METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ (HPLC)

HPLC este cea mai extinsă metodă cromatografică utilizată pentru analiza analiţilor

compuşi biologic activi, fiecare clasă a acestora fiind testată separat. Spre deosebire de

tehnica LC-MS, nu oferă o certitudine 100% cu privire la identificarea analiţilor.

Principiul cromatografiei lichide

Spre deosebire de cromatografia de gaze în care faza mobilă joacă doar rolul de

“cărăuş” în transportul componenţilor prin coloană, în cazul cromatografiei de lichide,

faza mobilă participă alături de faza staţionară la procesul de separare prin interacţiuni

selective mult mai complexe (Gocan, 2002).

Cromatografia lichidă se subclasifică după tipul suportului, în cromatografie cu

fază normală (NP-HPLC) şi inversă (RP-HPLC).

Sistemele NP-HPLC utilizează o fază staţionară polară (silicagel, alumină,

celuloză, Ca(OH)2, MgCO3 ), o fază mobilă nepolară (eter de petrol, hexan puri sau în

amestec cu acetonă 1-15%), separarea având la bază adsorbţia diferită a componentelor

amestecului pe faza staţionară. Se adresează probelor preponderent nepolare, ordinea de

eluţie (caracterizată de timpul de retenţie, tR, al probei pe coloană, exprimat în minute) a

componentelor amestecului fiind :

tR componente nepolare < tR componente polare

În sistemele RP-HPLC, faza staţionară devine nepolară prin legare chimică de

octadecilsilan (C18) sau octasilan (C8), ca fază mobilă se folosesc amestecuri de solvenţi

polari (acetonitril, metanol, acetat de etil, apă), iar procesul de separare are la bază

repartiţia componentelor amestecului între faza staţionară şi eluent. Este indicat în cazul

probelor preponderent polare, ordinea de eluţie fiind:

tR componente polare < tR componente nepolare (Socaciu, 1997).

În prezent, peste 60% din totalul separărilor se realizează prin cromatografia cu

fază inversă. Popularitatea acestei tehnici rezidă în faptul că prezintă o universalitate în

separarea unor compuşi nepolari, polari şi ionici, incluzând un larg domeniu de mase

moleculare şi faptul că optimizarea separărilor se realizează relativ uşor (Gocan, 2002).

După mecanismul de separare, cromatografia poate fi: de absorbţie, de repartiţie

lichid-lichid, de schimb ionic, de excluziune sterică (gel-cromatografia) sau de afinitate

(interacţiuni hidrofobe, separări chirale).

Principalele tipuri de tehnici cromatografice, în funcţie de mecanism, fază

staţionară şi mobilă sunt redate în tabelul 1.

Tabel 1

Principalele tipuri de tehnici cromatografice

Mecanism Faza staţionară Faza mobilă

Cromatografia

de lichide

1. Adsorbţie* (CA) S1, NP-HPLC Solvenţi preponderent

nepolari

2.Repartiţie LL**(CR) Si-C8,Si-C18,RP-

HPLC

Solvenţi preponderent

polari

3.Schimb ionic***(CSI) Schimbători de ioni2 Soluţii acizi-baze

4. Excluziune sterică *** Geluri3(CES) Soluţii tampon4

5.Afinitate** şi

Interacţiuni hidrofobe

Geluri şi

Hidroxilapatită

Soluţii tampon4

Cromatografia

gazoasă

1. Adsorbţie Oţel sau răşini (GSC) Ar, He, N2 + H2

2. Repartiţie Uleiuri(GLC) Ar, He, N2 + H2

* Efectuată pe hârtie (CH), strat subţire (CSS), coloană deschisă (CC) şi coloană închisă (HPLC)

** Efectuată pe strat subţire (CSS) sau pe coloană deschisă (CC) şi închisă de oţel (HPLC)

*** Efectuată pe coloană deschisă sau închisă de sticlă la presiuni joase (LPLC- Low pressure

liquid chromatography)1Vezi faze staţionare2răşini schimbătoare de ioni de tip Amberlit, Doriex3 geluri de tip Sephadex (G50, G100, G200), Sephacryl, cu pori controlaţi

Sursa: Socaciu, 1997

Părţile componente ale unui cromatograf de lichide de înaltă performanţă sunt:

pompele ataşate la un rezervor de unde preiau eluentul (faza mobilă), un injector manual

sau un autosampler, cuptorul termostatat în interiorul căruia se află coloana

cromatografică de separare, degazorul, controller-ul, detectorul şi instrumentul de

înregistrare a semnalului furnizat de detector (fig.1).

Fig. 1. Schema generală a unui HPLC

Coloana cromatografică este componenta cea mai importantă a cromatografului,

deoarece aici este sediul procesului de separare. Eluentul, împreună cu substanţa lichidă de

analizat este pompat în coloana ce conţine faza staţionară. Are loc migrarea, cu viteze

diferite, a componenţilor amestecului de separat de-a lungul coloanei.

La ieşirea din coloană, detectorul preia continuu fluxul de solvent conţinând

componentele separate şi transformă semnalul chimic în semnal electric, înregistrat sub

forma unei cromatograme (fig. 2). Aria corespunzătoare unui semnal cromatografic este

proporţională cu concentraţia substanţei pe care acesta o determină şi această arie se poate

măsura cu un integrator, sau cu un computer. Maximele înregistrate deasupra liniei de

bază în cromatogramă poartă numele de picuri şi au forma distribuţiei normale Gauss

(Socaciu, 1997).

Fig. 2. Cromatograma unui amestec de compuşi analizaţi prin tehnica HPLC

În cazul unor amestecuri complexe, atât ca număr de componenţi, cât mai ales ca

proprietăţi diferite ale acestora, separarea în condiţii izocratice, care implică o singură fază

mobilă, este imposibilă. În aceste situaţii se apelează la eluţia cu gradient, în care se

modifică faza mobilă în timp, după un anumit program. Acest lucru se realizează prin

amestecarea a doi, trei sau chiar patru solvenţi, pentru a obţine un gradient de un anumit

profil (Gocan, 2002).

