Cromatografie de lichide de inalta performanta cuplata cu spectrometrie de mas (HPLC-ESI Q-ToF MS)Ing. Loredana Todi

Cromatografie de lichide de inalta performanta (HPLC)Spectrometrie de masa (MS)Avantajele cuplarii HPLC-MS

HPLC-MS

HPLC HPLC metoda analitica utilizata in scopul separarii, identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutieHPLC

Calitativ: separarea, determinarea componentilor pe baza timpului de retentie;

Cantitativ: curba de etalonare - pe domeniul de valabilitate al legii Lambert Beer (variatie liniara a raspunsului DAD cu concentratia)ANALIZE: farmaceutice clinice toxicologice de mediu industriale alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationareCromatografia de adsorbtie : faza stationara - adsorbant de tip silicagel/ alte umpluturi pe baza de silice principiul separarii: etape repetate de adsorbtie-desorbtie Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa Interactiuni polare (dipol-dipol) faza normala

Cromatografia de schimb ionic : suprafata fazei stationare este incarcata ionic, de semn contrar ionilor analitului specifica analitilor ionici/ionizabili Interactiuni ionice

SEC (GPC) : umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate proba este separata functie de marimea ionului solvatatInteractiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala

faza stationara puternic polara (silicagel) faza mobila nepolara

Cromatografie cu faza inversa

faza stationara nepolara, lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice :Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze80%Octadecilsilice (ODS, C18)10%Octil (C8)5%Butil (C4)3% Fenil

2%Ciano (CN) faza mobila polara (faza organica - CH3OH, CH3CN, THF si/sau apa, cu/fara sol. tampon)HPLC Elutieizocraticain gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatograficaColoana: dimensiuni (L,d), TFaza stationara: natura, diametrul particulelorFaza mobila: tipul de elutie, debitul, solventiiAnalitul: polaritate, masa moleculara, concentratieHPLCFaza mobila compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm, 60% MeOH in Apa:

Benzamida, alcool benzilic, acetofenona, benzoat de metil, fenetol, naftalina, benzofenona, bifenilElutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen,(2)-Monoclorbenzen,(3)-Ortodiclorobenzen, (4)-1,2,3 triclorobenzen,(5)-1,3,5triclorobenzen,(6)-1,2,3,4 tetraclorobenzen, (7)-Pentaclorobenzen, (8)-Hexaclorobenzen

Dimensiunea particulelor (m)Timpul de retentie (min)Presiunea (bar)53019318871,59700

HPLCDetectorul cromatografic ideal

Raspuns independent de compoziia fazei mobile, debit, temperatura Sensibilitate panta curbei de calibrare mare sensibilitate mare Selectivitatea Raspuns rapid Zgomot de fond scazut Non-destructiv pentru proba Domeniu dinamic liniar mare Stabilitate ntr-un timp ndelungat de operare

RIUV/VISFluorescentaMSRaspunsUniversalSelectivSelectivSelectivSensibilitate4 micrograme5 nanograme3 picograme1 picogramSensibilitate la debitDANUNUNUSensibilitate la temperaturaDANUNUNU

Sursa de vid - atmosfera inert in interiorul instrumentului; Sursa de ioni ionizarea atomilor sau moleculelor neutre; polimeri: MALDI, ESI Analizorul de masa selecteaza ionii functie de valoarea raportului m/z: Quadrupol, ToF, Q-ToF Detectorul conversia curentului ionic in curent electric Sistem de analiza a datelor - controlul parametrilor, prelucrarea datelorSpectrometria de masa. Principiul metodei Spectrul de masa - abundenta ionilor corelata cu raportul m/z Spectrometria de masa metoda de caracterizare utilizata intens in ultimii ani in caracterizarea macromoleculelor sintetice sau naturale: informatii despre compozitie, distributia masei moleculare principiul: transformarea ionilor din faza lichida ioni in faza gazoasa, accelerarea si separarea acestora functie de raportul m/z, detectia si inregistrarea spectrului

Sursa de vidSursa de ioniAnalizor de masaDetectorSistem de date

Metode de ionizare

Faza in care se gaseste probaMetoda de ionizarePresiuneaGazElectron Impact (EI)Vid inaintatChemical Ionization (CI)Vid mijlociuPhotoionization (PI)Vid inaintatField ionization (FI)Vid inaintatMetastable Atom BombardmentVid inaintatSolutieThermospray (TS)Vid grosierAtmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)Presiune atmosfericaAtmospheric Pressure Photoionization (APPI)Presiune atmosfericaElectrospray (ESI)Presiune atmosfericaSolidPlasma DesorptionVid inaintatField Desorption (FD)Vid inaintatFast Atom Bombardment (FAB)Vid inaintatMatrix Asisted Laser Desorption (MALDI)Vid inaintat

