analiza hplc a micotoxinelor

8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor

1/57

ANALIZA HPLC A MICOTOXINELOR

Mucegaiurile de depozit sursa de contaminare cumicotoxine

Mucegaiurile sunt larg raspandite n natura, fiind mai numeroase nsa, n

mediile bogate n glucide de origine vegetala, intervenind ntotdeauna n

procesele de putrefactie a substantelor vegetale. Se raspndesc cu mare

usurinta n natura, n special prin spori, care spre deosebire de cei bacterieni

sunt o forma de nmultire si nu de rezistenta. Efectele favorabile ale unorcategorii de fungi se folosesc n industria alimentara pentru fermentarea unor

produse lactate proaspete, prepararea unor branzeturi (Rouefort, !ucegi,

"omorod# si produse de carne (salam tip $Sibiu$#. Efectele daunatoare se

manifesta prin producerea de toxine nocive pentru om si animale, genernd

diverse toxiinfectii alimentare. %in punct de vedere morfologic,

mucegaiurile sunt formate din mai multe cellule eucariote care formeaza

miceliul, avand la randul lui o portiune aeriana si una situata n mediul n

care se dezvolta. %in punct de vedere fiziologic, o parte din miceliu este

reprezentata de aparatul vegetativ (&ife tubular septate sau neseptate#, iar o

alta parte de aparatul reproducator (&ife pe care se dezvolta sporii#.

%in punct de vedere metabolic, mucegaiurile au cteva caracteristici si

anume' cele mai multe sunt saprofite, dezvoltnduse pe substraturi

organice) folosesc pentru &ranire surse de carbon) prefer atmosfera umeda sitemperatura de dezvoltare ntre *+++-) sunt n general aerobe si acidofile,

dezvoltnduse la un p" cuprins ntre .

/dentificarea mucegaiurilor se face cu a0utorul unor c&ei dicotomice, pe baza


2/57

caracterelor culturale si morfologice. Materia prima alimentara si produsele

finite pot fi contaminate cu sporiu sau fragmente de miceliu din mediul

ncon0urator, contaminarea putnd avea loc n diferite stadii de productie.

1rezenta unui numar mare de spori sau fragmente de miceliu n produse carenu sunt vizibil mucegaitepoate indica pe de o parte o contaminare generala a

mediului ncon0urator sau o prelucrare de materie prima mucegaita.

%ezvoltarea unei anumite specii de ciuperci pe un produs alimentar are si

aspecte necunoscute, dar cu siguranta, ea este corelata cu calitatea specie

micetice si cu proprietatile produsului alimentar. %e asemenea dominatia

unei specii se poate datora unei contaminari puternice din nise ecologiceunde sa dezvoltat mucegaiul.

Principalele specii de fungiide depozit si micotoxinele care le produc sunt'

1.Aspergillus flavus, A.parasiticus, A.nomius, Penicillium puberulum, P.

citrinum, Rizopusproduc 2flatoxine !3, !*, 43, 4*, M3, M*)

2. 1enicillium verucosum, 1. viridicatum, 1.commmune, 2spergillus

alutaceus, 2. oc&raceus, 2.melleus produc 5c&ratoxina 2

. 1enicillium expansum, !6ssoclam6s nivea, 2spergillus clavatus

1atulina MucegaiulAspergillus sp. infesteaza un numar mare de fura0e dar

mai ales pe cele de natura vegetala si animala. -reste foarte bine n sroturile

de ara&ide si nutreturile combinate. /nfesteaza n mare masura si asternutul

din adaposturi precum si plantele fura0ere smulse cu radacini. 2erul din

imediata apropiere a acestor focare este puternic ncarcat cu spori de

Aspergillus. %in numeroasele tulpini ale mucegaiului Aspergillus, maifrecvente si daunatoare animalelor sau dovedit a fi ' A. flavus, A.

fumigatum, A. nidulans,A.candidus, A. clavatus, A. niger, A. glaucus, A.

amstelodanii, A. parasiticus, A.giganteus si A. claviformeAspergillus sp.

contine mai multi principii toxici dintre care cei mai importanti sunt


3/57

aflatoxinele care deriva de la 7a-Aspergillus si 7fla- flavus, prima tulpina

din acest mucegai n care sau pus n evidenta astfel de micotoxine.

2flatoxinele sunt produse n cantitati variabile n directa concordanta cu

prezenta unor numerosi factori favorizanti. %intre aflatoxinele studiate pnan prezent cele mai daunatoare sunt aflatoxinele !3, !*, 43, 4*, care se

regasesc n laptele animalelor &ranite cu fura0e contaminate sub forma

M3,M*. 1e lnga aflatoxine n sursele fura0ere sau n asternutul

adaposturilor se mai pot gasi si alte micotoxine ntruct mucegaiul

Aspergillus creste de obicei mpreuna cu Mucor, Penicillium, Rhizopus,

Alternaria. 8otodata este bine stabilit ca nutretul infestat cu

Aspergillus

contine si alte toxine, ca acidul oxalic care tulbura absorbtia calciului din

tubul digestiv, ncetineste cresterea si scade calcemia. 2cidul oxalic rezulta

din degradarea de catre acest mucegai a &idratilor de carbon din substratul

infestat. 2cidul co0ic( * &6droximet6l9&6droxi:p6rone# este o toxina

neurotropa, cardiotoxica, leucocitotoxica, antibiotica. Se face responsabil de

miscarile necontrolate, exoftalmie si convulsii tetaniforme. 2lt derivat toxic

este acidul betanitopropionic, care produce vasodilatatie si ca urmare

insuficienta circulatiei cerebrale precum si transformarea &emoglobinei n

met&emoglobina, deci stare de anoxemie. 2cidul aspergilic si compusii

nruditi (acid &idroxiaspergilic, acid dezoxiaspergilic# au efect antibiotic.

2laturi de aflatoxine mai apare si substante tremorgene (generatoare de

frisoane# care se elaboreaza odata cu aflatoxinele, flavalcoolul sau

flavonolul, acidul galic, etc. 8otodata ciuperca contine si o endotoxina careeste puternic nefrotoxica, &emoaglutinanta, &emolitica, dermonecrotica) la

iepure aceasta produce &emoragii, necroze renale, degenerescenta grasa

&epatica. Se constata ca toate speciile de mamifere, pasari, pesti si albine pot

face aflatoxicoza. ;a doze mari de aflatoxina sau mucegai manifestarea


4/57

clinica va fi acuta sau subacuta, iar la doze mici, patrunse n organism ntro

perioada de timp ndelungata manifestarea clinica va avea o evolutie cronica.

Morbiditatea si mortalitatea cuprind adesea un numar mare de animale mai

cu seama cnd factorii care favorizeaza dezvoltarea mucegaiului persista.Micozootoxicoza apare n special n conditii de supraaglomerari, umiditate

ridicata, suprancalzire, etc., factorii principali fiind tot nutretul infestat si

aerul contaminat cu spori. Sporii deAspergillus pot patrunde si prin porii

co0ii n oua unde pot creste omornd embrionul sau producndui leziunile

caracteristice aspergilotoxicozei c&iar n faza embrionara.


5/57

serioasa de siguranta alimentara, mai ales n anumite regiuni ale globului n

care conditiile climatice sau standardele din agricultura sunt precare.

5rganizatia pentru 2limente si 2gricultura (=25# estimeaza ca pe plan

mondial pna la *9> din culturile alimentare sunt semnificativ contaminatecu micotoxine. /n literatura sunt citate date conform carora n natura ar

exista un mare numar de micotoxine, din care au fost identificate peste *++

de specii. 1ractic, nu se cunosc zone pe glob indemne si se apreciaza ca *9

?+> din cerealele lumii sunt contaminate cu micotoxine cunoscute, produse

mai ales de fungi din genurile Aspergillus, Fusarium, Penicillium, amintite

anterior. Raspndirea diferitelor specii de fungi, precum si concentratia nmicotoxine a &ranei este influentata de conditiile pedoclimatice. 5 situatie

precisa a distributiei geografice a micotoxinelor a fost facuta ntrun studiu

prezentat n 3@, la prima conferinta despre micotoxine a 5rganizatiei

pentru 2limentatie si 2gricultura (=25#, 5rganizatiei pentru Sanatate

Mondiala (A"5# si 1rogramului Batiunilor Cnite pentru Mediu (CBE1#.