Tehnici de extracţie

Tehnica HPLC presupune o etapă de prelucrare a probei în care se realizează

extracţia şi curăţarea matricei, urmată de analiza propriu-zisă, în care analitii vor fi

separaţi şi cuantificaţi.

Pentru extracţia analiţilor de interes din matrice se folosesc tehnicile LLE (extracţie

lichid-lichid), SPE (extracţie în fază solidă) sau SFE (extracţie cu fluide supercritice).

Primele două sunt cel mai frecvent folosite. Întrucât SFE necesită echipament specializat,

nu şi-a găsit aplicaţii foarte largi.

O importanţă deosebită prezintă alegerea solventului utilizat în extracţia analitului.

În acest sens, se va ţine seama de proprietăţile termodinamice ale solventului şi solvatului:

polaritate, interacţiuni dipol-dipol, calităţi donoare sau acceptoare de H+, precum şi de

observaţiile analistului din practica experimentală. Alternanţa pH-ului are un efect

dramatic asupra solubilităţii compuşilor ionizabili. Se ştie că compuşii ionizaţi sunt mult

mai solubili in solvenţi polari (în special soluţii apoase) decât compuşii neionizaţi

(Fedeniuk şi Shand, 1998).

Metodologia LLE constă în amestecarea a două faze nemiscibile (de obicei una

organică şi una apoasă), în urma căreia analitul de interes este separat de ceilalţi

componenţi ai matricei din prima fază şi extras în cea de-a doua fază lichidă. Procedeul se

repetă de regulă de 2-3 ori, pentru a asigura o extracţie completă.

Comparativ cu LLE, extracţia în fază solidă SPE are unele avantaje: este mai

rapidă, mai reproductibilă, se obţin extracte mai curate şi necesită cantităţi de solvenţi mai

reduse. Utilizarea cartuşelor SPE implică patru paşi: condiţionarea umpluturii cartuşului;

aplicarea probei prin care analiţii de interes vor fi reţinuţi selectiv pe cartuş, în timp ce

restul compuşilor vor fi îndepărtaţi; spălarea cartuşului cu solvenţi care să îndepărteze

compuşii nedoriţi adsorbiţi la încărcarea probei; eluarea compuşilor reţinuţi pe cartuş,

utilizând un solvent care va distruge interacţiunile analit-pat adsorbant.

Există patru mecanisme generale de extracţie întâlnite în tehnica SPE:

- nepolar - grupările funcţionale utilizate sunt C18, C8, C2, fenil, ciclohexil şi copolimerul

stiren-divinilbenzen

- polar - grupările funcţionale utilizate sunt: cianopropil, diol şi aminopropil

- schimbător de ioni - coloanele schimbătoare de ioni se împart în coloane schimbătoare de

anioni şi cationi. Grupările schimbătoare de cationi pot fi puternic schimbătoare (derivaţii

acidului sulfonic) sau slab schimbătoare (derivaţii acidului carboxilic). Grupările

schimbătoare de anioni pot fi deasemenea puternic schimbătoare (aminele cuaternare) sau

slab schimbătoare (aminele primare, secundare şi terţiare).

-covalent - interacţiunile de tip covalent depind de structura chimică a analitului. Un

exemplu ar fi utilizarea derivaţilor boratului pentru extracţia compuşilor cu două grupări

vecine hidroxil.

Cartuşele SPE cu o singură grupare funcţională prezintă dezavantajul că nu pot fi

folosite pentru analiza multireziduală, structura chimică a analiţilor fiind diferită.

Utilizarea mai multor cartuşe SPE cu structuri ale umpluturii diferite a fost aplicată cu

succes în pregătirea probei, dar timpul de analiză a fost mult mai mare. De aceea, s-a

încercat folosirea unor cartuşe SPE cu amestec de faze, care combinau grupările nepolare

cu cele schimbătoare de ioni (Oka şi col., 1987). Acestea, prezentau avantajul utilizării

unui singur cartuş pentru mai mulţi analiţi cu proprietăţi chimice diferite. Dar, datorită

faptului că extracţiile nu erau reproductibile, particulele umpluturii nefiind distribuite

omogen, s-a revenit la cartuşele SPE cu o singură fază.

S-a încercat deasemenea crearea unui tip de cartuş SPE care utiliza carbonul

grafitic poros (PGC). În acest caz, particulele PGC se caracterizau printr-o distribuţie

omogenă, dar capacitatea lor de adsorbţie era mai redusă. Deşi erau multifuncţionale,

având capacitatea de a reţine atât analiţi polari cât şi nepolari, principala problemă era

aceea că adsorbţia compuşilor era foarte puternică, în unele cazuri ireversibilă.

Principiul extracţiei SPE se bazează pe teoria cromatografiei. Alegerea variantei de

extracţie a analiţilor se va face ţinând cont de natura şi particularităţile matricei.

Detectori utilizaţi în cromatografía lichidă

Pentru cromatografia de lichide au fost create două tipuri de detectori care sunt astăzi

folosiţi în mod curent:

Detectorii bazaţi pe proprietatea componentului sunt sensibili la unele proprietăţi

chimice ori fizice. Din această categorie fac parte detectorii spectrofotometrici de

absorbţie UV-Vis, de fluorescenţă, electrochimici şi spectrometrul de masă. Se pot

atinge sensibilităţi remarcabile, selectivitate bună şi permit eluţia cu gradient.

Detectorii bazaţi pe proprietatea de volum funcţionează prin măsurarea unor

proprietăţi fizice ale componentului în efluent în comparaţie cu eluentul. Astfel de

detectori se bazează pe măsurarea indicelui de refracţie, a constantei dielectrice şi a

conductivităţii. Sunt foarte sensibili la variaţii de temperatură şi nu sunt

recomandaţi pentru eluţia cu gradient (Gocan, 2002).

Există posibilitatea creşterii selectivităţii şi sensibilităţii detecţiei prin tehnicile de

derivatizare pre- şi post-coloană.

