mucoasei analeEpiteliul cornean Epiteliul cristalinianEpiteliul senzorial auditivŢesutul nervos

Sistemul nervos HipofizaMedulosupra-renalaRetinaPlacoda olfactivăPlacoda cristalinianăPlacoda auditivă

Mezoderm Celulele sistemului macrofagicCelulele corticosuprarenaleiCelulelor glandelor interstiţialeEpiteliile renaleEpiteliile gonadelorMezotelii seroaselor Endoteliile vasculareŢesuturile conjunctiveŢesutul sanguinŢesutul muscular

ScheletulSistemul vascularSistemul limfaticAparatul urinarSegmente ale aparatelor genitale

OaseleMuşchii

Endoderm Epiteliul cavităţii timpaniceEpiteliul tubei auditiveEpiteliile tubului digestivEpiteliile aparatului respirator

Aparatul respiratorAparatul digestiv

TiroidaParatiroidaFicat PancreasVezică biliarăTimusul (parţial)

9.3.2.SEGMENTAŢIA LA PĂSĂRI

Datorită oului, care este de tip telolecit, segmentaţia este meroblastică sau parţială, iar după aspectul său este polară sau discoidală.

La păsări, celula sexuală femelă matură (sau ovulul) este reprezentat numai de gălbenuş. Nucleul ovulei este situat la polul animal al gălbenuşului, fiind înconjurat de o cantitate redusă de citoplasmă activă (sau vitelus formativ) împreună cu care alcătuieşte o formaţiune discoidală, denumită discgerminativ (cicatricula) sau pată germinativă (nucleul Pander). Numai discul germinativ va intra în segmentaţie.Restul ovoplasmei este format din vitelus alb formativ (ce conţine granule mici, cu compoziţie predominant proteică – 43%) şi din vitelus galben nutritiv, ce cuprinde granule mari, formate în principal din lipide şi proteine, în cantitate mai redusă (28%). Depunerea vitelusului începe de sub discul germinativ, cu un strat de vitelus alb care se prelungeşte spre centrul oului cu o formaţiune cu aspect de limbă de clopot, denumită latebra Purkinje. În afara acestui vitelus alb se se dispune un

strat de vitelus galben, iar în continuare are loc o dispunere a celor două tipuri de vitelus în straturi concentrice alternative. La periferie, oul este învelit de o membrană vitelină (de ovolemă). (Fig.9.17)

Fig.9.17. Oul la păsări

167

1- Latebră; 2- Disc germinativ; 3- Membrana vitelină; 4- Vitelus galben; 5- Vitelus alb;; 6- Albuş dens; 7- Şalaze; 8- Albuş fluid; 9- Albuş dens; 10- Albuş fluid, al treilea strat; 11- Membrana cochilieră internă; 12- Membrana cochilieră externă; 13- Camera cu aer; 14- Camera calcaroasă; 15- Cuticula.

Fecundarea ouălor are loc în porţiunea iniţială a oviductului sau pe suprafaţa ovarului, înainte de a fi acoperit cu albuş, membrane cochiliere şi cochilie. După fecundare ovula (oul nefecundat) devine ou fecundat (ovum fertilisatum s. sperovium) sau zigot (zygota s. conceptus).

Începutul segmentaţiei este marcat de apariţia unui şanţ linear ce marchează planul de separare dintre cele două celule fiice, plan ce cade perpendicular pe suprafaţa discului germinativ, fără să-i atingă marginile. Celulele rezultate sunt identice şi de talie egală (diviziune homoplastică). A doua mitoză are şanţul şi planul de separare dispuse perpendicular pe primul şanţ. În cea de-a treia mitoză apar două şanţuri verticale, ambele perpendiculare pe primul şanţ. Este urmată de alte diviziuni verticale, rezultând un singur strat de celule prismatice, reprezentând ectoblastul. Formarea primelor două blastomere are loc după 30 de minute de la singamie, iar după patru ore embrionul are 8 blastomere, ajungând la 152 blastomere după 7 ore.

Segmentarea este sincronă, deoarece toate diviziunile celulare se desfăşoară simultan. Intercineza este scurtă, fără sinteză de acizi nucleici, aceştia existând deja. În plus, vitelusul formativ este bogat în aminoacizi, enzime, glucide şi lipide, asigurând necesarul proceselor de multiplicare.

Ectoblastul este despărţit de vitelus printr-o cavitate plină de lichid, denumită cavitatea subgerminală sau de segmentare. Acest aspect (ectoblastul şi cavitatea subgerminală) reprezintă stadiul embrionar monoblastic (comparabil cu blastula de la amfiox), având la păsări forma de disc, de unde şi denumirea de discoblastulă (sau de disc embrionar sau bănuţ). (Fig.9. 18)

Fig.9.18. Segmentaţia zigotului la păsări.A-Discul germinativ nesegmentat; B-Stadiul cu două blastomere; C-Stadiul cu patru blastomere; D-Stadiul cu opt blastomere; F,G-Discoblastula.

Privit de sus, discul embrionar apare ca o suprafaţă relativ circulară care prezintă: 1) – o zonă mai transparentă – aria pelucidă (area pellucida), situată uşor excentric; şi 2) – o zonă mai întunecată – aria opacă (area opaca), ce înconjoară aria pelucidă.

În stadiul diblastic se formează endoblastul. Unele dintre celulele ectoblastice iau formă cubică şi migrează la limita dintre ectoblast şi

cavitatea subgerminală. În continuare, aceste celule se multiplică şi formează un strat continuu subectoblast, denumit hipoblast (hypoblastus), împărţind cavitatea de segmentare în două spaţii, o cavitate blastocelică şi o cavitate subgerminală propiuzisă, delimitată între vitelus şi hipoblast,umplută cu lichid blastocelic şi particule de vitelus. Procesul de de separare a celulelor ce formează hipoblastul se numeşte delaminare (delaminatio), iar ectoblastul devine epiblast (epiblastus). Hipoblastul are un rol temporar, fiind înlocuit de endoblast (endoblastus). Celulele endoblastice imping celulele hipoblastice in aria extraembrionară, unde participă la formare peretelui vezicii ombilicale.(Fig.9.19)

Stratul diblastic se realizează în intervalul de 24-48 de ore, cât durează parcurgerea oviductului, până în momentul eliminarii oului din corpul păsării (pontei). Evoluţia embrionului se opreşte prin menţinerea acestuia la 5-7°C şi continuă prin incubaţie la 38-39°C, în condiţii de umiditate, aerare şi întoarcere periodică.