2ceasta a aratat ca n alimentele si nutreturile contaminate natural cu fungi

se gasesc n concentratii mari doar sapte micotoxine' aflatoxina, oc&ratoxina

2, patulina, zearalenona, tricotecenele, citrinina si acidul penicilic.

%istributia micotoxinelor n diferite zone ale globului se caracterizeaza prin

urmatoarele'

D n regiunile reci (-anada, nordul SC2 si ma0oritatea tarilor europene#

domina aflatoxinele (exceptie fac produsele de import provenite din tarile

calde# dar foarte importante sunt' vomitoxina, zearalenona, oc&ratoxina,%2S, toxina 8* si toxina "8*)

D n sudul si centrul Europei, unde se cultiva porumb (Suedia, 2ustria,

Cngaria#, domina fusariotoxinele (vomitoxina, zearelona, toxina 8 *#)


6/57

D n nordul Europei (%anemarca, 1olonia# pe primul loc se afla oc&ratoxina

2)n regiunile calde si umede din 2merica ;atina, 2sia, 2frica si anumite

zone din 2ustralia, mai raspndite sunt aflatoxinele.

Micotoxinele contamineaza produsele agricole nainte sau dupa recoltare. # si p"ul acestuia (peste F#,

temperatura (9+ si ?++-, idela n medie *9+-#, luminozitatea si compozitia

atmosferei (areobioza# n care acestia se dezvolta.

1rodusele de origine vegatala reprezinta substraturi convenabile dezvoltarii

micetilor si elaborarii micotoxinelor. , si o

temperatura de peste *++-. Bumeroase dintre produsele alimentare sau

fura0ere de origine vegetala, cum sunt faina de gru, secara sau porumb,

sroturile de ara&ide, diferite fructe s.a. pe care sau dezvoltat fungi toxigeni,

n urma prelucrarilor suferite nu mai contin dect micotoxine care au rezistatacestor procese, n timp ce fungii care leau produs au fost omorati.


7/57

asemenea fura0e, la nivelul tubului digestive se absorb n organismul care le

a consumat numai micotoxinele, iar fungii nu trec bariera intestinala si se

elimina cu fecalele.

2ceste micotoxine a0ung pe calea circulatiei sanguine n tesuturile

organismului sau n unele produse de secretie si excretie cum este laptele si


8/57

urina.


9/57

ouale si alte produse ale organismului animal, existnd un important

potential de actiune asupra sanatatii umane. -onsecintele consumului de

alimente contaminate cu micotoxine asupra sanatatii omului sunt estimate

indirect pe baza efectului observat la animale. /ngestia n timp scurt a uneicantitati mari de aflatoxine duce la aparitia intoxicatiei acute. 5rganul tinta

care sufera leziuni grave n astfel de cazuri este ficatul. 2flatoxicoza acuta se

poate manifesta prin &emoragii, insuficienta &epatica acuta si c&iar moarte.

%oza mortala difera de la animal la animal si depinde de multi factori cum ar

fi cantitatea de aflatoxina ingerata, vrsta animalului, starea de sanatate si

starea de nutritie. -onsumul unei cantitati mai mici, dar timp mai ndelungatduce la aparitia intoxicatiei cronice. Efectele si simptomele sunt n general

greu de pus n evidenta att din cauza intensitatii reduse dar mai ales din

cauza caracterului lor nespecific. 2flatoxicoza cronica trebuie suspectata

cnd n lipsa altor cauze evidente, animalele au tulburari digestive

persistente nsotite de crestere anevoioasa n greutate. -onsumul de alimente

contaminate cu micotoxine poate avea urmari severe, cum ar fi ciroza si

carcinomul &epatic o forma particulara de boala canceroasa a ficatului.

Studiile epidemiologice efectuate n /ndia si n unele tari din 2frica au aratat

o asociere ntre consumul de alimente contaminate cu aflatoxine si cresterea

incidentei cancerului de ficat. Susceptibilitatea omului la aflatoxina nu este

foarte bine cunoscuta datorita raritatii cazurilor. %ate estimative cu privire la

doza de risc pentru oameni au fost obtinute cu ocazia unor intoxicatii

colective izbucnite, una n /ndia n 3@F n cursul careia au fost afectateaproape F++ de persoane din care o treime au murit, si alta n Genia n 3@:*,

unde au fost spitalizate *+ de persoane dintre care au decedat 3*.

/nvestigatiile din aceste focare de aflatoxicoza au dus la concluzia ca ele s

au datorat ingestiei repetate a unei cantitati de :99 micrograme de


10/57


11/57

evaluare a laboratoarelor pentru testarea alimentelor, respectiv pentru

acreditarea acestora. Clterior, metodele de analiza au fost aliniate la

recomandarile -odex 2limentarius -ommission privind metodele de analiza

si prelevare a probelor,2;/B5RM @H* si (=25, 3@@# si /S5H/E- 3+*9 din 3@@@.

Regle!en"#ri eur$pene referi"$are la ni%elul !a&i! ad!is de

!ic$"$&ine din cereale 'i pr$duse cerealiere

RE(LEMENT)RI E*ROPENE+ Nr. 1,,1-2/ 'i Nr. 112/-20

5c&ratoxina 2

-ereale neprocesate 9 JgHIg

-ereale neprocesate, destinate direct consumului uman JgHIg

-ereale procesate pentru copii +,9 JgHIg

%eoxinivalenol

-ereale neprocesate, altele dect gru dur, ovKz Li porumb 3*9+ JgHIg

4ru dur, porumb Li ovKz neprocesate 39+ JgHIg

-ereale Li produse de mKciniL destinate direct consumului uman 9+

JgHIg

1aste fKinoase 9+ JgHIg

1ine, biscuii, snacIs 9++ JgHIg

-ereale procesate pentru copii *++ JgHIg

1roduse de la mKciniLul porumbului cu particule N 9++ Jm 9+ JgHIg1roduse de la mKciniLul porumbului cu particule O 9++ Jm 3*9+ JgHIg

earalenonK

-ereale neprocesate, altele porumb 3++ JgHIg

1orumb neprocesat *++ JgHIg


12/57

-ereale destinate direct consumului uman 9 JgHIg

1ine, biscuii, snacIs 9+ JgHIg

-ereale procesate pentru copii *+ JgHIg

1orumb neprocesat, cu excepia celui destinat procesKrii umede 9+JgHIg

1orumb destinat direct consumului uman, mKlai 3++ JgHIg

1roduse de la mKciniLul porumbului cu particule N 9++ Jm *++ JgHIg

1roduse de la mKciniLul porumbului cu particule O 9++ Jm ++ JgHIg

2flatoxine

-ereale, produse cerealiere !3 * JgHIg)!3P!*P43P4* F JgHIg

1orumb dupK tratamente fizice !3 9 JgHIg)

!3P!*P43P4* 3+ JgHIg

-ereale procesate pentru copii !3 +,3 JgHIg

=umonisine

1orumb neprocesat, cu excepia celui destinat

procesKrii umede F+++ JgHIg

1orumb destinat direct consumului

uman 3+++ JgHIg

1roduse pentru mic de0un, snacIsuri

din porumb :++ JgHIg

1roduse pe bazK de porumb

pentru copii *++ JgHIgMKlai, germeni 3+++ JgHIg

1roduse de la mKciniLul porumbului

cu particule N 9++ Jm 3F++ JgHIg

1roduse de la mKciniLul porumbului


13/57

cu particule O 9++ Jm *+++ JgHIg

8e&nici rapide de determinare a micotoxinelor

-reLterea complexitKii analitice n industria alimentarK impune rezultate

rapide pentru fiecare contaminant individual.


14/57

Monitorizarea coninutului de micotoxine (%5B, E2, 582# din gru Lipine cu coninut ridicat de fibre se va realiza folosind metoda imunologicaE;/S2.8estul E;/S2 se bazeazK pe reacia antigenanticorp. 2vanta0ul te&niciiderivK din caracterul extrem de selectiv al reaciei antigen anticorp ca Lidin posibilitatea de a folosi o mare varietate de 7marcatoriQ fapt ce permitesensibilizarea teoretic nelimitatK a determinKrii.