Detectorii sunt selectivi, ei nu răspund la toate moleculele existente într-un

amestec, ci numai la anumite molecule sau clase de compuşi. În cromatografia lichidă nu

există un detector universal şi de înaltă sensibilitate, aşa cum este de exemplu detectorul

de ionizare cu flacără (FID) din cadrul cromatografiei gazoase, în schimb detectorii din

cromatografia lichidă acoperă un număr mult mai mare de substanţe.

Caracteristicile detectorului cromatografic ideal:

răspuns independent de compoziţia fazei mobile, debit, temperatură

sensibilitate mare

selectivitate

răspuns rapid

zgomot de fond scăzut

non-destructiv pentru probă

domeniu dinamic liniar mare

stabilitate într-un timp îndelungat de operare

Detectorii ce au la bază absorbţia în ultraviolet (UV)-vizibil (Vis) sunt cei mai

populari detectori utilizaţi în cromatografia de lichide şi sunt practic insensibili la variaţii

de debit şi temperatură. Pentru a se utiliza un asemenea detector, este necesar ca

componentele de analizat să manifeste absorbanţe suficient de mari în domeniul spectral la

care funcţionează detectorul, iar eluentul să fie transparent în domeniul spectral respectiv

(Gocan, 2002). Exista mai multe tipuri de detectori UV-Vis şi-anume:

detectori cu o singură lungime de undă, care folosesc ca sursă de lumină UV o lampă

de mercur la presiune joasă, având o energie înaltă de emisie la 254nm. Prezintă un

zgomot de fond redus, dar componentul trebuie să aibă o absorbanţă acceptabilă la

această lungime de undă.

spectrometre cu lungime de undă variabilă, care au sursă spectrală continuă de înaltă

energie stabilă reprezentată de lampa cu deuteriu (190-400nm). Pentru domeniul

vizibil (350-800nm) s-a introdus lampa de tungsten. Prezintă avantajele: poate fi aleasă

lungimea de undă optimă (adică corespunzătoare absorbanţei maxime), poate fi aleasă

absorbanţa cea mai bună în raport cu eluentul sau cu compuşii care interferă, putând fi

selectată continuu, din întreg domeniul UV. Acest tip de detector poate fi utilizat şi ca

un spectrofotometru pentru înregistrarea spectrului unui anumit component ce urmează

a fi identificat prin compararea acestui spectru cu cel din biblioteca de date.

detectori cu serie de fotodiode, care prezintă facilitatea că întreg domeniul spectral este

înregistrat continuu, la intervale de timp de microsecunde, iar datele stocate pot fi

folosite în diferite moduri şi la date ulterioare, fără a fi necesară repetarea separării.

Există situaţii în care amestecul de separat este complicat şi timpul de retenţie nu

este suficient pentru a caracteriza fiecare component. Unele substanţe organice au timpi de

retenţie identici, fapt ce conduce la erori de interpretare datorită suprapunerii semnalelor.

Astfel, este universal recunoscut că cea mai bună metodă de identificare şi caracterizare a

fiecărui component separat prin cromatografie constă în înregistrarea spectrului său de

masă. Spectrometrul de masă (MS) este detectorul care permite identificarea prin

compararea electronică a spectrului oricărei specii moleculare cu spectrele etalon din

biblioteca de spectre.

Spectrometrul de masă se bazează pe principiul că ionii de diferite greutăţi

(indiferent de modul lor de formare) după accelerarea într-un câmp electric, supuşi acţiunii

unui câmp magnetic perpendicular pe direcţia lor de deplasare, vor fi deviaţi mai mult sau

mai puţin în funcţie de masa şi sarcina lor (Oprean, 1974). În figura 3 este redată schema

de principiu a unui spectrometru de masă.

Fig. 3. Schema de principiu a unui spectrometru de masă

Spectrometrele de masă sunt alcătuite din trei componente de bază:

- sursa de ioni sau camera de ionizare

- analizatorul de ioni

- detectorul sau colectorul de ioni, la care se adaugă sistemul de introducere a probei şi

înregistratorul.

Sursa de ioni constituie partea cea mai importantă a unui spectrometru de masă,

fiind locul unde se petrece transformarea moleculelor neutre în ioni pozitivi (alături de alte

particule negative sau neutre). Analizatorul de ioni separă ionii proveniţi din camera de

ionizare în funcţie de raportul dintre masa şi sarcina acestora (m/z). Ionii cu aceeaşi

valoare m/z formează în colector un curent slab care este trimis spre amplificator şi apoi

înregistrat (Oprean, 1974).

METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE CUPLATE CU SPECTROMETRIE

DE MASĂ (LC-MS)

LC-MS este o tehnică cu multe aplicaţii datorită sensitivităţii şi specificităţii

sale foarte ridicate, având utilizări atât calitative cât şi cantitative: identificarea

compuşilor necunoscuţi, determinarea compoziţiei izotopice moleculare,

determinarea structurii în funcţie de fragmentare şi cuantificarea compuşilor din

diferite probe (http://en.wikipedia.org/wiki/Shimadzu_Scientific).

Pe parcursul anilor, sistemele LC-MS au suferit transformări semnificative,

pornind de la analize simple ca un înlocuitor al tradiţionalului UV şi ajungând la

analize calitative şi cantitative foarte exacte. Aceste sisteme şi-au găsit largi

aplicaţii în analiza alimentară, farmaceutică, a mediului şi în criminalistică.

Prin cuplarea cromatografului de lichide cu spectrometrul de masă s-a

obţinut un instrument de analiză performant capabil să separe, să identifice şi să

cuantifice componenţii din cele mai complexe probe.

Pentru utilizarea spectrometrului de masă ca detector în cromatografia de

lichide, problema principală este realizarea unei interfeţe eficiente care să

soluţioneze două incompatibilităţi majore:

- faza mobilă este un lichid, adesea conţinând proporţii semnificative de apă, care

este pompat prin coloană cu un debit de ordinul ml/min, în timp ce spectrometrul de

masa operează sub un vid de 10-6 torr. Astfel, este imposibilă trecerea directă a

eluentului din coloana HPLC în sursa spectrometrului şi rolul interfeţei este de a

îndepărta faza mobilă. Interfaţa asigură trecerea analiţilor din soluţie în stare de

vapori.