168

Fig.9.19. Discoblastula la păsări, înainte de începerea gastrulaţieiA, B- Discoblastule, aspecte dorsaleC,D,E – Secţiuni transversale 1-Aria opacă;2- Aria clară (pelucida), 3- Nodul posterior;4- Ectoblast;

5- Endoblast;6- Cavitate subgerminală

Procesele de multiplicare celulară se reiau după şase ore de la începerea incubaţiei,când începe perioada de gastrulare. Celulele epiblastice şi cele ale hipoblastului realizează: mişcări de convergenţă (pentru a forma linia primitivă şi nodulul caudal),migrări în profunzime (în cavitatea blastocelică şi în aria extraembrionară), mişcări de deplasare laterală (pentru a forma mezoblastul).

Gastrularea la păsări cuprinde: formarea nodulului posterior, formarea liniei primitive cu nodulul anterior, formarea mezodermului, formarea notocordului şi regresia liniei primitive.

După 24 de ore de incubaţie, discul embrionar (discus embryonicus) îşi modifică forma, devenind oval (din rotund), apoi cu aspect piriform (cu lungimea de 3,5-5 mm), prezentând o extremitate cefalică şi o extremitate caudală, cu o proliferare ectoblastică, de formă triunghiulară, cu aspect întunecat, denumită nodul caudal sau posterior. Această proliferare ectoblastică se prelungeşte pe linia mediană, în sens cranial, formând linia primitivă (linea primitiva), care este parcursă în sens longitudinal de o depresiune îngustă, denumită şanţul liniei primitive (sulcus primitivus). (Fig.9. 20)

Extremitatea cefalică a liniei primitive se termină printr-o formaţiune nodulară denumită nodul cranial sau anterior (Hensen) (nodus primitivus), apărută datorită proliferărilor mai intense. În centrul nodulului anterior se observă o depresiune denumită fosetă primitivă (fovea primitiva).

De la nodulul anterior, prin proliferări celulare, ia naştere o formaţiune – prelungirea cefalică (processus cephalicus s.processus notochordalis)– dirijată cranial, care va pătrunde sub forma unui deget de mănuşă între ectoblast şi endoblast, fără a se atinge limita discului (plica limtans areae et sulcus limitans disci embryonici). Această prelungire va genera cordomezoblastul, respectiv coarda dorsală (notochorda) şi mezoblastul (mesoderma embryonicum) anterior. (Fig.20)

169

Fig. 9.20. Aspecte evolutive ale ariei embrionare la păsări1- Vitelus; 2- Aria opacă; 3-Aria pelucidă; 4- Linia primară; 5- Nodul anterior; 6- Prelungire cefalică; 7- Semiluna gonocitară; 8- Creste neurale; 9- Plica limitantă anterioară;

10- Nodul posterior.

Spre deosebire de Amfioxus, unde mezoblastul are origine endodermică, la păsări, mezoblastul se formează din ectoblast. (Fig.9. 21, 9.22 )

Fig. 9.21. Secţiune

transversală prin prelungirea cefalică a liniei primare la găină1-Ectoblast; 2- Endoblast; 3-Mezoblast;4-Prelungire cefalică

Există la păsări două focare de mezoblastogeneză: a) la nivelul liniei primitive, unde are loc o proliferare celulară care se îndreaptă spre laturile discului embrionar (mesoderma paraaxiale) şi, pătrunzând între ectoblast şi endoblast, generează o parte a mezoblastului embrionar (mesoderma embryonicum ) şi mezoblastul extraembrionar (mesoderma extraembryonicum); b) la nivelul prelungirii cefalice, de unde ia naştere, aproape în totalitate mezoblastul ce invadează discul embrionar, generând coarda dorsală şi mezoblastul anterior (mesoderma capitis).

170

Fig.9.22. Secţiuni transversale prin aria embrionară la păsăriA, B, C – Etape succesive1- Linia primară; Sanţul liniei primare; 3- Ectoblast; 4- Endoblast; 5- Mezoblast

Mezoblastul anterior, situat pe părţile laterale ale coardei dorsale formează lamele mezodermale (mesoderma laterale) care vor evolua în somite, nefrotoame şi lame laterale. Printr-un proces de clivaj, din lamele laterale apare cavitatea celomică (cavum celomicum) delimitată de: a) somatopleură, formată din elementele celulare mezoblastice aflate în contact cu ectoblastul şi de b) splanchnopleură, aflată în contact cu endoblastul. (Fig.9.23)

Neurulaţia se desfăşoară în mod asemănător cu cea de la amfiox. Ectoblastul situat la nivelul prelungirii cefalice (median şi oral de nodul anterior), va genera prin îngroşări proliferative, placa neurală, şanţul neural, canalul (tubul) neural şi crestele neurale.

În partea anterioară a extremităţii cefalice a discului embrionar, în aria extraembrionară vasculară apare o formaţiune cu aspect semilunar – semiluna gonocitară sau conul germinativ, ce constituie locul de diferenţiere a celulelor gonocitare la păsări.

Fig. 9.23. Stadii succesive de dezvoltare embrionară la păsări – Scheme ale secţiunilor transversale

1- Ectoblast; 2- Endoblast; 3- Mezoblast; 4- Coarda dorsală; 5- Şanţ neural; 6- Somite; 7- Cavitate celomică; 8- Canal Wolf; 9- Somatopleura; 10- Splanchnopleura; 11- Aorta.

