histologie an i sem 2

5/7/2018 Histologie an I Sem 2 - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/histologie-an-i-sem-2 1/181

1.3.Concepţia actuală despre citologie

Citologia este o ramură a ştiinţelor biologice, care studiază structurile funcţionale şifenomenele biologice generale comune tuturor celulelor, evidenţiind legile generale de desfăşurare aproceselor vitale la nivelul celular şi molecular de organizare. Manifestându-se ca o ştiinţă integrativă,

ea foloseşte noţiuni de morfologie, biochimie moleculară şi celulară, fiziolgie celulară şi geneticămoleculară. Ultimul deceniu se remarcă prin intensificarea studierii nivelului molecular al proceselor celulare. Celula este considerată ,astfel, un microcosmos, în care structurile şi funcţiileinteracţionează armonios, fiind determinate şi reglate genetic, încât să se realizeze o eficacitatemaximă.

Dezvoltarea biologiei celulare şi moleculare se datorează pe de o parte perfecţionăriitehnicilor de studiere a celulei, iar pe de altă parte progreselor teoretice (conceptuale).

1.4.1.Tehnicile de studiere a celulei.

Sunt reprezentate de tehnici de microscopie (optică sau electronică) şi de tehnici decercetare ( fizice, biochimice, debiologie celulară şi moleculară , etc).

1.4.1. Tehnicile de microscopie optică şi electronică Microscopia optică foloseşte fotonii pentru realizarea imaginilor, asigurând măriri

de 1500-3000 de ori (în mod obişnuit de 1400 ori), cu o putere de rezoluţie de 0,2 micrometrii (µm).(Fig.1.1)

Fig.1.1 Formarea imaginii în microscopul optic1.Sursa de lumină; 2.Dispozitiv de uniformizare şi dozare a

luminii;3.Condensor;4.Preparat;5.Lentilă obictiv;6.Imagine formată înobiectiv;7.Lentilă ocular;8.Imagine finală.

Microscopia în contrast de fază, permite examinarea celulelor vii.Utilizează: microscoape cu interferenţă, pentru aprecierea cantitativă a maseiunor componente tisulare; - microscoape cu interferenţă diferenţiată, pentrustudierea suprafeţei celulelor.

Microscopia de fluorescenţă evidenţiază moleculele cu fluorescenţă

naturală ( vitamina A, catecolaminele) sau fluorescenţa indusă. Se foloseşte înimunohistochimie pentru detectarea reacţiei antigen-anticorp.

Microscopia cu ultraviolete foloseşte lumina ultravioletă pentrudetectarea unor amino acizi sau a acizilor nucleici.

Microscopia cu lumină polarizată pentru studierea formaţiunilor

cristaline. Microscopul confocal Permite obţinerea de imagini tridimensionale ale structurilor din

preparatele histologice.Principiul de funcţionare este asemănător cu cel al microscopului de

fluorescenţă. Sursa de lumină este reprezentată de un laser a cărei rază trece printr-o diafragmă cu deschidere punctiformă, după care este reflectată de ooglindă mobilă spre lentila obiectiv. Preparatul este situat la nivelul distanţei focale a obiectivului. In urma acţiunii razei laser asupra preparatului, acesta emite un fascicul delumină (eventual fluorescentă) care este colectat de lentila obiectiv şi dirijat spre diafragma punctiformă a detectorului , situată confocal ( în focarul lentilei obiectiv, opus focarului în careeste situat preparatul), rezultând o imagine finală, care este captată de un detector (similar ocularului).

Razele luminoase emise de formaţiuni situate în alte planuri nu vor fi captate de detector,încât se obţine o imagine foarte"curată", neestompată de imagini ale obiectelor situate proximal sau

1



distal faţă de planul focal. Prin deplasarea în plan vertical a focarului lentilei obiectiv, se pot obţineimagini ale unor planuri succesive, ca profunzime, realizând "secţiuni optice", fără a fi nevoie de oresecţionare a preparatului. Imaginile planurilor succesive sunt stocate în memoria unui computer,care le "ansamblează" obţinând o imagine tridimensională a preparatului examinat.

Microscopul confocal permite examinatorului să obţină "tomografia" unei structuri histologice,fiind folosit pentru studirea citoscheletului, a dispunerii cromozomilor în nucleu,etc. Dacă este dotat cu

lumină flurescentă se pot obţine imagini confocale fluorescente. Microscopul electronic sebazează pe utilizarea fluxurilor de electroni pentru realizarea imaginilor, permiţând obţinerea unor grosismente teoretice mai puternice de 10.000 de ori decât în microscopia optică. Se ajunge la oputere de rezoluţie egală cu 0,1 nanometri (nm).Există două tipuri principale demicroscoape electronice: - microscopul electronic de transmisie şi microscopulelectronic de baleaj (scanning).(Fig.1.2)

Fig.1.2 Formarea imaginii în microscopul electronic1-Catod; 2-Anod; 3-Lentila (bobina)condensator;4-Preparatul; 5-

Lentila (bobina) obiectiv; 6-Imaginea primară; 7-Lentila (bobina) de proiecţie; 8-Imagine finală.

Microscopul electronic de transmisie (Transmission electron

microscope - TEM) poate fi: - convenţional (CTEM), când diferenţa de potenţialajunge până la 100.000 volţi; sau - de înalt voltaj (HVEM), când diferenţa depotenţial ajunga la 800.000 volţi.

Componentele esenţiale ale unui microscop electronic detransmisie sunt:

Catodul sau sursa de electroni, reprezentat de un filament de tungsten

încălzit.

Anodul, care relizează diferenţa de potenţial. Un sistem de electromagneţi , care acţionează ca nişte lentile

condensator, lentile-obiectiv şi lentile de proiecţie.

Un suport pentru preparat sau portobiect , reprezentat de o grilămetalică fină pe care se fixează secţiunea de ţesut, inclusă în masă plastică.

Un ecran pe care se captează imaginea. Un dispozitiv de fotografiere a imaginii.

Puterea de rezoluţie este de 2 Angstromi(Å), în practică ajungându-se la 1,2 nanometri.

Fig.1.3 Formarea imaginii la microscopul de baleaj (scanning)1-Catod; 2-Anod; 3-Lentilă (bobină) condensator; 4-Bobină de scanare; 5-Preparat; 5'-Detector de electroni; 6-Amplificator electronic; 7-Ecran deproiecţie;8-Imagine finală.

Ca fixatori se folosesc glutaralaldehida, pentru constiutienţi proteicişi tetraoxidul de osmiu pentru lipide şi fosfolipide.

Se realizează secţiuni de ordinul nanometrilor cu ajutorul unor ultramicrotoame, înzestrate cu cuţite de diamant.

Ultrasecţiunile sunt incluse în mase plastice şi întise pe grile decupru . Pentru realizarea contrastului între diferite ultrastructuri se folosescsubstanţe precum citratul de plumb şi acetatul de uranil.

La examinare se observă că structurile cu densitate maredispersează (împrăştie) electronii, apărând de culoare închisă, în timp cestructurile cu densitate mică, care permit trecerea electronilor fară a-i deviaapar clare.

În cazul microscoapelor electronice de înalt voltaj ( HVEM ),diferenţa de potenţial atinge un milion de volţi. Electronii pot pătrunde prin

2



celule întregi sau preparate de câţiva microni (cca. 2 microni). Se obţine o imagine detaliată aorganizării tridimensionale, permiţându-se vizualizarea texturii celulare interne şi a unor detalii destructură, cum arfi de exemplu elemntele citoscheletului.

Microscopul electronic de scanning (Scanning electron microscope – SEM ) secarcterizează prin faptul că electronii nu trec prin preparatul studiat, ci mătură (şterg) suprafaţa

acestuia, încât se va obţine o imagine tridimensională a accidentelor de suprafaţă. Puterea derezoluţie este de cca. 100 Angstromi.Când electronii folosiţi de TEM sau SEM bombardează preparatul se produc radiaţii X cu

lungimi de undă caracteristice elementelor lovite de electroni. Prin analiza acestor raze X cu aparateadecvate se pot obţine estimări calitative şi cantitative foarte exacte asupra elementelor cu numărul atomic mai mare de 12.

1.4.2.Tehnici fizice .biochimice,de biologie celulară şimoleculară

Tehnici fizice:- Fracţionarea celulei prin centrifugare diferenţiată permite obţinerea în stare pură a unor

componente celulare, precum complexul Golgi, aparatul mitotic, ribozomi, etc.O contribuţie deosebită la perfecţionare acestei tehnici a adus-o G.Em.Palade care a pus la

punct centrifugarea în gel de sucroză.- Criofracturarea permite despicarea membranelor celulare îngheţate, la nivelul planuluimedian al bistratului lipidic.

- Autoradiografia localizează materialul radioactiv din ţesut.- Historadiografia realizează o microradiografie cu raze X a unui preparat histologic.- Difracţia razelor X , care a permis descifrarea structurii spaţiale a proteinelor şi a acizilor

nucleici.- Difracţia şi dispersia de neutroni , prin care s-a descifrat organizarea moleculară a

cromatinei.- Rezonanţa magnetică nucleară de înaltă rezoluţie, ce se utilizează pentru studierea

interacţiunilor moleculare în membranele biologice.- Rezonanţa magnetică în impulsuri , folosită la studiul permeabilităţii membranelor pentru apă

şi ioni.

- Rezonanţa electronică de spin, ce foloseşte ca markeri specifici substanţe cu electroniimpari care se ataşează şi evidenţiază molecule de ADN, de proteine,etc.- Spectrofluorometria,ce permite studierea vâscozităţii membranelor, difuziunea, rotaţia

proteinelor.

Tehnici biochimice În biologia moleculară se utilizează:- Electroforeza în gel de poliacrilamidă, pentru studiiul proteinelor şi acizilor nucleici.- Marcările bazate pe fotoafinitate a unor părţi din moleculelele integrate în structuri celulare.- Reconstituiri de structuri şi funcţii celulare din componentele purificate.- Imunocitochimia evidenţiază reacţiile dintre antigen şi anticorp.

Tehnici complexe de biologie celulară şi moleculară

Sunt reprezentate de:- Tehnica ADN-ului recombinat.- Producerea de anticorpi monoclonali cu ajutorul hibridoamelor, ce a permis descifrarea

mecanismelor care reglează exprimarea genei.- Sinteza artificială a genelor.- Manipulări de gene, etc.

1.5. Progrese conceptuale.Progresele teoretice sau conceptuale au permis îmbogăţirea, dezvoltarea şi aprofundarea

cunoştiinţelor de biologie celulară şi moleculară. Sunt reprezentate de:- Analiza şi sinteza informaţiilor obţinute de morfologia celulară, biochimia şi biofizica

celulară, fiziologia celulară, ►genetica moleculară, imunologia celulară şi moleculară, virusologie,etc. În acest concept se manifestă două tendinţe opuse: una de acentuare a sintezei şi alta de extindere asferei de sinteză.

3



- Molecularizarea informaţiilor , care constă în descifrarea structurilor şi funcţiilor până la nivel molecular. Acest fapt a dus la schimbarea denumirii acestei ramuri a ştiinţelor biologicedin "citologie generală" în "biologie celulară" şi apoi în "biologie celulară şi moleculară".

- Integrarea informaţiilor obţinute prin toate metodele şi de la toate nivelele într-un totunitar, încât biologia celulară şi moleculară studiază în mod complex şi complet aspectelemorfofuncţionale ale celululelor, observabile la microscopul optic, ultrastructurile relevate de

microscopul electronic, organizarea şi fiziologia moleculară, realizând o imagine exhaustivă a niveluluicelular de organizare a materiei vii.

2. CELULA CA SISTEM BIOLOGIC

Prin sistem biologic se înţelege un ansamblu de elemente (componente) interconectate într-o formaţiune complexă, relativ stabilă, formaţiune care se comportă ca un întreg, cu proprietăţi şifuncţii distincte cantitativ şi calitativ de proprietăţile elementelor componente.

Există sisteme lipsite de viaţă (abiotice), precum particulele subatomice, atomii, moleculele şisisteme dotate cu viaţă ( biotice )cum ar fi celulele, ţesuturile, organele, organismul, populaţia,biocenoza şi biosfera.

Celula (cellula) este primul sistem biologic care manifestă cea mai importantă caracteristicăa materiei vii - capacitatea de auto reproducere. Formele de "viaţă moleculară", identificate până în

prezent, ca "prionii" (microorganisme patogene, formate din particule proteice, fară acizi nucleici) şivirusurile (microorganisme ce conţin acizi nucleici şi proteine) sunt capabile să se reproducă numai îninteriorul celulei.

Celula, ca sistem, prezintă următoarele caracteristici:►Este un sistem deschis, pentru că are în permanenţă schimburi de energie şi substanţă cu

mediul extracelular.► Are un caracter istoric, apărând la un anumit moment al evuluţiei materiei vii şi putând să

dispară, atunci când materia vie îşi va produce o altă formă mai eficientă de organizare decât celula.► Are caracter informaţional, deoarece recepţionează, acumulează, prelucrează şi transmite

informaţii cu ajutorul codului genetic.► Prezintă trei categorii de programe, legate de capacităţile sale structurale şi funcţionale: a-

programul " pentru sine", ce asigură autoconservarea celulei ( de expl. în culturile de celule); b-programe ale sistemelor componente, ca de exemplu programele organitelor sau ale complexelor

moleculare; şi c- programe superioare care asigură existenţa sistemelor superioare ( ţesut, organ,organism).► Echilibrul dinamic, ce se manifestă printr-o "pendulare" continuă, faţă de o stare

morfofuncţională optimă, stabilă.► Autoreglarea sau "feed back"-ul, prin care îşi controlează procesele interne, în funcţie de

relaţiile cu mediul prin mecanisme de tip cibernetic.► Heterogenitatea internă este însuşirea de a fi alcătuită din elemente componente mai mult

sau mai puţin diferite ( de expl. mitocondrii, ribozomi, microfilamente, microtubului,etc.)► Integralitatea, prin care celula ca sistem, nu se reduce la suma însuşirilor elementelor

componente, ci prezintă însuşiri noi (structurale şi funcţionale) pe care nu le au aceste elementeconsiderate izolat. Această înşuşire permite desfăşurarea funcţiilor biologice fundamentale:metabolismul, reproducerea, adaptarea, menţinerea stării de stabilitatea diferenţiată,etc.

Pe baza acestor caracteristici, concepţia actuală despre celulă o defineşte ca fiind: unitatea

elementară a lumii vii, produs al evoluţiei, cu structură complexă, în relaţie de autonomie şiechilibru dinamic cu mediul înconjurător, având ca proprietăţi esenţiale metabolismul,autoreproducerea, creşterea şi dezvoltarea.

2.1. Arhetipurile celulareExistă două arhetipuri (arhetip = model primar, după G.E.Palade) celulare: procariotele

(procariot =prenucleat, fără nucleu distinct) şi eucariotele (eukariot= cu nucleu distinct).

2.1.1. Procariotele Sunt reprezentate, în principal, de bacterii şi de algele albastre verzi (denumite şi

cianobacterii).Ele sunt mai mici (1-10 µm) decât celulele eucariote şi lipsite de membrane intracelulare.

Organitele celulare sunt puţine ( numai ribozomi) sau absente.Nucleul nu apare distinct, genomul (totalitatea genelor) nefiind separat de citoplasmă.Prezintă un cromozom unic, dispus în citoplasmă şi reprezentat de un AND circular neconjugat

cu proteine. ARN-ul şi proteinele sunt sintetizate în acelaşi compartiment, în citoplasmă.

4



Nu au aparat mitotic, deoarece se înmulţesc prin sciziparitate.Îşi realizează locomoţia prin flageli simpli.

Au metabolism aerob sau anaerob.Sunt delimitate de o membrană plasmatică, ce trimite prelungiri endocelulare, denumite

mezozomi , dublată la exterior de un perete celular.Nu prezintă citoschelet, nu au curenţi citoplasmatici, iar endocitoza şi exocitoza sunt

absente.De obicei sunt monocelulare.

2.1.2.EucarioteleSunt reprezentate de protiste, fungi, plante şi animale.Au dimesiuni mai mari (5-100 µm) decât procariotele.Prezintă un sistem complicat de membrane intracelulare, care delimitează unele

componenete intracelulare (nucleul) şi unele organite (mitocondriile, reticulul endoplasmic,complexulGolgi,etc).

Au un nucleu distinct, în care este situat genomul, ce cuprinde mai mulţi cromozomi.Molecula de AND este foarte lungă şi conjugată cu proteine.

ARN-ul este sintetizat şi procesat în nucleu, în timp ce proteinele sunt sintetizate încitoplasmă.

Au citoschelet compus din proteine filamentoase, curenţi citoplasmatici şi desfăşoarăprocese de endocitoză şi exocitoză.Prezintă aparat mitotic.Se divid prin mitoză şi meioză.

2.2 Morfologia generală a celulelor eucariote

Dimensiunile celulelor eucariote sunt extrem de variate. Ele se exprimă în următoareleunităţi de măsură: micrometrul, nanometrul şi angstromul.

Unităţile de măsură folosite în morfologia microscopică

Denumire Simbol ValoareMicrometrul ( = micronul ) µm ( µ ) 1 µm =0,001 mm = 10 –6 m

Nanometrul nm 1 nm = 0,001 µm = 10-9

mAngstrom A 1A=0.1nm=10-4um=10-10m

Limita practică de rezoluţie a ochiului uman este de cca. 0,1 mm, a microscopului optic de0,2µm, iar a celui electronic de 2 angstromi( Å ).

Pentru fiecare categorie de celule, dimensiunile sunt relativ constante, indiferent despecie sau mărimea organului. Diferenţele de greutate a aceluiaşi organ la specii diferite suntgenerate de numărul de celule pe care îl conţin şi nu de volumul celulelor.

De exemplu, nefrocitele şi celulele musculare cardiace au dimensiuni apropiate la hominide,ecvine şi canide.

Limitele de rezoluţie in morfologie

A. Cu ochiul liber 0,1 milimetri (mm) Ovocitul de pasăreOvocitul umanAmoeba

B. Cu microscopuloptic

0,2 micrometri sau microni(μ sau μm)

Celule,Hematii,NeuroniNucleiMitocondriiBacterii, etc

C. cu microscopulelectronic

2 Angstromi (Ǻ)sau

0,2 nanometri (nm)

Ribozomi,Virusuri,Organite celulaere

Macromoleculemolecule

5



* Prin rezoluţie se înţelege distanţa minimă dintre două puncte în care acestea pot fi percepute caimagini seperate

Fig.2.1.Diagrama unităţilor de lungime

Dimensiunile medii ale diametrului celulelor se încadrează între 10-30 µm, dar în organismul animalelor există şi celule mai mici, precum: neuronii din stratul molecular al scoarţei cerebrale ( decca.4-4 µm), eritrocitele (5-7 µm), precum şi celule ce ajung la dimesiuni foarte mari, un exemplu constituindu-l ovulul ce atinge un diametru de 150-200 µm la mamifere, 3,5 cm la păsări şi 10 cm lastruţ. Neuronii motori din coarnele ventrale ale măduvei spinării au un corp ce atinge un diametru de200 µm, iar dacă se iau în considerare şi prelungirile ajung la o lungime de 1-1,5 m sau mai mult, înfuncţie de talia animalului. Fibra musculară striată are un diametru de ordinul micronilor, dar lungimea

este foarte variată, de la 1 la 12 cm.

Volumul celulelor variază în limite foarte largi de la 200 la15000 micrometri cubi (µm3),menţându-se constant pentru un anumit tip de celulă, independent de mărimea organului, aspectcunoscut sub denumirea de "legea constanţei volumului".

Vârsta şi funcţia determină variaţii în mărimea celulelor. Se observă o reducere a volumuluicelular în cursul embriogenezei timpurii, în cursul îmbătrânirii şi o creştere volumetrică în timpuldezvoltării postnatale. Se stabileşte un raport nucleo/citoplasmatic optim, un raport al suprafeţeicelulei faţă de volum şi un raport între metabolism şi volumul celulei.

Masa (greutatea) unei celule este de aproximativ 10-12 g, iar cea a unui ovocit uman de 10 -8

g.

6



Fig.2.2. Forma celulelor 1-Ovula; 2-Hematie de mamifer; 3-Eritrocit de pasăre; 4-Neutrofil de mamifer; 5-

Spermatozoid; 6-Celule poliedrice;7-Celule pavimentoase; 8-Celule cubice; 9-Leiocit; 10-Neuronpiramidal; 11-Neuron piriform; 12-Celulă mezenchimală; 13-Fibroblast;14-Melanocit,15-Adipocit alb;16-Histiocit; 17-Celulă prismatică cu platou striat; 18-Celulă caliciformă.

Forma celulelor , inţial sferică se modifică în cursul diferenţierii şi maturării celulelor. Formacelulelor este controlată atât de factori externi ca presiunea şi vâscozitatea mediului, cât şi de factoriinterni ca activitatea funcţională, vârsta, vâscozitatea citoplasmei, structura internă şi caracteristicilesuprafeţei.(Fig.2.2 )

Forma celulelor se adaptează la funcţie, respectându-se o lege generală a biologiei, conformcăreia se obţine maximum de randament funcţional cu minimum de cheltuieli materiale şienergetice.Astfel,celulele contractile sunt fuziforme sau cilindrice, iar celulele specializate înconductibilitate prezintă numeroase prelungiri.

Numărul celulelor este extrem de mare, ajungând la ordinul de milioane de miliarde (1014).Celulele sanguine reprezintă populaţia cea mai numeroasă, reprezentată de mai multe zeci

de miliarde. Numărul hepatocitelor şi al neuronilor este de circa 100 de miliarde, iar cel al nevrogliilor este de aproximativ 10 ori mai mare decât numărul neuronilor.

Durata vieţii celulei sau ciclul celular reprezintă intervalul de la apariţia unei celule până îşitermină propria sa diviziune.

Variază de la 10-20 minute până la 10 9 minute. Celulele bacteriene trăiesc câteva zeci deminute, celulele epiteliale 1-2 zile, hematiile 127 zile, iar unele celule musculare şi nervoase toatăviaţa individului.

La om, în fiecare secundă au loc peste 4 milioane de diviziuni celulare, într-o zi au loc cca.350 bilioane diviziuni, iar într-un an 10 14 diviziuni, număr egal practic cu numărul total al celulelor cealcătuiesc corpul omului adult.

2.3. Compartimentarea celulelor eucarioteCelula eucariotă prezintă trei componenete principale: membrana, nucleul şi citoplasma.

(Fig.2.3)Membrana poate fi situtată la periferie, realizând pe de o parte delimitarea celulei de mediul

extracelular, sau poate fi dispusă în citoplasmă, unde formează un sistem de membrane intracelularecu o suprafaţă deosebit de activă biologic, de 10-20 ori mai mare decât cea a membranei periferice.

7



Fig.2.3. Schema unei celule eucarioteideale

1-Membrana celulară;2-Nucleul; 3-Citoplasmă; 4-Lizozom primar; 5-Poliribozomi liberi; 6-Reticul endoplasmicrugos; 7-Reticul endoplasmic neted; 8-Complex Golgi;9-Microfilamente; 10-Microtubuli; 11-

Centrioli; 12-Corpuscul bazal; 13-Microvili;14-Cil; 15- Fagozom; 16-Peroxizom;17-Caveolă acoperită; 19-Nucleoli; 20-eterocromatină; 21- Cisternăperinucleară; 22-Por nuclear; 23-Mitocondrie; 24-Corp rezidual; 25-Granulede secreţie; 26-Picătură de lipide; 27-

Granule de glicogen; 28-Pseudopode.

Membranele intracelulare, endomembranele saucitomembranele diferă între ele prin structură, compoziţie

chimică şi funcţie.Ele împart celula în două compartimente: compartimentul matriceal sau plasmatic "P" şi

compartimentul intracisternal sau "E". Există şi un compartiment secundar sau de tip "C", reprezentatde matricea mitocondrială şi a cloroplastelor.

Totodată endomembranele delimitează nucleul şi unele organite celulare (lizozomii, reticululendoplasmic,complexul Golgi). Există şi organite nedelimitate de membrane (ribozomii,centriolii,corpusculii bazali, microfilamentele, filamentele intermediare şi microtubulii).

3. Membranele celulare Membranele celulare (membrana celullaris) sunt structuri moleculare complexe care

marchează limita celulei sau a unui teritoriu intracelular.Există trei categorii principale de membrane celulare:1.Membrana plasmatică sau plasmalema, ce conferă individualitate celulei şi participă la

interacţiunile dintre celule sau la cele cu mediul extracelular.2.Citomembranele sau endomembranele, reprezentate de membrana nucleului,

membranele reticulului endoplasmic, membranele complexului Golgi, membranele mitocondriilor,lizozomilor şi peroxizomilor.

3. Membranele speciale reprezentate de membranele tecilor de mielină şi de membranelediscurilor din segmentul extern al celulelor vizuale din retină.

3.1 Organizarea moleculară a membranelor

În evoluţia cunoştiinţelor despre organizarea moleculară a membranelor se disting mai multemodele: iniţial, paucimolecular, unit, mozaicul fluid şi modelul actual.

Fig.3.1 Modelul paucimolecular.1-Bistratul lipidic; 2-Stratul proteic extern; 3-Stratul proteicintern.

Modelul iniţial (elaborat de OVERTON în 1895 ) a sugeratprezenţa lipidelor în membranele celulare, observând căsolvenţii organici difuzează mai rapid prin membrane decât înapă. Lipidele din membrane sunt dispuse în strat dublu ( înbistrat ), pentru că suprafaţa filmului lipidic din hematii estedublă faţă de suprafaţa acestora. ( după GÖRTER şi GRENDEL – 1925 )

Modelul paucimolecular a fost elaborat ( în 1930 deDANIELLI şi DAVSON ) , după măsurarea tensiunii

8



superficiale a membranelor celulare, când au găsit aproximativ o dină/cm2 , faţă de 5 dine câtreieşea din calcule.

Asfel, ei au dedus că bistratul lipidic (stratul lipidic dublu ) este tapetat pe ambele feţe destraturi de proteine, care reduc tensiunea superficială. Totodată au demonstrat experimental acestfapt, adăugând proteine, ce au produs reducerea tensiunii superficiale. Tot ei au elaborat modelulpaucimolecular (paucus = puţin numeros), după care membranele celulare au un centru lipoid "lamina

intermedia", ( format din fosfolipide, dispuse în strat dublu, cu capetele polare orientate spreexterior ), tapetat cu proteine, care formează o lamină externă şi alta internă.(Fig.3.1) Modelul "UNIT" a fost elaborat ( de ROBERTSON, între 1958-1960 ), după cercetări

efectuate la microscopul electronic ( cu grosisment de 100.000 ), efectuate pe membrana tecii demielină. După acest model, membranele celulare au o ultrastructură trilaminară, prezentând douăbenzi dense (de 2,5 nm), ce delimitează între ele o bandă clară ( de 3 nm), formată dintr-un ax lipidichidrofob.

Acest model confirmă modele anterioare şi le dezvoltă, adăugând două noi concepte: -universalitatea bistratului lipidic şi - asimetria chimică, după care glucidele sunt ataşate numai pe faţaexternă, lipsind pe faţa internă. Modelul este incomplet pentru că ignoră dinamismul moleculelor componente.(Fig.3.2).

Fig.3.2 Organizarea moleculară amembranei periferice

Modelul"mozaicului fluid",(elaborat de SINGER şi NICOLSON în1972 ) susţine că moleculelecomponente ( de lipide şi de protide) semişcă în mod întâmplător în bistratullipidic.

Cercetările ulterioare au arătat cămişcările moleculelor sunt controlate de

citoschelet şi sunt limitate la anumiteporţiuni ale suprafeţei membranei. Existăşi zone ale feţei externe a bistratuluilipidic neacoperite de proteine.

Modelul actual susţine că: - bistratul lipidic este asimetric, fluid şi reprezintă axul întreguluiedificiu molecular al membranelor; - pe feţele hidrofile, proteinele sunt distribuite asimetric, înaranjamente caracteristice.

3.2. Ultrastructura membranei periferice

9



Membrana periferică are trei componente ultrastructurale: plasmalema,glicolema,citoscheletul membranei.

Membrana periferică a celulei eucariote

Glicolema

Componentainternă 20 nm Puţin densăla fluxul deelecroni

Conţine:GalactozaGalactozaminaManoza,Fucoza,Glucoza

(50 nm) Componentaexternă

30 nm Mai densăla fluxul deelectroni

Glucozamina,Acidul sialic

Lamina externa 2,5nm

Bandădensă lafluxul deelecroni

Conţine:Grupările polarehidrofile alefosfolipidelor

Proteine extriseciMembranacelularăperiferică

Plasmalema(7- 8 nm)

Laminaintermedia

3 nm Bandă clarăla fluxul deelectroni

Conţine:Fosfolipide –70%Colesterol-25%Glicolipide-5%

Lamina interna 2,5nm

Bandădensă lafluxul deelectroni

Conţine:Grupările polarehidrofile alefosfolipidelor Proteine extrinseci

Citoscheletulmembranei

5-9nm

Conţine:ActinăAnchirină

SpectrinăProteina benzii 4-1

3.2.1. Plasmalema

Plasmalema (plasmalemma) reprezintă structura de bază a tuturor membranelor celulare( periferice sau endomembrane), fiind alcătuită din bistratul lipidic asociat cu proteine. Are o grosimede cca. 7,5 nm.

La un grosisment redus (de 10.000 ori ) apare ca o linie unică elecronodensă. La o mărire

de 100.000 ori, dacă planul secţiunii a căzut perpendicular pe membrană, plasmalema prezintă unaspect caracteristic, trilaminar, cu două benzi dense (de 2,5 nm), separate de o bandă clară ( de 3nm).

Endomembranele au ,în general, acelaşi aspect electronomicroscopic, respectând modelulunit. (Fig.3.3)

10



Banda luminoasă, clară (lamina intermedia) corespunde radicalilor de acizi graşi hidrofobi dinfosfolipidele bistratului, iar benzile dense (lamina externa et interna) cuprind grupările polare hidrofileale fosfolipidelor şi parţial proteinele asociate membranei.

Fig.3.3Componentele

membranei celulareperifericeI-Glicolema; II-Plasmalema; III-Citoscheletul membranei

Compoziţiachimică a plasmalemeicuprinde: lipidecomplexe, proteine şiglucide.

LIPIDELE suntconţinute în bistratullipidic, fiind reprezentatede fosfolipide (70%),colesterol (25%) şiglicolipide (5%).

Fig.3.4. Tendinţa de organizare a moleculelor de fosfolipideA-Monostrat; B,C- Micelii1-Laţuri de acizi graşi; 2-Grup polar; 3-Apă; 4-Aer

Fosfolipidele şi glicolipidele sunt molecule complexe cu caracter amfofil (=amfipatice=bimodale), prezentând un "cap" hidrofil (sau grupare polară) şi o "coadă"hidrofobă, cecuprinde fragmente de acizi graşi esterificaţi.Ele au tendinţa de a se organiza în « pelicule sau micelii » , deoarece cozile trebuie să se dispună în afara contactului cu apa.Menţinerea moleculelor în pelicule sau micelii se realizează prin legături hidrofobe ce nu implică cheltuieli de energie.

În cazul fosfolipidelor şi glicolipidelor din membrană, forma cea mai stabilă a miceliilor estereprezentată de stratul lipidic dublu în care grupările polare sunt dispuse la exterior în contact cu apa,iar lanţul de acizi graşi se află la interior. Asfel, se formează un bistrat sau continuum lipidic.

Fosfolipidele din plasmalemă sunt reprezentate de fosfogliceride (ca de exemplu:fosfatidilcolină, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinozitolul) şi de sfingolipide ( dintre carecea mai răspâdită este sfingomielina. Molecula de fosfatidilcolină, denumită şi lecitină, are aspectul unui "cui", în care "capul" (alcătuit din radicali de colină şi fosfat) este hidrofil, poartă sarcini electriceşi este numit grup polar . Radicalii de acizi graşi sunt hidrofobi şi formează segmentul apolar al moleculei.

11



Glicolipidele pot fi simple ( de expl. cerebrozidele) sau complexe (de expl.gangliozidele). Auasarcină electrică negativă. Gangliozidele conţin unul sau mai multi radicali de acid sialic (numit şiacid N-acetilneuraminic sau NANA) care le conferă sarcină electrică negativă.

Încărcătura electrică negativă a suprafeţelor celulare este conferită în mare parte de grupările polare ale fosfolipidelor, ale glicoproteinelor sulfatate şi îndeosebi de radicalii carboxilici ai acidului sialic .

Colesterolul se găseşte în proporţie mai mare în membranele la care predomină funcţia debarieră, dar scade în membranele intracelulare.

Există o asimetrie în dispunerea lipidelor în bistratul membranei eritrocitare. Astfel,glicolipidele se găsesc numai în stratul extern, la nivelul căruia este abundent şi colesterolul. Înstratul intern al bistratului lipidic sunt mai frecvenţi acizii graşi nesaturaţi, în timp ce în stratul externse întâlnesc în proporţie mai mare acizii graşi saturaţi cu lanţuri lungi.

Lipidele sunt repartizate neuniform pe suprafaţa membranei celulare, putându-se grupa în"petice" sau "calote", cu implicaţii funcţionale speciale, îndeplinind rol de receptori.

Fluiditatea lipidelor. La temperatura corpului, toate lipidele din membrană se găsesc în stare fluidă.Ele pot executa două tipuri de mişcări: 1- mişcări în interiorul unei molecule, precum mişcări aleatomilor de carbon în lanţurile de acizi graşi şi în gruparea polară; 2-mişcări ale întregii molecule, ce

pot fi: - de translaţie sau de difuziune laterală; - de rotaţie în jurul axei longitudinale a moleculei şi c-mişcări de difuziune transversală (flip-flop).(Fig.3.5)

Fig.3.5.Mişcările lipidelor în bistrat1-Gruparea hidrofilă; 2-Gruparea hidrofobă; 3-Difuziune laterală; 4-Rotaţie; 5-Flip-flop;6-Flexie.

Moleculele de lipide se deplasează mai uşor prin mişcări laterale în acelaşi strat şi trec foartegreudintr-un strat în altul.

Unele lipide (expl. cardiolipina) sunt capabile, în prezenţa ionilor de calciu, să se detaşezedin straturile lipidice şi să se dispună în formă hexagonală, în cilindri de lipide, care delimiteazăcanale, ce permit schimburi selective prin bistratul lipidic .

PROTEINELE plasmalemei formează două straturi asimetrice, ce tapetează bistratul lipidic

sau pot traversa bistratul lipidic, unde execută mişcări de translaţie (difuziune laterală) şi de rotaţie.(Fig.3.6).Prin electroforeză în gel de poliacrilamidă au fost identificate 15 proteine majore, cu greutăţi

moleculare între 15.000-250.000 daltoni. Trei din aceste proteine (spectrina, glicoforina şi proteinabenzii 3) ocupă mai mult de 60% din greutatea proteinelor membranare.

Fig.3.6.Formarea porilor hidrofili

1-Lipide - grupărihihrofobe; 2-Lipide - grupărihidrofile; 3-Proteine;4-Por hidrofil.

12



S-au identificat două grupuri de proteine ( prin metode de cogelare-fracţionare şi fracţionare - purificare ):

-a) proteine transmembranare (intriseci sau integrale), cuprinse în bistratul lipidic ca niştecuburi de gheaţă, legate hidrofil şi hidrofob de lipide. Se extrag foarte greu şi servesc ca dispozitive

de recepţie-transducţie.-b) proteine membranare periferice (sau extrinseci), situate de o parte şi de alta abistratului lipidic, de care se ataşează prin slabe legături hidrofile.(Fig.3.7)

Fig.3.7. Dispunerea proteinelor în plasmalemă 1-Bistratul lipidic; 2- Proteine extrinseci externe;

3-Proteine extrinseci interne; 4-Proteine intrisecitransmembranare

Proteinele extrinseci sunt distribuite pe o faţă sau alta a bistratului lipidic şi şi seleagă de capatele hidrofile ale lipidelor.

Sunt mai numeroase pe faţă internă unde participă la realizarea citoscheletului membranei celulare.

Proteinele de pe faţa externă a bistratului lipidic sunt glicoproteine şi se prelungesc pedistanţe mai scurte sau mai lungi în glicolemă, ataşând pe lanţul lor polipeptidic fragmente deoligozaharide.

Compoziţia, ordinea moleculelor şi dispunerea lanţurilor de de oligozaharide faţă de proteinele transmembranare determină specificitatea funcţională şi identitatea fiecărui tip de celule .

3.2.2. Glicolema sau glicocalixulGlucidele plasmalemei sunt reprezentate de hexoze, hexozamine şi acid sialic. Fragmentelede acid sialic ocupă întotdeuna extremităţile periferice ale lanţurilor de oligozaharide şi conferăsarcină electrică negativă suprafeţei celulelor eucariote.(Fig.3.8)

Fig.3.8. Organizarea glicocalixuluiA-Glicocalix;B-Bistratul lipidic.

1-Rest glucidic;2-Glicolipidă;3-Glicoproteină adsorbită;4-Proteină transmembranară

Lanţurile de oligozaharide sunt ancorate peversantul extern al plasmalemei, formând un înveliş al

13



suprafeţei celulare, numit glicocalix (înveliş dulce) sau glicolemă. Nu există o delimitare netă întreglicocalix şi substanţa vie din spaţiul extracelular, cunoscută sub numele de matrice extracelulară.

Glicolema sau glicocalixul (glicocalyx ) este o componenta externă, de natură glicoproteicăa membranei celulare periferice (cu grosimea medie de 50 nm) .

Glicocalixul prezintă două zone: - o zonă internă, denumită şi înveliş de suprafaţă, mai puţin

densă, (cu grosimea de 20 nm) şi o zonă externă mai densă ( cu grosimea de 30 nm).Grosimea glicocalixului apare variată. Este mult redusă la celulele în culturi; - subţiat (pânala 20-30 nm), când ocupă spaţiul dintre celulele învecinate; - crescut (până la 50 nm) la celulele liberesau pe polul apical al celulelor intestinale.

Din punct de vedere chimic, glicocalixul este alcătuit dintr-o ţesătură delicată de de lanţuriproteice, pe care sunt ancorate fragmente de glucide.

Dintre monozaharide, în glicoproteinele şi glicolipidele de la nivelul membranelor şi din glicocalix,cele mai importante sunt: galactoza, galactozamina, manoza,fucoza, glucoza, glucozamina şi acidul sialic.

Raportul strâns, de continuitate, dintre glicolemă şi plasmalemă se datorează glicolipidelor şi glicoproteinelor componente, învelişul de suprafaţă devenând parte integrantă a membranei celulare.

Glicocalixul conferă individualitate biochimică celulei, comportându-se ca o "carte deidentitate a celulei", datorită numeroaselor variante moleculare pe care le realizează cu ajutorul

monozaharidelor componenete. Intre moleculele membranei, oligozaharidele induc o variabilitate periferică pronunţată, în contrast cu varibilitatea redusă a lanţului polipeptidc. Astfel, trei aminoacizi diferiţi pot da naştere la şase tripeptide, în timp ce trei monozaharide pot genera 1056 trizaharidediferite.

Funcţiile glicocalixului sunt :►Participă, alături de matricea extracelulară, la realizarea adezivităţii intercelulare;►Asigură specificitatea şi individualitatea biochimică tipului de celule.Astfel grupele sanguine

sunt determinate de grupările glucidice terminale aflate pe glicoproteinele şi glicolipidele dinmembrana eritrocitelor.

►Conţine grupările glucidice ale proteinelor-receptori din membrană, dar şi ale unor proteineimplicate în fenomenele de transport.

►Depozitează ionii de calciu (Ca2+)datorită sarcinilor elctrice negative şi intervine în controlul

schimburilor ionice transmembranare.► Participă la transmiterea informaţiei despre celulă. Astfel, unele celule din ficat şi din splină recunosc cu ajutorul receptorilor de membrană

glicoproteinele şi glicolipidele de pe suprafaţa eritrocitelor uzate, care au pierdut acidul sialic şi prezintă descoperită galactoza, ce ocupă penultimul loc din lanţ. Galactoza este recunoscută dereceptorii macrofagelor din ficat (celulele Kupffer), încât hematiile uzate sau îmbătrânite sunt imobilizate, fagocitate şi lizate.

3.2.3. CitoscheletulCitoscheletul (cytoscheleton) membranei celulare este o reţea de proteine extrinseci (cu

grosimea de 5-9 nm), situate pe faţa internă a membranei periferice. Citosheletul este legat deplasmalemă prin intermediul capătului intern al proteinelor transmembranare, iar spre interiorul celuleise continuă cu citoscheletul din matricea citoplasmatică.

La microscopul electronic, citoscheletul membranei apare ca o reţea de microfilamenteproteice orientate neregulat, în nodurile reţelei fiind prezente proteine globulare. (Fig.3.9)Datele referitoare la citoscheletul mebranei au fost obţinute în urma cercetărilor efectuate pe

membranele globulelor roşii, ulterior fiind considerate valabile şi pentru membranele altor tipuri decelule.

În membrana hematiilor, citoscheletul înglobează circa 60% din masa proteinelor întregii membrane. Principalele tipuri de proteine citoscheletale sunt: spectrina,anchirina, actina,glicoforina şi o proteină care în cursul electroforezei în gel de poliacrilamidă migrează în banda 4-1. Mai sunt prezente şi alte proteine neidentificate, ce au mase moleculare diferite. Prin extragerea spectrinei şi actinei, citoscheletul membranei se dezintegrează, piezându-şi forma şi structura.

Spectrina (sau tectina) este proteina care predomină în citoschelet. Moleculele solitare despectrină sunt foarte flexibile. Apare sub forma a doi dimeri (unul de 240.000daltoni şi altul de 220.000 daltoni). Dimerii despectrină au o formă de bastonaş cu o lungime de 100 nm şi o grosime de 5 nm. Ei se pot lega capla cap formând tetrameri, hexameri, octameri .

14



Fig.3.9.Schema citoscheletuluimembranei

A-Complexul spectrină,anchirină, proteină integrală;

B-Complexul spectrină,actină,proteina benzii 4-1;1-Proteină

transmembranară; 2-Anchirină; 3-Filamente scurte de actină; 4-Proteina benzii 4-1; 5-Spectrină.

.Anchirina (nectina sau

sindeina) este un polipeptid, cuformă sferică sau piramidală celeagă spectrina la capătul

citoplasmatic al proteinei benzii4,1. Are o greuate moleculară

de 200.000 daltoni,. Intr-o hematie de la om există cca. 120.000 de molecule de anchirină, într-unneutrofil - 600.000, într-un trombocit - 3.000, iar într-un fibroblast - 30.000 .

Actina se găseşte sub forma de mici fragmente de actină fibrilară, ce conţin 13 monomeri.Lungimea fragmentelor de actină variază în funcţie de numărul moleculelor de spectrină pe

care le leagă prin capetele lor, fapt ce poate explica plasticitatea citoscheletului membranei, in vivo şi aspectul lax al acestuia la microscopul electronic.

Proteina benzii 4-1 are aspect globular ( cu diametru de 6 nm) .Laturile ochiurilor din reţeaua citoscheletului membranar sunt alcătuite din dimeri de

spectrină, iar nodurile reţelei (complexele joncţionale) sunt formate din două tipuri de complexemoleculare: - un complex ce conţine spectrină, anchirină şi o proteină transmembranară, ce

realizează legătura cu membrana plasmatică; - şi un alt complex format din spectrină, actină, proteina benzii 4-1 şi adducină, prezent în nodurile propiu zise ale reţelei. Proteinele citoscheletului membranei, împreună cu lipidele şi proteinele de pe faţa internă a plasmalemei prezintă numeroşi radicali hidrofili electronegativi, încât încărcătura electrică negativă este mai puternică decât pe faţaexternă.

Totodată, în citoscheletul membranei, se găsesc unele proteine cu locusuri de legare acalciului, denumite calmoduline, ce joacă un rol important în reglarea proceselor intracelulare.Legăturile dintre diferitele tipuri de proteine din citoschelet sunt realizate prin procese de fosforilare, în care intervine o proteină reglatoare, gelsolina, dependentă de calciu.

Citoscheletul conferă membranei: -1) elasticitate, prin dispunerea în reţea a proteinelor; şi -2)rezistenţă, prin complexele proteice de la nivelul nodurilor.

3.3.Diferenţieri de suprafaţa ale membranei celulare periferice.Sunt neregularităţi ale citoplasmei periferice, cu caracter tranzitoriu sau permanent,

delimitate de membrană.

Diferenţieri ale membranei celulare periferice

InvaginăriCripteCanalicule intracelulare

Diferenţieritranzitorii Expansiuni sau

Pseudopode Filiforme

Digitiformeprocese Procese lamelare Văluri

Membrane ondulanteDiferenţieri

Microvilozităţi Platou striatMargine în perie

15



permanente Expansiuni CiliFlageli

Diferenţierile tranzitorii apar şi dispar în raport cu anumite momente funcţionale ale celulei,având aspectul unor învaginări (invaginatio

Fig.3.10. Diferenţeri ale membranei celulare1-Capilar sanguin; 2-Neutrofile; 3-Pseudopod; 4-Nucleu de histiocit; 5-Văluri ondulante; 6-

Macrofag cu văluri; 7-Enterocit;8 -Microvili; 9-Glicocalix; 10-Lumenul nefronului; 11- Margine înperie; 12-Celulă prismatică ciliată; 13-Cili; 14-Axonema; 15_Corpuscul bazal; 16-Rădăcina cilului;17-Secţiune transversală prin tija cilului; 18-microtubuli centrali şi periferici; 19-Stereocili pecelule epiteliale din epididim; 20-Flagelul spermatozoidului

cellularis) ale plasmalemei (în endocitoză), sau al unor expansiuni (processus celularis), cum ar fi

pseudopodele sau vălurile ondulante, prin care se realizează deplasarea celulelor.Pseudopodele (processus amoeboideus) sunt expansiuni cu formă de conuri (processus

filiformis) sau degete (processus digitiformis), cu ajutorul cărora leucocitele aderă de suporturi,deplasându-se în timpul diapedezei. Ele conţin organite celulare, precum mitocondrii, ribozomi,lizozomi.

Vălurile şi membranele ondulante (processus lamellosus) sunt expansiuni lamelare, foartemobile, ce se formează în mediul lichid. Nu conţin organite şi nu aderă la suporturi. Apar în urma unor modificări ale tensiunii superficiale şi se întâlnesc la histiocitele implicate în fagocitoză.

16



Expansiunile permanente sunt reprezentate demicrovili, cili şi flagel.

Fig.3.11.Dispunerea microfilamentelor înmicrovilul intestinal

1-Microvili;2-Microfilamente de actină; 3-Microfilamente de miozină; 4-Zonula adherens.

Microvilii ( microvillus, i ) sunt expansiunicilindrice, delimitate de membrana polului apical (apex cellularis).Ele intervin în procesele de absorbţie prinmărirea suprafeţei de contact a celulei cu substanţelece vor fi absorbite şi prin concentrarea unui număr mare de receptori. Pot fi dispuse grupat sau solitar.Microvilii solitari sunt inegali, cu forme şi dimensiuni

variabile, distanţate unele de altele, formând margineaîn perie ( de expl.la nefrocite, din tubii contorţi ai nefronului ).

Platoul striat cuprinde numeroşi microvili (300-3000/enterocit ) uniformi ca lungime (0,6-0,8µm) şi diametru (200 nm), îmbracati în glicocalix. Plasmalema microvililor conţine ATP-ază şi unnumăr mare de transportori. Citoplasma microvililor cuprinde în zona centrală microfilamente (10-40)de actină, dispuse paralel cu axul lung al microvilului.(Fig.3.11)

Microfilamentele de actină se inseră cu un capăt pe plasmalema polului apical al microvilului,iar la polul bazal al acestuia se termină într-o reţea perpendiculară de filamente de actină şi miozină,denumită buton terminal, ce are rolul de a menţine poziţia microvilului. Mănunchiul de microfilamentedin microvil este legat de plasmalemă, din loc în loc,printr-o proteină, denumită fimbrină . Aceste

legături formează o scară, în spirală, de-a lungul microvilului .

17



Fig.3.12.Cili- aspect, structură şi ultrastructurăA-Epiteliu pseudostratificat prismatic cilat; B-Celule prismatice ciliate,polulapical;C-Secţiune transversală prin cil.

Cilii (cilium,a) pot fi mobili (sau vibratili) şi rigizi (sau stereocili).Cilii mobili (kinetocilii ) sunt prezenţi la polul apical al celulelor epiteliale din mucoasa

aparatului respirator sau a oviductului. Au o lungime de 5-15 µm, o grosime de 0,2 µm. unt formaţi dintrei porţiuni: - tija sau porţiunea liberă, -corpusculul bazal şi rădăcina.

Tija (pars extracellularis) conţine o matrice electrono -densă, plasată la periferie şi uncomplex filamentos axial (sau axonema)(filamentum axiale), format din 10 perechi de tubulilongitudinali: -o pereche centrală (microtubulus centralis) şi - nouă perechi periferice(diplomicrotubulus periphericus), dispuse în jurul perechii centrale.

Corpusculul bazal (corpusculum basale) are un aspect cilindric şi cuprinde în structura sanouă dublete sau triplete (triplomicrotubulus) periferice de microtubuli, lipsându-i perechea centrală.Coordonează mişcarea cililor.(Fig.3.12)

Rădăcina (radix basalis) cilului este formată din dubletele sau tripletele periferice alecorpusculului bazal care ajung în citoplasma polului apical al celulei ciliate. Are rolul de a ancoracilul în citoplasmă, prezintă proprietăţi contractile şi participă la conducerea stimulilor recepţionaţi deporţiunea liberă.

Stereocilii sunt cili rigizi, în structura cărora lipseşte perechea de microtubuli centrali, avândnumai cele nouă dublete periferice. Se întâlnesc pe polul apical al celulelor din epiteliul epididimului.

18



Flagelul (flagellum) are în axonemă o pereche centrală şi nouă perechi periferice demicrotubuli. Este prezent în alcătuirea spermatozoidului.(microtubulus centralis) şi - nouă perechi periferice (diplomicrotubulus periphericus), dispuse în jurulperechii centrale.

Corpusculul bazal (corpusculum basale) are un aspect cilindric şi cuprinde în structura sa

nouă dublete sau triplete (triplomicrotubulus) periferice de microtubuli, lipsându-i perechea centrală.Coordonează mişcarea cililor.(Fig.3.12)Rădăcina (radix basalis) cilului este formată din dubletele sau tripletele periferice ale

corpusculului bazal care ajung în citoplasma polului apical al celulei ciliate. Are rolul de a ancoracilul în citoplasmă, prezintă proprietăţi contractile şi participă la conducerea stimulilor recepţionaţi deporţiunea liberă.

Stereocilii sunt cili rigizi, în structura cărora lipseşte perechea de microtubuli centrali, avândnumai cele nouă dublete periferice. Se întâlnesc pe polul apical al celulelor din epiteliul epididimului.

Flagelul (flagellum) are în axonemă o pereche centrală şi nouă perechi periferice demicrotubuli. Este prezent în alcătuirea spermatozoidului.

3.4. Joncţiunile celulareJoncţiunile celulare (junctio intercellulares) sunt structuri stabile prin care plasmalemele

celulelor interacţionează specific.

Tipuri de joncţiuni celulare

Spaţii intercelulareA. Joncţiuni simple Joncţiuni denticulate

Joncţiuni digitiforme

Joncţiuni de adezivitateDesmozomi în patăDesmozomi în bandăHemidesmozomi

B.Joncţiuni complexe Joncţiuni impermeabile Joncţiuni focaleJoncţiuni de comunicareC. Complexe joncţionale

Fig.3.13.Tipuri de joncţiuni celulare

A-Joncţiuni impermeabile -zonula occludens; B-Desmozomi în bandă - zonula adherens;C-Desmozomi în pată - maculaadherens; D-Joncţiuni permeabile-gap.

In raport cu structura lor, sedescriu joncţiuni simple, joncţiunicomplexe şi complexe joncţionale(jonctio intercellularis complex).

În cazul joncţiunilor simple(junctio intercelluaris simplex), între plasmaleme există un spaţiu(de cel puţin 30 nm) prin care pottrece toate tipurile de moleculeexistente în mediul intercelular.După aspectul lor, joncţiunilesimple sunt de trei feluri : - spaţii

intercelulare, - joncţiuni intercelulare denticulate (junctio intercellularis denticulata), şi - joncţiuni

intercelulare digitiforme (junctio intercelluaris digitiformes). În raport cu funcţiile lor , se disting trei categorii de joncţiuni complexe: -de adezivitate, -impermeabile şi -de comunicare.(Fig.3.13)

19



3.4.1.Joncţiunile de adezivitate sau dezmozomii.Desmozomii (desmosoma) sunt joncţiuni ce conferă o mare rezistenţă mecanică unor ţesuturi

şi organe, solicitate în acest sens . Se prezintă sub trei forme, toate întâlnite în ţesuturile epiteliale:1-desmozomi în pată; 2-desmozomi în bandă; 3-hemidesmozomi.

Desmozomii în pată (macula adherens) .Se mai numesc şi desmozomi în "spot", în "nit",

sau macula adherens (macula = pată, în limba latină). Sunt prezenţi mai ales în ţesuturile epitelialede acoperire. În alcătuirea lor intră următoarele componente: 1- plasmalemele adiacente, dispuseparalel, la o distanţă de 25-30 nm; 2-un material proteic, intercelular dens la fluxul de electroni, cuaspect filamentos, bisectat de o densificare centrală,bogată în glucide şi calciu; 3-densificăriintracelulare, în formă de disc, ataşate de plasmalele joncţionate; 4-dispozitive de legătură sau linkeri,reprezentaţi de microfilamente, ce se detaşează din materialul dens intercelular, străbatplasmalemele şi apoi discurile intracelulare, pentru a se ancora la microfilamentele citoscheletului;5-elemente citoscheletale, respectiv microfilamente de actină sau filamente intermediare decheratină, care se numesc tonfilamente.(Fig.3.14)

Fig.3.14Desmozom în pată-schemă1 -Plasmalemeleadiacente;2- Spaţiu şimaterialintercelular;

3-Discuriintracelulare;4-Linkeri;5-

Tonofilamente.

Desmozomii în bandă (zonula adherens) sau în panglică (zonula=panglică, în latină) suntprezenţi la polul apical al celulelor epiteliale şi la nivelul segmentelor transversale ale discurilor intercalare cardiace.

Prezintă o structură asemănătoare cu cea a desmozomilor în pată, cu următoarele deosebiri:-spaţiul intercelular, de 15-25 nm este mai sărac în material electronodens; -densificările intracelulare,de pe faţa internă a plasmalemelor joncţionate, nu au formă de disc, ci de bandă sau panglică.

(Fig.3.15)Hemidesmozomii (sau semidesmozomii) (hemidesmosoma) reprezintă o variantă a

desmozomilor în pată, prin care se leagă celulele epiteliale de membranele bazale. Prezintă numai

20



jumătate din structura desmozomului în pată, în sensul că, pe frotul citoplasmatic al plasmalemeiexistă un disc, care se leagă de membrana bazală prin filamente.

Fig.3.15. Schema desmozomilor în bandă (zonula adherens)A-Densificări intracelulare în bandă; b-Spaţiul intracelular.

3.4.2.Joncţiunile impermeabile

Sunt dispuse în panglică, fapt pentru care se mai numesc zonula occludens ( sau joncţiuni strânse).

Se caracterizează prin obliterarea spaţiului intercelular, deoarece membranele adiacente se

apropie complet sau se sudează pentru a forma structuri pentalaminate sau heptalaminate. Larealizarea acestor joncţiuni participă proteine transmembranare, care se dispun în şiruri gemenepentru a construi dispozitive ce se conectează "în fermoar" pe feţele externe ale membranelor adiacente. Pe feţele interne , proteinele transmembranare sunt "ancorate" prin intermediul unor microfilamente la citoscheletul matricei.

21



Fig.3.16.Schema joncţiunilor impermeabileA-,B-Plasmalemele adiacente; C-Proteine transmembranare;D-Spaţiu intercelular; E-Enterocit; F-Citoscheletul matricei.

Aceste joncţiuni împiedică scurgerea fluidelor printre celule, inclusiv a micromoleculelor, caresunt obligate să treacă prin celulă. Sunt întâlnite la porţiunile apicale ale celulelor care delimiteazălumenul intestinului. Astfel, glucoza este pompată activ din lumenul intestinal în celulă prin suprafaţapolului apical, după care trece în sânge prin difuziune facilitată mediată de transportorii situaţi înzonele bazo-laterale ale plasmalemei, pe care o polarizează funcţional într-un domeniuapical şi altullatero-bazal.Totodată, joncţiunile strânse împiedică Retrodifuziunea glucozei din spaţiul intercelular înlumenul intestinului.(Fig.3.16).

Joncţiunile strânse au aspecte diferite, în funcţie de ţesutul epitelial în care sunt prezente.Astfel, joncţiunile strânse de la polul apical al celulelor din tubul contort proximal al nefronului au orezistenţă relativ scăzută, fiind formate numai din unul sau două şiruri de proteine transmembranare.La nivelul celulelor epiteliale din mucoasa vezicii urinare, joncţiunile strânse conţin şase sau maimulte şiruri de proteine transmembranare, încât se realizează o joncţiune puternică, extrem de greu

de traversat. La nivelul barierei hematoencefalice, joncţiunile strânse existente între celuleleendoteliale ale vaselor din encefal realizează o protecţie eficientă pentru ţesutul nervos, permiţând însă trecerea glucozei (principala sursă de energie) din sânge în creier şi trecerea, în sens invers abioxidului de carbon, rezultat din respiraţia celulelor nervoase.

Joncţiunile celulare strânse se caracterizează prin: -flexibilitate şi siguranţă; - formarea unor bariere chimice şi fizice intercelulare; - conferirea unei polarităţi a celulelor angajate în joncţiuni;-apariţia de timpuriu, între celulele embrionare, iniţial sub formă de macule, care se extind treptat,luând formă de zonule.

Joncţiunile focale reprezintă o variantă a joncţiunilor strânse, în care membrana celulei seapropie de substratul de adezivitate până la 10-15 nm. Pe faţa extracelulară a membranei suntprezente filamente glicoproteice de fibronectină, iar pe faţa intracelulară se aglomerează fascicule demicrofilamente de actină şi vinculină, care se leagă de plasmalemă prin intermediul unor densificăriadiacente membranei. Între filamentele de fibronectină şi microfilamentele de actină şi vinculină serealizează dispozitive transmembranare de legătură (de 8-20 nm), denumite fibronexuri .

22



3.4.3.Joncţiunile de comunicarePermit trecerea unor molecule mici dintr-o celulă în alta şi sunt de de două tipuri: joncţiunile

permeabile şi sinapsele.Joncţiunile permeabile, de tip gap, nexus sau macula comunicans sunt realizate prin

structuri proteice, denumite conexoni, ce străbat plasmalema, proeminând de o parte şi de alta abistraturilor lipidice ale membranelor adiacente. Sunt răspândite în diferite tipuri de ţesuturi,

reprezentând principala cale de comunicare intercelulară. Permit schimburi rapide de molecule,făcând posibilă o cooperare metabolică eficientă.Spaţiul intercelular (spatium intercellulare) estefoarte îngust (2-4nm). În momentul realizării joncţiunii permeabile, conexonii din cele douăplasmaleme se aşează cap la cap, formând canale directe de comunicare între citoplasmele celor două celule, fără deschideri în spaţiul intercelular.(fig.3.18).

Fig.3.17Schema joncţiuniipermeabile (gap)1-Plasmalemeleadiacente;2-Spaţiu intercelular;3-Conexoni;4-Canale intercelulare.

Fig.3.18.Diagrama schimburilor moleculare prin joncţiunile gap.

Un conexon are o formă de prismăhexagonală cu diametrul de 7-8 nmşi este alcătuit din 6 subunităţiproteice (oligomeri). Subunităţile

delimitează un canal hidrofil cudiametrul reglabil. Ionii de calciuintracelular (Ca2+) modifică diametrulcanalului, controlând astfelcomunicarea intercelulară.Canalul hidrofil al joncţiunii gappermite trecerea dintr-o celulă în altaa ionilor şi a unor molecule cu

greutate sub 1.000-1500 daltoni, precum: glucide, aminoacizi, nucleotide, hormoni, vitamine,etc. Nupot să treacă macromoleculele (proteine, acizi nucleici, etc.), dar sunt de 10.000 ori mai permeabilepentru ionii metalici decât restul suprafeţei membranei.

În culturile de celule, joncţiunile de tip gap se organizează foarte rapid, din proteineleexistente în plasmalemă, care se grupează în conexoni. Ele permit schimbul unor molecule de mărimimedii, ca nucleotizii.

23



Joncţiunile gap sunt necesare mai ale în situaţiile în care celulele trebuie să acţionezesimultan, în grup, cum este cazul celulelor embrionare, pe cale de diferenţiere sau între celulelemusculare (cardiace şi netede), nervoase şi endocrine.

3.4.4.Complexele joncţionaleCuprind joncţiuni strânse spre frontul luminal şi desmozomi spre frontul latero-bazal. Sunt

întâlnite, mai ales, între celulele din epiteliile intestinale şi renale. În complexele joncţionale suntprezente toate tipurile de legături intercelulare necesare pentru îndeplinirea funcţiilor specificeţesuturilor respective.(fig.3.19)

Fig.3.19. Complexe joncţionale în epiteliulintestinului subţire.A-Micvrovili;B-Joncţiuniimpermeabile; C-Desmozomi înbandă; D-Desmozomi în pată;E-Filamente din citoschelet;F-Joncţiuni permeabile;G-Hemidesmozomi;H-Mebrana bazală.

24



3.5. Receptorii din membrane

Receptorii din membrane sunt dispozitive moleculare proteice intramembranare, cu ajutorulcărora se interceptează semnalele, ce sosesc pe cale nervoasă sau umorală.

Receptorii din membrane

Denumire

Liganzi= mesageri extracelulari(de ordinul I)

Receptoripentru:

Mediatori chimici locali Mediatori chimici locali

Hormoni hidrofili (insulina,glucagonul,etc)Hormoni

Hormoni hidrofobi (Hormoni steroizi sexuali)A. Receptoripentru

substanţeendogene Neurotransmitători

Acetil colinaAdrenalina

NoradrenalinaDopamina, serotoninaGABA= Acidul gama aminobutiricAcidul aspartic

Subst. imunogeneAntigene endogeneAnticorpiComponentele complementului

B. Receptoripentrusubstanţeexogene

VirusuriAntigene non self Toxine microbieneLectine, etc

AdenovirusuriMixovirusuriAntigene nonslef Toxine microbieneLectine,etc

Toate substanţele care se leagă de receptori şi modulează (modifică) funcţia celulară senumesc liganzi . Liganzii sunt substanţe, produse de celule specializate, care acţionează în modspecific asupra unui grup de celule "ţintă", producând-le modificări ale activităţii . Ei sunt denumiţi şimesageri extracelulari sau mesageri de ordinul I, cei mai cunoscuţi fiind hormonii şineurotransmiţătorii.

Liganzii acţionează în cantitate foarte mică (10 -8 M), iar receptorii îi leagă cu o constantă deafinitate mare (K=10 8 litri/mol).

Există două mari categorii de receptori în membrane: receptori pentru substanţe endogene şireceptori pentru substanţe exogene.

3.5.1. Receptorii pentru substanţe endogene

Se cunosc mai multe categorii de molecule semnal (de liganzi) de natură endogenă (produsede organism): 1-mediatori chimici locali; 2-hormoni; 3-neurotransmiţători; 4-substanţe imunogene.Mediatorii chimici locali sunt secretaţi de unele tipuri de celule şi acţionează numai asupra

celulelor din imediata lor vecinătate. Ei sunt rapid captaţi şi distruşi.(Fig.3.20).Hormonii sunt substanţe endogene produse de celulele glandelor endocrine. Pe cale

sanguină, ajung la celulele ţintă din diferite organe, acţionând la distanţe mari de locul de producere.Neurotransmiţătorii sunt substanţe endogene produse de neuroni şi eliberate la nivelul

sinapselor chimice. Ei acţionează numai asupra neuronilor agajaţi în sinapsă.Hormonii şi neurotransmiţătorii sunt consideraţi mesageri de ordinul I. Hormonii au o compoziţiechimică variată, putând fi substanţe steroide (hormonii sexuali) sau polipeptide ( ca de expl. hormoniipancreatici şi tiroidieni). Hormonii steroizi pătrund în celulă, traversând bistratul lipidic, pe când ceipolipeptidici se cuplează cu receptorii specifici din membrană, acţionând de la acest nivel.

Substanţele imunogene sunt reprezentate de : -antigene endogene; - anticorpi; -

componentele complementului.Receptorii pentru neurotransmiţători sunt situaţi în membrana postsinaptică a celulelor nervoase, în membrana celulelor musculare sau a altor celule efectoare. Ei recepţionează

25



acetilcolina, noradrenalina, dopamina, serotonina, adrenalina, histamina, acidul gama-aminobutiric,acidul aspartic, encefalina,etc.

Fig.3.20. Molecule semnalendogene.

Receptorii pentru hormoni au o localizarediferită în celulă, în funcţie de tipulhormonului, hidrofil sau hidrofob.Hormonii hidrofili (insulina, glucagonul,adrenalina, hormonii hipofizari,parathormonul,etc.) se ataşează de receptoriidin membrana periferică, transmiţând celuleiinformaţia necesară pentru a-şi modulaactivitatea. Dintre receptorii hidrofili, cei maibine studiaţi sunt receptorii pentru insulină din

membrana hepatocitelor şi adipocitelor.Ei au o masă moleculară de 300.000 daltoni,iar în membrana unei celule există circa10.000 receptori pentru insulină.Hormonii hidrofobi (steroizi şi tiroidieni)

traversează membrana celulei ţintă şi se leagăde receptorii membranelor intracelulare.

Receptorii pentru substanţele imunogenesunt de trei feluri: 1-pentru antigeneendogene; 2- pentru anticorpi; 3- pentrucomplement.