- majoritatea analiţilor separaţi prin HPLC sunt nevolatili şi/sau nestabili termic şi

prin urmare nu pot fi supuşi ionizării electronice sau chimice. A fost necesară

dezvoltarea unor metode alternative de ionizare (Ardrey, 2003).

Principalele interfeţe utilizate în cuplarea unui LC cu un MS sunt:

cu introducerea directă a efluentului

curgere continuă cu bombardament atomic rapid

cu bandă transportoare

cu pulverizare la temperatură (thermospray)

cu electropulverizare (electrospray)

cu pulverizarea efluentului într-un curent de gaz la cald combinată cu o ionizare

chimică la presiunea atmosferică (APCI) sau cu fotoionizare la presiunea

atmosferică (APPI) (Gocan, 2002).

Principiul cromatografiei lichide cuplate cu spectrometrie de masă

După extracţie şi purificare, proba de analizat este preluată din dispozitivul

de introducere a probei de către faza mobilă şi introdusă în coloana cromatografică

ce conţine faza staţionară. Aici are loc separarea componenţilor care, datorită

distribuţiei diferenţiate între cele două faze, vor migra cu viteze diferite de-a lungul

coloanei. Pe măsură ce componenţii amestecului sunt eluaţi din coloană, ei sunt

trecuţi în spectrometrul de masă.

Alegerea fazei mobile are o mare importanţă în obţinerea unor bune

separări. Tampoanele sunt folosite în cromatografia lichidă pentru a controla gradul

de ionizare al analitului şi implicit simetria semnalului şi reproductibilitatea

retenţiei. Cele mai des utilizate sunt cele anorganice, nevolatile cum ar fi fosfatul de

potasiu sau sodiu. Unul dintre rolurile interfeţei LC-MS este acela de a îndepărta

faza mobilă, lucru ce duce la depunerea nedorită a moleculelor de tampon în

interfaţă şi sursa ionică a spectrometrului. Consecinţa este reducerea performanţei

detectorului. Drept urmare, sunt de preferat metodele care implică utilizarea

tampoanelor volatile, cum ar fi acetatul de amoniu. Compoziţia şi parametrii fazei

mobile (punct de fierbere, tensiune superficială, conductivitate) pot afecta

funcţionarea diferitelor interfeţe. De mare importanţă este degazeificarea fazei

mobile pentru a preveni formarea de bule în cadrul interfeţei LC-MS. Solvenţii

trebuie să fie de puritate înaltă, pentru a nu da naştere la un fond spectral

semnificativ ce ar putea îngreuna interpretarea datelor (Ardrey, 2003).

Spectrometria de masă este o metodă ce permite obţinerea ionilor, separarea

acestora în funcţie de raportul dintre masă şi sarcină (m/z) precum şi înregistrarea

lor. În spectrometria de masă pot fi studiate numai particule gazoase. Fasciculul

molecular gazos este trimis în camera de ionizare, unde va fi bombardat de un flux

de electroni a căror energie e cuprinsă între 10-100 eV. În urma ciocnirii

moleculelor cu electronii, se formează specii moleculare cu energie mărită.

Moleculele pot ceda surplusul de energie fie prin schimbarea configuraţiei lor

electronice, fie prin radiaţie. În cazul când schimbarea configuraţiei electronice are

lor prin emisie de electroni, se formează ioni moleculari pozitivi (M+), în timp ce

schimbarea configuraţiei prin câştig de electroni duce la formarea de ioni moleculari

negativi (M-).

M - e- M+

M +e- M-

Procesul de formare al ionilor moleculari pozitivi este de aproximativ 104 ori

mai probabil.

Dacă energia fluxului de electroni depăşeşte cu mult energia necesară

ionizării (potenţialul de ionizare), molecula se fragmentează în ioni pozitivi,

negativi, radicali şi molecule neutre simple. Pentru a împiedica ciocnirile între

particulele pozitive pe de o parte, sau între acestea şi moleculele neionizate pe de

altă parte, întreaga incintă a camerei de ionizare, a sistemului de separare şi a

colectorului e menţinută sub un vid de 10-6 torr.

Radicalii şi moleculele neutre formate sub impactul electronic sunt evacuaţi

de către pompele de vid, iar ionii pozitivi sunt acceleraţi de-a lungul tubului

analizorului de ioni aflat în câmp magnetic. Ionii descriu o traiectorie circulară a

cărei rază e proporţională cu masa lor. Prin varierea continuă fie a câmpului

magnetic, fie a potenţialului accelerator, se realizează treptat condiţiile ca ionii de

toate mărimile m/z să focalizeze şi să ajungă la detector. După detectare-

amplificare, curentul de ioni este înregistrat de către înregistrator, care furnizează

astfel spectrul de masă (Oprean, 1974).

Spectrele de masă sunt spectre de linii, adică semnalul generat de ion apare

sub forma unei linii numite şi pic. În figura 4 sunt ilustrate tipurile de linii din

spectrul de masă al unui compus organic.

Fig. 4. Tipuri de linii în spectrul de masă al unui compus organic

Dacă o moleculă conţine doar atomi formaţi dintr-un singur izotop de

abundenţă naturală de 100%, linia de la valoarea m/z cea mai mare corespunde

ionului molecular. Majoritatea atomilor au mai mulţi izotopi, ceea ce determină

apariţia de linii la valori mai mari decât cea corespunzătoare ionului molecular.

Aceste linii se numesc linii izotopice sau picuri izotopice.

Cel mai înalt pic din spectrul de masă se numeşte pic de bază (linie de bază)

şi corespunde ionilor cu viaţă lungă, care ajung la detector în cea mai mare

cantitate. Acesta poate fi identic cu picul molecular sau poate fi un pic generat prin

fragmentarea ionului molecular. Intensitatea procentuală relativă se consideră de

100% pentru picul de bază, iar intensităţile relative a celorlalte picuri se determină

în raport cu picul de bază. Cunoaşterea intensităţii procentuale relative permite

cunoaşterea abundenţei procentuale relative pentru fiecare specie de ioni din

spectrul de masă.