La incheierea stadiului de neurulă, embrionul capătă forma literei “C” şi se delimitează de sacul vitelin, de care va rămâne ataşat prin canalul vitelin. Formarea corpului embrionului se realizează în două etape: în prima etapă, tubul neural creşte mai intens decât ectodermul şi endodermul,aparând un buzunar subencefalic şi un proces cranial; în etapa a doua, capul şi corpul embrionului se delimitează de zona extraembrionară, în ziua a IIIa de incubaţie.9.3.3.segmentaŢia la mamifere

171

Prezintă particularităţi generate de faptul că la mamifere oul este oligolecit. Segmentaţia este totală (întreaga masă a oului intră în diviziune), subegală (rezultând blastomere aproape egale ca mărime) şi de tip asincron (mitozele se succed fără o anumită ordine în timp).

Prezintă trei perioade: 1) o perioadă iniţială, asemănătoare cu segmentaţia de la amfioxus; 2) o perioadă specifică mamiferelor şi 3) o perioadă asemănătoare cu segmentaţia la păsări.

Prima diviziune a oului duce la formarea unei celule voluminoase macromera (macromerus), cu aspect clar şi a unei celule mici, micromera (micromerus), întunecată, ambele ocupând spaţiul delimitat de zona pelucidă. (Fig.9.24)

Fig.9.24. Segmentaţia la mamifereA- Zigotul oligolecit; B- Stadiul cu două blastomere; C- Stadiul cu trei blastomere; D- Stadiul cu patru blastomere; E- Formarea blastocistului.1- Macromera; 2- Micromera; 3- Zona pelucida; 4-Trofoblast; 5- Buton embrionar.

Macromera se divide înaintea micromerei, rezultând stadiul cu 3 blastomere (foarte scurt ca existenţă), pentru ca, imediat, unul din blastomerele clare (macromere) se divide, rezultând stadiul de 4 blastomere, dintre care 3 sunt clare (macromere) şi una este întunecată (micromeră). În continuare, ritmul de diviziune al blastomerelor devine cu totul neregulat, iar planurile de segmentaţie nu sunt ordonate spaţial, încât dispar şi diferenţele volumetrice între blastomerele clare şi cele întunecate.

În final se edifică morula (morula), alcătuită dintr-un bloc compact de celuleîntunecate, cu contururi poligonale.

Diferenţa faţă de ceea ce se întâmplă la amfiox, constă în aceea că micromerele şi macromerele nu se polarizează la antipozi, nici în morulă, nici în blastulă. Astfel, micromerele se dispun periferic învelind macromerele şi generând trofoblastul (trophoblastus), ce va servi la hrănirea embrionului până la formarea placentei. Macromerele se dispun central, alcătuind embrioblastul embrionar (embryoblastus s.massa cellularis interna) sau butonul embrionar.

Toate transformările desfăşurate până în acest moment se petrec în spaţiul delimitat de membrana pelucidă, care se va subţia treptat şi va dispare definitiv. Prin dispariţia membranei pelucide, trofoblastul ia contact intim cu membrana uterină, intervenind ulterior în nutriţia embrionului.

Celulele embrioblastului secretă un lichid albuminos, care se acumulează într-o cavitate, denumită lecitocel, ce împinge macromerele spre polul superior (animal). La acest pol, macromerele vor forma un mugure embrionar (nodus embryonicus s. massa embryonica), suspendat parcă de trofoblast, asemănător unei picături de apă condensată pe tavan.

Această formaţiune ce cuprinde trofoblastul (format din micromere dispuse periferic), lecitocelul şi mugurele embrionar poartă denumirea de blastocist (blastocystis s. blastula) şi este analog blastulei de la amfiox, apărând după aproximativ 7 zile de la fecundaţie. (Fig.9.25)

Fig.9.25. Secţiuni prin blastocistul de leporide

A, B – Etape evolutive

172

1- Buton embrionar; 2- Trofoblast; 3- Membrana pelucidă; 4- Cavitatea vitelină;

Blastocistul ajunge în cavitatea uterină şi se fixează de mucoasa uterină prin procesul de nidaţie (la om şi la rozătoare) sau implantaţie (la restul animalelor).

Concomitent cu începutul nidaţiei sau implantaţiei încep procesele de diferenţiere în butonul embrionar şi în trofoblast.

Din trofoblast se vor diferenţia 2 straturi: a) un strat extern, sinciţiotrofoblastul (sycytiotrophoblastus), alcătuit din celule cu limite celulare slabe şi cu o citoplasmă mai întunecată; şi b) un strat intern, citotrofoblastul (cytotrophoblastus), format din celule cu limite distincte.

Ca rezultat al diferenţierilor ulterioare, din trofoblast se va forma componenta fetală a placentei, iar din butonul embrionar se vor diferenţia cele trei foiţe embrionare: ectoblastul, endoblastul şi mezoblastul.

GastrulaţiaLa mamiferele

placentare, gastrulaţia se desfăşoară în două etape: în prima etapă se formează ectoblastul şi endoblastul, iar în a doua – mezoblastul. (Fig.9.26)

Fig. 9.26. Blastocist de leporide în timpul gastrulaţiei

1-Trofoblast;2-Ectoblast;

3-Endoblast;

4- Cavitate vitelină

Formarea ectoblastului şi endoblastului.Din stratul unic de macromere prismatice care reprezintă ectoblastul se diferenţiază pe faţa

sa profundă câteva celule mai intunecate. Acestea se vor înmulţi şi vor genera, similar cu ceea ce se întâmplă la păsări, un al doilea strat, format din celule turtite, denumit endoblast. Apare, în acest fel, stadiul diblastic, care datorită aspectului său se mai numeşte şi gastrodisc, sau pată embrionară. Odată ce endoblastul s-a format complet şi căptuşeşte întreaga cavitate a a lecitocelului, în blocul de celule care formează buttonul embrionar se produce o clivare (delaminatio), apărând un spaţiu nou, cavitatea amniotică (cavum amnii).