Receptorii pentru antigene endogene suntmai numeroşi pe membrana limfocitelor T,

sunt codificaţi genetic şi au capacitatea sărecunoască structurile moleculare "self"(proprii organismului respectiv).Ei pot fiprezenţi şi în membrana unor celuleneimunogene (expl. în membranaenterocitelor.)

Receptorii pentru anticorpi sunt receptoriFc, pentru fracţiunea cristalizabilă a imunoglobulinei G. Ei sunt prezenţi în membrana celulelor dinsistemul fagocitelor mononucleare. În membrana bazofilelor şi mastocitelor se găsesc receptoripentru imunoglobulina E.

Receptorii pentru complement leagă cea de a treia componentă a complementului desuprafaţa celulei, fiind caracteristici celulelor din sistemul fagocitelor mononucleare.

3.5.2.Receptorii pentru substanţe exogene Sunt receptori pentru:- virusuri, capabili să recunoască adenovirusuri, mixovirusuri,etc.;- antigene nonself (străine de organism); sunt prezenţi pe suprafaţa limfocitelor B şi au o

structură moleculară asemănătoare imunoglobulinelor.Aceşti receptori determină transformareablastică a limfocitelor B, după contactul cu antigenul.

- toxine microbiene. Sunt prezenţi în membrana celulelor imunocompetente.- lectine. Lectinele sunt substanţe proteice sau glicoproteice, extrase din ţesuturi vegetale sau

animale, capabile să formeze punţi între glicoproteinele membranare.

3.5.3.Mecanismul de acţiune al receptorilor .

26



Receptorii din membranele de suprafaţă sunt activaţi în majoritatea cazurilor de moleculesemnal (liganzi) hidrofile.

Moleculele semnal hidrofile nu pot străbate membrana celulară decât după ce se leagă dereceptorii specifici. Sub influenţa diferiţilor liganzi se produc modificări metabolice în celulele ţintă.Ataşarea liganzilor de receptori se realizează prin legături hidrofobe şi legături de hidrogen ( ca deexemplu legarea insulinei de receptori ). Legăturile sunt labile şi strict dependente de concentraţia

liganzilor din mediul extracelular.Efectele acţiunii complexului ligand-receptor asupra celulelor constau în: modificăristructurale ale membranei celulare şi modificări funcţionale ale membranelor.

Modificările structurale ale membranei celulare se manifestă prin redistribuirea receptorilor,răspândiţi la întâmplare înainte de interacţiunea ligand receptor. După contactul ligand-receptor,receptorii se grupează la suprafaţa membranei în zone delimitate sau "plaje".(Fig.3.21)

Acest lucru se poate realiza datorită fluidităţii bistratului lipidic, încât mai multe molecule deligand pot acţiona asupra mai multor receptori învecinaţi. Astfel în limfocitele B, lectinele pot induceformarea unor agregate receptor-ligand de dimensiuni mari, denumite cupole, unde se declanşeazăun proces de endocitoză.

Fig.

3.21.

Redistribuirea receptorilor din membrana celulară

Modificările funcţionale ale membranelor constau în:1- Modificări de permeabilitate a membranei, caracteristice pentru liganzi de tipul

neurotransmiţătorilor. În acest sens, acetilcolina se leagă de receptorii din membranele postsinapticeale fibrelor musculare, determinând creşterea permeabilităţii membranei pentru ionii din mediulextracelular.

2- Inducerea de endocitoză, care se produce când ligandul este o substanţă endogenă,vehiculată pe cale umorală.

3- Pătrunderea din mediul extracelular a unor ioni cu funcţie de mesageri de ordinul II. Astfel,ionii de calciu pătrund în celulă după ce neurotransmiţătorii se leagă de receptorii din membranelepost sinaptice ale joncţiunii neuromusculare.

4- Activarea unor enzime din membrana celulară. Se produce când liganzii sunt hormonihidrofili. Asfel se activează adenilat ciclaza ce va cataliza sinteza, pe faţa internă a membranei, aadenozin 3' - 5' monofosfatului ciclic (AMP-c) sau va determina fosforilarea proteinelor celulare.Activarea adenilat ciclazei se realizează cu ajutorul unor proteine reglatoare.(Fig.3.22)

După activarea adenilat ciclazei, în citosol creşte cantitatea de AMP-c (considerat mesager de ordinul II) , amplificându-se semnalul hormonal. Totodată se activează şi o proteinkinază carecontrolează fosforilarea mai multor molecule proteice, stimulând procesele metabolice din celulă.Sinteza de AMP-c poate fi blocată de unele prostaglandine care acţionează prin inhibarea acţiuniiadenilat ciclazei.

În unele maladii este implicată, în mod direct disfuncţia receptorilor din membrană. Astfel, în"miasthenia gravis" este inactivat receptorul pentru acetilcolină de la nivelul plăcii neuromusculare, iar în hipercolesterolemia genetică sunt absenţi sau nefuncţionali receptorii pentru colesterol.

27



Fig.3.22. Activarea unor enzime din membrana celulară

Există afecţiuni ale receptorilor care constau în blocarea funcţiei autoimune prin autoanticorpiantireceptori.

Asfel, autoanticorpii pentru receptorii de insulină pot acţiona ca insulinomimetici (activând receptorii) sau ca blocanţi ai acestora (în diabetul insulinorezistent). Autoanticorpii care stimuleazăreceptorii dopaminei pot constitui cauze ale scizofreniei, iar imunoautoanticorpii beta adrenergici sunt implicaţi în afecţiunile asmatice. În procesul de îmbătrânire şi în unele boli neuropsihice (la om) s-aobservat o modificare a densităţii receptorilor.

3.6.Schimburile prin membrană

Prin membrana celulară se efectuează schimbul de substanţe, fie prin traversarea diferitelor structuri ale acesteia, sau pe calea transportului în masă, cu ajutorul veziculelor, furnizate demembrana celulară.

Bistratul lipidic funcţionează ca o barieră de difuziune pentru apă şi alte molecule hidrofile, în

timp ce moleculele liposolubile, oxigenul şi bioxidul de carbon îl trec cu uşurinţă.3.6.1.Transportul transmembranar Realizează schimburile de molecule mici şi ioni (de unde şi denumirea de microtransport)

între celulă şi mediul extracelular. Îndeplineşte următoarele funcţii:► Preia din mediul extracelular o serie de combustibili metabolici necesari menţinerii vieţii

celulei şi activităţilor ei metabolice;►Elimină în mediul extracelular compuşi fiziologici necesari organismului (substanţe

secretate), precum şi substanţe toxice toxice , rezultate din activitatea celulei;►Reglează volumul celulelor;►Asigură menţinerea ph-ului intracelular şi compoziţia ionică la valori cât mai favorabile

desfăşurarii activităţii metabolice celularte;►Produce diferenţe de concentraţii (gradiente ionice), care permit desfăşurarea unor

activităţi biologice complexe, cum sânt excitabilitatea nervului şi a muşchiului.

► Preia din mediul extracelular o serie de combustibili metabolici necesari menţinerii vieţiicelulei şi activităţilor ei metabolice;

►Elimină în mediul extracelular compuşi fiziologici necesari organismului (substanţesecretate), precum şi substanţe toxice toxice , rezultate din activitatea celulei;

►Reglează volumul celulelor;►Asigură menţinerea ph-ului intracelular şi compoziţia ionică la valori cât mai favorabile

desfăşurarii activităţii metabolice celularte;►Produce diferenţe de concentraţii (gradiente ionice), care permit desfăşurarea unor

activităţi biologice complexe, cum sânt excitabilitatea nervului şi a muşchiului.

Transportul prin membrane

28



Denumire Modalităţi Mecanisme

A.Transport pasiv Difuziune simplă

PoriCanale moleculare transmembranare

Difuziune facilitată Cărăuşi proteici moleculariTransport prin pompe ionice Pompa de Na+- K+

Pompa de Ca 2+

B. Transport activ Transport cuplat Pompare molecularăTranslocare de grup

EndocitozaFagocitozaPinocitoza fără receptoriPinocitoza mediată de receptori

C. Transportul înmasă

Exocitoza

TranscitozaTranscitoza distributivăTranscitoza conectivă

În funcţie de mecanismele care intervin în mişcarea moleculelor prin membrana celulară sedeosebesc două forme de transport : a-transportul activ şi b- transportul pasiv. (Fig.3.23).

3.6.11.Transportul pasiv Realizează trecerea moleculelor mici în sensul gradientului de concentraţie, iar a ionilor în

sensul gradientului electrochimic. Se face fără consum de energie, fiind independent demetabolismul celular.

Există două modalităţi de realizare a transportului pasiv prin: difuziune simplă şi prindifuziune facilitată.

Transportul pasiv prin difuziune simplă. Se face lent, întrucât restructurarea permanentă amembranelor biologice este o dificultate pentru difuziune.Este supus legilor difuziunii şi osmozei, fiinddependent numai de forţe fizice.

Fig.3.23.Transportul transmembranar.

1-Bistrat lipidic;2-Proteine transmembranare;3-Molecule transportate;4-Difuziune simplă;5-Difuziune facilitată; 6-Transport activ;7-Sensul gradientului electrochimic.

Moleculele mici liposolubile difuzează prin bistratul lipidic, iar cele hidrosolubile trec prinorificii mici canale sau pori hidrofili situati în bistrat, delimitaţi de proteine transmembranare. Canaleletransmemebranare au un diametru de 1 nm, fiind specializate şi selective. Vasopresina stimuleazătransportul prin canale şi pori mărindu-le diametrul până la 2-3 nm. (Fig.3.24)

29



Fig.3.24. Transportul prin

canale şi pori.1-Por; 2-Bistrat lipidic; 3-Proteine

transmembranare; 4-Ion.Transportul prin difuziune faciliată.

Este mult mai rapid (decca.100.000 ori) decât cel prindifuziune simplă, permiţând trecereaprin membrană a unor substanţe greusolubile în lipide şi cu o masămoleculară relativ mare.

Se întâlneşte frecvent la hepatocite,unde, în acest mod, se transportăglucoza,aminoacizi,etc.(Fig.3.25.)

Fig.3.25.Tranportori detip canal şi cărăuş.1-Bistrat lipidic; 2-Canal; 3- Cărăuş

sau tranportor mobil.Se realizează cu ajutorulunor molecule proteice dincompoziţia membranei cu rol decărăuşi.

Astfel, pe membranahepatocitului există 800.000 decărăuşi, iar fiecare cărăuştransportă 100 molecule deglucoză pe secundă.

Transportul prin difuziune facilitată se efectuează în sensul gradientului de concentraţie şiduce la echilibrarea concentraţiilor pe ambele feţe ale membranei, însă viteza de transport estedirect proporţională cu concentraţia lor. În raport cu numărul speciilor transportate există transport

uniport, simport şi antiport. (Fig.3.26.)

Fig.3.26. Tipuri detransport, în funcţie de sens şinumărul speciilor transportate1-Bistrat lipidic; 2-Proteină transportor;3-Molecule transportate; 4-Uniport: 5-Sinport;6-Antiport.

3.6.1.2.Transportul activ

Se realizează împotriva gradientelor de concentraţie sau a gradientelor electrochimice,producând o creştere a concentraţiei pe o faţă a membranei. Solicită cheltuială de energie, care estefurnizată de metabolismul celular, fiind metabolic dependent. Unele celule înalt diferenţiate (fibremusculare, neuroni) îşi procură energia necesară transportului pe cale aerobă, prin producere deATP. Hematiile îşi produc moleculele de ATP necesare pentru transport prin glicoliză.

Există mai multe tipuri de transport activ, în funcţie de modul în care este folosită energia:1-Tranportul activ prin pompe ionice, în care proteinele ce efectuiază transportul folosesc

direct energia din ATP, având proprietăţi ATP-azice ( de descompunere a ATP-ului).2-Trasportul cuplat (sau cotransportul), în care se foloseşte energia gradientelor ionice,

substanţele de transportat (glucide, aminoacizi) fiind cuplate cu unii ioni (Na+).

3-Translocarea de grup, întâlnită la unele bacterii, care folosesc ca sursă de energiefosfoenolpiruvatul.

Transportul prin pompe ionice.

30



Pompele ionice sunt protein-enzime din compoziţia plasmalemei care transportă ionii într-odirecţie termodinamică nefavorabilă, împotriva gradientului electrochimic sau de concentraţie.

În organism se cunosc pompe transportoare pentru ioni sau cationi,existând pompe pentru unsingur ion (Ca2+sau Mg2+) sau pentru doi ioni (pompa de Na+şi K+).

Pompa de Na+ - K + este ce a mai bine cunoscută.(Fig.3.27)

Fig.3.27.Organizareamoleculară apompei ionice deNa+ - K+

1-

Plasmalema;α,ß-Proteinetransmembranare

În condiţiinormale, ionul de

potasiu (K+) se găseşte într-o concentraţie mai mare (de cca. 15 ori)intracelular, în timp ce ionul desodiu (Na+) are o concentraţie mai mare extracelular. Gradientele ionice (diferenţele de concentraţii)sunt menţinute printr-un sistem special de transport, denumit pompa de Na+-K+.

Pompa de Na+-K+ a fost studiată pe membranele hematiilor, unde s-a constatat o deplasareconcomitentă a Na+ extracelular (spre o concentraţie mai mare), iar a K+ intracelular (tot spre oconcentraţie mai mare), contrar gradientelor de concentraţie. Energia necesară acestui transport se

obţine prin hidroliza ATP-ului, care este realizată de către o enzimă din plasmalemă, denumită Na+

-K+-ATP-ază, deoarece acţionează numai în prezenţa ionilor de Na+,K+ şi a unei concentraţiifavorabile de Mg2+. Această enzimă este o glicoproteină mare, un tetramer cu o greutate molecularăde 270.000 daltoni .

Fig.3.28.Transportul cuplat prin pompare moleculară.

31



Pompa de Ca2+ sau Ca2+-ATP-aza asigură transportul ionilor de Ca2+ prin sistemul demembrane ale reticulului endoplasmic din fibrele musculare.

Există şi pompe pentru anioni, precum pompa de clor (Cl-) din celulele parietale ale glandelor gastrice sau pompa de iod (I-) din tiroidă.

Transportul cuplat (sau mecanismul de pompare moleculară) utilizează, pentru transportulunor molecule (glucoză, aminoacizi), energia care rezultă din mişcarea Na+ împotiva gradientului de

concentraţie şi al gradientului electric. Această energie poate fi folosită pentru introducerea în celulă aunor substanţe nutritive. (Fig.3.28).Glucoza este pompată din mediul extracelular în celule (enterocite sau nefrocite) odată cu

ionii de Na + cu ajutorul unei unităţi proteice de transport. După pătrunderea în celulă, glucoza sedecuplează de ionii de Na+ , care sunt pompaţi în afara celulei printr-o Na+-K+-ATP-ază.

3.6.2. Transportul în masăEste procesul prin care celulele preiau din mediul extracelular particule de natură diferită, prin

formarea de vezicule pe seama membranei celulare. În funcţie de direcţia în care se deplaseazăveziculele deosebim trei tipuri de transport în masă: 1-exocitoza; 2-endocitoza; şi 3-transcitoza.

3.6.2.1. ExocitozaExocitoza este procesul prin care celulele îşi descarcă în mediul extracelular produsele

secretate sau alte materiale pemtru export. Produsele pentru export se colectează în vezicule

intracitoplasmatice (vesicula cytoplasmatica, care se deplasează dinspre complexul Golgi spremembrana celulară, fie în mod spontan, fie după stimularea celulei de către unii factori secretagogi(hormoni, neurotransmiţători, factori de eliberare). Deschiderea veziculelor şi eliminarea conţinutului în spaţiul extracelular se datoreşte contracţiei microfilamentelor, în prezenţa moleculelor de ATP , deAMP-c şia ionilor de Ca2+.În celulele exocrine, exocitoza este limitată la domeniul apical (luminal) alplasmalemei.

Fig.3.29.Transportul prin vezicule (în masă).A-Endocitoza; B-Exocitoza; C-Transcitoza.1-Plasmalema; 2-Fagozom; 3-Lizozom primar; 4-Lizozom secundar;5-Veziculede secreţie; 6-Vezicule de transport.

Exocitoza este prezentă şi la nivelul sinapselor, unde veziculele ce conţin mediatori chimici(acetilcolină, noradrenalină) fuzionează cu membrana presinaptică. Mediatorii sunt eliberaţi în spaţiulsinaptic, după care se leagă de receptorii specifici din membrana postsinaptică, producânddepolarizarea ei şi transmiterea influxului nervos.

3.6.2.2. EndocitozaEndocitoza este procesul prin care celulele preiau din mediul extracelular molecule mari ( cu

greutate moleculară mai mare de 10.000 daltoni), prin intermediul unor vezicule, care se formează dinmembrana celulară. În acest fel se poate realiza nutriţia celulei, purificarea mediului extracelular şiunele procese de apărare imunitară.

După natura materialului endocitat şi după modaliatea de ingestie se disting două tipuri deendocitoză: 1-fagocitoza (de la grecescul phagein = a mânca) sau endocitoza de molecule şi particulesolide,microorganisme (bacteriene sau virale), macromolecule alterate, detritus celular, celule întregi,

32



etc. neînsoţite de fluid; 2- pinocitoza ( de la grecescul pinein = a bea) sau endocitoza de fluid, ceconţine molecule sau particule.

3.6.2.2.1.Fagocitoza În condiţii normale şi patologice, pot participa la fagocitoză un mare număr de tipuri celulare,

denumite generic fagocite. În funcţie de mărimea particulelor pe care sunt capabile să le înglobeze,se disting microfage, care înglobează numai particule mici (exemplu neutrofilele) şi macrofage, care

înglobează particule mari, existând macrofage mobile ( monocitele circulante) sau macrofage fixe(histiocitele din ţesutul conjunctiv, celulele Kupffer din ficat, celulele capilarelor sinusoide din splină,unele celule din măduva osoasă hematogenă, din limfonoduri, din pulmon,etc.).

Fagocitele prezintă pe suprafaţa membranei regiuni specializate purtătoare de receptori, cuajutorul cărora recunosc ceea ce este "self" (macromoleculele proprii organismului) de ceea ce este""non self", adică macromoleculele străine de organism, denumite generic antigen. Dintremacromoleculele self, receptorii pentru fagocitoză rercunosc ceea ce este sănătos de ceea ce estealterat ( self alterat: celule degenerate, celule maligne, celule îmbătrânite, resturi tisulare). În unelesituaţii patologice, receptorii celulelor ce intervin în fagocitoză pierd capacitatea de a diferenţia self-ulde non-self , acţionând, asfel, împotriva proteinelor din organismul propriu şi determinând apariţiareacţiilor autoimune, care pot genera o serie de entităţi patologice.

Recunoaşterea antigenilor în organism este înlesnită de prezenţa în mediul extracelular aunor proteine, denumite opsonine. Opsoninele sunt proteine extracelulare care mediază şi facilitează

legătura între receptorii membranei fagocitelor şi antigenele ce vor fi fagocitate, formând complexeantigen-opsonine.Se cunosc mai multe tipuri de receptori ai complexelor antigen-opsonină, precum: - receptorii

Fc, care leagă de suprafaţa membranei antigenele opsonizate cu imunoglobuline G ( Ig G), după ceau recunoscut fracţiunea cristalizabilă (Fc) a imunoglobulinei G.; - receptorii C 3, care reconosc şifixează antigenii opsonizaţi cu cel de al treilea component al complementului.

În membrana fagocitelor, în afară de receptoriii pentru complexe opsonizate, s-au mai descrisreceptori nespecifici care recunosc şi fixează selful alterat, reprezentat de resturi celulare sau celulemaligne.

Fagocitoza se desfăşoara în patru etape:chemotaxia,opsonizarea, ingestia şi digestia.Chemotaxia este proprietatea unei celule mobile (în cazul de faţă a neutrofilelor) de a se

deplasa prin ţesuturi către particule ţintă, ca răspuns la diverşi stimulli după ce ţinta a fostrecunoscută. Semnalele chemotactice sunt reprezentate de: substanţe bacteriene (proteine, lipide),

proteine serice, componente ale complementului (15 proteine serice, care amplifică răspusul imun),produse ale limfocitelor (limfokine), factori eliberaţi de neutrofile.

Fig.3.30. Opsonizarea şi fagocitarea.

Opsonizarea constă în acoperirea bacteriilor sensibilizate de anticorpi pentru a fi fagocitate.Principalele opsonine sunt anticorpii, în special imunoglobuline (Ig1, Ig3) şi componente ale

33



complementului (C3, C5). Fracţiunea cristalizabilă (Fc) a imunoglobulinei G este recunoscută dereceptorii Fc de pe suprafaţa neutrofilelor. (Fig.3.30)

Ingestia microorganismelor are loc după ce acestea au fost opsonizate. Complexul antigen-opsonine este recunoscut de receptorii de la suprafaţa fagocitelor şi legat de membrana celulară,determinând activarea receptorilor. În urma activării receptorilor, actina din citoscheletulmembranei,se contractă, determinând emiterea de pseudopode. Pseudopodele înconjoară strâns

particula şi în acest fel se realizează interacţiuni receptor- particulă pe toată suprafaţa ei. Mecanismulde fixare a particulei de membrana psedupodelor este comparat cu închiderea unui fermoar.Extremităţile pseudopodelor înconjoară particula şi formează o veziculă, denumită fagozom.(Fig.3.30.)

În citoplasmă, fagozomul se uneşte cu un lizozom , formându-se un fagolizozom, în carehidrolazele acide vor acţiona asupra particulei străine, producând digestia acesteia. În cazulneutrofilellor, contopirea granulelor azurofile primare (a lizozomilor) cu fagozomul şi eliberareaconţinutului lor în fagolizozom (sau vezicula digestivă) se manifestă prin dispariţia granulelor dincitoplasmă,fenomen cunoscut ca degranularea neutrofilelor.

Fig.3.31.Mecanismele fagocitozei ;A-Mecanisme moleculare; Realizarea fagozomilor.

1-ImunoglobulinaG; 2-Receptor inactiv; 3-Receptor activat; 4-Proteinăcontractilă din citoschelet; 5-Pseudopode; 6-Fagozom

Digestia intracelulară a particulelor fagocitate are loc în lizozomi şi se produce prin: -sistemedependente de oxigen, mediate de enzime (mieloperoxidază, superoxidismutază); şi - prin sistemeindependente de oxigen ,ce presupun acţiunea lizozimului, a lactoferinei,etc..

3.6.2.2.2.Pinocitoza

34



Pinocitoza sau endocitoza particulelor în fază fluidă reprezintă procesul de transport în masăa unei cantităţi variabile de fluid tisular, împreună cu particulele pe care le conţine, prin intermediulunor vezicule (vezicula pinocitocica), denumite pinozomi.

Se întâlneşte la toate tipurile de celule, apărând ca o modaliatate împortantă prin carecelulele captează din lichidul intercelular substanţele necesare metabolismului lor.

Se deosebesc două forme de pinocitoză în funcţie de mecanismele care intervin în procesul

de preluare a sustanţelor: - pinocitoza fară receptori şi - pinocitoza mediată de receptori.Pinocitoza fără receptori este endocitoza cea mai frecvent întâlnită la acele celule dinorganism, care folosesc pentru transport suprafeţe mari nespecializate din membrana plasmatică..Preluarea substanţelor cu ajutorul veziculelor se face fără o legare prealabilă a lor de membranacelulară prin receptori.

Pinocitoza se desfăşoară în mai multe etape:1-Contactul particulelor din fluidul tisular produce activarea unor puncte de pe suprafaţa

celulei , denumite situsuri anionice. Acest proces induce agregarea microfilamentelor din citoscheletulmembranei, producând creşterea flexibilităţii membranei celulare.

2-Membrana celulară se invaginează formând cripte sau canale intracelulare (invaginatiocellularis), în care intră lichid extracelular, împreună cu particulele prezente în el.

3-Membranele din vecinătatea extremităţii profunde a canalului se alipesc,fuzionează şi apar pinozomii (vesicula pinocytotica), vezicule ce se desprind de canal şi sunt antrenate de curenţii

intracitoplasmatic.4-Pinozomii fuzionează cu lizozomii, formând pinolizozomii , în care enzimele lizozomaleproduc digestia materialelor preluate din exteriorul celulei.

În funcţie de mărimea particulelor înglobate prin pinocitoză se distinge o micropinocitoză şi o-macropinocitoză. Macropinocitoza este modalitatea de transport a unor particule mari vizibile la microscopuloptic. Poate fi studiată prin injectarea “in vivo” de coloranţi vitali, care se fixează de proteinele serice.Complexele formate din proteine serice şi coloranţii vitali coloidali sunt introduse în citoplasmă împreună cu mici cantităţi de lichid extracelular, fiind utilizate ca indicator de recunoaştere acelulelor care manifestă proprietate de pinocitoză la nivelul organelor şi ţesuturilor.

Micropinocitoza reprezintă modalitatea de transport a moleculelor mici cu ajutorulveziculelor , vizibile numai la microscopul electronic.

Urmărindu-se soarta veziculelor pinocitate, s-a observat că acestea pot: 1- rămâne în

citoplasmă, unde fuzionează cu lizozomii, în care sunt digerate, iar după ce şi-au descărcatconţinutul, membranele lizozomale sunt reintegrate în membrana celulară; 2- traversa citoplasma fărăa fuziona cu lizozomii, descărcându-şi conţinutul pe cealaltă faţă a citoplasmei.

Pinocitoza mediată de receptori.Se mai numeşte şi pinocitoză absorbtivă, selectivă sau concentrativă. Este modalitatea de

preluare din mediul extracelular a unor materiale diferite, prin folosirea unor zone specializate alemembranei celulare, prevăzute cu receptori.

Receptorii recunosc şi leagă de membrană particule diferite. Fiind mobili receptorii segrupează la nivelul unor zone specializate ale membranei celulare, care se invaginează formândcaveolele (vesicula superficialis s. caveola) acoperite, deoarece sunt acoperite pe versantulcitoplasmatic de o reţea de microfilamente, formate dintr-o proteină, denumită clatrină. Reţeua declatrină stabilizează poziţia receptorilor şi menţin caveolele în comunicare cu mediul extracelular.(Fig.3.32.)

Caveolele acoperite care fixează complexele particulă-receptor (sau ligand-receptor) sunt înglobate rapid împreună cu o cantitate mică de fluid extracelular sub formă de vezicule care pot să-şipăstreze mantaua de clatrină pe faţa lor externă (vezicule acoperite) sau microfilamentele de clatrinăse desprind la nivelul membranei, în acest caz apărând vezicule netede sau receptozomi.

Particulele înglobate prin pinocitoza mediată de receptori pot fi degradate în lizozomi sau înunele cazuri, receptozomii traversează citoplasma fără să interacţioneze cu lizozomii, fiind eliminatepe cealaltă faţă a celulelor.

35



Fig.3.32. Pinocitoza mediată de receptori.1-Plasmalema; 2-Receptori mobili;3-Ligand; 4-Complex ligand receptor;

5-Caveolă acoperită cu clatrină; 6-receptozom ; 7-Nucleu; 8-Complex Golgi;9-Lizozom.

Spre deosebire de pinocitoza fără receptori, în care concentraţia substanţelor în veziculeleendocitate este aceeaşi ca în lichidul extracelular, în veziculele acoperite , ce apar în pinocitoza

mediată de receptori, concentraţia substanlţelor este mult mai mare decât în lichidul extracelular,datorită capacităţii receptorilor de a lega selectiv un număr mare de particule.

Implicaţii patologice. Pinocitoza mediată de receptori este o modalitate folosită pentru preluarea dinlichidul extracelular şi din sânge a colesterolului, o lipoproteină cu densitate mică. În situaţii normale,celulele prevăzute cu receptori pentru proteine cu densitate mică preiau colesterolul din mediulextracelular. Lipsa acestor receptori, întâlnită în unele deficienţe genetice, face imposibilă preluareamoleculelor de colesterol din sânge, determinând o creştere a concentraţiei acestuia(hipercolesterolemie) şi apariţia de plăci aterosclerotice în peretele vascular.

36



Fig.3.33. Schematizarea modalităţilor de transport prin celula endotelială. (după SIMIONESCU-1981)

3.6.2.3.Transcitoza

Transcitoza sau citopemsis reprezintă o formă aparte a transportului prin vezicule, prin care serealizează transportul macromoleculelor prin celule endoteliului capilar. A fost studiată de Palade(1953), care a observat, cu ajutorul microscopului electronic, vezicule ce traversează celuleleendoteliale, realizând schimburi între plasmă şi lichidul interstiţial.(Fig.3.33)

Transportul veziculelor pinocitate se poate realiza prin două modalităţi: 1-transcitozadistributivă, în care trecerea se face sub forma unor şiruri de vezicule intracitoplasmatice, ce se întindde la faţa luminală la faţa bazală, fără a ajunge în contact cu lizozomii; şi 2-transcitoza conectivă, încare transportul se face prin canale ce se formează fie prin fiziunea veziculelor, fie prin invaginareaplasmalemelor.

4. NUCLEULNucleul (lat. nucleus şi gr. karion = sâmbure) (nucleus) este o componentă esenţială

caracteristică celulelor eucariote. Îndeplineşte ca funcţii principale: -stocarea informaţiei genetice înADN-ul nuclear , reglarea şi controlul tuturor activităţilor celulare. În organismele animale, există şicelule anucleate (hematiile, trombocitele), care sunt incapabile să sintetizeze proteine, activităţiile lor metabolice fiind foarte restrânse.

Componentele nucleului

Denumire Componente Formaţiuni ultrastructuraleMembrana nuclearăexternă

A. Membrananucleară

( învelişulnuclear)

Cisterna perinucleară Complexul por:Anulus externAnulus internGranulă centrală8 granule proteice periferice8 conuri de proteine fibrilare

Membrana nuclearăinternă

B. NucleoplasmaScheletul nuclear Matricea fibrilară (granule şi matrixin )

Lamina densă internăComplexul lamina por Componenta fibrilară a nucleolului

Fracţiune labilăCromatina Eucromatina

HeterocromatinaC. Nucleolul Componenta

filamentarăFilamente de 5 nm grosime/30-40 nm lungime

37



Componenta granulară Precursori ribozomialiComponenta amorfă

Cromozomială Cromatina perinucleolarăCromatina intranucleolară

Nucleul a fost descoperit de FONTANA, în 1831, care a observat o formaţiune ovoidă încelulele epidermice. Ulterior, BROWN (1833) a fost primul care a enunţat conceptul de celulănucleată, ca unitate structurală, care intră în alcătuirea plantelor, concept ce a fost extins şi laalcăturiea corpului animalelor.

În alcătuirea nucleului intră: nucleolema sau membrana nucleară, nucleoplasma (matriceasau sucul nuclear), nucleolii şi cromatina sau cromozomii.

Nucleul reprezintă centrul de comandă, control şi de coordonare a celulei eucariote,funcţionând ca un computer chimic prevăzut cu un program (ADN-ul) şi o memorie (ARN-ul). Încalitate de centru informaţional al celulei, nucleul coordonează toate reacţiile chimice legate dedesfăşurarea proceselor vitale, contrlând atât sinteza proteinelor enzime din celulă, cât şi sinteza proteinelor de structură. (Fig.4.1.)

Fig.4.1. Rolul nucleului în circulaţia informaţiei genetice în celula eucariotă.

Nucleul conţine genomul (totalitatea genelor) celulei, format dintr-un număr precis de gene. Ogenă este o secvenţă de nucleotide (500-1500), care determină o secvenţă de aminoacizi, împreunăcu elementele de control (un promotor, o secvenţă lider şi un terminator. La animalele domestice,gena ocupă un loc specific în molecula de ADN care întră în compoziţia cromozomului.

Într-o celulă umană, lungimea totală a moleculelor de ADN este de cca. 1,6 m conţinând un potenţial informaţional imens, estimat la aproximativ 9 X 10 11 biţi, ce corespunde informaţiilor cuprinseîntr-o bibliotecă cu 180.000 volume (considerându-se că un cuvânt este evaluat în medie la 36 biţi,iar în fiecare volum se găsesc 150.000 cuvinte).

Totodată nucleul conţine echipamentul enzimatic necesar pentru: repararea genomului,replicarea sa, transcrierea mesajului în ARN şi prelucrarea ARN-ului ( în ARN mesager, ARN detransfer şi ARN ribozomal.

38



Fig.4.2. Forme de nuclei1-Veziculos (în neuron); 2-Multilobat (neutrofil); 3,11-Bilobat (eozinofil, pseudoeozinofil de

pasăre); 4-Aplatizat (adipocit); 5-Reniform (monocit); 6-Ovoidal (eritrocit); 7-Discoidal (celulacaliciformă); 8-Alungit (leiocit); 9,10-Sferoidal sau ovoidal (limfocit)

4.1. Caracterele morfologice ale nucleului

Răspândire. Majorittea celulelor organismului prezintă nucleu. Există şi excepţii(hematiile,celulele cristaliniene, trombocitele), care reprezintă stadii finale, în evoluţia unui tip celular,cu existenţă limitată în timp, stadii specializate la funcţii pasive. Celulele fără nucleu nu pot creşte şinu se mai divid.

Forma nucleilor este foarte variată,indicând, de regulă, pe cea a celulei. Nucleul apare: -sferic-ovoidal (nucleus sphericus- ovoideus), în celulele izodiametrice (sferice,cubice,poliedrice);-alungit (bacilliformis,fusiformis), în celulele fusiforme (musculare) sau columnare (prismatice); -turtit,aplatizat (planus) în celulele pavimentoase (endoteliale),în adipocite, în celulele caliciforme;lobat (segmentalis s. moniliformis)), în celulele care trebuie să se modeleze rapid.(Fig.4.2.)

39



Forma nucleului este influenţată de activitatea celulei. Devine neregulată în celulele foarteactive. În acest mod se produce o creştere a suprafeţei prin care se realizează schimburile dintrenucleu şi citoplasmă. Totodată nucleul prezintă o oarecare plasticitate (deformabilitate) care îi permiteca, în anumite condiţii spaţiale intracelulare, să îşi modifice forma. Asfel, în monocite nucleul aparereniform (nucleus reniformis), deşi celula este sferică, deformarea datorându-se prezenţei centriolului.

Poziţia. În cele mai multe cazuri, nucleul ocupă o poziţie centrală, strategică pentru rolul decoordonator al activităţii celulare. Totodată există numeroase excepţii, în care nucleul ocupă o poziţie:excentrică, în adipocite (celule care acumulează grăsimi în citoplasmă); medio-bazală, în celulelesecretoare din pancreas sau parotidă; bazală, în secretoare de mucus, în celulele caliciforme. Îngeneral în celulele secretoare.(Fig.4.3.)

Număr. Ca regulă generală, o celulă prezintă un nucleu. Excepţiile sunt însă numeroase.

Fig.4.3. Poziţia nucleului în diferite celule.1-Centrală; 2-Periferică; 3-Mediobazală; 4,5-Bazală.

Astfel, hepatocitele sunt binucleate în proporţie de 7-8%, osteoclastele au 30-40 nuclei, iar fibra musculară striată (rabdocitul) prezintă între 20-40 nuclei pentru fiecare centimetru.

În condiţii patologice, mai mulţi nuclei apar în:- celulele gigante Langhans (prezente întuberculoză, au câţva zeci de nuclei, dispuşi la periferia celulei, în coroană sau potcoavă); -celulelegigante de corp străin, care apar în cazul pătrunderii în organism a unor particule străine,nedigerabile de către celule; - celulele tumorale.

Multinuclearitatea se produce în două moduri: 1- prin multiplicare nucleară repetată(cariokineză), fără diviziunea citoplasmei (citodiereză),rezultând un plasmodiu ; 2-prin fuzionarea maimultor celule mononucleate, rezultând un sinciţiu (cum este cazul osteoclastelor,rabdocitelor,celulelor Langhans,etc.)

Fig.4.4. Variaţia dimensiunilor nucleului în funcţie de gradul de poliploidie

Dimensiunile nucleului. Variază în limite mai strânse (între 5-15µ) decât dimensiunile celulelor,diversitatea dimensiunilor celulelor din organismul animal realizându-se pe baza variaţiei de volum acitoplasmelor.

Măsurarea dimensiunilor nucleului se numeşte cariometrie şi reprezintă un domeniu de mareinteres pentru biologia şi patologia celulară. Nucleii prezintă variaţii dimensionale funcţionale şipatologice.

Variaţiile funcţionale ale dimensiunilor nucleului sunt în legătură cu: ►Vârsta, nucleul fiindmai mare în celula tânără, decât în celula îmbătrânită, în cazul aceluiaşi tip celular;

► Bioritmul, existând diferenţe de volum de până la 20%, între zi şi noapte, la

hepatocite,neuroni, nefrocite,etc.;► Gradul de poliploidie (numărul de seturi cromozomale prezente în nucleu). Cu cât gradulde poliploidie este mai mare cu atât nucleul este mai mare. Astfel, nucleii megacariocitelor sunt mult

40



mai voluminoşi decât cei a hepatocitelor. Din acest punct de vedere în hepatocite se pot întâlni : 1 -nuclei mici (cu diametru de 10 µm), diploizi (2n), întâlniţi la cca.80% din hepatocite; 2 - nuclei medii(cu diametru de 15 µm); - tetraploizi (4 n), întâlniţi la 16% din hepatocite şi uneori octaploizi. S-aconstatat că suprafaţa nucleară creşte proporţional cu gradul de poliploidie, fapt ce explică înmugurirea nucleilor poliploizi.

În patologie, variaţii ale dimensiunilor nucleului se întâlnesc în toxicoze, în boala de iradiere

şi în cancer. În celulele neoplazice, nucleii apar de talie mare, cu morfologie extrem de variată înacelaşi câmp microscopic, putând prezenta uneori aspect monstruos.+Între volumul nucleului şi volumul citoplasmei se stabileşte un raport nucleo-citoplasmatic

(N/C), a cărei valoare variază în limite foarte largi (1/3 - 1/20), de obicei situându-se între 1/7 - 1/10.Atunci când volumul citoplasmei creşte mai mult decât volumul nucleului, raportul N/C va fi

refăcut fie prin diviziune celulară, fie printr-o creştere a volumului nuclear. În cazul în care volumul nupoate fi refăcut, funcţionarea normală a celulei este perturbată. În condiţii patologice, raportul N/Cpoate fi complet modificat, ajungându-se la inversarea raportului, în celulele tumorale.

Vâscozitatea nucleoplasmei este mai mică decât a citoplasmei, excepţie făcând ovocitul.Greutatea specifică a nucleului este influenţată de conţinutul în apă şi de starea fiziologică a celulei,descrescând în următoarea ordine: nucleol, cromatină, nucleoplasmă.

Ph-ul nuclear este uşor alcalin (7,4-7,5). Totodată, în nucleu se realizează diferenţe depotenţial între membrana nucleară (cu sarcini electrice negative) şi nucleoli sau cromozomi, ce au

sarcini electrice pozitive.Componentele nucleului sunt: membrana nucleară, nucleoplasma,cromatina şi nucleolul.

4.2. Membrana nucleară

Membrana nucleară (nucleolema sau carioteca) (nucleolemma s. karyoteca) este o structurălipoproteică, cu o grosime de câţiva zeci de nanometri, caracteristică eucariotelor care împarte celula în două compartimente: - nucleul ce conţine genomul, structurile implicate în transcripţie şi înprelucrarea produsului transcriptic; - citoplasma ce cuprinde organitele celulare. În celulele vii, apareca o peliculă fină, cu indice de refracţie şi densitate mai mare decât restul nucleului. În celulele fixate,se colorează bazofil, iar vizibilitatea cromatică se datoreşte condensării şi coagulării unor componenteale carioplasmei care se depozitează pe faţa internă a membranei.

La microscopul electronic, nucleolema apare formată din două foiţe (una internă şi altaexternă), fiecare trilaminată, lipoproteică, groase de 60-100 Å , separate printr-un spaţiu perinuclear sau cisterna perinucleară, de 150 – 300 Å , plin cu o substanţă amorfă.

41



Fig.4.5.Membrana (MN) nucleară - reprezentare tridimesională1-MN şi relaţiile sale cu reticulul endoplasmic (RE); 2-MN, la microscopul electronic,cu grosisment redus; 3-Trilaminaritatea celor două MN; 4-Organizarea moleculară a MN;5-Ultrastructura MN .a-Nucleul; b-Membrana nucleară; c-Citoplasma; d-Por; e-Reticul endoplasmic; f-ribozomi.

Membrana nucleară externă (membrana nuclearis externa) prezintă o faţă citoplasmatică,ornată cu ribozomi, are un contur mai flexibil şi zone active de formare a veziculelor.Membrana nucleară internă (mebrana nuclearis interna) este lipsită de ribozomi şi aderă fie la

nucleoplasmă, care poate diferenţia o lamină densă, fie la cromatină.Cisterna perinucleară (cisterna nucleolemmae) apare ca un spaţiu tridimensional, aflat în

continuitate cu spaţiul reticulului endoplasmatic. În acest spaţiu s-au pus în evidenţă proteine,enzime.Ca2+.(Fig.4.5)

Nucleolema sau învelişul nuclear este întreruptă (fenestrată) de orificii circulare, denumitepori circulari, la nivelul cărora cele două membrane se află în raporturi de continuitate. Numărul depori de pe o unitate de suprafaţă este legat de intensitatea schimburilor nucleo-citoplasmatice. Asfel,la celulele în creştere pot exista 10 pori/µm2. Se întâlnesc variaţii în numărul, frecvenţa şi distribuţiaporilor de la un tip de nucleu la altul. Porii sunt în fapt "porţile" folosite de macromolecule şi deansamblurile macromoleculare (proteine, ARN m, subunităţi ribozomale,etc.) pentru a intra sau ieşi

din nucleu. (Fig.4.6)

Fig.4.6. Structura porului nuclear.

Porul (porus nuclearis) împreună cu structurile adiacente formează complexul porului.Complexul por (complexus pori) cuprinde: a - două inele sau anuli , asezate pe ambele feţe aleporului (nucleară şi citoplasmatică), fiecare inel (anulus pori) fiind compus din granule proteicesferoide cu diametrul de 10-25 nm, care sunt dispuse în formă de octagon; b - opt conuri, orientatedinspre peretele porului către lumenul său, considerate a fi agregate de fibrile; c - o particulă centrală, în formă de granulă sau bastonaş, inconstant prezentă; d - pachete de filamente nucleoplasmatice de

4-8 nm, care se inseră cu oextremitate de inelul intern, iar cu cealaltă extremitate se prinde peformaţiuni intra nucleare (eventual pe nucleol).După unii autori, diferitele structuri care apar în centrul porului (diafragma porului, granula

centrală, filamentele) par a fi mai curând materiale surprinse în timpul trecerii prin por decât structuripemanente.

42



Fig.4.7.Schema complexului por.1-MN externă; 2-MN-internă;3-Spaţiu cisternal; 4-Filament intern; 5-Formaţiune conică; 6-Granulă-anulus extern; 7-Granulă-anulus intern; 8-Granulă centrală.

Funcţiile membranei nucleare sunt: 1 - delimitează conţinutul nucleului de cel alcitoplasmei;2 - reglează schimburile dintre nucleu şi citoplasmă; 3 - formează membranele reticululuiendoplasmic, reprezentând rezerva de citomembrane în celule care se divid rapid; 4 - menţine şistabilizează cromatina, care se ataşează de faţa sa internă; 5 - rol mecanic în susţinerea organitelor,acestea fiind legate de faţa sa externă prin fibrile de 18 nm.(Fig.4.8.)

Fig.4.8. Diagrama căilor de translocare a matrialului din nucleu (A) în citoplasmă (B).1-Transport prin microvezicule; 2-Transport transmembranar3-Transport combinat;4-Translocare prin pori; 5-Extruzare prin delimitarea unor saci din învelişul nuclear.

4.3.NucleoplasmaNucleoplasma, matricea nucleară sau sucul nuclear (nucleoplasma) reprezintă acea parte a

nucleului, aparent lipsită de structuri (la microscopul optic şi la cel electronic,de grosisment redus). Lanivelul molecular apare structurată, încât denumirea de suc nuclear apare impropie, fiind maiadecvată denumirea de matrice nucleară. Nucleoplasma se prezintă ca un mediu de natură proteicăcare în care "plutesc" nucleolii şi cromatina. Are rol esenţial în organizarea nucleului, determinându-iforma, în sinteza de ADN şi ARN, în medierea semnalelor hormonale (ale steroizilor).Conţine diverseenzime, ce intervin în glicoliza anaerobă şi în realizarea unor legături macroergice.

43



Matricea nucleară cuprinde două componente: matricea nucleară propiu-zisă şi fracţiunealabilă a matricei.

Matricea nucleară propiu-zisă sau scheletul nuclear reprezintă echivalentul citoscheletului lanivel nuclear,fiind formată dintr-o reţea de proteine stabile cu greutatea moleculară mare.Se poateizola după extragerea cromatinei şi nucleolului. Este formată din trei componente: matricea fibrilară,componentele fibrilare (nemembranoase) ale învelişului nuclear şi componenta fibrilară a nucleolului.

Matricea fibrilară apare ca o reţea de fibrile intranucleare, întinsă în toată masa nucleului.Este formată din granule sau particule matriceale, electronodense, cu diametru de 15-20 nm şi dinfibrile matriceale (sau matrixin), cu diametru de 5 nm,dispuse în pachete. Matricea fibrilară conţineproteine (20% din totalul proteinelor nucleare), ADN (1,2%), ARN (0,5%) şi fosfolipide, în cantitateredusă. Lipsesc proteinenele histonice, în timp ce proteinele nonhistonice ocupă 18,2%,predominând cele acide.

Componentele fibrilare (nemembranoase) ale învelişului nuclear sunt o formă specializată acitoscheletului nuclear,fiind reprezentate de lamina densă internă (sau lamina fibrosa) şi de complexul por .

Lamina densă internă este situată pe faţa nucleară a membranei interne a învelişului nuclear.Are aspectul unei reţele de fibrile legate pe de o parte la reţeaua matricei nucleare şi pe de altă partela componentele fibrilare ale complexului por. Complexul por este format din structuri inelare(matricea anulară sau anulii), din granule centrale şi din filamente radiare.

Lamina densă internă împreună cu complexul por formează o componentă a scheletuluinuclear, denumită complex lamina-por. Acest complex conţine 2-3% din totalul proteinelor din nucleu(95% din ele fiind nehistonice, predominent acide). Pe faţa internă a complexului lamina-por a fostidentificată o nucleozid trifosfatază, implicată în transportul ARN către citoplasmă.

Componenta fibrilară nucleolară (matricea nucleolilor) este reprezentată de o reţea defilamente ce ocupă aria ce corespunde părţii fibroase şi părţii granuloase din nucleol.Este formată dinpolipeptide asemănătoare celor din scheletul nuclear şi are rol de suport pentru depozitareagranulelor ribozomale.

Funcţiile matricei nucleare sunt: 1- menţine forma nucleului şi stabilitatea acestuia îninterfază; 2-asigură flexibilitatea nucleului, fapt ce permite realizarea unor modificări structuralelegate de organizarea cromatinei, replicarea ADN, transcripţia şi transportul intranuclear de ARN; 3-contractilitatea, independentă de ATP, dar influenţată de ionii bivalenţi (Ca2+,Mg2+) ce permiterealizarea unor variaţii ale volumlui nuclear; 4- suport pentru depozitarea granulelor ribozomale.

4.4. Cromatina

Cromatina nu este o substanţă chimică, ci o noţiune biologică, fiind reprezentată dematerialul intranuclear care se evidenţiază cu coloranţi bazici. Este forma de existenţă acromozomilor în interfază , în celula aflată între două diviziuni. Cromatina şi cromozomii sunt douăforme de organizare ale unuia şi aceluiaşi material genetic (ADN-ul).

Compoziţia chimică a cromatinei cuprinde ADN, proteine histonice, mici cantităţi de ARN şiproteine nehistonice.

Cantitatea de ADN din nucleu este constantă pentru o anumită specie şi reprezintă genomulspeciei respective. Este dată de numărul şi dimensiunile moleculelor de AND.

Histonele sunt proteine bazice, prezente numai în genomul eucariotelor. În funcţie deconţinutul în arginină şi lizină există cinci tipuri de histone, denumite H1, H2A, H2B, H3, H4. La rândul său

fiecare tip prezintă mai multe subtipuri.Histonele prezintă mai multe particularităţi: 1- au masă moleculară mică; 2- sunt puternicbazice, datorită conţinutului mare (10-20%) de aminoacizi bazici (lizine şi arginine); 3- sunt purtătoarede sarcini electrice pozitive, care le permit să se lege de sarcinile negative ale grupărilor fosfat dinADN; 4-sunt proteine cu evoluţie filogenetică moleculară definitivă.

Histonele îndeplinesc un rol major în împachetarea ADN-ului în nucleu, în realizareaorganizării supramoleculare a ADN-ului sub formă de nucleozomi. În cursul ciclului celular, histonelesuferă o serie de modificări chimice ( acetilări,fosforilări, metilări).

În spermatozoid, histonele sunt înlocuite de protamine. Protaminele au o greutate molecularăfoarte mică (4200 daltoni), o lungime medie de numai 33 aminoacizi şi sunt foarte bazice, conţinândmultă arginină. Înlocuirea histonelor are loc în timpul trecerii de la spermatidă la spermatozoid, permiţând realizarea unui înalt grad de condensare şi compactare a cromatinei, pentru împachetarea ADN-ului într-un volum foarte mic, cum este cel al capului spermatozoidului.

Fig.4.9. Aspecte ale cromatinei nucleareI. La microscopul optic: 1-Cruste; 2-Granule; 3-Nevuri; 4-Nucleu hipercromatic;

44



5-Nucleu hipocromatic.II. La microscopul electronic: 1- Cromatină periferică; 2-Cromatină insulară; 3- Cromatinaasociată nucleolui; 4-Nucleol; 5-Membrană nucleară; 6-Spaţiu perinuclear; 7-Pori.

Aspectele histologice ale cromatinei. Datorită conţinutului bogat în ADN,complexat cuhistone, cromatina se colorează întens cu coloranţi bazici (hematoxilină,albastru de tripan), putândprezenta aspecte variate: granule, grămezi neregulate, reţele de filamente, corpusculi cromocentrici(sau cariozomi). Aspectul morfologic al cromatinei este asemănător în nucleii aparţinând aceluiaşi tipcelular, dar variază în funcţie de tipul celular şi de stadiul funcţional,fiind un criteriu important pentruidentificarea celulelor la microscopul optic.

4.4.1. Eucromatina

Eucromatina (euchromatinum) reprezintă cromatina funcţională, activă, purtătoare de genestructurale, pe care se face transcripţia mesajului genetic. Poate fi de două feluri: 1- eucromatinăactivă, pecare transcripţia se efectuează continuu, asigurându-se deşfăşurarea normală a vieţiicelulei; 2- eucromatină permisivă , potenţial activă, devenindactivă în momentul în care acţioneazăsemnale specific modulatoare (de exemplu: hormonii).

Reglarea conformaţiei genetice se realizează pe eucromatină, prin intervenţia unor agenţibiochimici, în principal proteine nehistonice, ce pot acţiona ca represori sau derepresori , modulândtranscriptibilitatea materialului genetic activ şi nu structura acestuia.

Raportul dintre eucromatină şi heterocromatină se exprimă funcţional prin raportul dintretranscriptibil şi netranscriptibil, permiţând, în fapt, realizarea relaţiei dintre genotip şi fenotip. Astfel,prin genotip se înţelege totalitatea materialului genetic cuprins în cromatina interfazică, decieucromatina împreună cu heterocromatina. Fenotipul reprezintă expresia unei părţi din genotip, carea fost transcrisă din eucromatină în interfază, totalitatea trăsăturilor (însuşirilor morfologice,fiziologice,etc.) exprimate din noianul de informaţii înscrise în genotip.

4.4.2. Heterocromatina

Heterocromatina (heterochromatinum) este cromatina condensată, netranscriptibilă, inactivămetabolic.Există două tipuri de heterocromatină: constitutivă şi facultativă.

Heterocromatina constitutivă este genetic inactivă, lipsită de gene structurale. Pe ea nu se

face transcripţie niciodată, rămânâd întotdeuna condensată în interfază. Conţine ADN repetitiv sausatelit, un ADN în care anumite secvenţe nucleotidice sunt repetate de un număr foarte mare de ori.

45



La mamifere, ADN-ul repetitiv reprezintă 15% din cantitatea totală de ADN. Există două tipuri de ADNrepetitiv:1- ADN înalt repetitiv (10%), în care secvenţele se repetă de sute de mii de ori; 2-ADNmediu repetitiv (5 %), în care secvenţele se repetă de 100 ori, de 1000 ori sau de zeci de mii de ori.

Pe cromozomii omologi (care formează o pereche), heterocromatina constitutivă selocalizează identic, de regulă, în imediata vecinătate a centromerului, putând fi detectată printehnica de bandare a cromozomilor.

Rolul heterocromatinei constitutive este incomplet elucidat, atribuindu-se o semnificaţie de"protecţie" sau de "suport", sugerându-se ipoteza că ea determină specificitatea centromerică,respectiv poziţia centromerului în cromozomi.

Heterocromatina facultativă este o cromatină condensată, care conţine gene structuralerepresate (inactive) pe care nu se face transcripţia. Pe aceste gene, transcripţia s-a efectuat sau nu într-o perioadă anterioară, sau se va putea efectua, dacă se transformă în eucromatină, subinfluenţa unui agent derepresor. Astfel, transformarea unei părţi din heterocromatina autozomală îneucromatină determină sinteza de imunoglobuline şi transformarea limfoblastică a limfocitelor.

În funcţie de cromozomi în care se găseşte, heterocromatina poate fi: 1-autozomală(autosoma), prezentă în perechile de cromozomi autozomi, sub forma porţiunilor condensate,heterocromatice, ce conţin lanţuri de gene, inactive transcripţional; 2-gonozomală (gonosoma),prezentă numai în cromozomii ce determină sexul , reprezentată de cromatina X, la femelă şi decorpusculul Y, la mascul.

Fig.4.10. Aspectele cromatinei X1-Satelit nucleolar; 2-Drumstick; 3-Corpuscul cromocentric

Cromatina X sau corpusculul Barr a fost descrisă de M.L.BARR şi de E.G.BERTRAM în1949, în neuronii din nucleul nervului hipoglos la pisică. Este folosită ca marker genetic pentrurecunoaşterea sexului genetic. In mod normal este prezentă numai în nucleii celulelor somatice alefemelelor sub forma unui corpuscul cromatidian, denumit corpuscul Barr. Acesta reprezintăcondensarea interfazică a unuia din cei doi gonozomi X. Prin condensare, eucromatina se transformă în heterocromatină facultativă inactivă. În situaţia în care ambii gonozomi X ar fi activi(transcripţionabili), în celulele femelei ar trebui să existe o cantitate dublă de enzime, controlate degenele situate pe cromozomul X.

Cromatina X este prezentă şi detectabilă la toate femelele mamiferelor, cu excepţia femeleide opussum (mamifer marsupial), unde este prezentă la ambele sexe. Lipseşte la toţi masculii

normali.Corpusculul Barr are un diametru de cca. 1µm şi poate prezenta forme diferite: plan-convex,convex-concav, biconvex, triunghiular. Poziţia sa variază după tipul celular, apărând situtat adiacentmembranei nucleare interne ( în celulele epidermale şi ale epiteliului mucoasei bucale) sau ataşatnucleolului (în unii neuroni). În neutrofilele femelelor este prezentă o formaţiune echivalentăcorpusculului Barr, denumită, după aspectul său "băţ de tobă" (drumstick), formată dintr-un cap cudiametrul de 1,5µm, ataşat printr-un filament cromatic extrem de subţire la unul din lobii nucleului.Frecvenţa drumstick-ului est de 7/500 neutrofile, sau chiar mai mult.

Cromatina Y sau corpusculul F se poate observa în nucleii celulelor provenite de la masculiinormali, examinate în lumină ultravioletă, după colorare cu fluorocrom. Are aspectul unui corpusculintens fluorescent. A fost descpoperit de PEARSON, în 1970 şi reprezintă expresia citologică acromozomului Y. La indivizii ce prezintă doi cromozomi Y se observă doi corpusculi F. În acest modse pot diagnostica unele anomalii cromozomiale (trisomia XXY) la masculi, care predispun la uncomportament dur, înrăit.

4.4.3. Cromozomii

46



Cromozomii (Chromosoma) sunt structuri celulare cu număr, forme şi mărimi caracteristicepentru fiecare specie. Ei devin vizibili la microscopul optic în celulele care se pregătesc pentrudiviziune sub forma unor filamente lungi, cu mare afinitate pentru coloranţi bazici, de unde îşi tragdenumirea, croma însemnând în limba greacă culoare, iar soma - corp. (Fig.4.11.)

În funcţie de posibilităţile de a fi observaţi la microscopul optic, cromozomii pot fi clasificaţi în : - cromozomi interfazici, necondensaţi şi neobservabili la microscop; -cromozomi mitotici , uşor

observabili la microscop, mai ales în cursul metafazei şi de aceea denumiţi cromozomi metafazici.Structura cromozomilor metafazici cuprinde: cromatidele, centromerul, kinetocorii, constricţiilesecundare şi sateliţii.

Cromatidele (chromatidea) sunt cele două jumătăţi longitudinale, genetic identice ceformează fiecare cromozom metafazic. Fiecare cromatidă corespunde unei molecule de ADN.

Fig.4.11. Cromozomi interfazici şi cromozomi mitotici

Extremităţile terminale ale cromatidelor se numesc telomere (telomerus) şi sunt absolutnecesare pentru structura şi funcţionarea normală a cromozomilor, deoarece previn fuziunea şimenţin o anumită ordine a cromozomilor interfazici în interiorul nucleului prin ataşarea lor lamembrana nucleară internă.Centromerul (centromerus ) sau constricţia primară este regiunea cea mai îngustă din lungimeacromozomului, unde cele două cromatide se unesc. Centromerul este slab colorat sau acromatic,având un conţinut scăzut de ADN. În vecinătatea centromerului se găseşte heterocromatinaconstitutivă. Cei mai mulţi cromozomi sunt monocentrici ( cromosoma monocentricum), prezentândun singur centromer. În cazul unor anomalii cromozomiale apar cromozomi dicentrici ( cromosoma

dicentricum) sau policentrici (cromosoma polycentricum).Kinetocorii (kinetocorus, i) sunt în număr de doi pentru un cromozom şi reprezintă

locul prin care fiecare cromatidă se ataşează de microtubulii fusului de diviziune. La microscopulelectronic un kinetocor are forma unui oval cu dimensiunile de 5/25 nm. (fig.4.12.)

47



Fig.4.12.Ultrastructura cromozomului1-Centromer; 2-Cromatide; 3-Cromoneme; 4-Cromomere.

Constricţiile secundare sunt zone ale cromozomilor ce nu reţin colorantul bazic. Servescdrept criteriu morfologic de indiviudalizare a cromozomilor. În comparaţie cu constricţiile primare, lanivelul costricţiilor secundare nuse produc deviaţii angulare ale segmentelor pe care le unesc. Uneledin zonele de constricţie secundară sunt legate de formarea nucleolilor şi se numesc zone nucleolare

sau organizatori nucleolari. iar cromozomii care participă la formarea nucleolilor sunt denumiţicromozomi nucleolari (chromosoma nucleolare).Satelitul (satelles chromosomalis) este un corpuscul sferic, cu diametrul egal cu al

cromozomului sau mai mic, ataşat de restul cromozomului printr-un filament ( filum satellitis) subţirede cromatină de lungime variabilă. Cromozomii ce prezintă satelit se numesc SAT-cromozomi (chromosoma satellitiferum).

În funcţie de poziţia centromerului, cromozomii se clasifică în: 1- telocentrici (chromosomatelocentricum), la care centromerul este situat la o extremitate a cromozomului,lipsindu-i braţelescurte; 2-acrocentrici (chromosoma acrocentricum), cu braţe scurte abia vizibile, centromerul fiindsituat în apropierea extremităţii cromozomului;3-submetacentrici (chromosoma submetacentricum), lacare centromerul este situat în apropierea mijlocului lungimii cromozomului, prezentând un braţ scurtşi un braţ lung; 4- metacentrici (chromosoma metacentricum), cu braţeleaproximativ egale, centromerul fiind situat la mijlocul lungimii cromozomului.

Fig.4.13. Schema unui cromozom.Tipuri de cromozomi.1-Centromer: 2-Constricţie secundară; 3-Satelit;

48



a-Cromozom telocentric; b-Cromozom acrocentric;c-Cromozom submetacentric;d-Cromozom metacentric.

Dimensiunile cromozomilor sunt cuprinse între 1,5-10 µm, lungime şi 0,2-2 µm diametru,putându-se întâlni cromozomi giganţi şi cromozomi pitici.

Numărul cromozomilor apare constant pentru aceiaşi specie, existând: 60 cromozomi la

bovine, 54 la ovine, 38 la suine, 64 la cabaline, 63 la catâr, 38 la felide, 78 la canide şi 46 la primate.Celulele sexuale sau gameţii sunt haploide (haplos= simplu), conţinând un singur set decromozomi, notat cu "n",faţă de celulele somatice care sunt diploide (diplos=dublu) şi conţin douăseturi (2n) de cromozomi (un set matern şi altul patern). Fiecare cromozom dintr-un set are în setulopus un cromozom complementar, identic structurat morfologic şi genetic, alcătuind o pereche decromozomi omologi. Asfel, taurinele prezintă 58 cromozomi autozomi (29 perechi) şi 2 cromozomi desex ( heterocromozomi sau gonozomi). Taurinele femele au în celulele somatice doi cromozomi X,,iar formula cromozomială este 60,XX. Masculii taurinelor au formula cromozomială 60,XY şi prezintă în celulele somatice un cromozom X şi altul Y. În formula cromozomială, prima cifră indică numărultotal de cromozomi, după virgulă fiind indicaţi cromozomii de sex (gonozomii). La taurine, fiecare dincele 29 perechi de cromozomi autosomi este formată din 2 cromozomi omologi, cu aceiaşi morfologieşi dispunere a genelor. Heterocromozomii ( gonozomii) nu sunt omologi. La taur, diferenţa de formă între cromozomul X şi cel Y este evidentă, cromozomul Y fiind un cromozom submetacentric mic. La

vaci, cei doi cromozomi X submetacentrici nu sunt omologi, deoarece numai unul este activ genetic,iar celălalt este inactiv, rămâne condensat în interfază şi formează cromatina sexuală (corpuscululBarr). Diferenţierea celor doi cromozomi X în unul activ şi altul inert genetic se face într-un stadiuprecoce al dezvoltării embrionare.

Compoziţia chimică a cromozomilor include ADN, proteine (histonice şi nonhistonice) şi ocantitate redusă de ARN.

Histonele sunt proteine cu greutate moleculară redusă (10.000- 20.000 dal), cu conţinut mare(10-20%) de aminoacizi bazici (lizină şi arginină), purtători de sarcini electrice pozitive, ce le permitesă se lege de sarcinile negative ale grupărilor fosfat din ADN. La eucariote există cinci clase dehistone, ce diferă după conţinutul lor în lizină şi arginină: H1, H2A, H2B, H3 şi H4.. În timp ce histoneleH2A, H2B, H3 şi H4 sunt cele mai constante din punct de vedere al secvenţei aminoacizilor la diversespecii, histonele H1 prezintă o variabilitate a secvenţelor.

Proteinele nonhistonice sunt de foarte multe tipuri, de la proteine ce intră în structura

cromozomilor sau care se leagă de ADN, intervenind în exprimarea genelor şi până la proteineenzime ce intervin în sinteza de ADN şi ARN sau în scindarea lor.Proteinele ce intervin în reglarea exprimării genelor sunt rare, apărând într-un exemplar la

3000 de nucleozomi. Există, însă şi proteine nehistonice mult mai abundente, precum grupul deproteine cu mobilitate mare (HMG-higt mobility group), care fiind mici şi cu multe sarcini electricemigrează rapid în cursul electroforezei. Din acest grup, proteinele HMG14 şi HMG17 se găsesc în toatecelulele de la mamifere, legându-se de nucleozomii asociaţi cu genele active.

ARN-ul se găseşte în cantitate redusă în cromozomi, fiind reprezentat de ARN-ul nascent,care se formează pe matriţa de ADN în procesul de transcriere.

4.4.3.1. Cariotipul

Cariotipul este reprezentat de totalitatea caracterelor morfologice (număr, mărime, formă,

poziţia centromerului, constricţiile ) ale cromozomilordintr-o celulă diploidă. Grafic poate fi prezentatprintr-o "hartă" numită cario- sau idiogramă, în care perechile de cromozomi omologi sunt aşezaţi înordinea descrescândă a lungimii. Cromozomii sexuali sunt cromozomi X submetacentrici şicromozomul Y, submetacentric mic.

Cariotipul unei specii se obţine prin fotografierea cromozomilor metafazici, obţinuţi dinmetafazele limfocitelor din culturi, stimulate să se dividă cu fitohemaglutinine şi blocate în metafazăprin adaus de colchicină, un alcaloid ce împiedică asamblarea fusului de diviziune. Din fotografiileobţinute se decupează cromozomii şi se aranjează în cariotip, putându-se identifica grupele decromozomi, făra a se putea preciza cu certitudine perechea.

Identificarea fiecărei perechi se face prin folosirea tehnicilor de bandare, tehnici care permitpunerea în evidenţă a unor benzi transversale de-a lungul cromozomilor, benzi care suntcaracteristice pentru fiecare cromozom.

Se folosesc două categorii de tehnici de bandare: 1- tehnici cu fluorescenţă prin care se obţinbenzile "Q" ( de la quinacrină) fluorescente; 2 -tehnici bazate pe tratarea cromozomilor cu diferiţiagenţi fizici şi chimici, urmate de coloraţia Giemsa prin care se evidenţiază trei feluri de benzi :benzile G (Giemsa), care apar intens colorate şi corespund benzilor fluorescente Q; -benzile R

49



(reverse band), cu o dispunere inversă benzilor G, încât benzile R intens colorate, corespund benzilor G palide;- benzile C, apar numai în regiunea centromerului sau în apropiere ei şi corespund localizăriiheterocromatinei constitutive.