Componentele spectrometrului de masa Agilent 6520Sursa ionizare ESI (evaporare & ionizare)Sisteme de mentinere a vacuumului (pompa rotativa, pompe turbomoleculare)Elemente de ghidare si focusarea fasciculului de ioni Analizoare de masa Q, ToF (CC/RF- Scan sau SIM)Detector de ioni si Amplificator de semnalSistem de control si achizitie a datelorMS

Electrospray Ionization (ESI) Producerea picaturilor incarcate electric Evaporarea solventului si contractia picaturilor Densitate de sarcini crescuta explozii coulombice si dezintegrarea picaturii in picaturi mai mici Desorbtia ionilor in faza gazoasa

Metoda de ionizareAnaliti uzualiIntroducerea probeiDomeniul de masaCaracteristiciElectron Impact (EI) Mic-moleculari Volatili GCProbe lichide/solide 1.000 DaIonizare agresivaInformatii structuraleElectrospray (ESI) Mic-moleculari Macromoleculari Volatili, nonvolatiliLCInjectie directa (seringa) 20.000 Da Ionizare blanda Specii incarcate multiplu

Formarea aductilorModul ESI (+)

Moleculele protonate [M+H]+, [M+nH]+ Aducti cu diferiti ioni [M+Na]+, [M+K]+ sau cu Ag+, Cs+, Li+, NH4+ Aducti de tip cluster cu solvent [M+nxCH3CN+H]+

Modul ESI (-)

Molecule deprotonate [M-H] , [M-nH]- Aducti [M+HCOO -] -, [M+Cl-] etc.Spectrul ESI al Tripsinogenului (+) (Mw=23983)Spectrul ESI al anilinei (-)

Factorii care influenteaza procesul ESI Natura probei: pH, puritate, polaritatea analitului, caracter covalent/ionic, mic/macro-molecular Concentratia analitului

Natura solventului: tensiune superficiala, polaritate, vascozitate, constanta dielectrica, volatilitate, debit; solventul ideal functie de natura analitului: modul ESI (+) : 50% CH3OH/ CH3CN si 50% H20 modul ESI (-) : solventi halogenati: CH2Cl2, CHCl3

MS Parametrii din sursa ESI: temperatura gazului de uscare, presiunea nebulizatorului, debitul de gaz de uscare, voltajele elementelor de transport si ghidaj, distanta de la capatul acului de injectie la contraelectrod

Prezenta unor agenti de cationizare: NaI, KI, HCOONH4, HCOOH, CH3COOH etc.Determinarea cantitativa a amestecurilor in ESI Q-ToF - eficienta de ionizare a tuturor componentelor (Mw, solubilitate, gr functionale nr situsuri la care se pot atasa electrostatic H+, cationi) - competitie - supresie

Ce tipuri de analiti pot fi analizati prin ESI-Q-ToF-MS?Molecule organice volatile si mai ales nevolatile, labile termicMolecule polare/ polarizabile - solubile in solventi polari si volatili R-NH2, R-COOH, R-SO3H, R-OH, R-O-R, R-CHO, R1-CO-R2, zaharide etcBiopolimeriProteine, peptide, ADN, ARN, polizaharidePolimeri sinteticiComplecsi organometalici

Ce tipuri de analiti NU pot fi analizati prin ESI-Q-ToF-MS? Molecule nepolare (lanuturi hidrocarbonate), fara grupari polarizabile Probe in solventi nepolari sau nevolatili: hexan, benzen, CH2Cl2, DMSO, DMF, etc. Probe care contin:sisteme tampon incompatibile cu ESI : saruri nonvolatile solutii cu o conductivitate electrica prea mare (ex. > 100 mM HCl, TFA)detergenti Amestecuri complexe spectre de masa complexeMS

Avantajele cuplarii HPLC/MS

Cromatografia metoda oarba achizitie simultana atat a timpilor de retentie, cat si a maselor moleculare ale componentilor din amestec ;Polimeri sintetici cu indice de polidispersitate crescut eficienta de ionizare inegala pentru componentii probei necesarea separarea prealabila LC sau GPCNu exista degradare termicaAnaliza rapidaCantitati foarte mici de proba, sensibilitate inaltaInformatii structurale prin LC/MS/MSMasa moleculara medie sau indicii de polidispersitate pot fi utilizate pentru a verifica procedurile de sinteza, in studiul mecanismelor de degradare, determinarea aditivilor si a impuritatilor, etc. Determinarea masei moleculare absolute a lanturilor macromoleculare spre deosebire de tehnicile cromatografice precum SEC care furnizeaza valori relative.