173

9.27. Dezvoltarea endoblastului la leporide1- Trofoblast; 2- Ectoblast; 3- Endoblast; 4- Cavitate vitelină.

La suine,ovine, cervide şi leporide, ectoblastul se formează din podeaua cavităţii amniotice,dispărâd tavanul acesteia împreună cu trofoblastul adiacent.Tavanul cavităţii amniotice rămâne intact la cobai, şoarece, şobolan, veveriţă, arici şi liliac, unde formează ectoblastul, ce este acoperit în totalitate de trofoblast. La ecvine, taurine şi carnivore, nu apare cavitate amniotică primară, iar ectoblastul se formează din celulele superficiale ale butonului embrionar.(Fig.9. 27)

În stadiul incipient al gastrulaţiei, când ectoblastul şi endoblastul sunt complet formate, aria embrionară ( câmp embrionar sau zonă embriogenă ) are un aspect piriform, cu extremitatea caudală mai ascuţită şi cu cea cranială mai rotunjită. La extremitatea caudală, se realizează prin proliferare, o formaţiune mai opacă, denumită nodul posterior, ce se continuă în sens cranial cu linia primitivă. La mijlocul ariei embrionare, linia primitivă prezintă o dilataţie, nodulul anterior (Hensen), după care se continuă spre extremitatea cefalică cu prelungirea cefalică. (Fig.9.28)

De pe părţile laterale ale liniei primitive, se desprind numeroase celule cu contur neregulat (stelat), ce vor forma mezoblastul (mesoblastus), între ectoblast şi endoblast.

Fig. 9.28. Aria embrionară la mamifere - aspecte dorsale evolutive

1-Aria embrionară; 2- Linia primitivă; 3- Nodul posterior; 4- Nodul anterior;

5- Prelungire cefalică.

Mezoblastul embrionar prezintă trei porţiuni distincte: a) o porţiune cefalică, nesegmentată; b) o porţiune mijlocie, sau mezoblastul trunchiului; c) o porţiune caudală, nesegmentată.

Mezoblastul trunchiului cuprinde trei zone (regiuni) distincte: 1) o zonă dorsală; 2) o zonă intermediară; 3) o zonă laterală. (Fig.9.29)

1) Zona dorsală se va fragmenta transversal, generând somitele (somiti). Fiecare somită prezintă, la

rândul ei, trei porţiuni: 1) miotomul (myotomus), porţiunea medio-dorsală din care vor lua naştere mioblaştii şi ulterior muşchii; 2) sclerotomul (sclerotomus), porţiunea medio-ventrală, din care se desprind celulele mezenchimale, care migrează în jurul tubului neural, structurând mezenchimul (mesenchyma); 3) dermatomul (dermatomus), porţiunea laterală a somitei care va genera dermul (dermis) şi hipodermul.

2) Zona intermediară (zona nefrogenă) (mesoderma intermedium) se segmentează transversal în veziculele nefrogene ale pronefrosului, ale mezonefrosului şi ale metanefrosului.

174

Fig. 9.29. Gastrulaţia la mamifere – stadiu avansat. Secţiuni transversaleA (a – a) – Înaintea nodulului anterior; B (b – b ) – Prin nodulul anterior; C (c – c) – Prin linia primitivă1- Ectoblast; 2- Endoblast; 3- Mezoblast; 4- Nodul anterior; 5- Linia primitivă; 6-Şanţ primitiv.

3) Zona laterală a mezoblastului (mesoderma laterale) se clivează, dând splanchnopleura şi somatopleura, între care se delimitează celomul primitiv embrionar (cavum coelomicum) .

Concomitent acestor transformări, embrionul ia aspect tubular şi apoi suferă o încurbare, sub forma literei “C”, ale cărei capete se apropie şi închid o parte din cavitatea blastocelică ce va deveni cavitate toraco-abdominală, iar ceea ce rămâne din cavitatea blastocelică va forma extraembrionar, vezicula vitelină (ombilicală) a embrionului.

Odată realizate fenomenele de proliferare şi diferenţiere, în dezvoltarea embrionului începe o nouă etapă, denumită histogeneză şi organogeneză, iar embrionul îşi continuă dezvoltarea devenind fetus (foetus). Cele trei foiţe embrionare îşi schimbă denumirea în ectoderm, endoderm şi mezoderm.

9.4.Anexele embrionare şi fetale

Sunt formaţiuni morfologice cu rol în protecţia, nutriţia şi epuraţia embrionului şi fetusului. Ele sunt o continuare în exteriorul embrionului a componentelor embrionare (ectoderm, endoderm şi mezoderm), alcătuind, în totalitatea lor, aria extraembrionară.

Anexele embrionare şi fetale (membranae fetales) sunt reprezentate de: a) vezicula vitelină (sau ombilicală); b) alantoidă; c) amnios; d) corion.

9.4.1. Vezicula vitelină (ombilicală)

Vezicula vitelină sau sacul vitelin (saccus vitellinus) este anexă embrionară care derivă din endoderm, după ce acesta înlocuieşte hipoblastul. Este despărţită de trofoblast prin lecitocel sau blastocel. Ocupă o parte din spaţiul cavitatăţii lecitocelice care, odată cu încurbarea embrionului (sau a ariei embrionare) se împarte în două compartimente: - un compartiment cuprins în corpul embrionului, reprezentând intestinul primitiv (enteron primitivum) căptuşit de endoderm; şi - un compartiment mai spaţios, situat extraembrionar, care va forma vezicula ombilicală, căptuşită de endodermul extraembrionar, ce delimitează cavitatea vitelină (cavum vitellinum). Comunică cu

175

intestinul embrionar prin canalul ombilical (vitelin) (ductus pedunculi vitellini), care străbate pedunculul vitelin (pedunculus vitellinus), de legătură cu embrionul şi fetusul. Peretele vezicii viteline este format din două straturi: unul intern, format de celulelele endodermale ( care au înlocuit hipoblastul) şi altul extern format din splanchnopleură (din mezoderm extraembrionar). Aici celulele mezenchimale se se grupează şi formează insule sanguine (hemato- şi vasculo-formatoare).