Determinarea cariotipului are o mare importanţă în practica medicală, pentru: a-diagnosticulunor boli congenitale, precum trisomia perechiii 21, care produce boala Down (idioţia mongoloidă); b-sfatul genetic şi dirijarea împerecherilor la animale; c-aprecierea statusului genetic la populaţiile cu

mare risc genetic; d-diagnosticul diferenţial al unor anomalii sexuale, cu determinare genetică,precum sindromul Turner (XO, în loc de XX), ce produce sterilitate, ovare vestigiale şi sindromulKleinfelter (XXX, în loc de XY), ce se manifestă prin testicule atrofiate, sterilitate, ginecomastie; e-diagnosticul unor boli ale sângelui, precum leucemia mieloidă, unde apare un cromozom marker anormal (cromozomul Ph-Philadelphia); f - pentru diagnosticul de paternitate, prin măsurarea lungimiicromozomului Y, care trebuie să fie aceiaşi la făt ca şi la presupusul tată; g- pentru diagnosticuldiferenţial între unele tumori benigne şi alte maligne, ce modifică cariotipul. De asemenea stabilirealocusului pe care îl ocupă ogenă într-un cromozom permite realizarea hărţilor cromozomiale, undomeniu de cercetare de mare actualitate.

4.4.3.2. Organizarea moleculară şi supramoleculară acromozomilor la eucariote.

La microcopul electronic, cromozomii metafazici apar ca nişte gheme de cromatină, înfăşurate foarte neregulat. Fiecare cromatidă conţine o singură moleculă de ADN ce se organizează

sub forma unei fibre de cromatină, cu grosimea de 10 nm, foarte sinuoasă, împachetată compact,prezentând zone de eucromatină şi heterocromatină. Împachetarea ADN-ului şi a histonelor încromozom este absolut necesară pentru ca o moleculă de AND co greutate moleculară de 6×1010

daltoni şi o lungime de 3 cm să încapă într-un cromozom lung de 5 µm ( 0,0005 cm). Împachetarease facecu ajutoul nucleozomilor, care sunt unităţi fundamentale repetitive de organizare a complexuluiAND -histone, deci a cromatinei. (Fig.4.14).

Fig.4.14.Modalităţi de plicaturare a fibrei de cromatină în cromozom1-Plicaturare transversală; 2-Plicaturare longiutdinală;

3-Plicaturare combinată; 4-Structură cuaternară.

4.4.3.3. NucleozomiiConceptul de nucleozom a fost elaborat de KÖRNBERG, în anii 1975-1977. Un nucleozom

este un octamer histonic de forma unui cilindru scurt , cu un diametru de 11 nm şi o înălţime de 5,5nm, pe care duplexul de AND îl înconjoară de două ori.(Fig.4.15.)

50



Fig.4.15.Alcătuirea nucleozomului Fig.4.16.Poziţia histonei H1

Octamerul histonic este format din opt molecule de histone, câte două molecule de H 2A, H2B,H3 şi H4. Tetramerul de histone - (H3)×2 şi (H4)×2 - bogate în arginină formează miezulnucleozomului şi determină înfăşurarea duplexului de ADN. Cei doi dimeri de histone bogate în lizină,- (H2A)×2 şi (H2B)×2 - sunt ataşaţi miezului nucleozomului. Nucleozomul nu conţine proteinenonhistonice.

Histona H 1 nu intră în structura nucleozomului, fiind siutată lateral de acesta, în contact cuintrarea sau ieşirea ADN-ului din nucleozom. Histona H1 se leagă de ADN-ul linker prin forţe ionice,prezentând o porţiune C (carboxil) terminală, legată direct de ADN şi o porţiune N (amino-), ce nu seataşează de ADN, dar oferă locusuri de legare pentru proteinele nehistonice HMG1 şi HMG2. HistonaH1 este implicată în spiralizarea Fibrei de cromatină.(Fig.4.16).

Molecula de ADN este continuă de-a lungul cromozomului, prezetând porţiuni înfăşurate penucleozomi şi porţiuni ce fac legătura dintre doi nucleozomi succesivi, denumite ADN-linker sauinternucleozomic. De ADN-ul linker se leagă o moleculă de histonă H1, amplasată între doinucleozomi. Se realizează, asfel, o înşiruire a nucleozomilor unul după altul, ca mărgele pe aţă,formându-se filamentul subţire de cromatină, cu diametrul de 11 nm, care se poate observa lamicroscopul electronic, numai dacă cromatina este "întinsă" în mod artificial. În celula vie, fibra decromatină are un diametru de 30 nm, răsucită într-o structură helicoidală (un solenoid sau o bobină)cu pasul elicei de 11 nm. La fiecare tur de spiră se inseră şase nucleozomi. Rata de împerechere aADN-ului pe nucleozom este de circa 10/1. aproximativ 60 nm de ADN fiind înfăşuraţi pe un cilindrunucleozomic înalt de 5,5 nm. Apoi, dispunerea nucleozomilor sub formă de bobină (solenoid) cudiametru de 30 nm permite realizarea unui raport de împachetare de cca. 50/1. Eucromatinacorespunde filamentului de cromatină de 10 nm, iar heterocromatina corespunde solenoidului(bobinei) de 30 nm.(Fig.4.17)

51



Fig.4.17.Formarea filamentului subţire de cromatinăA-Histona H1; B-Nucleozom; C-Filamentul de cromatină;1-Porţiunea globulară a histonei.

Împachetarea duplexului de ADN pe nucleozom şi a nucleozomilor în fibra de cromatină de

30 nm ar permite ca într-un cromozom ipotetic de 1 mm lungime, să încapă un ADN lung de 3 cm.La rândul ei, fibra de cromatină de 30 nm se pliază formând bucle de mărimi variabile, ce permite săse reducă lungimea "firului" de ADN de la 1 mm la 100 µm.

Pentru a "încape" în cei 5 µm lungime ai unui cromozom metafazic sunt necesare încă douăordine de condensare a cromatinei, care se realizează probabil prin împachetarea elicoidală abuclelor de cromatină, încât aglomerarea lor în anumite zone determină apariţia benzilor vizibile încromozomul metafazic. Se pare că superspiralizarea solenoidului se realizează cu ajutorul unor proteine nehistonice. Astfel, fosforilarea proteinelor nehistonice ar declanşa superspiralizareasolenoidului, în momentul trecerii de la G2 la mitoză, iar defosforilarea lor ar induce despiralizarea, înmomentul trecerii de la mitoză la G1. Alături de histone, în procesele de împachetare a nucleozomilor în fibra de cromatină, întervine ionul de Mg2+.(Fig.4.18.)

Fig.4.18.Structurafibrei de cromatină de 30 nm (A) şi nucleozomului (B).1- Miezul histonic; 2- ADN linker.

In timpul diviziunii celulare, condensa-rea cromatinei corespunde împachetă-rii compacte înspaţiu a fibrei de cromatină de 30 nm, odată cu realizarea structurii cromozomului metafazic.(Fig.4.19.)

S-a calculat că, ADN-ul înfăşurat pe un nucleozom este prea scurt pentru a corespunde uneigene structurale, încât nu există o concordanţă între o genă, ca unitate de informaţie genetică şi unnucleozom, ca unitate de împachetare a ADN-ului.

52



Gena este formată din aproximativ 1000 perechi de nucleotide (perechi de baze), în timp ceADN-ul înfăşurat pe un nucleozom are 200 perechi de baze. Unele gene de la eucariote apar discontinui, prezentând secvenţele din ADN care codifică aminoacizi (exoni), separate între ele prinsecvenţe de ADN care nu codifică aminoacizi (introni).(fig. 4.19)

Fig.4.19.Eucromatina şi heterocromatina Fig.4.20.Etapele realizării structurilor cromozomilor eucariotici

1-ADN linker A-Duplex de ADN;1+2–Eucromatină; B-Filament de cromatină;3-Solenoid de 30 nm - heterocromatină C-Fibra de cromatină;

D-Bucle de cromatină;E-Bandă condensată;F-Cromozom în metafază.

Există mai multe ipoteze asupra mecanismului prin care genele structurale din ADN-ul înfăşurat pe nucleozom sunt activate pentru transcripţie. Cea mai larg acceptată ipoteză (emisă în1982) susţine că activarea genelor se face ca urmare a intervenţiei proteinelor nehistonice HMG 14 şiHMG17, care fie că înlocuiesc proteinele HMG1 şi HMG2 de pe locurile lor de legare pe histona H1,fiecă înlocuiesc însăşi histona H1 de pe ADN-ul linker internucleozomic.(Fig.4.20.)

In acest fel, regiunile din filamentul nucleozomic în care intervin proteinele HMG14 şi HMG17

îşi vor modifica conformaţia biochimică, devenind regiuni active transcripţional. 4.5. Nucleolul

53



Nucleolul (nucleolus) este o componentă intranucleară, cu aspect corpuscular (corpusculum

nucleare), prezentă în interfază, a cărei funcţie principală constă în biogeneza ribozomilor (cuexcepţia ribozomilor mitocondriali. Ocupă o poziţie cheie în circuitul intracelular al informaţiei, fiindsediul unui considerabil trafic de molecule. În el se desfăşoară principalele procese care au loc înnucleu (replicare, transcripţie, transport), jucând rolul unui intermediar între cromozomi şi citoplasmă.

Este prezent (vizibil sau nu ) în toate celulele eucariote. Nu există nucleu fără nucleol, iar celulelecare îşi perd nucleolii nu mai sunt viabile. În timpul diviziunii celulare se dezintegrează şi reapare după terminarea acesteia. În

structurarea nucleolului, un rol deosebit revineorganizatorilor nucleolari, prezenţi în unii cromozomi,adiacent constricţiei secundare.

Deşi a fost observat încă din 1836 de către VALENTIN, ca o granulă densă în interiorulnucleului, rolul său a fost dezlegat mult mai târziu, abia în 1960, precizându-se rolul esenţial pe care îlare în biogeneza ribozomilor.

Examinat la microscopul prezintă un aspect omogen, puternic bazofil, bine delimitat. Prinimpregnări argentice, au fost evidenţiate două componente în structura nucleolului: 1-nucleolonema(nucleolonema), o formaţiune filamentoasă, răsucită ca un ghem; şi 2- o componentă astructuratăsau amorfă (pars amorpha). Nu este delimitat de o membrană.

În celulele vii, examinate în contrast de fază, nucleolul apare ca un corpuscul puternic

refringent, datorită conţinutului redus de apă, heterogen şi cu contur neregulat.Numărul nucleolilor. În nucleii celulelor somatice există, în mod obişnuit doi nucleoli, câte unulpentru ,fiecare set cromozomial. Numărul nucleolilor creşte în raport direct cu gradul de poliploidie.Astfel, în hepatocite există 2 nucleoli, în celulele diploide, 4 în cele tetraploide şi 8 în cele octaploide.

Dimesiunile nucleolilor sunt între 1-2 µm, ocupând circa 30% din volumul nucleului. Elevariază în funcţie de implicarea celulelor în sinteza de proteine. Celulele care sintetizează cantităţimari de proteine (neuronii, celulele embrionare, limfocitele stimulate antigenic) au nevoie de mulţiribozomi,ceea ce face ca nucleolii să aibă dimensiuni mari. În celule în care sinteza de proteine esteredusă (în spermatozoizi), nucleolii au dimensiuni mai mici. Nucleolul apare hipertrofiat în anabolism, în perioada de diferenţiere embrionară şi se reduce în catabolism şi în inaniţie.

Raportul nucleolo / nuclear. Numărul şi volumul nucleolilor depind de starea funcţională acelulei. Cu cât celula este mai activă în sinteza proteinelor, cu atât raportul nucleolo/nuclear este maimare. Acest raport este folosit drept criteriu pentru aprecierea vârstei celulelor. Astfel celula tânără

prezintă un nucleu mare eucromatic, cu un nucleol mare, cu o citoplasmă redusă şi bazofilă, iar ocelulă adultă prezintă un nucleu mai mic, hipercrom, cu nucleoli mici şi o citoplasmă abundentă.

Fig.4.21. Forma şi poziţia nucleoluluiA-Forma: 1-Sferoidal-ovoidală; 2-Discoidală; 3-Triunghiulară; 4-Neregulată.B-Poziţia: 1-Alipit membranei nucleolare;2-Central; 3-Excentric.

Forma nucleolilor. Nucleoliiprezintă, de cele mai multe ori, o formăsferic-ovoidală, care pe măsura îmbătrânirii celulei devine neregulată.

Densitatea nucleolilor este mare (1,35), nucleolul fiind cea mai densă structură din celulă,datorită concentraţiei ridicate în substanţă uscată şi a cantităţii foarte mici de apă.

Dispunerea nucleolilor în nucleu este în majoritatea cazurilor centrală sau paracentrală,putând varia în raport cu mometul funcţional. S-au observat şi descris mişcări ale nucleolului îninteriorul nucleului şi stabilirea unor contacte cu învelişul nuclear, localizare eficientă pentrudescărcarea de material biologic în citoplasmă.

4.5.1. Ultrastructura nucleoluluiUltrastructura nucleolului evidenţiază patru componente în alcătuirea nucleolului: componenta

filamentară ( pars filamentosa), componenta granulară (pars granulosa), componenta cromozomială(pars cromosoma) şi componenta astructurată (pars amorpha).

54



Componenta filamentară cuprinde filamente de 5nm grosime şi 30-40nm lungime, dispuse înpachete întretăiate, formând o reţea. Conţine ADN-ul pe care se sintetizează ARN-ul ribozomal şiprodusul primar al acestei sinteze (ARN de 45 S). (Fig.4.22.)

Componenta granulară este domi-nantă, fiindalcătuită din granule cu diametru de 15-20 nm,asemănătoare, dar nu identice cu ribozomii citoplasma-tici. Aceste granule reprezintă precursoriiribozomilor.

Componenta cromozomială, dispusă la periferia nucleolului (cromatina perinucleolară) sauavansând spre interiorul nucleolului sub formă de benzi (cromatină intranucleolară) este alcătuită dinfilamente de 10 nm.

Fig.4.22.Ultrastructuranucleolului.

1-Componenta filamentară;

2-Componenta granulară;3-Componenta cromozomială;4-Componenta

astructurată.

Componenta astructuratăapare omogenă şi cu densitate medie la fluxul de electroni. Umple spaţiul dintre granule şi fibre, fiindconsiderată, de unii autori, cariolimfă, iar de alţi autori un gen de matrice pentru celelaltecomponente nucleolare.

Cele patru componente nucleolare se pot distinge în acelaşi nucleol numai în cazuri rare.Raporturile cantitative şi topografice dintre ele variază în funcţie de tipul celulei şi de momentulfuncţional al acesteia. Asfel, în hepatocitul uman, componentei filamentoase îi revine 15 %, celeigranulare 70%, iar componentei cromozomiale 5% din volumul nucleolului. În celulele active,componenetele nucleolare pot segrega, dând naştere unui corpuscul nucleolar (corpusculumnucleare).

Nucleolul nu conţine membrane şi nu este delimitat de membrane.Componenta filamentoasăşi ce granulară se pot asocia formând benzi ce apar, la microscopul optic, ca nucleolemă. iar

porţiunea periferică a componentei cromozomiale corespunde cromatinei asociate nucleolului. În funcţie de criteriile ultrastructurale, există mai multe tipuri de nucleoli: nucleoli reticulari , ceimai comuni, cu cele patru componente distincte; nucleoli compacţi , în care nu se distingcomponentele, întîlniţi la câteva tipuri celulare, ca de exemplu la limfocite; nucleoli inelari , în carecopmponenetele filamentoasă şi granulară formează un inel periferic, care înconjoară o lacunăcentrală.

Compoziţia chimică a nucleolului variază în funcţie de tipul celular şi de momentul funcţional,principalele componente chimice fiind: ADN-ul (3 %), ARN-ul (7%) şi proteinele (90% din greutateauscată). La aceasta se mai adaugă cantităţi mici foarte mici de lipide şi minerale (magneziu, calciu,zinc, cobalt, etc.).

ADN-ul din nucleol este reprezentat de organizatorii nucleolari ce pătrund ca nişte bucle deADN în nucleol.

ARN-ul din nucleol este în principal ARN ribozomal aflat în diverse faza de maturare. Sepresupune că nucleolul este o staţie intermediară obligatorie în tranzitul spre citoplasmă al ARN-uluimesager şi al celui de transfer.În nucleol există diferite tipuri de ARN, ce diferă după coeficentul lor de

55



sedimentare (exprimat în unităţi Svedberg), precum ARN 45 S, ARN 41 S, ARN 20 S, ARN 28 S,ARN 32 S. Aceste tipuri corespund diferitelor etape de maturare a ARN-lui.

Proteinele nucleolare provin din citoplasmă şi sunt repezentate în cea mai mare parte deenzime implicate în sinteza şi maturarea ARN r (ribozomal), precum ARN-polimeraza-ADNdependentă (sau ARN-polimeraza I), convertaza, metilaza,etc.

Bazofilia nucleolului reprezintă principala sa caracteristică, vizibilă la microscopul optic şi se

datoreşte conţinutului relativ mare de ARN şi AND.4.5.2.Biogeneza nucleolilor Nucleolul este vizibil numai în interfază,dispărând în profază şi reapărând în interfază. Un rol

esenţial în biogeneza nucleolului îi revine organizatorului nucleolar,care este o zonă cromozomialădistinctă, slab colarabilă (heteropicnoză negativă), situată în vecinătatea constricţiei secundare,având un grad mai redus de înfăşurare a fibrei de cromatină. Numărul cromozomilor care prezintăorganizatori nucleolari este limitat şi variabil în funcţie de specie. La hominide există cinci perechi decromozomi autuzomi, purtători de organizatori nucleolari (perechile 13, 14, 15,21 şi 22 ). (Fig.4.23.)

La microscopul optic, organizatorii nucleolari corespund cromatinei asociată nucleolului, cepoate fi evidenţiată prin reacţia Feulgen, apărând colorată roşu-violaceu. La microscopul electronic,organizatorii nucleolari corespund componentei cromozomiale, iar funcţional cu ADN r (genele carecodifică ARN r) ce cuprinde cistronii responsabili de transcripţia ARN r.

Fig.4.23. Organizatorii nucleolari.1-Învelişul nuclear; 2-Nucleol; 3-Cromozomi cu oranizatori nucleolari; 4-

Bucle de cromatină cu gene pentru ARNr.

Ipotezele clasice privind biogenezanucleolului susţin: a- continuitatea sau persistenţanucleolului în cursul diviziunii celulare sub formă degranule sau filamente fine (denumite corpusculi

nucleolari), ataşate de cromozomi, împreună cu care se repartizează în celulele fiice, după care suntasamblaţi de organizatorii nucleolari; b-formarea de novo, deoarece materialul nucleolar sedezintegrează complet în cursul mitozei, fără a fi incorporat în noii nucleoli.

Concepţia actuală a realizat un compromis raţional din punct de vedere molecular, întreipotezele clasice (a continuităţii şi a formării de novo), în sensul că componeneta cromozomalărespectă continuitatea, iar celelalte componente (filamentoasă, granulară şi amorfă) sunt neoformate

rapid în faza G1

a ciclului celular, când cistronii sunt reactivaţi pentru transcripţie.4.5.3. Funcţiile nucleolului

Nucleolul îndeplineşte funcţii legate de: - sinteza ARN r şi biogeneza ribozomilor; -reglareasintezei de ARN r; - transferul ARNm şi ARNs în citoplasmă; pregătirea mitozei.

În sinteza de ARNr, ADN-ul nucleolar joacă rolul de matriţă, reprezentând organizatorulnucleolar. ADN nucleolar conţine cistroni, denumiţi ADNr, responsabili pentru transcripţia ARNr,separaţi între ei prin segmente de spaţiere şi terminare, formate din ADN care nu codifică. ADNr estetranscris prin intervenţia ARN-polimerazei I, rezultând un ARN de 45 S care reprezintă precursorulARN-ribozomal. În nucleolii hepatocitelor se sintetizează 1000 de molecule de ARN-45S pe minut. Oparte din molecula de ARN de 45 S este îndepărtată de o endonuclează şi apare un ARN de 41 S,care prin intervenţia unei convertaze este scindat în ARN de 20 S şi ARN de 32 S. (Fig.4.24.)

56



Fig.4.24.Rolul nucleolului în sinteza de ARNr şi în biogeneza ribozomilor

ARN-ul de 20 S suferă intervenţia unei metilaze, care îndepărtează un fragment molecular,transformându-se în forma matură de 18 S. ARN-ul de 18 S părăseşte nucleolul şi se combină cuproteine venite din citoplasmă, după care este trecut în citoplasmă prin porii membranei nucleare subformă de particule ribonucleoproteice, care reprezintă subunitatea ribozomală mică de 40 S, ce apare în citoplasmă la 30 minute de la începerea sintezei.

ARN-ul de 32 S este şi el metilat şi se transformă în formamatură de ARN de 28 S, după ce a pierdut un fragment din moleculă. ARN-ul de 28 S împreună cuARN-ul de 5 S ( de origine nucleară, dar extranucleolară) şi cu proteine formează o particulăribonucleoproteică, care reprezintă subunitatea ribozomală mare (de 60 S). Subunitatea ribozomalămare trece prin porii învelişului nuclear, apărând în citoplasmă la o oră de la debutul sintezei. Celedouă subunităţi ribozomale se ataşează de ARNm, în momentul începerii sintezei de proteine,formând ribozomii. Fibrilele din componenta filamentoasă sunt filamente de ARN de 45 S, iar granulele din componenta granulară sunt subunităţi ribozomale mari.

57



Biogeneza ribozomilor Etape Intervin: RezultatCopierea cistronilor ADNr ARN-polimeraza I Sinteza de ARN 45 SPrelucrarea ARN 45 S Endonucleaza ARN 41 SPrelucrarea ARN 41S Convertaze ARN 20 S

ARN 32 S

Prelucrare ARN 20 S Metilaze ARN 18 SPrelucrare ARN 32 S Metilaze ARN 28 SPrelucrare ARN 18 S Proteine ribozomale Subunitatea ribozomala mica 40 SPrelucrare ARN 28 S Proteine ribozomale Subunitatea ribozomala mare 60 S

Reglarea sintezei de ARNr în nucleol se realizează printr-un mecanism de feed-back.Existeţa unui exces de ribozomii acţionează ca inhibitor al genelor ADN r, care determină sinteza deARNr. Invers, distrugerea ribozomilor va declanşa încetarea inhibiţiei şi creşterea sintezei de ARNr,cu formarea de noi ribozomi.

Transferul de ARN mesager (ARN m), deci a mesajului genetic şi de ARN de transport (ARNt) din nucleu în citoplasmă nu poate avea loc decât în prezenţa unui nucleol funcţional, faptdemonstrat experimental rpin distrugerea selectivă anucleolului cu un fascicul laser. Se crede cănucleolul joacă rolul de staţie intermediară în tranzitul ARN m-ului şi ARN t-ului spre citoplasmă.

Pregătirea şi desfăşurarea mitozei nu pote avea loc fără prezenţa nucleolului în interfază.Distrugerea acestuia produce blocarea celulei în faza G2, care precede mitoza.

4.5.4. Implicarea nucleolului în citopatologie.Aspectul nucleolului poate fi folosit pentru recunoaşterea celulelor canceroase. În celulele

canceroase, nucleolul prezintă modificări de volum,număr şi formă, care sunt o consecinţă amalignizării şi nu cauza acesteia.

Hipertrofia nucleolară apare ca o caracteristică aproape constantă în celulele neoplazice(canceroase),iar creşterea numărului de nucleoli şi neregularităţile de formă sunt relativ frcvente.Hipertrofia nucleolară nu este acompaniată şi de o hipertrofie proporţională a nucleului încât valoarearaportului nucleolo-nuclear este mai ridicat în celulele neoplazice faţă de cele normale (depăşindvaloarea de 1/3). Gradul de hipertrofie a nucleolului reflectă capacitatea proliferativă a celulei fiindproporţional cu gradul de malignitate a tumorii.

Numărul nucleolilor este mai mare în celulele maligne decât în celulele normale, fiind uneoriproporţional cu gradul de malignitate a tumorii. Asfel, în unele adenocarcinoame din ovar, au putut fiobservati 24 nucleoli într-o celulă.

Forma nucleolilor este neregulată în celulele maligne, ea putând varia de la o celulă la alta încadrul aceleiaşi tumori.

5.CITOPLASMA

58



Citoplasma (cytoplasma) reprezintă acea componentă a celulei situată între plasmalemă şinucleolemă. Cuprinde în volumul său : - o matrice citoplamatică ( hialoplasmă sau citoplasmafundamentală) ce corespunde părţii din citoplasmă, care nu este cuprinsă în compartimenteledelimitate de membranele intracelulare; - organite celulare sau intracitoplasmatice (organellaecytoplasmaticae); şi - incluziuni (inclusiones cytoplasmaticae) celulare.

5.1. Matricea citoplasmatică

Matricea citoplasmatică (matrix cytoplasmae) se prezintă ca un mediu intern al celulei în care sunt"găzduite" organitele celulare. O lungă perioadă de timp s-a considerat că matricea citoplasmaticăeste omogenă, nestructurată (amorfă), fapt pentru care a fost denumită hialoplasmă.

Fig.5.1. Ultrastructura citoplasmei1-Membrana celulară; 2-Citoscheletul membranei; 3- Microtubuli; 4-Microtrabecule; 5-

Mitocondrie; 6-Reticul endoplasmic rugos; 7-Polizomi; 8-Fibre de stress;9-Ribozomi.

Ultrastructura citoplasmei

Denumire Componente Ultrastructuri Observatii

59



A.Matriceacitoplasmatica

I.Citoscheletulmatriceal

a.Microfilamenteleb.Microfilamentele intermediarec.Microtrabeculed.Microtubuli

Faza solidă

II. Citosolul Citoplama astructurata Faza fluidă

1.Microfilamentele de actina Contin:actina, tropomiozina,troponinele (T,C,I)

I. Organitelemiscarii celulare

2.Microfilamentele de miozina Contin:molecule de miozina

3.Microtubulii Contin: α si β tubuline,dineină

II. Organiteleenergetice

Mitocondriile Au : membrana externa,membrana interna

cu criste, compartimentextern,matrice mitocondrială

a.Ribozomi Au: subunitate mica de 40S,subunitate mare de 60sB.Organitecitoplasmatice

III. Organitelede sinteza

b.Reticulul endoplasmatic Reticul endoplasmatic rugosReticul endoplsamatic neted

c.Complexul Golgi Compus din: microvezicule,cisterne golgiene si

macroveziculeIV. Organitelede digestie

1.Lizozomi Contin: hidrolaze acide

2.Peroxizomi (glioxizomi) Contin: uratoxidaza sicatalaza

I.Incluziunicu substante

de rezerva

Vezicule delimitatede endomembrane

Conţin : proteine,lipide, glucide,vitamine,

mineraleC.Incluziunicitoplasmatice

II.Incluziunicu produside elaborare

Conţin : granule de zimogen,granule de mucigen,hormoni,etc.

III. Incluziunicu produside dezasimilatie

Pigmenti cromolipoizi lipofuscina, hemofuscina

IV. Incluziuni cupigmenti

1.Pigmenti endogeni

2.Pigmenti exogeni

-carotenoizi, melanici,cu nucleu tetrazolic-praf, pulberi,caroten

La microscopul optic apare astructurată, cu grade diferite de acidofilie sau bazofilie. În celulavie prezintă vâscoelasticitate, apărând mai frecvent cu aspect de gel decât de sol, în funcţie de

echilibrul dinamic dintre procesele de polimerizare şi depolimerizare, echilibru determinat demomentul funcţional al celulei, de condiţiile mediului intracelular si extracelular.

Cu ajutorul microscopiei electronice (de transmisie şi de înalt voltaj) s-a observat, înhialoplasmă, citoscheletul matriceal , format din microfilamente şi microtubuli , precum şi dintr-o reţeade microtrabecule. În acest fel matricea citoplasmatică, prezintă două faze sau componente: -ocomponentă (fază) fluidă,denumită citosol, ce conţine apă, aminoacizi,enzime,electroliţi, ioni şi gaze; -o componentă (fază) solidă, polimerizată, sub forma unei reţele bogată în proteine structurale şi înenzime.(Fig.5.1.)

Matricea citoplasmatică îndeplineşte mai multe roluri: - menţine forma celulei şi o adapteazăla necesităţile funcţionale ale celulei prin componentele citoscheletului; - este sediul de desfăşurare aunor procese metabolice, precum glicoliza, gluconeogeneza, glicogenoliza, glicogenogeneza,biosinteza acizilor graşi, a nucleotidelor, etc.; - conţine sau depozitează glicogen (în ficat şi muşchi),lipide (în corticosuprarenală), ioni, pigmenţi, ribozomi liberi, 15% din ARN-ul celular (sub formă de

ARN mesager şi ARN de transport); adăposteşte organitele celulare şi incluziunile citoplasmatice.Organitele citoplasmatice au diferite mărimi, unele de ordinul micrometrilor, fiind observabile

la microscopul optic (complexul Golgi, mitocondriile, centrul celular,ergastoplasma) iar altele sunt mai

60



mici, de ordinul nanometrilor, putând fii observate numai la microscopul electronic (ribozomii,lizozomii, peroxizomii, reticulul endoplasmic neted şi rugos, microtubulii şi microfilamentele). Uneleorganite sunt delimitate de membrane (complexul Golgi, mitocondriile, peroxozomii, lizozomii, reticululendoplasmic), în timp ce altele sunt lipsite de membrane (ribozomii, centriolii, microtubulii şimicrofilamentele).

Organitele delimitate conţin în structura membranelor unele enzime caracteristice, denumite

enzime marker , ce pot fi evidenţiate prin metode histochimice. De exemplu, mitocondria secaracterizează prin prezenţa monoaminoxidazei, citocromoxidazei şi a enzimelor ciclului Krebs.Lizozomii au ca enzime marker fosfataza acidă şi aril sulfataza, peroxizomii au catalaza şi urat oxidaza, iar reticulul endoplasmic glucozo-6-fosfataza.

Membranele ce aparţin reticulului endoplasmic, complexului Golgi şi învelişului nuclear se află în continuitate structurală şi funcţională, formând un sistem al endomembranelor. Acest sistem poatestabili conexiuni temporare cu unele organite ca mitocondriile, peroxizomii, unele vacuole şi cumembrana periferică.

Organitele celulare îndeplinesc diferite funcţii: 1- mişcarea intracelulară (microfilamentele,microtubulii, centriolii); 2- deplasarea celulei în mediu extracelular (cilii şi flagelul); 3- producerea deenergie (mitocondriile); 4-digestia intracelululară (lizozomii, peroxizomii); 5-dezintoxicare (reticululendoplasmic neted, peroxizomii); 6- sinteza de molecule necesare celulei sau destinate exportului(ribozomii, reticulul endoplasmic rugos şi neted, compexul Golgi); 7- unele funcţii speciale în celulele

musculare (miofilamentele), în celulele epiteliale (tonofilamentele), în celulele nervoase(neurofilamentele) şi nevroglice (gliofilamentele).

5.2.Citoscheletul

Citoscleletul (cytoskeleton) este o reţea în spaţiu (tridimensională) de filamente proteice şimicrotubuli care străbat întreaga matrice citoplasmatică, întretăindu-se în toate direcţiile.

Citoscheletul îndeplineşte funcţii variate: - menţine forma celulei şi o adaptează la necesităţilefuncţionale; - participă la realizarea mişcărilor celulei; - ia parte la formarea citoscheletuluimembranei;- interacţionează cu nucleul şi cu organitele celulare (mitocondriile,veziculele sinaptice),participând la menţinerea lor în poziţie şi la deplasarea lor în celulă (mitocondriile şi lizozomiiefectuând o mişcare saltatorie); - interacţionează cu macromoleculele din citosol, evidenţiindu-seenzime glicolitice legate de filamentele de actină; - participă la transportul proteinelor în lungul

axonului.Citoscheletul se modifică în celulele maligne. Astfel, fibroblastele transformate malign îşi pierd fibrele de stress din citoschelet şi devin sferice.

În compunerea citoscheletului intră microfilamentele, microtubulii, microfilamenteleintermediare şi microtrabeculele.

5.2.1. Microfilamentele şi microtubulii

Microfilamentele (microfilamentum, a) sunt componente ale citoscheletului, prezente încitoplasma tuturor celulelor, apărând mai abundente în celulele care prezintă mişcări de deplasare înţesuturi sau mişcări active intracitoplasmatice. Au lungimi variate şi un diametru de 5-7 nm, putândapare izolate sau grupate. Sunt orientate pe direcţii diferite şi formate din molecule proteice, înspecial din actină şi miozină, asemănătoare celor din celulele musculare.

Microtubulii(microtubulus,i)

sunt componente ale citoscheletului cu aspect cilindric, cudiametrul cuprins între 20-30 nm, formaţi prin polimerizarea unor molecule proteice, denumitetubuline. Pot apare grupaţi sau izolaţi.

Microfilamentele şi microtubulii sunt ultrastructuri cu caracter dinamic, deoarece procesele depolimerizare şi depolimerizare se desfăşoară concomitent şi continuu. Ele se asamblează şidezasamblează rapid în celulă, în citoplasmă existând un depozit permanent de monomeri de actinăşi de dimeri de tubulină.

Microtubulii şi microfilamentele prezintă polaritate, încât polimerizarea şi depolimerizarea sedesfăşoară cu viteze diferite la cele două extremităţi. La extremitatea pozitivă (notată cu +), vitezapolimerizării este mult mai mare decât cea a depolimerizării, încât microfilamentul sau microtubulul sealungeşte. La extremitatea negativă (notată cu -), viteza de depolimerizare este mai mare,determinând scurtarea. Pentru o anumită concentraţie de monomeri liberi în citosol, microfilamentulsau microtubulul se află într-o stare de echilibru, în care la extremitatea negativă se pierd molecule,iar la extremitatea pozitivă se ataşează molecule. În acest fel, un grup de molecule ataşate la capătulpozitiv (+), se deplasează de-a lungul filamentului sau microtubulului, de la extremitatea pozitivă spreextremitatea negativă. (Fig.5.2.)

61



În cazul când se protejează capătul negativ (-) şi se împiedică depolimerizarea, se producecreşterea în lungime. Din acest motiv, microtubulii liberi au capătul negativ inserat în centrul celular sau în corpusculii bazali.

Fig.5.2.

Polilerizarea şi depolimerizarea microtubulului.

Dinamismul citosheletului este influenţat foarte mult de cationii bivalenţi. Astfel, modificareaconcentraţiei ionilor de calciu ( Ca2+ ) induce polimerizarea sau depolimerizarea microtubulilor şi reglează interacţiunile dintre actină şi miozină. Ionul de calciu îşi exercită efectele sale prinintermediul unor proteine ce leagă calciul, ca de exemplul calmodulina, o proteină formată din 148 aminoacizi, cu secvenţe de aminoacizi asemănătoare cu troponina C . Calmodulina a fost detectată întoate celulele animale şi vegetale, încât este considerată a fi un receptor intracelular pentru calciu.

De asemenea unele proteine ca profilina,vilina, gelsolina, filamina, alfa-actinina, fibrina,miozina influenţează polimerizarea şi depolimerizarea microfilamentelor de actină. În polimerizarea şi depolimerizarea microtubulilor intervin proteinele tau ( τ ) şi proteinele asociate microtubulilor.

Un alt factor care modulează dinamismul citoscheletului îl reprezintă nucleotidele. Astfel,

adenozin monofosfatul ciclic (AMPc) favorizează polimerizarea citoscheletului şi determinăaglomerarea microfilamentelor şi a microtubulilor, modificând forma şi mobilitatea celulelor.

5.2.2.Microfilementele intermediareMicrofilamentele intermediare au fost descrise şi investigate intens după anul 1978. Sunt

denumite astfel, deoarece au diametrul de 10 nm, cuprins între cel al microfilamentelor de actină (6nm) şi cel al microtubulilor (25 nm).

La microscopul electronic apar sub forma unor filamente rectilinii sau uşor curbate, prezente în endoplasmă, la periferia celulei (în desmozomi sau în prelungiri). Sunt structuri mult mai stabiledecât filamentele de actină şi decât microtubulii, încât odată asamblate nu se mai depoliomerizează.

Sunt formate din molecule filiforme de proteine. Polimerizarea lor se face prin alăturarea şi împletirea monomerilor, ca într-o frâghie şi nu prin înşiruirea monomerilor. Rezultă astfel, structurirezistente, ce pot fi întărite la nevoie şi prin legături covalente între subunităţi. Proteinele ce

alcătuiesc filamentele intermediare variază după tipul de celulă în care apar şi după specie. Încompoziţia unui filament intermediar pot intra mai multe polipeptide diferite, cu greutăţi moleculare cevariază în limite largi.

În funcţie de proteinele componenete, există următoarele tipuri de filamente intermediare: -filamentele de cheratină sau tonofilamentele, caracteristice pentru celula epitelială, formate dinproteine (citokeratine) asemănătoare keratinei din păr şi ongloane; -neurofilamentele, caracteristiceneuronului, prin asociere cu microtubulii strucutrează neurofibrilele ce au un diametru de 1-2 µm; -filamentele de vimentină, caracteristice celulelor de origine mezodermică (fibroblaste, condroblaste,

macrofage, celule endoteliale, leiocite, astrocite, celulele Sertoli).(Fig.5.3.)

62



Fig.5.3. TonofilamenteleA-Aspect la microscopul optic; B-Aspect la electronomicroscop:1-Material fibrilar; 2-Material granular.

Aplicaţii medicale. Identificarea tipului de filament intermediar cu ajutorul anticorpilor monoclonali, marcaţi prin fluorescenţă sau cuplaţi cu o enzimă capabilă să coloreze, permite

diagnosticarea tumorilor maligne, deoarece: carcinoamele au filamente de cheratină, sarcoamele devimentină, iar rabdomiosarcoamele de desmină. Glioamele au filamente gliale, iar neuroblastoameleau neurofilamente.

5.2.3.Microtrabeculele.

Microtrabeculele au fost descrise în celule examinate prin microscopie electronică de voltajsupraînalt, la măriri de 300.000 ori. Sunt structuri fibrilare mai subţiri de 4-6 nm, decâtmicrofilamentele.

Microtrabeculele formează o reţea ce străbate întreaga citoplasmă, înterconectândmicrofilamentele,microtubulii, practic toate componentele subcelulare prezente în celula animală. Potfi considerate ca fiind expresia fenomenului de gelificare, deşi uneori se contestă realitatea lor biologică, fiind considerate un artefact.

Microtrabeculele menţin poziţia în spaţiul intracelular a citoscheletului şi organitelor,fiindconsiderate suportul matricii biostructurate. De reţeaua microtrabeculară se leagă enzimele dincitosol, asigurându-se trecerea substratului de la o enzimă la alta în mod coordonat. În ochiurilereţelei se găseşte apă şi ioni , încât microtrabeculele protejează celula în cazul fluctuaţilor conţinutului în apă. Atunci când apa pătrunde în celulă, spaţiile se dilată, în timp ce în cazul deshidratării celulei,spaţiile se contractă. Un alt rol al reţelei de microtrabecule constp în mişcarea intracelulară agranulelor de pigment.

5.3.Organitele mişcării celulare

Organitele mişcării celulare sunt: -microfilamentele de actină, microfilamentele de miozină şimicrotubulii.

5.3.1.Microfilamentele de actinăMicrofilamentele de actină sunt formate din molecule de actină şi au diametrul de 6 nm. La

eucariote, actina ocupă 10% din totalul proteinelor din celulele nemusculare. În citoplasmă, moleculele de actină se pot găsi fie sub formă monomerică ( actină globulară

sau actină G), fie sub formă polimerizată, filamentoasă ( actină filamentoasă sau actină F).Microfilamentele de actină (denumite, pe scurt , filamente) se formează prin polimerizarea

actinei globulare. Un filament cuprinde două lanţuri de actină înfăşurate unul în jurul celuilalt,formând dublu helix răsucit spre dreapta având pasul spiralei de 70-80 nm.Fiecare moleculă de actinădin microfilament este capabilă să lege câte un cap al moleculei de miozină.

În celulele eucariote, cu excepţia celulelor musculare, microfilementele se pot găsi izolate saugrupate în mănunchuri, dispuse la periferia citoplasmei, imediat sub plasmalemă, formând fibrele destress în cazul celulelor în culturi sau intând în structura inelelor contractile. Inelul contractil poate fi: -tranzitoriu

, când apare în telofaza diviziunii celulare indirecte, producând strangularea citoplasmei şisepararea celulelor fiice; - permanent , ca de exemplu în zona apicală a celulelor epiteliale, undeformează dezmozomul în bandă. Mănunchiuri de filamente de actină există şi în microvili, înstereocili, în prelungirile filiforme temporare ale celulelor din culturi.

În alte tipuri de celule decât cele musculare, microfilamentele de actină îndeplinesc atât unrol structural sau de susţinere, formând suportul prelungirilor (al microvililor, cât şi un rol dinamic înrealizarea mişcărilor bazate pe mecanismul actină-miozină.

Există un echilibru dinamic între filamentele de actină şi monomerii de actină din citoplasmă, între polimerizare şi depolimerizarea actinei, echilibru ce joacă un rol esenţial în mişcările celulare.Polimerizarea actinei este însoţită de o creştere a vâscozităţii citoplasmei, iar depolimerizarea seasociază cu scăderea vâscozităţii.Ambele procese joacă un rol principal în trecerea de la starea degel la cea de sol a citoplasmei.

Polimerizarea actinei este inhibată de unele substanţe (citocalazine) secretate demucegaiuri, producându-se oprirea mişcării de locomoţie ameboidală.

În celulele musculare, moleculele de actină împreună cu proteinele reglatoare formeazămiofilamentele subţiri (miofilamentum tenue) din sarcomere. Astfel, pe toată lungimea miofilamentului

63



de actină se găseşte o proteină tropomiozina, pe care se înşiră 7 monomeri de actină.Tropomiozina are atât un rol structural, întărind flilamentul subţire, cât şi un rol funcţional înrealizarea contracţiei. Din loc în loc, de-a lungul filamentului de actină se găseşte o altă proteină,troponina, care este un complex de trei polipetide - troponinele T,I şi C.Troponina T este strânsataşată de tropomiozină, troponina C leagă ionii de calciu, iar troponina I inhibă interacţiunea actină-miozină. Tropomiozina are atât un rol structural, participând la structurarea filamentului subţire, cât şi

un rol funcţional mediind reglarea contracţiei. (Fig.5.4).Filamentele subţiri se găsesc numai în miofibrilele din muşchii scheletici şi muşchiul cardiacunde sunt dispuse ordonat, paralel cu filamentele groase de miozină.

Şi în alte tipuri de celule decât cele musculare au fost evidenţiate proteine reglatoare aleinteracţiunii actină-miozină,asemănătoare tropomiozinei, dar acestea sunt mai scurte, permiţândataşarea a numai 6 monomeri de actină, în loc de 7 cum apare în celulele musculare. În celulelenemusculare, nu a fost bine precizată existenţa troponinelor T şi I, dar au fost identificate proteinereglatoare, asemănăotare troponinei C, carer leagă ionii de calciu şi au fost denumite proteinemodulatorii sau calmoduline.

În afara proteinelor reglatoare amintite (tropomiozina,troponinele şi calmodulina), încelule se mai pot găsi şi alte proteine reglatoare ce se leagă de actină, ca: -filamina, prezentă mai abundent în leiocite; -spectrina, ce se găseşte în citoscheletul membranei celulare.

64



Fig.5.4. Organizarea moleculară a filamentului subţire de actină

5.3.2.Microfilamentele de miozină

65



Formate prin polimerizarea proteinelor denumite miozine, miofilamentele de miozină au undiametru de 10 nm. Miozinele se găsesc în cantitate mai mică decât actinele în toate celuleleeucariote, cu excepţia celulelor musculare.

Fig.5.5. Moleculele demiozină şi formarea

filamentului gros.1-Coadă; 2-Cap; 3-Puntetransversală.

Molecula de miozină areaspectul unui bastonaş lung(160 nm/2nm) şi subţire(coada),prevăzut la una dinextremităţi cu o regiuneglobulară (capul ). Capulmoleculei de miozină(4-5nm/15-20 nm) este bipartit (iar molecula este bicefală), fiind

alcătuit din două subunităţisau lobi . Polimerizarea seproduce prin agregareacozilor moleculelor demiozină, în timp ce capetelerămân la exterior. În acest fel,mio- filamentul de miozinăprezintă o zonă "nudă"(netedă) la mijloc, unde segăsesc cozile şi două zonemai groase la extremităţi încare proemină de jur împrejurul filamentului

capetele globulare alemiozinelor.(fig.5.5.) În alte celule decât cele

musculare, filamentele demiozină sunt agregate mici,labile greu observabile,

formate prin polimerizarea a 10-20 molecule. În celulele musculare, polimerizează câteva sute de molecule de miozină (200-500 ), formând

miofilamente groase (myofilamentum crassum) cu diametrul de 10-20 nm, ce se dispun paralel cufilamentele subţiri de actină.Miofilamentele sunt dispuse într-o reţea hexagonală, la un miofilamentgros revenind 6 miofilamente subţiri.

66



Fig.5.6. Reprezentarea schematică a moleculei de miozinăLMM - L meromiozină; HMM - H meromiozină; S1 - Subfragmentul 1;S2 - Subfragmentul 2.

Alcătuirea moleculei de miozină cuprinde două lanţuri polipeptidice grele, fiecare cu greutatede cca. 200 kilodaltoni şi patru lanţuri uşoare cu greutăţi de 15-20 kilodaltoni. Lanţurile grele se întindpe toată lungimea moleculei, în timp ce lanţurile uşoare sunt localizate la capul moleculei de miozină,câte două pentru fiecare lob. Fiecare lanţ greu are două porţiuni: - o porţiune alungită alfa -helicoidală (coada) şi un cap globular. Porţiunile alungite ale lanţurilor grele sunt răsucite în spirală,pe cândcapetele globulare rămân separate. De fiecare cap sau lob se leagă câte o pereche de lanţuriuşoare.

Pentru studierea alcătuirii moleculei de miozină s-a efectuat proteoliza moleculei cu ajutorultripsinei. Din molecula de miozină se formează două fragmente, denumite meromiozine: - omeromiozină uşoară, L meromiozina (de la light = uşor în engleză) şi o meromiozină grea, H -meromiozina (de la heavy = greu).

L meromiozina (LMM) are aspectul unui bastonaş cu lungimea de 80 nm şi grosimea de 2nm, este lipsită de activitate ATP-azică şi nu interacţionează cu actina.

H meromiozina (HMM) are o porţiune lineară de 60 nm, care se termină cu o porţiuneglobulară de 20/5 nm. Sub acţiunea papainei, HMM poate fi scindată în două subunităţi,subfragmentul 1 şi subfragmentul 2.

Subfragmentul 1(S -1) are o greutate de 120 KD şi corespunde porţiunii globulare a Hmeromiozinei, prezintă activitate ATP-azică şi poate interacţiona cu actina.

Subfragmentul 2 (S - 2) are o greutate mileculară de 60 KD, îi lipseşte activitatea ATP-azicăşi capacitaea de a interacţiona cu actina.

În întregul ei, porţiunea liniară a moleculei de miozină este formată din L meromiozină şisubfragmentul 2 al H meromiozinei, iar capul moleculei de miozină este reprezentat de subfragmentul1 al H meromiozinei.

5.3.2.1.Funcţiile microfilamentelor de actină şi miozină.

Microfilamentele de actină şi miozină sunt implicate atât în mişcările celulare de locomoţie(deplasarea fibroblastelor în culturi, mişcarea ameboidală prin emiterea de pseudopode, mişcărilemorfogenetice din embrion), cât şi în mişcările intracitoplasmatice (migrarea granulelor de secreţie, a

67



granulelor pigmentare, deplasarea organitelor celulare, mobilitatea microvililor). Participareamicrofilamentelor în aceste fenomene celulare este influenţată de concentraţia în citosol a ionilor decalciu, a moleculeor de ATP şi de AMP-ciclic, de ph, etc.

În celulele musculare, actina şi miozina intră în alcătuirea unor ultrastructuri stabile, denumitemicrofilamente sau miofilamente (myofilamentum) de actină şi de miozină. Miofilamentele se dispunordonat, în sensul lungimii, paralele între ele şi formează miofibrilele, cu un diametru de 1-2 µm. Un

miofilament de actină este alcătuit din 600 molecule de actină, în timp ce un miofilament de miozinăconţine numai 200 molecule de miozină.Cea mai precisă organizare şi dispunerea a moleculeor de actină şi miozină se întâlneşte în

miofilamentele şi miofibrilele muşchiului striat (scheletic şi cardiac), care sunt orientate paralel cu axulmare al fibrei musculare. (Fig.5.7.) În rabdocit (fibra musculară scheletică) există cca. 1000miofibrile ,dispuse în pachete longitudinale (colonete Leydig), ce apar pe secţiune transversală subforma unor grupări de 30-50 miofibrile ( câmpurile Cohnheim).

La microscopul optic, miofibrilele apar striate,prezentând o succesiune alternantă de benzisau discuri. O bandă A (stria A), denumită şi disc întunecat, de 1,5 nm, anizotropă (discusanizotropicus) în lumină polarizată, întunecată în contrast de fază, mai intens colorabilă, alterneazăcu o bandă clară (stria I) de 0.8 nm, izotropă (discus isotropicus) în lumină polarizată, clară încontrast de fază, mai slab colorabilă.

Fig.5.7.Organizarea dispozitivului contractil în fibra musculară striată

Discul întunecat (banda A) este transversat prin mijlocul lui de zonă clară (zona lucida s.

stria H) care este străbătută de o linie întunecată, numită linia M (linea M) sau mesofragmă(mesophragma).

68



Discul clar (banda I) este şi el traversat de o linie intunecată, denumită linia Z (linea Z),telofragmă (telophragma) sau stria AMICI, ce se prelungeşte transversal, de o parte şi de alta, întoate miofibrilele dintr-un rabdocit. În unele fibre musculare mai intens solicitate, discurile clare (I) potfi traversate, în plus, şi de o fina linie accesorie, linia N.

Între două telofragme (strii Amici sau linii Z) sucesive se delimitează un sarcomer sau unmiomer (myomerrum), care reprezintă unitatea fundamentală de structură şi funcţie a miofibrilei. Un

sarcomer are o lungime de 2,5 µm şi cuprinde un disc întunecat ( o bandă A) şi cele două jumătăţide benzi clare (I) adiacente. Într-o mifobrilă se găsesc câteva zeci de mii de sarcomere aşezate capla cap. De exemplu, într-un rabdocit cu lungimea de 5 cm sunt 20.000 de sarcomere, încât 20.000 x2,5 µm = 50.000 = 5 cm.

Fig.5.8. Organizarea ultrastructurilor din banda M

a.Secţiune transversalăb. Reprezentare tridimensionala, FG-filament gros de miozină;FM-filamente M alecitoscheletului endosarcometric enodsarcomeric; PM-punţi M

Ultrastructura sarcomerului a fost investigată prin studii de microscopie electronică încă dinanul 1953, reprezentând primele aplicaţii ale electronomicroscopiei în biologie. S-a constatat căfilamentele groase, de miozină (cu diametrul de 15 nm şi lungimea de 1,6 nm) sunt dispuse înmijlocul sarcomerului în zona ocupată de discul întunecat ( banda A) în timp ce la nivelul discului clar (banda I) se găsesc numai filamente subţiri, de actină (cu diametrul de 6 nm şi lungimea de 1nm),care pornesc de o parte şi de alta a benzii Z şi pătrund în discul întunecat (A) până în apropiereazonei H, în care se găsesc numai filamente groase. În restul discului întunecat (A) se produce ointerdigitare a filamentelor groase şi subţiri, încât pe o secţiune transversală la acest nivel, ficarefilament gros are în jurul său 6 filamente subţiri, realizându-se un model hexagonal. (Fig.5.8.)

Pe suprafaţa filamentelor groase proemină capetele moleculelor de miozină sub forma unor punţi transversale. Pe imaginile electronomicroscopice,punţile transversale apar ca proeminenţe laterale,perpendiculare pe axa filamentelor groase, extinse sprefilamentele subţiri pe care tind să le atingă. S-au numărat200-220 punţi transversale pentru un filament gros, dispuseregulat urmând un traiect spiralat de-a lungul filamentului.Punţile transversale conţin HMM (H meromiozină) ce areactivitate ATP-azică şi interacţionează cu actina.(Fig.5.9)

Fig.5.9. Dispunerea punţilor transversale la

nivelul filamentului

69



5.3.2.2. Mişcări celulare bazate pe sistemul actină-miozină

Pe baza sistemului molecular actină-miozină se realizaeză mai multe categorii de mişcăricelulare: -mişcările din timpul contracţiei musculare; -mişcarea de locomoţie ameboidală; - mişcăriledin microvili; şi curenţii citoplasmatici.

Interacţiunile actină-miozină se desfăşoară după acelaşi mecanism molecular atât în celulele

musculare, cât şi în cele nemusculare: Ele se stabilesc între filamentele subţiri de actină şi capeteglobulare ale moleculelor de miozină din punţile tranversale. Mişcarea se produce prin alunecareafilamentelor de actină şi miozină, unul peste altul. Pentru aceasta se desface puntea dintre miozină şiactină şi se restabileşte puntea cu monomerul următor din filamentul de actină, antrenând deplasareafilamentului. Energia necesară este furnizată de hidroliza ATP-ului, iar deplasarea se face dupămecaniosmul "roţii cu clicheţi" de la ceasornicele mecanice.Relaxarea se produce prin desfacereasimultană a tuturor punţilor dintre filamentele de actină şi miozină, ceea ce permite glisareafilamentelor.(fig.5.10).

Fig.5.10. Schema modului de acţiune a punţilor transversale.a-În relaxare; b-La începutul contracţiei; c-detaşareade filamentul de actină;d-Reataşarea pe monomerul următor de actină;1,2,3,4,5,6,7-Monomeri de actină.

5.3.2.2.1. Contracţia fibrelor musculare striate

Contracţia musculară reprezintă forma cea maiperfecţionată de mişcare bazată pe sistemul actină-miozină. Se produce prin alunecarea (glisarea)filamentelor de actină printre cele de miozină, fără a semodifica lungimile lor. Mecanismul glisării a fost propusde HUXLEY în 1954 şi apoi demonstrat experimental.Ca rezultat al glisării se scurtează lungimeasarcomerului, iar prin însumarea scurtării tuturor sarcomerelor se ajunge la scurtarea fibrei musculare în întregul ei. De exemplu, o scurtare a sarcomeruluide la 2,5 la 2 µm (deci cu 20%), însumată pentru20.000de sarcomere produce o scurtare de la 5 cm la4 cm. În timpul contracţiei, discul întunecat (banda A)nu se modifică, scurtându-se doar discul clar (banda I)(fig.5.11.)

70



Fig.5.11. Aspectul sarcomeruluia-în muşchiul contractat; b- în muşchiul relaxat; c-în muşchiul întins.

Glisarea se datorează faptului că fiecare cap al moleculelor de miozină "păşeşte" în lungulfilamentului de actină, de pe un monomer pe următorul "trăgând" filamentul de actină pas cu pas.

Contracţia muşchiului scheletic se declanşează în momentul în care excitarea nervului motor al muşchiului determină apariţia unui potenţial de acţiune în sarcolemă ( plasmalema fibrei musculare

striate), la nivelul joncţiunii neuromusculare. Semnalul electric se transmite rapid în jurul fiecăreimiofibrile prin tubii transverşi (T) ce se întind de la sarcolemă la miofibrilă. În acest fel, semnalulelectric ajunge la reticulul sarcoplamic ( o formă specifică a reticulului endoplasmic în fibramusculară), producând eliberarea din cisternele reticulului în citosol, a unei cantităţi mari de ioni decalciu ( Ca2+), ce se află stocaţi în lumenul cisternelor. Creşterea bruscă a concentraţiei de ioni decalciu declanşează contracţia miofibrilei, datorită efectului pe care Ca2+ îl produc asupra troponinei şitropomiozinei, proteine asociate cu actina în filamentul subţire. În repaus, tropomiozina se interpune între actină şi capul miozinei, blocând interacţiunea dintre ele. Troponina C leagă ionul de calciu şiprin aceasta modifică poziţia tropomiozinei, făcând posibilă interacţiunea actinei cu miozina.(Fig.5.12).

Fig.5.12. Relaţiile actină- miozină- tropomiozină

a - în repaus; b- în activitate;1- miozina; 2- actina; 3 – tropomiozina

71



În momentul în care capul miozinei atinge actina este eliberat ADP şi gruparea fostfat, ceiace determină o flexare a capului miozinei care trage de filamentul de actină, rezultând glisareafilamentului şi contracţia musculară. După acest moment, de capul miozinei se leagă o moleculă deATP, producându-se desprinderea miozinei de actină.Miozina hidrolizează ATP-ul în ADP şi grupareafosfat, iar capul miozinei îşi recapătă conformaţia iniţială, după capul se repetă.

Mişcările de "păşire" a capetelor de miozină (din filamentele groase) în lungul filamentelor

subţiri (de actină) sunt efectuate de către fiecare moleculă şi de către fiecare lob al capului. În acestfel, într-un muşchi în contracţie, la un moment dat există capete ale moleculelor de miozină care suntataşate de actină, iar altele sunt detaşate. Într-o contracţie rapidă, fiecare din cele 500 capete demiozină ale unui filament gros parcurge ciclul de 5 ori într-o secundă.

După terminarea contracţiei, ionii de calciu sunt recaptaţi în cisternele reticululuisarcoplasmic printr-o enzimă (Ca2+ - ATP - ază), ceea ce produce relaxarea muşchiului.

Pe lângă actină şi miozină, în miofibrile se mai găsesc proteine accesorii cu rolstructural.Astfel, în stria Z, se găsesc proteine (α-actina şi desmina) ce ancorează filamentele de actină şialiniază miofibrilele adiacente, asigurând contracţia sincronizată a miofibrilelor. Alte proteine accesorii îndeplinesc un rol funcţional mediind efectul pe care Ca2+ îl are în contracţia musculară.

În muşchiul cardiac, filamentele de actină şi miozină prezintă o dispunere asemănătoare cudin muşchiul scheletic, fiind evidente striaţiile.

Muşchiul neted este lipsit de striaţii, iar filamentele de miozină şi de actină nu formează

miofibrile, nefiind dispuse strict ordonat ca în muşchii striaţi, deşi, în general, sunt orintate paralel cuaxul lung al celulei. Miozina din celulele musculare netede (leiocite) se deosebeşte de cea din fibrelemusculare striate (rabdocite) prin două caractere:1-activitatea ATP-azică este de zece ori mai mică, fiind mult mai direct legată de ionii de calciu; 2- înleiocite, miozina poate interacţiona cu actina numai dacă lanţuriile uşoare sunt fosforilate.

Fig.5.14. Diagrama activării kinazei1-Calmodulina; 2-Ioni de calciu; 3-Complexul Ca2+ - calmodulină; 4- Kinază inactivă;5-Kinază activată.

Fosforilarea şi defosforilarea lanţurilor uşoare ale miozinei din leiocit sunt efectuate deenzime specifice. Astfel. enzima de fosforilare se numeşte kinaza lanţurilor uşoare şi este activată decomplexul Ca2+- calmodulină. Kinaza activată fosforilează lanţurile uşoare din molecula de miozină,

permiţând interacţiunea cu actina. (Fig.5.14.)Kinaza miozinei poate fi activată de influxul de Ca2+, rezultat în urma excitării sistemuluineurovegetativ, dar şi prin AMP-ul cicclic al cărui nivel în celulă este legat de hormoni. În acest felcontracţia muşchiului neted poate fi produsă prin acţiune nervoasă sau hormonală. Contracţiamuşchiului neted este mai lentă deoarece şi activarea miozinei prin sistemul calmodulinei este lentă. În muşchiul striat, unde se realizează o contracţie rapidă este prezentă o formă specializată acalmodulinei, troponina C.

În toate celulele nemusculare, miozina se aseamănă cu cea din muşchiul neted prin faptulcă activarea ei (dobândirea capacităţii de a se lega de actină) depinde de fosforilarea lanţurilor uşoare. care la rândul ei este stimulată de complexul Ca2+-calmodulină.Fosforilarea induceasamblarea miozinei în agregate mici bipolare, formate din 10-20 molecule de miozină, legate princozile lor. Aceste agregate pot produce deplasarea filamentelor de actină prin mecanismulinteracţiunii actină-miozină. Contracţia complexului acto-miozinic produce trecerea citoplasmei în

starea de gel, iar relaxarea determină trecerea în stare fluidă, cum se întâmplă în mişcareaameboidală şi în motilitatea microvililor. (Fig.5.15.)

72



Fig.5.15. Agregarea miozinei în celulele nemusculare.1-Molecule de miozină;2-Agregate moleculare.

Alte mişcări bazate pe sistemul actină-miozină sunt mişcarea ameboidală, mişcările din

microvili şi curenţii citoplasmatici.

5.3.2.2.2. Mişcarea de locomoţie ameboidală

Mişcarea de locomoţie ameboidală prezintă o importanţă deosebită pentru organisme,deoarece prin acest mecanism leucocitele ies din vasele sanguine şi se deplasează la locul infecţiilor,iar fibroblastele se deplasează pe suprafaţa rănilor depunând colagen, cu rol în formarea cicatricei.

73



Fig.5.16.Mişcarea ameboidală a fibroblastelor.1-Nucleu; 2-Coadă; 3-Ondulaţii de suprafaţă; 4-Microvârfuri; 5-Lamelipode;

6-Plăci de adeziune; 7,8-Extensie; 9-Adeziune; 10-Contracţie.

În cazul animalelor domestice, emiterea de pseudopode mici se întâlneşte la deplasarealeucocitelor, care se face lent. Fibroblastul emite pe direcţia mişcării prelungiri lăţite, lamelipode, careformează o muchie de înaintare. Procesul de emitere a acestor prelungiri este continuu, uneleprelungiri aderând la substrat prin una din feţele lor cu plăci de adeziune, în timp ce alte prelungiri,desprinse de pe faţa opusă, se reîntorc spre corpul celulei, formând ondulaţii de suprafaţă. Pemăsură ce are loc înaintarea celulei, rămâne o coadă în interiorul căreia se găsesc fibre de retracţie,iar din această coadă se desprind fragmente pe care celula le lasă în urmă. La mişcareafibroblastelor se produc treceri succesive şi reversibile ale citoplasmei din starea de gel în cea de sol,ajungându-se la o viteză de 40 nm/oră.

Mişcarea ameboidală nu se face la întâmplare, fibroblastele manifestând o preferinţă pentrusuprafeţele pe care pot adera. Este posibil ca prelungirile subţiri, ţepii observaţi pe lamelipode săacţioneze ca nişte antene de exploatare a suprafeţei. Forma suprafeţei influenţează mişcareaameboidală, fibroblastele migrând pe direcţia curburii minime ( în sensul lungimii cilindrului de sticlă).(Fig.5.16)

Emiterea pseudopodelor şi deplasarea celulei se face spre un stimul chimic, fenomencunoscut sub denumirea de chemotactism.S-a dovedit că leucocitele sunt atrase de molecule"atractante" eliberate în focarul inflamator. Aceste molecule produc metilarea unor grupări carboxil dinproteinele din membrană. Dacă metilarea este blocată, chemotactismul este inhibat.

5.3.2.2.3. Mişcările din microvili

În alcătuirea unui microvil (microvillus) există filamente de actină (cca.40), dispuselongitudinal şi paralele între ele, având toate aceeaşi polaritate. O extremitate a filamentelor ajunge alvârful microvilului, într-o regiune amorfă, cu o compoziţie chimică insuficient precizată, ce ancoreazăfilamentele de membrană. Extremitatea opusă ajunge la polul bazal al microvilului, terminându-se într-o reţea perpendiculară de filamente de actină, denumită buton terminal , ce conţine şi miozină,având rolul de a menţine în poziţie microvilul. Mănunchiul de filamente din microvil este legat, din loc în loc, între ele şi cu plasmalema prin fimbrină, ce realizează o "scară " în spirală în lungulmicrovilului. (Fig.5.16.)

74



Fig.5.16.Diagrama ultrastructurii microvililor

Polaritatea filamentelor de actină din microvil este similară cu a filamentelor subţiri dinsarcomer, producând scurtarea ritmică a microvililor şi împingerea substanţelor absorbite spreinteriorul celulei. (Fig.5.18.)

Fig.5.19.Polaritatea filamentelor de actinăA - în microvilB în sarcomer

5.3.2.2.4. Curenţii citoplasmatici

Curenţii citoplasmatici sunt mişcări ce realizează o deplasarea organitelor şi componenetelor în interiorul celulei. Se manifestă sub formă de: 1 - scurgere acitoplasmei fluidifiate în prelungirile celulere în timpul mişcării ameboidale; 2 - mişcare saltatorie a

organitelor, în care pe filamentele de actină situate la periferia celulei se deplaseazăfilamente de miozină pe care sunt ancorate organite celulare; 3 -cicloza, o mişcare în jurul nucleului,vizibilă în celule vegetale sau în algele verzi unicelulare.

Curenţii citoplasmatici sunt caracteristici celulelor eucariote vii, dispărând odată cu moarteaacestora. Transportul axoplasmatic din neuroni reprezintă o formă specializată de curenţicitoplasmatici în care intervin microtubulii.

5.3.3. Microtubulii şi mişcările bazate pe sistemul

microtubul - dineină

5.3.3.1. Microtubulii

75



Microtubulii (microtubulus, i) sunt formaţiuni rectiliniii cu lungimi variabile (până la câţiva micrometri) şi cu un diametru mediu de 25 nm. Pot apare grupaţi sau singulari în citoplasmă.Peretele microtubulului este format din 13 şiruri lineare, drepte sau spiralate, formate din moleculeproteice globulare, cu diametru de 5nm, cu o greutate moleculară de 50-60 Kdal., denumite tubuline.