1rincipiul te&nicii E;/S2 pentru determinarea micotoxinelor'a# amestecare probK cu micotoxinKenzimK)

b# amestecare coninut cu anticorpii de fixare din godeu)c# legarea micotoxinelor de anticorpi)d# ndepKrtarea prin spKlare a materialului nelegat)

8E"B5;54/2;CM/BE xM21

8E"B5;54/2M/-R52RR2

15;/MER/ -CRE-CB52S8EREM5;E-C;2R2

8E"B5;54/2CB%E;5R

ET2BES-EB8E

ME85%2=;C5R5ME8R/-2

2B2;/2=;C5R/ME8R/-2

/MCB5%E8ERM/B2R/

!228E 1EMEM!R2BE

2B2;/2/MCB5;54/-2

E;/S2

MICOTOXINE


15/57

e# adKugare substrat pentru developarea culorii)f# adKugare soluie pentru stoparea reaciei.

CLASIFICAREA TEHNICILOR

CROMATOGRAFICES-au realizat numeroase variante ale metodei

cromatografce, dierind unele de altele n primul rnd prin

natura azei mobile, dar si a celei stationare. Astel se

distinge:

a. cromatografa de lichide (LC) cnd aza mobila este un

lichid in

cadrul careia se distinge:

-cromatografa de lichide pe coloana deschisa;

-cromatografa de lichide pe coloana inchisa;

b. cromatografa de gae (GC) cnd aza mobila este un

gaz;

c. cromatografa c! "!ide #!$racritice la care aza

mobila este un

lichid aat peste temperatura critica.

A. !n cadrul cromatografei i% lichide "LC) se disting mai

multe variante, n unctie de mecanismele de separare:

#. Cromatografa de ad#or&tie utilizata pentru separarea

substantelor organice cu molecule de dimensiuni mici si

medii pe adsorbanti, ca silicagel si alumina, olosindu-se, caaze mobile, dierite amestecuri de solventi organici.

$. Cromatografa io%ica "de schimb ionic%, care se petrece

pe o aza


16/57

stationara solida, poroasa, ormata din materiale specifce -

schimbatorii de ioni

- substante cu o retea solida anata, de natura organica sau

anorganica. &ele mai raspndite sunt rasinile schimbatoarede ioni.

'. Cromatografa de e'cl!i!%e #terica se desasoara pe

aze

stationare poroase dar cu porozitatea selectionata astel

nct sa corespunda dimensiunilor moleculelor supuse

separarii. ( parte dintre molecule intra prin pori, iar altelesunt e)cluse deplasndu-se practic neretinute odata cu aza

mobila. *ehnica se mai ntlneste si sub denumirea de

fltrare prin geluri sau permeatie prin geluri n unctie de

natura apoasa sau organica a azei mobile.

+. Cromatografa lichid-lichid (LLC%, n care aza

stationara este o

aza lichida, nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un

suport solid, ntr-o coloana. Aici suportul solid este inert ata

de componentele din proba. Acesta tehnica este cea mai

raspndita devenind aproape sinonima cu cromatografa de

lichide.

. Cromatografa $e coloa%a de#chi#a #a!

cromatografa $la%ara

(C) aza mobila circula printr-un material poros dispus ntr-

un plan si ormnd un strat relativ subtire, dar de compozitie


17/57


18/57

stationara o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv

1sitele moleculare2 "niste silicati naturali sau sintetici%

respective granulele de carbon poros. 3etoda este e)trem

de importanta pentru separarea gazelor permanente "&(,&($, ($, 4$, gaze nobile etc.%

CROMATOGRAFIA .E LICHI.E .E INALTAERFORMANTA (HLC)

Ge%eralitati&romatografa de lichide de nalta perormanta "567&%

acopera azi, n proportie apro)imativ 89, analiza

substantelor moleculare: organice, organometalice si

anorganice inclusiv compusii oarte polari sau labili termic

precum si compusii cu masa moleculara ridicata "naturali

sau sintetici%. e aceea, mpreuna cu cromatografa de gazeconstituie un punct de spriin important n analizele chimice

moderne. esi efcacitatea coloanelor nu o egaleaza nca pe

cea din /&, prin aptul ca se poate modifca, pe lnga aza

stationara, si aza mobila, cromatografa de lichide "7&% ace

posibile separari si analize uneori

imposibil de realizat prin alte tehnici. &uplaul cu

spectrometria de masa a transormat, n ultimul timp,

aceasta metoda n principalul miloc de analiza a compusilor

moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii


19/57

pe care se spriina chimia sintetica actuala si pe care s-a

dezvoltat biochimia si biotehnologia moderna.

3etoda constituie o evolutie a unei metode mai vechi,

cromatografa pe coloana clasica, care servea n primul rnd

la izolarea preparativa a compusilor naturali. 6rin

introducerea pompelor si n consecinta, lucrndu-se la

presiuni tot mai ridicate "$atm%, dezvoltarea unor aze

stationare perormante, de dimensiuni tot mai mici "recent

constituite din granule de aze stationare serice, cu

diametre $-


20/57

automat, prin intermediul unui ventil cu b? pass. !n coloana

aata ntr-o etuva termostat, are loc separarea propriu-zisa.

@uentul coloanei intra ntr-un detector de unde

componentul, daca este separat complet, poate f colectat siizolat, cu autorul unui colector de ractiuni. Semnalul este

nregistrat fe cu un nregistrator, fe direct n memoria unui

calculator. !n esenta, un cromatogra analitic 567& are

structura din fg. unde nu s-a mai prezentat colectorul de

ractiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se

poate observa asemanarea cu /& singura deosebire maoraconstituind-o sursa de eluent pompa.

Sol/e%t 0 om$a 0 I%1ector 0 Coloa%a 0 .etector 0

2%regi#trator

Schema &loc a !%!i cromatogra, HLC

&romatografa de lichide de inalta perormanta este olosita

pentru analiza substantelor moleculare: organice, organo-

metalice si anorganice inclusive compusii oarte polari sau

labili termic precum si compusii cu masa moleculara ridicata.

Aceasta metoda a acut posibile separari si analize uneori

imposibil de realizat prin alte metode. Bn cromatografa de

lichide de inalta perormanta detectorii sunt situati la iesireaeluentului din coloana cromatografca. Sistemul de detectie

trebuie:


21/57


22/57

- detectorii de uorescenta sunt olositi la identifcarea

substntelor care prezinta uorescenta sau pot f tranormati

in derivati ce prezinta aceasta proprietate;

- diodele Arra? sunt olosite in multe cazuri de identifcare.Cn alt criteriu de comparatie intre detectori este cel al

valorilor caracteristice ale domeniului liniar dinamic si al

sensitivitatii.

0iecare detector prezinta avantae si dezavantae iar pentru

alegerea celui mai potrivit detector necesar in identifcarea

subtantelor dintr-un amestec se vor tine cont de ele.

Stabilirea metodelor de determinare a concentra tiei de

micotoxine.

ri%ci$iile de /alidare a metodei HLC

AZE IN HPLC

Prepararea pr$ei

In3ec"area in c$l$ana

Eluarea cu fa4a !$ila

5e"ec"area c$!p$nen"il$r din pr$a

Iden"ificare si !asurare


23/57

A) Tato%ari

3) 4 $re$arari #ol!tii #ta%dard

- apa F substanta "concentratii medii si mici%

- parametrii 567& "conc, debit, detector, inectare%- coloana si aza mobila

- gradient de concentratie "cand e cazul%

5) 4 #ta&ilire $rofl de acti!%e al #!ta%tei

- substante izomere prezente in sistem concomitent

- substante rezultate prin degradare

- etaloane "izomeri, substante de degradare%

6) - co%cl!ii

- stabilire lungime de unda pentru analiza

- specifcitate ara intererente la G* "Getention *ime%

) St!dii i%termediare

- stabilitate 1on line2 " # $ ' #$ $+ ore% la dierente de

temperatura cuprinse intre &

- liniaritate solutii standard 8 conc. " ' conc. la limita minima%

C) 7alidare

3) S$ecifcitate

- teste in dieriti solventi "polari si nepolari cel putin %

- lipsa intererentelor la G*

5) artea E#e%tiala preparari solutiia% liniaritate din aza mobila se prepara 8 conc. "' la minim%

-# &$ &'-# &+-# & &> &H-#

&8


24/57

-$ &'-$ &+-$ &H-$

-' &'-' &+-' &H-'

-+ &'-+ &+-+ &H-+

- &'- &+- &H- L.. 8CA 8C 8CC

8C. dilutie +) a solutiei &8 se repeta in fecare zi

b% e)actitatea "acuratetea accurac?% E9

- la concentratii mici E9 : 5;9

- la concentratii mari E9 : 3


25/57

A Tato% a ri

a) se prepara solutii standard n mediu apos sau solvent

preselectat:- prepararea solutiilor de concentratii medii si mici utiliznd

substanta active si apa purifcata sau solvent pur;

- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului 567&;

- se alege coloana cromatografca si aza mobila de lucru;

- eventual se stabileste gradientul de concentratie respectiv

etapele intermediare de spalare a coloanei cromatografce.