În etapa timpurie a embriogenezei îndeplineşte rolul de organ vasculo şi hematoformator, precum şi de rezervor de substanţe nutritive, regresând ulterior.

9.4.2. Amniosul

Amniosul (amnion) se formează (amniogenesis) din îndoiturile ectodermului şi ala somatopleurei care îl căptuşeşte, cute ce apar în urma “coborârii” embrionului în cavitatea lecitocelică. În acest mod se formează patru cute (plica limitans): anterioară, posterioară şi două laterale, care se vor suda în planul median, delimitând o cavitate amniotică (cavum amnii) între ectodermul embrionar şi foiţa amniotică realizată. În lichidul amniotic (liquor amnioticus) pluteşte embrionul şi apoi fetusul căruia-i conferă atât mobilitate cât şi protecţie. (Fig.9.30)

9.4.3. Alantoida

Este o anexă formată din endoderm şi splanchnopleură. Se dezvoltă (allantogenesis) din endodermul intestinului caudal, care prin proliferare şi evaginare generează iniţial un mugure alantoidian digitiform (processus allantoicus). Pe măsură ce mugurele embrionar creşte, se insinuează şi se interpune între amnios şi vezicula ombilicală, reducând spaţiul ocupat de cavitatea vitelină şi antrenând cu el şi splanchnopleura care ocupă intestinul primitiv.

Fig.9.30. Formarea anexelor embrionare la păsări1- Ectoblast; 2- Endoblast; 3- Mezoblast; 4- Cavitate amniotică; 5- Alantoidă; 6- Veziculă ombilicală; 7- Vitelus; 8- Splanchnopleura; 9- Intestin primitiv; 10- Somatopleura.

Alantoida rămâne legată de locul de origine printr-un pedicul , străbătut de canalul urac (urachus),denumit şi canal alantoidian (ductus allantoicus). În splanchnopleura, ce acoperă endodermul se dezvoltă o bogată reţea vasculară ce se va conecta la vasele viteline pe care le înlocuieşte treptat, alcătuind cea de-a doua circulaţie fetală (circulaţia alantoidiană) ce cuprinde două artere şi două vene alantoidiene.

Cavitatea (vezicula) alantoidiană (cavum allantoicum), plină cu lichid, este delimitată de două foiţe: una internă, în contact cu amniosul (allantoamnion) şi alta externă, în contact cu corionul (allantochorion).

9.4.5.Corionul

176

Cea mai externă anexă (învelitoare) din aria extraembrionară, corionul, provine din micromerele morulei. După dispariţia membranei pelucide, acestea vor forma corionul primar (chorion primarium) sau procorionul sau trofoblastul. Pe suprafaţa sa externă prezintă vilozităţi (villi chorii primarii) ce sunt repartizate în diferite moduri, în funcţie de specie.

O vilozitate corială este constituită din: axul conjunctiv de ţesut lax şi din trofoblastul care acoperă axul conjunctiv. Trofoblastul este format din două rânduri de celule, morfologic distincte: citotrofoblastul şi sinciţiotrofoblastul.

Sinciţiotrofoblastul (syncytiotrophoblastus), stratul extern, are o culoare mai închisă şi numeroşi nuclei dispersaţi într-o masă de citoplasmă, fără limite celulare. Citoplasma are un aspect spumos, conţine lipide, colesterol şi mucopoliglucide şi prezintă un citoschelet filamentos.

Are aspectul unui epiteliu cubic simplu, cu margine în perie. Examinată la microscopul electronic, marginea în perie prezintă microvilozităţi dispuse la intervale de 8-20 nm. Microvilozităţile nu sunt structuri rigide, prezentând lungimi ce variază între 1-2 µm şi un diametru de 150-250 nm.

Nucleii sinciţiotrofoblastului apar deseori grupaţi, polimorfi, prezentând un nucleol excentric, cu citoplasma clară şi cromatina granulară, răspândită neuniform.

Citotrofoblastul (cytotrophoblastus) (stratul intern sau stratul celular Langhans) cuprinde celule mari cu limite celulare distincte, cu nuclei veziculoşi, cu nucleoli evidenţi, cu citoplasmă clară, cu numeroase mitocondrii, reticul endoplasmic rugos, complex Golgi perinuclear, numeroase microvezicule şi granule cu fier. La limita cu sinciţiotrofoblastul prezintă numeroşi desmozomi.

Membrana bazală a trofoblastului are un aspect neregulat, discontinuu şi o grosime de 150 nm. Este despărţită de polul bazal al celulelor citotrofoblastice printr-un spaţiu de 25 nm, plin de o masă amorfă cu o densitate electronică scăzută.

Axul conjunctiv al vilozităţii coriale este format din ţesut conjunctiv embrionar, cu celule mezenchimatoase stelate. Cuprinde o arteriolă care se capilarizează sub membrana bazală a epiteliului vilozităţii. Din ţesătura de capilare se desprinde o venulă care va fi colectată de venele membranei coriale. Endoteliul acestora, extrem de fin, este înconjurat de fibre delicate, ce aparţin ţesutului conjunctiv embrionar al axului vilozităţii.

9.4.5.Particularităţi ale anexelor embrionare şi fetale la mamifere

Vezicula vitelină are o dezvoltare redusă, rolul său nutritiv limitându-se la fazele timpurii ale embriogenezei, datorită faptului că ovulele mamiferelor sunt oligolecite. După atrofia veziculei viteline, se menţine o formaţiune vestigială, denumită “diverticulul Meckel”.

Prezintă o funcţie vasculoformatoare şi hematoformatoare timpurie. Astfel, celulele mezoblastice din peretele veziculei viteline vor forma insule vasculo şi hemato-formatoare (insulele Wolff şi Pander) (insulae sanguineae). Aici apar primele elemente figurate sanguine şi reţeaua extraembrinară de capilare, care se va conecta la circulaţia sanguină intraembrionară. Circulaţia vitelină a embrionilor, denumită şi omfalomezenterică, va fi înlocuită treptat cu circulaţia placentară, iar hematopoeza este preluată de ficat.