Tubulinele polimerizează rezultând dimeri de tubulină, alcătuiţi dintr-o alfa-tubulină şi o beta-

tubulină, legate prin interacţiuni necovalente şi dispuse alternant în peretele microtubulului. În peretele microtubulilor, dimerii de tubuline formează protofilamente sau protofibrile( protofibrila) cu diametrul de 5 nm. În protofibrile, dimerii formează se dispun în aşa fel, încât alfa-tubulina de la un dimer de leagă de beta-tubulina de la de la dimerul din rândul vecin. Protofibrilele, în număr de 13 se dispun sub forma unui cilindru, structurând un microtubul cu diametrul de 25 nmconstant în toate cazurile.Energia necesară asamblării microtubulilor este furnizată de moleculele deguanizin-trifosfat (G.T.P.) şi nu de cele de A.T.P.

Microtubulii prezintă polaritate, adaugarea de dimeri, având lo intensitate mai mare la capătulpozitiv, producându-se creşterea, în în timp ce la capătul opus (negativ) predomină pierdera dedimeri, având loc scurtarea. Există un echilibru dinamic între microtubuli şi dimerii de tubulină dincitosol. Polimerizarea se petrece spontan la temperatura de 370 C, în timp ce depolimerizarea are locla 00 . Cationii bivalenţi de calciu şi magneziu în concentraţie mică (micromolară) sunt necesari pentrupolimerizare, care este mult accelerată în prezenţa proteinelor asociate microtubulilor (MPAs), care

pot fi: - proteine cu greutate moleculară mare (HMW = Hight Molecular Weight ) şi proteine tau ( τ).De asemenea, calmodulina controlează procesul de asamblare - dezasamblare, iar colchicina, unalcaloid blochează polimerizarea tubulinelor, prin legarea unei molecule de colchicină de un dimer detubulină. Pe această proprietate se bazează folosirea colchicinei la blocarea metafazelor în culturilede celule, pentru studierea cromozomilor. Unele medicamente,folosite ca citostatice (vinblastina,vincristina) distrug fusul de diviziune şi oară celulelele maligne, care se divid intens.

Fig.5.20.Formarea protofibrilelor din dimeri de tubulină şi asamblarea unuimicrotubul

A.Secţiune transversală prin microtubul1-Alfa-tubulină; 2-Beta-tubulină; 3-Dimer; 4-Asamblare;5- Blocarea asamblării prin colchicină; 6-Protofibrilă; 7-Dezasamblare.

În celulă, microtubulii îndeplinesc atât un rol structural, cât şi un rol dinamic.Rolul strucutural constă în: 1- menţinerea formei celulelor şi a prelungirilor sale (axon,dentrite,

cili, flageli); 2-determinarea şi păstrarea dispunerii spaţiale a organitelor; 3- organizarea citosheletului,determinând distribuţia filamentelor intermediare în celulă; 4- dispunerea filamentelor de actină, cestructurează inelul contractil, între cei doi poli ai celulei; 5- formarea unor "schele temporare" pe carecelula să-şi dispună unele componente, ca de exemplu în cursul spermatogenezei, când microtubuliiformează o "schelă" în spirală pe care se sprijină mitocondriile.

Rolul dinamic constă în: 1- participă la realizarea mişcărilor celulare ce au la bazămecanismul microtubul-dineină, precum mişcarea cililor şi flagelilor; 2- asigură o serie de mişcăriintracitoplasmatice, precum mişcarea granulelor de melanină în melanocite; 4- asigură transportul

76



unor molecule şi substanţe; 5- realizează transportul axonal rapid (200 nm/ 24 ore) şi lent (24 nm/24ore); 5- participă la eliberarea proteinelor şi lipoproteinelor sintetizate în hepatocite. În citoplasmă, microtubulii sunt prezenţi în alcătuirea unor structuri stabile, cum sunt centriolii, fusulde diviziune, cilii şi flagelii.

5.3.3.2. Centriolii

Centriolul (centriolum) este o structură microtubulară stabilă ce intră în componenţa centruluicelular ( cytocentrum).

În majoritatea celulelor, centrul celular este situat juxta nuclear, în apropierea complexulluiGolgi şi conţine unul sau doi centrioli, ce sunt înconjuraţi de o zonă citoplamatică clară, denumitămaterial pericentriolar.

Centrul celular lipseşte în celulele înalt specializate (eritrocit, rabdocit, neuron), iar când esteprezent coordonează mobilitatea celulară în timpul diviziunii. (Fig.5.20.)

Fig.5.21.Aspectul centrului celular la microscopul optic A- În intercineză; B- În timpul diviziunii.

La microscopul electronic, fiecare centriol apare ca o structură cilindrică (în lungimre de 0,5µm şi cu diametrul de 0,11 µm), dispusă perpendicular pe congenerul său. Fiecare centriol esteformat din 9 triplete (triplomicrotubulus) de microtubuli, notaţi de la interior spre exterior cu A,B,C şi îmbrăcaţi într-o masă de substanţă densă. Centrul cilindrului este lipsit de microtubuli, realizându-se ostructură de tipul "9+0", diferită de structura axonemei cililor şi flagelului, care este de tipul "9+2".(Fig.5.22)

77



Fig.5.22.Ultrastructura centriolilor 1-Tripletă de microtubuli

Centrul celular (sau centrozomul ) joacă rolul de organizator al microtubulilor, datorită faptuluică materialul pericentriolar format din proteine şi ARN, determină polimerizarea tubulinelor şiasamblarea microtubulilor, care au capătul negativ ( - ) în materialul pericentriolar din centrazom, întimp ce capătul pozitiv( + ) dispus distal prezintă o creştere intensă.

Datorită funcţiei sale de organizator temporar, spaţial şi vectorial al microtubulilor, centrul

celular este implicat în toate procesele în care aceştia apar ca organizatori ai citoscheletului.Centrul celular intervine şi în direcţionarea mişcărilor de locomoţie ameboidală ( a

fibroblastelor şi leucocitelor), situându-se înaintea nucleului pe direcţia mişcarii celulelor.Tot odată,centrul celular participă şi definirea polarităţii celulei, dispunându-se ca şi complexul Golgi, apical faţăde nucleu în celulele epiteliale.

5.3.3.3. Fusul de diviziuneFusul de diviziune (fusus mitoticus) este o structură intra celulară, formată din microtubuli

(microtubuli fusalis) ce realizează o legătură între centriolii care se despart şi migrază la cei doi poli aicelulei, în timpul diviziunii celulare.

În interfază, centrozomul este situat în vecinătatea nucleului şi din el pleacă microtubuli întoată citoplasma. În timpul fazei "S" a ciclului celular începe dublarea centrului celular prin separareacentriolilor, în vecinătatea fiecăruia din centriolii vechi producându-se asamblarea unui centriol, nou

perpendicular pe cel vechi. Concomitent cu deplasarea spre polii celulei a centrilor celulari,microtubulii formează filamente ce se dispun sub forma unui fus de diviziune.Fiecare filament estealcătuit din circa 100 microtubuli şi proteinele asociate lor.Între microtubuli din fus şi moleculele detubulină din citosol se stabileşte un echilibru dinamic.(Fig.5.22)

Fig.5.22.Participarea microtubulilor la formarea fusului de diviziune3-Centrioli; 2-Microtubuli;3-Fibrele fusului de diviziune; 4-Cromozomi.

78



5.3.3.4. Cilii şi flagelulCilii (cilium,a) şi flagelul (flagellum) sunt expansiuni celulare permanente, formate din

citoplasmă şi membrană celulară, dispuse la polul apical al celulei. În structura lor, microtubulii sunt prezenţi, în axul citoplasmatic ciliar, denumit axonemă

(axonema), fiind dispuşi ordonat, paraleli între ei şi cu axul longiutudinal al formaţiunii. La baza

fiecărei axoneme se află câte un corpuscul bazal (corpusculum basale), ce are organizarea unuicentriol.Cilii pot fi vibratili ( sau kinetocili) şi nevibratili (sau stereocili).La cilii vibratili (din mucoasa traheală, nasală), axonema este formată din doi microtubuli

axiali, înconjuraţi, la periferie de nouă dublete de microtubuli. Fiecare dublet cuprinde un microtubulcomplet sau subfibra A, formată din 13 protofilamente şi un microtubul incomplet sau subfibra B,formată din 10 sau 11protofilamente. Tubulinele alfa (α) şi beta (β) ce formează subfibra A suntdiferite de tubulinele omoloage din subfibra B.

Fig.5.24. Ultrastructura cililor

De la fiecare subfibră A pornesc înspre subfibra B din dubletul vecin două braţe simetrice înformă de cleşte formate din molecule de dineină, care este o protein-enzimă bogată în ATP-ază.Braţele de dineină sunt dispuse în lungul microtubulului la intervale regulate de 24 nm. La intervalemai mari de 24 nm există, din loc în loc, la o distanţă de 86,5 nm legături elastice, formate dintr-o altăproteină, denumită nexină.

De la subfibra A pleacă spre centrul axonemei câte un braţ de legătură (sau spiţă), ce setermină printr-o porţiune globulară, în vecinătatea tecii interne ce înconjoară cei doi microtubulicentrali.(Fig.5.25).

Flagelul (flagellum), de obicei, unul singur pentru fiecare celulă (expl. la spermatozoid)prezintă o structură asemănătoare cu a cilului, dar mai complexă. Axonema sa este structurată dupătipul "9+2", prezentând în jurul său o coroană de mitocondrii ce a asigură ATP-ul necesar mişcării.

Cilii nevibratili sau stereocilii ( de exempl. cei din epididim şi din urechea internă) au aceiaşistructură ca şi cilii mobili, cu deosebirea că lipsesc cei doi microtubuli centrali din axonemă.

Mişcările celulare ce au la bază sistemul microtubul-dineină sunt pe deoparte mişcărilecaracteristice cililor şi flagelilor, iar pe de altă parte sunt mişcările cromozomilor din cursul diviziuniicelulare.

79



Fig.5.25.Secţiune transversală prin axonema unui cilA - Subfibra A.; B - Subfibra B.

a-Braţe de dineină; b-Legături de nexină; c-Spiţă; d-Teaca internă; e-Microtubuli centrali; f-Tija cilului; g-Rădăcina cilului.

Mişcarea cililor şi flagelilor se realizează prin alunecarea unui dublet periferic în raport cudubletul vecin lui.Alunecarea depinde de legarea ciclică a dineinei subfibrei A dintr-un dublet desubfibra B a dubletului vecin, încât braţele de dineină "păşesc " de-a lungul dubletelor, producândenergia necesară bătăilor cilului sau a flagelului.Se realizează astfel glisarea dubletelor unul pestealtulşi încovăierea cilului şi flagelului.

Dineina prezintă o funcţie similară cu a miozinei, prezentând activitate ATP-azică, încât prin

scindarea ATP-ului furnizează energia necesară mişcării. ATP-ul provine din glicoliză şi difuzeazăprin citoplasmă în axonema cililor, pe când, în flageli, ATP-ul este generat de mitocondriile ce înconjoară axonema.

Legăturile radiare (spiţele) dintre teaca internă şi dubletele periferice, precum şi teaca internăau rolul de a controla activitatea braţelor de dineină, încât să se producă o undă coerentă de mişcăride la bază spre vârf. Astfel cilii au mişcări ciclice în doi timpi (bătaie - revenire), ce durează 0,1-0,2secunde, în timp ce flagelul are o mişcare ondulatorie sinusoidală sau elicoidală.(Fig.5.26).

80



Fig.5.26. Schema mişcării flagelului (A) şi a cililor.a-Bătaie; b-Revenire

În condiţii patologice, pot apărea tulburări funcţionale ale cililor datorită unor anomalii

localizate fie la nivelul corpuisculului bazal (centriol incomplet), fie la nivelul axonemei (complexetubulare supranumerare, sau cu aranjament dezorganizat) ,fie înpărţi componente ale cilului.

De asemenea, absenţa dineinei produce sindromul cililor imobili (o boală genetică ), care secaracterizează prin infecţii respiratorii cronice (datorită incapacităţii cililor de a curăţii căile respiratoriisau prin sterilitate (spermatozoizii fiind imobili).

5.4.Mitocondriile - organite generatoare de energie

Mitocondriile (mitochondrion gr.= filament,granulă) sunt organite specializate în producereade energie necesară activităţii celulelor eucariote, comportându-se ca nişte “centrale energetice”, incare energia este eliberată prin oxidarea unor substrate şi transformată în energie chimică (ATP) prinprocesul de fosforilare oxidativă. Sunt “fabricile” de energie ale celulei.

Mitocondriile sunt prezente în toate tipurile de celule cu excepţia eritrocitului adult, în carelipsesc. Au fost observate la microscopul optic în a II-a jumătate a secolului XIX de către ALTMAN-1890, prin coloraţie cu verde Janus şi de BENDA-1897, care afolosit coloraţia cu hematoxilină fericăRegaud.

Enzimele marker pentru mitocondrii sunt: monoaminoxidaza, citrocromoxidaza şi enzimeleciclului Krebs.

Numărul mitocondriilor diferă de la o celulă la alta în funcţie de intensitatea activităţiiacestora, fiind mai mare în celulele mai active. Astfel, în hepatocite există 1000-3000 de mitocondrii în citosol, în nefrocite-300, în spematozoizi 20-24, în timp ce în eritrocite lipsesc.Numărulmitocondriilor este mai redus în celulele cu activitate metabolică redusă.

Poziţia mitocondriilor în celulă este diferită.Ele pot fi răspâdite, reletiv uniform, în întreagacitoplasmă ( de expl. în hepatocit) sau localizate în celulă, în locurile unde ATP-ul este necesar încantitate mai mare. Astfel: - în muşchiul scheletic, mitocondriile sunt dispuse între miofibrile; -înspermatozoid, sunt aranjate helicoidal în jurul axonemei flagelului; - în neuroni, în regiunea sinaptică;- în panceasul endocrin, mitocondriile sunt alăturate reticulului endoplasmic rugos, generând ATP-ulnecesar biosintezei proteinelor. Mitocondriile se concentrează la polii activi ai celulelor polarizatefuncţional: - la polul bazal, în nefrocite; - la polul apical, în enterocite;- perinuclear, în momentele deintensă activitate de sinteză, după care se răspâdesc în citoplasmă. Mitocondriile îşi schimbă mereupoziţia, putându-se alătura temporar unor organite aflate în intensă activitate, în special reticululuiendoplasmic.

5.4.1.Morfologie,structură şi ultrastructurăDimensiunile mitocondriilor sunt variabile de la o celulă la alta, ajungând până la 7 µm

lungime şi 0,5 µm grosime. În general, cu cât o celulă este mai activă, cu atât mitocondriile sunt maimari. În celule aflate în repaus, dimesiunile sunt mai mici.

La microscopul optic, mitocondria se poate prezenta sub trei aspecte:-granule ( granulummitochondriale),mitocondrii individualizate , diseminate în citoplasmă; -granule înşirate ca niştemărgele pe aţă (condriomite)şi filamente (filamentum mitochondriale) sau virgule (condrioconţi )(Fig.5.27).

81



Fig.5.27. MitocondriileA. Aspecte la microscopul optic: 1-Condrioconte; 2-Bastonaşe Heidenhein;3-Mitocondrii; 4-Condriomite; 5-Condrioconţi, localizaţi bipolar.B.Aspecte la microscopul electronic: 6-Organizarea spaţială a mitocondriei;7-Ultrastructura membranelor; 8-Aspecte ale cristelor; 9-Ultrastructura cristelor;

10-Secţiune transversală printr-o cristă.

Ultrastructura mitocondriilor a fost elucidată de PALADE şi SJÖSTRAND-1952, pe secţiunide ficat examinate electronomicroscopic. În ultrastructura mitocondriei intră două membrane(membrana mitochondrialis), cu grosimea de 6 nm fiecare, ce delimitează douăcompartimente.Membrana externă (membrana mitochondrialis externa) este netedă, în timp cemembrana internă (membrana mitocondrialis interna) deşi urmăreşte conturul celei externe prezintădin loc în loc pliuri sau invaginări denumite criste (latinescul crista= creastă) mitocondriale cugrosimea de 25 nm, de forme variate. Numărul, dispoziţia şi dimensiunea cristelor variază în raport cu

tipul activităţii metabolice şi necesităţile energetice ale celulei. Numărul cristelor este mai mare atuncicând activitatea celulelor este mai intensă. Cristele mitocondriale au forme variate, putând apărea

lamelate sau septate (sub formă de foiţe sau septe) şi tubulare (t ubulus),sub formă de cilindri sau veziculare (vesicula). Cristele pot fi

orientate perpendicular sau paralel cu axul longitudinal almitocondriei. Ele pot fi rectilinii,ramificate sau încrucişate în reţea,compartimentând matricea mitocondriei. (Fig.5.28).

Fig.5.28.Ultrastructura mitocondriei1-Cristă; 2-ADN-mitocondrial;3-F1-ATP-ază; 4-Membrana externă;5-Membrana internă;6-Spaţiul intermembranar; 7-Ribozomi; 8-Incluziuni; 9-Matrice; 10-Particulă elementară(F1): a-piesa bazală,b-

piesa intermediară,c-piesa superioară.

82



Între cele două membrane (externă şi internă) se delimitează un compartiment extern(spatium intermembranosum) de 7-8nm. Membrana internă delimitează un compartiment intern saumatricea mitocondrială (matrix mitochondrialis). La nivelul membranei interne, prin tehnici adecvate(coloraţie negativă cu acid fosfotungtic, pentru a obţine un contrast mai mare la microscopulelectronic) s-au evidenţiat subunităţi de membrană sau particule elementare (particule F1) ( particulaelementaria s. spherula s.sphaerula membrane).

O particulă elementară apare ca o proeminenţă de 10 nm, formată din trei piese: bazală,intermediară şi superioară. Particulele elementare conţin o enzimă, F1 - ATP-ază, ce face parte dincomplexul enzimatic ce participă la sinteza ATP-ului.(Fig.5.29)

Membrana mitocondrială internă este mai puţin permeabilă decât membrana mitocondrialăexternă, comportându-se ca unfel de barieră între matricea mitocondrială şi restul mitocondriei. Prinea trec spre spaţiul intern: -ioni de calciu (Ca 2+) şi magneziu (Mg2+), necesari activităţii enzimelor cuprinse în matricea mitocondrială; - molecule de ADP şi ATP, necesare desfăşurării procesului defosforilare activă; -acizi graşi şi unii aminoacizi (glutamatul şi apartatul). Transportul prin membrană aacestor produşi se realizează cu ajutorul unor proteine din membrană,care servesc ca transportori

sau cărăuşi (translocazele şi permeazele).

Fig.5.29. Organizarea particulelor elementare1-Factorul de cuplare; 2-Citocromi;

3-Succinat dehidrogenaza.

5.4.2. Matricea mitocondrială.

Matricea mitocondrială conţine enzime, vitamine (B,A,C), acizi nucleici (ADN şi ARN), ioni( K+, Na+, Ca 2+, Mg2+) şi granule de glicogen, lipide, riboproteine (ribozomi).Enzimele matricei aparţin la următoarele sisteme: -sistemul enzimatic al ciclului acidului citric

(Krebs); - sistemul enzimatic al beta oxidării acizilor graşi; -sistemul enzimatic de fosforilare oxidativă;enzime care intervin în sinteze specifice; -enzime proteolitice.

Acizii nucleici mitocondriali sunt reprezentaţi de ARN ribozomal, ARN mesager, ARN detransfer şi ADN. Molecula de ADN mitocondrial (cu lungimea de 20µm) este circulară, asemănătoarecu cea a procariotelor. Replicarea ADN-ului mitocondrial nu se produce sincron cu replicarea ADN-ului nuclear şi nici în mod continuu. Sinteza ADN-ului mitocondrial se produce mai lent decât în cazulADN-ului nuclear şi independent de acesta. ADN-ul mitocondrial este sintetizat independent înmatricea mitocondrială,fapt demonstrat prin evidenţierea în matrice a enzimei care catalizeazăbiosinteza ADN-ului, enzimă denumită ADN-polimeraza.

Ribozomii mitocondriali au diametrul de 15 nm şi sunt asemănători celor de la procariote,de tip 70 S, cu cele două subunităţi: mare, de 50S şi mică, de 30S.

Mitocondria are autonomie genetică parţială, întrucât posedă un cromosom (cromosomamitochondrialis) ce conţine programul genetic (ADN-ul mitocondrial), şi este capabilă să-şi sintetizezesingură, fără ajutorul nucleului unele protein-enzime (datorită înzestrării cu ribozomi proprii, cebiosintetizează proteine).Codul genetic folosit de mitocondrie diferă parţial de codul genetic nuclear.

5.4.3.Procesele metabolice mitocondriale

Aparţin pe de o parte metabolismului energetic, iar pe de altă parte metabolismului sintetetic.Mitocondria este sediul metabolismului celular aerob, dependent de oxigen, care include: 1-

ciclul acidului citric (KREBS); 2- oxidarea acizilor graşi şi 3-fosforilarea oxidativă. Prin aceste procese, în mitocondrii se produce întreaga cantitate de energie (sub formă de ATP) necesarăcreşterii,funcţionării şi vieţii celulei, încât mitocondriile se comportă ca nişte centrale energeticecelulare.

Într-un caz ipotetic, în care celulele animale ar fi lipsite de mitocondrii, producerea de energiear depinde de glicoliza anaerobă, în care fiecare moleculă de glucoză generează două molecule de

83



ATP. În realitate, în mitocondrii, metabolismul glucozei este complet, oxidarea mergând pănă laCO2 şi H2O, încât fiecare moleculă de glucoză produce 36 molecule de ATP.Prin hidroliza ATP-ului seeliberează o cantitate importantă de energie (8.000-10.000 Kcal/mol) necesară proceselor metabolice.

În cazul acizilor graşi, aceştia trec din citosol în matricea mitocondrială, unde intră în ciclulbeta-oxidării,pierzând în mod repetat câte doi atomi de carbon de la capătul carboxil şi rezultând o

moleculă de acetil-coenzimă A. Totodată, în urma glicolizei ce are loc în citosol,rezultă două moleculede piruvat, care în matricea mitocondrială este convertit de către complexul piruvat dehidrogenază înacetil coenzima A.

Acetil coenzima A, rezultată din acizii graşi sau din glucoză intră în ciclul acidului citric (ciclulKREBS), ce are loc în matricea mitocondrială.La acest nivel cu ajutorul oxigenului molecular, produsde respiraţia celulară, au loc oxidări în urma cărora rezultă energie ce este folosită pentru sinteza deATP, de către complexul ATP- sintetazei, prezent în membrana mitocondrială internă.

Celulele dispun de depozite de lipide (trigliceride) în ţesutul adipos şi de glucide (glicogen), înficat şi muşchi, prin care se asigură o sursă continuă de piruvat.

Participarea mitocondriilor la efectuarea unor procese metabolice este posibilă datorităexistenţei unui mozaic complex de enzime,localizate în diferite structuri mitocondriale, precummembrana externă, membrana internă cu criste şi particule elementare, compartimentul extern (sauspaţiul intermembranar) şi compartimentul intern (sau matricea mitocondrială).Astfel, enzimele care

intervin în ciclul acidului citric şi în beta -oxidarea acizilor graşi sunt localizate în membrana externă şi în matricea mitocondriilor.Enzimele şi alţi factori care participă la procesul de fosforilare oxidativă(generatoare de ATP) sunt localizate în membrana internă,respectiv în criste.În particuleleelementare ale membranei interne se află localizată enzima denumită factorul de cuplare F1, careposedă activitate ATP-azică şi catalizează ultima etapă a formării ATP-ului.

Procesele metabolice biosintetice pot avea loc, datorită faptului că mitocondriile conţin ADN,ARN, ribozomi şi toate enzimele necesare exprimării genelor mitocondriale.În mitocondrii sedesfăşoară unele etape din sinteza hemului şi a hormonilor steroizi, ca de exemplu în celuleleinterstiţiale din ovar şi testicul, în corticosuprarenală.

Structura chimică a mitocondriilor cuprinde 65-70% proteine (din care 30% structurale şi 70%enzime), 25-28% lipide (fosfolipide, lecitine, trigliceride, cardiolipin), 0,5% ARN, AND (în cantitatemică),glucide,ioni,apă şi uneori vitaminac. Într-o mitocondrie, toate proteinele, ca şi toate lipidele sunt în locuite la aproximativ 20 de zile, încât mitocondria se reînoieşte continuu, iar când iese din funcţie,

este îndepărtată prin autofagie cu ajutorul lizozomilor.5.4.4. Originea mitocondriilor

În celulă, noile mitocondrii apar prin condrodiereză (clivaj,despicare), încât dintr-o mitocondriefuncţională rezultă două organite asemănătoare. Se menţioneaz şi posibilitatea de formare amitocondriilor din molecule proteice şi lipidice sintetizate în celulă sau din alte citomembrane, înspecial din cele ale reticulului endoplasmic.

În filogeneză, primele mitocondrii au apărut în celulele animale prin transformarea unor bacterii care, odată pătrunse în celulă animală şi-au pierdut virulenţa, şi-au structurat o a douamembrană (membrana mitocondrială externă), şi-au adoptata metabolismul la celula gazdă, devenindun organit endo-simbiont. Mitocondria,ca şi bacteriile prezintă o moleculă de AND circular, iar uneleenzime sunt prezente atât în bacterii, cât şi în mitocondrii.

5.4.5. Funcţiile mitocondriilor

Mitocondriile îndeplinesc un rol esenţial în metabolismul energetic al celulelor vii, producândenergia necesară desfăşurării oricărei activităţi celulare (diviziune,diferenţiere,secreţie, contracţiemusculară, transmitere nervoasă).Energia este generată prin acţiunea enzimelor oxido-reductoriimitocondriale şi prin procesul fosforilării active sub forma molecelor macroergice de ATP.Enzimadenumită ATP-ază, scindează molecule de ATP şi eliberează energia pe care acestea o conţin.

În cursul desfăşurării reacţiilor enzimatice oxidative şi ale cuplării oxidării cu fosforilarea,mitocondria suferă o serie de modificări de formă şi strucutură, ceformează un ciclu fiziologic de umflare contracţie. În acest ciclu,membrana externă rămâne nemodificată, în timp ce membrana internăpermite mişcări ale apei şi ionilor cu ajutorul translocatorilor specifici.(Fig.5.30)

Fig.5.30. Ciclu fiziologic de balonare-contracţie al mitocondriei.

84



1-Mitocondrie nemodificată; 2-Mitocondrie condensată; 3-Mitocondrie balonată.

În stare de contracţie,datorită proteinelor contractile pe care le conţine, mitocondria îşimicşorează mult volumul, spaţiul intermembranar se reduce, iar cristele mitocondriale se tasează,organitul, în totalitatea sa, apărând electronodens.

În starea de balonare, mitocondria acumulează o cantitate mărită de apă, îşi măreşte

volumul, se sterg cresteler mitocondriale, iar cele două membrane ajung în contact una cu cealaltă.Aceste modificări pot fi fiziologice şi reversibile. Balonarea se datoreşte pe de o parte modificăriiraportului ATP/ADP de la suprafaţa externă a mitocondriei, cât şi datorită acumulării peste normal aunor ioni.

5.5.Organitele de sinteză şi secreţie ale celulei

Sunt reprezentate de ribozomi,reticulul endoplasmic şi complexul Golgi.

5.5.1. Ribozomii

Ribozomii (ribosoma) sau granulele Palade sunt organite celulare intracitoplasmaticeprezente în toate celulele cu excepţia eritrocitelor . (Fig.5.31).

Fig.5.31. Ribozomii - aspect, ultrastructură şi biogeneză:1-Ribozomi liberi;2-Ribozomi ataşaţi la RE;3-Poliribozomi;4-Subunitate mică;5-Subunitate mare;6-Ribozom funcţional;7-Dimer;8-Proteină ribozomală structurală;9-ARN ribozomal dublu elicoidal;10-ARN ribozomal monocatenar;11-Nucleu;12-Nucleol;13-Ribozom;14-citoplasmă,15-membrană celulară.

Ribozomii pot fi liberi în citoplasmă , solitari sau grupaţi sub formă de poliribozomi(polyribosoma). De asemenea,se pot ataşa de membranele reticulului endoplasmatic (structurândreticulul endoplasmic granular) sau de faţa externă a membranei nucleare.

Numărul ribozomilor variază în funcţie de tipul celulei şi de momentele funcţionale ale acesteia ,fiind foarte mare şi ataşaţi reticulului endoplasmic în celulele care sintetizează proteine de export(celulele acinoase, limfocit şi plasmocit ). În celulele care secretă hormoni steroizi ( din glandelesuprarenale , din gonade ) numărul este foarte mic, ribozomii apărând liberi, în citoplasmă (Fig.5.32).

Diametrul ribozomilor este de 15-30nm, având aspectul unor granule sferice, cu constanţa desedimentare de 80S la eucariote şi de 70S (unităţi Svedberg) la procariote.

85



Fig.5.32.Aspecte ale ribozomilor examinaţi cu microscopul optic1-Ergastoplasmă; 2-Corpusculi Nissl; 3-Grupări bazofile în celulele secretorii din glanda

mamară; 4-Corpi Berg în hepatocit. Organizarea ultrastructurală. La eucariote, un ribozom este format din două subunităţi

inegale, ca dimensiuni asimetrice: a) o subunitate mare (cu diametrul de aproximativ 30nm), de formăsferoidală, cu constanţă de sedimentare de 60S. ; b) o subunitate mică, alungită, cu o constantă desedimentare de 40S.(Fig.5.33).

Fig.5.33.Schema ribozomilor şi a formelor lor de organizare1-Subunitatea mică; 2-Subunitatea mare; 3-Ribozomi; 4-Dimer; 5-Poliribozomi.

Ribozomul de la procariote este asemănător cu ribozomul mitocondrial de la eucariote, avândo constantă de sedimentare de 70S, cu o subunitate mică, de 30S şi o subunitate mare, de 50S.

Cele două subunităţi ribozomale sunt separate atunci când nu participă la sinteza de proteinesau când, în citoplasmă, concentraţia ionilor de magneziu (Mg2+) scade sub 10-3 sau în prezenţa unor inhibitori ai sintezei de proteine ca puromicina sau etionina. Atunci, când concentraţia ionilor demagneziu creşte peste 10-3 se produce agregarea ribozomilor în grupuri denumite polimeri (di, tri,tetra) care nu au o funcţie specială în celulă. Odată cu revenirea la normal a concentraţiei ionilor de

magneziu în citoplasmă se produce desfacerea polimerilor şi individualizarea ribozomilor. În cursul proceselor de biosinteză a proteinelor mai mulţi ribozomi se dispun de-a lungul unei

molecule de ARN mesager (ARNm), formând cu un poliribozom ( polirybozoma), sau un polizom.ARNm se amplasează în spaţiul dintre cele două subunităţi ale ribozomului şi introduce mesajulgenetic în secvenţa de aminoacizi a proteinelor ce se sintetizează. Numărul de ribozomi ce segrupează variază în funcţie de mărimea moleculei proteice ce urmează a fi sintetizată, fiind necesari100 ribozomi pentru o moleculă de colagen şi de 5 ribozomi pentru o moleculă de globină dinhemoglobină. Molecula de ARN mesager are forma unui filament sinuos, gros de 2nm, ce înşirăribozomii, precum mărgelele pe aţă, trecând prin fiecare ribozom, printre subunitatea mică şi ceamare. După ce proteina a fost sintetizată, lanţul poliribozomal se rupe, iar ribozomii se dispersează încitoplasmă.

Compoziţia chimică a ribozomilor cuprinde ARN ribozomal (ARNr) şi proteine în părţiaproximativ egale, cantităţi mici de apă şi diferiţi ioni metalici (de magneziu şi calciu).

86



Fig.5.34. Proteine de structură (1)şi ARN ribozomal (2)

Molecula de ARN ribozomalprezintă segmente bicatenareelicoidale, dispuse la suprafaţasubunităţilor ribozomale, cealternează cu segmentemonocatenare nespiralate, dispuse îninteriorul subunităţilor, unde suntsituate şi proteinele ribozomale. Princonţinutul lor în ARNr, ribozomi

conferă bazofilia celulelor . (Fig.5.34). În subunitatea mare de 60S sunt prezente 3 specii de ARNr (de 5,8S, de 28S şi de 5S), în

timp ce, subunitatea mică conţine numai o singură specie de ARNr (de 18S). În moleculele de ARNr,bazele apar asimetrice, fiind reprezentate de baze purinice (guanină şi adenină) mai abundente şi de

baze pirimidinice (uracil şi citozină).Proteinele ribozomale sunt legate mai strâns sau mai lax de ARNr şi îndeplinesc un rolstructural, unele intervenind în asamblarea unităţilor ribozomale, iar altele sunt implicate în realizareafuncţiilor specifice ribozomilor. Proteinele ribozomale sunt bogate în radicali specifici de tipul arginineişi lizinei în subunitatea mare existând 45 proteine şi în subunitatea mică 33 proteine (Fig.5.35).

Fig.5.35. Diagrama componentelor ribozomului la eucariote.1-Ribozom; 2-Subunitate ribozomală mică; 3-Subunitate ribozomală mare.Biogeneza ribozomilor începe în nucleol, la nivelul moleculelor de AND nucleolar din

componenta cromozomală, unde pe o porţiune a cromozomului denumită organizator nuclear segăsesc genele pentru producerea ARNr. Iniţial se produce un precursor al ARNr cu constantă de 45Sce se localizează în componenta fibrilară a nucleolului. O parte din ARNr 45S dă naştere la ARNr 28Sşi ARNr 18S, care trece în componenta granulară a nucleolului, iar cealaltă parte de ARN 41S setransformă sub acţiunea exonucleazelor în ARNr 28S şi ARNr 20S (din care rezultă rapid un ARNr 18S). ARNr 28S şi ARNr 18S, împreună cu o parte din proteinele ribozomale venite în nucleu dincitoplasmă, migrează separat în citoplasmă prin porii membranei nucleare. ARNr 58S se sintetizează în afara nucleolului în nucleoplasmă după tiparul ADN-ului, iar ARNr 5S şi ARNr 5,8S migrează în

citoplasmă ataşaţi de molecula de ARNr 28S. Odată trecute în citoplasmă, cele două subunităţi, încăimature se maturează foarte repede, se asamblează şi se asociază cu proteine citoplasmaticespecifice ribozomului, structurând în final ribozomii.

87



Funcţia ribozomilor constă în sinteza proteinelor. Ribozomii ataşaţi membranelor reticululuiendoplasmic sintetizează proteinele de export (enzime, hormoni, anticorpi, tropocolageni- ca în cazulcelulelor seroase din pancreas, limfocitelor, plasmocitelor şi fibroblastelor), în timp ce poliribozomiiliberi neataşaţi sintetizează proteine de structură (ce se consumă în diviziune şi creştere, în înlocuireaorganitelor uzate), precum şi unele proteine speciale (proteine contractile, proteinele din mioglobină şihemoglobină).

5.5.2.RETICULUL ENDOPLASMIC

Reticulul endoplasmic (reticulum endoplasmaticum s.cytoplasmaticum) este un organitintracelular implicat în activităţile de sinteză şi secreţie celulară, format dintr-un complex demembrane intracelulare ce delimitează un sistem de canalicule (tuburi, cisterne) care străbat întreagacitoploasmă a celulei eucariote. Este prezent în toate tipurile de celule, cu excepţia eritrocitului adult.(Fig.5.36).

Fig.5.36. Reticulul endoplasmatic - aspect şi organizare tridimensională.1-Reticul endoplasmic rugos; 2-Reticul endoplasmic neted; 3-Organizaretridimensională a REN; 4-Ergastoplasmă în celula seroasă din pancreas; 5- Corpusculii

Nissl în neuron.

A fost observat în secolul trecut la microscopul optic sub forma unor granulaţii bazofile înneuron (unde formează substanţa tigroidă sau corpusculii Nissl), în hepatocit (sub forma unor zonesferice, corpii Berg) şi în pancreas (unde formează o zonă bazofilă cu striaţii longitudinale numităergastoplasmă).

Reticulul endoplasmic este mai bine reprezentat în celulele active în sinteze (de proteine, deglucide, de lipide) şi foarte dezvoltat în celulele secretorii exo- şi endocrine. În interiorul celulei estesituat cu precădere în zona internă şi mijlocie a citoplasmei, ce formează endoplasma (endoplasma)şi mai puţin în zona externă. Este separat de plasmalemă printr-un strat subţire de ectoplasmă, ceconţine infrastructurile fibrilare ale citoscheletului. Contactul cu plasmalema sau continuitateamembranei reticulului cu plasmalema este extrem de rar şi poate fi considerat accidental (sau

artefacte datorită preparării).Ultrastructura reticulului endoplasmic cuprinde saci (sacculus), cisterne (cisterna) , tubi

(tubulus) şi vezicule anastomozate între ele şi delimitate de o endomembrană groasă de 6 nm, cu

88



organizare moleculară , comună tuturor membranelor interne. Lumenul formaţiunilor reticululuiendoplasmic variază între 25-500 nm, în raport de momentul funcţional al celulei, iar conţinutul lor poate apare la M.E. clar sau întunecat, mai des omogen şi amorf decât heterogen.

Unele porţiuni ale reticulului endoplasmic prezintă ribozomi ataşaţi de endomembrane şipoartă numele de reticul endoplasmic rugos (RER) sau granulos (reticulum endoplasmaticumgranulosum), în timp ce alte porţiuni sunt lipsite de ribozomi şi formează reticulul endoplasmic neted

(REN) (reticulum endoplasmaticum nongranulosum).Membrana REN se continuă cu membrana RER, dar în RER predomină cisternele, pe când în REN sunt mai frecvente tuburile şi canalele interconectate în reţea. Membrana RER se continuă cufoiţa externă a învelişului nuclear, iar lumenul RER comunică cu spaţiul perinuclear. REN se întindespre periferia celulei fără a atinge plasmalema. Cele două porţiuni ale reticulului endoplasmic, rugosşi neted, prezintă interconexiuni morfologice şi funcţionale.

Reticulul endoplasmic rugos prezintă pe faţa externă a endomembranei sale ribozomiindividualizaţi sau grupaţi în poliribozomi. Ribozomii se leagă de membranele reticulului prinsubunitatea mare, care este străbătută de un canal ce se deschide în lumenul reticulului şi prin caretrec lanţurile polipeptidice, ce se formează în ribozomi. Legarea ribozomilor se face cu ajutorul unor glicoproteine transmembranare denumite riboforine (I şi II). Ribozomii ataşaţi conferă o puternicăbazofilie celulei respective.

R.E.R. prezintă o mare plasticitate şi o mare putere de adoptare în raport cu vârsta sau

starea funcţională a celulei. În situaţii patologice ale celulei se observă mari variaţii morfologice aleorganitului, precum: fragmentări, dilatări, acumulări de materiale în cisterne şi vezicule, proliferări aleformaţiunilor reticulului.

R.E.R. este specializat în sinteza proteinelor.Reticulul endoplasmic neted (R.E.N.) nu prezintă ribozomi pe membrana sa limitantă.

Este alcătuit mai mult din formaţiuni tubulare cu diametrul de 30nm, ce comunică prin canale delegătură cu R.E.R. Este prezent în citoplasma tuturor celulelor, dar mai puţin reprezentat cantitativdecât cel rugos.

REN apare mai dezvoltat în celulele care: - sintetizeaza hormoni steroizi (glandelesuprarenale, celulele interstitiale din ovar si testicul); - produc glucide în cantitate mare (hepatocite,celule musculare); - formeaza pigment (melanoblaste) si - elaborează acid clorhidric (parietale dinglandele fundice).

În celula musculara, REN se numeste reticul sarcoplasmic prezentând un aspect morfologic

si functional particular si îndeplinind un rol esential în cuplarea excitatiei cu contractia. În celulelepigmentare ale retinei, REN apare si sub forma unor corpi nucleoizi, biconvexi, PAS pozitivi cu rol înprocesele de fotoreceptie.

Compoziţia chimica a reticulului endoplasmic a fost studiată dupa centrifugarea diferentiata aomogenatului celular, când s-au obtinut microzomii.

Microzomii nu sunt organite celulare, ci fractiuni subcelulare, ce cuprind portiuni de reticulendoplasmic,membrane golgiene şi fragmente de membrane celulare. Se pot obtine şi separamicrozomii rugosi si netezi, atunci când se desprind ribozomii de RER. În microzomi se pastreazaorientarea membranei reticulului endoplasmic din celula, prezentând o fata externa, ce corespundefetei citoplasmatice a reticulului endoplasmic, iar continutul lor este identic cu cel din lumenulreticulului endoplasmic.

In compozitia chimica a reticulului endoplasmic intra proteine (60%) si lipide (40%). O partedin proteine sunt incluse în structurile organitului (proteine structurale), iar alta parte sunt proteine de

export (hormoni, enzime). Dintre lipide, predomina fosfolipidele, lecitinele si cefalinele, iar colesteroluleste în cantitate mica (mai ales în RER). Acizii grasi din fosfolipide sunt foarte nesaturati, ceea ceconfera o mare fluiditate membranei reticulului endoplasmic.

Enzima marker pentru reticulul endoplasmic este glucozo-6-fosfataza, dar în membranelereticulului endoplasmic se mai gasesc si alte enzime legate de transferul de electroni, precum sienzime hidrolitice sau de dezaminare.

Originea reticulului endoplasmic este înca discutabila, el parând sa se formeze fie dinmembranele nucleare, fie “de novo” prin sinteza macromoleculelor caracteristice în membrane siasamblarea lor. Membranele reticulului endoplasmic se reînnoiesc cu viteze diferite de la un segmentla altul (unele dupa 40-60 de ore, iar altele dupa 16 zile).

Functiile comune ale reticulului endoplasmic sunt:1) RE realizeaza un vast sistem microcirculator intracitoplasmatic, prin care sunt vehiculate

în permanentă substante în toata citoplasma sau în alte structuri cu care RE comunica (precumcomplexul golgian sau spatiul perinuclear).

2) RE formeaza un suport intracitoplasmatic atât pentru celelalte organite, cât si pentrumentinerea formei celulei.

89



3) RE participa prin citomembranele sale, dotate cu permeabilitate selectiva, la realizareaunor schimburi active între continutul formatiunilor componente si citosol.

Fig.5.37 -

Participarea RERla sintezaproteinelor

Functiilespecifice difera laRER la REN.

Reticulul endoplasmic rugos(RER) are cafunctie de bazasinteza proteinelor

de export, dar sisinteza proteinelor de membrana destinate diferitelor membrane ale organitelor si plasmalemei.

Astfel, RER apare foarte bine dezvoltat în: a) celulele seroase ale pancreasului exocrin cesecreta enzime digestive; b) în plasmocitele ce sintetizeaza imunoglobuline; c) în hepatocite careproduc albumine si alte proteine serice; d) în neuroni, unde îndeplineste rolul unei “fabrici demembrane”, care produce si întretine o suprafata mare de membrane, datorita prelungirilor. Îngeneral, RER este fabrica de membrane a celulei eucariote. (Fig.5.37)

Reticulul endoplasmic neted îndeplineste mai multe functii specifice în celule:1) participa la sinteza hormonilor steroizi (în celulele corticosuprarenalei, precum si în celulele

glandei interstitiale din ovar si testicul;2) participa la metabolismul glucidelor, intervin atât în glicogeneza (în hepatocite), cât si în

glicogenolliza (prin glucozo-6-fosfataza pe care o contine);3) intervine în metabolismul lipidelor, participând la sinteza unor lipoproteine (trigliceride saucomplexe lipoproteice). Astfel, în celulele intestinale, REN este foarte dezvoltat şi sintetizeazatrigliceride (din substante absorbite), ce pot fi evidentiate în REN sub forma de chilimicroni (picaturide grasime);

4) intervine în procesele de detoxifiere, prin metabolizarea unor substante toxice endo- siextracelulare, datorita enzimelor localizate în citomembranele sale (de exemplu, metabolizeazasarurile biliare, hormonii steroizi, colesterolul, hemoglobina, precum si unele medicamente);

5) participa la realizarea contractiei musculare, conducând, prin sistemul tubilor transversi,excitatia de la suprafata plasmalemei la miofilamentele contractile;

6) intervine în biosinteza acidului clorhidric în celulele parietale ale glandelor fundice;7) participa la fotoreceptie, în celulele pigmentare din retina.

5.5.3.complexul golgiComplexul Golgi (complexus golgiensis s. apparatus reticulatus internus) este un organit

celular comun, prezent în toate tipurile de celule, cu exceptia hematiei adulte. A fost descoperit în1898 de catre Camillo Golgi, în neuronii piriformi din cerebel. La microscopul optic, în celulaproaspata poate fi evidentiat prin colorare cu rosu neutru, iar în celula fixata prin impregnare cu saruride metale grele (osmiu, argint etc.), aparând sub forma unei retele, formata din canaliculeanastomozate, vacuole de diverse marimi sau bastonase (dictiozomi). (Fig.5.38)

90



Fig.5.38 - Aparatul Golgi - aspecte la microscopul optic1 - Retea perinucleara; 2 - Vezicule; 3 - Ramificat printre granule de secretie (a); 4 - Retea terminata în cârlig în celulele foliculului tiroidian; 5 - Coarda rasucita; 6 - Imagine Golgi negativa.

Pozitia complexului Golgi în celula variaza dupa tipul si activitatea celulei. Astfel, în neuronieste dispus perinuclear, pe când în celulele secretorii exocrine (de exemplu în celulele acinilor serosidin pancreas) ocupa o pozitie supranucleara, fiind situat între nucleu si polul apical al celulei. Încelulele cu dubla polaritate functionala (exemplu celula tiroidiana si adamantoblastul), complexulGolgi se deplaseaza frecvent între cei doi poli, în functie de activitatea metabolica predominanta aunuia sau altuia.

În celule, complexul Golgi se poate gasi în mai multe exemplare distincte.Organizarea ultrastructurala a complexului Golgi cuprinde trei elemente componente: a)

pachete de saci turtiti sau cisterne asezate în stiva; b) microvezicule si c) macrovezicule. Acesteelemente componente sunt delimitate de endomembrane (citomembrane), groase de 6-8 nm, netede,fara ribozomi atasati de suprafetele lor.

Sacii sau cisternele golgiene sunt polarizate morfologic si functional, prezentând:a) o fata cis sau proximala sau convexa sau imatura, formatoare, în strânsa relatie cu RER.

(Fig.5.39)

Fig.5.39 - Complexul Golgi - ultrastructura si relatii cu alte componente celulare

91



b) o fata trans sau distala, concava sau matura, îndreptata catre membrana celulara, unde seformeaza veziculele de secretie. Membrana sacilor si veziculelor este mai subtire (6 nm, ca la RE) pefata “CIS” si mai groasa (10 nm, ca la plasmalema), pe fata “TRANS”, tranzitia de la un tip demembrana la altul fac^andu-se la nivelul cisternelor.

Structurile complexului Golgi se găsesc în mişcare continuă, în sensul migrarii lor de la fata

imatura spre fata de maturare a organitului, încât microveziculele vor forma sacii Golgieni, iar dinacestia vor lua nastere macroveziculele si apoi veziculele secretorii.Microveziculele (sau veziculele de transfer) (vesicula) sunt cavitati sferoidale (de 20-80 nm),

delimitate de o membrana de 6 nm, sunt dispuse de obicei pe fata imatura “CIS” sau se găsesc întreRER si sacii Golgieni. Se formeaza prin gâtuirea capetelor dilatate ale RER, de care se desprindpierzându-si ribozomii de pe fata externa. Unele dintre microvezicule prezinta o membrana maigroasa decât a primilor saci golgieni si sunt pozitive la reactia pentru fosfataza acida, încât suntinterpretate a fi lizozomi primari formati în complexul GERL (Golgi - endoplasmic reticulum -lysosome). Restul microveziculelor fuzioneaza, formând astfel noi saci golgieni. (Fig.5.40)

Cisternele (sacii) golgieni (sacculus lamelliformis) formeaza componenta majoră acomplexului Golgi, având un aspect de saci turtiţi, usor curbati si dispusi paralel unii fata de altii siseparati între ei prin spatii regulate de 20-30 nm. Fiecare sac (cisterna) se aseamana cu o farfurie,având regiunea centrala mai subtire (1-7 nm) si periferia mai groasa. Numarul sacilor este variat

(între 3-12) putând sa ajunga în unele celule secretorii pâna la 20. Extremitatile laterale ale sacilor potprezenta pori sau prelungiri care sa anastomozeze sacii între ei sau sa-i lege de RE.

Fig.5.40. Formarea veziculelor de transfer

Macroveziculele sunt cavitati sferoidale sau ovoidale, cu diametrul între 200-600 nm,delimitate de o citomembrana groasa (8 nm), cu un continut amorf sau granular-heterogen, cu

material mai condensat si inegal la fluxul de electroni. Ele sunt situate de obicei pe fata de maturare -TRANS - a complexului Golgi si sunt interpretate ca fiind vacuole de secretie sau corpi decondensare a produsului secretat de celula.

Macroveziculele se formeaza din dilatatiile laterale ale sacilor golgieni, de care se desprind sise individualizeaza.

Numarul veziculelor de secretie difera de la un tip de celula la altul, fiind mai numeroase înfaza de maxima activitate a celulelor secretorii exocrine si endocrine.

Compozitia chimica a complexului Golgi contine 60% proteine de structura si protein-enzimesi 40% fosfolipide si colesterol.

Enzimele marker pentru complexul Golgi sunt: a) tiaminpirofosfataza (TPP), localizata maiales în interiorul sacilor golgieni de pe fata trans; b) nucleoziddifosfataza (NDP) prezenta în interiorulsacilor golgieni intermediari si c) unele glicoziltransferaze. Totodata complexul Golgi este bogat însulfatotransferaza, care intervine activ în sulfatarea polizaharidelor. De asemenea mai contine:citocrom-reductaza (ca si RE) 5-nucleotidaza (ca si membrana plasmatica), adenilat ciclaza,fosfataza acida (în veziculele sistemului GERL), ubiquinona, vitamina A si vitamina K.

92



Originea complexului Golgi. Structurile complexului Golgi se formeaza din membranelepreexistente ale sacilor golgieni. Nucleul controleaza sinteza proteinelor specifice din endomembranesi deci indirect influenteaza formarea complexului Golgi.

Functiile complexului Golgi sunt multiple, fiind reprezentate de:1) Functii legate de procesul de secreţie intracelulară, aparatul Golgi fiind implicat în: a)

concentrarea produsilor sintetizati în RE; b) prelucrarea produsilor sintetizati în RE prin procese

biochimice; c) sinteza de noi componente; d) stocarea si segregarea produsilor de secretie; e)ambalarea produsilor sub forma de vezicule; f) livrarea produsilor spre plasmalema. Produsul desecretie elaborat în RE ajunge la formatiunile golgiene prin microvezicule ce se detaseaza dincapetele reticulului endoplasmic rugos, functionând ca o naveta (suveica) cu frecvente deplasari dus- întors între RE si sacii golgieni. (Fig.5.41).

Fig.5.41 - Functiile complexului Golgi

2) Fabricarea de endomembrane pentru veziculele secretorii si din acestea mai departepentru plasmalema. În acest mod, membrana veziculelor de secretie se încorporeaza în plasmalema,compensând astfel pierderile de plasmalema prin endocitoza. Complexul Golgi participa la reciclarea(reutilizarea) membranelor veziculelor secretoare, ale veziculelor sinaptice si ale veziculelor deendocitoza. Prin acest proces, unele componente ale plasmalemei ca receptori, enzime sau unelemolecule informationale din mediul extracelular (hormoni peptidici, cotecolamine) sunt introduse încelula pe calea complexului Golgi, unde sunt modificate (glicozilate, sulfatate, fosforilate) saureparate. În acest mod, complexul Golgi îndeplineste rolul de a fi principala statie de reînnoire aendomembranelor si a plasmalemei.

Actiunea unor virusuri sau transformarea maligna a celulelor poate altera fluxul membranelor,atât în ceea ce priveste conexiunile dintre formatiunile delimitate de endomembrane, cât si în ceea ce priveste manifestarile functionale ale acestora.

3) Sinteza complexelor hidratilor de carbon. Complexul Golgi participa la sintezaglicoproteinelor prin faptul ca în structurile golgiene componenta primita de la RER se uneste cumoleculele de hidrati de carbon, cu ajutorul unor enzime aflate în organit (transferaze,glucozaminidaze). În complexul Golgi se desavârseste procesul de glicozilare a glicoproteinelor.Glicoproteinele sintetizate pot ramâne intracelular ca enzime lizozomale sau pot forma continutulveziculelor secretorii, care prin exocitoza ajung extracelular.

4) Formarea proteoglicanilor sulfatat i (condroitin sulfatatilor) si a glicoproteinelor sulfatate(mucina) se realizeaza prin procesul enzimatic de sulfatare a glicoproteinelor cu ajutorulsulfotransferazei golgiene.

93



5) Maturarea lipoproteinelor si a albuminelor . Lipidele sintetizate la nivelul reticululuiendoplasmic neted sunt transportate la complexul Golgian, unde are loc procesul de maturare sicomplexare cu proteinele.

6) Formarea lizozomilor primari are loc pe fata “cis” - imatura - sub forma unor microveziculepozitive pentru fosfataza acida. Enzimele lizozomale sintetizate în RER sunt transportate si împachetate fie în sistemul GERL, fie în vezicule de condensare.

7) Formarea acrozomului . În spermiogeneza, complexul Golgi ocupa o pozitie supranucleara, îsi modifica forma si realizeaza acrozomul , care elibereaza enzime litice la contactul cu ovulul.

5.5.4.Ciclul secretor

Ciclul secretor sau procesul secretor reprezinta o succesiune de etape pe care le parcurgproteinele de export din momentul sintezei si pâna la eliberarea lor în mediul extracelular. Se descriucinci etape obligatorii:

Fig.5.42. Desfasurarea ciclului secretor

1. Sinteza si segregarea proteinelor de export la nivelul RER. Initial proteinele sunt sintetizatepe polizomii neatasati membranelor RE, formati din ribozomi dispusi de-a lungul unei molecule deARNm la distante de 100 nucleotide. Într-un polizom, fiecare ribozom sintetizeaza independent câteun lant polipeptidic, care este adapostit în tunelul subunitatii ribozomale mari. Atunci când lantulpolipeptidic a atind un anumit stadiu de formare, ribozomii se ataseaza de membrana reticulului

endoplasmic într-o anumita pozitie care recunoaste o secventa specifica fiecarei proteine, denumitasecventa semnal, situata pe capatul terminal amino al peptidei care ia nastere. Acest semnal esteinterceptat de proteine specifice din membrana reticulului (denumite riboforine). În momentul atasariipolizomilor se formeaza un orificiu în membranele RER, în continuarea celui din subunitatearibozomala mare. Prin acest tunel trec în spatiul endoplasmic lanturile polipeptidice nou-formate.(Fig.5.42)

2. Transportul intracelular al proteinelor prin formatiunile reticulului endoplasmic rugos lacomplexul Golgi se realizeaza cu ajutorul microveziculelor , care sunt încarcate cu proteine sintetizatede polizomi si se îndreapta spre sacii golgieni.

3. Condensarea si maturarea proteinelor în structurile golgiene. Procesul de maturare saucondensare (cu durata de circa 1 ora) desavârseste conformatia cuaternara a proteinelor, realizându-se prin interactiunea proteinelor cu un peptidoglican sulfatat sintetizat în complexul Golgi. Din aceastainteractiune se formeaza agregate osmotic inactive însotite de eliberarea unor molecule de apa dinproteinele nou formate (deci de o concentrare a lor).

94



4. Depozitarea intracelulara se face sub forma veziculelor secretorii, care ramân un timp încitoplasma, dupa care sunt trecute în ectoplasma si mai departe în mediul extracelular, sub actiuneaunor hormoni sau neurotransmitatori.

5. Exocitoza este procesul prin care veziculele secretorii sunt trecute în mediul extracelular.

Este influentat de concentratia intracelulara a ionilor de calciu, de prezenta moleculelor de ATP siAMP-ciclic care provoaca contractia microfilamentelor care determina deschiderea veziculelor sieliminarea continutului în spatiul extracelular.

Prin exocitoza sunt eliberati din celula: hormonii, enzime, imunoglobuline, lipoproteine,neurotransmitatori, constituenti ai serului si laptelui, componente ale membranei celulare,glicocalixului sau alti produsi sintetizati în reticulul endoplasmic si condensati în complexul Golgi. Prinacelasi mecanism al exocitozei sunt eliminati si unii produsi terminali, metabolic inerti, nefolositori saudaunatori pentru celula.5.6. ORGANITELE DIGESTIEI INTRACELULARE

Digestia intracelulară cuprinde totalitatea fenomenelor care produc degradarea biochimică amoleculelor pătrunse în citoplasmă prin endocitoză, a unor organite uzate, a unor fragmente de celulăsau structuri celulare.

La procesul de digestie intracelulară participă două tipuri de organite: lizozomii şi peroxizomii.5.61. Lizozomii

Lizozomii (lysosoma) sunt organite celulare de formă sferică sau ovoidală (de 0,2 - 1 nmdiametru), prezenţi în citoplasma tuturor celulelor animale, cu excepţia hematiilor adulte.

Lizozomii au fost descoperiţi în 1950, de către DE DUVE prin tehnici de fracţionare celulară,ca particule ce sedimentează între mitocondrii şi microzomi şi conţin enzime hidrolitice cu pH optimde acţiune acid. Organizarea lor ultrastructurală a fost descrisă de către NOVIKOFF în 1956. Au maifost denumiţi corpi litici , saci de sinucidere sau stomacul celulei.

Organizarea ultrastructurală a lizozomilor cuprinde o membrană lizozomală şi matricealizozomală (Fig 5.43).

Fig. 5.43. Schema imaginii electronooptice alizozomilor

1- Membrană lizozomală;2- Matrice lizozomală.

Membrana lizozomală delimitează lizozomii,prezentând o structură comună endomembranelor,lipoproteică, mozaicată, cu o grosime medie de 6-8 nm.Membrana lizozomală poate fi dublă sau unică,prevăzută la exterior cu mici prelungiri numite spiculi. Eaacţionează ca o barieră între enzimele digestive şi

citosol, împiedicând pătrunderea acestor hidrolaze în matricea citoplasmatică. Hormoniiglucocorticoizi (cortizon, cortizol) şi colchicina activează ca stabilizatori ai membranei lizozomale, întimp ce vitaminele A, E, radiaţiile X şi ultraviolete, endotoxinele, hormonii steroizi sexuali (testosteron,progesteron), dezoxicorticosteronul, şocul osmotic, hipoxia, anoxia etc. acţionează ca destabilizatoriai membranei.

Matricea lizozomală prezintă aspecte diferite la microscopul electronic, putând apăreaomogenă, fin granular ă sau heterogenă încât se recunosc două tipuri majore de lizozomi: primari şisecundari .

Lizozomii primari sunt de talie mică şi au matricea omogenă sau fin granular ă fiind dotată cuun set incomplet de hidrolaze acide. Sunt lizozomi tineri, cu o viaţă scurtă (de 24-48 ore), neangajaţiîncă în activităţile de digestie intracelular ă. Conţinutul enzimatic variază în raport cu specia, stareafuncţională şi tipul celulei. Astfel, lizozomii primari ai polimorfonuclearelor neutrofile (microfage mobile)conţin o mare cantitate de neuroaminidază, care distruge membrana bacteriilor; - lizozomii

macrofagelor conţin multe fosfataze acide.Lizozomii secundari sunt heterogeni, conţinând în matrice structuri granulare şi membranoaseşi desf ăşur ând activităţi enzimatice digestive. Au o viaţă mai lungă (de la câteva zile la câteva

95



săptămâni), talia mai mare şi un set enzimatic complet. Se formează din fuziunea lizozomilor primari,cu veziculele de endocitoză ce conţin substanţe fagocitate, endocitate sau degradate din celule. Înfuncţie de modul în care s-au format, există mai multe tipuri de fagozomi secundari:heterofagolizozomi (heterophagosoma s. phagolysosoma), autofagolizozomi (autophagosoma),crinofagolizozomi, corpusculi reziduali (corpusculum residuale) şi corpi multiveziculari (corpusmultivesiculare).

Organizarea chimic ă a lizozomilor cuprinde un număr mare de hidrolaze acide (peste 50enzime), care pot degrada orice componentă a celulei: acizi nucleici (prin ribonuclează acidă),proteinele (prin colagenază, catepsină), glicogenul (prin alfa-glicozidază), mucopolizaharidele (prinalfa-monozidază).

Enzimele lizozomale sunt active numai la pH acid (4-6).

Fig. 5.44. Conţinutul enzimatic lizozomal şi acţiunile sale

Enzimele marker pentru identificarea lizozomilor pe secţiuni de ţesuturi sunt fosfataza acidă şiarilsulfataza, iar în timpul fracţionării celulare: fosfataza acidă, catepsina C, N-acetil-beta-glucozaminidaza. Niciodată un lizozom nu conţine întreg setul de enzime hidrolitice, încâtheterogenitatea lizozomilor este dată atât de numărul, cât şi de concentraţia unor enzime din matrice şimembrana lizozomală. Cea mai mare parte a enzimelor e localizată în matricea lizozomală, existândînsă enzime localizate numai pe membrana lizozomală, cât şi enzime cu dublă localizare în matrice şiîn membrană. (Fig. 5.44)

În afar ă de hidrolaze acide, lizozomii mai conţin conponente de origine extra sau intracelular ă,supuse digestiei şi aflate în diferite stadii de degradare. Datorită acestui aspect pentru identificarealizozomilor trebuie avute în vedere enzimele marker, atât la examinarea la microscopul electronic, câtşi la examinarea prin fracţionare celular ă.

Lizozomii pot fi comparaţi cu nişte “saci de sinucidere” ce conţin enzime (hidrolaze acide)care sunt eliberate în mediul intracelular, fie prin modificarea membranei lizozomale de către diferiţiagenţi toxici, chimici sau fizici (ca de exemplu: temperaturi foarte joase, raze ultraviolete, vitamina K),fie de către detergenţi care rup membrana. Odată eliberate în citoplasmă enzimele produc liza celulei.Eliberarea poate avea loc şi în mod normal în timpul unor fenomene de involuţie fiziologică (ca înevoluţia uterină post partum, în glanda mamar ă în perioada de post-lactaţie).

96



Fig.5.43. Lizozomi primari şi formarea lizozomilor secundari

1- Lzozom primar: a-membrană, b- halou, c-matrice; 2- Corp multivezicular;3- Fagozom; 4- Heterolizozom (heterofagolizozom); 5- Hetero lizozom cu materialdigerat; 6- Corp rezidual; 7- Mitocondrie; 8- Autofagozom; 9- Membrana nucleară.

Ph-ul optim (acid) pentru activitatea enzimelor lizozomale este asigurat de membranalizozomilor care conţine o proteină ce grupează ionii de hidrogen în lumenul lizozomilor folosindenergia rezultată din hidroliza ATP. Alături de enzimele hidrolitice acide, în lizozomi se mai găsesc încantităţi reduse lipide şi proteine de structur ă, iar în propor ţii foarte reduse glicolipide, flavine, acidhialuronic.

În funcţie de natura (substratul) materialului asupra căruia acţionează lizozomii există treitipuri de “digestie lizozomală”: a) heterofagia, când lizozomii acţionează asupra materialelor exogeneînglobate prin endocitoză; b) autofagia, când lizozomii acţionează asupra propriilor constituenţicitoplasmatici (exemplu: organite degenerate), segregaţi în “focare de citoliză”; c) crinofagia, cândlizozomii digeră unele materiale de secreţie celulară. (Fig. 5.45).

În heterofagie se diger ă intracelular, cu ajutorul lizozomilor substanţele nutritive, bacteriile,virusurile introduse prin endocitoză (fagocitoză, pinocitoză). În urma proceselor de endocitoză se

formează: fagozomi (phagosoma) (sau heterofagozomi), în cazul fagocitozei, pinozomi în procesul depinocitoză fără receptori şi receptozomi în pinocitoza mediată de receptori. (Fig.5.46)

97



Fig. 5.46. Schemă privind participarea lizozomilor la procesul de digestie intracelulară

Fagozomii, pinozomii şi receptozomii sunt antrenaţi prin mişcările din citoplasmă, cătreinteriorul celulei. Spre ei se îndreaptă chimiotactil lizozomii primari şi prin fuzionare, rezultă o singurăvacuolă, denumită lizozom-secundar sau heterolizozom sau heterolizom.

În interiorul lizozomilor secundari, enzimele hidrolitice lizozomale produc digestia în funcţie decomplexitatea materialului endocitat. Ca urmare a acţiunii enzimelor lizozomale se obţin produşi dedigestie micromoleculari (aminoacizi, nucleotide, hidraţi de carbon, lipide) ce vor traversa membrana

lizozomală, ajungând în citoplasmă, unde sunt folosite ca materie primă pentru procesele biosinteticesau ca sursă de energie. Pe măsură ce produşii de digestie părăsesc lizozomul secundar, acesta îşimicşorează volumul, producându-se simultan o invaginare a membranei lizozomale cu formarea unor vezicule (ca la pinocitoză), care vor fi şi ele digerate. Prezen ţa acestor vezicule mici în interiorul unuilizozom secundari dă aspectul de corp multivezicular (corpus multiveziculare), observabillelectro-microscopic.

AUTOFAGIA este procesul de digestie intracelulară, cu ajutorul enzimelor lizozomale, aorganitelor celulare epuizate sau uzate. În acest mod, mitocondriile uzate, peroxizomii, por ţiuni uzatede reticul endoplasmic sunt iniţial înconjurate cu o membrană, denumită înveliş de izolare provenit dinreticulul endoplasmic sau din aparatul Golgi. Se formează astfel vezicule (autofagozomi) sau vacuoleautofagice, ce conţin materialul intracelular ce trebuie îndepărtat. Autofagozomii fuzionează culizozomii primari, rezultând lizozomi secundari în care se produce digestia materialelor incluse. Oparte din produsele rezultate din digestie sunt eliberate în citoplasmă pentru a fi reutilizate, iar ceea

ce r ămâne formează corpii reziduali. Prin autofagie, lizozomii asigur ă reînnoirea (turn-over-ul)componentelor citoplasmei, deoarece mitocondriile au o viaţă de circa 12 zile, peroxizomii de 2-3 zile,

98



iar ribozomii de 10 zile. În ficat se distrug mai mult de un miliard de mitocondrii pe un gram de ţesut într-o or ă.