&) se prepara Jblanc2-uri de solutie n vederea eliminariiposibilelor intererente cu substantele active luate n lucru:

- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului 567&;

- se eectueaza studii pe coloana cromatografca si aza mobila

aleasa;

- se eectueaza studii pentru alegerea gradientului de

concentratie si a

etapelor de spalare a sistemului.

c)se dopeaza matricea cu substante active la concentratii medii

si mici:

- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului 567& astel nct

semnalele

de raspuns ale substantelor active respectiv ale componentelor

de degradare sa nu se suprapuna, pentru posibilitatea evaluarii

cantitative a substantelor active dopate;

- se eectueaza studii pe coloana cromatografca si aza mobila

aleasa;


26/57


27/57


28/57

dopate cu substante active, derivati sau alte substante etalon

"ST.% la 8 nivele de concentratie dierite "dintre care trei la valori

mici% c# c8. 6entru solutiile de concentratii c#, c', c+ si cH se

repeta determinarile de cte + ori pentru a avea date multiple laconcentratia minima-c# , medie-c+ si mare-cH, respectiv ale

controlului de calitate K&A-c', K&E-c+ si K&&-cH, si nu n ultimul

rnd se prepara o solutie K& prin dilutia de + ori a celei mai

concentrate valori c8 pentru care se eectueaza doua determinari.

6robele K& trebuie eectuate zilnic n solutii standard.

5 E'actitatea (ac!ratetea 4Accuracy) E9*se determina prin

calcule sitrebuie sa respecte conditia urmatoare:

- @9 L $9 pentru valorile celei mai mici concentratii;

- @9 L #9 pentru toate celelalte concentratii.

'. &oefcientul de variatie "precizia-repetabilitatea Precision-

Repetability% &D9 se determina prin calcule si trebuie sa respecte

urmatoarele conditii:

- &D9 L $9 pentru valorile celei mai mici concentratii;

- &D9 L #9 pentru toate celelalte concentratii.

+. Gandamentul de e)tractie "Recovery, RE% M9 se determina la

solutiile

cu concentratiile c#, c', c+, si cH din solutiile standard.

C Re$rod!cti&ilitatea (Intermediate Precision) se

determina n

urmatoarele + zile consecutive, repetnd probele de la liniaritate

cu cele 8

concentratii c# c8 alese mai sus pentru care se calculeaza

e)actitatea "acuratetea%@9 si coefcientul de variatie "precizia%


29/57

&D9, respectnd criteriile precizate la paragraele

corespunzatoare.

. Sta&ilitatea (Stability)care se determina tinnd seama de

urmatoarele:#. stabilitatea Jon-line2 "intermediara% n autosamplerul

sistemului 567& pentru o durata care e)cede cu cel putin '9

timpul ma)im pentru derularea unei secvente complete.

$. stabilitatea la nghet-dezghet Jreeze-thaN2 pentru care se

eectueaza ' cicluri de temperatura.

'. stabilitatea de lunga durata pentru care se prepara solutii care

se vor stoca si analiza dupa #, $, ', + ... saptamni.E 2%tocmirea ra$ort!l!i /alidarii care trebuie sa contina

valorile nregistrate, modul de calcul al dieritelor caracteristici si

parametri, reprezentarile grafce si evaluarile si interpretarile

rezultatelor. 6entru ustifcarea concluziilor fnale ale raportului

trebuiesc ane)ate cromatogramele nregistrate cu numele

analistului care a eectuat validarea si a celor care au verifcat si

aprobat metoda.

efnirea s i determinarea parametrilor de

perorman ta ai metodei de studiu cu 567&

efnit ie: &aracteristicile si parametri de perormanta sunt

proprietati de baza ale metodelor analitice cu autorul carora se

demonstreaza ca metoda dezvoltata corespunde scopului propus.

&aracteristici de perormanta:

A S$ecifcitatea (S$ecifcit?)

Bnvestigatiile de selectivitate se eectueaza mpreuna cu cele

pentru curbele de calibrare care dau liniaritatea. 3edia naltimii


30/57

picurilor masurate pentru probele standard de calibrare la cea

mai mica concentratie de cuantifcare "7oNer 7imit o

Kuantifcation, LL8% se calculeaza si se compara cu posibilele

picuri endogene din Jblanc2-urile de matrici nedopate. &onditiade baza este ca n cromatogramele Jblanc2-urilor de matrici

nedopate sa nu e)iste picuri semnifcative la timpii de retentie ai

ma)imelor e)aminate. Dalorile sunt acceptabile doar daca

naltimea picului compusului endogen este mai mica dect $9

din naltimea picului substantei studiate la cea mai mica

concentratie "LL8%.

C!r&a de cali&rare (Li%earit?)6entru fecare dintre cele cinci nivele de concentratie alese se

prepara cte cinci probe "ST.% care se analizeaza ntr-o singura

serie. ierenta procentuala calculata ata de valoarea nominala

a concentratiei preparate se determina pentru fecare standard

ST. . &onditia de baza pentru ca modelul sa fe acceptat trebuie

sa respecte o valoare de cel putin ,== pentru coefcientul de

regresie "R5%, iar coefcientul de variatie "C79% trebuie sa fe

cuprins ntr-un domeniu de O$9 pentru cea mai mica

concentratie respectiv O#9 pentru toate celelalte concentratii

testate.

C reciia si Ac!ratetea (reci#io% a%d Acc!rac?)

Se analizeaza probele de control de calitate "Quality Control,

QC% ntr-o

singura serie de cte probe identice pentru fecare nivel de

concentratie ales si se compara cu valorile teoretice obtinute

pentru curba de calibrare. "determinari zilnice, intra-day assay%.

e asemenea, n fecare din cele cinci zile se mai eectueaza cte


31/57

o singura proba de control de calitate "8C% la fecare dintre

concentratiile alese si se compara cu valorile teoretice obtinute

pentru curba de calibrare "determinari n zile succesive, between-

days assay%. Se calculeaza concentratiile medii, deviatiilestandard relative "relative standard deviation, S.%, coefcientii de

variatie "coefcient o variation, C79% si dierentele valorilor

medii ata de cele nominale "E9% la toate nivele de concentratie.

&onditia de baza pentru acceptarea preciziei este ca deviatia

standard relative "S.% a probelor de control de calitate "8C% sa

nu depaseasca O#9 att n determinarile zilnice ct si n

determinarile n zile succesive. Bar conditia principala pentruacceptarea acuratetei este ca dierenta ntre media valorilor

masurate si a celor nominale sa nu depasesca O#9 nici n

determinarile zilnice, nici n determinarile n zile succesive.

D. Limita minima de cuantifcare (LLQ)

Se analizeaza probe identice la concentratia minima de

cuantifcare "LL8%, si se compara ata de valoarea teoretica din

curba de calibrare pentru determinarile n zile succesive. 7a

aceste concentratii se calculeaza dierenta dintre media valorilor

masurate si cele nominale "E9%, deviatia standard relativa "S.%

si coefcientul de variatie "C79%.

&onditia de baza pentru acceptarea preciziei este ca deviatia

standard relative "S.% a concentratiilor din probele masurate

"LL8% sa nu depaseasca O$9 nici n determinarile zilnice, nici n

determinarile n zile succesive. Bar conditia principala pentru

acceptarea acuratetei este ca dierenta ntre media valorilor

masurate ata de cele nominale sa nu depaseasca $9 nici n

determinarile zilnice nici n cele din zile succesive.