HPLC-MS

***High Performance Liquid Chromatography (HPLC) este una dintre cele mai folosite tehnici analitice. Separarea amestecului, dizolvat intr-un solvent adecvat are la baza distribuirea intre o faza mobila si una stationara. Curba de calibrare - folosind substante standard, de concentratii cunoscute

*

Selectia tipului de coloana si a fazei mobile se face functie e natura analititilor care necesita a fi separati: polimeri, polizaharide, peptide, proteine, acizi nucleici, compusi organici mic-moleculari;

Clasificare functie de natura fazei stationare si, implicit, pe modul de separare 3 tipuri de cromatografie:

Cromatografia de schimb ionic : faza stationara poseda o suprafata incarcata ionic, de semn contrar ionilor analitului specifica analitilor ionici/ionizabili; cu cat sarcina analitului este mai puternica, cu atat va fi mai puternic atras de faza stationara timp de retentie mai mare; faza mobila este o solutie tampon apoasa, pH-ul si taria ionica fiind parametrii de control ai timpului de elutie.

SEC (GPC) : umplutura coloanei este constituita dintr-un material ce poseda pori cu dimensiuni controlate; Proba este separata functie de marimea ionului solvatat. Moleculele de mari dimensiuni sunt indepartate rapid, avand mai putine posibilitati de a patrunde in porii adsorbentului; moleculele mai mici patrund in interiorul porilor si elueaza mai tarziu;

*

Cel mai utilizat suport - particule de silice poroasa cu faza stationara legata la suprafata (C18-ODS). Gruparea izobutil se foloseste pentru protejarea legaturilor Si-O impotriva hidrolizei.

Principiul separarii: cu cat natura analitului va fi mai apropiata de cea a fazei stationare, cu atat interactiunile lui cu aceasta vor fi mai puternice VA ELUA MAI TARZIU, TIMP DE RETENTIE CRESCUT.

Elutie in gradient: O faza mobila care confera o separare buna acomponentelor inalt polare va conduce la timpi de retentie excesiv delungi pentru componentele nepolare si invers separarea se atinge cel mai adesea prin varierea compozitiei fazei mobile.

In cromatografia cu faz invers compozitia initiala este polar, iar polaritatea descrete n timpul separrii creste cantitatea de solvent organic din compozitia fazei mobile.

C1 (trimethylchlorosilane) si C4 (dimethylbutylchlorosilane):Separare si purificarea proteinelor PhenylSepararea amestecurilor complexeCNSuprafata usor polara si in faza inversa si in cea normalaPt amestecuri de compusi foarte diferiti NH2Schimbator de ion slab - in faza normala retinerea compusilor aromatici.DiolAdsorbant usor polar - faza normalaAmestecuri complexe de compusi cu polaritate foarte diferita*Concentratia uzuala a analitului pt LC: 5 100 M

Diam intern coloanei = 4 sau 4.6 mm compromis intre viteza de separare, rezolutie, consum de solventiL = 10,15,25 cm; Diam particulelor = 3, 5 sau 10 microni

Solventul poate ataca unele piese ale cromatografului (pompe, valve, detector etc) CHCl3 CARE DA HCl coroziv

Faza normala solventi nepolari: CHCl3, CHCl3 MeOH, CCl4 Acetone, acetat de etil-toluen, acetat de etil-hexan, toluenhexan

Pentru faza inversa eluentii sunt de obicei amestecuri de apa si un alt solvent polar organic acetonitril, metanol

*Cel mai folosit tip de detector cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL. Un astfel de detector, capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800 nm, potrivit pentru majoritatea compusilor. DAD - poate fi aleasa lungimea de unda ptima pentru o anumita analiza

Alte tipuri de detectori:

RI indice de refractie. Detector universal, sensibil la T, greu de stabilizat linia de baza, NON-SELECTIV gruparile functionale pot exista in orice compusFD Fluorescence. Analitul trebuie sa posede grupari fluorofore; foarte selectiv si sensibil; SELECTIVMS Mass Spec. Permite identificarea raportului m/z

Mai exista si detectorul conductometric.*

Spectrometria de masa este o metoda de caracterizare extrem de valoroasa, utilizata intens in ultimii ani in caracterizarea macromoleculelor sintetice sau naturale. In cazul analizei polimerilor se pot obtine informatii cu privire la distributia masei moleculare, compozitie, in conditiile in care structurile analizate permit ionizarea.