Procesele de autofagie sunt accelerate: a) în inaniţie când se remarcă o creştere a număruluide vacuole autofagice (de exemplu în ficat) sau b) în inactivitate ( în muşchi). De asemenea, seintensifică funcţia de autofagie în timpul morfogenezei ori de câte ori are loc involu ţia unor ţesuturi.

În unele situaţii, enzimele lizozomale sunt deversate în afara celulei, producând efecte litice,

prin acest mecanism osteoclastele digerând ţesutul osos.CRINOFAGIA reprezintă un aspect particular de autofagie observat în celulele secretorii

exocrine şi endocrine, prin care lizozomii intervin în reglarea cantităţii de produşi de secreţie ai celulei.În cazul în care în celulă se acumulează un surplus de vezicule secretorii, care nu

ajung să fie exocitate, acest surplus va fi digerat cu ajutorul lizozomilor primari care vor fuziona cuveziculele secretorii, formând crinofagolizozomii . Moleculele mici rezultate în urma digestiei sunttrecute în citosol unde sunt reutilizate (Fig. 5.47).

Fig.5.47. Participarea lizozomilor la

crinofagie1-Hormon sintetizat pe ribozom; 2-Segregare şi transport prin R.E.; 3-Vezicule Golgicu hormon; 5- Vezicule de secreţie; 6- Fuzionareaveziculei cu lizozomul.

Digestia în heterolizozomi şi în autolizozomieste incompletă, unele materiale nefiind digerabile.Lizozomii care, deşi şi-au terminat funcţiadigestivă, conţin încă resturi nedigerabile senumesc lizozomi terţiari , telolizomi sau corpi reziduali şi vor fi eliminaţi în cea mai mare parte

prin procesul de exocitoză. În cazul celulelor carenu se divid (neuronii, celulele musculare) corpiireziduali se pot întâlni în celulele în vârstă,formând granule de lipofuscină. În corpii rezidualise mai pot întâlni: figuri mielinice, ce reprezintăproduşi de degradare a fosfolipidelor, pigmenţihemoglobinici sub forma granulelor de

hemosiderină, substanţe injectate.Biogeneza lizozomilor începe în reticulul endoplasmic rugos, unde sunt sintetizate proteinele

componente (structurale şi enzimatice) ale lizozomilor. Microveziculele formate în RER şi caretransportă hidrolazele acide pot fi împachetate în sistemul GERL (scurtcircuitând structurile golgiene)sau în veziculele de condensare. (Fig. 5.48)

Fig.5.48. Formarea lizozomilor 1- Complexul Golgi; 2-Reticul endoplasmic neted; 3-

Reticul endoplasmic granular; 4- Veziculă autofagică; 6-Veziculă de fagocitoză; 7- Corp dens; 8- Corp multivezicular;9- Endocitoză; 10-Exocitoză

Implicarea lizozomilor în patologie

Lizozomii pot fi implicaţi într-o serie de procese patologicedeterminate de diverse substanţe (medicamente, toxinemicrobiene), introduse în celulă prin endocitoză, sau deunele boli congenitale. Sunt descrise în aceste condiţii

modificări ale structurii şi funcţiei lizozomilor precum: a)alterări morfologice şi funcţionale (creşteri în volum,intensificarea sau reducerea funcţiei datorită acumulării în exces a substan ţelor toxice endocitate); b)

99



alterări ale activităţii, prin activarea sau inhibarea mai multor hidrolaze acide; c) alterări ale stabilităţiimembranei, cu eliberarea enzimelor lizozomale în citoplasmă sau extracelular, provocând distrugereamatricei ţesuturilor.

Astfel, vitamina K şi expunerea prelungită la soare produc ruperea membranelor lizozomalecu distrugerea celulelor epidermice. Unele bacterii vii (bacilul turbeculozei, al leprei) sau toxoplasma(un protozoor parazit) inhibă fuziunea lizozomilor primari cu veziculele de endocitoză, permiţând

acestor microorganisme să distrugă celulele care le-au fagocitat. Uneori fuziunea lizozomilor primaricu veziculele endocitate are loc prematur, înainte ca membrana plasmatică să fi închis completvezicula, încât conţinutul enzimatic lizozomal este eliminat în spaţiul extracelular, producând inflamaţii(exemplu: în reumatism, în artrita gutoasă), afecţiuni în care se foloseşte colchicina, care inhibăfuziunea lizozomilor cu veziculele de endocitoză, împiedicând trecerea enzimelor lizozomale în mediulextracelular. În mucolipidoza II (sau boala cu celule I), enzimele lizozomale sunt lipsite de “semnalulde recunoaştere” (manoză-6-P) şi din acest motiv sunt eliminate şi nu mai pot fi recaptate, nefiindrecunoscute.

Lipsa unei enzime din setul de hidrolaze acide se datorează unui defect genetic şi determinăapariţia bolilor de depozit, denumite şi tezaurimoze lizozomice, care se manifestă prin acumularea, înlizozomii deficienţi, a substanţelor ce nu pot fi digerate din lipsa unei enzimei sau mai multor enzime.Astfel se acumulează lipide sau poliozide nedigerate, care, în final, ocupă celula şi compromit funcţiaei, afectând organe precum creierul, ficatul, splina.

În ultimii ani se foloseşte terapia lizozomotropică, care constă în administrarea unor medicamente legate de un vehicul transportor. Lizozomii desfac legătura dintre medicament şivehiculul transportor, medicamentul trecând în citoplasma celulei bolnave, în timp ce transportoruleste digerat.

În orice necroză celulară se distrug şi lizozomii încât trec în sânge unele enzime, care permitprecizarea diagnosticului (exemplu în necroză hepatică sau miocardică).5.6.2. PEROXIZOMII

Peroxizomii ( peroxysoma) sunt organite celulare comune şi permanente, care secaracterizează printr-un bogat conţinut în peroxidaze, enzime care catalizează reacţia de formare(oxidaza) şi de descompunere (catalaza) a peroxidului de hidrogen (sau a apei oxigenate H2O2).

Au fost observaţi la microscopul electronic în 1954, în rinichi de către RHODIN şi denumiţi“microbodies”. Mai târziu, DE DUVE şi colaboratorii, în urma unor cercetări de fracţionare ahepatocitului, le-au considerat ca organite distincte, ce au ca enzime marker: uratoxidaza, catalaza şi

D-aminoacidoxidaza. În celulele din cotiledoanele plantelor au fost descrişi sub denumirea deglioxizomi , deoarece conţin glioxilat şi participă la transformarea lipidelor în carbohidraţi. Denumireade glioxizomi este acceptată şi în cazul celulelor animale, pentru acei peroxizomi care, pe lângă alteenzime peroxizomale, mai conţin cel puţin două enzime ale ciclului glioxilat (malat-sintetaza sauizocitrat-liaza).

Forma, dimensiuni şi număr . Peroxizomii au o formă sferică sau ovală, uneori neregulată cuprelungiri. Au dimensiuni de 0,5 - 1 nm, variabile de la o celulă la alta. În funcţie de talia lor sedeosebesc două categorii de peroxizomi: macroperoxizomi , cu diametrul de o,5 - 1,5 nm şimicroperoxizomi , cu diametrul de 0,1 - 0,4 nm.

Numărul peroxizomilor apare diferit de la un tip de celulă la altul, iar în aceeaşi celulă, înfuncţie de momentul ei de activitate. În unele celule (exemplu celula hepatică), numărul peroxizomilor depăşeşte cu mult pe cel al lizozomilor.

Fig.5. 49. Organizarea ultrastructurală aperoxizomului1- Reticul endoplasmatic rugos;

2- Reticul endoplasmaticneted;2- Mitocondrie;

4- Peroxizom: a- membrană, b-matrice, c- cristaloid

Organizarea ultrastructurală a peroxizomilor cuprinde: o endomembrană, de 6,5 - 8 nmgrosime şi o matrice fin granular ă, mai densă lafluxul de electroni decât matricea lizozomală. Launii peroxizomi, în matrice se observă o zonăcentrală densă, numită miez sau cristaloid , carela un grosisment puternic apare format dintr-unmănunchi de tubuli paraleli şi denşi la fluxul de

100



electroni, care pe secţiune transversală dau imaginea unui fagure de miere. La unii peroxizomi se maiobservă în matrice prezenţa unei plăci marginale, cu aspect de regiune densă, îngroşată la periferie,cu funcţie încă neelucidată. Cristaloidul nu apare decât la unele specii şi conţine uratoxidaza. (Fig. 5.49)

Endomembrana peroxizomală, deşi prezintă o compoziţie asemănătoare cu a membranei

reticulului endoplasmic, diferă de aceasta prin unele polipeptide şi enzime din structura sa. S-a pututobserva, în unele cazuri atât o continuitate între membrana microperoxizomilor şi a reticululuiendoplasmic neted, dar şi o continuitate a membranei de la un peroxizom la altul, formând un “ reticul peroxizomal ”, diferit de reticulul endoplasmic.

Biogeneza peroxizomilor se poate realiza direct din reticulul endoplasmic prin dilatarea şidesprinderea unor păr ţi terminale ale cisternelor, care sunt pozitive pentru catalază. Mai frecvent,peroxizomii se formează prin reticulul endoplasmic - complexul Golgi, unele enzime peroxizomalesintetizându-se în reticulul endoplasmic rugos, iar altele (catalaza, uricaza) în ribozomii liberi, dupăcare sunt dirijate spre peroxizomi direct prin citosol.

În compoziţia chimică a peroxizomilor sunt prezente proteine, lipide şi enzime speciale,precum: catalaza (33% din proteinele peroxizomale, enzimă marker), uratoxidaza (uricaza), enzimeleciclului glioxilat, D-aminoacidoxidaza. Aceste enzime diferă ca număr şi specificitate de la unperoxizom la altul. Astfel, peroxizomii renali nu conţin sistemul enzimatic al beta-oxidării.

Funcţ ţ iile peroxizomilor sunt :1. Intervin în metabolismul peroxidului de hidrogen, într-o primă etapă în producereaacestuia, cu ajutorul oxidazelor, care folosesc oxigenul molecular pentru oxidarea unor substraturivariate, producând peroxidul de hidrogen ( H2O2 ), un produs toxic pentru celule. În etapa următoare,peroxidul de hidrogen este descompus, cu ajutorul catalazei, în oxigen şi apă.

2. Intervin în metabolismul acizilor nucleici deoarece prin uratoxidază, participă la degradareapurinelor (adenina şi guanina).

3. Participă la reglarea metabolismului glucozei , prin enzima denumită alfa-hidroxiacidoxidaza, care catalizează oxidarea lactatului la piruvat. Prin alfa-hidroxiacid-oxidaza şi D-amino-acidoxidaza (sau aminotransferaza), peroxizomii participă şi la procesul de gluconeogeneză(prin care se sintetizează glucoză pe seama unor precursori neglucidici). Cu ajutorul acestor enzimese realizează transferul ireversibil al grupărilor amino de la unii aminoacizi (leucina, fenilalanina)formându-se în acest fel alfa-cetoacizii care reprezintă substratul pentru gluconeogeneză.

4. Participă la beta-oxidarea acizilor graşi , împăr ţind această funcţie cu mitocondria, fiind însămai puţin activi, încât numai 1/4 - 1/5 din totalul oxidării acizilor graşi are loc în peroxizomi.Caracteristic apare faptul că peroxizomii oxidează acizii graşi, cu lanţ lung de atomi de carbon pânăcând lanţul s-a scurtat la 6 atomi de carbon, după care oxidarea este realizată de mitocondrii.

5. Produc acetil coenzima A şi reduc NAD+ la NADH , ambele substanţe fiind utilizate demitocondrie pentru producerea de ATP.

6. Participă la detoxificarea unor molecule deoarece membrana peroxizomilor este foartepermeabilă pentru ioni şi moleculele cu greutate moleculară mică. Astfel, jumătate din etanolulconsumat este oxidat în acetaldehidă.

7. Sintetizează plasmalogenii (substanţe asemănătoare cu fosfolipidele), care intră înproporţie de 10% în componenţa unor membrane.

8. Produc căldură, intervenind în termogeneză. Astfel numărul lor e crescut în ţesutul adiposbrun.

Implicaţii medicale. Peroxizomii sunt afectaţi în unele boli congenitale, fie prin absen

ţacatalazei ( acatalasemie), fie prin reducere numerică şi alterarea conţinutului enzimatic, în sindromul

cerebro-hepato-renal (Zellwegar). Este descrisă o reducere a funcţiei de oxidare a acizilor graşi culanţ lung de atomi de carbon în adreno-leuco-distrofii, boli genetice letale caracterizate prindistrugerea progresivă a substanţei albe din creier şi a corticosuprarenalei.

S-a observat o relaţie între peroxizomi şi cancer, peroxizomii lipsind total în tumorile cuproliferare rapidă.

Peroxizomii cresc numeric şi în dimensiuni în unele infecţii virale (exemplu, în hepatită) saudupă administrarea de medicamente ce scad lipemia. Hipertiroidia determină o proliferare hepatică aperoxizomilor şi în consecinţă o creştere remarcabilă a activităţii catalazei şi a beta-oxidării acizilor graşi cu lanţ lung de atomi de carbon.

5.7.Incluziunile celulare

101



Incluziunile (sau pseudoincluziile) celulare, sau citoplasmice (inclusiones cytoplasmicae) suntformaţiuni prezente în matricea citoplasmatică în care pot fi depozitaţi temporar sau definitiv diferiţiproduşi ai metabolismului. Aceste depuneri, denumite incluziuni pot conţine: a) substanţe de rezervă(proteine, glucide, lipide, vitamine, minerale, cristale şi cristaloizi); b) produşi de elaborare (granule dezimogen, granule de mucus, de pigment, hormoni); c) produşi de dezasimilaţie (pigmentul

lipofuscinic).Proteinele se depozitează ca substanţe de rezervă în fibrele musculare, hepatocite şi învitelusul oului, putându-se prezenta ca granule fine sau mase omogene. Se pot evidenţia prin reacţiaMILLON (când apar roşii), prin reacţia xantoproteică ( când apar galbene) şi prin impregnări argentice(când apar brune). (Fig.5.50)

Lipidele se prezintă sub forma unor picături sferice de diferite mărimi. Ele se evidenţiază însecţiuni, obţinute la criostat, unde se pot colora în galben (cu Sudan III ), în roşu (cu SARLACH ), înnegru (cu Sudan negru ). Lipidele sunt frecvente în: hepatocite (în cantităţi diferite în funcţie dediverse stări fiziologice şi patologice); - în celulele producătoare de hormoni steroizi dincorticosuprarenală, ovar, corp galben, testicul, unde formează substratul în steroidogeneză. Înlipocitele din ţesutul adipos alb, lipidele formează o bulă mare, ce ocupă aproape în întregime celula,pe când, în ţesutul adipos brun apar forme de picături mici, dispersate în citoplasmă.

Fig.5.50. Incluziuni celulare1- Granule; 2-Bocuri; 3- Depozite perinucleare; 4—Granule de cherato-hialină şi eleidină (în

celulele epiteliale); 5- Mucopoliozide neutre (în glandele uterine); 6- Mucopoliozide acide în celulelecervixului); 7- Adipocit alb; 8-9 Vezicule cu lipide (în celula luteinică); 10-Cristale Reinke ( în celulaLeydig, din testicul); 11- Granule de zimogen (în celulele seroase); 12-Hemoglobină (în hematie);13-Melanină (în melanocite); 14- Vitamina C; 15- Cristale de colesterol

102



Glucidele se depozitează sub formă de glicogen, în special în hepatocite şi în fibrelemusculare. Histochimic se evidenţiază prin metoda PAS (periodic acid SCHIFF) sau prin colorare cucarmin BEST , când apar sub formă de roşu violaceu, grupate în grămezi sau plaje. Laelectronomicroscop, glicogenul poate apare: a) sub formă de particule mari , neregulate sau în formăde rozetă cu diametrul de 150 nm ( particule alfa); b) cu aspect de particule mici , cu formă debastonaşe lungi de 20 - 30 nm ( particule beta). În unele boli de depozit sau în diabet, glucidele pot

apare şi în nucleu.Incluziuni citoplasmatice

Denumire Conţin :Incluziuni cu substante de rezervă proteine,lipide, glucide,vitamine, mineraleIncluziuni cu produsi de elaborare hormoni,granule de zimogen, granule de mucigen, vezicule

de secreţie, etc.

Incluziuni cu pigmenti endogeni

a.Carotenoizi : lipocromi, luiteina, caroten protidele(iodopsina, rodopsina, caroten-albumina) ;

b.Cromolipozi (de dezasimilaţie): lipofuscina, hemofuscina ;

c.melanici : melanina

d. cu nucleu tetrazolic : hemoglobina, mioglobina,hemosiderina ;

Pigmenti exogeniParticule de cărbune (în antracoză) ;Particule de fier (în sideroză) ;Particule de siliciu (în sideroză)

Vitaminele se pot evidenţia în epitelii prin fluorescenţă naturală (vitamina A), sau prinimpregnaţie argentică (metoda Cater) în corticosuprarenală, gonade, hepatocite şi fibre musculare.

Incluziile minerale de fier, cupru, potasiu, calciu se prezintă cu aspect de granule, ce pot fievidenţţiate prin metode citochimice specifice.

Incluziile cristaloide sunt prezente în citoplasma celulelor interstiţiale din testicul sub forma

cristalelor REINKE , fine, polimorfe.Produ şii de elaborare apar sub forma unor incluzii diferite precum: granulele de zimogen (lapolul apical al celulelor seroase din pancreas); granulele de mucigen (la polul apical al celulelor mucoase şi în celulele caliciforme); hormonii (în celulele glandelor endocrine); pigmen ţ i (melanina înmelanocite). Aceste incluzii se evidenţiază prin diferite metode histochimice: cu roşu Magenta(zimogenul), cu mucicarmin (mucusul) sau prin colorare naturală proprie în cazul pigmenţilor.

Pigmenţii pot fi de origine endogenă sau exogenă.Pigmenţii endogeni sunt reprezentaţi de: carotenoizi, cromolipoizi, pigmenţi melanici şi

pigmenţi cu nucleu tetrazolic.Carotenoizii sunt de obicei asociaţi cu lipidele şi sunt reprezentaţi de: lipocrom (pigmentul

ţesutului adipos, la cabaline), luteina (în celulele corpului galben din ovarul mamiferelor),carotenproteidele (carotenalbumine, iodopsina şi rodopsina din celulele cu conuri şi bastonaş dinretină).

Cromolipoizii sunt: pigmenţi de culoare brună sau neagră (lipofuscina), rezultaţi în urmadezasimilaţiei în neuroni, hepatocite, zona reticulară a corticosuprarenalei, miocard, celuleleinterstiţiale Leydig, sau hemofuscina întâlnită în focare hemoragice.

Pigmenţii melanici sunt de culori diferite: neagră, brună sau galbenă. Cel mai cunoscut estemelanina, prezentă în melanocitele pielii, coroidei, proceselor ciliare, irisului şi stratului pigmentar dinretină.

Pigmenţii cu nucleu tetrazolic sunt reprezentaţi de: hemoglobină (în eritrocite), mioglobina (înmuşchi), hemosiderina (în celulele sistemului macrofagic monocitar din măduva hematogenă, ficat,pulmoni).

Pigmenţii de origine exogenă provin din mediul extern şi sunt încorporaţi prin aer sau prinfuraje, producând impregnarea ţesuturilor cărora le imprimă devieri de la coloraţia naturală specifică.Astfel, impregnarea cu particule de praf (cărbune) produce antracoza, cu localizări mai frecvente înpulmoni la carnasiere, în limfocentrul bronşic, la rumegătoare şi în mucoasa duodenală la păsări; -

impregnarea cu pulberi de fier produce sideroza cu localizare predominant pulmonară; impregnareacu pulberi de siliciu (nisip) produce silicoza, frecventă la ovinele ce pasc pe terenuri cu nisipuri foarte

103



fine; furajele bogate în caroten (exemplu morcovul) imprimă o coloraţie gălbuie ţesuturilor la suine şila păsări datorită carotenilor din vitelus.

6. Reproducerea celulara

Reproducerea celulară este fenomenul prin care se asigură continuitatea în timp a celulelor şi

constă în esenţă în faptul că dintr-o celulă se obţin două celule. Acest proces are loc în cursuldiviziunii celulare, care devine posibilă numai după ce a avut loc o reproducere biochimică saumoleculară, care necesită atât materiale nutritive şi energie, cât şi informaţie genetică.

Reproducerea biochimică se produce în cel puţin 4 faze: 1) acumularea de substanţeanorganice; 2) sinteza enzimatică a unor substanţe organice simple (aminoacizi, monozaharide etc.);3) sinteza proteinelor şi 4) sinteza (sau replicarea) ADN-ului, care este esenţială pentru declanşareadiviziunii.

În cursul reproducerii biochimice are loc dublarea masei celulare, duplicarea componentelor şise produce un complex de evenimente ce se succed ciclic, realizându-se un ciclu celular.

6.1. Ciclul celular

Ciclul celular (cyclus cellularis) sau ciclul de viaţă al unei celule este perioada de timp cuprinsă

între momentul apariţiei unei celule şi momentul terminării propriei diviziuni. Ciclul vieţii celularecuprinde două mari perioade sau faze: a) diviziunea celulară (notată cu M de la mitoză) (periodusmitoticus) şi b) interfaza sau intercineza (periodus intermitoticus), perioada dintre două diviziunisuccesive sau perioada ce precede diviziunea. Mult timp s-a considerat în mod greşit că în interfază(în perioada situată în afara diviziunii) “celula se odihneşte”. Prin folosirea metodelor biologieicelulare, s-a observat că interfaza este perioada din viaţa celulei cu maximă activitate metabolică,deoarece în cursul ei se produce sinteza ADN-ului, ARN-ului şi a proteinelor din celulă.

Etapele ciclului celular

Faze Perioade Puncte de restricţiePerioada presintetică (G1)

Interfaza Punct de restricţie (R 1)

Perioada sintetică (S)Perioda Postsintetica (G2)Punct de restricţie (R2)

ProfazaPrometafaza

Mitoza MetafazaAnafazaTelofaza

În timp ce sinteza ARN şi a proteinelor are loc în toată interfaza, sinteza ADN are loc numai într-o anumită perioadă, numită perioada sintetică (şi notată cu S) care este precedată de o perioadăpresintetică (notată cu G1) şi succedată de o perioadă postsintetică (notată cu G2).

Un ciclu celular complet (cu durata de circa 16 ore) cuprinde patru perioade: 1) G 1

(intervallum ambiguum s.postmitoticum))- intervalul de timp de 5 ore de la sfârşitul mitozei până la începutul sintezei de ADN; 2) S - perioada sintezei de AND( synthesis genomica) de circa 7 ore; 3)G2 (intervallum premitoticum) - intervalul de timp de la sfârşitul sintezei de ADN şi începutul diviziuniide circa 3 ore şi 4) M - diviziunea celulară de circa 1 oră.

La celulele eucariote ciclul celular durează 10-25 ore. Durata lui variază în funcţie de specie,tip celular şi chiar de la o celulă la alta în cadrul aceluiaşi ţesut. Dintre perioadele ciclului, perioada G1

are durata cea mai variabilă, putând să difere, la unele celule, în timp ce perioada S sau G 2 este ceamai constantă pentru un anumit tip celular. Astfel există celule care se divid foarte rapid, parcurgândciclul în 8 ore, în timp ce altele se divid mai rar, având ciclul de 100 zile sau mai mult. (Fig.6.1)

104



Fig.6.1. Diagrama cicluluicelular

G0_ - Perioada de repausG1 –Peroada presinteticăS – perioada sinteticăG2 – Perioada postsintetică

Există două momente denumite puncte de restricţie a căror depăşire permite parcurgereaetapelor următoare. Primul şi cel mai important punct de restricţie este între perioadele G 1 şi S1, iar cel de-al doilea este între perioadele G2 şi M. Într-o populaţie de celule, momentul depăşirii punctuluide restricţie (punctul R) diferă de la o celulă la alta, încât nu toate celulele parcurg în acelaşi timpetapele ciclului celular, găsindu-se în diferite etape. Datorită acestui aspect populaţiile celulare suntasincrome.

Nu se cunoaşte precis care este factorul care determină trecerea unei celule de mamifer dincolo de punctul R. Practic se consideră că depăşirea punctului de restricţie G 1/S depinde derealizarea unei concentra ţ ii prag a unei proteine instabile, denumită proteina U de la “unstable”. Într-ocelulă, proteina U poate trece pragul concentraţiei numai când este sintetizată rapid. În momentul

realizării pragului de concentraţie, proteina U determină începerea replicării ADN şi în consecinţătrecerea celulei din faza G1 în S. Inhibarea sintezei proteinelor şi în mod implicit a sintezei proteinei Upoate explica prelungirea fazei G1.

Existenţa punctului de restricţie G1/S constituie o rezervă de supravieţuire a celulei, care încondiţii vitrege, sintetizează în primul rând “proteine de întreţinere”, iar sinteza proteinei U va firedusă, încât deşi celula nu se divide, ea rămâne vie pentru perioade lungi de timp, chiar şi în condi ţiide “inaniţie severă”. În condiţii în care celula este lipsită de aport nutritiv în alte perioade ale cicluluicelular, ea nu va supravieţui. În acest mod, punctul de restricţie G1/S apare ca un “punct de odihnă”sigur pentru celulele care din cauza condiţiilor de creştere sau interacţiunilor cu alte celule trebuiesă-şi oprească diviziunile. Celulele care se află oprite în această stare stabilă se află în faza “G 0” aciclului celular.

Un alt punct de restricţie se află la sfârşitul perioadei G 2. Inhibarea sintezei proteinelor înaceastă fază împiedică intrarea celulei în diviziune. Se consideră că la sfârşitul perioadei G2 este

activată

o proteinkinază solubilă, care catalizează fosforilarea proteinelor din membrana nuclear ă şi ahistonelor H1. Fosforilarea proteinelor din membrana nucleară induce dezasamblarea învelişului

nuclear, iar fosforilarea histonelor H1 produce condensarea cromozomilor, fenomen caracteristicdiviziunii.

În raport cu modul în care parcurg ciclul celular, se disting trei categorii de celule:I - Celulele care şi-au pierdut capacitatea de a se divide, după parturiţie, fiind oprite în faza

G1, ca de exemplu: neuronii, celulele musculare.II - Celulele care au o capacitate scăzută de a se divide (hepatocitele, unele celule

endocrine), dar care în condiţii speciale se pot divide rapid. Astfel, hepatocitele se divid rapid dupăhepatectomie, refăcând celulele pierdute.

III - Celulele care se divid rapid, ca de exemplu celulele măduvei osoase hematogene, dinepiderm, din epiteliul mucoasei intestinale, celulele liniei germinative spermatogene. Aceste celule sepot găsi în ţesuturi în două compartimente (grupe) celulare: a) un compartiment proliferativ, cecuprinde celulele care se divid rapid şi b) un compartiment neproliferativ, ce cuprind celule care nu sedivid decât în anumite condiţii. Astfel, se petrec fenomenele în ţesuturile în care o parte din celulelematerne se pierd în mod fiziologic, ca de exemplu celulele din epiteliul mucoasei intestinale, care se

105



descuamează după 3-5 zile; hematiile care se distrug după 120 zile de viaţă. Pierderile de celulemature sunt compensate prin trecerea constantă a unor celule de rezervă, numite şi celule sursă, saucelule stem, aflate în faza G0, din compartimentul neproliferator în compartimentul proliferator.Trecerea din faza G0 se face sub acţiunea unor stimuli specifici, reprezentaţi de substanţelemitogene, adică de cele ce induc mitoza, precum: eritropoietina, factorii de creştere ai unor celule (ainervilor, ai fibroblastelor), poliamina (exemplu putrescina), hormoni (estrogeni). Pot ac ţiona însă şi

factori tisulari, cum sunt chalonele (peptide sau glicoproteine), care inhibă diviziunile celulare.

Tip Modalitati Faze Etape StadiiInmugurire

Diviziunea Clivajdirectă(amitoza)

Sciziparitate

ProfazaMitoza Prometafaza(Diviziunea Metafazanereducţională) Anafaza

Telofaza

Meioza I(reductională)

Profaza I Leptonema

ZigonemaPachinemaDiplonemaDiachineza

Prometafaza IDiviziunea Meioza Metafaza Iindirectă (Diviziunea Anafaza I

reducţională) Telofaza IInterfaza

Meioza II(nereducţională)

Profaza IIPrometafaza IIMetafaza IIAnafaza IITelofaza II

6.2. Diviziunea celularĂ

Diviziunea celulară (divisio cellularis) este acea perioadă a ciclului celular în care serealizează distribuirea materialului genetic la cele două celule fiice. Există două modalităţi de realizarea diviziunii celulare: a) diviziunea directă (sau amitoza) şi b) diviziunea indirectă, care poate fi de douăfeluri: mitoză sau meioză.

6.2.1.Diviziunea directă

Diviziunea directă sau amitoza(amitosis) reprezintă forma inferioară dereproducere celulară, caracteristicăorganismelor unicelulare. La metazoareapare fie în procesele de regenerare,fie în condiţii patologice în unele procesetumorale. Secaracterizează prin lipsa aparatuluimitotic, iar materialul genetic esteinegal distribuit, putându- se produceerori în distribuţie. Cele mai frecventemodalităţi de diviziune directă sunt: înmugurirea, sciziparitatea, c(Fig.6.2.)

106



Fig.6.2. Diviziunea directă - amitoza

6.2.2.Diviziunea indirectă

Se caracterizează prin procese mai complexe, ce constau în modificări sincrone încitoplasmă (cytokinesis) şi nucleu (nucleokinesis), ce realizează o distribuire egală a materialuluigenetic la celulele fiice.

Există două tipuri de diviziune indirectă: a) mitoza sau diviziunea ecuaţională, întâlnită lacelulele somatice şi produce celule diploide; b) meioza sau diviziunea reducţională, întâlnită numai lacelulele gametogene şi produc celule haploide.

107



Fig. 6.3. Mitoza1- Centrul celular; 2- Spirem; 3- fusul de diviziune;4- Cromozom; 5-Placă

metafazică;6- Inel contractil

108



6.2.2.1.Mitoza

Mitosa (mitosis) are o durată totală de circa 60 minute la om şi se desfăşoară în patru faze:a) profaza ( prophasis), împreună cu o fază intermediară - prometafaza (30 minute sau 50% dindurata totală); b) metafaza (metaphsis) (8 minute sau 13,4%); c) anafaza (anaphasis) (4 minute sau6,6%); d) telofaza (telophasis)(18 minute sau 30%).

ProfazaSe remarcă printr-o serie de fenomene caracteristice, ce se desfăşoară atât în citoplasmă,

cât şi în nucleu. (Fig.6.3.) În citoplasmă:1) Devine vizibil cel de-al II-lea centru celular (centrozom), dublarea centriolilor realizându-se

prin asamblarea unui centriol nou (centriolum filiale), din depozitul de tubuline al citoplasmei.Polimerizarea tubulinelor are loc începând din faza “S”.

2) Separarea şi îndepărtarea centriolilor centrosomului spre polul celulei, între ei realizându-se un fus de diviziune (fusus mitoticus), format din filamente structurate pe seama microtubulilor.

În nucleu: 1) dispare nucleolul; 2) se condensează cromatina nuclear ă sub forma unui spirem(sau ghem ) (glomus), iniţial compact (glomus compactum) şi apoi lax (glomus dispersum) din care sedesprind cromozomii sub formă de bastonaşe.

În nucleol - componenta amorfă se desprinde şi se amestecă cu sucul nuclear, iar restulstructurii se ataşează pe fragmentele cromozomilor SAT.

În prometafază: 1) dispare nucleolema (membrana nucleară) prin acţiunea proteinkinazeisolubile (conţinute în lizozomi) care produce fosforilarea proteinelor din membrană; 2) cromozomii încep să interacţioneze cu fibrele fusului de diviziune. Ei execută mişcări oscilatorii agitate, iar datorităcontracţiei tubulinei, cromozomii se deplasează spre mijlocul fusului de diviziune. Viteza lor dedeplasare variază de la un cromozom la altul, ultimul ajungând cromozomul X.

În metafază:1) Cromozomii sunt dispuşi la nivelul ecuatorului fusului(equator fusi) de diviziune, cu axul lor

lung perpendicular pe axul fusului, realizând o placă metafazică (lamina equatorialis).2) În placa metafazică, cromozomii se despică (clivează) longitudinal, încât cele două

cromatide surori se despart. În urma acestei clivări longitudinale se dublează numărul de cromozomi(exemplu la taurine, din 60 rezultă 120 cromozomi monocromatidici ), iar materialul genetic sedistribuie în mod egal la celulele fiice.

Fiecare din fibrele fusului de diviziune este alcătuit dintr-un mănunchi de circa 100 microtubulişi proteinele asociate lor. În structura fusului de diviziune (fusus mirtoticus) se disting două categoriide fibre, în funcţie de modul lor de ancorare la capete: a) fibre polare (centrozom-centrozom)(microtubulus continuus), cele mai numeroase, dispuse de la un pol la altul; b) fibre cinetocorice(centrozom-kenetocor) sau fibre de jumătate de fus (microtubulus chromosomaticus), ancorate cu uncapăt pe centrozom şi cu celălalt pe cinetocorii cromatidelor (câte doi pentru fiecare centromer al unuicromozom). Fibrele cinetocorice sunt alcătuite din mănunchiuri de microtubuli ce radiază în direcţieopusă de pe cea cinetocori ai fiecărui cromozom. Ele servesc la aşezarea cromozomilor în placametafazică, având capetele pozitive (+) blocate în cinetocori, iar capetele negative (-) libere. (Fig.6.4.)

Fig.6.4. Schema fusului de diviziuneA-Începutul metafazei; B – Sfârşitul metafazei1- Centrozom; 2- Cromozom; 3- Fibră polară;

4- Fibră cinetocorică

109



Dacă fusul este distrus nu se mai produce diviziunea celulară, pe acest fapt bazându-seutilizarea unor medicamente citostatice (ca vinblastina sau vincristina).

AnafazaSe caracterizează prin deplasarea cromatidelor devenite cromozomii fii spre cei doi poli ai

celulei. Deplasarea spre polii celulei este rezultatul a două evenimente independente: a) mişcareaspre poli a fibrelor cinetocorice prin depolimerizarea capetelor libere (negative) ale microtubulilor şiantrenarea cu ele a cromatidelor ataşate; b) alungirea prin polimerizare la capătul pozitiv (+) a fibrelor polare, producându-se distanţarea celor doi poli. Alunecarea fibrelor polare are la bază sistemul motilmicrotubul-dineină.

Telofaza

Începe în momentul în care cele două grupe cromozomiale au ajuns la cei doi poli celulari şifuzionează aparent formând câte un spirem. În jurul spiremului se reface învelişul nuclear prindefosforilarea proteinelor laminare. Totodată se refac nucleolii, datorită acţiunii cromozomilor SAT, iar nucleul îşi recapătă structura din interfază, cromatina luându-şi aspectul de reţea şi granule.

Clivarea citoplasmei la nivelul plăcii ecuatoriale, în cursul fenomenului denumit citodiereză

sau citokineză (cytokinesis), începe prin apariţia unui şanţ pe suprafaţa celulei (constrictiocytoplasmatica), datorită activităţii unui inel contractil, prezent sub plasmalemă.Inelul contractil (anulus equatorialis) este format dintr-un mănunchi de filamente de actină, ce

începe să fie asamblat încă de la începutul anafazei. Inelul îşi micşorează diametrul prindepolimerizarea filamentelor sale, necesitând prezenţa ionilor de calciu.

Suprafaţa totală a celor două celule fiice este mai mare decât a celulei mamă, fapt cenecesită o biogeneză de plasmalemă. Se constată că biogeneza plasmalemei începe înainteadiviziunii, observându-se prin microscopia de baleaj că pe măsură ce celula trece din faza G1 în fazaS şi apoi în faza G2, suprafaţa ei devine din ce în ce mai “păroasă” prezentând microvilozităţi carereprezintă rezerva de membrană necesară pentru învelirea celulelor fiice, ce au foarte puţini microvili.

În urma mitozei, dintr-o celulă mamă rezultă două celule fiice având aceeaşi cantitate deADN şi acelaşi număr de cromozomi ca şi celula mamă. Gradul de asemănare al celulelor fiice cucelula mamă permite să se distingă patru forme de mitoză: homotipică, heterotipică, asimetrică şi de

întinerire.În mitoza homotipică ( sau homoplastică ) celulele fiice sunt asemănătoare între ele şi cucelula mamă. Este întâlnită la celulele nediferenţiate (foarte tinere).

În mitoza heterotipică ( sau heteroplastică ), celulele fiice sunt asemănătoare între ele, dar sunt mai mature, mai diferenţiate decât celula mamă, fapt pentru care se mai numeşte şi mitoză dediferenţiere.

În mitoza asimetrică ( homo-heteroplastică ), una din celulele fiice seamănă cu celula mamă,iar cealaltă este diferită.

În mitoza de întinerire (sau de dediferenţiere), celula mamă dă naştere la celule „mai tinere”(active), cu potenţialităţi biologice caracteristice formelor tinere (active) ale celulei mamă. Seîntâlneşte la limfocit, care prin diviziune dă naştere la două limfoblaste.

Factorii care determină mitozele sunt încă insuficient precizaţi. Mitoza apare ca o fazăobligatorie a ciclului celular ( în situaţia în care s-au depăşit punctele de restricţie) şi ca o consecinţăa dublării masei şi componentelor celulei, fiind declanşaţi de o serie de factori ce pot fi încadraţi în treigrupe: a) factori generali , ca: temperatura, lumina, hormonii (tiroidieni, hipofizari), vitamine; b) factori intracelulari , ca: modificarea raportului nucleo-citoplasmatic şi nucleolo-nuclear (ca şi cum volumulcrescut al citoplasmei nu ar mai putea fi controlat de nucleu, făcând necesară diviziunea celulei); c)factori intercelulari , precum raportul care trebuie să existe, în fiecare ţesut, între celulele uzate şi celecare se divid. Sunt cei mai importanţi în cazul în care un grup de celule moare, se declanşeazădiviziunea unui alt grup de celule printr-un mecanism de retro-acţiune (“feed-back”), încât raportul între cele trei categorii de celule să rămână aproximativ acelaşi.

6.2.2.2. Meioza

110



Meioza (meyosis s. cyclus meioticus) se caracterizează prin faptul că reduce la jumătatenumărul de cromozomi ( deci materialul genetic), încât plecându-se de la celule diploide, se ajunge lacelule haploide, care conţin numai câte un cromozom din fiecare pereche de omologi şi

Fig.6.5. Comparaţie între mitoză şi meioză

111



numai un cromozom de sex. Este prezentă în procesul de maturare al gameţilor. Permite ca, prinprocesul fecundării, din două celule haploide să rezulte o celulă diploidă, din care se poate dezvolta înmod normal întregul organism (Fig.6.5).

Meioza este alcătuită din două diviziuni indirecte care se succed fără ca între ele să se maiproducă sinteza de ADN. Prima diviziune se numeşte meioza I şi este reducţională, în timp ce a douadiviziune se numeşte meioza II şi este nereducţională, apărând ca o mitoză homoplastică.

Meioza I apare mai complicată, cu o profază specifică în care se petrec fenomenecaracteristice. Poate dura zile, luni şi ani de zile (în funcţie de specie), iar profaza este foarte lungă,ocupând 90% din această durată. Astfel, ovocitele primare rămân în profaza I până la pubertate, iar spermatogoniile intră în meioză numai la pubertate.

Profaza I ( prophasis I) cuprinde 5 faze (etape, stadii) succesive: leptonema, zigonema, pachinema, diplonema şi diachinezis.

1) În leptonemă (leptonema), se produce condensarea cromatinei, încât cromozomii devinvizibili cu aspect de filamente lungi, cu diametrul neuniform. Ei se ataşează cu ambele capete de învelişul nuclear la nivelul unor structuri denumite plăci de ataşare . Fiecare cromozom deci esteduplicat şi format din 2 cromatide surori, intim ataşate una de alta încât în lungul cromozomului seformează o lamă proteică, denumită axă. (Fig.6.6).

Fig. 6.6. Modificarea cromozomilor în profaza I a meiozei - schemăA- Interfază; B-Leptoten; C-zigoten; D-Pahiten; E- Diploten şi daicinezisA, b, c, d - cromatide

2) În zigonemă (zygonema), caracteristic este fenomenul de sinapsă sau conjugarea(conjugatio) cromozomilor, care constă în faptul că, cromozomii omologi (chromosoma homologum)( din aceeaşi pereche), unul din setul matern şi altul din setul patern se apropie şi se alipesc, dar nufunzionează. Cromozomii omologi sunt legaţi unul de altul printr-o reţea proteică, denumită complex sinaptolemal (complexus synaptonematicus), ce se întinde pe întreaga lungime a cromozomilor,ancorându-se la cele două capete de învelişul nuclear. Complexul sinaptolemal realizează aliniereaperfectă a celor doi cromozomi, încât genele alele să fie situate faţă în faţă. (Fig.6.7.)

112



Fig.6.7. Structura complexului sinaptolemal din

cromozomul bivalent1- Modul de recombinare; 2- Element central;3-Elemente laterale;

a-b şi c-d – cromatide surori.

3) În pachinemă (pachynema), cromozomiisunt mai condensaţi. Pachinema începe în momentul încare sinapsa (synapsis) este completă şi are dreptcaracteristică fenomenul de crossing-over (decussatio),ce constă în ruperea unei cromatide materne şi a uneicromatide paterne în acelaşi punct din lungimea

cromozomului şi sudarea încrucişată a fragmentelor, încât un fragment situat iniţial pe un cromozompatern ajunge pe cromozomul matern şi invers.

Fiecare pereche de cromozomi omologi estedenumită cromozom bivalent (chromosomabivalens) sau tetradă (chromosoma tetravalens),deoarece fiecare cromozom omolog este clivat îndouă cromatide surori, încât într-o pereche existăpatru cromatide. (Fig.6.8)

Fig.6.8. Schema tetradei şi a fenomenului decrossing-over

113



1- Centromere; 2- Chiasma;a-b şi c-d –cromatide surori

Prin schimbul de fragmente între cromozomi omologi se realizează un schimb de gene, cu un

rol extrem de important în ereditate, încât gametul unui individ va avea în final gene ce provin de lacromozomul patern, cât şi gene ce provin de la cromozomul matern. În acest fel, un cromozombivalent, va cuprinde tot patru cromatide, din care una este paternă pură, alta maternă pură, iar celedouă cromatide între care s-a efectuat schimbul de material genetic sunt mixte.

Acest schimb de gene între cromozomii omologi (chromosoma homologicum), denumit şirecombinare genetică sau fenomen de crossing-over este universal şi are importanţă foarte mare întransmiterea caracterelor ereditare.

Fig.-6.9. Comparaţie între mecanismele alinierii şi separarii cromozomilor în meioza I şimeioza II

4) În diplonemă (diplonema), cromozomii rezultaţi după crossing over (cromosomameioticum) încep să se despartă (să realizeze desinapsa ). Ei rămân, însă, legaţi în punctele numite

chiasme, în care s-a produs crossing-overul.La ovocite, diplonema poate dura luni sau ani de zile, deoarece cromozomii sedecondensează şi începe sinteza de ARN.

5) În diachinesis (diakinesis), încetează sinteza ARN-ului, cromozomii se condensează, se îngroaşă şi se detaşează de învelişul nuclear. Fiecare cromozom bivalent conţine patru cromatide,din care cromatidele surori sunt unite la nivelul centromerilor, iar cele nesurori, mixte, între care s-aprodus crossing-overul sunt unite la nivelul chiasmelor.

În concluzie, în profaza I au loc trei importante fenomene caracteristice: 1) condensareacromozomilor; 2) conjugarea sau sinapsa ( în zigonemă ) şi 3) schimbul de gene între cromatidelenesurori (sau crossing-overul ).

În prometafaza I ( prometaphasis I ) se produce dispariţia învelişului nuclear şi formareafusului de diviziune.

În metafaza I ( metaphasis I ) cromozomii se ataşează de fibrele fusului de diviziune şi

formează placa metafazică .

114



În anafaza I ( anaphasis I ) se produce deplasarea câte unui cromozom întreg(bicromatidic,cu două cromatide) din fiecare cromozom bivalent către un pol al celulei, pe cândcelălalt cromozom, tot bicromatidic, se deplasează spre polul opus. Diferenţa esenţială faţă deanafaza din mitoză constă în faptul că nu se despart şi nu migrează separat cromatidele fiecăruicromozom, ele rămânând legate la nivelul centromerului. (Fig.6.9)

Fig.6.10. Diagrama meiozei

Meioza II se realizează ca o mitoză obişnuită, având cele patru faze: profaza II cuprometafaza II (prometaphasis II), metafaza II (metaphasis II), anafaza II (anaphasis), telofaza II

115



(telophasis) . În metafaza II se despart cromatidele fiecărui cromozom, după care are loc deplasarealor spre polii celulei, în timpul anafazei II. (Fig.6.10)

În concluzie, în cursul diviziunii reducţionale (a meiozei), celula sedivide de 2 ori, în timp ce cromozomii se divid (despărţindu-şicromatidele) numai o singură dată, în timpul metafazei II.

6.3.BAZELE MOLECULARE ALE REPRODUCERII CELULARE

Bazele moleculare ale reproducerii celulare se refer ă la trei fenomene esenţiale: 1)replicarea ADN ; 2) transcrierea mesajului genetic şi 3) traducerea mesajului genetic în biosintezaproteinelor.

6.3.1. Structura şi replicarea ADN

Acidul deoxiribonucleic (ADN) constituie materialul genetic al tuturor vieţuitoarelor, care au în compoziţia lor acest acid nucleic.

Replicarea (sau duplicarea sau autoreplicarea) ADN-ului cromozomial şi distribuirea lui înmod egal în celulele fiice formează baza mecanismelor moleculare de transmitere a informaţiei

genetice.Replicarea ADN este procesul molecular prin care se realizează o copiere fidelă a moleculelor de ADN (a secvenţelor de nucleotide) în timpul duplicării cromozomilor. Dublarea cantităţii de ADN areloc în cursul biosintezei de ADN în faza S a ciclului celular, biosinteză care se numeşte replicare.

Structura ADN-ului

ADN-ul este o macromoleculă, compusă din două lanţuri de nucleotide foarte lungi, r ăsuciteunul în jurul celuilalt într-o structur ă dublu-elicoidală (numită dublu-helix sau duplex de ADN).

Fiecare lanţ are: a) o parte constantă (ce poate fi asemănată cu coloana vertebrală) formatădin dezoxiriboze, situate pe latura externă şi legate prin punţi diesterice şi b) o parte variabilă,reprezentată de secvenţa bazelor. Bazele sunt situate pe latura internă (între lanţuri) şi suntreprezentate de două baze purinice (adenina — A şi guanina — G) şi două baze pirimidinice (timina —

T şi citozina — C) (fig.6.11).

Fiecare lanţ este polarizat, deoarece la un capătprezintă hidroxilul 5’ liber, iar la capătul opus hidroxilul3’ liber. În mod convenţional se consideră că secvenţa în lanţ este „scrisă” de la 5’ spre 3’, aşa cum înproteine secvenţa este „scrisă” în direcţia amino-carboxil. Cele două lanţuri sunt antiparalele, avânddirecţia legăturilor fosfo-diesterice opusă, pe unul estede la 5’ la 3’, iar pe lanţul pereche de la 3’ la 5’.

Cele două lanţuripolinucleotidice sunt

menţinute împreună prinlegături de hidrogen întrebaze, existând două legături între adenină şi timină şi trei între guanină şi citozină.

Fig.6.11. Structura ADN-ului

Aranjarea bazelor în perechi este specifică, încâtadenina este legată, în pereche, întotdeauna cutimina, iar guanina cu citozina. Această specificitateeste determinată de factori spaţiali (sterici) şi delegăturile de hidrogen. Astfel, diametrul constant alduplexului de ADN (de 2 nm) face ca spaţiul dintrecele două lanţuri să fie de 1,1 nm, atât cât ocupă o

116



bază pirimidinică aranjată în pereche cu o bază purinică. Două baze purinice ar ocupa prea multspaţiu, iar două baze pirimidinice prea puţin.

Pasul helixului este de 3,4 nm şi reprezintă intervalul la care se repetă structura helicoidală.Pe această distanţă se află zece nucleotide, deci 10 perechi de baze. Numărul de perechi de bazedintr-o moleculă de ADN variază de la câteva mii până la câteva milioane ( de exemplu, la E. collimolecula de ADN cuprinde 3,4 milioane perechi de baze).

Pe un lanţ polinucleotidic, considerat izolat, secvenţa bazelor nu este expusă nici uneirestricţii; dar pe lanţul pereche secvenţa va fi strict determinată de specificitatea aranjării bazelor înperechi, încât lanţurile sunt complementare. Astfel, un lanţ este complementul celuilalt, la secven ţaGCTAG corespunzând pe lanţul opus secvenţa CGATC.

Complementaritatea lanţurilor polinucleotidice a permis lui WATSON şi CRICK (1953),descoperitorii structurilor în dublu helix a ADN-ului, să sugereze mecanismul replicării şi al transmiteriiinformaţiei genetice. Astfel fiecare lanţ acţionează ca o matriţă pentru formarea unui lanţ noucomplementar cu el însuşi. În acest fel se poate replica ADN-ul (dubla cantitate de ADN), iar pentru c ămolecula de ADN funcţionează ca matriţă pentru propria sa formare, procesul a fost denumitautoreplicare. (fig. 6.12).

Fig.6.12. Autoreplicarea AND-ului

În biologia molecular ă prin matriţă se înţelege o macromoleculă ce prezintă o suprafaţă delegare cu o anumită configuraţie spaţială. Pe fiecareloc de matriţă se poate lega în mod specific unsingur fel de monomer, cel care are o configuraţiecomplementar ă cu a matriţei (fig. 124).

Replicarea ADN-ului

Replicarea ADN-ului prezintă următoarelecaracteristici: 1) este semiconservativă, încât înfiecare moleculă de ADN nou formată, unul din

lanţuri provine din molecula mamă (iniţială); 2) începe întotdeauna în acelaşi punct numit origine,din care pleacă pe fiecare lanţ câte o furculiţă dereplicare, ce reprezintă locul în care se producesimultan dezr ăsucirea ADN-ului parental şi în caredin două lanţuri se formează patru lanţuripolinucleotidice.

Replicarea ADN-ului începe odată cudezr ăsucirea celor două lanţuri polinucleotidice dindublul helix al ADN parental. Dezr ăsucirea estefavorizată de ruperea unuia din cele două lanţuri lanivelul “coloanei vertebrale” de riboză-fosfat, ladistanţă de circa 30 Å de furculiţa de replicare, cu

ajutorul unei enzime. În continuare dezr ăsucireaeste uşurată de unele proteine specifice de

dezr ăsucire, care se leagă una după alta de ADNmonocatenar, împiedicând r ăsucirea lui.Concomitent cu dezr ăsucirea, pe fiecare din celedouă lanţuri polinucleotidice se sintetizează un lanţnou (o replică) cu secvenţă complementar ă de

nucleotide. Astfel pe fiecare din lanţurile parentale este sintetizat un ADN nou sub formă defragmente mici (fragmente OKAZAKI) de circa 1000 nucleotide. În procesul sintezei ADN-ului intervinurmătoarele enzime:

1. ARN-polimeraza, ce sintetizează câte un fragment scurt de ARN (de circa 100 nucleotide)pe fiecare din lanţurile de ADN parental ce serveşte ca matriţă. Rezultă astfel un primer de ARN,necesar pentru începerea sintezei propriu-zise de ADN cu ajutorul polimerazelor.(Fig. 6.13)

117



Fig.6.13. Reprezentarea schematică a biosintezei de ADN

2. ADN-polimerazele denumite ADN-polimeraza I, II şi III înordinea descoperirii lor la E coli, catalizează polimerizareadeoxiribonucleotidelor.

3. ADN-ligaza, ce leagă câte două capete ale unor

fragmente de ADN ce fac parte dintr-un duplex, prin formarea unor legături fosfo-diesterice între cele două capete (unul cu OH în 3’, iar celălalt cu un fosfat la 5’). Se închid astfel discontinuităţile („spărturile”) din ADN. Reacţia este endergonică, energia fiind donată decătre ATP.

4. ADN-topoizomerazele ( I şi II ) scindează reversibil dublexul de ADN, permiţând astfelrotaţia şi îndepărtarea tensiunii acumulate în timpul dezr ăsucirii lanţurilor polinucleotidice.

Mecanismul molecular al biosintezei (replicării) de ADN cuprinde următoarele etape: 1)desprinderea (desperecherea) lanţurilor de ADN din molecula parentală; 2) sintetizarea, pe fiecarelanţ, prin acţiunea ARN-polimerazei, a câte unui primer de ARN; 3) sintetizarea, în continuareaprimerului, a lanţurilor de ADN complementare matriţei, cu ajutorul ADN-polimerazei; 4) fragmenteleOKAZAKI - se formează în direcţia 5’ - 3’ pe ambele lanţuri; 5) excizia fragmentului de ARN subacţiunea ARN-polimerazei I încât pe măsur ă ce se îndepărtează câte un ribonucleotid, se adaugăimediat dezoxiribonucleotidul corespunzător; 6) legarea fragmentelor de ADN nou formate prin

acţiunea ADN-ligazei.6.3.1.1. Particularităţile replicării la eucariote

Diferenţele care există între replicarea de la procariote şi cea de la eucariote se datoresccomplexităţii organizării cromatinei la eucariote, unde ADN-ul este complexat cu histone înnucleozomi, care se succed la intervale de circa 200 perechi baze în lungul ADN, încât fragmentelede ADN nou formate (OKAZAKI) sunt mai mici ca la procariote având 100-200 nucleotide, iar primerulde ARN numai 10-20 nucleotide.

Viteza replicării la eucariote este de 10 ori mai mică decât la procariote (de exemplu se replică50 nucleotide pe secundă faţă de 500 la procariote). Astfel pentru întreaga replicare a unui cromozomuman, o singur ă furculiţă de replicare ar avea nevoie de 800 de ore, depăşind de circa 10 ori perioadaS a ciclului celular.

Fig.6.14. Replicarea ADN-ului laeucariote1- Puncte de origine; 2- Furculiţe de

replicare; 3- Bule de replicare

Pentru a se putea încadra în faza S, replicarea începe pe fiecare cromozom în mai multe punctede origine (circa 100 pentru fiecare cromozomuman). Pentru fiecare punct de origine apar douăfurculiţe de replicare, ce se deplasează pe direcţii

opuse în lungul cromozomului generând nişte structuri denumite bule de replicare (fig. 6.14).Originile furculiţelor de replicare apar în grupe (de 20-80) situate toate într-o anumită zonă.Fiecare grupă se numeşte unitate de replicare (sau replicon). Repliconii se activează treptat în faza Sa ciclului, zonele de heterocromatină fiind ultimele activate. Furculiţele de replicare se deplasează cuaceeaşi viteză în tot cursul fazei S. Când ajung să se întâlnească pe tot cromozomul, replicarea setermină, iar cei doi cromozomi se despart.

Replicarea ADN-ului se produce paralel cu sinteza de histone, care are loc numai în faza S aciclului celular. Odată sintetizate şi asamblate în nucleozomi, histonele nu mai păr ăsesc ADN-ul decare s-au legat încât miezurile nucleozomilor vechi trec numai pe unul din duplexuri, în timp ce pecelălalt duplex de ADN se leagă numai de miezurile nucleozomilor noi sintetizaţi.

Implicaţiile şi aplica ţ iile medicale ale replicării ADN-ului constau în: a) apariţia mutaţiilor; b)sinteza reparatoare a ADN-lui şi c) inhibarea sintezei de ADN.

Apari ţ ia muta ţ iilor este rezultatul unor greşeli care apar în procesul de replicare a ADN-ului.

Un anumit nivel de apariţie a mutaţiilor (de obicei scăzut) a fost necesar şi util în evoluţia speciilor, dar atunci când depăşesc acest nivel fac imposibilă supravieţuirea celulei, majoritatea mutaţiilor fiinddăunătoare. Din această cauză celulele au numeroase sisteme enzimatice de reparare a erorilor care

118



pot apare în ADN spontan sau induse de agenţi mutageni (fizici sau chimici). Mecanismele reparatoriisunt eficace, încât o mutaţie spontană apare la un milion de replicări ale genelor.

Pot să apar ă mutaţii punctiforme (prin înlocuirea unui singur nucleotid) sau mutaţii maricomplexe, ca: deleţii (lipsa unor secvenţe din ADN), inser ţii (secvenţe în plus de nucleotide).Frecvenţa mutaţiilor poate creşte foarte mult în urma acţiunii unor substanţe, denumite mutagene,precum: a) unele substanţe chimice (ce modifică direct bazele din ADN), agenţii alchilanţi (care

fixează radicalii metil, etil etc.) actiflavinele, cofeina; b) radiaţiile ultraviolete; c) radiaţiile ionizante (ceproduc ruperea unuia sau a ambelor lanţuri de ADN, pierderi de baze, modificări ale bazelor).Unii din aceşti agenţi pot fi folosiţi în terapia cancerului , întrucât celulele maligne sunt mai

sensibile la acţiunea lor (ca de exemplu, unii agenţi alchilanţi, radiaţiile ionizante).Sinteza reparatorie a ADN-lui se produce într-o anumită perioadă de timp, încât există

posibilitatea (în cazul celulelor care proliferează foarte rapid) ca să înceapă un nou ciclu de replicare înainte ca reparaţia să fie completă. În acest fel, celulele care proliferează foarte rapid sunt foartesensibile la radiaţii, fapt ce permite folosirea radiaţiilor ionizante în tratamentul cancerelor.

Inhibarea sintezei de ADN este produsă de o serie de substanţe chimice, care pot fi folosite în practica medicală curentă - ca substanţe antimicrobiene, antivirale şi antitumorale (citostatice).Astfel: acidul nalidixic, un antibiotic, inhibă biosinteza ADN-ului; acidul fosfonoacetic, un agentantiviral, inhibă selectiv ADN-polimerazele virale şi din celula gazdă. Unele substanţe antitumorale(arabinozilcitozina, arabinoziladenina) inhibă sinteza de ADN, iar altele (neocarcinostatina - o proteină

formată din 109 aminoacizi) produc rupturi în molecula de ADN.6.3.2.Transcrierea mesajului genetic

În exprimarea informaţiei genetice (a mesajului genetic) există două etape: 1) transcrierea(copierea) informa ţ iei din ADN în ARN şi 2) traducerea informaţiei conţinută în ARN în sinteza deproteine. Sub formă prescurtată transmiterea informaţiei genetice este cuprinsă în dogma centrală abiologiei moleculare care se exprimă în formula:autoreplicare ADN transcriere ARN traducere proteine → →

Astfel, genele din ADN determină sinteza de proteine de către celulă, dar nu ADN-ul estematricea pe care se sintetizează proteinele, ci moleculele de ARN (Fig. 6.15).

Moleculele de ARN care poartă informaţia genetică necesar ă pentru biosinteza proteinelor senumesc ARN mesager (ARN-m).

ARN-ul mesager

Conceptul de ARN mesager (ARN-m) a fost introdus în biologia molecular ă în 1961 de cătreJACOB şi MONOD care au presupus existenţa unui ARN care este sintetizat şi degradat foarte rapid,ce serveşte ca mesager al genei (aflată în nucleu), transferând informaţia de la nucleu la sediulsintezei proteinelor (ribozomi) - aflaţi în citoplasmă.

ARN mesager este o moleculă sintetizată pe matriţa de ADN, având o secvenţă a bazelor complementar ă ADN-matriţă. Pentru fiecare genă se sintetizează câte o moleculă de ARN-m, care vaservi la rândul ei ca matriţă pentru sinteza proteinei codificată de gena respectivă.

119



Fig. 6.15. Reprezentarea schematică a transmiterii informaţiei genetice

În celulă, pe lângă ARN-ul mesager, mai există încă două categorii de ARN, implicate direct înbiosinteza proteinelor: ARN-l de transfer şi ARN-ul ribozomal.

ARN-ul de transfer (ARNt) transportă aminoacizii activaţi la ribozomi, unde se realizeazăformarea legăturilor polipeptidice în secvenţa dictată de matriţa de ARNm.

ARN-ul ribozomal (ARNr) intr ă în componenţa ribozomilor, f ăr ă a i se cunoaşte precis rolul lui în biosinteza proteinelor.

6.3.3.1. Mecanismul molecular al biosintezei de ARN

ARN-ul este o macromoleculă lungă formată din ribonucleotide legate prin legături 3’-5’fosfodiesterice. Numărul de nucleotide variază între 75 (în ARNt) şi câteva mii (în ARNm).

Toate tipurile de ARN sunt biosintetizate printr-un mecanism molecular asemănător, sintezade ARN pe matriţă de ADN fiind catalizată de enzima denumită ARN-polimeraz ă -ADN-dependentă(transcriptază).

Pentru realizarea sintezei de ARN sunt necesare următoarele elemente: 1) matri ţ a de ADN dublu helicoidal; 2) precursori activa ţ i , ca ribonucleozid-trifosfaţi (ATP, GTP, UTP, CTP); 3) ioni demagneziu sau alte metale bivalente. Sinteza de ARN se aseamănă cu sinteza de ADN prin: a) direcţiade sinteză (de la 5’ la 3’, care este antiparalelă lanţului de ADN); b) mecanismul de alungire, careproduce eliberarea de acid pirofosforic (din ribonucleozid-trifosfat), ce este hidrolizat, eliberându-seenergie.

Diferenţele între biosinteza de ARN şi biosinteza de ADN constau în: 1) conservarea integralăa matriţei de ADN în procesul de sinteză de ARN (în timp ce în sinteza de ADN matriţa estesemiconservată); 2) ARN-polimeraza nu necesită un primer; 3) ARN-polimeraza nu desf ăşoar ăactivitate nucleazică.

La eucariote, există mai multe ARN-polimeraze, încât cele din clasa A produc ARNr, cele dinclasa B produc ARNm, iar cele din clasa C produc ARNt.

În timpul procesului de transcriere se parcurg mai multe etape după cum urmează:

120



1) Legarea ARN-polimerazei de matriţa de ADN în regiunile promotoare care suntrecunoscute în mod specific, producându-se dezr ăsuciri locale ale helixului.

2) Iniţierea formării lanţului de ARN prin formarea primei legături diesterice la nivelul regiuniidezr ăsucite.

3) Alungirea lanţului de ARN se face în direcţia de la 3’ la 5’ a matriţei de ADN, în timp celanţul de ARN creşte în direcţia 5’ la 3’. Matriţa de ADN transcrisă î şi reia conformaţia dublu

helicoidală, în timp ce por ţiunea următoare se dezr ăsuceşte.4) terminarea lanţului de ARN are loc în momentul în care pe matriţa de ADN se recunoscunele puncte de terminare, cu ajutorul unei proteine specifice.

5) maturarea sau prelucrarea are loc numai după desprinderea de pe matriţă de ADN şi estesuferită numai de unele molecule de ARN. Maturarea constă în: a) clivarea (ruperea) lanţului de ARN(de 45 S) în lanţuri mai mici (de 28 S şi 18 S); b) metilarea unor grupări OH din riboză sau din bazelepurinice şi pirimidinice.

La eucariote, trecerea ARNm din nucleu în citoplasmă se face prin porii nucleeari sub formaunor precursori ribozomali.

S-a demonstrat că, pentru fiecare genă (care are două lanţuri ADN), numai unul din cele douălanţuri de ADN este copiat, încât o genă codifică o singur ă proteină.

Aplica ţ iile medicale legate de transcrierea mesajului genetic constau în folosirea unor inhibitori şi a transcrierii în combaterea unor infecţii microbiene sau virale. Astfel, rifampicina (extrasă

din Streptomyces) şi rifampicina (un derivat semisintetic) inhibă în mod specific iniţierea sintezei deARNm. Actinomicina D inhibă în mod specific transcrierea f ăr ă a inhiba replicarea ADN sau biosintezaproteinelor.

6.3.3.Traducerea mesajului genetic în biosinteza proteinelor

În conformitate cu dogma centrală a biologiei moleculare, informaţia genetică stocată subforma secvenţei de baze în ADN este transcrisă (copiată) în secvenţa de baze din ARNm şi apoi estetradusă (concretizată) în secvenţa ( dispunerea ) aminoacizilor din proteine.

Întrucât în acizii nucleici există numai patru baze azotate diferite, iar în proteine există 20aminoacizi diferiţi, apare necesitatea existenţei unui cod genetic (o formă cifrată) care să permitălegarea în proteine a acestor aminoacizi.

Codul genetic reprezintă, astfel, relaţia care există între secvenţa bazelor în ADN (sau în

ARNm) şi secvenţa aminoacizilor în proteine. El cuprinde 64 secvenţe (grupuri) de câte 3 nucleotidedenumite codoni , care determină legarea unui aminoacid într-o proteină, jucând rolul unor “cuvinte” întraducerea informaţiei genetice în sinteza proteinelor. Astfel, codonul U-U-U determină legareafenilalaninei într-o proteină.

Codul genetic prezintă următoarele caracteristici:a) este degenerat , deoarece legarea unui aminoacid (specificarea lui) într-o proteină este

determinată de mai mulţi codoni;b) prezintă 3 codoni nonsens, care nu specifică (leagă) nici un acid, ci determină terminarea

lanţului polipeptidic;c) este universal , fiind acelaşi în toate celulele de la bacterii până la om.Sinteza unei molecule de proteină, prin asamblarea aminoacizilor, se face la nivelul

ribozomilor, unde se citeşte informaţia genetică de pe ARNm, participând şi o serie de proteinesolubile, precum şi aminoacizi activaţi legaţi de ARNt ce prezintă: 1) un loc de punct de legare a

aminoaciduluişi 2) un loc de recunoa

ştere a matri

ţei de ARNm, reprezentat de o secven

ţăde 3 baze,denumit anticodon.