32/57

E ro&ele de dil!tie (Sam$le .il!tio%)

!n fecare din cele zile de determinari se prepara o proba prin

diluarea de + ori cu Jblanc2 de matrice nedopata, a celei mai

concentrate alese pentru curba de calibrare c8, iar concentratiaprobelor diluate se determina prin comparatie cu valorile

determinarilor zilnice. &onditia de baza pentru ca rezultatul sa fe

acceptat este ca valoare dierentei medii masurate ata de cea

nominala sa nu depaseasca O#9.

F Sta&ilitatea (Sta&ilit?)

0# Stabilitatea n autosampler "n!Line Stability, LS%

Se prepara cte 8 probe pentru doua concentratii dierite, aleseastel nct sa fe una aproape minima iar cealalta aproape

ma)ima n comparatie cu valorile concentratiilor alese pentru

curbele de calibrare. *oate probele se pastreaza la temperatura

din autosampler "cea aleasa pentru seria de determinari% si se

analizeaza dupa $, ', + ...#, ...$+, ...+8 ore, calculndu-se

valorile concentratiilor ata de curba de calibrare din prima zi.

&onditia de baza pentru acceptarea stabilitatii n autosampler

este ca nici una dintre valorile determinate dupa perioadele de

timp descrise mai sus, pentru toate probele de la ambele

concentratii alese sa nu depaseasca un domeniu de O#9 ata

de valoarea de reerinta.

0$ Stabilitaea de lunga durata "Lon"!#erm Stability, L#S%

Se prepara cte #> "sau un alt multiplu de +)% probe pentru cele

doua concentratii alese la stabilitatea n autosampler "descrisa

mai sus%. !n prima zi se analizeaza cte + perechi de probe pentru

ambele concentratii si se compara cu valorile obtinute pentru

curba de calibrare din ziua respectiva. Gestul probelor preparate


33/57

se pastreaza n aceleasi conditii n care se pastreaza si probele

matricilor prelevate si se analizeaza cromatografc dupa $, '

respectiv + "sau mai multe% saptamni. e fecare data se

masoara cte + probe din fecare concentratie si se compara cuvalorile obtinute pentru probele proaspat preparate "tot cte +% si

curbele de calibrare corespunzatoare zilei respective.

&oncentratiile se determina ata de curbele de calibrare din ziua

respectiva, att pentru probele depozitate ct si pentru cele

proaspete, apoi se compara valorile medii pentru ambele

categorii "resh si old%. &onditia ce baza pentru a considera

analitul stabil este ca dierenta dintre valorile medii din probelenghetate si pastrate ata de mediile celor proaspete sa nu

depaseasca O#9.

0' Stabilitatea la nghet-dezghet "$ree%e!#&a' Stability, $#S%

Se prepara cte + probe pentru cele doua concentratii alese "ca

mai sus la

stabilitatea n autosampler%, care vor f supuse unor cicluri

repetate de ' ori de nghet-dezghet n ' zile consecutive. upa

cel de-al treilea ciclu se analizeaza probele n comparatie cu

probe proaspat preparate n ziua respectiva "cu aceleasi

concentratii% si se determina valorile concentratiilor ata de curba

de calibrare din aceeasi zi. &onditia de baza pentru ca proba sa

fe considerata nealterata de procesele de nghet-dezghet este ca

dierenta dintre valorile medii ale probelor "FTS% ata de cele

proaspete sa fe cuprinsa ntr-un domeniu de O#9.

G Ra%dame%t!l de rec!$erare (Retrie/i%g EBcie%c?* RE)

Se prepara + probe dupa cum urmeaza, una pentru limita minima

de cuantifcare "77K%, iar celelalte trei pentru valorile


34/57

concentratiilor de control de calitate "K&%. Aceste probe se

prepara ntr-o zi a perioadei validare, astel nct se analizeaza si

se compara cu mediile valorilor a cte probe din cea mai mica

concentratie "77K% respectiv control de calitate "K&%. @fcienta secalculeaza prin raportarea mediei naltimii picurilor pentru valorile

preparate la concentratiile "77K, K&% ata de naltimile picurilor

probelor de reerinta preparate n supernatant.

.etermi%area ochrato'i%ei A di% ca,ea &oa&e$ri% metoda HLCRe4u!a"'

Scop.Talidarea metodei de determinare a oc&ratoxinei 2 prin cromatografie

de lic&ide de naltK performanK ("1;-# Li aplicarea acesteia pe probe decafea boabe prK0itK.

Material i metod.1robele de cafea, ac&iziioante din reeaua comercialK a

oraLului /aLi, au fost supuse extraciei cu un amestec -"5"' Ba"-5 (n

raport de :+'*+#. Extractele au fost purificate prin extracie n fazK solidK

(-3:# pentru reinerea oc&ratoxinei 2. Micotoxina a fost eluatK cu

cloroform) faza organicK a fost evaporatK la sec Li apoi, reziduul reluat cu +,?

ml fazK mobilK. Cn volum de *+ Jl a fost supus analizei "1;-. 2naliza sa

realizat pe un cromatograf de lic&ide tip "1 3+@+ Series //, ec&ipat cu o

coloanK cromatograficK tip Stable !ond S! -3: (39+ x F,? mm) 9 Jm#,

folosind ca fazK mobilK un amestec de acetonitril ' apK ' acid acetic (n raport


35/57

de @@ ' @@ ' *#. %etecia oc&ratoxinei 2 sa realizat n fluorescenK (UexV**:

nm Li UemVF* nm#.

Rezultate.Metoda "1;- a fost validatK.

din numKrul total de probe#, oc&ratoxina 2 a fost prezentK sub limita maximKadmisK de legislaia n vigoare (9 JgHIg cafea boabe prK0itK#, ntro singurK

probK concentraia oc&ratoxinei 2 a fost peste limita maximK admisK 2 iar n

F de probe (:9> din numKrul total probe# oc&ratoxina 2 nu a fost

identificatK prin metoda aplicatK.

Discuii.2ceastK lucrare contribuie la evaluarea prezenei oc&ratoxinei 2 n

produsele alimentare (cafea boabe# comercializate n Romnia Li atrageatenia asupra riscului consumului de alimente contaminate cu micotoxine.

In"r$ducere5c&ratoxina 2 (=igura nr. 3# este un metabolit toxic produs de specii din

genulAspergillus n zonele tropicale Li subtropicale Li de specii din genul

Penicillium n zonele temperate (3#. 5c&ratoxina 2 a fost izolatK pentru

prima datK din culturi de Aspergillus ochraceus de Tan der MerWe Li colab.n anul 3@?9 (*# n timp ce testau capacitatea toxigenK a unor tulpini de

micromicei izolate din diferite boabe de cereale Li legume.

=igura nr. 3 5c&ratoxina 2 structura c&imicK


36/57


37/57

E&"rac"ia $c6ra"$&inei A si purificarea e&"rac"ului

1robele de analizat (cafea boabe pra0ite vrac# au fost supuse extractiei in

vederea separarii oc&ratoxinei 2.

2stfel, o cantitate de *+ grame proba maruntita se agita *+ minute cu unvolum de *+ ml amestec -"5" 'Ba"-5>(:+ '*+# dupa care se filtreaza

prin &artie de filtru cantitativa (F, 9#. =iltratul se trece prin coloana S1E

preconditionata prin spalare succesiva cu Fml metanol, respectiv cu F ml apa

purificata. 5c&ratoxina 2 este eluata de pe coloana cu un volum de ml

cloroform, cu o viteza de * mlHmin. =aza organica se evapora la sec ) reziduu

obtinut se reia cu un volum de +,? ml faza mobila si se supune analizei"1;- prin in0ectarea unui volum de *+ Jl in conditiile mentionate.

/n paralel, sau lucrat probe imbogatite cu cantitati cunoscute de

oc&ratoxina 2 pentru stabilirea randamentului de extractie.

2naliza "1;- sa realizat astfel ) un volum de *+ Jl proba (obtinuta prin

dizolvarea reziduului obtinut in urma prelucrarii probei intrun volum de +,?

ml faza mobila# a fost supus analizei pe un cromatograf de lic&ide tip "1

3+@+ Series //, ec&ipat cu o coloana cromatografica tip Stable !ond S!