Pe lângă linia ionului molecular şi a liniilor izotopice, spectrul de masă mai

conţine şi alte linii datorate ionilor (cationi sau radicali cationici) de fragmentare.

Fragmentarea ionului molecular în spectrul de masă se face după anumite reguli

specifice fiecărei clase de compuşi.

Spectrometrul de masă poate fi utilizat în două moduri:

modul “scan” (scanare completă), în care se monitorizează toţi ionii dintr-un

anumit interval al fragmentelor de masă. Tehnica are sensibilitate redusă şi se

foloseşte la determinarea compuşilor necunoscuţi a unei probe. Deasemenea,

când se realizează dezvoltarea unei metode în laborator, este indicat să se

efectueze mai întâi analiza în modul “scan” pentru a determina timpii de

retenţie şi amprentele spectrale ale analiţilor de interes.

modul “sim” (monitorizarea ionului selectat), în care se introduc în metodă

numai fragmentele de masă ale compuşilor urmăriţi şi numai acele fragmente

sunt detectate de MS. Avantajele modului “sim” sunt: limita de detecţie e mai

joasă, interferenţele matriceale sunt mai mici şi poate confirma identificarea

unui compus dacă raţia ionilor obţinută este comparabilă cu cea dată de

standardele de referinţă.

Cromatograful de lichide poate fi deasemenea cuplat cu două sau multiple

stadii de analiză de masă (LC-MS/MS respectiv LC-(MS)n ). Acest mod de operare

poate fi foarte folositor la identificarea unor substanţe necunoscute şi anume în

cazul în care s-a utilizat o ionizare blândă, se vor produce predominant ionii [M+H]+ . Acest spectru este sărac în informaţii, din acest motiv fiind nevoie de o a doua

etapă de analiză MS (Gocan, 2002).

Tehnici de ionizare

Producerea ionilor în spectrometrul de masă se poate realiza în mai multe

moduri (Gocan, 2002):

Ionizare electronică (electron ionization, EI)

Ionizare chimică (chemical ionization, CI)

Pulverizare electronică (electrospray ionization, ESI)

Pulverizare termică (thermospray, TSP)

Ionizare chimică la presiune atmosferică (atmospheric-pressure chemical

ionization, APCI)

Ionizare prin bombardament cu atomi rapizi (fast atom bombardment, FAB)

Ionizare prin desorbţie asistată laser din matrice (matrix assisted laser desorption

ionization, MALDI).

Ionizarea electronică şi chimică poate fi aplicată numai probelor în fază

gazoasă. De aceea, aceste tehnici de ionizare sunt utilizate cu precădere în

cromatografia de gaze. Cromatografia de lichide este folosită la analiza unor

compuşi polari şi nevolatili şi prin urmare necesită alte moduri de ionizare.

Ionizarea electrospray constă în trecerea la presiunea atmosferică şi debit

foarte mic a unei soluţii a compusului de analizat printr-o capilară expusă unui

câmp electric foarte puternic (3-6 kV). Soluţia este transformată în picături foarte

fine (spray), înalt încărcate electric şi odată cu evaporarea solventului, încărcarea

electrică este transferată moleculei de analizat. Tehnica se aplică moleculelor foarte

polare, polimerilor şi proteinelor. Ionizarea ESI este o metodă blândă de producere

a ionilor, fără a afecta integritatea probelor. În urma ionizării, sunt produşi ioni

moleculari cvasistabili care nu sunt fragmentaţi în timpul analizei. Aceşti ioni

moleculari sunt formaţi prin ataşamentul unor ioni mic moleculari la

macromoleculele studiate ori prin sustragerea unui ion

(http://www.icmpp.ro/intranet/Prezentari/HPLC_MSD.doc).

În cazul interfeţei care utilizează pulverizarea termică, tot eluentul este

introdus prin intermediul acesteia în masa spectrometrului. Prin pulverizarea

termică, ionizarea probei poate fi obţinută fără a se recurge la folosirea unui

filament. Ionizarea thermospray se produce când un component într-o soluţie salină

este vaporizat, producând un jet supersonic de vapori încărcaţi. Pe măsură ce

solventul se evaporă şi raza picăturii se micşorează, suprafaţa câmpului pe o

picătură creşte până are loc evaporarea finală a unui ion. Spectrele de masă obţinute

prin ionizare TSP sunt simple, producând aducţi protonaţi (M+1)+ prin procedeul cu

ion pozitiv şi (M-1)- prin procedeul cu ion negativ. Temperatura joacă un rol

important şi de aceea trebuie riguros controlată şi menţinută la parametri optimi de

funcţionare a interfeţei (Gocan, 2002).

Ionizarea APCI este o tehnică în care fluxul de eluent provenit din coloana

cromatografică este dispersat în picături mici datorită temperaturii şi a unui gaz

nebulizator. Mecanismul de formare al ionilor implică un transfer de sarcină

speciilor între un ion reactiv şi o moleculă ţintă, pentru a produce un ion ţintă care

poate fi transmis către analizorul de masă. Spectrele obţinute prin APCI sunt

similare cu cele obţinute prin pulverizarea electronică prin metoda ioni pozitivi când

rezultă ionii [M+H]+, în timp ce prin metoda ioni negativi sunt produşi ionii [M-H]-.

Spre deosebire de pulverizarea electronică, APCI nu produce ioni cu sarcini

multiple şi nu este potrivită pentru analiza compuşilor cu mase moleculare mari

cum ar fi proteinele. Totuşi, datorită energiei termice mari utilizată la generarea de

ioni, APCI poate ioniza compuşi relativ nepolari, cu un domeniu al maselor

moleculare de la 100 la 2000 dalton (Gocan, 2002).

În tehnica de ionizare FAB, proba dizolvată într-o matrice lichidă (glicerina)

este bombardată cu un fascicul de atomi (Xe) de energie foarte înaltă. Ionizarea are

loc la impactul atomilor cu matricea din care sunt expulzaţi ionii compusului de

analizat. Matricea se adaugă la eluentul HPLC, de preferinţă post-coloană, pentru a

nu influenţa procesul de separare. Pentru a nu se diminua performanţa tehnicii FAB,

conţinutul matricei din faza mobilă nu trebuie să depăşească procentul de 5%, fapt

ce ar conduce la creşterea fundalului spectral (Ardrey, 2003).