Anticodonul de pe ARNt recunoaşte secvenţa complementar ă de 3 baze din codonul de peARNm permiţând legarea specifică a aminoacidului de matriţă. Pentru un aminoacid (din cei 20existenţi în proteine) pot exista mai multe molecule diferite de ARNt, legată de faptul că mai mulţicodoni pot specifica (lega) mai mulţi aminoacizi. (Fig. 6.16)

121



Fig.6.16. Schema moleculei de ARN t

Moleculele de ARNt prezintă: a) patru regiuni cu baze complementare dispuse în dublu helix,denumite tulpini (tulpina acceptor, tulpina D, tulpina T şi tulpina anticodon) şi b) 4 regiuni f ăr ă bazecomplementare denumite bucle (o buclă anticodon, o buclă D, o buclă T şi o buclă variabilă).(Fig. 6.16)

Datorită apariţiei structurii de dublu helix la nivelul tulpinilor, molecula de ARNt are odispunere spaţială în forma literei “L”, cu două braţe: a) un braţ lung ce cuprinde tulpinile T şi acceptor.Regiunile dublu helicoidale sunt perpendiculare una pe alta şi conţin fiecare câte 10 perechi de baze,ce corespund la o tur ă de dublu helix. Formarea regiunilor de dublu helix asigur ă moleculei o marestabilitate, iar buclele ce proemină pot interacţiona specific cu alte grupări de atomi. Astfel,anticodonul este situat la capătul braţului lung din “L”, iar aminoacidul este legat la capătul braţuluiscurt din “L”.

Rolul ARNt este de a lega specific aminoacizii liberi din citoplasmă şi de a-i transporta înribozomi, permiţând legarea lor în lanţul polipeptidic în secvenţa dictată de ARNm. (Fig.6.17)

122



Fig.6. 17. Aspectul tridimensional al moleculei de ARN-t

Legarea aminoacidului de ARNt este catalizată de o enzimă, denumităaminoacil-ARN-sintetaz ă existând câte o enzimă specifică pentru fiecare din cei 20 aminoacizi, carepoate lega aminoacidul de ARNt diferiţi.

Aminoacidul ARNt-sintetaza catalizează două reacţii succesive:1) activează aminoacidul legându-l de AMP, formând un compus intermediar, denumit

aminoaciladenilat (aminoacil~AMP), care r ămâne legat de enzimă până întâlneşte o moleculă de ARNtspecifică pentru aminoacidul respectiv;

AA + ATP = AA ~ AMP + ADP

2) transferă aminoacidul pe ARNt formând complexul ARNt încărcat ( aminoacil-ARNt ).Energia legăturii macroergice din complexul aminoacil-ARNt poate fi utilizată ulterior în ribozomipentru formarea legăturii macroergice;

AA~AMP + ARN t = AA~ ARN t + AMP

Molecula de ARNt prezintă la toate vieţuitoarele o structur ă asemănătoare, perfect adaptatăfuncţiei sale, fiind o moleculă universală ca şi codul genetic.

Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr) este reprezentat de mai multe specii cu constante desedimentare diferite. ARNr este sintetizat în nucleu şi intr ă în constituţia celor două subunităţiribozomale: a) subunitatea mică (40 S) şi b) subunitatea mare (60 S), care se angrenează, încitoplasmă, cu subunitatea mică, realizând ribozomul.

6.3.3.1.Mecanismul molecular al biosintezei proteinelor

Formarea legăturilor peptidice între aminoacizii care compun proteina are loc în ribozom,sinteza lanţului polipeptidic având loc în direcţia aminocarboxil. Ribozomul devine funcţional numaiatunci când are loc asocierea celor două subunităţi. (Fig. 6.18)

123



Fig.6.18. Schema sintezei proteinelor în celula eucariotăMecanismul sintezei de proteine, mai bine studiat la E.coli, este acelaşi în toate celulele şi

cuprinde trei faze: 1) faza de iniţiere, 2) faza de elongare şi 3) faza de terminare (la fel ca şi la sintezade ADN şi de ARN).

Faza de ini ţ iere începe odată cu formarea compusului formil-metionil-ARNt prin legarea

metioninei de un ARNt specific şi prin blocarea grupării amino prin formilare. În continuare seformează Complexul de iniţiere 30 S la care participă formil-metionil-ARNt, subunitatea mică 30 S,ARNm şi unele proteine solubile din citosol, denumite factori de iniţiere (IF1, IF2, IF3), precum şi GTP.Subunitatea mică (30 S) se leagă de ARNm pe un loc specific situat la circa 10 nucleotide de lacapătul 5’ al ARNm (factorul IF3 intervenind în această legare).

Biosinteza proteinelor la procariote

Faze Timpi FenomeneA.Iniţiere Formarea compusului formil

metionil - ARNt- se leagă metionina de ARNt-se blocheză gruparea amino prin formilare-se formează complexul de iniţiere

1.Inserţia unui AA-ARNt -pe locul A se inseră un AA ~ ARNt

B. Elongare2.Formarea legăturii peptidice

-se transferă formil metionina de pe locul Ppe gruparea aminoacil ~ ARNt de pe locul A-pe locul P rămâne un ARNt descărcat-pe locul A se găseşte un dipeptidil ~ ARNt

-ARNt descăcat părăseşţ locul P3.Translocarea -dipeptidil ~ ARNt se mută de pe locu lA pe

locul P-ARNm se deplasează spre capătul 3!

C.Terminare

Terminarea sintezei lanţuluipolipeptidic

-în dreptul locusului A, pe ARNm apareun codon nonsens

De complexul 30 S se leagă apoi subunitatea mare (50 S) a ribozomului, folosind pentru

legare energia rezultată din hidroliza GTP-ului. S-a format astfel, complexul de iniţiere (70 S), în care

124



pe ribozom există două locuri de legare: a) un loc P (de la peptidil) care este ocupat deformil-metionil-ARNt şi b) un loc A (de la aminoacid) neocupat în complexul de iniţiere.

Faza de elongare se realizează în trei timpi (subfaze): a) inser ţia unui aminoacid; b) formarealegăturii peptidice şi c) translocarea.

Inser ţ ia constă în legarea pe locul A din ribozom a unui aminoacid-ARNt, ce corespundecodonului din ARNm, aflat în dreptul locului A. Codonul din ARNm este recunoscut de anticodonul ce

transportă aminoacidul cerut (specificat) de cele trei nucleotide ale codonului (din ARNm). Pentruinser ţie sunt necesare: o moleculă de GTP şi o proteină din citosol numită primul factor al elongării. Înurma inser ţiei a rezultat un complex în care pe locul P se află formilmetionil-ARNt-ul, iar pe locul A seaflă un aminoacil-ARNt.

Formarea leg ă turii peptidice se produce cu ajutorul unei enzime denumită peptidil transferază,existentă în subunitatea 50 S a ribozomului, prin transferul formilmetioninei (de pe locul P) pegruparea amino din animoacil-ARNt (aflat pe locul A). În urma formării legăturii peptidice pe locul Pr ămâne un ARNt descărcat, în timp ce pe locul A se găseşte un dipeptidil-ARNt.

Translocarea cuprinde trei fenomene: a) ARNt descărcat păr ăseşte locul P; b) dipeptidil-ARNtse mută (translocă) de pe locul A pe locul P şi c) ARNm se deplasează cu trei nucleotide spre capătul3’. Datorită acestui fapt, codonul următor de pe ARNm este pregătit pentru a fi ”citit” de cătreanticodonul unui nou aminoacid-ARNt corespunzător.

Translocarea necesită hidroliza celei de-a treia molecule de GTP şi intervenţia celui de al

treilea factor al elongării, denumit translocază.Odată încheiată translocarea, ciclul elongării se poate repeta, fiindcă locul A a devenit vacant,iar în dreptul său se află un alt codon, care poate fi recunoscut de aminoacidul ce prezintă anticodonulcomplementar. În acest fel un alt aminoacid este legat în locul polipeptidic (P), iar mesajul genetic“înscris” în ARNm este “citit” de către anticodonii de pe ARNt şi “tradus” în formarea unei legăturipeptidice între aminoacizi în conformitate cu secvenţa “dictată” (specificată) de codoni.

Faza de terminare a sintezei lanţului polipeptidic se declanşează în momentul când la sfâr şitulfazei de elongare, în dreptul locului A din ribozom ajunge unul dintre cei trei codoni nonsens (UAA,UGA şi UAG); în citoplasma celulelor normale nu se găsesc molecule de ARN cu anticodonicamplementari acestor codoni. Dar aceşti codoni nonsens sunt recunoscuţi de o proteină, denumităfactor de eliberare (existând doi factori de eliberare RF 1 şi RF2). Factorii de eliberare se leagă de loculA şi determină hidroliza legăturii dintre polipeptid şi ARNt de pe locul P, eliberând lanţul polipeptidicterminat care păr ăseşte ribozomul. În continuare, ribozomul se disociază în cele două subunităţi, care

se desprind de ARNm, iar ARNt-ul este pus în libertate.Compoziţia lanţului polipeptidic sintetizat de un ribozom este determinat în mod exclusiv deARNm şi nu de felul ribozomului. În acest mod, aceiaşi ribozomi pot sintetiza lanţuri polipeptidicediferite în funcţie de matriţa de ARNm pe care sunt legaţi.

6.3.3.2.Particularităţi ale biosintezei proteinelor la eucariote

La eucariote, sinteza proteinelor are loc în ribozomii 80 S din citosol, iar iniţierea sintezeilanţului polipeptidic se face prin metionil-ARNt care nu este formilat ca la bacterii. Factorii de ini ţieresunt mai numeroşi şi mai complecşi la eucariote, ei controlând viteza sintezei proteinelor.Viteza cu care se sintetizează proteinele este foarte mare, atât datorită elongării foarte rapide, cât şidatorită faptului că o molecul~a de ARNm este tradusă simultan de mai mulţi ribozomi. Grupul deribozomi legat de o moleculă de ARNm se numeşte poliribozom sau polizom. Într-un polizom ribozomii

sunt dispuşi la distan

ţe de circa 100 nucleotide unul de altul

şi fiecare ribozom sintetizeaz

ăcâte un

lanţ polipeptidic. (Fig. 6.19)

125



Fig.6. 19. Schema poliribozomului la eucariote1- Subunitate mică; 2- Subunitate mare; 3- ARN m; 5-Începerea sintezei;6- Terminarea sintezei lanţului polipeptidic.

În lanţul polipeptidic, aminoacizii sunt legaţi în mod strict în ordinea (secvenţa) codificată degenă, încât codul genetic (limbajul bazelor nucleotidice din ADN şi ARNm) este tradus în ordonarea

(aşezarea) aminoacizilor din molecula de proteină.Numărul de lanţuri polipeptidice care pot fi sintetizate pe o moleculă de ARNm este diferit laprocariote, de eucariote. Astfel, la eucariote pe fiecare moleculă de ARNm se sintetizează un singur lanţ polipeptidic, în timp ce la procariote o moleculă de ARNm sintetizează mai multe lanţuripolipeptidice. Porţiunea din ARNm care codifică un lanţ polipeptidic se numeşte cistron şi începe cuun codon de iniţiere (unde se leagă ribozomii) şi se termină cu un codon nonsens.

La eucariote ARNm este întotdeauna monocistronic, pe când la bacterii este de obiceipolicistronic.

Prin adăugarea sau prin delecţia (înlăturarea) unei baze din ARNm apar mutaţii, deoarece dinacel punct de vedere citirea codonilor este greşită, defazată faţă de mesajul original, rezultând alte“cuvinte”.

La eucariote unele gene apar discontinui. Până în prezent gena este definită ca o regiune acromozomului (ca un fragment de ADN) care este copiată (transcrisă) într-o moleculă de ARNm, iar

aceasta este tradusă într-un lanţ polipeptidic. La eucariote secvenţele de ADN (denumite exoni) carecodifică aminoacizii sunt separate prin segmente de ADN (denumite introni) care nu codifică. Dinmoleculele de ARNm precursor (ce apare prin transcrierea genei) sunt îndepărtate porţiunile cecorespund intronilor, fragmentele rămase fiind legate cap la cap printr-un proces de “înădire”(splicing) ce se pot produce în nucleu în cursul maturării ARNm. (Fig.6.20)

Fig. 6.20. Schema procesului de splicing a ARN-ului mesager

Şi la eucariote există posibilitatea ca unele secvenţe de ADN să producă cel puţin douămolecule diferite de ARNm, datorită unor variaţii în fenomenul de “înădire”. De asemenea, nu toategenele codifică proteine.

Influenţarea biosintezei proteinelor cu ajutorul unor antibiotice sau prin acţiunea unor toxinestă la baza unor aplicaţii sau implicaţii medicale. Aplicaţii medicale În practica medicală sunt folosite antibiotice care inhibă biosinteza proteinelor, acţionând pe

subunitatea mică sau mare şi pe ribozomi de tipuri diferite (70 S sau 80 S). Streptomicina şitetraciclinele acţionează pe subunitatea 30 S, producând citirea greşită a ARNm (streptomicina) saublocând legarea aminoacil-ARNt pe locul A din ribozomi (tetraciclinele).

Cloramfenicolul şi ciclohexinida acţionează pe subunitatea mare, blocând activitatea peptidiltransferazei. Eritromicina acţionează pe subunitatea mare (50 S) a ribozomului procariotic, împiedicând translocarea.

Puromicina acţionează pe ambele tipuri de ribozomi producând terminarea prematură asintezei lanţului polipeptidic.

Unele toxine microbiene inhibă biosinteza proteinelor la eucariote. Astfel, toxina diftericăprodusă de Corynebacterium dyphteriae, blochează faza de elongare la eucariote, inactivândtranslocaza.

126



7.Diferentierea si evolutia celulelor

Diferenţierea celulară este procesul biologic, în care, pornindu-se de la o singură celulă, seconstituie tipuri celulare stabile, deosebite morfofuncţional între ele.

În biologie, diferenţierea este un proces esenţial, de el depinzând însăşi apariţia şi existenţaorganismelor individuale. Prin diferenţiere se realizează: 1) reproducerea, în urma căreia se formează

noi indivizi într-o specie; 2) creşterea şi dezvoltarea organismelor; 3) regenerarea celulelor sau aţesuturilor lezate sau uzate; 4) evoluţia speciilor şi adaptarea organismelor la mediu.Diferenţierea celulară are caracter universal în lumea vie, fiind prezentă la toate speciile de

plante sau animale. Nefiind limitată în timp, diferenţierea celulară se desfăşoară pe tot parcursul vieţiiindividului, din momentul concepţiei şi până în momentul morţii organismului. Intensitatea şiamploarea diferenţierii sunt variabile în timpul diverselor perioade ale vieţii organismului, înregistrândo intensitate maximă în embriogeneză. La mamifere, diferenţierea celulară are un caracter ireversibil, încât nici o celulă diferenţiată nu-şi mai poate redobândi caracterele embrionare.

7.1.Mecanismele diferenţierii celulare

La mamifere, diferenţierea celulară debutează în momentul fecundării, când se formeazăzigotul. Atât zigotul, cât şi celulele rezultate din primele diviziuni se pot diferenţia în oricare din tipurile

celulare funcţionale ale adultului. Aceste celule care au potenţial maxim de diferenţiere sunt denumitecelule totipotente sau pluripotente şi se caracterizează din punct de vedere genetic că au toategenele active (derepresate) încât acceptă orice mesaj genetic, putând urma orice traseu evolutiv. Elese pot integra în oricare din regiunile unui embrion avansat, la care soarta celulelor este definitivă,generând structuri specializate în funcţie de indicaţia primită de la regiunea suport.

O serie de factori extracelulari denumiţi factori determinanţi , obligă fiecare celulă pluripotentăsă aleagă un anumit traseu evolutiv, transformându-se în celule determinate ( direcţionate ).

Determinarea reduce progresiv numărul de tipuri celulare specializate care pot lua naştere dincelule embrionare. Astfel, celulele pluripotente pot genera prin diferenţiere toate tipurile de celuleadulte, dar mai târziu, odată cu apari,tia celor trei foiţe embrionare, din fiecare foiţă rezultă un număr limitat de celule, ca de exemplu: celule nervoase din ectoderm; celule conjunctive, musculare dinmezoderm etc.

Deşi cantitativ şi calitativ genotipul celulelor pluripotente şi determinate este identic,

determinarea şi diferenţierea celulară represează (inactivează) un număr variabil de gene, mereualtele în funcţie de tipul de celule specializate. Cu cât vârsta embrionului este mai avansată, numărulgenelor represate este mai mare, iar starea de celulă determinată este ireversibilă la mamifere.

Factorii care impun alegerea unui anumit parcurs şi deci diferenţierea spre un anumit tip decelulă specializată se numesc inductori. Inductorii acţionează asupra unor celule “ţintă”, iar acţiunealor este posibilă numai dacă celulele ţintă devin permisive, în urma primirii unor mesaje sau influenţedirectoare.

Etapele diferenţierii celulelor

Etapă Denumirea

celulei

Exemple Caracteristici Asupra lor acţioneză:

Iniţială Celulatotipotentă(pluripotentă)

Zigotul şi primele8-16 blastomere

Toate genele suntactive(derepresate)

Factori determinanţi

Determinării Celuledeterminate(direcţionate)

Celule foiţelor embrionare

Au gene active şigene inactive(represate)

Factori inductori

Apariţia celulelor permisive

Celule stemmultipoten -ţiale

Celule mezenchi -maleHemohistio -blastHemocitoblast

Sunt permisiveCreşte numărulgenelor represate

Factori inductori

Apariţia celulelor

progeni-toare

Celule stem

direcţionate(formatoare decolonii)

Celule multipoten

-ţiale limfoideCelule multipoten-ţiale mieloide

Creşte numărul

genelor represate

Factori inductori

127



Apariţia celuleor precursoare

Celule tinere(blaşti)

Proeritro-blastMieloblastMonoblastLimfoblast

Creşte numărulgenelor represate

Factori inductori

Apariţia celulelor specializate

Celulele mature Neuroni,celule musculare,

eritrocite,leucocite

Numărul de geneactive este

caracteristicfiecărui tip celular

Permisivitatea apare ca urmare a unor modificări genetice şi structurale ce au loc la nivelulmembranei celulare, modificări determinate de acţiunea unui alt inductor anterior. Se remarcă faptulcă permisivitatea pentru un anumit inductor este limitată în timp.

Diferenţierea celulară se realizează prin intervenţia unui grup heterogen de factori inductori,care iniţial acţionează asupra unei populaţii de celule pluripotente, iar mai apoi, asupra unor celuledeterminate (direcţionate). Astfel, în ontogeneză numărul determinărilor succesive coincide cunumărul inductorilor.

În urma acţiunii inductorilor şi determinării rezultă celulele STEM, celule de origine, din carevor lua naştere anumite tipuri de celule specializate. Astfel, celulele stem din măduva osoasăhematogenă sunt capăt de serie pentru hematii, leucocite şi trombocite, iar celulele nediferenţiarte din

epiteliu sunt capăt de serie pentru diverse tipuri de epitelii. În organismul adult nu mai există celule pluripotente, dar fiecare ţesut şi fiecare organ maiare încă rezerve de celule stem incomplet diferenţiate (excepţie făcând ţesutul nervos şi muscular cardiac). Aceste celule stem îşi pot continua programul de diferenţiere, putând reface celulelespecializate adulte, lezate sau uzate.

La mamifere, celula diferenţiată îşi păstrează aceeaşi cantitate de ADN ca şi celulapluripotentă, iar caracterele generale ale celulelor diferenţiate sunt expresia fnotipică a numărului degene nerepresate din genotip.

Diferenţierea celulară se realizează în două etape: a) o etapă a diferenţierii intracelulară şi b)o etapă a diferenţierii intercelulară.

În etapa diferenţierii intracelulare, în interiorul celulei se produc modificări structuralesuccesive care determină apariţia formei şi structurilor specifice celulei diferenţiate, ca de exemplumodificarea formei spermatogoniei şi apariţia flagelului.

În etapa diferenţierii intercelulare, modificările structurale suferite de un grup restrâns decelule dintr-o populaţie mai mare determină apariţia unor diferenţe între caracterele celulelor iniţiale şicaracterele celulelor provenite din celulele iniţiale.

Sub raport biochimic, diferenţierea s-a realizat în momentul în care în celulă s-a acumulat osubstanţă specifică, de regulă o proteină cu funcţie enzimatică, ca de exemplu hemoglobina înhematii, actina şi miozina în celulele musculare.

Ca rezultat al diferenţierii celulare apar funcţii specifice fiecărui tip celular constituit, precumcontractilitatea celulelor musculare, mobilitatea spermatozoidului, transportul de oxigen şi bioxid decarbon.

7.2. Caracteristicile celulelor diferenţiate

Caracterele celulelor diferenţiate sunt reprezentate de:

1) Specializarea funcţională, care reprezintă principalul obiectiv al diferenţierii celulare, fără ase contrapune cooperării cu alte tipuri celulare.2) Morfologia (forma şi structura) celulelor diferenţiate este specifică în sensul dezvoltării mai

accentuate a organitelor celulare necesare îndeplinirii funcţiilor specifice. Astfel, reticulul endoplasmicrugos şi complexul Golgi sunt foarte dezvoltate în celulele implicate în sinteza de proteine, iar aparatul de contracţie, respectiv filamentele de actină şi miozină, apare foarte dezvoltat în celulelemusculare.

3) Compoziţia chimică apare specifică, datorită acumulării unor proteine specifice sau datoritădesfăşurării unor activităţi enzimatice specifice.

4) Adezivitatea pe substrat, care permite formarea ţesuturilor şi organelor.5) Interrelaţia cu alte celule sau joncţiunea, prin care se realizează solidarizarea între ele în

cadrul unui ţesut. Prin joncţiunile permeabile, de tip gap pot trece anumite molecule cu rol în reglarea

funcţională, permiţând funcţionarea sincronă a celulelor din ţesuturi.6) Inhibiţia capacităţii de diviziune. Celulele diferenţiate sunt greu divizibile sau indivizibile (caneuronul, hematia, celula musculară cardiacă etc). Celulele diferenţiate divizibile îşi pot regla ritmul de

128



diviziune în funcţie de necesităţi (ca în cazul hepatocitelor). Capacitatea de diviziune este mai întârziată sau inhibată în cazul celulelor cu grad de specializare avansat. De asemenea, în cazul unor ţesuturi în care celulele specializate au o durată de viaţă foarte scurtă, ca urmare a solicitărilor func,tionale intense (exemplu în epiteliu interstiţial) se întâlnesc celule tinere, incomplet diferenţiate,capabile să se dividă pentru refacerea populaţiei de celule adulte specializate, epuizate.

7) Inhibiţia de contact, care apare atunci când densitatea celulelor atinge un anumit grad

într-un ţesut (ca, de exemplu în regenerarea epiteliilor după lezionare) sau în culturile de celule. Prinaceastă proprietate celulele sunt oprite din migrare şi proliferare.

Celule specializate

7.3. Caracteristicele celulelor nediferenţiate

Celulele nediferenţiate prezintă următoarele caracteristici.1) Nu au funcţii specifice, celulele nediferenţiate pot îndeplini un singur rol, acela de a genera

diverse tipuri de celule specializate în urma determinărilor succesive.2) Nu au structuri specifice, toate celulele nediferenţiate sau parţial diferenţiate sunt

asemănătoare prezentând: nucleul mare, eucromatic, citoplasma redusă cantitativ, slab bazofilădatorită numărului scăzut de ribozomi.

3) Nu au compoziţii chimice specifice.4) Prezintă adezivitate pe substrat, încât atunci când vin în contact se recunosc, aderă şi

formează ţesuturi sau organe.5) Joncţionarea cu alte celule se poate realiza prin joncţiuni de tip gap, cu un diametrul mai

mic decât în cazul celulelor diferenţiate. Aceste joncţiuni prezintă un mare dinamism desfăcându-se şirefăcându-se cu rapiditate.

6) Prezintă o mare capacitate de diviziune, ceea ce permite unui număr redus de moleculeinductoare care acţionează iniţial asupra unui număr foarte mic de celule să genereze un număr marede celule.

7) Prezintă inhibiţie de contact, ca şi în cazul celulelor diferenţiate. În momentul în care iaucontact cu alte tipuri de celule, celulele nediferenţiate se opresc din migrare, putând să realizezeţesuturi şi organe.

Celulele mature pot suferi fenomenul de modulaţie şi de metaplazie.Modulaţia este fenomenul prin care în celulele mature, în anumite condiţii fiziologice sau

patologice, pot să apară modificări structurale şi funcţionale, minore şi pasagere, reversibile, care le

fac să semene cu celula tânără din care au provenit. Astfel, fibrocitele se pot transforma în fibroblaste în culturile de celule, datorită condiţiilor de mediu.

Metaplazia este fenomenul de transformare a unei celule diferenţiată într-o celulă diferenţiatăde alt tip. Metaplazia apare exclusiv la ţesutul epitelial şi conjunctiv.7.4.ÎmbĂtrÂnirea Şi moartea celulelor

În viaţa sa, celula parcurge următoarele stadii (sau faze): 1) un stadiu de funcţionarenormală; 2) îmbătrânirea (sau senescenţa); 3) agonia; 4) moartea celulară.

Celule îmbătrânite suferă o serie de modificări morfologice precum: a) scăderea volumuluicelular; b) scăderea ritmului mitotic şi creşterea procentului de celule moarte, într-o populaţie decelule; c) modificări ale nuceului şi d) modificări ale citoplasmei.

Denumirea celulelor Specializarea funcţionalăEritrocite Transport de oxigen şi dioxid de carbonMiocite ContracţieEnterocite Absorbţie şi metabolismCelule caliciforme Sinteză de substanţe mucoaseExocrinocitele pancreatice Sinteză şi secreţie de enzime

Endocrinocitele pancreatice Sinteză de hormoni pancreaticiEndocrinocitele din gonade Sinteză de hormoni steroiziNefrocitele Transport de ioniNeuroni Generare şi conducere de impulsuri nervoaseMacrofage Digestie intracelulară

129



Fig.7.1. Modificări ale nucleului în timpul înbătrânirii şi morţii celulelor 1-Picnoza; 2- Cariorexis; 3- Carioliză

Modificările nucleului sunt reprezentate de: a) picnoza nucleară, care constă în retractarea şicondensarea nucleilor, colorare intensă (hipercromie) şi dispariţia detaliilor de structură; b) cariorexissau fragmentarea nucleului; c) carioliza sau dispariţia (dizolvarea) nucleului.

Modificările citoplasmei constau în: scăderea bazofiliei, vacuolizarea citoplasmei, acumulareade pigmenţi de uzură şi lipide ca urmare a scindării moleculelor lipoproteice. (Fig.7.1)

În celulele în agonie se observă: a) modificări nucleare asemănătoare celor întâlnite încelulele îmbătrânite; b) modificări ale organitelor citoplasmatice, cu eliberare de fosfolipide şiformarea de figuri mielinice; c) modificarea stării coloidale a citoplasmei (fluidificare sau gelificare) şimodificări ale curenţilor citoplasmatici.

Ipotezele şi teoriile privind îmbătrânirea şi moartea celulelor se pot grupa în două categorii:a) o teorie a erorilor şi b) o teorie a morţii programate a celulelor.

Teoria erorilor consideră că senescenţa celulară (îmbătrânirea) este o consecinţă aacumulării defectelor genetice în urma acţiunii radiaţiilor, agenţilor mutageni sau radicallor liberi dinmediu asupra ADN-ului sau asupra diferitelor etape din transcrierea şi traducerea informaţiei

genetice. Rezultatul acestei acţiuni este producerea unor “erori ” în sinteza unor proteine şi înfuncţionalitatea lor. O variantă a teoriei erorilor o reprezintă teoria invaziei virale care considerăsenescenţa celulară ca fiiind o consecinţă a încorporării ADN-ului viral în genomul celulei. Prin teoriaerorilor nu se poate explica însă variabilitatea duratei de viaţă a diferitelor tipuri de celule.

Teoria morţii programate, recent elaborată, susţine că fiecare tip de celulă are înscris înprogramul genetic o anumită durată de viaţă, după care celula moare. Această teorie este sprijinită derezultatele experimentale obţinute de HAYFLICK (1986), care, în culturi de celule, a observat căfibroblastele provenite din ţesutul embrionar se divid de 50 de ori, în timp ce la fibroblastele provenitede la persoane de diferite vârste, numărul diviziunilor scade treptat cu vârsta. Dacă culturile de celulesunt îngheţate mai mulţi ani, la dezgheţare, culturile se divid exact de atâtea ori, ca şi celulele deaceeaşi generaţie neîngheţate. Descifrarea mecanismului programării morţii în celulele normale poateoferi cheia vindecării cancerului şi prelungirea vieţii.

Îmbătrânirea celulară apare ca un proces cu semnificaţii structurale şi funcţionale variate

pentru diferitele tipuri de celule existente în organism. Astfel, celulele cu ritm rapid de diviziune au unproces de îmbătrânire cu un mecanism de producere diferit faţă de unele celule nedivizibile. Orice tipcelular diferenţiat divizibil parcurge în cursul viaţii organismului un număr precis de diviziuniprogramate genetic, încât îmbătrânirea poate să se traducă prin scăderea ritmului sau chiar oprireacompletă a procesului de diviziune. În cazul celulelor nedivizibile în cursul vieţii organismului(neuronul, celulele musculare) îmbătrânirea se traduce prin acumularea de macromolecule cuproprietăţi diferite de cele iniţiale sau prin acumularea de substanţe nedegradabile (ca lipofuscinăetc.).

Între senescenţa celulară şi îmbătrânirea organismului întreg este o mare diferenţă,organismul animal fiind format din mai multe sisteme. Astfel îmbătrânirea organismului este rezultatul îmbătrânirii fiecărui sistem în parte şi mai ales rezultatul îmbătrânirii moleculelor, celulelor, ţesuturilor şi organelor, fiecare dintre acestea îmbătrânind într-un mod specific, diferit.

Moartea celulei Studierea mecanismelor şi a cauzelor care produc moartea celulei constiuie obiectul de

studiu al tanatologiei celulare.

130



Moartea celulei se produce instantaneu, încât post mortem se poate observa: a) retractareapseudopodelor şi adoptarea unei forme sferice; b) o colorare difuză a nucleului şi citoplasmei cucoloranţi vitali; c) balonarea şi dispariţia mitocondrilor; d) picnoză, cariorexis şi carioliză nucleară.Aceste modificări sunt rezultatul eliberării enzimelor din lizozomii alteraţi, ca urmare a încetăriicirculaţiei sanguine şi constituie un semn cert al morţii organismului animal.

Sunt descrise trei tipuri de moarte a celulelor: moartea celulară programată, apoptoza şi

necroza.Moartea celulară programată sau oncoza constă în autodistrugerea celului prin activareaunui program genetic propriu şi specific. Se întâlneşte în cursul dezvoltării ontogenetice embrio-foetale, pe parcursul dezvoltării sau funcţionării unor organe (de exemplu: in- voluţia glandei mamare,la încheierea unui ciclu de lactaţie sau involuţia uerului la încetarea stării de gestaţie.

Apoptoza este o moarte celulară lentă, care intervine după primirea unor semnale intrinsecişi se realizează prin mecanisme proprii. Prin acest tip de moarte celulară, organismul se elibereazăde anumite celule care nu-i mai sunt utile (celule lezate, celule în exces, celule cu ADN-ul modificat şinereparat, etc)

În producerea apoptozei se pot distinge patru stadii evulutive : un stadiu molecular, un stadiude contractare, un stadiu de clivaj şi un stadiu de fagocitoză.

În stadiul molecular sau de preangajare apar modificări ale membranei şi citoplasmei care îipermit celulei să recepţioneze semnale (de obicei chimice: AMP-c, inozitol trifosfatul, ioni de calciu,

etc), ce produc modificarea permeabilităţii membranelor celulare, dispariţia microvililor , dispariţia joncţiunilor şi pierderea contactului cu celulele adiacente. Ca o consecinţă a acestor fenomene seproduce activarea unor „gene de liză” sau „gene letale” (protooncogene c-fos, c-myc, antioncogena P53). Aceste gene induc sinteza de macromolecule efectoare sau activatoare ale apoptozei (proteinade stress hsp 70, catepsina D etc.) Celulele părăsesc angrenajul tisular, citosolul se condensează,plasmalema prezintă invaginaţii adânci, iar în nucleu apare o hipercromatoză marginală, datoritădispunerii periferice a eucromatinei nucleare. În acest stadiu ribozomii şi mitocondriile nu suntmodificate,iar celula este încă capabilă să elimine colranţii vitali

În stadiul următor, de clivaj în corpi apoptotici, cisternele reticulului endoplasmic şi unii sacigolgieni se vacuolizează, iar fibra de cromatină este fragmentată, sub acţiunea unor endonucleaze,dependente de calciu şi sensibile la zinc. Apar „ corpii apototici ” cu aspectul fragmente celularedelimitate de plamalemă şi conţinând citosol, organite şi oligonucleozomi. Stadiul de fagocitoză şi de eliminare a corpilor apoptotici este de scurtă durată, deoarece

corpii apoptotici sunt recunoscuţi imediat de lectine şi receptorii macrofagelor şi eliminaţi prinfagocitoză.Citonecroza sau necroza sau necrobioza este o moarte celulară violentă. Se produce sub o

acţiune patogenă intensă ce depăseşte posibităţile de adaptare ale celulei şi cuprinde un număr maimare de celule. Într-o primă fază celula se tumefiază, apoi lizozomii eliberează hidrolazele acide, încât celulele se lizează în totalitate,generând o reacţie inflamatorie în teritorillie învecinate. Nucleultrece prin modificări profunde (picnoză, carirexis şi carioliză).Celulele necrozate îşi măresc volumul,contrar faţă de ceea ce se întâmplă în apoptoză.

7.5. Recunoaşterea celulară

Celula posedă capacitatea de a se recunoaşte unele pe altele în mod specific. Astfel, dacăun embrion de găină este disociat în celule independente, prin tratament cu tripsină, după câteva orecelulele aflate în suspensie se agregă (se grupează) din nou. Dacă se amestecă celule ectodermiceşi mezodermice, iniţial se formează un conglomerat sferic, dar după 1-2 zile, celulele se separă dupătip, cele mezodermice dispunându-se la interior, iar cele ectodermice la exterior. Fenomenul sedatorează glicoproteinelor prezente în membrana citoplasmatică, care formează molecule specifice,capabile să transmită informaţia genetică. În cultură fenomenul recunoaşterii celulare se manifestă încazul celulelor normale prin inhibiţia de contact încât contactul cu peretele lateral al vasului şi cucelulele vecine oferă celulei informaţia necesară pentru oprirea diviziunii.

Inhibiţia de contact este absentă în cazul celulelor maligne şi a unor celule transformate, careapar spontan în culturile de celule normale.

Pierderea inhibiţiei de contact nu este însă un criteriu suficient pentru a defini o celulămalignă sau o celulă transformată. Astfel în 1960, AUB a descoperit că celulele maligne şitransformate au un plus încă o proprietate care le deosebeşte de celulele normale, ele fiind aglutinatede lectine (sau fit - hemaglutinine) care sunt proteine vegetale ce se leagă de glicolipidele şiglicoproteinele din membranele celulelor transformate şi tumorale.

131



7.6.ONCOGENELE

Oncogenele sunt o categorie de gene, care pot să determine transformarea unei celulenormale într-o celulă canceroasă. Sunt considerate o formă mutantă a unei gene normale ( proto-oncogenă) implicată în creşterea şi diviziunea celulelor.

Modificările de membrană ale celulelor maligne se datoresc modificărilor intervenite înexprimarea unor gene, care determină compoziţia şi proprietăţile membranei celulare periferice,ceeace face ca celulele maligne să aibă o capacitate de creştere autonomă, ele reproducându-se şiproliferând independent de mecanismele normale de reglare.

Un model al genezei cancerelor (cancerogenezei ) propus de HUEBNER şi TODARO (1969)susţine că în toate celulele normale există un virus integrat în cromozomi (un provirus). La unmoment dat se produce activarea uneia din genele virale (denumită oncogenă) care codifică proteinece pot să transforme o celulă normală într-o celulă malignă.

S-a constatat că, în cromozomii umani, există gene care au secvenţe foarte asemănătoarecu oncogenele virusurilor cu ARN (denumite v-oncogene). Astăzi se ştie că nu oncogenele celulareprovin din cele virale (deci nu sunt virusuri integrate), ci dimpotrivă virusurile au preluat din celulelenormale aceste gene.

Oncogenele celulare au fost denumite şi proto-oncogene şi se pare că s-au conservat, în

evoluţie, un timp foarte îndelungat, îndeplinind funcţii foarte importante. Până în prezent nu secunoaşte ce rol au în celula normală şi nici ce este modificat, atunci când se produce cancerul,determinând perturbări în exprimarea oncogenelor. În cancer s-au descris modificări ale cromozomilor ca ruperi de cromozomi şi transferuri ale fragmentelor pe alţi cromozomi, oncogenele fiind localizatetocmai în locul în care se rup cromozomii sau în fragmentele translocate.

Sunt cunoscute 18 proto-oncogene, care se pot clasifica în două clase: a) myc şi b) ras.Oncogenele myc intervin în codificarea proteinelor nucleare, reglează transcrierea şi induc

transcrierea unor gene esenţiale, critice pentru proliferarea celulară.Oncogenele ras codifică o serie de proteine ce se localizează în citoplasmă şi determină

modificări de formă, de adezivitate şi de recepţionare a unor semnale de creştere. Se pare că o celulădevine transformată malignă întrucât secretă în exces un factor stimulator al creşterii celulare, careprintr-un mecanism “autocin” suprastimulează însăşi creşterea celulei care l-a produs.

Date recente par a indica că o singură oncogenă nu poate produce cancer, fiind necesară

colaborarea mai multor oncogene care intră în activitate în fiecare din etapele carcicogenezei.Cunoscându-se mecanismele moleculare ale malignizării se pot identifica punctele unde aceasta vaputea fi întreruptă încât se speră că biologia moleculară va contribui la adoptarea unei adevărateterapii a cancerelor.

8.MATRICEA EXTRACELULARĂ

Matricea extracelulară sau intercelulară este mediul în care trăiesc şi îşi desfăşoarăactivitatea diferitele tipuri de celule ale organismelor pluricelulare. În acest mod, celulele se află în

contact cu o reţea de macromolecule, denumită matricea extracelulară, care ocupă spaţiul intercelular continuându-se cu glicocalixul.

Matricea extracelulară

132



Matricea extracelulară este compusă dintr-o mare diversitate de molecule de proteine şi depoliglucide,care sunt asamblate într-o reţea, ce menţine strânse raporturi cu suprafaţa celulelor, carele sintetizează.Este bogată în polimeri fibrilari, în special de colagen, care rezistă mai mult decâtcelulele la diferite solicitări mecanice.

Există mari diferenţe în cantitatea, tipul de molecule şi modul de organizare a matriceiextracelulare, fiecare formă de organizare fiind adaptată la solicitările funcţionale aleţesutului.Astfel,matricea extracelulară se calcifică în ţesutul osos şi în dinţi, este transparentă încornee.În ţesutul conjunctiv, matricea este mai abundentă decât în alte tipuri de ţesuturi, încâtcelulele apar relativ mai rare.

Matricea extracelulară participă la realizarea unor structuri specializate precum: membranelebazale, cartilagiile şi tendoanele. iar împreună cu depunerea cristalelor de fosfat de calciu participă laformarea oaselor şi dinţilor.

Funcţiile matricei extracelulare sunt multiple: a) stabilizează structura fizică a ţesuturilor; b)lubrefiază, amortizează şocurile mecanice şi asigură elasticitatea ţesuturilor şi organelor; c) asigură şicontrolează adezivitatea celulară, acţionând ca un “clei intercelular universal”; d) influenţează şicontrolează creşterea, diferenţierea, proliferarea şi migrarea celulelor; e) îndeplineşte un rol metabolicactiv.

În alcătuirea matricei extracelulare intră trei componente: a) membrana bazală; b) fibreleintercelulare (colagene, elastice şi reticulare) şi c) substanţa fundamentală a matricei.

8.1.Membrana bazală

Membrana bazală (membrana basalis) sau lamina bazală este o structură specială situatăsub celulele epiteliale (pe care le separă de ţesutul conjunctiv subiacent) sau în jurul unor celuleindividuale (musculare, adipoase, celula Schwann).

În histologia clasică, termenul de membrană bazală a fost atribuit structurilor alcătuite dintr-olamă fină polizaharidică, ce îndeplinea rolul de a cimenta baza epiteliilor şi care se asociază cu otramă reticulară fină, în contact cu ţesutul conjunctiv.

Lama poliglucidică a fost evidenţiată selectiv prin impregnări cu săruri de argint sau prinreacţia PAS când se colorează în roşu purpuriu.

Epiteliile în marea lor majoritate, prezintă membrane bazale de formă lamelară, cu o grosimede ordinul zecilor de nanometri (40-120, în epiderm, epiteliul căilor respiratorii, glandele exocrine).Membrane bazale mai groase (de câţiva micrometri) sunt prezente la nivelul epiteliilor corneei(anterior şi posterior), cristalinului. În alte cazuri, ca în epiteliul vezicii urinare, existenţa membraneibazale a fost pusă la îndoială în histologia clasică, grosimea ei fiind sub puterea de rezoluţie amicroscopului optic. În glomerulul renal (în foiţa viscerală a capsulei Browmann) sau în epiteliulalveolar, membrana bazală este singura care se interpune între epiteliul respectiv şi endoteliulcapilarelor sanguine, acţionând ca un filtru foarte selectiv. (Fig.8.1)

Componente Ultrastructuri Compoziţie moleculară

Membranabazală

A.Lamina bazală(lamina lucida + laminareticularis)B. Lamina reticulară

colagen IVproteoglicani (perlecan)fibronectinălaminină

Fibre de colagen colagen fibrilar (I, II, III )colageni asociaţi fibrilelor ( IX, XII)Fibreintercelulare

Fibre elastice (oxitalanice,de elaunină)

elastinafibrilinaelaunina

Fibre de reticulină colagen III

Substanţăfundamentală

astructurată

- Glicozaminaglicani : acidul hialuronic,condroitinsulfaţii, keratan sulfaţii,heparina- Proteoglicanii : agrecan,sindecan, betaglican)- Glicoproteinele structurale :fibronectina,laminina,condronectina, uvomorulina,glicoproteina 115

Lichid tisular astrucuturat apă, ioni, micromolecule de proteine

133



Fig.8.1.Ultrastructura membranei bazale1- Nucleu; 2- Citoplasmă; 3-Plasmalemă; 4- Membrana bazală; 5- Fibre conjunctive;6.Lamina lucida; 7- Lamina densa; 8- Lamina reticularis; 9- Colagen

La microscopul electronic, membrana bazală se prezintă ca o structură matriceală fină carese interpune între ţesuturile epiteliale şi ţesutul conjunctiv subiacent. Membrana bazală prezintă înalcătuirea sa trei structuri lamelare suprapuse: 1) lamina lucidă (lamina lucida), cu grosime de 10 nm,adiacentă plasmalemei bazale a celulelor epiteliale, omogenă şi traversată de rare filamente fine; 2) olamină densă (lamina densa s.basalis), cu grosime de 20-30 nm formată din filamente fine,abundente, cuprinse într-o matrice amorfă, densă şi 3) o lamină reticulată (lamina fibroreticularis),care face trecerea la matricea ţesutului consjunctiv.

Membrana bazală este produsă, prin secreţie, de către celulele ce se sprijină pe ea şi seleagă prin dispozitive joncţionale speciale de adezivitate, denumite hemidesmozomi . În epiteliulstratificat pavimentos cornificat al epidermului, lamina basalis este ancorată de ţesutul conjunctivsubiacent prin fibrile de ancorare (anchoring fibrils), formate colagen VII.

Compoziţia chimică a membranelor bazale variază de la un ţesut la altul, de la o regiune laalta a aceleiaşi lamine şi cuprinde: colagen (de tipul IV ), proteoglicani (precum un mare heparansulfat, denumit perlecan), fibronectină, entactina şi laminina.

Laminina este una din primele proteine ale matricei extracelulare, sintetizată de celuleleembrionare. În stadiile timpuriii ale structurării, lamina bazală este formată dintr-o reţea de laminină,colagenul IV lipsind sau fiind redus cantitativ.

134



Fig.8.2. Componentele membranei bazale

Laminina este o macromoleculă (850.000 daltoni), complexă flexibilă, formată din trei lanţuri polipeptidice foarte lungi, legate între ele prin legături disulfidice şi dispuse în fomă de cruceasimetrică. Are mai multe domenii funcţionale care leagă colagenul IV, heparan sulfatul, entactina, iar unul sau mai multe domenii se leagă de unele de pe suprafaţa celulei proteine receptori. Asemănător colagenului IV, moleculele de laminină pot forma, in vitro, o reţea prin stabilirea deinteracţiuni între capetele braţelor moleculei de laminină.

Entactina, o moleculă proteică cu aspect de halteră, se leagă strâns de braţul scurt alfiecărei moleculă de laminină. totodată entactina se mai leagă de colagenul IV, jucând rolul unei punţiide legătură între colagenul IV şi reţeua de laminină din membrana bazală.

Funcţiile membranei bazale sunt multiple şi complexe:1) Acţionează ca un filtru semipermeabil selectiv, reglând trecerea macromoleculelor

(exemplu, din sânge în urină, la nivelul glomerulilor renali). Heparan sulfatul joacă un rol împortant înrealizarea acestei funcţii, încât atunci când lanţurile de glicozaminoglicani sunt distruse enzimatic,funcţia de filtru selectiv este distrusă. (Fig. 8.2)

2) Acţionează ca o barieră celulară în epitelii, oprind trecerea fibroblastelor,încât acestea nu ajung în contact direct cu celulele epiteliale, dar permite trecerea macrofagelor, limfocitelor şi a prelungirilor nervoase.

3) Participă la regenerarea ţesuturilor lezionate (epitelii, muşchi, nervi), funcţionând ca unsuport pentru deplasarea celulelor în cursul regenerării ţesuturilor epiteliale, a joncţiunilor

neuromusculare.În cazul joncţiunii neuromusculare, membrana bazală care înconjoară celula musculară

prezintă o porţiune joncţională care se interpune între terminaţiile neuronului motor şi plasmalemacelulei musculare. Această porţiune joncţională joacă un rol central în refacerea sinapsei dupălezarea nervului sau a muşchiului.Astfel, membrana bazală joncţională ghidează terminaţiile nervoasemotorii şi controlează localizarea receptorilor pentru acetilcolină în plasmalem celulei musculare.

În extractele obţinute din membrana bazală joncţională s-a identificat o nouă proteinămatriceală, denumită agrină, care adaugată la culturile de celule musculare, inţiază apariţia destructuri sinaptice în plasmalemă. Agrina este produsă nu numai de neuronii motori şi pare a avearolul în configurarea ansamblului de receptori şi de alte macromolecule postsinaptice.

4) Participă la recunoaşterea intercelulară şi la ghidarea celulelor, în timpul dezvoltariiembrionului. Astfel, s-a observat că mutaţia unei gene care codifică o proteină asemănătoarelamininei perturbă căile pe care unele celule mezodermice şi axoni nervoşi se deplasează pe

memebrana bazală ce susţine epidermul.

135



5) Membranele bazale sunt capabile să: inducă diferenţierea celulară, să determinepolaritatea celulară, să influenţeze metabolismul celular, să organizeze proteinele din membranaplasmatică adiacentă şi să constituie o cale specifică pentru migrarea celulelor.

8.2. Fibrele intercelulare

Fibrele intercelulare sunt reprezentate de: a) fibrele de colagen; b) fibrele elastice cu variantalor fibrele oxitalanice şi c) fibrele de reticulină.

8.2.1. Fibrele de colagen

Fibrele de colagen (Fibrae collagenosae) sunt alcătuite din proteine fibroase (sauscleroproteine), constituite din molecule de colagen, care reprezintă aproximativ 25-30% din totalulproteinelor din organism.

Molecula de colagen are o lungime de 300 nm şi un diametru de 1,5 nm, fiind formată din treilanţuri polipeptidice numite lanţuri alfa, răsucite în triplu helix. Configuraţia de triplu helix a moleculeide colagen este stabilizată prin punţi de hidrogen şi legături bisulfidice, realizate între cele trei lanţuri,din care două lanţuri alfa 1 (α1) sunt asemănătoare între ele prin frecvenţa aminoacizilor, dar diferă decel de al treilea lanţ, denumit lanţ alfa 2 (α2).

Lanţurile alfa pot fi de 25 tipuri diferite, fiecare fiind codificat de câte o genă proprie. Un lanţ conţine 1000 radicali de aminoacizi, este răsucit în helix spre dreapta, pe fiecare tură existând otripletă de aminoaci ( glicină -prolină -hidroxiprolină). Prolina are o formă sferică, stabilizeazăconformaţia helicoidală în fiecare lanţ α .Glicina, cel mai mic aminoacid din lanţ (având numai un atomde hidrogen în lanţ) permite împacetarea strânsă a celor trei lanţuri pentru a forma în final triplu helixul de colagen. Genele care codifică lanţurile α sunt foarte mari, ajungând la o lungime de 44Kilobaze şi conţin în jur de 50 exoni. Multi exoni au o lungime de 54 (sau un multiplu de 54) denucleotide, ceea ce sugerează că colagenii iau naştere prin multiple duplicaţii ale unei gene primordiale ce conţine 54 nucleotide şi codifică tripleta Gly-X-Y (glicină-prolină-hidroxiprolină).

Fig.8.3. Schema moleculei de colagen IVA-Domeniu necolagenic 1 (globulus); B- Domeniu necolagenic 2; C- Fragment 7 S;D-Segment major; E- Zona mobilă a moleculei.

Există 25 lanţuri α care pot fi asamblate în mai mult de 10.000 tipuri de molecule decolagen, dintre care numai 15 sunt mai bine cunoscute. Principalele tipuri de colagen din ţesutulconjuctiv sunt colagenul de tip I, II, III,IV, V şi XI (Fig.8.3).

Colagenul de tip I , fibrilar, este cel mai comun,fiind principalul colagen din piele, tendoane,oase şi capsule. Prezintă o structură moleculară tipică, în triplu helix (Fig.8.4).

Colagenii de tip IV şi VII formează reţele (network-forming collagens).Moleculele de colagenIV formează o ţesătură care ocupă o parte importantă din membrana bazală. Moleculele de colgen detip VII formează dimeri, care întră în structura fibrilelor de ancorare (anchoring fibrils), mai abundente în piele şi care ajută la ancorarea membranei bazale a epidermului la ţesutul conjunctiv subiacent.Colagenii de tip IX şi XII, denumiţi colageni asociaţi fibrilelor (fibril-associated collagens) acoperăsuprafaţa acestora şi participă la legarea fibrilelor atât între ele, cât şi de alţi componenţi ai matriceiextracelulare.

136



Fig.8.4. Lanţurile polipeptidice ale moleculei de colagen

Colagenul de tip I, II şi III polimerizează sub formă de fibrile de colagen şi organizeazăcolagenul fibrilar care intră în alcătuirea fibrelor de colagen şi reticulină.

Colagenul de tip IV şi V nu formează fibrile, fiind colagen afibrilar şi intrând în structuramembranelor bazale şi învelitorilor fetale.

În mediul extracelular, moleculele de colagen polimerizează, formând microfibrile de

colagen (microfibrilla colagenoidea), cu diametrul de 10-300 nm, lungi de mai multe sute de microni,observabile în electronomicrografii. Fiecare microfibrilă de colagen prezintă o alternanţă regulată debenzi clare şi întunecate, ce se succed cu o periodicitate de 67 nm, datorită dispunerii ordonate amoleculelor. În microfibrile, moleculele de colagen (sau tropocolagen) sunt dispuse paralel între ele şi“în scară”, apărând astfel, de-a lungul microfibrilei, zone lacunare (gap) de 35 nm ce alterneazăregulat cu zone de suprapunere. Zonele sau benzile lacunare apar negre la microscopul electronic,deoarece au mai mulţi radicali liberi care fixează mai uşor colorantul negativ. Mărimea gap-ului esteastfel aranjată, încât se repetă după 5 molecule de colagen. (Fig.8.5)

Fig.8.5. Dispunerea microfibrilelor în fibra de colagen

Microfibrilele de colagen se leagă între ele, prin interacţiuni covalente transversale, ce sestabilesc între radicalii de lizină din moleculele constituiente, formând fibrilele de colagen (fibrillacolagenosa), groase de 0,2 - 0,5 µm. Dacă legăturile transversale sunt inhibate, rezistenţa la întindere

este foarte redusă, iar formaţiunile colagenoase din piele,tendoane şi vase devin fragile, rupându-se. În unele structuri (tendonul Ahile), legăturile transversale sunt foarte dese, asigurând o foarte marerezistenţă la intindere.

Fibrilele au diametre variate şi se organizează diferit. În pielea mamiferelor se dispun în reţelepentru a rezista la tracţiuni pe mai multe direcţii.În tendoane, se dispun în benzi parale, orientate înaxul major al tensiunii. În osul matur şi în cornee, se dispun în lamele,iar fibrlele dintr-o lamelă suntparalele între ele, dar perpendiculare pe cele din lamela învecinată.

Celulele conjunctive regla mărimea şi dispunerea fibrilelor de colagen, prin ghidareadispunerii moleculelor de colagen după secreţie în strânsă asociere cu plasmalemma. În plus,organizarea spaţială a fibrilelor de colagen este influenţată şi de interacţiunile cu alte molecule dinmatricea extracelulară. Astfel, molecule de colagen de tip IX şi XII sunt produse de însuşi celuleconjunctive locale şi devin colageni asociaţi f ibrilelor.

Colagenii asociaţi fibrilelor diferă de colagenii fibrilari prin mai multe particularităţi: - au

structura triplu helicoidală întreruptă de unul sau două domenii nonhelicoidale, ceea ce le conferă maimultă flexibilitate; - reţin propeptidele după secreţie; - nu se grupează pentru a forma fibrile;- se leagăperiodic de suprafaţa fibrilelor din colagenii fibrilar. Astfel, colagenul de tip IX se leagă de colagenul II,

137



conţinut în cartilagii, cornee şi corpul vitros.Clagenul de tip XII se leagă de colagenul I din tendoane şidin alte ţesuturi. Colagenii asociaţi fibrilelor au rolul să medieze atât interacţiunile fibrelor între ele, câtşi cu alte molecule din matrice, jucând un rol deosebit în dispunere fibrilelor.

Un număr variabil de fibrile de colagen se asociază şi formează fibre de colagen(fibracollagenosa), cu grosimi între 1 şi 20 µm. La rândul lor, fibrele sunt unite între ele prin ca hexoze,care conferă o reacţie PAS-pozitivă fibrelor de colagen.

Fibrele de colagen sunt cilindrice lungi şi sinuoase cu capete care se pierd în matriceaextracelulară. Sunt denumite şi fibre albe şi nu se anastomozează între ele, dar se pot grupa în benzi, în unele ţesuturi conjunctive. Sunt foarte rezistente şi apar birefringente la microscopul de polarizare.Fiind acidofile se colorează în roz cu eozina, în albastru prin coloraţia tricromică Mallory şi în verde cucoloraţia tricromică Masson. Pot fi degradate sub acţiunea colagenazeiă, care eliberează molecula detropocolagen la un anumit nivel şi împarte triplul helix în două fragmente inegale, unul reprezentând75% din moleculă, iar celălalt 25%. Numai în cazuri rare se reuşeste să separe unul de altul cele treilanţuri ale moleculei de colagen.

Formarea (geneza) fibrelor de colagenColagenul este produs (sintetizat şi secretat) de către fibroblaste (în ţesuturile conjunctive),

condroblaste (în cartilaj), osteoblaste (în ţesuturile osos). Producerea colagenului are loc în douăetape: o etapă intracelulară şi alta extracelulară.(Fig.8.6)

Fig.8.6. Etapele producerii fibrei de colage

138



În etapa intracelulară are loc:- copierea genelor (transcripţia) care codifică sintezamoleculelor de colagen; - traducerea mesajului genetic în sinteza lanţurilor pro α ; - hidroxilarearadicalilor de prolină şi lizină, precum şi glicozilarea radicalilor de hidroxilizină; - elaborarea lanţurilor polipeptidice, formarea legăturilor bisulfidice şi asamblarea lanţurilor polipeptidice cu formarea detriplu helix ; - împachetarea procolagenului în complexul Golgi şi eliberarea acestuia în mediulextracelular.

Lanturile polipeptidice de colagen sintetizate de ribozomii ataşati membranele reticulului endoplasmic sunt injectate în lumenul acestuia ca precursori, denumiţi lanţuri pro-α. Aceşti precursori prezintă la ambele capete ( amino- şi carboxil-) aminoacizi adiţionali, denumiţi propeptide.Propeptidele ghidează formarea intracelulară a moleculeor de procolagen triplu răsucite, prevenind,totodată, apariţia intracelulară a unor fibrile mari,care ar putea fi nocive pentru celule. În lumenul RE, radicalii de prolină şi lizină sunt hidroxilaţi, formând hidroxiproline şi hidroxilizine, iar unelehidroxilizine sunt glicozilate. Fiecare lanţ pro-α se leagă de alte două lanţuri prin punţi de hidrogen,rezultând o moleculă triplu răsucită helicoidal, denumită procolagen.

În etapa extracelulară, procolagenul este transformat în molecule de colagen (tropocolagen ) prin înlăturarea enzimatică a propeptidelor (numai în cazul formelor de colagenfibrilar), după care are loc polimerizarea moleculelor şi formarea fibrilelor de colagen.

În moleculele de colagen, gupurile hidroxil din hidroxiprolină şi hidroxilizină au rolul săformeze legături de hidrogen între lanţuri, care stabilizează conformaţia spaţială de triplu helix şi

previn hidroxilarea prolinei, cum se întâmplă în deficienţa de acid ascorbic (scorbut). Înlocuirea(turnoverul) moleculelor de colagen are loc după o perioadă destul de lungă, ce ajunge în os până la10 ani.

Fibrilele de colagen se depun pe suprafaţa celulei care le-a produs, ocupând cu predilecţie înfundările plasmalemei, formate prin fuziunea veziculelor secretorii cu suprafaţa celulei. Citoscheletuldin citoplasma periferică influentează poziţia, numărul şi orientarea ansamblului de fibrile.

8.2.2.Fibrele elastice

Fibrele elastice (fibrae elasticae) sau fibrele galbene sunt mai subţiri decât cele de colagenavând diametrul de numai 1 nm. Ele sunt monofibrilare, se ramifică şi se anastomozează formândreţele neregulate. Sunt de cel puţin cinci ori mai extensibile decât o fibră de cauciuc de aceeaşisecţiune transversală. Se pot colora electiv cu orceină ( în roşu brun întunecat ), cu rezorcin fuxină

WEIGERT (în roşu aprins), cu aldehidfuxină GÖMÖRI (în negru) şi cu hematoxilină-eozină (când secolorează slab şi inconstant). Sunt rezistente şi extensibile (cu 100-200%), revenind la lungimeainiţială, după ce tracţiunea asupra lor a încetat. Se găsesc în pereţii vaselor sanguine, în pulmon, înpiele şi în ţesutul conjunctiv lax. Odată cu înaintarea în vârstă se răresc provocând disfuncţiaorganelor respective. Au o compoziţie în amino-acizi asemănătoare cu a fibrelor de colagen. Fibrele

elastice sunt de trei feluri: oxitalanice, de elaunină şielastice propiu-zise.(Fig.8.7)

Fig.8.7. Contracţia şi relaxarea moleculelor deelastină

Componentul principal al fibelor elastice este

elastina, o proteină foarte hidrofilă cu o lungime decirca 750 resturi (radicali) de amino acizi.Asemănător colagenului este bogată în prolină şiglicină, dar spre deosebire de acesta nu esteglicozilată şi conţine puţină hidroxiprolină şihidroxilizină.

La microscopul electronic, fibrele elasticeprezintă în centru o masă amorfă, astructurată, ceconţine elastina, înconjurată de o teacă demicrotubuli, orientată în axul longitudinal al fibrei şi

dispuşi în benzi. Microtubulii sunt formaţi din glicoproteine, apar primii în cursul elaborării fibrei decătre fibroblast şi au rolul de a orienta depunerea elastinei în regiunea amorfă centrală.

Formarea (geneza) fibrelor elastice.

Elastina este sintetizată ca precursor ( proelastina) de către fibroblastele din piele şi tendoanesau de către celulele musculare netede din pereţii vaselor mari. Proelastina, o moleculă globulară cumasa de 70 kDa este eliminată în matricea extracelulară, unde pe suprafaţa membranei plasmatice

139



(în înfundăturile acesteia) are loc polimerizarea în fibre elastice. Sub formă nefibrilară, elastina esteprezentă în lamele elastice din pereţii unor vase sanguine.

Elastina conţine doi amino acizi, desmosina şi isodesmozina, fiind compusă din două tipuride segmente scurte, care alternează dealungul lanţurilor polipeptidice:- segmente hidrofobe, care îiconferă proprietăţi elasticitate şi semente α-helicoidale,bogate în alanină şi lizină, care formeazălegături transversale între moleculele adiacente. Fiecare segment este codificat de un exon separat.

Elastina este rezistentă la fierbere, la extracţia cu acizi şi baze diluate şi la acţiunea tripsinei. În schimb, este hidrolizată de o enzimă, elastaza, secretată de pancreas.Moleculele de elastină, sinuoase şi polimorfe, sunt legate între ele prin punţi necovalente

slabe, ca şi prin punţi covalente distanţate, care permit reţelei să fie elastică. În organism, elastina poate servi ca matrice pentru calcifiere, explicându-se astfel formarea plăcilor ateromatoase şi calcifierea unor ţesuturi.

Miezul de elastină este acoperit de o teacă de microfibrile, care au un diametru de 10 nm.Microfibrilele sunt compuse dintr-un număr de glicoproteine, dintre care fibrilina pare a fi esenţialăpentru integritatea lor. Microfibrilele joacă un rol important în asmblarea fibrelo elastice. Ele apar înaintea elastinei în timpul dezvoltării fibrelor elastice şi formează o “schelă” pe care se depunmoleculele de elastină.

Fibrele oxitalanice sunt o varietate de fibre elastice, foarte rezistente la acizi. Sunt maigroase şi mai rigide decât fibrele elastice. Ele se pot colora cu coloranţii fibrelor elastice (orceina,

fucsina) numai după o prealabilă tratare cu acid peracetic, acid permanganic sau acid performic.Rezistă la digestia cu elastază, dar sunt degradate imediat prin tratare cu acid peracetic. Se găsesc în număr mare în ligamentele alveolo-dentare, dispersate printre fibrele de colagen şi reticulină.Numărul lor creşte în bolile paradonţiului sau în chisturile radiculare dentare.

O formă aparte de fibre elasice sunt fibrele de elaunină, care se găsesc în jurul glandelor sudoripare şi în derm.

8.2.3.Fibrele de reticulină

Fibrele de reticulină se caracterizează printr-un diametru mai redus (între 0,5 şi 2 µm),apărând foarte subţiri. Nu sunt grupate în fascicule, dar sunt ramificate şi formează reţele, în modfrecvent. Pot fi observate în contrast de fază şi în microscopul de polarizaţie, după colorare cu roşuSirius. Pe preparatele fixate, se colorează ca şi cele de colagen (cu albastru de anilină). Fiind fibre

argirofile, se pot evidenţia în condiţii bune cu săruri de argint. Datorită conţinutului mai mare înglicoproteine, fibrele de reticulină sunt PAS-pozitive. Astfel, hexozele sunt în procent de 6-12% înfibrele de reticulină, faţă de 1% în fibrele de colagen.

Fibrele de reticulină conţin, în principal, molecule de colagen de tip III, asociat cuglicoproteine, proteoglicani şi alte tipuri de colagen. La microscopul electronic apar formate din fibrilegroase de 35 nm, strâns împachetate şi legate între ele prin punţi de proteoglicani şi glicoproteine.Fibrele de reticulină iau naştere, ca şi celelalte două tipuri de fibre conjunctive, în fibroblaste, undeare loc sinteza de molecule de colagen tip III, ce vor fi exocitate şi polimerizate extracelular.

Sunt răspândite în: muşchii netezei, în ţesuturile hematopoetice şi limfopoetice (măduvaosoasă, splină şi organele limfoide), în jurul capilarelor, în membranele bazale, în glandele endocrine, în ficat, în rinichi, iar,în condiţii patologice, apar în ţesuturi după lezionări.Diametru redus şidispunerea în reţea laxă şi flexibilă a fibrelor reticulare permite modificări de formă şi volum a unor organe,precum splina, ficatul, arteerele, musculatura uterină şi intestinală. În cursul embriogenezei, în

procesele inflamatorii şi de cicatrizare, firbrele de reticulină pot fi înlocuite de fibre de colagen.8.3Substanţa fundamentală a matricei extracelulare.

Substanţa fundamentală (substantia fundamentalis), interfibrilară sau intercelulară, apareamorfă, incoloră, transparentă, omogenă şi vâscoasă. Din punct de vedere chimic, conţine diferitemolecule de glicozaminoglicani, de obicei legaţi covalent de o proteină, formând proteoglicani şiproteine fibroase, care sunt de două feluri: structurale (colagen, elastină) şi glicoproteine structuraleadezive (fibronectina şi laminina).

8.3.1.Glicozaminoglicanii

140



Denumiţi, în trecut, mucopoliglucide sau mucopolizaharide, glicozaminoglicanii (GAG) suntcomplexe poliglucidice neramificate, compuse din unităţi repetitive de diglucide, în care unul din celedouă resturi de glucid care se repetă este un aminoglucid ( N-acetil glucozamina sau N-acetil-galactozamina ).Cel de al doilea glucid este, de obicei un acid uronic (glucoronic sau iduronic).

Fig.8.8. Proteoglicani în monomer şi în agregat1-Miez proteic; 2-Heparan sulfat; Condroitin sulfat; 4Keratan sulfat;5-Proteine de legătură

Glicozaminoglicanii sunt intens încărcaţi negativ , din cauza grupărilor (terminaţiilor) sulfat sau

carboxil existente pe resturile de glucide. După radicalii de glucide, tipul de legături între acestea,numărul şi dispunerea grupărilor sulfat se disting mai multe tipuri principale de glicozaminoglicani:-acidul hialuronic sau hialuranul ;- condroitin sulfatul şi dermatan sulfatul ;- heparan sulfatul şi heparina;-keratan sulfatul (Fig. 8.8).