-3:(39+xF,?mm )9Jm #, folosind o faza mobila un amestec de

acetonitril 'apa 'acid acetic(in raport de @@ '@@ '*#. %etectia oc&ratoxinei 2 s

a realizat in fluorescenta (UexV**:nm si UemVF*nm#

Re4ul"a"e si discu"ii

7pecifici"a"e 1entru determinarea specificitatii metodei au fost analizate probe

continand oc&ratoxina 2 si o proba continand faza mobile utilizata ca solvent

al probelor in0ectate. ;a timpul de retentie al oc&ratoxinei 2 nu sa obtinut


38/57

nici un semnal in cromatograma corespunzatoare fazei mobile, rezulta deci

faptul ca nu exista interferenti(:,@,3+#

Iden"ificarea picuril$r /dentificarea picului corespunzator oc&ratoxinei 2 se realizeaza in functie

de timpul de retentie. /n conditiile mentionate, timpul de retentie pentru

oc&ratoxina 2 este de @,9 min.

ig. nr.28Cr$!a"$gra!a pen"ru s$lu"ia s"andard de $c6ra"$&ina A

9alidarea !e"$dei de de"er!inare a $c6ra"$&inei A prin cr$!a"$grafie

de lic6ide de inal"a perf$r!an"a:HPLC;

1entru determinarea cantitativa a oc&ratoxinei 2, metoda de analiza prin"1;- prezentata a fost avalidata, urmarinduse urmatorii parametrii )

stabilitatea in timp asolutiei, linearitatea, limita de detectie si limita de

cuantificare, precizia sistemului, precizia metodei, exactitatea metodei.

7"aili"a"eas$lu"iei

1entru a determina stabilitatea solutiei de oc&ratoxina 2 a fost analizata oproba cu o concentratie de 3@,9ngHml oc&ratoxina 2 dupa ce a fost mentinuta

la temperatura camerei *, si 3+ zile. Rezultatele experimentale sunt

precizate in tabelul 3.

7TA


39/57

Nr. Ziua Arie pic 5a"e s"a"is"ice3 + ,: 2rie medieV*,F9

S%V 3,@RS% (>#V F,3*+

* * +,@ ,F 3+ 3,:

TA#

Lineari"a"ea=li!i"a de de"ec"ie si li!i"a de cuan"ificare

1entru studiul linearitatii au fost analizate sase serii de solutii, pentru

fiecare cromatograma a fost calculata aria picului corespunzator

oc&ratoxinei 2, iar valoarea ariei medie a fost reprezentata grafic functie deconcentratie. 1rin analiza statistica au fost calculate ecuatia dreptei de

regresie, coeficientul de corectie (r# si eroarea standard de regresie. =olosind

panta dreptei de regresie si eroarea standard a acestei drepte sau calculat

valorile limitei de detectie si a limitei de cuantificare.

/n tabelul nr * sunt prezentate ariile picurilor corespunzatoare oc&rtoxinei,

iar ia figura nr este reprezentata dreapta de calibrare a oc&ratoxinei 2.

Ariile picuril$r $c6ra"$&inei A $"inu"e in s"udiul lineari"a"ii !e"$deiOc6ra"$&ina A

:ng-!l;Arie pic Arie

!edieI II III I9 9 9I@,?9?*9 *+,+++ 3,3 39,@ 3,: 3:,3 3,: 3,3*3@,93*9 ,:++ *?, +,@ *9,F *?,* , *@,:


40/57

@,+?*9+ 9?,3++ 9,F F9,3 F,@ F*,? F:, F:,@:,3*9++ @9,+++ :?, @, :@, :9,: :+,? ::,F939?,*9++ 3,+ 3*,: 3?9,: 3?9, 3?F,9 39:, 3?,F+3*,9+++ ,:+ *:,9 3,@ +*,9 +?,: *3,9 *3,9+?*9,++++ ?*:,F+ ?3F,9+ ?3@,+ ?+*,3+ 99@,@+ ?33,9+ ?+?,+*

@,9+++ :@:,F @+F,* :@:,F @+9,F @+@, @3F,: @+9,*33*9+,+++ 3**,3 33@F,: 33??,9 33@*,? 3+F3,F 3*+*,* 333,?+TA


41/57

;ZV3+xSEV3+x3,**@F3FF??9V3*,3ngHml (*#

panta 3,+9+:+@9*:3

Preci4ie si e&ac"i"a"ea 1rima etapa in determinarea preciziei o reprezinta studiul sistemului.

2stfel, o solutie de concentratie de *+ngHml a fost analizata de cinci ori.

2riile picurile corespunzatoare oc&ratoxinei 2 pentru cele cinci determinari

sunt prezentate in tabelul nr .

Preci4ia sis"e!ului la de"er!inarea $c6ra"$&inei ANr. Arie pic 5a"e s"a"is"ice3 *?, 2rie medie V *?,3?

S% V *, 9FFRS% (># V :,?@3*

* +,F +,F *?,*9 3,:

TA# a fost calculata ca

fiind :,?@3*>. 1entru concentratii in proba de ordinul ng, valoarea este

buna, sistemul este precis.

1recizia si exactitatea metodei au fost determinate prin calcularea valorii

medii a determinari la trei concentratii deferite in 0urul valorii de interes

@,+?*9ngHml,3@,93*9ngHml si respectiv, @,?9?*9ngHml(concentratii

urmarita P9+>#.

/ntregul experiment a fost realizat in zile diferite, de alt analist, cu scopulde a obtine informatii despre robustetea metodei.

Ctilizand ecuatia curbei de calibrare si ariile picurilor au fost calculate

concentratiile pentru fiecare proba. 2 fost determinata regasirea ca procent

din valoarea concentratiei teoretice, regasirea medie si precizia metodei


42/57

exprimata prin deviatia stsndard relativa din regasirea calculata. 1entru

aceste doua grupuri de date (/ si //#, valorile obtinute sunt prezentate in

tabelul nr F

Preci4ia si e&ac"i"a"ea !e"$deiNr.

C$ncen"ra"iaTe$re"ica:ng-!l;

Arie pic C$ncen"ra"iacalcula"a:ng-!l;

Regasire:>;

/ // / // / //3

@,?9?*9*+,+ 3,3 33,@ @,+@ 3*+, @,3

* 3:,3 3,: 3+,+* ?,+* 3+*,? ?3,3 3,: 39,@ @,F ,@: @@, :3,F

3@,93*9,: *?, *F,? 3:,+* 3*?,3 @*,

9 *?,* *9,F 3,9? 3?,:3 :@,@ :?,3? , +,@ *F,3? *3,@ 3*, 33*,

@,+?*9

9?,3 9,F F9, F*,:? 33?,3 3+@,

: F*,? F,@ *,:3 ,F :F,+ @?,?@ F:, F9,3 :,F@ 9,3F @:,9 @+,+Media VMinim V

Maxim V%eviatia standard(S%# V

%eviatia standard relativa(RS%># V

@@,*>?3,?>3*?,3>3?,*+?

3?,@?*@> TA a deviatiei standard relative ceea ce demonstreaza

precizia metodei 'regasirea medie fiind de @@,*>(pe intervalul ?3,?3*?,3>#

ceea ce demonstreaza exactitatea metodei.


43/57

Taloarea medie (3: valori si o precizie de @9>,valoarea t din Student fiind

de *,33#, intervalul de incredere pentru regasire este de :,*@339,++>.

Aplica"ie la de"er!inarea $c6ra"$&inei A din pr$e de cafea $aepra3i"a.

Metoda de analiza validata a oc&ratoxinei 2 prin "1;- a fost aplicata la

determinare oc&ratoxinei 2 din probe de cafea boabe.

1robele au fost procurate den reteaua comerciala a orasului /asi si anume

din unitati ce comercializeaza produse vrac. Sau analizat F+ de probe decafea boabe pra0ita, de diferite sorturi(-olumbia3+ probe, [acobs 3+ probe,

/ndonezia : probe, !raziliaF probe, Robusta* probe, /ndia3 proba, cafea

decofeinizata 9 probe#.

/n urma analizei prin "1;-, cromatogramele obtinute au fost prelucrate,

stabilinduse aria picurilor corespunzatoare oc&ratoxinei 2 si, folosind

ecuatia dreptei de regresie, sa calculat continutul in ic&ratoxina 2 pentru

probele de cafea(valori prezentate in tabelul nr 9#

C$n"inu"ul in $c6ra"$&ina A Nr. cr". Nr. pr$a 5enu!ire

pr$aOc6ra"$&ina A

:@g-g pr$a cafea$ae;

3 -afea /ndonezia +,* F -afea /ndonezia +,: 9 -afea /ndonezia 3,+?