Procesul de analiza se realizeaza in aparate numite spectrometre de masa, care se compun in principal din cinci elemente:

Proba este introdusa in sursa de ioni, unde sufera un proces de volatilizare si ionizare, ionii rezultati fiind apoi accelerati in camp electric si focalizati catre analizorul de masa, unde sunt separati functie de raportul specific, m/z (masa ionului/ sarcina electrica a acestuia). Sistemul de vid mentine o atmosfera inerta in interiorul aparatului, prevenind ciocnirile ionilor cu moleculele neutre, care ar genera o serie de reactii secundare, ingreunand interpretarea spectrului. La iesirea din analizorul de masa, ionii sunt accelerati in ordinea cresterii masei catre detector, care produce un semnal proportional cu abundenta lor. Programul cu care este dotat computerul genereaza un spectru care constituie reprezentarea grafica a abundentei ionilor corelata cu raportul m/z *Sursa de ioni are rolul de a realiza vaporizarea si ionizarea moleculelor prezente in proba de analizat. Necesitatea ionizarii moleculelor neutre rezida din faptul ca modul si directia de deplasare a particulelor incarcate electric sunt mai usor de manipulat din punct de vedere experimental, aplicand unui camp electric/ magnetic .

Moleculele neutre aflate in stare gazoasa se caracterizeaza printr-o miscare de tip brownian, iar separarea lor pe baza fortei gravitationale este total nepractica si daca totusi ar fi pusa in aplicare, ar necesita ca aceste specii neutre sa parcurga o cale extrem de lunga.

Ionizarea poate fi indusa printr-o varietate de tehnici; In tabelul 1 sunt prezentate cele mai utilizate dintre acestea, cu denumirea sub care se gasesc in literatura anglo-saxona de specialitate*Ionii rezultati in urma procesului de ionizare ESI sunt atrasi inspre capilara de sticla, care separa cele doua regiuni ale aparatului, cea aflata la presiune atmosferica (sursa de ioni) si cea cu vid inaintat. Folosirea unui simplu orificiu in locul capilarei ar conduce la scaderea brusca a presiunii. Capilara este confectionata din sticla izolatoare si are un invelis metalic la capetele, la care se aplica o diferenta de potential. Capilara asigura, pe langa procesul de dirijare a fasciculului de ioni, eliminarea si prevenirea formarii clusterilor (mai ales clusterii formati cu apa).

Caderea de presiune de-a lungul capilarei conduce la formarea unui fascicul supersonic de ioni, in centrul caruia se concentreaza ionii cu masa ridicata; ionii cu masa scazuta sunt afectati mai puternic de caderea de presiune si, in consecinta, sunt indepartati cu ajutorul skimmerului, impreuna cu excesul de molecule neutre, provenite atat din solvent cat si din proba neionizata.

In continuare, fasciculul de ioni este dirijat catre quadrupolul 1 (MS1) cu ajutorul unui octopol, format din opt tije metalice dispuse paralel si conectate la o sursa de curent de radiofrecventa si respectiv de curent continuu. Tijele adiacente prezinta voltaj de semn contrar. In interiorul octopolului are loc uniformizarea distributiei energetice a ionilor inaintea intrarii acestora in quadrupol, pentru a impiedica dispersarea fasciculului de ioni. In plus, aceasta regiune permite eliminarea unei cantitati apreciabile de specii neutre, sub actiunea unei pompe turbomoleculare.

La iesirea din octopol, ionii sunt ghidati de doua lentile, care exercitao actiune repelenta asupra ionilor prin potentialul de aceeasi polaritate aplicat. In modul SIM, analizorul de masa quadrupolar separa ionii, permitand doar ionului (sau unui domeniu limitat de ioni) caracterizat de un anumit raport m/z sa traverseze lungimea quadrupolului la un anumit moment, pe cand in modul SCAN, acesta joaca rolul de element de ghidaj al ionilor.