Ionizarea MALDI se realizează prin impactul fotonilor de energie ridicată

asupra probei plasate într-o matrice organică solidă. Se aplică moleculelor polare,

nestabile termic, cu mase de până la 500000 dalton (Ardrey, 2003).

METODA CROMATOGRAFIEI GAZOASE CUPLATE CU SPECTROMETRIE

DE MASĂ (GC-MS)

Dacă gaz cromatografia era la început aplicată doar analizelor compuşilor

volatili, studiile ulterioare au revoluţionat chimia separărilor. În prezent, GC poate

fi utilizată atât pentru probe gazoase, cât şi pentru soluţii lichide şi solide volatile.

Dacă proba analizată este nevolatilă, se pot folosi tehnicile de derivatizare sau

piroliză GC (Grob şi Barry, 2004).

Tehnica cromatografiei gazoase cuplată cu spectrometria de masă se bazează

pe natura şi distribuţia fragmentelor moleculare rezultate prin bombardarea

componenţilor probei cu electroni de o anumită energie. Spectrometria de masă este

cea mai performantă şi sigură tehnică de identificare a compuşilor, întrucât face

posibilă compararea numerelor de masă obţinute cu numerele de masă a unor

compuşi cunoscuţi, din librăria de spectre. Datorită acestui fapt, toate metodele

bazate pe cromatografie fără utilizarea MS, trebuie confirmate prin spectrometrie de

masă, prevede Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE (Gentili şi col., 2005).

Principiul cromatografiei gazoase

Ca principiu de funcţionare, cromatografia gazoasă realizează separarea

substanţelor volatile pe baza adsorbţiei sau repartiţiei lor într-o fază staţionară

(solidă sau lichidă) şi o fază mobilă gazoasă ( un gaz sau un amestec de gaze).

În funcţie de natura fazei staţionare, gaz cromatografia se poate diviza în

cromatografie gaz-solid (GSC) şi cromatografie gaz-lichid (LGC). În primul caz,

faza staţionară introdusă în coloana cromatografică este adsorbant sau suport polar

activ, iar în al doilea caz suportul este legat chimic de o peliculă de lichid nepolar cu

tensiune de vapori mică, nevolatil la temperatura de lucru. Faza mobilă este

constituită din gaze inerte (H , N , He, Ar, CO ) care nu sunt reţinute de faza

staţionară.

Faza mobilă se deplasează de-a lungul coloanei prin porii fazei staţionare.

Dacă la capătul superior al coloanei se introduce amestecul de separat în stare de

vapori, fiecare component al amestecului va fi transportat diferenţiat de gaz,

menţinându-se un echilibru între cantitatea reţinută în faza staţionară şi cantitatea

din faza mobilă. Dintr-un amestec de substanţe, fiecare component va fi separat la

timpi de retenţie (t ) diferiţi. Efluentul care părăseşte coloana este analizat de un

detector care permite trasarea cromatogramei: variaţia concentraţiei fiecărui

component eliminat din coloană în funcţie de timpul de retenţie pe coloană sau

variaţia concentraţiei în funcţie de volumul efluentului.

Separarea se poate face în sistem izoterm şi izobar (temperatura, debitul fazei

mobile şi presiunea în coloană sunt constante) sau în sistem de gradient (variază

unul sau doi dintre parametri, de obicei temperatura coloanei sau debitul gazului

purtător). Separarea compuşilor este realizată atât de stratul activ al coloanei, cât şi

de programarea temperaturii (separarea compuşilor condensaţi în capul coloanei pe

baza punctelor de fierbere). Între factorii care pot influenţa capacitatea separării se

numără: numărul de talere teoretice din stratul cromatografic, factorul de separare şi

volumul de retenţie a componentelor (Socaciu, 2000).

Un cromatograf de gaze conţine următoarele componente principale: butelia

cu gazul transportor, injectorul, coloana de separare situată într-un cuptor

termostatat, detectorul şi înregistratorul. În figura 5 este redată schema de principiu

a unui gaz cromatograf.

Fig. 5. Schema de principiu a unui gaz cromatograf

Coloanele cromatografice sunt foarte diverse, cu lungimi, diametre,

compoziţii diferite, în funcţie de natura componenţilor de separat. Se disting două

tipuri de coloane: coloane cu umplutură ce conţin suporturi solide şi care pot fi

analitice sau preparative în funcţie de lungime şi coloane capilare construite dintr-

un tub de oţel moale sau Cu, Al, sticlă, în care pereţii interiori pot fi folosiţi ca atare,

ca fază staţionară sau pot fi tapetaţi cu o fază staţionară. Coloanele capilare sunt net

superioare celor cu umplutură, larga lor utilizare datorându-se eficienţei ridicate de

separare a acestora.

Numărul de talere teoretice este proporţional cu lungimea coloanei, deci

pentru separări optime se folosesc coloane lungi. Diametrul interior al coloanelor

este de 2-500mm pentru coloanele clasice şi <1mm pentru coloanele capilare.

Diametrul interior influenţează viteza optimă a gazului transportor, capacitatea de

lucru a coloanei şi cantitatea maximă de material separat. Cu cât diametrul coloanei

este mai mic, separarea este mai performantă. Umplutura coloanelor clasice depinde

de tipul cromatografiei, astfel în GSC se folosesc faze staţionare active: cărbune

activ, silicagel, alumină, site moleculare, zeoliţi, sticlă poroasă, silicat de Mg.

Întrucât energiile de absorbţie sunt mai mari decât energiile de disociere, analiza se

realizează la temperaturi mai mari decât în GLC. Faza staţionară în GLC este

constituită dintr-un suport inactiv, poros (suprafaţa specifică de 1-10 m /g)

impregnat 5-20% cu un lichid. Faza staţionară astfel constituită este repartizată

uniform ca peliculă subţire pe pereţii coloanei, pentru a opune rezistenţă cât mai

mică amestecului de separat. Suporturile poroase folosite sunt: Chromosorb W sau

P, celita, pământul de diatomee, produsele Brique C , iar suporturile mai puţin

poroase sunt: bile de sticlă, pudra de teflon, grafit, polietilenă microporoasă.