F ? -afea /ndonezia +,999 3+ -afea -olumbia @,F? F+ -afea /ndia ,9

TA


44/57

%in analiza datelor obtinute in urma determinarii oc&ratoxinei 2 din cele F+

de probe de cafea boabe pra0ita, sa constatat ca intro singura proba (*,9>

din numarul total de probe# oc&ratoxina 2 este prezenta intro cantitae mai

mare decat limita maxima admisa de legislatia in vigoare (9JgHIg cafeaboabe pra0ita#(33# ' in 9 probe (*,9> din numarul total de probe# oc&ratoxina

2 se gaseste in concentratii sub limita maxima admisa, iar intrun numar de

F probe (:9> din numarul total de probe# oc&ratoxina 2 nu a fost

identificata prin metoda aplicata.

C$nclu4ii Metoda corespunde parametrilor de validare si a fost aplicata cu bune

rezultate la determinarea oc&ratoxinei 2 din probe de cafea boabe pra0ita.

2ceasta lucrare contribuie la evaluarea prezentei oc&ratoxinei 2 in

produsele alimentare ,cafea boabe vrac# comercializate in Romania.

2vand in vedere consumul crescut de cafea in randul populatiei adulte este

necesara adoptarea unor masuri in vederea prote0arii sanatatii

consumatorului, o masura importanta fiind evitarea comercializatii probelor

cu un nivel ridicat de contaminare cu oc&ratoxina 2.


45/57


46/57

INCI5ENA DI TRAN7ER*L 5EOXINI9ALENOL*L*I

5IN *RAE FN 7ER LA O9INE

INTRO5*CERE

-ontaminarea cerealelor, cafelei, condimentelor, ara&idelor Li a produselor

derivate din acestea cu fusariotoxine a fost descrisK pe larg n literatura de

specialitate, datoritK implicaiilor acestora asupra sKnKtKii animale Li umane.

5mul este expus acestor riscuri att prin consumul de produse vegetale

contaminate, ct Li prin consumul unor produse provenite de la animale care

au consumat &ranK contaminatK. %eoarece acest risc alimentar esteconsiderat o problema de sKnKtate publicK, se acordK o importanK din ce n

ce mai mareproblematicii cu privire la cKile de metabolizare a micotoxinelor

n organismul animal Li cel uman. %eoxinivalenolul este fusariotoxina cu cea

mai mare rKspndire n cereale Li n produsele derivate din acestea. 1rin

mecanisme ca inducerea apoptozei la celulele &ematopoetice Li imunitare,

alterarea imunoglobulinelor Li prin impactulasupra sintezei proteice,deoxinivalenolul are efect &ematotoxic, imunomodulator sau de inducere a

unei toxicitKi cutanate. ;a rumegatoare, deLi efectele

sunt mai puin toxice, studiile au asociat deoxinivalenolul cu reducerea

consumului de &ranK (8 r e & o l m, 3@:9# sau cu pierderea produciei de

lapte (A & i t l o W, 3@@3#. Rezultate Ltiinifice recente au demonstrat cK

administrarea deoxinivalenolului, la oaie, produce modificKri ale

parametrilor sangvini Li ale activitKii enzimelor &epatice (! u s u r i c u Li

a m f i e s c u, *++#. Mecanismele de transfer al fusariotoxinelor n

organismul animal Li uman rKmn nsK ncK neclare. " e d m a n (3@@#

considerK cK ratele de absorbie Li metabolizare diferite sunt datorate


47/57

sensibilitKii diferite a animalelor. 2li specialiLti (M e I 6, *++) - a v r e t,

*++?# au considerat cK fusariotoxinele sunt rapid absorbite n intestinul

subire Li se eliminK n primele *F de ore de la ingestie, urmatK de o excreie

n cantitKi mici. 8otuLi, n produsele animaliere se gKsesc urme alefusariotoxinelor Li a derivatelor lor. %e aici apare nevoia unor studii avansate

privind mecanismele implicate n metabolismul micotoxinelor Li a

neutralizKrii activitKii lor nainte de a evalua riscul asupra sKnKtKii omului.

%eoarece cantitatea de deoxinivalenol prezentK n sngele Li esuturile de

origine animalK n urma intoxicaiei cu fusariotoxine este foarte micK, de

ordinal ppm, se impune folosirea unor metode de analizK adecvatK, cu limitede detecie n acest interval. %eLi pentru analiza deoxinivalenolului se

folosesc n general metode gaz cromatografice, Li metoda cromatografiei de

lic&ide de naltK performanK ("1;-# oferK performane analitice similare,

cu condiia unei purificKri riguroase a probei. 5biectivul acestui studiu a fost

acela de a determina incidena contaminKrii cu deoxinivalenol a fura0elor

administrate animalelor din loturile experimentale ale laboratorului Li

determinarea gradului de transmitere a acestuia n snge la ovine n

condiiile unei intoxicaii acute sau cronice.

MATERIAL*L DI METO5A 5E CERCETARE

Me"$de de anali4#

Experienele sau desfKLurat la /.-.%.-.5.-. 1alas-onstana, n perioada

*++*++:, n baza unui proiect -EE, finanat de la buget iar instituiaconducKtoare, care a Li asigurat fura0ul contaminat, a fost /.B.-.%.2.

=undulea. =ura0ul a fost contaminat artificial prin in0ectarea fnului de

lucernK sub formK de baloi nfoliai cu filtratul de culturK al cipercii

Fusarium medicaginis (un litru de filtratH balot de *+ Ig#, iar fura0ul de


48/57


49/57

folosii pentru extracie Li ca fazK mobilK (apa distilatK, metanol, acetonitril#

au puritate grad "1;-. Enzima folositK n procesul de extracie a

deoxinivalenolului din ser este glucuronidaza arilsulfataza extrasK din

)eli* pomatia. 1entru determinarea micotoxinei din fura0e Li ser prin te&nicaE;/S2 sau

folosit truse %5B R/%2S-REEB.

Me"$da HPLC pen"ru de"er!inarea de$&ini%alen$lului din c$ncen"ra"ul

de cereale

E&"racGia micotoxinei sa efectuat prin omogenizarea a *9 g amesteccontaminat mKcinat n *++ ml apK distilatK Li agitare timp de + min. la

temperature camerei. /mediat dupK terminarea agitKrii, cel puin *+ ml din

extract sa filtrate prin &rtie de filtru A&atman nr. 33. 1entru purificarea

probelor sau folosit coloane de imunoafinitate %5B1RE1. Sa utilizat

procesul de 7bacIflus&ingQ (inversarea fluxului eluanilor pentru completa

denaturare a anticorpilor# de ori Li apoi sa trecut aer prin coloanK. 1roba

purificatK, recuperatK n metanol, a fost evaporatK la sec sub un current de

azot. Clterior aceasta a fost reluatK n 3,+ ml fazK mobilK Li amestecatK

viguros timp de + sec. folosind un vortex. 2ceastK etapK are rolul att de a

concentra proba, innd cont de cantitKile mici de analit, ct Li pentru a

obine rezultate reproductibile, prin reluarea ntrun volum fix de fazK

mobilK. %in probK sa in0ectat n sistemul "1;- un volum de 3++l.

C$ndiGii cr$!a"$grafice=aza mobilK a fost constituitK dintrun amestec apK ' metanol ' acetonitril (@F

' ' vHvHv#) eluia sa realizat timp de 39 minute la un debit de 3,+ mlHmin.

la temperatura coloanei de +o-.


50/57

Preg#"irea s"andardel$r 'i preg#"irea curei s"andard. 1udra cristalinK de

%5B se reconstituie cu 3+ ml acetonitril 3++> pentru a obine o soluie stoc

cu concentraia de 3++gHml %5B. %in aceasta sau preparat soluii seriate

n faza mobilK (3+gHml, 9gHml, *gHml, 3gHml, +,9 gHml# Li sain0ectat 3++l din fiecare soluie seriatK de standard n sistemul "1;-.