Lanţurile de poliglucide sunt intens hidrofile şi inflexibile, încât nu se pot plia în structuriglobulare. De aceia, glicozaminoglicanii au o conformaţie foarte extinsă, ocupând un volum imensfaţă de masa lor, formând geluri şi la concentraţii foarte mici.

Sarcinile negative, foarte numeroase, atrag o mulţime de cationi (Na+), sunt osmotic active şi reţin o mare cantitate de apă în matricea extracelulară, făcând-o turgescentă, capabilă să reziste lacompresiuni, în contradicţie cu fibrele de colagen care rezistă la tracţiuni. Prin acest mecanism,matricea cartilajului articular poate rezista la presiuni de sute de atmosfere.

În ţesutul conjunctiv, glicozaminoglicanii ocupă mai puţin de 10% din cantitatea de proteinefibroase. Dar, pentru că ei formează geluri hidratate "poroase" , glicozaminoglicanii ocupă mult din

spaţiul extracelular, oferind suport mecanic pentru ţesuturi şi permiţând o rapidă difuziune amoleculelor solubile în apă (nutrienţi, metaboliţi, hormoni) sau deplasarea celulelor. În fibrele de colagen şi elastice şi sunt reprezentati de: acidul hialuronic (singurul nesulfatat),

condroitin-sulfaţii, heparan-sulfaţii, keratan-sulfaţii şi heparina. Excepţie făcând acidul hialuronic, toţiceilalţi glicozaminoglicani se leagă covalent de o proteină formând molecule de proteoglicani (PG), încare glicozaminoglicanii ocupă 95%, iar proteinele 5%. În ţesutul conjunctiv, glicozaminoglicanii şi proteoglicanii formează un gel foarte hidratat, rezistent la compresiuni, în care sunt cuprinseproteinele fibroase. (Fig.8.9)

Acidul hialuronic ( sau hialuronanul sau hialuronatul ) este format dintr-o repetaresecvenţială a peste 25.000 de unităţi diglucidice nesulfatate. Se găseşte în cantităţi variabile în toateţesuturile, fiind mai abundent la embrionii timpurii. Este cea mai simplă formă de glicozaminoglicani.

Producerea acidului hialuronic se realizează direct pe suprafaţa celulei, cu ajutorul unuicomplex de enzime, cuprinse în membrana plasmatică, nefiind nevoie de exocitoză.

Faţă de ceilalţi glicozaminoglicani, acidul hialuronic nu conţine dizaharide sulfatate,secvenţele sunt mai simple,iar lanţurile mai scurte (mai puţin de 300 resturi glucidice).

141



Acidul hialuronic îndeplineşte multiple roluri : - asigură rezistenţa mecanică în ţesuturi şiarticulaţii; - ocupă spaţiile libere în timpul dezvoltării embrionare, permiţând modificarea formelor şistructurilor ;- fiind produs de zona bazală a epiteliilor, seveşte la crearea unui spaţiu liber, în care celulele vor migra , ca în cazul formării cordului, corneei etc. Când migrarea celulelor s-a încheiat, excesul dehialuronan este degradat de hialuronidază. Hialuronanul este produs în cantităţi mari în timpul

cicatrizării leziunilor şi constituie un “lubrefiant” al lichidului articular.Îndeplinirea acestor roluri estecondiţionată de legarea hialuronanului de proteinele sau proteoglicanii din matricea extracelulară saude pe suprafaţa celulelor. Unele din aceste molecule, denumite hialaderine prezintă domeniiomoloage pentru legare de acidul hialuronic, conţinând grupe de radicali aminoacizi, încărcatepozitiv.

Fig.8.9.Relaţiile proteoglicanilor cu acidul hialuronic.

8.3.2.Proteoglicanii

Proteoglicanii (PG) sunt compuşi din lanţuri de glicozaminoglicani legate covalent de un miezproteic. Ca şi în cazul altor glicoproteine, lanţul de polipeptide sau miezul proteic este sintetizat înreticulul endoplasmic rugos, iar lanţurile de polizaharide sunt asamblate pe acesta în complexul Golgi.

Proteoglicanii se deosebesc de celelalte glicoproteine prin felul, cantitatea şi aranjamentullanţurilor de glucide. Apar foarte heterogeni , în ceea ce priveşte conţinutul proteic, mărimeamoleculei şi număr, dar prezintă o repetare a diglucidelor similare.

Miezul proteic al unui proteoglican este de obicei o glicoproteină. În el, carbohidraţii pot ocupamai mult de 95% din greutatea sa, cel mai adesea având forma de lanţuri lungi neramificate, cu 80radicali de glucide.

De obicei, proteoglicanii sunt mult mai mari decât glicoproteinele. Astfel, agrecanul care esteo componentă majoră a cartilajului are o masă de 3 x 10 6 daltoni, peste 100 lanţuri de GAG, câte unul

142



la fiecare 20 resturi de aminoacizi. Există, însă şi proteoglicani mici, cu 1-10 lanţuri de GAG, ca deexemplu decorinul, care este secretat de fiboblaste şi are numai un lanţ de GAG .

În principiu, proteoglicanii au o heterogenitate fără limită. Greutatea moleculară a miezuluiproteic variază de la 10.000 la 600.000 daltoni, de el putându-se ataşa un mare număr şi tipuri diferitede GAG. În plus, modelul de repetare a diglucidelor în fiecare GAG poate varia în funcţie degrupările –SH, încât se obţine o heterogenitate enormă, ce face dificilă identificarea şi clasificarea

proteoglicanilor în funcţie de glucidele lor. Secvenţa proteinelor din miezul proteic, determinată printehnici de ADN recombinat apare, de asemenea extrem de diversă. Deşi au fost identificate câtevafamilii mici, nu există un aspect structural comun care să distingă clar proteinele din miezul proteic dealte proteine, iar mulţi PG au unul sau mai multe domenii care sunt omoloage cu domeniile existente în alte proteine din matricea extracelulară şi din membrană. Se consideră (Hardungham, Fosang –1992) că proteoglicanii sunt un grup aparte de glicoproteine glicosilate, a căror funcţii sunt mediateatât de miezul proteic, cât şi de lanţurile de GAG.

Funcţiile proteoglicanilor .Rolul PG nu poate fi limitat la menţinerea hidratării spaţiului intercelular.Lanţurile de GAG formează geluri cu pori de mărimi variate,încât servesc ca site selective ce

reglează traficul de molecule în funcţie de mărime şi încărcătura electrică. Astfel, perlecanul , un PGheparan sulfat, joacă acest rol în membrana bazală a glomerulului renal.

PG intervin în comunicarea chimică dintre celule. Ei leagă diferite molecule semnal produse

de celule, ca de exemplu unii factori de creştere, modificându-le activitatea. Astfel, factorul decreştere a fibroblastelor (FGF) se leagă de lanţurile de heparan sulfat ale PG, atât în ţesuturi, cât şi invitro. Pentru unele celule această legare reprezintă un pas necesar pentru activarea receptorilor desuprafaţă.

În majoritatea cazurilor, moleculele semnal se leagă de lanţurile de GAG ale PG, existânddiferenţe între molecule: - factorul β de transformare a creşterii ( transforming growth factor β =TGF-β ) se leagă de miezul proteic al mai multor PG din matrice ( de decorin) încetându-şi activitatea. PGse leagă şi reglează activitatea proteazelor şi a inhibitorilor de protease.

Legarea de un PG controleză activitatea unei proteine prin următoarele mecanisme:- îi limitează sfera de acţiune, imobilizând proteina la locul de producere; - îi blochează activitatea; -crează un rezervor de proteine, în vederea unei eliberări ulterioare; - protezează o proteină faţă de odegradare proteolitică;- modifică sau concentreză proteina pentru o mai eficientă prezentare lareceptorii de suprafaţă.

Glicozaminoglicanii şi proteoglicanii se asociază pentru a forma complexe polimerice imense în matricea extracelulară, Astfel, molecula de aggrecan ( un PG important din ţesutul cartilaginos)formează împreună cu acidul hialuronic un complex mai mare decât o bacterie.

Totodată GAG şi PG se asociază cu proteinele fibroase din matrice (cu colagenul),rezultândstructuri extrem de complexe. Dispunerea spaţială a moleculelor de PG este intens determinată înţesuturile vii.

Exită şi PG intracelulari . Astfel, serglycina este un constituient al veziculelor secretoriiintracelulare, unde ajută la împachetarea şi stocarea moleculelor secretate.

Alţi PG sunt componenete integrate în membranele plasmatice, având miezul proteic inserattransversal în bistratul lipidic sau ataşat la bistrat prin glicosil-fosfatidil-inozitol (GPI). Asfel, syndecanii au un miez proteic ce traversează membrana. De domeniul lor extracelular se leagă un număr variabilde lanţuri GAG (condroitin sulfat şi heparan sulfat), în timp ce domeniul lor intracelular interacţioneazăcu actina citoscheletului din cortexul celular.

Sindecanii se găsesc pe suprafaţa mai multor tipuri de celule (fibroblaste, celule epiteliale),unde îndeplinesc, alături de integrine, rolul de receptori pentru colagen, fibronectină şi alte proteine

matriceale , de care ei se leagă.Sindecanii se mai leagă factorul de creştere a fibroblastelor (FGF),fiind prezenţi în receptorii pentru FGF. Betaglicanul se leagă de TGF-β (factorul de transformare acreşterii), fiind prezent în receptorii pentru TGF-β. În acest mod, proteoglicanii din membraneleplasmatice acţionează ca şi coreceptori care colaborează cu receptorii convenţionali ai suprafeţeicelulare, atât în legarea celulelor de matricea extracelulară, cât şi în iniţierea răspunsului celular lafactorii de creştere.

Sindecanii sunt organizaţi în gel hidratat , încât lanţul de GAG difuzează repede între celule,facilitând migrarea celulelor şi formarea prelungirilor celulare.

Proteoglicanii se leagă covalent de o parte şi de alta a unui ax polipeptidic, denumit “miez proteic” , încât formează subunităţi şi complexe moleculare mari.

Mai multe subunităţi se leagă necovalent pe un lung filament de acid hialuronic (AH) prinintermediul unor mici “linkeri proteici” , ajungând la o masă de 105 Kdal şi o lungime de ordinulmicrometrilor. În majoritatea proteoglicanilor, miezul proteic este asociat cu dermatan-sulfatul,

143



condritin-sulfatul sau heparan-sulfatul . În unele cazuri proteoglicanii se pot lega unii de alţii sau dealte macromolecule locale cum ar fi colagenul, elastina şi fibronectina.

La microscopul electronic , proteoglicanii pot fi evidenţiaţi cu ajutorul roşului de ruteniu , carese leagă selectiv la polimerii acizi şi devin electronodenşi după combinarea lor cu oxidul de osmiu(OsO4). Astfel proteoglicanii au fost identificaţi în glicocalix (sub formă de filamente subţiri de 3-5 nm), în matricea extracelulară (sub formă de granule mari de 20-50 nm) şi în membranele bazale (sub

formă de granule mici de 10-20 nm). În concluzie, proteoglicanii îndeplinesc multiple roluri , dintre care subliniem : 1) participă larealizarea adezivităţii celulare faţă de matrice; 2) conferă vâsco-elasticitate şi rezistenţă la presiunepopulaţiilor celulare; 3) reglează deplasarea moleculelor (mari şi mici) prin spaţiul interstiţial; 4)modelează homeostazia tisulară; 5) interacţionează cu lipoproteinele sanguine.

Sinteza glicozaminoglicanilor şi proteoglicanilor se realizează în fibroblaste printr-unmecanism de sinteză comun glicoproteinelor. Astfel componenta proteică se sintetizează la nivelulribozomilor reticulului endoplasmic rugos (RER), unde începe şi glicolizarea, care va fi completată înstructurile golgiene, unde se desfăşoară şi sulfatarea, după care sunt eliminaţi în matriceaextracelulară. După o funcţionare de 2-4 zile (pentru proteoglicani) ei sunt degradaţi de macrofageprin sistemul lor de hidrolaze acide lizozomale.

8.3.3.Glicoproteinele structurale

Sunt formate dintr-un miez proteic la care se ataşează glucide cu structură ramificată. Încontrast cu PG, în glicoproteinele structurale (GS) predomină miezul proteic, iar glicoproteinelestructurale nu conţin poliglucide lineare formate din diglucide repetitive ce au glucozamine. Ele joacăun rol important în funcţionalitatea matricei extracelulare, cum ar fi relaţiile intercelulare, adezivitateacelulelor .

Sunt reprezentate de fibronectine (prezente în matricea tuturor tipurilor de ţesuturiconjunctive) şi în cele mai multe membrane bazale, condronectine (prezente în matriceacartilaginoasă) şi laminine (prezente în membranele bazale).

Fibronectina este o glicoproteină, cu o greutate medie de 222-240 kDa, compusă din douăsubunităţ i legate prin punţi bisulfidice, în apropierea terminaţiei carboxil. Fiecare subunitate prezintă oserie de domenii funcţionale distincte, despărţite prin domenii polipetidice flexibile. (Fig.8.10)

Fig.8.10. Adezivitatea celulelor la colagenul intercelular cu ajutorul fibronectineişi proteoglicanilor

144



Domeniile sunt constituite din mici module repetabile, codificate de codoni separaţi deoarecegena fibronectinei prezintă multiple duplicaţii ale exonilor, asemănându-se cu genele colagenului. Undomeniu leagă colagenul, altul heparina, iar altul se leagă de diverşi receptori specifici de pesuprafaţa unor variate tipuri de celule.Îndată ce un domeniu cu activitate de legare a fost identificat dereceptori, secvenţa sa de aminoacizi determină sinteza unor peptide care îi corespund. Acestepeptide sunt folosite pentru găsirea regiunii principale pentru legarea celulei, fiind identificată o

secveţă specifică de tripeptide (Arg-Gly-Asp sau RDG). Fiecare peptidă foarte scurtă conţinesecvenţa RDG şi concură cu fibronectina pe situsul de legare al celulei, putând să inhibe ataşareacelulelor la fibronectină. Dacă aceste peptide sunt prezente pe o suprafaţă solidă, ele determinăaderenţa celulelor la aceasta.

Tipul principal de modul, numit repetiţia fibronectinei de tip III (type III fibronectin repeat) areo lungime de circa 90 radicali de aminoacizi şi se găseşte de cel puţin 15 ori în fiecare subunitate. Acest modul mai este întâlnit şi în alte proteine matriceale, în unele proteine ale membranei plasmatice şi citoplasmei .

Există mai multe forme ( izoforme ) de fibronectină:- fibronectina plasmatică,solubilă,prezentă în sânge şi alte lichide din corp, intervine în coagularea sângelui , în vindecarearănilor şi în fagocitoză; - fibronectina filamentoasă, asamblată pe suprafaţa celulelor şi depozitată înmatrice. Toate formele de fibronectină sunt codificate de o singură genă mare, lungă de 50 kilobase şi

formată din circa 50 exoni cu mărimi similare. Transcrierea AND-ului produce o singură moleculămare deARN, care pote fi sudată alternativ în trei regiuni în funcţie de tipul de celulă şi de stadiu dedezvoltare. La om se produc 20 tipuri de ARN mesageri, fiecare fiind capabil să codifice cel puţin osubunitate diferită de fibronectină. Sudarea alternativă permite celulei să producă tipul de fibronectinăcel mai potrivit cu necesităţile ţesutului.

Astfel, formele de fibronectină produse în timpul dezvoltării embrionare diferă de celeîntâlnite în fazele târzii. Dar dacă cutisul adult este lezat se revine la fibrovectina embrionară. Învindecarea rănilor, fibronectina permite migrarea celulelor şi proliferările cerute de dezvoltare sau repararea ţesuturilor. Prin experienţe de inginerie genetică,efectuate pe şoareci, s-au inactivat genelefibronectinei, fapt ce a generat o serie de defecte morfologice ce au produs anomalii în dezvoltareanotocordului, somitelor, cordului, vaselor sanguine, tubului neural şi anexelor extraembrionare.

Fibronectina este produsă de fibroblaste, de celulele endoteliale şi în cantitate mai mică şi deunele celule epiteliale şi mediază aderarea celulelor la colagen sau la alte componente ale matricei

extracelulare, acţiune la care pot contribui şi alte molecule locale ca laminina, condronectina etc.Alte roluri ale fibronectinelor constau în: a) organizarea spaţială a citoscheletului ; b) intervenţialor în migrarea celulelor în cursul diferenţierii embrionare, în fagocitoză, în hemostază şi înmalignizarea celulelor (când lipsa lor favorizează malignizarea); c) pot înlocui unii factori decompetenţă (ca de exemplu: factorul de creştere al fibroblastelor şi al plachetelor sanguine, factorulde creştere epidermic).

În timpul dezvoltării embrionare, fibronectina ghidează deplasarea celulelor, ajutând celulelesă se ataşeze de matrice, fără să fie imobilizate în ea.

Mai există şi alte tipuri de molecule adezive din matrice, care joacă un rol în ghidareacelulelor în cursul deplasărilor morfogenetice. Astfel,este tenascina – un complex glicoproteic cuşase lanţuri polipeptidice, care se desprind dintr-un centru.

Fiecare din lanţuri este pliat şi compus din diferite secvenţe scurte de aminoacizi, care serepetă de mai multe ori. Pe fiecare lanţ se găsesc un număr de domenii funcţionale distincte, din careunul se leagă de suprafaţa celulei prin syndecan ( un proteoglican transmemebranar), iar altul defibronectină. Tenascina este mai abundentă în matricea a ţesuturilor embrionare. Ea poate săfavorizeze, sau să inhibe adeziunea celulară, în funcţie de tipul de celulă şi de medierea unor domenii proteice, jucând un rol în ghidarea deplasărilor celulare.

Laminina este o glicoproteină a membranelor bazale, fiind localizată în lamina rara, înimediata apropiere a celulelor epiteliale cu membrana bazală, mediind ataşarea acestora decolagenul de tip IV al membranelor bazale. Nu prezintă o specificitate absolută încât poate facilita şiataşarea fibroblastelor la un substrat de sticlă. Este compusă din trei lanţuri alfa (sau A) şi un lanţbeta (sau B) ce formează o moleculă foarte mare cu o greutate de 1 milion daltoni, ce posedă locurispecifice de legare. (Fig.8.11)

145



Fig. 8.11. Laminina –domenii structurale şi funcţionaleA şi B –lanţuri alfa şi beta; Regiunile haşurate sunt rezistente la proteaze.

Condronectina este o glicoproteină serică ce mediază specific ataşarea condrocitelor decolagenul de tip II din cartilaj. Este sintetizată de condrocite.

În matricea extracelulară din aproape toate ţesuturile conjunctive s-a identificatglicoproteina 115 (necolagenă), cu o greutate moleculară de aproape 115.000, care este prezentă în cantitate mai mare în vasele sanguine, în fibrele musculare netede, şi în unele membrane bazale,având o funcţie asemănătoare fibronectinei şi lamininei.

La embrion, în faza de morulă, se întâlneşte o glicoproteină denumită uvomorulina implicată în adezivitatea celulelor embrionare. Ea a putut fi identificată şi la adult în spaţiul intercelular al

epiteliului intestinal, în jurul domeniului laterobazal al celulelor. Uvomorulina este distribuită uniform lasuprafaţa celulelor maligne în carcinomul nediferenţiat. Tot în matricea extracelulară a unui tip decarcinom a fost izolat epinectina, o proteină cu greutatea moleculară de 70.000 daltoni.

În serul sanguin, în afară de condronectină şi fibronectină se mai întâlnesc şi alteglicoproteine cu importanţă majoră în adezivitatea celulelor de colagen şi în etalarea celulelor în vitro,ca de exemplu: factorul de etalare a fibroblaştilor şi a celulelor epiteliale, epibolina (ce favorizeazăetalarea celulelor epiteliale).

Tot în matricea extracelulară a ţesuturilor conjunctive este prezent şi lichidul tisular care are ocompoziţie asemănătoare plasmei sanguine, conţinând apă, molecule mici (inclusiv proteine) şi diferiţiioni (în special de sodiu şi clor şi mai puţin magneziu, calciu şi potasiu).

Unele moleculele din matricea extracelulară pot să regleze cantitatea altor moleculeextracelulare. Astfel, fibronectina stimulează sinteza colagenului de către hepatocite în urma efectelor pe care fibronectina le are asupra fosforilării proteinelor. La fel factorul de creştere epidermică, AMP-

ul ciclic, vitamina A stimulează acumularea fibronectinei în diferite linii celulare. Refacerea (turnoverul) moleculelor matricei extracelulare este continuă şi prezintă o mareimportaţă pentru multe procese biologice. Se realizează un echilibru între degradare şi resinteză.

Astfel, o degradare rapidă se produce în timpul involuţiei uterine post partum. Degradări localizate sunt necesare atunci când unele celule ( leucocitele) trec prin memebrana bazală înţesuturi, iar celulele canceroase migrează la distanţă, dând metastaze. Componentele matricei sunt degradate prin enzime proteolitice care sunt produse şi eliberate local de celule, precum:- unelemetaloproteaze, ce depind de ionii de Ca2+ şi de Zn2+, iar altele sunt proteaze serice. Ele cooperează pentru a degrada proteinele matriceale (colagenul, laminina, fibronectina). Colagenaza (o proteazăserică) ore o specificitate restrânsă, modificând integritatea matricei pe zone limitate şi facilitând migrarea celulelor. O importantă protează serică este un activator de tip plasminogen al urokinazei (urokinase-type plasminogen activator) (U-PA). Ea transformă plasminogenul într-o protează activă plasmina, care degradează fibrina, fibronjectina şi laminina.

Degradarea componentelor matricealeeste controlată strâns prin mai multe mecanisme ca: -secreţia unor proteaze ca precursori inactivi;- activitatea proteazelor este limitată la anumite arii de

inhibitori specifici ; -inhibitorii sunt produşi de celulele de la marginea ariilor cu degradări active, având

146



scopul de a conserva matricea neimplicată. Ei protejează de asemenea şi proteinele de pe suprafaţacelulelor, care sunt necesare pentru adeziune şi migrare. Multe celulele au receptori de memebranăcare leagă U-PA, limitând acţiunea acesteia la zonele unde este necesară. Astfel, un receptor pentruU-PA a fost detectat pe conul de creştere al neuronului, la marginea de înaintare a leucocitelor şi launele tipuri de celule canceroase, care metastazează.

8.4. Integrinele sau receptorii celulari pentrumatricea extracelulară

Integrinele sunt o familie de proteine transmembranare care leagă colagenul, fibronectina şilaminina.

Spre deosebire de alţi receptori de membrană, integrinele prezintă o constantă de afinitaterelativ joasă (K a =10 6 – 10 9 litri/ mol), permiţând celulelor să exploreze ambianţa fără să se ataşezede matrice. Interginele sunt heterodimeri, compusi din două subunităţi (α şi β) necovalente asociatecu glicoproteine transmembranare.

Integrinele îndeplinesc un rol crucial pentru adeziunea şi cooperarea celulelor cu matriceaextracelulară. În timp ce unele integrine leagă numai o macromoleculă din matrice (fibronectina saulaminina), altele pot lega mai multe. Astfel, o integrină prezentă pe suprafaţa fibroblastelor leagăcolagenul, fibronectina şi laminina. Mai mult aceiaşi moleculă de integrină, în diferite tipuri de celule,

poate lega diferite molecule. O subfamilie de integrine recunoaşte şi leagă secvenţa de aminoaciziarginină-glicină-aspartat, care este prezentă în fibronectină şi în alte proteine matriceale.Se pare căunii factori celulari specifici interacţionează cu integrinele şi le modulează activitatea.

Datorită prezenţei a 3 sau 4 domenii de legare existente pe partea extracelulară a catenei α,legarea integrinelor depinde de unii cationi extracelulari bivalenţi(Ca2+, Mg2+).

La vertebrate, unele proteine matriceale pot fi recunoscute şi ataşate de mai multe integrine. Astfel, fibronectina este legată de 8 integrine, iar laminina de 5 fibronectine.Integrinele sunt foartediverse, deoarece cei 20 heterodimeri pot forma 9 tipuri de subunităţi β şi 14 tipuri de subunităţi α.Catenele β 1 care formează dimeri cu cel puţin 9 catene α există la aproape toate celuele de lavertebrate. Astfel, α5 β 1 este receptor pentru fibronectină, iar α6 β 1 leagă laminina. Lanţurile β 2 careformează dimeri cu 3 tipuri de lanţuri α se găsesec pe suprafaţa leucocitelor şi joacă un rol esenţial înactivarea lor. Astfel, integrina α1β 2 este un factor asociat limfocitelor (LAF-1), iar integrina αM β 2 esteasociată macrofagelor (Mac-1). Integrinele β 2 mediază în principal interacţiunile dintre celule şi mai

puţin pe cele dintre celulă şi matrice. Ele premit leucocitelor să se ataşeze de endoteliul vascular şi să-l traverseze.Integrinele funcţionează ca linkeri transmembranari (sau integratori) care mediază

interacţiunea dintre citoschelet şi matricea extracelulară. Cele mai multe intergine se leagă defilamentele de actină, excepţie făcând integrina α

6 β 4, existentă în hemidesmozomi, care se leagă defilamentele intermediare. În timpul ataşării integrinei de un ligand extracelular, capătul intracelular alcatenei β se leagă la filamentele de actină din citoschelet. Ataşarea transmembranară la citoscheleteste o cerinţă importantă atât pentru adeziunea celelelor la matrice, cât şi pentru adeziunileintercelulare, deoarece în lipsa unei ancorări interne adeziunile sunt slabe, nerezistente, aşa cum s-aobservat în cazul unei integrine mutante fară domeniu intracelular, obţinută prin tehnici de ANDrecombinat.

Integrinele mediază, interacţiuni transmembranare, între citoschelet şi matricea extracelulară jucând un rol important în orientarea celulelor şi matricei în ţesuturi .

La rândul său,matricea extracelulară poate influenţa organizarea citoscheletului

, determinând în fibroblastele transformate (cancer like) din culturi apariţia intracelulară a fibrelor de stres, prinorganizarea filamentelor de actină şi producerea unei cantităţi mai reduse de fibronectină.Citoscheletul exercită forţe care orientează moleculele matricei pe care celulele o produc, iar acesteainfluenţează organizarea citoscheletului.

Celulele regleză activitatea integrinelor pe care le produc . Astfel, integrinele celulelor sanguine trebuie să fie activate pentru a media adeziunea celulară. Acest fapt permite celulelor sanguine să circule nestânjenite până când sunt activate rapid de un stimul specific, deoareceintegrinele lor nu trebuie sintetizate, ele existând deja sub formă inactivă.

Trombocitele sunt activate de contactul cu peretele lezat al vasului sanguin sau de unelemolecule semnal solubile. Acestea determină activarea integrinei β 3 din membrana trombocitelor, încât aceasta recepţionează şi leagă proteinele coagulării, determinând agregarea trombocitelor şiformarea coagulilor.

În mod asemănător, legarea de limfocitul T a unui antigen de suprafaţă specific blochezăcalea de semnalizare intracelulară, ceea ce duce la o activare rapidă, dar trecătoare a integrinei(LFA -1). Integrina activată permite limfocitului T să adere puternic şi pentru un timp suficient de lung

147



la celula ţintă, până de vine stimulat. După aceia integrina revine la starea sa inactivă, permiţândlimfocitului T să se desprindă.

Şi alte evenimente intracelulare pot determina activarea integrinelor. Astfel, fosforilareaserinei de pe capătul citoplasmatic a integrinei β 1 , în timpul mitozei celulelor din culturi diminueazăcapacitatea integrinei de a lega fibronectina, încât celulele îşi modifică forma şi se detaşează desubstrat.

Moleculele matricei extracelulare influenţează puternic comportaea celulelor în culturi,modificându-le forma, mişcarea, metabolisnmul, dezvoltarea şi diferite funcţii. Integrinele mediazămulte din aceste evenimente. Asfel , integrinele de locul de contact cu matricea sau cu altă celulă potactiva mai multe căi de semnalizare intracelulară. ( pe cea a fosfolipid inozitolului, a tirozinkinazei,etc). Se produce,astfel un semnal complex pe faţa internă a membranei , care determinăintrarea in activitate a unor receptori intracelulari . În urma acestor evenimente, numai celuleleataşate prin integrine la moleculele matricei extracelulare reacţionează, declaşând o cascadă desemnale care se traduc prin mnodificări în comportamentul celulelor şi prin proliferări celulare.9.Embriologia GENERALĂ

Embriologia este disciplina biologică care se ocupă cu studiul dezvoltării ontogenetice aorganismelor, din momentul producerii gameţilori si până în momentul parturitiei sau ecloziunii.

Ontogeneza (ontogenesis) parcurge mai multe etape sau faze: 1) gametogeneza; 2)

fecundaţia; 3) segmentarea; 4) gastrularea; 5) histogeneza; 6) organogeneza si 7) creşterea şidezvoltarea postnatală sau post eclozională.

Etapele ontogenezei

Perioade ETAPE FAZEGametogeneza multiplicare

creşterematurare

Fecundaţia apropierepenetrareamfimixie

Dezvoltarea

intramaternală(preeclozionala) Embriogeneza(segmentaţia)

morulă

blastulăgastrulă

Histogeneza(formarea ţesuturilor)

Neurulă

Organogeneza

Dezvoltarea fetală (preeclozională)Dezvoltareapostpartum(posteclozională)

Perinatală (perieclozională)TinereţeMaturitateImbătrânire

În cazul mamiferelor, unele din aceste faze sunt parcurse în organismul matern, alcătuinddezvoltarea intrauterină, ce cuprinde: fecundaţia, segmentarea, gastrularea, histogeneza şiorganogeneza.

Dezvoltarea intrauterină (genesis praenatalis) se continuă dupa actul parturiţiei (parturitio), înafara organismului matern cu o perioada denumita extrauterină sau postnatală.

În cazul păsărilor , perioada dezvoltării în organismul matern este înlocuită, aproape întotalitatea sa (exceptând fecundatia) de perioada dezvoltării în ou, iar după ecloziune se continua cuo perioada posteclozionala.

148



Fig.9.1. Formarea şi evoluţia gameţilor în cursul unei generaţii1- Ovul; 2-Spermatozoid; 3-Zigot; 4 – Celule somatice; 5- Celulă sexuală primordială; 6- Gonocite; 7-Ovogonii; 8- Ovocit I, 9- Ovocit II; 10- Globuli polari; 11- Ovocit matur; 12- Spermatogonii; 13-Spermatocit I, 14- Spermatocit II; 15- Spermatidă.

Dezvoltarea intrauterină sau

preeclozională se desfasoară în trei etape:1) o perioada embrionară sauembriogeneza (embryogenesis), care ţinepână la apariţia celor trei foiţe embrionare şi aanexelor embrionare;

2) o perioada de histogeneză(histogenesis) şi organogeneză(organogenesis);

3) o perioada fetală (fetogenesis) - încare se continuă dezvoltarea organelor pâna lafatare (parturiţio) sau ecloziune.

Embriogeneza constituie obiectul destudiu al embriologiei generale, iar

histogeneza, organogeneza şi perioada fetalăsunt studiate de embriologia specială (ce va fiprezentată odată cu histologia ţesuturilor şiorganelor).

9.1. Gametogeneza

Gametogeneza (gametogenesis)cuprinde ansamblul de transformari prin caretrec celulele germinale primordiale (cellulaegerminales promordial)sau gonociteleprimordiale pâna la stadiul de celula sexualamatura. (Fig.9.1)

Procesul de gametogeneza parcurge treiperioade, asemanatoare la ambele sexe: 1)perioada germinativa (de multiplicare sau de înmultire); 2) perioada de crestere; si 3) perioada dematurare.

Gametogeneza

Perioade Spermatogeneza OvogenezaPerioada germinativă Spermatogonii (prăfoase-A

↓intermediare-I

↓crustoase-B)

Ovogonii

Perioada de creştere Spermatocit primar I Ovocit primar I

Perioada de maturare

Speramatocit secundar II↓Spermatidie(faza Golgi → faza cap →faza acrozomică → faza dematurare)↓Spermatozoid

Ovocit secundar II( + polocit primar)

↓

Ovul(+polocit secundar)

149



9.1.1. Spermatogeneza

Spermatogeneza (spermatogenesis) cuprinde totalitatea proceselor pe care le parcurgspermatogoniile (gonocite primordiale mascule) până devin celule sexuale mature (spermatozoizi),apte pentru fecundaţie. Se desfasoară la nivelul epiteliului seminal din tubii seminiferi ai testiculului.(Fig.9.2)

1) Perioada germinativă (de multiplicare sau de înmultire) este parcursa în timpulprepubertatii, când gonocitele primordiale se divid mitotic, generând doua categorii de spermatogonii:a) unele mici, identice cu gonocitele primordiale; b) altele mai mari, spermatogoniile prafoase (de tipA) (spermatogonium A), care se vor divide mitotic, în mod repetat, trecând spritr-un stadiuintermediar (spermatogonium intermedium) şi generând spermatogoniile crustoase (de tip B)(spermatogonium B), care vor continua linia seminala.

Fig. 9.2. Epiteliul tubului seminal

1-Spermatogonie; 2- Spermatocit I; 3- Spermatocit II, 4, 5, 6 – Spermatide în evoluţie; 7-Spermatozoizi; 8- Celulă Sertoli; 9 – Membrană bazală.

2) Perioada de creştere se declansează odată cu pubertatea şi constă în creşterea(dublarea în volum) a spermatogoniilor, transformându-se în spermatocite de ordinul I(spermatocytus primarius).

Fig.9.3. SpermatogenezaI-Perioada germinativă; II-Perioada de creştere;III-Perioda de maturare.1-Gonocit; 2- Spermatogonii;3-Spermatocit I;4-Spermatocit II; 5-Spermatide; 6-Spermatozoizi

3) Perioada de maturare se remarcă prin faptul caspermatocitul de ordinul I se divide reducţional (meiotic)generând doua spermatide de ordinul II (spermatocytussecundarius) (cu set haploid de cromozomi), care se dividimediat (în mod mitotic), rezultând în final 4 spermatidedintr-un spermatocit de ordinul I sau două spermatidedintr-un spermatocit de ordinul II. (Fig.9. 3)

150



Spermatidele (spermatidium,a) parcurg o metamorfoză celulară, denumită spermiogeneza(spermiogenesis) , fiecare spermatidă devenind un spermatozoid (spermatozoon s. spermium).

Spermiogeneza are loc în căile genitale intratesticulare.Spermatida apare ca o celula poliedrică, în citoplasma careia se găseşte un nucleol situat

central. Complexul Golgi şi mitocondriile sunt dezvoltate, iar centrul celular este reprezentat de doicentrioli. Elementele reticulului endoplasmic neted sunt numeroase şi asociate cu lipide. Enzimele

hidrolitice sunt active.Transformarea spermatidei în spermatozoid, spermiogeneza, se realizează în patru perioadesuccesive: a) perioada Golgi; b) perioada cap; c) perioada acrozom; d) perioada de maturare.(Fig.9.4)

Fig. 9.4. Spermiogeneza1-Nucleu; 2- Complex Golgi; 3- Mitocondrii; 4- Centrioli; 5- Vacuolă acrozomală;6- Gâtul spermatozoidului; 7- Centriol proximal; 8- Porţiunea proximală a centriolului distal; 9-Piesa intermediară; 10- Porţiunea distală a centriolului distal; 11 –Piesa principală a cozii.

a) În perioada Golgi : 1. - nucleul spermatidei se deplasează în sens axial, către un pol alcelulei, se alungeşte şi se aplatizează uşor; 2. - complexul Golgi , cuprinzând în interiorul sau granuleproacrozomice (granulum proacrosomaticum) şi vezicule proacrozomiale (vezicula proacrosomatica),se deplaseaza, în cadrul citoplasmei, către polul anterior al nucleului; 3. - centriolii se despart,dispunându-se unul lângă polul caudal al nucleului (centriolul proximal ), iar celălalt la o distanţă de 1-2µm (centriolul distal), de nucleu - de la el desprinzându-se filamentul axial al viitoarei cozi.

b) În perioada cap: 1. – proacrozomul (proacrosoma) sau vezicula crozomală se detaşeazăde complexul Golgi, se aplatizează şi ia forma unui capişon ce îmbracă jumatatea anterioară anucleului; 2. - complexul Golgi migrează spre periferia citoplasmei; 3. - microtubulii din citoplasmă segrupează între cei doi centrioli şi structurează filamentul axial, din care se va constitui viitoareaaxonemă a spermatozoidului.

c) În perioada acrozomică: 1. - nucleul spermatidei se alungeşte, devenind ovoidal; 2. –vezicula acrozomală se transformă în acrozom şi acoperă jumătatea anterioară a nucleului; 3. nucleul devine compact, pierde o parte din apă, iar cromatina se condensează; 4. - citoplasma se deplaseazăspre polul posterior al nucleului; 5.-axonema creşte în lungime, structurând piesa de conjugare şi piesa intermediară; 6.- centriolul distal se desparte într-o jumătate proximală, cu aspect discoidal,situată între piesa de conjugare şi piesa intermediară, si o jumătate distală, cu aspect inelar , ce înconjoară axonema cozii, fiind situată între piesa intermediară şi piesa principală.

d) În perioada de maturare a spermiogenezei : 1. - jumătatea inelară a centriolului distal(denumită si “inelul Jensen”) se îndepărtează, delimitând lungimea piesei intermediare; 2. -citoplasma spermatidei se reduce; 3. – mitocondriile, în număr de 15-25, se dispun în helix (cu 14ture), în jurul filamentului axial al cozii; 4. - se conturează aspectul morfologic al spermatozoizilor maturi, care au capul înfundat în faldurile membranei apicale a celulelor de susţinere (Sertoli); 5. - pemăsură ce se realizează maturarea, spermatozoizii încep să secrete hialuronidaza şi se desprind de

celulele de sustinere, devenind liberi.Nucleul spermatidei suferă o serie de modificări, precum:

151



– condensarea cromatinei , formând în stadiile iniţiale fibre paralele cu axul lung al nucleului, fibre caremai târziu se grupează în lamele; – membrana nucleară îsi măreşte suprafaţa, formând faldur i care sunt mai numeroase spre polulposterior (caudal) al nucleului, unde şi porii membranei sunt mai numeroşi; – la polul anterior, cromatina nucleară aderă la membrana nucleului, iar la polul posterior se dispunesub aspectul unui material filamentos între cutele membranei.

Citoplasma spermatidei este mai hialină şi conţine ribozomi, lipide, glicogen şi puţinemitocondrii. Se realizează un trazit intens între nucleu şi citoplasmă.Odată cu maturarea completă seacumulează spre polul posterior al nucleului, sub forma unei picături, denumită relicvat citoplasmatic ( sau corp rezidual), ce va fi fagocitat de celule Sertoli. În viitorul spermatozoid, rămâne numai o finăpeliculă citoplasmatică acoperită de plasmalemă.

9.1.1.1.Morfologia spermatozoidului

Evidenţiat în 1667 la om, de Ham din Leyda şi în 1679, la animale, de van Leeuwenhoek,spermatozoidul (spermatozoon s. spermium) este format din: cap şi flagel (coadă).

Fig. 9. 5. Structura şi ultrastructuraspermatozoidului la taurineA- Aspect la microscopul optic; B – Aspecte

electronomicroscopice.I – Capul spermatozoidului; II – Gâtul; III – Piesaintermediară; IV – Piesa principală;V – Peisa terminală.1- Plasmalema; 2- Acrozom; 3-Membrana nucleară; 4 – Nucleu; 5-Protuberanţe bazale; 6- Placa bazală; 7-Capitelul; 8- Coloanele segmentate; 9- Centriolul proximal; 10-Mitocondrii; 11- Perecheacentrală de microtubuli; 11- Perechile periferice de microtubuli; 13- Fibre dense.

Capul spermatozoidului

152



Capul (caput) prezintă forme şi dimensiuni diferite, în funcţie de specie, apărând ovalar (lahominide, armăsar, taur, berbec, ţap, vier) sau cu formă de: pară (la iepure şi câine), seceră (lacocoş şi şobolan), cu lungimi medii între 5 µm (la băbat) şi 9 µm (la berbec), grosimile mediiatingând între 2-5 µm.

Nucleul spermatozoidului este înconjurat de un strat subţire de citoplasmă şi de o plasmalemă periferică foarte delicată.

În componenţa capului intră: nucleul, acrozomul, capişonul cefalic, perforatorul,protuberanţele bazale şi membrana periferică.Nucleul (nucleus) conţine cromatina deshidratată şi condensată, în care ADN-ul (43%) este

strâns combinat cu protamine bazice (57%). Ocupă cea mai mare parte din capul spermatozoidului.Cromatina apare mai condensată la baza nucleului, granulară în partea apexială şi cu aspect clar, înregiunea ecuatorială. Cantitatea de cromatină reprezintă o caracteristică de specie. Din cromatină seformează cromozomii autosomi şi un heterozom. Deoarece spermatozoizii sunt celule haploide conţinnumai jumătate din numărul de cromozomi al unei specii ( n cromozomi ). Se acceptă că,aproximativ, jumătate din numărul total de spermatozoizi dintr-un testicul conţin cromozomul sexualX, iar cealaltă jumătate cromozomul Y.(Fig.9.5)

Acrozomul este situat supranuclear, interpus între membrană şi nucleu, pe care îl acoperăpână în zona inelului ecuatorial. Se formeză din complexul Golgi în timpul spermiogenezei. Cuprinde în structura sa: o membrana acrozomică internă (membrana acrosomatica interna),o membrană

acrozomică externă ( membrana acrosomatica externa) şi o substanţa acrozomică (substantiacrosomatica), în care se disting granulele acrozomice (granulum acrosomale). Este considerat unlizozom specializat ce conţine multe enzime hidrolitice (ex: fosfataza acidă, hialuronidaza) si oproteină înrudită cu tripsina. Aceste enzime depolimerizează acidul hialuronic ce cimentează celulelefoliculare din coroana radiată a ovocitului, dispersându-le . Joacă un rol hotărâtor în fecundaţie şifiind prezent la toate speciile de animale.

Capişonul cefalic reprezintă o peliculă foarte fină de citoplasmă condensată, ce seinterpune între membrana periferică şi acrozomul pe care îl acoperă. Conţine glicoproteine.

Perforatorul este situat între acrozom şi membrana nuclerară, având rolul să perforezeplamalema ovocitului. Formeză un canal în citoplasmă, prin care se transferă conţinutul nucleuluispermatozoidului.

153



Structura şi ultrastructura spermatozoidului

Protuberanţele bazale apar ca două formaţiuni osmiofile semicirculare, formate dincitoplasmă condensată, dispuse la polul caudal (bazal) al capului. Delimitează între ele fosa deimplantare. Fosa de implantare (fosulla articularis) apare ca o escavaţie redusă ce serveşte pentruinserţia extremităţii proximale a filamentului axial al cozii spermatozoidului.

Membrana periferică, trilaminată, foarte delicată şi transparentă, acoperă capişonul cefalicşi acrozomul, delimitând capul spermatozoidului. Prezintă receptori specifici.

Coada spermatozoidului sau flagelul Flagelul (flagellum) cuprinde (dupa “Nomina Histologica” – 1994) următoarele parti: gâtul,

piesa intermediară, piesa principală şi piesa terminală.a) Gâtul spermatozoidului (pars conjungens) apare foarte scurt, circa 0,4 µm, fiind delimitat

între nucleu şi jumătatea proximală a centriolului distal.Conţine placa bazală, capitelul, coloanele segmentate, centriolul proximal, mitocondriile şi

dispozitivul fibrilar, fiind delimitat la periferie de o membrană fină de natura lipoproteică. Este foarte

fragil, rupându-se deseori.

Parţicomponente

Structuri Ultrastructuri Observaţii

Nucleul

vezicule nucleare

saci nucleari

CAP

Acrosomul Membrană acrosomicăinternăMembrană acrosomicăexternăSubstanţă acrosomicăGranule acrosomice

Capişonul cefalic citoplasma dintre plasmalemă şiacrozom

PerforatorulWaldeyer

ctoplasma dintre acrozom şimembrana nucleară

Protuberanţelebazale

delimitează foseta de implantaţie

Plasmalema membrana periferică

Piesa de conjugare(gâtul)

placa bazalăcapitelulcoloanele segmentarecentriolul proximaldispozitivul fibrilar plasmalema

FLAGEL

Piesa intermediară

jumătate proximală acentriolului distalaxonema (filamentul axial)

dispozitivul fibrilar teaca mitocondrilă jumătatea distală acentriolului distal -inelul

9 fibrile proteice dense

Piesa principală

axonema (filamentul axial)dispozitivul fibrilar teaca fibroasă

plasmalemafibre circumferenţiale + 2 coloanelongitudinale

Piesa terminalăFilamentul axialplasmalema

154



Placa bazală (patella basalis) este o lamă fixă de citoplasmă osmiofilă, dispusă în fosa deimplantare. Delimitează capul spermatozoidului de gât, interpunându-se între membrana nucleară şicapitel.

Capitelul (capitulum) este segmentul proximal al complexului centriolar şi reprezintă zona deunire a bazelor coloanelor segmentate (basis columnaris), care vine în contact cu faţa distală a plăciibazale.

Coloanele segmentate sau striate (columna striata), sunt considerate ca fiind rădăcinileaxonemei flagelului. Apar formate din elemente proteice fibroase, cu o structură periodică (perioadaeste de 650 Å). Sunt sintetizate în ribozomii spermatidei şi polimerizate radial în jurul centrioluluiproximal.

Dupa constituirea coloanelor segmentate, centriolul proximal devine centriol cinetic al coziispermatozoidului.

Centriolul proximal (centriolum proximale), situat sub capitel, prezintă o forma de cilindru (cuo lungime de 500nm şi un diametru de 250nm) şi o înclinaţie de 70°, în raport cu axa lungă a cozii.Are peretele format din 9 triplete (A,B,C) de microtubuli.

Mitocondriile sunt alungite şi dispuse în partea distală a gâtului, înconjurând dispozitivulfibrilar.

Dispozitivul fibrilar este compus din 9 fibrile dense (aflate în continuarea coloanelor segmentare), care înconjoară un complex filamentos axial (axonema), alcătuit din 10 perechi de

microtubuli, din care o pereche este centrală, iar celelalte 9 perechi sunt dispuse periferic. (Fig. 9.6)

Fig.9.6. Secţiuni transversale prin coada spermatozoiduluiA – Piesa intermediară; B- piesa principală; C Piesa terminală.a- Filament axial; b –Fibre externe; c – Fibre satelit; d- Teaca mitocondrială;e-Teaca fibroasă; f- coloane longitudinale; g – Plasmalema.

Spermatozoizii imaturi prezintă la limita dintre piesa de comjugare şi piesa inmtermediară o picătură citoplasmatică, care va fi fagocitată de celulele Sertoli până la maturarea completă.

b) Piesa intermediara ( pars intermedia), cu lungimi variabile (5-10 µm), este delimitată între cele

două jumatăţi (proximală şi distală) ale centriolului distal. Cuprinde în structura sa: 1. o membrana plasmatică periferică, ce prezintă o margine inelară (annulus) - la limita cu piesa principală; 2. opelicula de citoplasmă, în care se găsesc particule mici ce formează rezerva de glicogen aspermatozoidului; 3. mitocondriile - dispuse helicoidal într-un filament dublu spiral (cu circa 25 de turea 3-4 mitocondrii fiecare), ce formează o “teacă mitocondrială” (vagina mitochondrialis); 4. fibreexterne dense (fibra densa), groase si masive, în numar de nouă, inegal dezvoltate şi în contact cufibrele satelite axolemei, plasate central; 5. filamentul axial (filamentum axiale s. axonema), compusdin 9 dublete periferice (diplomicrotubulus periphericus) si o pereche de filamente centrale(microtubulus centralis).

Piesa intermediară joacă rolul de centrală energetică a spermatozoidului.

c) Piesa principală apare de aproximativ 9 ori mai lungă decât piesa intermediară. Cuprinde:1. - filamentul axial (axonema), format din cele 10 perechi (9+1) de microtubuli ; 2. – nouă fibre

dense (fibra densa) externe, groase; 3. - teaca fibroasă (vagina fibrosa) formată din fibrecircumferenţiale (costa fibrosa), care se prind prin capetele lor în două coloane longitudinale(columna longitudinalis) ce reprezintă îngroşări ale tecii, diametral opuse; 4. - membrana plasmatică.

155



d) Piesa terminală (pars terminalis), cu o lungime de 3-4 µm cuprinde numai membranaplasmatică şi complexul filamentos axial (axonema), care îsi pierde aranjarea tipică a dubletelor.

Ciclul spermatogenetic (spermatogenesis) are o durată variabilă la diverse specii (13,5 zile lataur, 10,4 la berbec, 8 zile la vier), iar dintr-o spermatogonie rezultă un numar variabil de spermatide(112 la şoarece, 96 la hamster şi 64 la taur şi berbec).

Desfăşurarea spermatogenezei este influenţată de numeroşi factori fizici, fiziologici,

farmacologici, umorali. Astfel, temperatura ridicată, aplicată local sau în condiţii generale produceoligospermie, iar razele X şi gama atacă spermatogoniile si cromozomii spermatidelor. Alimentaţiadeficitară în proteine sau vitamine (A, E), unii hormoni (FSH, LH) şi sistemul nervos pot interveni,modificând funcţia spermatogenetică.

Pentru a-si îndeplini functia de reproducere, spermatozoizii trebuie să prezinte: mobilitate,putere fecundantă şi vitalitate.

Mobilitatea se datorează prezenţei tubulilor în organizarea flagelului (cozii) spermatozoidului.Suprimarea mobilitaţii împiedică, în mod ireversibil fecundaţia. Viteza de deplasare diferă în funcţiede specie, atingând: 6-7 mm/minut la taur; 5-10 mm/minut la berbec; 4-6 mm/minut la armasar; 3-6mm/minut la vier.

Puterea fecundanta sau capacitatea vitală (capacitaţia) este o însuşire pe carespermatozoizii o dobândesc când ajung în căile genitale femele, după o perioadă de aclimatizare.Această însuşire se dobândeşte prin pierderea unei calităţi antagoniste (decapacitaţia) pe care

spermatozoizii o folosesc ca protecţie în drumul lor prin căile genitale mascule. Ea permitespermatozoidului să pătrundă în ovul sau în mucoasa uterină.Vitalitatea este proprietatea spermatozoizilor de a-şi păstra mobilitatea şi puterea fecundantă

în condiţii de conservare.

9.1.2. Ovogeneza

Ovogeneza (ovogenesis) cuprinde complexul de transformări prin care trece ovogonia (celulagerminativă iniţială) până devine ovul (ovocit) apt de fecundare.

Se petrece în zona corticală a ovarului, în interiorul unor formaţiuni histologice complexe,denumite foliculi ovarieni.

În ovogeneză sunt parcurse trei perioade: germinativă, de creştere şi de maturare.1. Perioada germinativă (de înmulţire) se desfăşoară în timpul vieţii embrionare, având ca

punct de plecare ovogoniile din ovarul embrionar. În perioada embrio-fetală, în ovar se formează întreaga rezervă de celule sexuale femele, pentru toată viaţa (ce cuprinde circa 60.000 - 100.000ovocite de ordinul I). Ovocitele de ordinul I (ovocytus primarius) rămân în stare de latenţă biologică(status quiescent) până la pubertate, fiind blocate în profaza diviziunii meiotice (reducţionale).

2. Perioada de creştere variază foarte mult ca durată, începând imediat dupa naştere şiajungând să se întindă pe ani de zile (exemplu: la hominide până la 20-30 de ani). În cursul acesteiperioade se produce şi se acumulează vitelus.

La păsări, perioada de vitelogeneza cuprinde două intervale: a) unul lung de circa 180 de zile,la găină, în care se realizează 5-10% din rezervă de vitelus şi b) altul mai scurt, de circa 5 -12 zile, încare se sintetizează 90-95% din vitelus.

Vitelogeneza constă în formarea de plăcuţe de vitelus în citoplasma ovociţilor primari.Vitelusul este format din substanţe nutritive (glicogen, lipide, fosfolipide) care sunt produse în ficat(vitelus exogen) apoi sunt vehiculate de sânge şi pinocitate în ovocite prin microvilozităţile care apar

la suprafaţa membranei acestor celule.3. Perioada de maturare a ovocitelor începe la pubertatea animalului. Cuprinde cele douădiviziuni de maturare: a) prima diviziune, care este meiotică (reducţionala), din ovocitul de ordinul Irezultând două celule inegale: una de talie mare (haploidă) - ovocitul de ordinul II (ovocytussecundarius) şi alta de talie mică - primul globul (polocytus primarius), ce se poate divide; b) a douadiviziune de maturare este mitotică, din ovocitul secundar (ovocit de ordinul II) rezultând ovulul(ovocitul) matur şi al doilea globul polar (polocytus secundarius).

În acest fel, la sfârşitul perioadei de maturare, dintr-un ovocit primar, rezultă un ovocit cu sethaploid de cromozomi şi trei globuli polari. (Fig. 9.7)

156



Fig.9.7. Ovogeneza1- Ovogonie; 2- Ovocit I; 3-

Ovocit II; 4- Primul globulpolar; 5- Spermatozoid; 6_ Ovul

matur; 7- Globuli polarisecundari.

Dehiscenţa (ruperea) foliculară şieliberarea ovocitelor are loc înmomentul în care ovocitul primar (ovocitul de ordinul I) îsi formează fusul dediviziune, intrând în prima diviziune dematurare (meiotica), încât pavilionuloviductului captează deja ovocitulsecundar (ovocitul de ordinul II).Posibilităţile de supravieţuire ale

ovocitului secundar (ovocitul de ordinul II)sunt de 24-48 de ore, iar a douădiviziune de maturare se finalizeazănumai dacă a avut loc penetraţia zoneipelucide de către spermatozoizi. În cazcontrar, ovocitul secundar (de ordinul II) rămâne blocat în metafaza celei de-a doua diviziuni dematurare.

În momentul dehiscenţei, ovocitul secundar (ovocitul de ordinul II) este înconjurat deovolemă, zona pelucida şi coroana radiata.

Ovolema (ovolema sau membrana vitelină) este o membrana citoplasmatică cu numeroşimicrovili.

Zona pelucidă (zona pellucida) este o zonă mucopoliglucidică, traversată de microvili lungi aicelulelor foliculare, ce ajung la microvilii ovolemei.

Coroana radiata (corona radiata) este formată din 1-2 rânduri de celule foliculare.9.1.2.1. Morfologia ovulei

Ovula sau ovocitul matur (ovum) reprezintă celula sexuală femelă matură, haploidă, cu oformă sferică şi cu un diametru de până la 200 µm. Conţine, pe lângă materialul genetic inclus încromozomi şi material nutritiv necesar pentru perioada iniţială de dezvoltare a embrionului.

a) Nucleul celulei apare sferic, veziculos, nucleolat, cu cromatina fin granulară, situat centralsau excentric şi delimitat de o membrană dublă cu pori, în al căror lumen este prezent un materialelectronodens, ce intervine selectiv în reglarea tranzitului nucleo-citoplasmatic. Prin porii membraneinucleare trec în citoplasmă granule electronodense de 350Å.(Fig.9. 8)

157



Fig. 9.8. Structura şi ultrastructura ovocituluiA- Aspect la microscopul optic; B- Aspect electronomicroscopic.1- Citoplasma ovocitului; 2- Nucleu; 3- Reticul endoplasmic neted; 4- Reticul endoplasmic

rugos; 5- Mitocondrii; 6- Plăcuţe viteline; 7- Ovolema; 8-Zona pelucida;9- Celule foliculare.

b) Citoplasma ovulei (ovoplasma) este acidofilă şi fin granulară. Conţine, pe lângă organitelecomune, aglomerate în zona perinucleară, mult ARN liber şi “nucleul vitelin” (Balbiani)(deuteroplasma s. vitellus), o formaţiune ovoidă formată din mitocondrii, dictiozomi şi lamele inelare.Mitocondriile alcătuiesc o coroană perinucleară incompletă. La bovidee, mitocondriile au o prelungire în forma de “glugă” , ce cuprinde în concavitatea ei o picatură lipidică. Cristele mitocondriale lipsesc înprelungire dar se menţin în restul mitocondriei. (Fig.8.9)

Fig. 8.9. Aspectul mitocondriei în ovocitul de la bovidee1- Matrice mitocondrială; 2- Criste mitocondriale; 3- Prelungire în formă de glugă;4- Picătură în formă de lipide.

c) Complexul Golgi se extinde şi în zona corticală acitoplasmei, unde este constituit din granule corticale, înconjurate deendomembrane. Granulele corticale participă la formarea lichiduluiperivitelin, îndeplinind un rol important în fecundaţie. Complexul Golgiparticipă activ la concentrarea vitelusului şi la sinteza lipidelor, procese în care sunt implicate şi mitocondriile.

Reticulul endoplasmic este de tip neted, cu elemente dispuse lax.Ribozomii sunt liberi sau ataşaţi reticulului endoplasmic. De

asemenea, sunt prezenţi în citoplasmă: lizozomi primari, corpi multiveziculari (ca urmare a pinocitozeiintense) şi numeroase granule (plăcuţe de vitelus).

d) Membrana vitelina a ovocitului ( ovolemma s.plamalemma) este de natura lipoproteicătrilaminată şi prezintă numeroase prelungiri - sub forma de microvilozităţi fine, care se angrenează

cu prelungirile rare şi groase ale celulelor foliculare. Se pare că formaţiunile microviloase nu suntpermanente, apariţia lor fiind legată de stadiul funcţional al celulei. La nivelul membranei viteline seobservă numeroase vezicule pinocitice, ceea ce demonstrează schimbul intens de substanţe ce seefectuează între celulele foliculare ale coroanei radiata şi ovul. (Fig.9.10)

Fig. 9.10. Relaţia dintre ovocit şi celulele foliculare

1- Prelungirile celulelor foliculare;2- Microvilii ovocitului;

3- Zona pelucida;4- Desmozomi;5- Vezicule de pinocitoză

Zona pelucida (zona pellucida) prezintă unaspect striat, datorat microvilozităţilor membraneiviteline şi ale celulelor foliculare, în care se realizează joncţiuni celulare de tipul “zonulei adherens”.

Capacitatea vitală a gametului femel diferă, în raportcu specia şi se menţine: 10 ore la iapă, 20 ore lavacă, 5 ore la oaie, 12 ore la scroafă şi 6 ore laiepuroaică.

Clasificarea ovocitelor se face în funcţie de cantitateade vitelus pe care o conţin, existând următoarele tipuri: oligolecite, lecite, teloleciteşi centrolecite.

158



Ovulele oligolecite conţin vitelus în cantitate mică, iar segmentaţia lor este totală şi inegală. Suntprezente la cefalocordate (la amfioxus)si la mamifere. (Fig.9.11)

9.11. Tipuri de ovociteA- Ovocit oligolecit; B- Ovocit centrolecit;C- Ovocit mezolecit (lecit); D-Ovocit telolecit;1-Disc germinativ;

2- Latebră Purkinje;3- Vitelus nutritiv.

Ovulele lecite sau mezolecite se întâlnesc la batracieni şi cuprind mai mult vitelus decât celeoligolecite. Vitelusul se aglomerează la polul vitelin sau vegetativ al celulei, în timp ce polul vitelin alcelulei este sărac în vitelus şi conţine nucleul. Segmentaţia este totală, rezultând blastomere inegale.

Ovulele telolecite sunt caracteristice peştilor, reptilelor şi păsaărilor. Vitelusul, în cantitatemare, ocupă aproape întreaga masă a ovulei, în timp ce nucleul (sau vezicula germinativă) împreunăcu o cantitate redusă de citoplasmă formeaza discul germinativ. Segmentaţia este parţială şidiscoidală interesând numai

Ovulele centrolecite sunt caracteristice artropodelor. Vitelusul nutritiv ocupa centrul ovulei, întimp ce vitelusul formativ (hialoplasma) formează un strat periferic subţire. Segmentaţia intereseazănumai vitelusul formativ, apărând de tip superficial .

159



9.2.FECUNDAŢIA

Fecundatia este un proces biologic complex, format dintr-o succesiune de fenomeneinterdependente prin care, cei doi gameţi de sex opus (spermatozoidul şi ovula) se contopesc şi seasimilează reciproc, rezultând zigotul (sau oul), prima celula a unui viitor organism.

Fazele fecundaţiei

Faze Intervin: Se produce: Observaţii:Faza deapropiere

-fertilizina( ginogamon)-antifertilizina(androgamon)

-disociere celulelor foliculare -este nespecifică

Faza depenetraţie

-acrozina(=hialuronidaza)

-penetraţia membranei pelucida-eliberarea polocitului secundar - pătrunderea spermatozoidului înovula

- la homonide şirozătoarepenetraţia estetotală

Faza deamfimixie

-rotaţia capului spermatozoidului-formarea asterului spermatic

-cariogamia-singamia-refacerea setului diploiddeterminarea sexului

Fecundaţia se realizează în trei faze succesive: de apropiere, de penetraţie şi de amfimixie.a) Faza de apropiere are loc datorită atracţiei reciproce dintre cei doi gameţi întrucât

membrana pelucida a ovocitului conţine o glicoproteină denumită fertilizină sau ginogamon, carereacţionează cu o proteină acidă de pe suprafaţa spermatozoizilor, denumită antifertilizină sauandrogamon. În felul acesta se produce o reacţie similară reacţiei dintre antigen şi anticorp.

S-a demonstrat ca anticorpii IgG pot impiedica ataşarea spermatozoizilor şi penetrarea zoneipelucide (denumită şi membrană pelucida). Pot apărea autoanticorpi pentru zona pellucida care săgenereze infecunditate.

Spermatozoizii care au capacitate fecundantă (capacitatio) produc disocierea celulelor foliculare din “coroana radiata” cu ajutorul hialuronidazei , deschizând drumul spre membrana (zona)pelucida. La vacă, oaie, capră disocierea are loc imediat după ovulaţie. Disocierea celulelor folicularenu este specifică, realizându-se şi sub acţiunea enzimelor eliberate de spermatozoizii altor specii.

Apropierea celor doi gameti are loc în treimea superioara oviductului. Ataşareaspermatozoidului de zona pelulucida are loc în urma formării unor legături între o glicoproteină dinmembrana plamatică a spermatozoidului (o galactosyltransferază) şi receptorii pentru aceasta dinzona pellucida .(Fig.9.12)

Fig. 9.12. Etapele realizării

fecundaţieiA- Penetrarea zoneipelucide, a speţiuluiperivitelin şi amembranei viteline;

B- Pătrundereaspermatozoidului în ovul;

C- C-Formarea pronucleilor mascul şi femel;

D-Amfimixia;E- Metafaza primei

diviziuni1- Ovocitul; 2- Nucleul; 3-

Ovolema; 4- Spaţiulperivitelin; 5- Zona pelucidăcu spermatozoizi.

160



b) Faza de penetraţie (penetratio spermii) constă în pătrunderea câtorva spermatozoizi,

numai din aceeaşi specie sau din specii foarte apropiate, ca de exemplu: cal-măgar. Spermatozoiziitrec prin zona (membrana) pelucida şi ajung în spaţiul perivitelin (spatium perivitellinum), plin culichid perivitelin (liquor perivitellinus).

În urma contactului dintre acrozom şi membrana (zona) pelucida, se rupe membrana

acrozomului (reactio acxrosomalis), eliberându-se acrozina (sau hialuronidaza), ce produce ohidroliză localizată, realizând un canal (via spermatica) tangenţial la ovolemă. Mişcărilespermatozoizilor (motus spermii) de traversare a zonei pelucide durează circa 5 minute.

Ovocita reacţionează la pătrunderea unui număr redus de spermatozoizi în zona pelucida,prin realizarea celei de-a doua diviziuni de maturare, rezultând al doilea globul polar (polocitul secundar), celulă care va fi eliminată şi ovula, aptă pentru fecundare. Dupa ce primii spermatozoizi aupătruns în zona pelucidă se produce reacţia zonei pelucide, adică: granulele corticale din ovocit îşivarsă conţinutul în spatiul perivitelin, ceea ce face ca din acest moment zona pelucida să devinăimpermeabilă şi rezistentă faţă de acrozina altor spermatozoizi. Impermeabilizarea se poate realizalent, in circa 60 secunde (la vacă, iapă, oaie, scroafă, căţea, hamster ), sau rapid în1-2 secunde (laiepuroaică). În felul acesta se asigura fecundaţia monospermică (monospermia) şi se evităpolispermia (polyspermia).

Spermatozoizii cei mai viguroşi se orientează spre orificiul membranei viteline prin care a fost

expulzat cel de-al doilea globul polar. Numai un singur spermatozoid, denumit spermatozoid privilegiat pătrunde în ovulă.La taurine, ovine, canide şi leporide, în ovulă pătrunde numai capul spermatozoidului, gâtul şi

coada rămânând în zona pelucida. La hominide şi la unele rozătoare ( şoarece, cobai) penetraţia estetotală.

La mamifere, producerea contactului dintre cei doi gameţi şi realizarea fecundaţiei depinde desupravieţuirea spermatozoizilor, depuşi în căile genitale femele. Supravietuirea variază în funcţie despecie, fiind de: 44 ore la armăsar, 25-30 ore la taur, 30-35 ore la berbec, 8 -12 ore la iepure.

c) Faza de amfimixie sau concepţie (conceptio) are loc după pătrunderea spermatozoidului înovulă. În această fază se produc următoarele fenomene: 1. capul spermatozoidului migrează sprecentrul ovulului, unde se afla nucleul, suferind o rotaţie de 180°, încât acrozomul se orientează spremembrana vitelină, iar gâtul spermatozoidului se orientează spre nucleul ovulului; 2. centriolulproximal se detaşează de baza capului, formând spermocentrul , iar citoplasma ovulei se

condensează în jurul spermocentrului sub formă de “raze” citoplasmatice, dând naştere la “asterulspermatic” (aster spermaticus); 3. capul spermatozoidului, respectiv nucleul, începe sa asimilezefoarte repede citoplasma ovulei, creşte în volum şi devine pronucleu mascul (pronucleus masculinus);4. nucleul ovulei suferă modificări infrastructurale şi mai ales biochimice, transformându-se în pronucleu femel(pronucleus femininus); 5. cei doi pronuclei se apropie reciproc, membranele lor vin încontact, se alipesc (realizând cariogamia), se dizolvă în acest punct şi se formeaza o singurămembrană nucleară, în interiorul căreia se asimilează reciproc (realizând singamia ) componenteleinfrastructurale şi biochimice ale celor doi pronuclei, obţinându-se astfel o celula nouă, zigotul (zygotas. conceptus) sau oul fertilizat (ovum fertilizatum s.spermovium).