Înălţimea unui taler teoretic este proporţională cu diametrul particulelor. Este

important ca particulele să aibă dimensiuni apropiate. Pentru a elimina proprietăţile

absorbante ale suportului se pot face tratamente chimice cu dimetildiclorsilan sau

acoperirea suportului cu polivinilpirolidonă (PVP), cu teflon sau argintare.

În alegerea fazei staţionare trebuie să se ţină seama de tipul substanţelor de

separat (polaritate, legături de hidrogen, etc.), de interacţiunile chimice posibile cu

faza staţionară sau faza mobilă, de capacitatea de adsorbţie pe suport. S-a făcut o

scală de selectivitate a lichidelor staţionare care începe cu squalenul (nepolar) şi se

încheie cu β, β’- dioxipropionitril (cel mai polar). Suportul impregnat cu lichid este

încălzit într-un curent de gaz inert la o temperatură apropiată de cea de separare.

Umplerea coloanei se face sub vid, iar condiţionarea ei constă în încălzire sub

curent de gaz purtător la temperatură înaltă pentru a îndepărta impurităţile volatile.

Coloanele capilare pot fi constituite din tuburi goale în care faza staţionară

nu este fixată pe suport, fiind repartizată uniform pe pereţii interiori ai coloanei.

Practic se realizează o peliculă foarte subţire prin evaporarea fazei staţionare

lichide. Diametrul interior este de 0.25-0.5mm, iar lungimea de 20-50m, realizându-

se aproximativ 10000 talere teoretice.

Proba nu se introduce direct în coloană, ci printr-o cameră de injectare a

cărei formă şi volum influenţează mult separarea. Această cameră are o temperatură

mai mare decât coloana, permiţând evaporarea probei. Volumul probei trebuie să fie

cât mai mic. Când coloanele sunt supraîncărcate, se reduce numărul de talere

teoretice, creşte înălţimea unui taler şi picurile devin asimetrice şi cu lăţime mare.

Injectarea probei poate fi făcută cu sau fără splitare. În cel de-al doilea caz, toată

cantitatea injectată intră în coloana cromatografică. Pentru compuşii mai volatili

decât solventul este obligatoriu să se lucreze cu splitare: o parte din extractul de

injectat va intra în coloană, o parte va fi direcţionată în exteriorul cromatografului.

În calculul concentraţiilor componenţilor determinaţi se va ţine seama de raportul de

splitare, care are practic semnificaţia unei diluţii.

Analiza unei probe implică etapele de pregătire a probei, de separare a

componenţilor şi de evaluare calitativă şi cantitativă a componenţilor separaţi.

Analiza calitativă presupune identificarea fiecărui pic din cromatogramă. Analiza

cantitativă se face prin integrarea picurilor şi calculul ariilor acestora, exprimate ca

procent din totalul picurilor. Acest procent este proporţional cu ponderea fiecărei

componente în amestec. Pentru a exprima în valori absolute cantitatea fiecărei

componente din amestec, trebuie determinată concentraţia totală a substanţelor în

amestec şi apoi pe baza procentelor deduse din cromatograme se calculează

concentraţia fiecărei componente (Socaciu, 2000).

Detectori utilizaţi în cromatografía gazoasă

Detectorul pune în evidenţă componentele separate pe coloana

cromatografică, sub forma unor semnale electrice care pot fi înregistrate. Detectorul

trebuie să deosebească o proprietate oarecare a componentului de analizat faţă de

gazul purtător. Există detectori universali, sensibili la un număr mare de componenţi

şi specifici, sensibili numai la anumiţi componenţi (la anumite grupări funcţionale

sau legături chimice).

Caracteristicile detectorului:

sensibilitate cât mai mare pentru a putea detecta chiar şi urmele de componenţi şi

pentru a nu fi necesară încărcarea coloanei cu cantităţi mult prea mari de probă

viteză de răspuns cât mai mare

liniaritate: sensibilitatea detectorului să rămână constantă într-un domeniu larg de

concentraţii

limită de sensibilitate ( concentraţia minimă de substanţă în eluent pentru care se

obţine un pic) cât mai joasă

stabilitate: linia de fond şi reproductibilitatea să fie cât mai puţin afectate de

condiţiile de lucru (temperatură, debit, presiune, etc) (Liteanu şi col., 1981).

Cele mai importante tipuri de detectori sunt:

. Detectorul de conductibilitate termică (DCT) a fost primul care a

apărut, făcând parte din categoria detectorilor universali. Se mai numeşte şi

catarometru, este nedestructiv, putând fi utilizat şi în cromatografia preparativă.

Principiul de funcţionare se bazează pe diferenţa de conductibilitate termică dintre

component şi eluent.

. Detectorul cu flacără de ionizare (FID) este tipul de detector cel mai

mult folosit în GC. Principiul de funcţionare constă în măsurarea conductibilităţii

electrice a unei flăcări de hidrogen în prezenţa unui compus organic. La ieşirea din

coloană, eluentul este amestecat cu un curent de hidrogen şi este aprins la capătul

unei duze din oţel inoxidabil. Creând un câmp electric între duză şi un electrod

colector aşezat deasupra flăcării, se stabileşte un curent slab (10-14 A) între cei doi

electrozi prin flacără. Apariţia în flacără a unui compus organic măreşte intensitatea

curentului datorită ionizării acestuia în funcţie de natura şi concentraţia

componentului respectiv. Acest curent va fi amplificat şi apoi înregistrat. Detectorul

FID are o sensibilitate înaltă, stabilitate pe termen lung, răspuns al semnalului rapid,

simplitate în operare şi întreţinere.

. Detectorul cu captură de electroni (ECD) prezintă o mare sensibilitate

pentru compuşii capabili de captură de electroni, cum ar fi compuşii conţinând

halogeni. Mulţi compuşi de interes biologic prezintă proprietatea de a capta

electroni sau posilitatea de a fi derivatizaţi cu compuşi care au această proprietate.