Me"$da HPLC pen"ru de"er!inarea de$&ini%alen$lului din serul $%in

Extracia deoxinivalenolului din probele de ser sa fKcut dupK metoda

descrisK de ; a n g (*++?#. 1robe de *,+ ml de ser au fost incubate peste

noapte,la temperatura camerei, cu cte ,+ ml tampon fosfat (p" ?,:# Li :+Jl glucuronidaza arilsulfataza extrasK din)eli* pomatia. -ei 9,+ ml de

ser, incubai, au fost purificai ulterior prin coloane de imunoafinitate

%5B1RE1.1rincipiul de purificare este acelaLi ca pentru probele de cereale,

diferK doarsolvenii folosii. -oloanele de imunoafinitate au fost spKlate o

datK cu 3F,+ ml1!S Li de douK ori cu cte *,+ ml apK distilatK. Eluia sa

fKcut cu *,+ x *,+ ml metanol. 1robele obinute sau concentrat la sec sub

azot Li au fost reconstituiten 39+ Jl faza mobilK (aceeaLi ca pentru probele

de cereale#, n vederea analizei"1;-. -ondiiile cromatografice au rKmas

aceleaLi' sa in0ectat cte 3++ Jl din fiecare probK) debitul a fost de 3,+

mlHmin. Eluia sa realizat timp de 39 minute, iar deoxinivalenolul a fost

detectat la *3: nm.

REZ*LTATE DI 5I7C*II1. In"$&icaGia cr$nic#

Re4ul"a"ele de"er!in#ril$r c$ncen"raGiei de 5ON din pr$ele de fura3e.

2naliza serului sangvin poate da informaii preioase privind expunerea la

diferite concentraii de micotoxine. 1robele biologice, de genul serului, sunt


51/57

matrici complexe, n care un numKr mare de produLi pot interfera n analiza

micotoxinelor Li prezintK avanta0ul cK pot fi colectate fKrK mari eforturi.

Metoda "1;- pentru determinarea micotoxinei %5B din diferite matrice

este o metodK cantitativK, de referinK, care conferK o acuratee sporitKanalizelor, nsK necesitK o purificare riguroasK a probelor. 1urificarea se

poate face

prin mai multe metode, nsK metoda cea mai folositK n prezent este

purificarea prin coloane de imunoafinitate (/2-# (G r s I a Li A e l z i g,

*++3#. 1rin purificarea probelor cu a0utorul coloanelor de imunoafinitate se

mbunKtKesc att selectivitatea, ct Li sensibilitatea metodei. 2cest lucrupermite o mai bunK detecie a micotoxinei, c&iar Li atunci cnd aceasta se

aflK n cantitKi foarte mici, de genul probelor de ser, Li eliminK interferenele

legate de produLii acetilai ai deoxinivalenolului (2c%5B Li 392c%5B#.

-oloanele de imunoafinitate conin un anticorp monoclonal specific pentru

%5B care poate purifica %5Bul din probe. %5Bul prezent n probK se

leagK de anticorpul din coloanK, care este apoi spalatK pentru ndepartarea

interferenelor) toxina este eliberatK ulterior prin eluare cu metanol. %eLi

extracia din cereale sau alte produse derivate este mai eficientK n cazul

folosirii unui amestec de apK Li acetonitril (! e n n e t t Li G l i c &, *++) G r

s I a Li A e l z i g, *++3#, n cazul nostru extracia deoxinivalenolului din

probele de amestec de fura0 sa fKcut numai n apK datoritK purificKrii

ulterioare a extractelor prin coloane de imunoafinitate.


52/57

datelor -&romeleon (%ionex#. -urba de calibrare pentru detecia

deoxinivalenolului din fura0e (figura 3# este dreaptK Li porneLte din origine)

coeficientul de linearitate obinut a fost de +,@@?.

Fig. +]-urba de calibrare pentru deoxinivalenol

(-alibration curve of t&e deox6nivalenol#


53/57

Fig. 2]-romatograma %5B fura0 contaminat(%5B c&romatogram contaminated forage#

-oncentraia medie nregistratK a fost de F3,9F microgrameHIg, cu variaii

cuprinse ntre F3,33 Li F3,:? microgrameHIg (tabelul 3#, n amestecul 3

("1;-# Li ,F9 mg, cu limite ntre ,33,9 n amestecul * (E;/S2#) ;%

fiind de 3:,9 mg.


54/57

Tabelul 1

C$ncen"raGie de 5ON nregis"ra"# n pr$ele de fura3e

(%5B concentration from t&e forage samples#

Nr.

Cr".

C$ncen"ra"ie 5ON

A!es"ec 1 : HPLC;@g-g

A!es"ec 2 : ELI7A;@g-g

1. F3,:? ,332. F3,9* ,*3. F3,?: ,9*?. F3,33 ,?9B. F3,9? ,9

Medie F3,99 ,F9

1robele de fura0 administrate n cazul intoxicaiei acute au avut o

concentraie medie de %5B, analizatK prin te&nica E;/S2, de ,F9 mgHIg

(tabelul 3#. -oncentraia de %5B nu depKLeste norma legalK admisK (3*9+

gHIg pentru cereale neprocesate# stabilite de -omisia CE (-omisia -odex

2limentarius# (tabelul *# pentru gradul de contaminare cu deoxinivalenol n

cazul amestecului utilizat n inducereea intoxicaiei cronice, dar l depKLeLte

n cazul fura0elor administrate n intoxicaia acutK.

Tabelul 2

Li!i"ele !a&i!e s"aili"e de *niunea Eur$pean# pri%ind c$ncen"raGia 5ON

din diferi"e !a"rice


55/57

(Maxim limits fixed b6 t&e European Cnion regarding %5B concentrations in different

matrices

Pr$dus Ni%el !a&i!

:@g-g;

-ereale neprocesate, altele decat graul, ovaz si porumb 3*9+4rau, ovaz, porumb neprocesate 39+1orumb neprocesat 39+=aina de cereale incluzand si malai 9+1aine, biscuiti, cereale pentru mic de0un 9++1aste fainoase 9+-ereale procesate pentru &rana sugarilor si copiilor mici *++

Re4ul"a"ele de"er!in#ril$r c$ncen"raGiei de 5ON din pr$ele de ser

1entru extracia deoxinivalenolului din ser sau incubat mai nti probele cu

enzimaglucuronidaza arilsulfataza extrasK din)eli* pomatia, deoarece la

rumegKtoare principalul metabolit n plasmK este con0ugatul glucuronidat (1

r e l u s I 6 Li colab., 3@:?, 3@:, 3@@#. 1rezena metaboliilor glucuronidai

a fost pusK n evidenK prin creLterea ratei de recuperare a %5B dupK

tratamentul cu glucuronidaza arilsulfataza. Studiile au aratat cK dupK

administrarea oralK a deoxinivalenolului proporia de %5B glucuronidcon0ugat n plasmK este de > (1 r e l u s I 6 Li colab., 3@:?#. %eLi studiile

aratK cK glucuronid %5B este mai puin toxic, timpul sKu de in0umKtKire

este mai mare comparativ cu cel al %5Bului liber. 2naliza cromatograficK a

tuturor probelor de ser recoltate de la animalele supuse intoxicaiei cronice a

condus la obinerea unor rezultate nesemnificative de intoxicare, la toate

animalele din experienK, care ar putea fi explicate prin cantitatea micK

ingeratK, sub limita dozei zilnice tolerate (8%/#) menionKm cK pentru %5B

doza minimK este de 3,+ JgHIg greutate corporalK. Este important sK luKm n

calcul Li faptul cK rumegatoarele, comparativ cu animalele monogastrice,

sunt mai rezistente la aciunea ma0oritaii micotoxinelor, fapt datorat


56/57

probabil, unei detoxificKri la nivel ruminal.


57/57

2bsena deoxinivalenolului din probele de ser semnificK faptul cK la

aceastK concentraie, acesta este fie eliminat rapid, fie transformat n ali

produLi de metabolism.

2dministrarea unui fura0 cu o cantitate de %5B crescutK (,F9 mgHIg# acondus la trecerea acestuia n snge n proporie de 9+>, prezena

micotoxinei n ser avnd valoarea medie de ,3 JgHl.

;a rumegKtoare sau realizat mai puine studii cu privire la efectul

tricotecenelor, iar rezultatele sunt destul de contradictorii. -a urmare,

studiile ulterioare trebuie sK determine dacK la alte concentraii de %5B are

loc transmiterea acestuia n ser.

analiza hplc a micotoxinelor

Documents