Anexele embrionare si fetale

Anexa Origine în: Structuri Formaţiuni specificeCorion Micromerele morulei Sinciţiotrofoblastul

CitotrofoblastulMembrana bazală

Vilozităţi coriale

Alantoida Endoderm Cavitatea alantoidianăSplanchnopleurăReţea vasculară

Canalul urac

Vezicula ombilicală (vitelină)

Endoderm Compartiment intraembrionarCompartiment extraembrionar

Canal ombilical(vitelin)

Amniosul Ectoderm Cavitate amnioticăLichid amniotic

Cute amniotice

La mamiferele cu schizamnios (primate, cobai, arici, liliac) vezicula ombilicală este mai redusă decât la mamiferele cu plectamnios (rumegătoare, carnivore, rozătoare).

Amniosul se formează foarte timpuriu. Modul de formare a amniosului diferă în funcţie de modul de implantare (nidaţie). Formarea poate avea loc în două moduri: prin plicaturare (plectamnios) şi prin clivaţie (schizamnios). Prin plicaturarea ectodermului se formează amniosul la leporide,

177

carnivore, suine şi rumegătoare, unde nidaţia este de tip central. La hominide şi la alte specii de mamifere (cobai, arici,liliac,tatu),unde nidaţia este de tip interstiţial, formarea amniosului are loc în faza de embrion diblastic (gastrodisc) printr-un proces de clivaj orizontal al celulelor ectoblastului. Rândul superior va forma amniosul, iar spaţiul dintre cele două straturi de celule ectoblastice va genera cavitatea amniotică, în care se va acumula lichid amniotic. La mamiferele cu nidaţie de tip excentric, într-o primă fază apare un scizamnios,care va fi înlocuit de un plectamnios.

Lichidul amniotic, înghiţit de fetus, este resorbit în intestin, ajunge în circulaţia fetală alantoidiană şi, prin traversul placentei, în circulaţia maternă, dar nu pătrunde în căile respiratorii. Este mucilaginos, limpede şi sporeşte cantitativ în prima parte a gestaţiei. Acumularea de lichid amniotic este mai lentă în a doua parte a gestaţiei, când lichidul devine tulbure şi conţine păr, celule descuamate etc. În apropierea parturiţiei este galben datorită meconiului format din luna a şaptea de gestaţie.

Amniosul mamiferelor se dezvoltă foarte mult, revenindu-i mai multe roluri: - de protecţie a embrionului împotriva şocurilor mecanice; - de lubrefiere a căilor de expulzare a fetusului şi dec urăţirea a acestora de bacterii şi miceţi; -rol trofic, fiind bogat îăn apă, săruri minerale, proteine;-rol metabolic întervenind în glicogeneză (la rumegătoare) şi în lipogeneză; -rol de depozit pentru produşide dezasimilaţie (acid uric,uree). Gradul de dezvoltare al amniosului, respectiv suprafaţa şi volumul de lichid amniotic (raportat la talia speciei) creşte progresiv la marsupiale, la carnivore, la rumegătoare şi la primate.

La iapă, amniosul începe să se formeze la 21 de zile, iar cantitatea de lichid ajunge la 3-7 litri, formând a “doua pungă a apelor”. La rumegătoare, la nivelul amniosului se descriu formaţiuni, cu formă neregulată, denumite plaje amnitotice cu rol neelucidat, (probabil glicogenogenetic).Plajele amniotice lipsesc la scroafă şi căţea, iar la iapă şi oaie sunt rar înrtâlnite.

La scroafă, lichidul amniotic, ajunge la 40-300ml, dar scade după săptămâna a 12-a de gestaţie, iar la carnivore (căţea şi pisică) la parturiţie rămân numai câteva picături (8-30 ml). (Fig.9.31)

Fig. 9.31. Schema unui fetus de mamifer, împreună cu anexele sale1- Fetus; 2- Intestin primitiv; 3- Cordon ombilical; 4- Cavitate amniotică; 5- Alantoida; 6- Vezicula vitelină; 7- Corion; 8- Vilozitate corială.

Alantoida prezintă un grad de dezvoltare ce diferă foarte mult în raport cu specia. Astfel, există specii cu: a) alantoida redusă la un diverticul “în deget de mănuşă” (la primate); b) alantocorion, în care alantoida apare ca o pungă aplatizată, a cărei faţă internă acoperă aproape în

178

totalitate amniosul ( la mamiferele aplacentare); c) amniocorionul, la care alantoida acoperă numai parţial amniosul, aceasta venind în contact cu corionul. Foiţa externă a alantoidei va căptuşi corionul pe o suprafaţă mai mare sau mai mică.

La mamifere, alantoida prezintă trei zone: 1) zona intraembrionară, din care se va forma vezica urinară; 2) zona mijlocie, din care va rezulta canalul urac, zona este cuprinsă în cordonul ombilical; 3) zona extraembrionară sau sacul alantoidian propriu-zis, interpus între amnios şi corion.

Lichidul alantoidian apare înainte ca rinichii fetali să devină funcţionali. Este limpede, apos, brun gălbui. Conţine albumină, fructoză şi uree, deoarece filtratul renal fetal ajunge în sacul alantoidian prin canalul urac. La vacă, iapă, oaie,capră şi scroafă, se întâlnesc “calculi alantoidieni” (formaţi din detritusuri celulare, fosfat de calciu şi mucoproteine)ceplutesc în lichidul alantoidian.

La mamifere, reţeaua vasculară alantoidiană (a doua circulaţie embrionară) este mai dezvoltată decât la păsări şi participă la realizarea circulaţiei placentare. La vârsta de 2 luni (la ecvine, taurine), circulaţia vitelină este complet atrofiată şi înlocuită de circulaţia alantoidiană.

Din fuzionarea mezodermului extraembrionar ce acoperă alantoida cu troblastul se formează corionul alantoidian ce găzduieşte o reţea vasculară bogată ce asigură conexiunea între endometru maternal şi reţeua vasculară alantoidiană.