In celula de coliziune, presiunea este de aproximativ 8 x 10-3 Torr, pe cand presiunea exterioara celulei este de 10-5 Torr; la ambele capete ale celulei de coliziune exista cate un orificiu, pentru ca ionii sa intre si sa iasa din aceasta. Deoarece presiunea in camera de coliziune este crescuta, gazul se degaja pe la ambele capete ale sale. Presiunea la iesirea din celula de coliziune scade, iar in lipsa unui filtru suplimentar, capatul quadrupolului s-ar afla la presiunea de 10-3 Torr, fapt care ar afecta stabilitatea ionilor. Post-filtrul nu este conectat la o sursa de curent continuu, ci doar la una de curent de radiofrecventa, avand doar rolul de dispozitiv de ghidare a ionilor catre orificiul de intrare al celulei de coliziune, unde sunt supusi ciocnirii cu moleculele de azot.Celula de coliziune contine in interiorul sau un hexapol al carui diametru este dublu fata de cel al octopolului, pentru a favoriza ciocnirile intre ioni si moleculele de gaz.

Daca energia de coliziune are o valoare suficient de crescuta, molecula va vibra suficient de rapid incat sa se produca fragmentarea. Cat de mult se fragmenteaza un ion depinde de energia de coliziune, de parametrii gazului si de insasi structura sa. Moleculele cu masa mica necesita energii de fragmentare scazute, pe cand ionii cu masa mai mare se fragmenteaza la valori ale acesteia mai ridicate.

In continuare, ionii sunt ghidati catre analizorul de tip ToF si trimisi catre detector, care cuantifica abundenta ionilor si genereaza un semnal ce va fi amplificat si inregistrat sub forma unui spectru.

*

La capatul acului e injectie se aplica un potential electric suficient de mare incat solutia de proba este dispersata in picaturi foarte fine, incarcate electric. Potentialul electric aplicat la capatul acului de injectie si al contraelectrodului cauzeaza migrarea ionilor + catre suprafata lichidului, speciile incarcate deplasandu-se in directie opusa.In modul negativ, procesul de ESI are loc similar, la capatul acului de injectie si contarelectrodului aplicandu-se un potential electric de polaritate opusa decat in cazul ESI (+).

Gazul de uscare N2 asigura limitarea in spatiu a norului de picaturi.

Acumularea progresiva a sarcinilor + conduce la destabilizarae suprafetei lichidului, pana intr-un punct in care repulsiile dintre ionii de acelasi semn depasesc forta de tensiune superficiala care asigura coezivitatea picaturii

Spre deosebire de EI, energia necesara ionizarii si volatilizarii probei nu este furnizata odata, intr-un timp foarte scurt, de aceea nu apare fragmentarea.

*Adesea, ionii analitului preexista in solutie analitul este sub forma ionica (peptide - amfion) sau rezulta din reactia cu solventul sau sarurile existente in faza mobila in cazul aminelor biogene s-a adaugat acid TCA care asigura solubilizarea in mediu apos.

TFA realizeaza supresia ionilor, solutie avand o conductivitate electrica prea pronuntata.

Transferul H+ are loc de la solvent sau de la acidul adaugat in scopul cresterii eficientei de ionizare: HCOOH, CH3COOH.

Densitatea de sarcina crescuta si prezenta analitilor cu multiple grupari acide/bazice favorizeaza formarea speciilor cu multiple sarcini.

Agentii de cationizare cantitati foarte mici : NaI, CH3COONa LiI, KI, AgI, CsI HCOONH4Analitii care nu poseda grupari bazice pot forma ioni negativi in modul ESI (-). In practica s-a dovedit ca analizele in modul ESI (-) tind sa manifeste o MODUL (-) sensibilitate mai scazuta fata de cele in modul (+).

*Continut apa tensiune superficiala mare si volatilitate scazuta - problemeDebitul trebuie sa asigure forma constanta a conului Taylor si densitate constanta a picaturilor in norul de gaz

Voltajele elementelor de transport si ghidaj: Extremitatile capilarei, Skimmer, Octopol

Favorizarea formarii speciilor multiply charge - densitate crescuta de sacini transport mai facil

*

Problema: concentratie mare de saruri background puternic (formare de clusteri)

Saruri nonvolatile (NaH2PO4) supresia semnaluluiIn cazul amestecurilor, diferitii componenti se afla in competitie pentru protonii cu care formeaza aducti, prin urmare unii compusi pot avea un efect de supresie asupra altora, diminuandu-le eficienta de ionizare.

Obtinerea ionilor incarcati multiplu permite analiza moleculelor cu masa moleculara inaltaDezavantajeNU fragmentare CID !!Proba solubila in solvent polar (MeOH, ACN, H2O, Acetona cei mai buni)Spre deosebire de EI, energia necesara ionizarii si volatilizarii probei nu este furnizata odata, intr-un timp foarte scurt, de aceea nu apare fragmentarea.

*