Sursa de ionizare constă din tritiu sau Ni63 radiocactiv. Azotul se utilizează ca gaz

purtător şi produce prin iradiere electroni şi ioni pozitivi:

N2 N2 + +e-

Datorită mobilităţii ridicate a electronilor liberi, nu are loc recombinarea lor cu ionii

pozitivi. Prin aplicarea unui câmp electric între electrozii camerei de ionizare, ionii

formaţi prin iradiere vor fi colectaţi. Prezenţa unor molecule cu afinitate ridicată

pentru captarea electronilor liberi favorizează formarea ionilor negativi:

[component] + e- [component]-

Ionii negativi se recombină cu ionii pozitivi mult mai uşor decât electronii liberi:

N2 + + [component]- [moleculă neutră]

Detectorul ECD are avantajul selectivităţii şi sensibilităţii foarte ridicate.

. Detectorul cu fotoionizare (DFI) are la bază ionizarea fotonică a

moleculelor probei şi măsurarea curentului format cu ajutorul electrodului colector

cuplat cu un electrometru.

. Spectrometrul de masă (MS): în urma ionizării în vid a moleculelor

substanţei de analizat, are loc fragmentarea acestora cu formarea unui grup de ioni

caracteristici, cu mase diferite. Procesele se desfăşoară în sursa de ionizare a

spectrometrului. Ionii formaţi sunt separaţi în funcţie de masa lor în analizorul de

masă şi apoi sunt detectaţi şi înregistraţi. Reprezentarea abundenţei lor

(concentraţiei relative) în funcţie de masă constituie spectrul de masă.

Ionizarea moleculelor poate avea loc în două modalităţi: prin impact

electronic (EI) şi ionizare chimică (CI).

Ionizarea prin impact electronic

În camera de ionizare se realizează un vid înaintat, de 10 -8 torr. Electronii

proveniţi de la un filament încălzit sunt focalizaţi în timp ce străbat camera şi

colectaţi de un electrod având un potenţial de 70V. Acesta îi conferă fiecărui

electron o energie de 70eV. Dacă în camera de ionizare se introduce o substanţă

într-o cantitate suficientă ca presiunea să crească la 10-5torr, ciocnirile dintre

electroni şi moleculele compusului respectiv determină fragmentarea acestora.

Întrucât electronii la 70eV au energie suficientă pentru a rupe orice legatură din

moleculă, prin fragmentare se vor forma toţi ionii posibili. Din cauza presiunii

scăzute din camera de ionizare, numai o moleculă din aproximativ 106 va realiza

ciocnirea şi ionizarea. Fragmentele de molecule neutre şi de ioni formaţi nu se vor

ciocni între ei, ci numai cu pereţii camerei, fiind posibilă aşadar îndepărtarea lor din

camera de ionizare şi colectarea ionilor de mase diferite în detector.

Ionizarea EI duce la fragmentarea moleculei şi la obţinerea unui amestec

complex de ioni a căror masă si abundenţă relativă se poate utiliza pentru

identificarea calitativă a compuşilor respectivi. Spectrul de masă obţinut în

asemenea condiţii va fi reproductibil şi caracteristic pentru compusul respectiv.

Primul ion care se formează în urma impactului este aşa-numitul ion molecular, care

are mare importanţă în identificarea substanţei deoarece are aceeaşi masă cu masa

moleculară a compusului respectiv. Din păcate însă, stabilitatea ionului molecular

este aşa de redusă (el se va fragmenta mai departe) încât, abundenţa sa relativă va fi

foarte mică şi identificarea de cele mai multe ori imposibilă. În consecinţă, a devenit

necesară utilizarea unei tehnici de ionizare mai blânde, prin care să se obţină

informaţii despre masa moleculară. Această tehnică este ionizarea chimică,

introdusă în anul 1966.

Spectrele de masă cu ionizare chimică sunt produse prin reacţii ion-

moleculare între moleculele neutre ale componentului (10-5 torr) şi o presiune

ridicată (0.2-2 torr) a plasmei de ioni a gazului reactiv (de obicei metan sau

izobutan). Gazul reactiv poate să înlocuiască gazul purtător în GC-MS şi poate fi

introdus direct în sursă, cu puţine efecte asupra rezoluţiei cromatografice. Întrucât

concentraţia gazului reactiv este cu câteva ordine de mărime peste concentraţia

probei, fasciculul de electroni ionizează gazul reactiv cu puţine molecule ale probei

ionizate direct. Deoarece sursa este operată la presiune înaltă comparativ cu sursa

EI, reacţiile ion-molecule sunt favorizate, realizându-se ionizarea probei. Aceste

reacţii au loc cu energie mică în comparaţie cu impactul direct cu electroni,

abundenţa ionului molecular faţă de alte fragmente rezultate va fi mare şi

mecanismul de fragmentare va fi mult mai simplu.

Majoritatea tehnicilor de ionizare chimică lucrează cu ioni pozitivi, dar s-au

dezvoltat şi cele cu ioni negativi bazate pe captura unor electroni cu energie mai

mică. Comparativ cu ionizarea prin EI, ionizarea chimică prezintă dezavantajul că

oferă rezultate mai puţin reproductibile şi nu este posibilă alcătuirea unei librării de

spectre care să fie folosită în scopuri de identificare.

Separarea ionilor formaţi are loc în analizorul de masă, tipurile cele mai

uzuale fiind cele magnetice şi cu cuadrupol descrise în capitolul 3.3.3.

Spectrele de masă pot fi înregistrate sub formă de picuri cu maxime (forma

originală a spectrului), dar în practică se utilizează reprezentarea fiecărui pic sub

forma unei linii. Celei mai înalte linii din spectru i se atribuie arbitrar valoarea 100,

iar restul sunt exprimate ca procente faţă de aceasta, obţinându-se concentraţia

diverselor fragmente ionice ca valori de abundenţă relativă (Gocan, 1998; Ciucanu,

1990; http://www.scritube.com/stiinta/chimie/Cromatografia-de-gaze41182.php).