Alantoida îndeplineşte la mamifere mai multe roluri: -de rezervor de substanţe toxice şi deşeuri metabolice; - organizator al reţelei vasculare embrio-fetale ce înlocuieşte reţeaua vasculară vitelină; -furnizează mezenchim pentru axul vilozităţilor coriale;- pregăteşte şi lubrefiază tractusul genital pentru parturiţie; - participă la formarea cordonului ombilical.

Cordonul ombilical face legătura dinte placentă şi fetus. La structurarea lui participă: vezica vitelină cu canalul ombilical, alantoida cu canalul alantoidian, peretele sacului amniotic adiacent zonei ombilicale, mezodermul extraembrionar (celule mezenchimale, substanţă fundamentală mucoidă-gelatină Wharton”), arterele şi venele ombilicale. Lungimea cordonului ombilical este, în medie de 50-60 cm la iapă, 30-40 cm la bovine, 25 cm la scroafă, 8-12 cm la căţea şi pisică. La rumegătoare şi cabaline în cordonul ombilical sunt prezente şi fibre musculare netede, care produc vasoconstricţie în momentul parturiţiei.

La iapă, mugurele alantoidian apare la 21 de zile şi ajunge în contact cu corionul la 55-60 de zile, când are reţeaua vasculară dezvoltată şi înlocuieşte circulaţia vitelină (omfalo-mezenterică) până la 70-80 de zile. Cantitatea de lichid alantoidian ajunge la 8-18 litri, fiind clar şi constituit iniţial din transsudat sanguin. În apropierea parturiţiei, din cauza urinii fetale devine gălbui murdar.

La scroafă, alantoida lipseşte în mare parte la nivelul zonei centrale, unde amniosul, venind în contact cu corionul, realizează un amniocorion. Cantitatea de lichid alantoidian creşte (ajunge la 100-200 ml), până la jumătatea gestaţiei, după care se resoarbe treptat, devenind de culoare brun-murdar şi, la parturaţie, rămânând doar câţiva mililitri.

La rumegătoare, alantocorionul se găseşte pe cea mai mare parte a suprafeţei, exceptând zona centrală, unde predomină amniocorionul (ca la scroafă).

La căţea şi pisică, alantoida separă complet amniosul de corion (alantocorion). Cantitatea de lichid alantoidian ajunge la 40-110 mililitri (la căţea),iar la pisică este între 5-15 ml.

Corionul la mamifere prezintă vilozităţi coriale primare, cu aspect de formaţiuni filiforme sau digitiforme orientate spre exterior. Concomitent cu vascularizarea şi dezvoltarea alantoidei, vilozităţile coriale primare se repartizează diferit, în raport cu specia, se vascularizează şi pătrund în criptele mucoasei, devenind vilozităţi coriale secundare şi participând la constituirea placentei. Astfel, o vilozitate corială secundară este o prelungire a corionului ( trofoblast cu mezoderm extraembrionar) în care au pătruns vasele alantoidiene (în cazul alantocorionului) sau vasele viteline (în cazul omfalocorionului).

Vilozităţile coriale secundare pot fi răspândite: a) difuz, cu răspândire uniformă completă (pe toată suprafaţa), la iapă sau incompletă (lipsind la capetele corionului), la scroafă; b) zonal, sub forma unui brâu circular median, la carnivore; c) grupate în formaţiuni denumite cotiledoane, la rumegătoare; d) discoidal, sub forma unei zone circulare la rozătoare şi primate.

Vilozităţile coriale lipsesc la marsupiale, care au un corion avilos şi sunt denumite mamifere aplacentare.

La iapă, corionul este căptuşit în întregime de alantoidă, după 55-60 de zile, când apare şi circulaţia placentară. Complexul corio-alantoidian prezintă cute care se pot desprinde, cad în lichidul alantoidian şi constituie hipomamele. Corionul are un aspect catifelat, datorită vilozităţilor fine (microcotiledoane), dispuse uniform pe toată suprafaţa sa. La nivelul contactului corio-alantoidian pot apare depuneri de fosfat de calciu, denumite plăci opace.

La scroafă, sacul corial este iniţial alungit-fusiform, (măsurând 15 mm la 17 zile) după care se scurtează (prin necroza extremităţilor) şi se dilată după 20 de zile. Vilozităţile lipsesc la capetele sacilor corionici.

179

La vacă, sacul corial fusiform ajunge la 50-60 cm lungime. Vilozităţile coriale se grupează în cotiledoane, dispuse pe 4 rânduri, fiind în număr de 80-120, în dreptul fiecărui corn uterin. În zona centrală a sacului, corionul nu este căptuşit de alantoidă, stabilindu-se un raport amnio-corial. În restul suprafeţei uterine a corionului, raportul este alanto-corial. La extremităţile sale, corionul este necrotic, ca şi la scroafă. La oaie şi capră, angrenarea vilozităţilor coriale în criptele uterine are loc în a 44-a zi de gestaţie.

La căţea şi pisică, iniţial corionul este acoperit în totalitate cu vilozităţi coriale primitive, dintre care se dezvoltă numai cele cin zona circulară centrală (reprezentând 1/3 din suprafaţa corionului). În totalitatea sa, corionul este căptuşit de alantoidă (alantocorion).

9.4.6.Particularităţile anexelor embrionare la păsări

La păsări, sacul vitelin (vezicula vitelină) are o importanţă mult mai mare decât la mamifere, deoarece ovula este de tip telolecit. Este prima anexă embrionară care se organizează ( din ziua a treia de incubaţie). În ziua a 5-a de incubaţie, vitelusul conţinut în vezicula ombilicală este acoperit în întregime de endodermul şi mezodermul extraembrionar, încât peretele sacului vitelin este structurat din endoderm, membrana vitelină şi mezoderm.