În timpul amfimixiei se reface setul diploid al zigotului, realizându-se setul de cromozomicaracteristic speciei şi stabilindu-se bazele eredităţii ale noului organism. Se determină sexul şi sedeclanşează segmentaţia.

Durata totală a fecundaţiei variază în funcţie de specie, fiind în medie de 12-16 ore, la

animalele domestice. Cel mai mare număr de ore (10-12 ore) este ocupat de fenomenele care au locla nivelul pronucleilor.Există unle specii de animale nevertebrate (albine,furnici, purici de plante) sau vertebrate (o

specie de şopârlă, Lacerta saxatilis), la care dezvoltarea ovulei se poate produce fără a fi avut locfecundaţia, prin fenomenul de partenogeneză. De asemenea, la unele specii de peşti (la caras -Carassius auratus gibelio), a fost observat fenomenul de pseudogamie sau ginogeneză , o formă defecundaţie incompletă, când nu se produce amfimixia, deşi spermatozoidul pătrunde în ovul. Puiirezultaţi au moştenit şi unele caractere de la taţi, ceea ce demonstreză influenţa substanţelor dinspermatozoizi asupra metabolismului şi dezvoltării oului,chiar şi în cazul, în care nu s-a produsamfimixia.

În patologia fecundaţiei se întâlnesc aspecte precum: a) himerismul - când are loc ofecundaţie dispermică: un spermatozoid face amfimixie cu nucleul ovulei, iar celălalt spermatozoidface amfimixie cu nucleul globulului polar, antrenându-se într-o dezvoltare anarhică; b) aberaţiilecromozomiale, datorate greşelilor din meioză şi mitoză, ce pot interesa atât gonozomii, cât şiautozomii, producându-se diferite malformaţii cromozomiale.

161



9.3. Segmentatia

Prin segmentaţie se înţelege ansamblul diviziunilor pe care le urmează zigotul şi în urmacărora se realizează edificii pluricelulare. Se declanşează la un interval variabil de timp dupăfecundare (la circa 30 de ore la hominide).La sfârşitul ei embrionul este schiţat, fiind constituit dinprimele două foiţe embrionare. Se desfaşoară în timp ce zigotul coboară prin oviduct în uter şi

cuprinde următoarele stadii embrionare: morula, blastula, gastrula şi neurula.Ca model didactic pentru explicarea segmentaţiei, se prezintă segmentaţia la amfioxus (de lagrecescul amphi = dublu; oxys = ascuţit), Branchiostoma lanceolatum, un cefalocordat. Este cea maisimplă segmentaţie şi prezintă asemănări cu cea de la pasăre şi mamifere.

9.3.1.Segmentaţia la amfioxus

Amfioxus are ovul de tip oligolecit , care va realiza o segmentaţie totală holoblastică (fissioholoblastica s. fissio totalis) şi inegală ( fissio inequalis) , parcurgând fazele de: morulă, blastulă,gastrulă şi neurulă. (Fig. 9.13)

Fig. 9.13.

Segmentaţia la amfioxusA- Zigot; E,C,D – Apariţia blastomerelor; E- Morula;F- Invaginarea blastulei; G- Formarea gastrulei.1- Polul animal; 2- Polul vegetal;

9.3.1.1.. Faza de morula

Faza de morulă (morulatio) începe la câteva ore după fecundare, când zigotul (zygota s.conceptus) sau celula ou intră în diviziune. Prima diviziune se realizează după un plan vertical,meridional (planul fissionis meridionalis), rezultând două blastomere (blastomerus) egale, al căror volum total nu depăseşte volumul zigotului (a celulei ou). A doua diviziune este tot meridională(verticală), însă perpendiculară pe planul primei diviziuni, rezultând patru blastomere. A treia diviziuneeste transversală, planul de diviziune fiind paralel cu ecuatorul, dar situat supraecuatorial (planumfissionis tangentiale). Rezultă opt blastomere inegale: patru blastomere mici, micromere(micromerus), în emisfera polului animal şi patru blastomere mai mari, macromere (macromerus),situate în emisfera polului vegetativ. Prin diviziunile ulterioare, numărul blastomerelor creşte înproporţie geometrică (16, 32, 64, 128) atât în cazul micromerelor cât şi în al macromerelor. Celulelerezultate în urma acestor diviziuni vor genera o formaţiune sferoidală (spheroideum s.sphaeroideum), plină de celule cu aspect muriform, denumită morula (morula).

Morula este mai mare, ca volum, decât celula ou din care s-a format. În cadrul ei,micromerele se dispun spre polul animal, iar macromerele spre polul vegetal al morulei.

Se consideră că, până în stadiul de câteva (8-10) blastomere, toate celelele sunt omnipotente(cellula omnipotens) sau pluripotente (cellula pluripotents), având aceeaşi valoare în diferenţiere. Înacest stadiu celulele sunt nedeterminate (cellula indetermniata) şi indiferent de poziţia lor, dacă sunt

162



detaşate şi puse în condiţii propice, evoluează până la sfârşitul dezvoltării embrionare, putândgenerând un organism întreg.

9.3.1.2. Faza de blastula (blastulatio)

Blastomerele din interiorul morulei încep să producă un lichid blastocelic ce le împinge la

periferie, unde se dispun sub forma unui singur strat de celule, ce delimitează cavitatea blastocelică(cavum blastocystis). Rezultă, astfel, stadiul monoblastic (blastocystis unilaminaris) sau blastula(blastula) s.blastocystis).

Blastula sau blastocistul (blastocystis) cuprinde circa 128 blastomere, Este sferoidală şi nudepăseşte, la amfiox, volumul iniţial al zigotului. În cazul acestei formaţiuni, micromerele au mai puţinvitelus şi formează peretele emisferei animale, iar macromerele sunt mai bogate în vitelus, alcătuindperetele emisferei vegetale.

În aceasta fază se produce determinarea (determinatio) prin poziţie, blastomerele ocupândprin diviziuni repetate, anumite poziţii. Blastomerele vor evolua diferit,în funcţie de factorii de mediuambiant şi în raport cu interrelatiile intercelulare. Aceasta fază este denumita şi “preludiuldiferenţierii”, pentru ca, după intrarea celulelor în faza de determinare, conform poziţiilor şi relaţiilor intercelulare noi, în fiecare celulă sau într-un grup de celule să înceapă sinteze specifice. În acest felsunt activate anumite protein-enzime, care vor iniţia sinteza unei proteine specifice sau a unui anumit

teritoriu morfogenetic din care fac parte celulele respective.9.3.1.3. Faza de gastrulă (gastrulatio)

Faza de gastrulă (gastrulatio) se caracterizează printr-o proliferare intensă, o creşterevolumetrică şi prin deplasări morfogenetice (motus morphogenetici ) ample de celule sau grupuri decelule, în urma cărora rezultă foiţele embrionare (strata germinalia).

Micromerele se divid mai rapid şi alunecă (immigratio) la suprafaţa blastulei prin epibolie(epibolia), realizând foiţa celulară externă (epiblastus) sau ectoblastul (ectoblastus). Macromerelecare conţin vitelusul se divid mai puţin intens şi se invaginează (invaginatio), prin embolie, realizândfoiţa internă (endoderma) sau endoblastul (endoblastus). Embolia constă într-o invaginanare încavitatea blastocelică a macromerelor. Cavitatea formată în urma invaginării se numeşte arhenteronşi comunică cu exteriorul prin blastopor , care marchează extremitatea caudală a corpului viitorului

animal, fiind delimitat de două buze, una superioară, alta inferioară. Spre sfârşitul fazei are loc oalungire (elongatio) a gastrulei, în sensul axului antero-posterior.

Factorii ce intervin în diferenţierea şi dezvoltarea embrionului . În evenimentele complexe ale diferenţierii şi dezvoltării embrionare, un rol important, în afara

controlului genetic permanent, îl au influenţele din mediul extracelular , interacţiunea celulelor învecinate, mişcarile celulare morfogenetice şi adezivitatea celulară.

Astfel, accesibilitatea diferită la factorii din mediul extracelular, determină potenţialităţievolutive diferite. Acţionează un gradient de mediu , care se referă la faptul că lichidul extracelular este mai bogat în substanţe nutritive la periferia masei de celule, în timp ce în centrul masei de celuleeste mai sărac în substante nutritive şi mai bogat în produşi de excreţie ai celulelor.

Interacţiunile celulare cu rol inductiv apar foarte de timpuriu în embriogeneză, încă din fazade 8 blastomere. În etapa de morulă, celulele sunt cuplate electric, membranele celulare având o

foarte mare permeabilitate ionică. Curentul electric realizează un cuplaj, chiar în absenţa joncţiunilor specializate. Într-o fază mai avansată, permeabilitatea pentru ioni scade foarte mult, rămânândnealterate la nivelul joncţiunilor de tip gap, care apar imediat dupa primele determinări.

Mişcările celulare (motus morphogenetici ) sunt foarte intense în embriogeneză, fiinddeterminate de factori greu de definit, asemănători, ca efect, cu factorii chimio-tactici pentru leucocite.Mişcările celulare încep în faza de gastrulă şi permit celulelor să ajungă în contact cu un alt tip decelule cu care pot stabili interacţiuni cu rol inductiv.

Adezivitatea celulară joacă un rol deosebit în evenimentele complexe ale diferenţierii şidezvoltării embrionare, fiind mediată de molecule de proteine, denumite molecule de adezivitate (înlimba engleza: “cell adhesion molecules”, prescurtat: CAM ). Acestea aparţin membranei celulare şimatricei extracelulare. (Fig.9.14)

163



Fig.9.14. Regiunile blastocistului în funcţiede prezenţa moleculelor adezivităţii celulare (CAM)

A-Regiuni cu N-CAM; B- Regiuni cu L-

CAM; C-Regiuni fără CAM.1-Linia primitivă; 2- Ectoderm; 3- Sistem nervos; 4-Notocord; 5- Somite;6- Cord;7- Aparat urinar; 8-Muşchi neted; 9- Endoderm; 10-Tesuturi hematoformatoare.

Moleculele adezivităţii celulare activează selectiv încursul desfăşurării proceselor dinamice care au loc,modificând comportamentul celulelor angajate înmişcari morfogenetice. Ele au fost identificate sauizolate prin metode ale imunologiei şi au fost

definite după celulele pe care au fost depistate, astfel, existând: molecule de adezivitate

interneuronale ( N-CAM ), molecule ale adezivitatii celulelor hepatice ( L-CAM ) şi molecule aleadezivitatii dintre neuron şi nevroglie ( NG-CAM ). Ele sunt glicoproteine, iar N-CAM conţin cantitţtifoarte mari de acid sialic. N-CAM, L-CAM si NG-CAM nu au specificitate încrucişată, deoarece nu seleagă între ele pentru a media adezivitatea dintre celule.

În funcţie de repartiţia moleculelor adezivităţii celulare (CAM), embriologii au conceput hărtice indică ţesuturile şi structurile care se vor forma din fiecare regiune. Astfel, regiunile blastocistuluicare exprimă N-CAM vor da naştere plăcii neurale, notocordului şi somitelor, iar cele care exprimă L-CAM vor genera ectodermul non-neural şi endodermul. Cu ajutorul metodelor de imunofluorescenţăs-a observat că 2/3 din suprafaţa blastomerului este pozitivă pentru cele două tipuri de molecule aleadezivităţii.

9.3.1.4. Faza de neurulă

Faza de neurulă (neurulatio) sau perioada iniţială a şanţului neural (periodus sulci neuralisinitialis) se caracterizează prin formarea din ectoblast, în mod succesiv a plăcii neurale (laminaneuralis), a canalului şi a tubului neural . Astfel, faza neurulării marchează constituirea tubului nervos,dar, totodată şi începutul histogenezei , precum şi a diferenţierii primordiilor de organe. În aceastăfază se petrec două evenimente morfogenetice majore: a) formarea tubului neural sib) cordomezoblastului.

a) Formarea tubului neural Micromerele ectoblastice din zona dorso-centrală a embrionului devin mai înalte decât

ectoblastul, se îngroaşă, formându-se placa sau lama neurală (neuroectoblastul) orientată în axullongitudinal al embrionului.

Fig. 9.15. Neurulaţia la Amfioxus – Etape iniţialeA,B,C – Secţiuni transversale1-Ectoderm, 2-Endoderm, 3- Arhenteron, 4- Şanţ şi tub neural;5-Notocord; 6-Diverticuli mezoblastici.

164



Celulele plăcii neurale se divid în continuare cu mare intensitate, încât placa neurală se îndoaie şi se invaginează puţin, formând jgheabul (sulcus neuralis) şi canalul neural (canalis neuralis) cu forma literei “U” sau “V” (pe secţiune transversală) delimitat de crestele neurale (crista neuralis ).Ulterior, jgheabul neural se închide prin apropierea şi sudarea marginilor sale superioare,realizându-se tubul neural (tubus neuralis) .

Neurulaţia la Amfioxus

b) Formarea cordomezoblastului Se desfăşoară concomitent cu formarea tubului neural şi constă în formarea coardei dorsale

şi a mezoblastului primar .Coarda dorsală sau notocordul (notochorda) se formează în axul sagital dorsal al

endoblastului prin diviziuni rapide şi proliferări puternice, după care se detaşează de endoblast şi sedispune ventral de tubul neural.

Concomitent, paramedian se produce o îngroşare a celor două margini laterale ale jumătăţiidorsale a endoblastului, realizându-se două creste paramediane cu aspect triunghiular, care se vor detaşa de endoblast şi vor forma, pe ambele laturi, mezoblastul primar .

Mezoblastul primar sau mesodermul paraaxial (mesoderma paraaxiale) se dezvoltă,pătrunzând, pe fiecare parte, printre ectoblast şi endoblast, constituind cea de-a treia foiţăembrionară, ce marchează apariţia stadiului triblastic (tridermic), care încheie embriogeneza,marcând trecerea spre histogeneză şi organogeneză.(fig.9.16)

Evenimente Etape Formaţiunispecifice

Formaţiniterminale

Observaţii:

Placa neurala La păsări şimamifere, înectoblast, în ariapelucidă apar: liniaprimară, nodululanterior,prelungireacefalică, semilunagonocitară, nodululposterior

Fomarea tubuluineural(origine înectoblast)

Jgheab neural Creste neurale GanglioniinervoşiNervii

Tub neural

Vezicula cerebralăprimară (encefalul)

TelencefalDiencefalMezencefalMielencefalMetencefal

Tubul neural Măduvaspinării

Coarda dorsală Notocordul Coloanavertebrală

La pasări simamifere sedezvoltă dinectoblast-prelungirea cefalică

Formareacordomezo-blastului(origine înendoblast)

Mezoblastulprimar

SomiteleNefrotomulHipoblastul

MiotoameleSclerotoa-meleHipoblastul(somatopleuraşi splanchno-pleura)

La păsări şimamifere sedezvoltă dinectoblast de pelaturile linieiprimitive şi dinprelungirea cefalică

165



Fig.9.16. Neurulaţia la Amfioxus –Etape finaleA,B,C – Secţiuni transversale1- Tub neural; 2- Coardă dorsală; 3- Saci celomici; 4- Intestin; 5- Cavitate celomică; 6-

Splanchnopleura; 7- Somatopleura.

Prin dezvoltarea mezoblastului, vor rezulta trei formaţiuni (somitele, nefrotomul şi hipoblastul)dispuse dorso-ventral şi iniţial legate între ele. Tot din mezoblast derivă şi mezenchimul.

Somitele(somiti) apar ca două mase celulare, triunghiulare pe secţiune transversală ceflanchează lateral tubul neural şi coarda dorsală. Ele se vor segmenta transversal, printr-un procesdenumit metamerizare. Din somite se vor diferenţia: a) miotoamele (myotomi),din partea dorso-laterală a somitelor, formate din mioblaşti, care se vor transforma în fibre musculare; b)sclerotoamele (sclerotomi),din partea medială a somitelor, din care se vor dezvolta oasele.

Nefrotomul (nephfrotomi ) se segmentează transversal (se metamerizează) generând

primordiile (primordia) sau mugurii embrionari ai aparatului urinar.Hipoblastul nu se metamerizează, ci se delaminează (delaminatio) (despică) longitudinal,generând splanchnopleura şi somatopleura, ce vor delimita cavitatea celomică primară (celoma s.coeloma) şi vor da naştere membranelor seroase ale cavităţilor (pleura, peritoneul, pericardul).(Fig.9.16)

Splanchnopleura (splanchnopleura) sau foiţa viscerală va acoperi intestinul primitiv şi toateorganele ce se vor forma din el. Somatopleura (somatopleura) sau foiţa parietală va căptuşiectoblastul care delimitează embrionul.

Mezenchimul (mesenchyma) este un derivat mezoblastic ce se formează din celulele migratede pe faţa internă a somitelor şi a splanchnopleurei. El va da naştere: sângelui, ţesutului conjunctivpropriu-zis, sistemului macrofagic monocitar şi muşchilor netezi.

După încheierea stadiului de morulă, în locul termenilor de “ectoblast”, “endoblast” şi“mezoblast”, se vor folosi termenii de “ectoderm”, “endoderm” şi “mezoderm”. Din foiţele embrionare

se vor diferenţia ţesuturile, sistemele şi aparatele organismului.Din ectoderm (ectoderma) se formează: epiderma, epiteliul mucoasei bucale şi anale,sistemul nervos, hipofiza, epifiza, medulosuprarenala, epiteliul cornean şi cristalinian, epiteliulsenzorial auditiv, retina şi epiteliul olfactiv. Se remarcă apariţia unor îngroşări ectoblastice denumite placode: placoda olfactivă, placoda cristaliniană şi placoda auditivă.

Placoda olfactivă (placoda olfactoria) diferenţiază, prin evoluţie, neuronii olfactivi şi celulele desusţinere din mucoasa olfactivă. Placoda cristalinului (placoda lentis) va genera cristalinul, iar din placoda auditivă (placoda otica)se va diferenţia vezicula auditivă din care se va dezvolta labirintulmembranos.

Din mezoderm (mesoderma) se diferenţiază: epiteliile rinichilor şi gonadelor, mezoteliilecavităţilor pleurale, pericardiace şi peritoneale; endoteliile vaselor sanguine şi limfatice; celulelecorticosuprarenalei; celulele Leydig din testicul, celulele luteale ale ovarului; ţesuturile conjunctive,sistemul macrofagic monocitar; scheletul osos; sângele, muşchii; vasele; aparatul urinar; unele

porţiuni ale aparatelor genitale.Din endoderm (endoderma) se diferenţiază: epiteliile aparatului respirator (cu excepţiamucoasei nazale); epiteliul tubului digestiv (exceptând epiteliile cavităţii bucale şi canalului anal);

166



ficatul, pancreasul şi vezica biliară; glandele tiroidă şi paratiroidă; epiteliul cavităţii timpanice şi aletubei auditive; timusul.

Histogeneza şi organogeneza

Foiţaembrionară

Ţesuturi Aparate sausisteme

Organe

Ectoderm EpidermulEpiteliul mucoasei bucale şinazaleEpiteliul mucoasei anale

Epiteliul corneanEpiteliul cristalinianEpiteliul senzorial auditivŢesutul nervos

Sistemul nervos HipofizaMedulosupra-renalaRetinaPlacoda olfactivăPlacoda cristalinianăPlacoda auditivă

Mezoderm Celulele sistemului macrofagicCelulele corticosuprarenalei

Celulelor glandelor interstiţialeEpiteliile renaleEpiteliile gonadelor Mezotelii seroaselor Endoteliile vasculareŢesuturile conjunctiveŢesutul sanguinŢesutul muscular

ScheletulSistemul vascular

Sistemul limfaticAparatul urinar Segmente aleaparatelor genitale

OaseleMuşchii

Endoderm Epiteliul cavităţii timpaniceEpiteliul tubei auditiveEpiteliile tubului digestivEpiteliile aparatului respirator

Aparatul respirator Aparatul digestiv

TiroidaParatiroidaFicatPancreas

Vezică biliarăTimusul (parţial)

9.3.2.SEGMENTAŢIA LA PĂSĂRI

Datorită oului, care este de tip telolecit , segmentaţia este meroblastică sau parţială, iar dupăaspectul său este polară sau discoidală.

La păsări, celula sexuală femelă matură (sau ovulul ) este reprezentat numai de gălbenuş.Nucleul ovulei este situat la polul animal al gălbenuşului, fiind înconjurat de o cantitate redusă decitoplasmă activă (sau vitelus formativ ) împreună cu care alcătuieşte o formaţiune discoidală,denumită discgerminativ (cicatricula) sau pată germinativă (nucleul Pander). Numai discul germinativva intra în segmentaţie.

Restul ovoplasmei este format din vitelus alb formativ (ce conţine granule mici, cu compoziţiepredominant proteică – 43%) şi din vitelus galben nutritiv , ce cuprinde granule mari, formate înprincipal din lipide şi proteine, în cantitate mai redusă (28%). Depunerea vitelusului începe de subdiscul germinativ, cu un strat de vitelus alb care se prelungeşte spre centrul oului cu o formaţiune cuaspect de limbă de clopot, denumită latebra Purkinje. În afara acestui vitelus alb se se dispune un

strat de vitelus galben, iar încontinuare are loc o dispunere acelor două tipuri de vitelus înstraturi concentrice alternative. Laperiferie, oul este învelit de omembrană vitelină (de ovolemă).(Fig.9.17)

Fig.9.17. Oul la păsări

167



1- Latebră; 2- Disc germinativ; 3- Membrana vitelină; 4- Vitelus galben; 5- Vitelus alb;; 6-Albuş dens; 7- Şalaze; 8- Albuş fluid; 9- Albuş dens; 10- Albuş fluid, al treilea strat; 11- Membranacochilieră internă; 12- Membrana cochilieră externă; 13- Camera cu aer; 14- Camera calcaroasă; 15-Cuticula.

Fecundarea ouălor are loc în porţiunea iniţială a oviductului sau pe suprafaţa ovarului, înainte

de a fi acoperit cu albuş, membrane cochiliere şi cochilie. După fecundare ovula (oul nefecundat)devine ou fecundat (ovum fertilisatum s. sperovium) sau zigot (zygota s. conceptus). Începutul segmentaţiei este marcat de apariţia unui şanţ linear ce marchează planul de

separare dintre cele două celule fiice, plan ce cade perpendicular pe suprafaţa discului germinativ,fără să-i atingă marginile. Celulele rezultate sunt identice şi de talie egală (diviziune homoplastică). Adoua mitoză are şanţul şi planul de separare dispuse perpendicular pe primul şanţ. În cea de-a treiamitoză apar două şanţuri verticale, ambele perpendiculare pe primul şanţ. Este urmată de altediviziuni verticale, rezultând un singur strat de celule prismatice, reprezentând ectoblastul . Formareaprimelor două blastomere are loc după 30 de minute de la singamie, iar după patru ore embrionul are8 blastomere, ajungând la 152 blastomere după 7 ore.

Segmentarea este sincronă, deoarece toate diviziunile celulare se desfăşoară simultan.Intercineza este scurtă, fără sinteză de acizi nucleici, aceştia existând deja. În plus, vitelusul formativeste bogat în aminoacizi, enzime, glucide şi lipide, asigurând necesarul proceselor de multiplicare.

Ectoblastul este despărţit de vitelus printr-o cavitate plină de lichid, denumită cavitateasubgerminală sau de segmentare. Acest aspect (ectoblastul şi cavitatea subgerminală) reprezintăstadiul embrionar monoblastic (comparabil cu blastula de la amfiox), având la păsări forma de disc,de unde şi denumirea de discoblastulă (sau de disc embrionar sau bănuţ ). (Fig.9. 18)

Fig.9.18. Segmentaţia zigotului la păsări.A-Discul germinativ nesegmentat; B-Stadiul cu două blastomere; C-Stadiul cu patrublastomere; D-Stadiul cu opt blastomere; F,G-Discoblastula.

Privit de sus, discul embrionar apare ca o suprafaţă relativ circulară care prezintă: 1) – o zonămai transparentă – aria pelucidă (area pellucida), situată uşor excentric; şi 2) – o zonă mai întunecată – aria opacă (area opaca), ce înconjoară aria pelucidă.

În stadiul diblastic se formează endoblastul .Unele dintre celulele ectoblastice iau formă cubică şi migrează la limita dintre ectoblast şi

cavitatea subgerminală. În continuare, aceste celule se multiplică şi formează un strat continuusubectoblast, denumit hipoblast (hypoblastus), împărţind cavitatea de segmentare în două spaţii, ocavitate blastocelică şi o cavitate subgerminală propiuzisă, delimitată între vitelus şi hipoblast,umplutăcu lichid blastocelic şi particule de vitelus. Procesul de de separare a celulelor ce formeazăhipoblastul se numeşte delaminare (delaminatio), iar ectoblastul devine epiblast (epiblastus).Hipoblastul are un rol temporar, fiind înlocuit de endoblast (endoblastus). Celulele endoblasticeimping celulele hipoblastice in aria extraembrionară, unde participă la formare peretelui veziciiombilicale.(Fig.9.19)

Stratul diblastic se realizează în intervalul de 24-48 de ore, cât durează parcurgereaoviductului, până în momentul eliminarii oului din corpul păsării (pontei). Evoluţia embrionului seopreşte prin menţinerea acestuia la 5-7°C şi continuă prin incubaţie la 38-39°C, în condiţii deumiditate, aerare şi întoarcere periodică.

168



Fig.9.19. Discoblastula la păsări, înainte de începerea gastrulaţieiA, B- Discoblastule, aspecte dorsaleC,D,E – Secţiuni transversale

1-Aria opacă;2- Aria clară (pelucida), 3- Nodul posterior;4- Ectoblast;5- Endoblast;6- Cavitate subgerminală

Procesele de multiplicare celulară se reiau după şase ore de la începerea incubaţiei,când începe perioada de gastrulare. Celulele epiblastice şi cele ale hipoblastului realizează: mişcări deconvergenţă (pentru a forma linia primitivă şi nodulul caudal),migrări în profunzime (în cavitateablastocelică şi în aria extraembrionară), mişcări de deplasare laterală (pentru a forma mezoblastul).

Gastrularea la păsări cuprinde: formarea nodulului posterior, formarea liniei primitive cunodulul anterior, formarea mezodermului, formarea notocordului şi regresia liniei primitive.

După 24 de ore de incubaţie, discul embrionar (discus embryonicus) îşi modifică forma,devenind oval (din rotund), apoi cu aspect piriform (cu lungimea de 3,5-5 mm), prezentând oextremitate cefalică şi o extremitate caudală, cu o proliferare ectoblastică, de formă triunghiulară, cuaspect întunecat, denumită nodul caudal sau posterior . Această proliferare ectoblastică seprelungeşte pe linia mediană, în sens cranial, formând linia primitivă (linea primitiva), care esteparcursă în sens longitudinal de o depresiune îngustă, denumită şanţul liniei primitive (sulcus primitivus). (Fig.9. 20)

Extremitatea cefalică a liniei primitive se termină printr-o formaţiune nodulară denumită nodul cranial sau anterior (Hensen) (nodus primitivus), apărută datorită proliferărilor mai intense. În centrulnodulului anterior se observă o depresiune denumită fosetă primitivă (fovea primitiva).

De la nodulul anterior, prin proliferări celulare, ia naştere o formaţiune – prelungirea cefalică(processus cephalicus s.processus notochordalis)– dirijată cranial, care va pătrunde sub forma unuideget de mănuşă între ectoblast şi endoblast, fără a se atinge limita discului (plica limtans areae etsulcus limitans disci embryonici ). Această prelungire va genera cordomezoblastul, respectiv coardadorsală (notochorda) şi mezoblastul (mesoderma embryonicum) anterior. (Fig.20)

169



Fig. 9.20. Aspecte evolutive ale ariei embrionare la păsări1- Vitelus; 2- Aria opacă; 3-Aria pelucidă; 4- Linia primară; 5- Nodul anterior;6- Prelungire cefalică; 7- Semiluna gonocitară; 8- Creste neurale; 9- Plica limitantă anterioară;

10- Nodul posterior.

Spre deosebire de Amfioxus, unde mezoblastul are origine endodermică, la păsări,mezoblastul se formează din ectoblast. (Fig.9. 21, 9.22 )

Fig.9.21. Secţiune

transversală prin prelungirea cefalică a liniei primare la găină1-Ectoblast; 2- Endoblast;3-Mezoblast;4-Prelungire cefalică

Există la păsări două focare de mezoblastogeneză: a) la nivelul liniei primitive, unde are loc o

proliferare celulară care se îndreaptă spre laturile discului embrionar (mesoderma paraaxiale) şi,pătrunzând între ectoblast şi endoblast, generează o parte a mezoblastului embrionar (mesodermaembryonicum ) şi mezoblastul extraembrionar (mesoderma extraembryonicum); b) la nivelulprelungirii cefalice, de unde ia naştere, aproape în totalitate mezoblastul ce invadează disculembrionar, generând coarda dorsală şi mezoblastul anterior (mesoderma capitis).

170



Fig.9.22. Secţiuni transversale prin aria embrionară la păsăriA, B, C – Etape succesive1- Linia primară; Sanţul liniei primare; 3- Ectoblast; 4- Endoblast; 5- Mezoblast

Mezoblastul anterior, situat pe părţile laterale ale coardei dorsale formează lamelemezodermale (mesoderma laterale) care vor evolua în somite, nefrotoame şi lame laterale. Printr-unproces de clivaj, din lamele laterale apare cavitatea celomică (cavum celomicum) delimitată de: a)somatopleură, formată din elementele celulare mezoblastice aflate în contact cu ectoblastul şi de b)splanchnopleură, aflată în contact cu endoblastul. (Fig.9.23)

Neurulaţia se desfăşoară în mod asemănător cu cea de la amfiox. Ectoblastul situat la nivelulprelungirii cefalice (median şi oral de nodul anterior), va genera prin îngroşări proliferative, placaneurală, şanţul neural, canalul (tubul) neural şi crestele neurale.

În partea anterioară a extremităţii cefalice a discului embrionar, în aria extraembrionarăvasculară apare o formaţiune cu aspect semilunar – semiluna gonocitară sau conul germinativ , ceconstituie locul de diferenţiere a celulelor gonocitare la păsări.

Fig. 9.23. Stadii succesive de dezvoltare embrionară la păsări – Scheme ale secţiunilor transversale

1- Ectoblast; 2- Endoblast; 3- Mezoblast; 4- Coarda dorsală; 5- Şanţ neural; 6- Somite;7- Cavitate celomică; 8- Canal Wolf; 9- Somatopleura; 10- Splanchnopleura; 11- Aorta.

La incheierea stadiului de neurulă, embrionul capătă forma literei “C” şi se delimitează desacul vitelin, de care va rămâne ataşat prin canalul vitelin. Formarea corpului embrionului serealizează în două etape: în prima etapă, tubul neural creşte mai intens decât ectodermul şiendodermul,aparând un buzunar subencefalic şi un proces cranial; în etapa a doua, capul şi corpulembrionului se delimitează de zona extraembrionară, în ziua a IIIa de incubaţie.9.3.3.segmentaŢia la mamifere

171



Prezintă particularităţi generate de faptul că la mamifere oul este oligolecit. Segmentaţia estetotală (întreaga masă a oului intră în diviziune), subegală (rezultând blastomere aproape egale camărime) şi de tip asincron (mitozele se succed fără o anumită ordine în timp).

Prezintă trei perioade: 1) o perioadă iniţială, asemănătoare cu segmentaţia de la amfioxus; 2)o perioadă specifică mamiferelor şi 3) o perioadă asemănătoare cu segmentaţia la păsări.

Prima diviziune a oului duce la formarea unei celule voluminoase macromera (macromerus),

cu aspect clar şi a unei celule mici, micromera (micromerus), întunecată, ambele ocupând spaţiuldelimitat de zona pelucidă. (Fig.9.24)

Fig.9.24. Segmentaţia la mamifereA- Zigotul oligolecit; B- Stadiul cu două blastomere; C- Stadiul cu trei blastomere;D- Stadiul cu patru blastomere; E- Formarea blastocistului.1- Macromera; 2- Micromera; 3- Zona pelucida; 4-Trofoblast; 5- Buton embrionar.

Macromera se divide înaintea micromerei, rezultând stadiul cu 3 blastomere (foarte scurt caexistenţă), pentru ca, imediat, unul din blastomerele clare (macromere) se divide, rezultând stadiul de4 blastomere, dintre care 3 sunt clare (macromere) şi una este întunecată (micromeră). În continuare,

ritmul de diviziune al blastomerelor devine cu totul neregulat, iar planurile de segmentaţie nu suntordonate spaţial, încât dispar şi diferenţele volumetrice între blastomerele clare şi cele întunecate. În final se edifică morula (morula), alcătuită dintr-un bloc compact de celuleîntunecate, cu

contururi poligonale.Diferenţa faţă de ceea ce se întâmplă la amfiox, constă în aceea că micromerele şi

macromerele nu se polarizează la antipozi, nici în morulă, nici în blastulă. Astfel, micromerele sedispun periferic învelind macromerele şi generând trofoblastul (trophoblastus), ce va servi la hrănireaembrionului până la formarea placentei. Macromerele se dispun central, alcătuind embrioblastulembrionar (embryoblastus s.massa cellularis interna) sau butonul embrionar .

Toate transformările desfăşurate până în acest moment se petrec în spaţiul delimitat demembrana pelucidă, care se va subţia treptat şi va dispare definitiv. Prin dispariţia membraneipelucide, trofoblastul ia contact intim cu membrana uterină, intervenind ulterior în nutriţia embrionului.

Celulele embrioblastului secretă un lichid albuminos, care se acumulează într-o cavitate,

denumită lecitocel , ce împinge macromerele spre polul superior (animal). La acest pol, macromerelevor forma un mugure embrionar (nodus embryonicus s. massa embryonica), suspendat parcă detrofoblast, asemănător unei picături de apă condensată pe tavan.

Această formaţiune ce cuprinde trofoblastul(format din micromere dispuse periferic),lecitocelul şi mugurele embrionar poartădenumirea de blastocist (blastocystis s.blastula) şi este analog blastulei de la amfiox,apărând după aproximativ 7 zile de lafecundaţie. (Fig.9.25)

Fig.9.25. Secţiuni prin blastocistul de

leporideA, B – Etape evolutive

172



1- Buton embrionar; 2- Trofoblast; 3- Membrana pelucidă;4- Cavitatea vitelină;

Blastocistul ajunge în cavitatea uterină şi se fixeazăde mucoasa uterină prin procesul de nidaţie (la om şi larozătoare) sau implantaţie (la restul animalelor).

Concomitent cu începutul nidaţieisau implantaţiei încep procesele dediferenţiere în butonul embrionar şi întrofoblast.

Din trofoblast se vor diferenţia 2 straturi: a) un stratextern, sinciţiotrofoblastul (sycytiotrophoblastus), alcătuit dincelule cu limite celulare slabe şi cu o citoplasmă mai întunecată; şi b) un strat intern, citotrofoblastul (cytotrophoblastus), format din celule cu limite distincte.

Ca rezultat al diferenţierilor ulterioare, din trofoblastse va forma componenta fetală a placentei , iar din butonul embrionar se vor diferenţia cele trei foiţeembrionare: ectoblastul , endoblastul şi mezoblastul .

Gastrulaţia

La mamifereleplacentare, gastrulaţia sedesfăşoară în două etape: înprima etapă se formeazăectoblastul şi endoblastul , iar îna doua – mezoblastul . (Fig.9.26)

Fig. 9.26. Blastocist deleporide în timpul gastrulaţiei

1-Trofoblast;2-Ectoblast;

3-Endoblast;

4- Cavitate vitelină

Formarea ectoblastului şi endoblastului .Din stratul unic de macromere prismatice care reprezintă ectoblastul se diferenţiază pe faţa

sa profundă câteva celule mai intunecate. Acestea se vor înmulţi şi vor genera, similar cu ceea ce se întâmplă la păsări, un al doilea strat, format din celule turtite, denumit endoblast . Apare, în acest fel,stadiul diblastic , care datorită aspectului său se mai numeşte şi gastrodisc , sau pată embrionară.Odată ce endoblastul s-a format complet şi căptuşeşte întreaga cavitate a a lecitocelului, în blocul decelule care formează buttonul embrionar se produce o clivare (delaminatio), apărând un spaţiu nou,

cavitatea amniotică (cavum amnii).

173



9.27. Dezvoltarea endoblastului la leporide

1- Trofoblast; 2- Ectoblast;3- Endoblast; 4- Cavitate vitelină.

La suine,ovine, cervide şi leporide, ectoblastul se formează din pod eaua cavităţii amniotice,dispărâdtavanul acesteia împreună cu trofoblastul adiacent.Tavanul cavităţii amniotice rămâne intact la cobai,şoarece, şobolan, veveriţă, arici şi liliac, unde formează ectoblastul, ce este acoperit în totalitate detrofoblast. La ecvine, taurine şi carnivore, nu apare cavitate amniotică primară, iar ectoblastul seformează din celulele superficiale ale butonului embrionar.(Fig.9. 27)

În stadiul incipient al gastrulaţiei, când ectoblastul şi endoblastul sunt complet formate, ariaembrionară ( câmp embrionar sau zonă embriogenă ) are un aspect piriform, cu extremitatea caudalămai ascuţită şi cu cea cranială mai rotunjită. La extremitatea caudală, se realizează prin proliferare, oformaţiune mai opacă, denumită nodul posterior , ce se continuă în sens cranial cu linia primitivă. Lamijlocul ariei embrionare, linia primitivă prezintă o dilataţie, nodulul anterior (Hensen), după care se

continuă spre extremitatea cefalică cu prelungirea cefalică. (Fig.9.28)De pe părţile laterale ale liniei primitive, se desprind numeroase celule cu contur neregulat(stelat), ce vor forma mezoblastul (mesoblastus), între ectoblast şi endoblast.

Fig. 9.28. Aria embrionară la mamifere - aspecte dorsaleevolutive

1-Aria embrionară; 2- Linia primitivă;3- Nodul posterior; 4- Nodul anterior;

5- Prelungire cefalică.

Mezoblastul embrionar prezintă trei porţiuni distincte:a) o porţiune cefalică, nesegmentată; b) o porţiune mijlocie,

sau mezoblastul trunchiului; c) o porţiune caudală,nesegmentată.Mezoblastul trunchiului cuprinde trei zone (regiuni)

distincte: 1) o zonă dorsală; 2) o zonă intermediară; 3) ozonă laterală. (Fig.9.29)

1) Zona dorsală se va fragmenta transversal,generând somitele (somiti ). Fiecare somită prezintă, la

rândul ei, trei porţiuni: 1) miotomul (myotomus), porţiunea medio-dorsală din care vor lua naşteremioblaştii şi ulterior muşchii; 2) sclerotomul (sclerotomus), porţiunea medio-ventrală, din care sedesprind celulele mezenchimale, care migrează în jurul tubului neural, structurând mezenchimul(mesenchyma); 3) dermatomul (dermatomus), porţiunea laterală a somitei care va genera dermul(dermis) şi hipodermul.

2) Zona intermediară (zona nefrogenă) (mesoderma intermedium) se segmentează

transversal în veziculele nefrogene ale pronefrosului, ale mezonefrosului şi ale metanefrosului.

174



Fig. 9.29. Gastrulaţia la mamifere – stadiu avansat. Secţiuni transversaleA (a – a) – Înaintea nodulului anterior; B (b – b ) – Prin nodulul anterior;C (c – c) – Prin linia primitivă1- Ectoblast; 2- Endoblast; 3- Mezoblast; 4- Nodul anterior; 5- Linia primitivă;6-Şanţ primitiv.

3) Zona laterală a mezoblastului (mesoderma laterale) se clivează, dând splanchnopleura şisomatopleura, între care se delimitează celomul primitiv embrionar (cavum coelomicum) .

Concomitent acestor transformări, embrionul ia aspect tubular şi apoi suferă o încurbare, subforma literei “C”, ale cărei capete se apropie şi închid o parte din cavitatea blastocelică ce va devenicavitate toraco-abdominală, iar ceea ce rămâne din cavitatea blastocelică va forma extraembrionar,vezicula vitelină (ombilicală) a embrionului.

Odată realizate fenomenele de proliferare şi diferenţiere, în dezvoltarea embrionului începe onouă etapă, denumită histogeneză şi organogeneză, iar embrionul îşi continuă dezvoltarea devenindfetus (foetus). Cele trei foiţe embrionare îşi schimbă denumirea în ectoderm, endoderm şi mezoderm.

9.4.Anexele embrionare şi fetale

Sunt formaţiuni morfologice cu rol în protecţia, nutriţia şi epuraţia embrionului şi fetusului. Elesunt o continuare în exteriorul embrionului a componentelor embrionare (ectoderm, endoderm şimezoderm), alcătuind, în totalitatea lor, aria extraembrionară.

Anexele embrionare şi fetale (membranae fetales) sunt reprezentate de: a) vezicula vitelină(sau ombilicală); b) alantoidă; c) amnios; d) corion.

9.4.1. Vezicula vitelină (ombilicală)

Vezicula vitelină sau sacul vitelin (saccus vitellinus) este anexă embrionară care derivă dinendoderm, după ce acesta înlocuieşte hipoblastul. Este despărţită de trofoblast prin lecitocel saublastocel. Ocupă o parte din spaţiul cavitatăţii lecitocelice care, odată cu încurbarea embrionului (saua ariei embrionare) se împarte în două compartimente: - un compartiment cuprins în corpul

embrionului, reprezentând intestinul primitiv (enteron primitivum) căptuşit de endoderm; şi - uncompartiment mai spaţios, situat extraembrionar, care va forma vezicula ombilicală, căptuşită deendodermul extraembrionar, ce delimitează cavitatea vitelină (cavum vitellinum). Comunică cu

175



intestinul embrionar prin canalul ombilical (vitelin) (ductus pedunculi vitellini), care străbate peduncululvitelin (pedunculus vitellinus), de legătură cu embrionul şi fetusul. Peretele vezicii viteline este formatdin două straturi: unul intern, format de celulelele endodermale ( care au înlocuit hipoblastul) şi altulextern format din splanchnopleură (din mezoderm extraembrionar). Aici celulele mezenchimale se segrupează şi formează insule sanguine (hemato- şi vasculo-formatoare).

În etapa timpurie a embriogenezei îndeplineşte rolul de organ vasculo şi hematoformator,

precum şi de rezervor de substanţe nutritive, regresând ulterior.9.4.2. Amniosul

Amniosul (amnion) se formează (amniogenesis) din îndoiturile ectodermului şi alasomatopleurei care îl căptuşeşte, cute ce apar în urma “coborârii” embrionului în cavitatealecitocelică. În acest mod se formează patru cute (plica limitans): anterioară, posterioară şi douălaterale, care se vor suda în planul median, delimitând o cavitate amniotică (cavum amnii) întreectodermul embrionar şi foiţa amniotică realizată. În lichidul amniotic (liquor amnioticus) pluteşteembrionul şi apoi fetusul căruia-i conferă atât mobilitate cât şi protecţie. (Fig.9.30)

9.4.3. Alantoida

Este o anexă formată din endoderm şi splanchnopleură. Se dezvoltă (allantogenesis) dinendodermul intestinului caudal, care prin proliferare şi evaginare generează iniţial un mugurealantoidian digitiform (processus allantoicus). Pe măsură ce mugurele embrionar creşte, seinsinuează şi se interpune între amnios şi vezicula ombilicală, reducând spaţiul ocupat de cavitateavitelină şi antrenând cu el şi splanchnopleura care ocupă intestinul primitiv.

Fig.9.30. Formarea anexelor embrionare la păsări1- Ectoblast; 2- Endoblast; 3- Mezoblast; 4- Cavitate amniotică; 5- Alantoidă;6- Veziculă ombilicală; 7- Vitelus; 8- Splanchnopleura; 9- Intestin primitiv;

10- Somatopleura.

Alantoida rămâne legată de locul de origine printr-un pedicul , străbătut de canalul urac (urachus),denumit şi canal alantoidian (ductus allantoicus). În splanchnopleura, ce acoperăendodermul se dezvoltă o bogată reţea vasculară ce se va conecta la vasele viteline pe care le înlocuieşte treptat, alcătuind cea de-a doua circulaţie fetală (circulaţia alantoidiană) ce cuprinde douăartere şi două vene alantoidiene.

Cavitatea (vezicula) alantoidiană (cavum allantoicum), plină cu lichid, este delimitată de douăfoiţe: una internă, în contact cu amniosul (allantoamnion) şi alta externă, în contact cu corionul(allantochorion).

9.4.5.Corionul

176



Cea mai externă anexă (învelitoare) din aria extraembrionară, corionul, provine dinmicromerele morulei . După dispariţia membranei pelucide, acestea vor forma corionul primar (chorion primarium) sau procorionul sau trofoblastul . Pe suprafaţa sa externă prezintă vilozităţi (villi chorii primarii) ce sunt repartizate în diferite moduri, în funcţie de specie.

O vilozitate corială este constituită din: axul conjunctiv de ţesut lax şi din trofoblastul care

acoperă axul conjunctiv. Trofoblastul este format din două rânduri de celule, morfologic distincte:citotrofoblastul şi sinciţiotrofoblastul.Sinciţiotrofoblastul (syncytiotrophoblastus), stratul extern, are o culoare mai închisă şi

numeroşi nuclei dispersaţi într-o masă de citoplasmă, fără limite celulare. Citoplasma are un aspectspumos, conţine lipide, colesterol şi mucopoliglucide şi prezintă un citoschelet filamentos.

Are aspectul unui epiteliu cubic simplu, cu margine în perie. Examinată la microscopulelectronic, marginea în perie prezintă microvilozităţi dispuse la intervale de 8-20 nm. Microvilozităţilenu sunt structuri rigide, prezentând lungimi ce variază între 1-2 µm şi un diametru de 150-250 nm.

Nucleii sinciţiotrofoblastului apar deseori grupaţi, polimorfi, prezentând un nucleol excentric,cu citoplasma clară şi cromatina granulară, răspândită neuniform.

Citotrofoblastul (cytotrophoblastus) (stratul intern sau stratul celular Langhans) cuprindecelule mari cu limite celulare distincte, cu nuclei veziculoşi, cu nucleoli evidenţi, cu citoplasmă clară,cu numeroase mitocondrii, reticul endoplasmic rugos, complex Golgi perinuclear, numeroase

microvezicule şi granule cu fier. La limita cu sinciţiotrofoblastul prezintă numeroşi desmozomi.Membrana bazală a trofoblastului are un aspect neregulat, discontinuu şi o grosime de 150nm. Este despărţită de polul bazal al celulelor citotrofoblastice printr-un spaţiu de 25 nm, plin de omasă amorfă cu o densitate electronică scăzută.

Axul conjunctiv al vilozităţii coriale este format din ţesut conjunctiv embrionar, cu celulemezenchimatoase stelate. Cuprinde o arteriolă care se capilarizează sub membrana bazală aepiteliului vilozităţii. Din ţesătura de capilare se desprinde o venulă care va fi colectată de venelemembranei coriale. Endoteliul acestora, extrem de fin, este înconjurat de fibre delicate, ce aparţinţesutului conjunctiv embrionar al axului vilozităţii.

9.4.5.Particularităţi ale anexelor embrionare şi fetale la mamifere

Vezicula vitelină are o dezvoltare redusă, rolul său nutritiv limitându-se la fazele timpurii ale

embriogenezei, datorită faptului că ovulele mamiferelor sunt oligolecite. După atrofia veziculei viteline,se menţine o formaţiune vestigială, denumită “diverticulul Meckel”.Prezintă o funcţie vasculoformatoare şi hematoformatoare timpurie. Astfel, celulele

mezoblastice din peretele veziculei viteline vor forma insule vasculo şi hemato-formatoare (insuleleWolff şi Pander) (insulae sanguineae). Aici apar primele elemente figurate sanguine şi reţeauaextraembrinară de capilare, care se va conecta la circulaţia sanguină intraembrionară. Circulaţiavitelină a embrionilor, denumită şi omfalomezenterică, va fi înlocuită treptat cu circulaţia placentară,iar hematopoeza este preluată de ficat.

Anexele embrionare si fetale

Anexa Origine în: Structuri Formaţiuni specificeCorion Micromerele morulei Sinciţiotrofoblastul

CitotrofoblastulMembrana bazală

Vilozităţi coriale

Alantoida Endoderm Cavitatea alantoidianăSplanchnopleurăReţea vasculară

Canalul urac

Veziculaombilicală(vitelină)

Endoderm Compartimentintraembrionar Compartimentextraembrionar

Canal ombilical(vitelin)

Amniosul Ectoderm Cavitate amnioticăLichid amniotic

Cute amniotice

La mamiferele cu schizamnios (primate, cobai, arici, liliac) vezicula ombilicală este mairedusă decât la mamiferele cu plectamnios (rumegătoare, carnivore, rozătoare).

Amniosul se formează foarte timpuriu. Modul de formare a amniosului diferă în funcţie demodul de implantare (nidaţie). Formarea poate avea loc în două moduri: prin plicaturare ( plectamnios)şi prin clivaţie (schizamnios). Prin plicaturarea ectodermului se formează amniosul la leporide,

177



carnivore, suine şi rumegătoare, unde nidaţia este de tip central. La hominide şi la alte specii demamifere (cobai, arici,liliac,tatu),unde nidaţia este de tip interstiţial, formarea amniosului are loc înfaza de embrion diblastic (gastrodisc) printr-un proces de clivaj orizontal al celulelor ectoblastului.Rândul superior va forma amniosul, iar spaţiul dintre cele două straturi de celule ectoblastice vagenera cavitatea amniotică, în care se va acumula lichid amniotic . La mamiferele cu nidaţie de tipexcentric, într-o primă fază apare un scizamnios,care va fi înlocuit de un plectamnios.

Lichidul amniotic, înghiţit de fetus, este resorbit în intestin, ajunge în circulaţia fetalăalantoidiană şi, prin traversul placentei, în circulaţia maternă, dar nu pătrunde în căile respiratorii.Este mucilaginos, limpede şi sporeşte cantitativ în prima parte a gestaţiei. Acumularea de lichidamniotic este mai lentă în a doua parte a gestaţiei, când lichidul devine tulbure şi conţine păr, celuledescuamate etc. În apropierea parturiţiei este galben datorită meconiului format din luna a şaptea degestaţie.

Amniosul mamiferelor se dezvoltă foarte mult, revenindu-i mai multe roluri: - de protecţie aembrionului împotriva şocurilor mecanice; - de lubrefiere a căilor de expulzare a fetusului şi decurăţirea a acestora de bacterii şi miceţi; -rol trofic, fiind bogat îăn apă, săruri minerale, proteine;-rolmetabolic întervenind în glicogeneză (la rumegătoare) şi în lipogeneză; -rol de depozit pentruproduşide dezasimilaţie (acid uric,uree). Gradul de dezvoltare al amniosului, respectiv suprafaţa şivolumul de lichid amniotic (raportat la talia speciei) creşte progresiv la marsupiale, la carnivore, larumegătoare şi la primate.

La iapă, amniosul începe să se formeze la 21 de zile, iar cantitatea de lichid ajunge la 3-7 litri,formând a “doua pungă a apelor”. La rumegătoare, la nivelul amniosului se descriu formaţiuni, cuformă neregulată, denumite plaje amnitotice cu rol neelucidat, (probabil glicogenogenetic).Plajeleamniotice lipsesc la scroafă şi căţea, iar la iapă şi oaie sunt rar înrtâlnite.

La scroafă, lichidul amniotic, ajunge la 40-300ml, dar scade după săptămâna a 12-a degestaţie, iar la carnivore (căţea şi pisică) la parturiţie rămân numai câteva picături (8-30 ml).(Fig.9.31)

Fig. 9.31. Schema unui fetus de mamifer, împreună cu anexele sale1- Fetus; 2- Intestin primitiv; 3- Cordon ombilical; 4- Cavitate amniotică; 5- Alantoida;6- Vezicula vitelină; 7- Corion; 8- Vilozitate corială.

Alantoida prezintă un grad de dezvoltare ce diferă foarte mult în raport cu specia. Astfel,există specii cu: a) alantoida redusă la un diverticul “în deget de mănuşă” (la primate); b)alantocorion, în care alantoida apare ca o pungă aplatizată, a cărei faţă internă acoperă aproape în

178



totalitate amniosul ( la mamiferele aplacentare); c) amniocorionul , la care alantoida acoperă numaiparţial amniosul, aceasta venind în contact cu corionul. Foiţa externă a alantoidei va căptuşi corionulpe o suprafaţă mai mare sau mai mică.

La mamifere, alantoida prezintă trei zone: 1) zona intraembrionară, din care se va formavezica urinară; 2 ) zona mijlocie, din care va rezulta canalul urac, zona este cuprinsă în cordonulombilical; 3) zona extraembrionară sau sacul alantoidian propriu-zis, interpus între amnios şi corion.

Lichidul alantoidian apare înainte ca rinichii fetali să devină funcţionali. Este limpede, apos,brun gălbui. Conţine albumină, fructoză şi uree, deoarece filtratul renal fetal ajunge în saculalantoidian prin canalul urac. La vacă, iapă, oaie,capră şi scroafă, se întâlnesc “calculi alantoidieni”(formaţi din detritusuri celulare, fosfat de calciu şi mucoproteine)ceplutesc în lichidul alantoidian.

La mamifere, reţeaua vasculară alantoidiană (a doua circulaţie embrionară) este maidezvoltată decât la păsări şi participă la realizarea circulaţiei placentare. La vârsta de 2 luni (la ecvine,taurine), circulaţia vitelină este complet atrofiată şi înlocuită de circulaţia alantoidiană.

Din fuzionarea mezodermului extraembrionar ce acoperă alantoida cu troblastul se formeazăcorionul alantoidian ce găzduieşte o reţea vasculară bogată ce asigură conexiunea între endometrumaternal şi reţeua vasculară alantoidiană.

Alantoida îndeplineşte la mamifere mai multe roluri: -de rezervor de substanţe toxice şideşeuri metabolice; - organizator al reţelei vasculare embrio-fetale ce înlocuieşte reţeaua vascularăvitelină; -furnizează mezenchim pentru axul vilozităţilor coriale;- pregăteşte şi lubrefiază tractusul

genital pentru parturiţie; - participă la formarea cordonului ombilical.Cordonul ombilical face legătura dinte placentă şi fetus. La structurarea lui participă: vezicavitelină cu canalul ombilical, alantoida cu canalul alantoidian, peretele sacului amniotic adiacent zoneiombilicale, mezodermul extraembrionar (celule mezenchimale, substanţă fundamentală mucoidă-gelatină Wharton”), arterele şi venele ombilicale. Lungimea cordonului ombilical este, în medie de 50-60 cm la iapă, 30-40 cm la bovine, 25 cm la scroafă, 8-12 cm la căţea şi pisică. La rumegătoare şicabaline în cordonul ombilical sunt prezente şi fibre musculare netede, care produc vasoconstricţie înmomentul parturiţiei.

La iapă, mugurele alantoidian apare la 21 de zile şi ajunge în contact cu corionul la 55-60 dezile, când are reţeaua vasculară dezvoltată şi înlocuieşte circulaţia vitelină (omfalo-mezenterică) pânăla 70-80 de zile. Cantitatea de lichid alantoidian ajunge la 8-18 litri, fiind clar şi constituit iniţial dintranssudat sanguin. În apropierea parturiţiei, din cauza urinii fetale devine gălbui murdar.

La scroafă, alantoida lipseşte în mare parte la nivelul zonei centrale, unde amniosul, venind

în contact cu corionul, realizează un amniocorion. Cantitatea de lichid alantoidian creşte (ajunge la100-200 ml), până la jumătatea gestaţiei, după care se resoarbe treptat, devenind de culoare brun-murdar şi, la parturaţie, rămânând doar câţiva mililitri.

La rumegătoare, alantocorionul se găseşte pe cea mai mare parte a suprafeţei, exceptândzona centrală, unde predomină amniocorionul (ca la scroafă).

La căţea şi pisică, alantoida separă complet amniosul de corion (alantocorion). Cantitatea delichid alantoidian ajunge la 40-110 mililitri (la căţea),iar la pisică este între 5-15 ml.

Corionul la mamifere prezintă vilozităţi coriale primare, cu aspect de formaţiuni filiforme saudigitiforme orientate spre exterior. Concomitent cu vascularizarea şi dezvoltarea alantoidei, vilozităţilecoriale primare se repartizează diferit, în raport cu specia, se vascularizează şi pătrund în criptelemucoasei, devenind vilozităţi coriale secundare şi participând la constituirea placentei. Astfel, ovilozitate corială secundară este o prelungire a corionului ( trofoblast cu mezoderm extraembrionar) încare au pătruns vasele alantoidiene (în cazul alantocorionului ) sau vasele viteline (în cazulomfalocorionului

).Vilozităţile coriale secundare pot fi răspândite: a) difuz , cu răspândire uniformă completă (petoată suprafaţa), la iapă sau incompletă (lipsind la capetele corionului), la scroafă; b) zonal , sub formaunui brâu circular median, la carnivore; c) grupate în formaţiuni denumite cotiledoane, larumegătoare; d) discoidal , sub forma unei zone circulare la rozătoare şi primate.

Vilozităţile coriale lipsesc la marsupiale, care au un corion avilos şi sunt denumite mamifereaplacentare.

La iapă, corionul este căptuşit în întregime de alantoidă, după 55-60 de zile, când apare şicirculaţia placentară. Complexul corio-alantoidian prezintă cute care se pot desprinde, cad în lichidulalantoidian şi constituie hipomamele. Corionul are un aspect catifelat, datorită vilozităţilor fine(microcotiledoane), dispuse uniform pe toată suprafaţa sa. La nivelul contactului corio-alantoidian potapare depuneri de fosfat de calciu, denumite plăci opace.

La scroafă, sacul corial este iniţial alungit-fusiform, (măsurând 15 mm la 17 zile) după care sescurtează (prin necroza extremităţilor) şi se dilată după 20 de zile. Vilozităţile lipsesc la capetelesacilor corionici.

179



La vacă, sacul corial fusiform ajunge la 50-60 cm lungime. Vilozităţile coriale se grupează încotiledoane, dispuse pe 4 rânduri, fiind în număr de 80-120, în dreptul fiecărui corn uterin. În zonacentrală a sacului, corionul nu este căptuşit de alantoidă, stabilindu-se un raport amnio-corial. Înrestul suprafeţei uterine a corionului, raportul este alanto-corial. La extremităţile sale, corionul estenecrotic, ca şi la scroafă. La oaie şi capră, angrenarea vilozităţilor coriale în criptele uterine are loc îna 44-a zi de gestaţie.

La căţea şi pisică, iniţial corionul este acoperit în totalitate cu vilozităţi coriale primitive, dintrecare se dezvoltă numai cele cin zona circulară centrală (reprezentând 1/3 din suprafaţa corionului). Întotalitatea sa, corionul este căptuşit de alantoidă (alantocorion).

9.4.6.Particularităţile anexelor embrionare la păsări

La păsări, sacul vitelin (vezicula vitelină) are o importanţă mult mai mare decât la mamifere,deoarece ovula este de tip telolecit . Este prima anexă embrionară care se organizează ( din ziua atreia de incubaţie). În ziua a 5-a de incubaţie, vitelusul conţinut în vezicula ombilicală este acoperit în întregime de endodermul şi mezodermul extraembrionar, încât peretele sacului vitelin este structuratdin endoderm, membrana vitelină şi mezoderm.

În mezodermul sacului vitelin se formează insulele sanguino- şi vasculo-formatoare (Wolff şiPander), din care iau naştere celulele sanguine şi vasele primei circulaţii embrionare (circulaţia

omfalomezenterică). Această reţea vasculară transportă substanţele absorbite de către endodermulvitelin, care prezintă vilozităţi. Rezorbţia vitelusului continuă şi în primele zile după ecloziune. Tot prinreţeaua vasculară se realizează transferul pasiv al anticorpilor maternali existenţi în vitelus, precum şial unor proteine virale sau virusuri. Acest fapt permite transmiterea pe verticală (transembrionară) aunor infecţii şi vaccinarea “in ovo” , aplicată pentru imunoprofilaxia unor boli ( Boala Marek, bursitainfecţioasă aviară).

Sacul vitelin este complet dezvoltat după 5-6 zile de incubaţie şi comunică cu intestinulembrionului prin canalul vitelin (ductus vitellinus), fără ca vitelusul să treacă prin acest canal înintestin. Vestigiile canalului vitelin persistă sub forma diverticulului vitelin ( diverticulum intestinale jejuni) sau a tubercului Meckel, care prezintă o structură (cu patru tunici), asemănătoare pereteluiintestinal, şi o populaţie limfocitară şi plasmocitară bogată, încât este considerat organ limfoidsecundar.

Sacul vitelin îndeplineşte mai multe roluri, precum:-absorbţia din vitelus a substanţelor

nutritive şi plastice, necesare dezvoltarii embrionului până la ecloziune; - organizează reţeaua decapilare omfalomezenterice; - produce primele celule sanguine; - are funcţie de apărare imună localăşi generală.

Amniosul se formează de timpuriu (din a doua zi de incubaţie),prin plicaturare, fiind complet închis în ziua a treia (la găină) sau a patra (la curcă şi la gâscă) de incubaţie. Peretele amniosuluieste format din două straturi:- un strat intern, orientat către embrion, reprezentat de ectodermulextraembrionar şi altul extern, reprezentat de mezodermul extraembrionar (respectiv desomatopleură), în care vor apare vase de sânge şi fibre musculare. Fibrele musculare genereazăcontracţii ritmice.Amniosul este despărţit de corion printr-un spaţiu denumit cavitate celomicăextraembrionară (celoma extraembryonicum).

Ectodermul amniosului secretă lichidul amniotic (liquor amnioticus) care umple cavitateamniotică (cavum amnii). În acest lichid seacumulează uraţi, produşi de rinichiul

embrionar, fulgi şi secreţii ale glandelor dincavitatea bucală şi tractusul respirator. Dinziua a 5-a de incubaţie, lichidul amniotic este înghiţit de pui.

Amniosul şi lichidul amniotic asigură:-protecţia mecanică; libertate de mişcarepentru embrion; -nutriţia embrionului cu albuş,care este transferat din sacul cu albuş(albumen) – delimitat de corion – într-un canalsero-amniotic şi înghiţit de embrion;-asigurănecesarul de apă; detoxifică embrionul de uraţişi săruri minerale; stimulează funcţiile dedeglutiţie şi respiraţie. După 11 zile deincubaţie, amniosul începe să regreseze, seatrofiază şi dispare.

180



Fig.9.32. Schema unei secţiuni prin oul de găină, la începutul incubaţiei1-Camera cu aer;2- Amnios;3- Alantoidă; 4- Sacul vitelin; 5- Coaja calcaroasă; 6- Membrana cochilieră;7- Albuş; 8- Corion

Alantoida se formează începând cu a 46 ore de incubaţie, când mugurele endodermicalantoidian, detaşat din zona caudo-ventrală a intestinului părăseşte aria embrionară, devenind oveziculă (după 72 ore de incubaţie) plină cu lichid, ce comunică cu intestinul primitiv printr-un pediculstrăbătut de canalul urac. Pe măsură ce se dezvoltă, vezicula alantoidiană se insinuează între saculvitelin, amnios şi corion, antrenând splanchnopleura şi ocupând întreg celomul extraembrionar. Înconjoară albuşul pe care îl cuprinde într-un sac. Din corion se formează un diverticul tubular caretrece printre alantoidă şi sacul vitelin,devenind canal seroamniotic, prin care albuşul este transferat înamnios şi înghiţit de pui.

Mezodermul splanchnic al foiţei externe, se sudează cu somatopleura corionului, realizândmembrana corioalantoidiană , în care se dezvoltă o reţea vasculară (după 5-6 zile de incubaţie), care

se va lega de reţeaua vitelină pe care o va înlocui treptat, realizând circulaţia alantoidiană care se varacorda la circulaţia embrionarăRolul alantoidei este foarte important în a doua jumătate a incubaţieicând asigură: protecţia embrionului prin lichidul alantoidian;consumarea albuşului (rol nutritiv); excreţia metaboliţilor (prin canalulurac); respiraţia (prin intermediul circulaţiei alantocoriale, începândcu ziua a 6-a).

Corionul este anexa cea mai puţin importantă la păsări. Se formează de timpuriu, o dată cuamniosul, din partea externă a cutelor amniotice. Are origine ectodermică şi parţial mezodermică (dinsomatopleură). Este împins de alantoidă şi ajunge în contact (după 7-8 zile de incubaţie) cumembranele cochiliere şi cu alantoida, când somatopleura corionului se sudează cu splanchnopleuraalantoidei, realizând membrana corioalantoidiană (alantocorionul). Membrana corioalantoidianăasigură, începând cu zillele 9-10 de incubaţie, respiraţia embrionului prin circulaţia alantocorială şi

schimburile de apă între embrion şi mediul exterior.În timpul incubaţiei: - nutriţia se face pe seama vitelusului conţinut în vezicula ombilicală şiprin intermediul alantoidei (din sacul de albuş); -respiraţia se face prin intermediul vascularizaţieialantoidine direct din camera de aer; - excreţia se face prin alantoidă. Pe măsură ce rezerva devitelus este consumată, sacul vitelin se retractează şi dispare, închizându-se ombilicul. În momentulecloziunii puiul sparge cu ciocul resturile de alantoidă, corionul, membranele cochiliere şi coajacalcaroasă.

181

histologie an i sem 2

Documents