În mezodermul sacului vitelin se formează insulele sanguino- şi vasculo-formatoare (Wolff şi Pander), din care iau naştere celulele sanguine şi vasele primei circulaţii embrionare (circulaţia omfalomezenterică). Această reţea vasculară transportă substanţele absorbite de către endodermul vitelin, care prezintă vilozităţi. Rezorbţia vitelusului continuă şi în primele zile după ecloziune. Tot prin reţeaua vasculară se realizează transferul pasiv al anticorpilor maternali existenţi în vitelus, precum şi al unor proteine virale sau virusuri. Acest fapt permite transmiterea pe verticală (transembrionară) a unor infecţii şi vaccinarea “in ovo” , aplicată pentru imunoprofilaxia unor boli ( Boala Marek, bursita infecţioasă aviară).

Sacul vitelin este complet dezvoltat după 5-6 zile de incubaţie şi comunică cu intestinul embrionului prin canalul vitelin (ductus vitellinus), fără ca vitelusul să treacă prin acest canal în intestin. Vestigiile canalului vitelin persistă sub forma diverticulului vitelin ( diverticulum intestinale jejuni) sau a tubercului Meckel, care prezintă o structură (cu patru tunici), asemănătoare peretelui intestinal, şi o populaţie limfocitară şi plasmocitară bogată, încât este considerat organ limfoid secundar.

Sacul vitelin îndeplineşte mai multe roluri, precum:-absorbţia din vitelus a substanţelor nutritive şi plastice, necesare dezvoltarii embrionului până la ecloziune; - organizează reţeaua de capilare omfalomezenterice; - produce primele celule sanguine; - are funcţie de apărare imună locală şi generală.

Amniosul se formează de timpuriu (din a doua zi de incubaţie),prin plicaturare, fiind complet închis în ziua a treia (la găină) sau a patra (la curcă şi la gâscă) de incubaţie. Peretele amniosului este format din două straturi:- un strat intern, orientat către embrion, reprezentat de ectodermul extraembrionar şi altul extern, reprezentat de mezodermul extraembrionar (respectiv de somatopleură), în care vor apare vase de sânge şi fibre musculare. Fibrele musculare generează contracţii ritmice.Amniosul este despărţit de corion printr-un spaţiu denumit cavitate celomică extraembrionară (celoma extraembryonicum).

Ectodermul amniosului secretă lichidul amniotic (liquor amnioticus) care umple cavitate amniotică (cavum amnii). În acest lichid se acumulează uraţi, produşi de rinichiul embrionar, fulgi şi secreţii ale glandelor din cavitatea bucală şi tractusul respirator. Din ziua a 5-a de incubaţie, lichidul amniotic este înghiţit de pui. Amniosul şi lichidul amniotic asigură: -protecţia mecanică; libertate de mişcare pentru embrion; -nutriţia embrionului cu albuş, care este transferat din sacul cu albuş (albumen) – delimitat de corion – într-un canal sero-amniotic şi înghiţit de embrion;-asigură necesarul de apă; detoxifică embrionul de uraţi şi săruri minerale; stimulează funcţiile de deglutiţie şi respiraţie. După 11 zile de incubaţie, amniosul începe să regreseze, se atrofiază şi dispare.

180

Fig.9.32. Schema unei secţiuni prin oul de găină, la începutul incubaţiei1-Camera cu aer;2- Amnios; 3- Alantoidă; 4- Sacul vitelin; 5- Coaja calcaroasă; 6- Membrana cochilieră; 7- Albuş; 8- Corion

Alantoida se formează începând cu a 46 ore de incubaţie, când mugurele endodermic alantoidian, detaşat din zona caudo-ventrală a intestinului părăseşte aria embrionară, devenind o veziculă (după 72 ore de incubaţie) plină cu lichid, ce comunică cu intestinul primitiv printr-un pedicul străbătut de canalul urac. Pe măsură ce se dezvoltă, vezicula alantoidiană se insinuează între sacul vitelin, amnios şi corion, antrenând splanchnopleura şi ocupând întreg celomul extraembrionar. Înconjoară albuşul pe care îl cuprinde într-un sac. Din corion se formează un diverticul tubular care trece printre alantoidă şi sacul vitelin,devenind canal seroamniotic, prin care albuşul este transferat în amnios şi înghiţit de pui.

Mezodermul splanchnic al foiţei externe, se sudează cu somatopleura corionului, realizând membrana corioalantoidiană , în care se dezvoltă o reţea vasculară (după 5-6 zile de incubaţie), care se va lega de reţeaua vitelină pe care o va înlocui treptat, realizând circulaţia alantoidiană care se va racorda la circulaţia embrionară

Rolul alantoidei este foarte important în a doua jumătate a incubaţiei când asigură: protecţia embrionului prin lichidul alantoidian; consumarea albuşului (rol nutritiv); excreţia metaboliţilor (prin canalul urac); respiraţia (prin intermediul circulaţiei alantocoriale, începând cu ziua a 6-a).

Corionul este anexa cea mai puţin importantă la păsări. Se formează de timpuriu, o dată cu amniosul, din partea externă a cutelor amniotice. Are origine ectodermică şi parţial mezodermică (din somatopleură). Este împins de alantoidă şi ajunge în contact (după 7-8 zile de incubaţie) cu membranele cochiliere şi cu alantoida, când somatopleura corionului se sudează cu splanchnopleura alantoidei, realizând membrana corioalantoidiană (alantocorionul). Membrana corioalantoidiană asigură, începând cu zillele 9-10 de incubaţie, respiraţia embrionului prin circulaţia alantocorială şi schimburile de apă între embrion şi mediul exterior.

În timpul incubaţiei: - nutriţia se face pe seama vitelusului conţinut în vezicula ombilicală şi prin intermediul alantoidei (din sacul de albuş); -respiraţia se face prin intermediul vascularizaţiei alantoidine direct din camera de aer; - excreţia se face prin alantoidă. Pe măsură ce rezerva de vitelus este consumată, sacul vitelin se retractează şi dispare, închizându-se ombilicul. În momentul ecloziunii puiul sparge cu ciocul resturile de alantoidă, corionul, membranele cochiliere şi coaja calcaroasă.

181