Scopul cercet rilor a fost ob inerea unor biofungicide pe baz de microorganisme utile n combaterea biologic a fungilor fitopatogeni din genurile Botrytis i Penicillium care produc boli diferitelor plante de cultur i depreciaz calitatea produselor agroalimentare. Pentru realizarea scopului propus s-au avut n vedere urm toarele obiective majore: Izolarea i identificarea fungilor fitopatogeni din genurile Botrytis Penicillium;

i

Stabilirea poten ialului antifungic i a spectrului de ac iune al tulpinilor de microorganisme; Ob inerea biofungicidelor; Testarea in vitro i in vivo a biofungicidelor.

TULPINILE DE FUNGI FILAMENTO I UTILIZATE N EXPERIMENTE

Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Tulpina Botrytis cinerea Botrytis cinerea Botrytis cinerea Botrytis cinerea Penicillium sp. Penicillium sp. Penicillium sp. Penicillium sp. Penicillium sp.

Nota ia de lab. F37 F38 F39 F47 F40 F42 F43 F45 F46

Povenien a Colectia de culturi a Laboratorului de Microbiologie U.S.A.M.V. Bucuresti, F.I.F.I.M. (c p uni) I.C.D.P.P. DR. LILIANA TEFAN (c p uni) I.C.D.P.P. DR. LILIANA TEFAN (struguri) I.C.D.P.P. DR. LILIANA TEFAN (mere) Colectia de culturi a Laboratorului de Microbiologie U.S.A.M.V. Bucuresti, F.I.F.I.M. (mandarine) Colectia de culturi a Laboratorului de Microbiologie U.S.A.M.V. Bucuresti, F.I.F.I.M. (castrave i) Colectia de culturi a Laboratorului de Microbiologie U.S.A.M.V. Bucuresti, F.I.F.I.M. (portocale) Colectia de culturi a Laboratorului de Microbiologie U.S.A.M.V. Bucuresti, F.I.F.I.M. (l mi) Colectia de culturi a Laboratorului de Microbiologie U.S.A.M.V. Bucuresti, F.I.F.I.M. (l mi)

Fig. 1 Atac de Botrytis cinerea pe c p uni

Fig. 2 Caise infectate cu Monilinia laxa, M. fructigena, Penicillium sp., Rhizopus sp.

Fig. 3 Mandarin infectat cu Penicillium italicum

Fig. 4 Portocal infectat cu Penicillium digitatum

Fig. 5 L mie infectat cu Penicillium italicum

Fig. 6 Botrytis cinerea (400 x)

Fig. 7 Penicillium digitatum (400 x)

Fig. 8 Penicillium expansum (400 x)

Fig. 9 Penicillium italicum (400 x)

Nr. Crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21.

Microorganisme Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae var. ellipsiodeus Saccharomyces chevalieri Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces florentinus Pichia membranaefaciens Kloeckera apiculata Saccharomyces sp. Candida glabrata Candida tropicalis Candida guilliermondii Candida sp. Candida guilliermondii Saccharomyces sp. Metschnikowia pulcherrima Metschnikowia pulcherrima Saccharomyces chevalieri S. cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiae

Nota ia de laborator L2 L8 L9 L12 L13 L16 L17 L18 L20 (182) L21 L24 L25 L26 L27 L28 (SG2) L29 (SG1) L30 (Sch) 17/17 9744C 10701C SMR4

Provenien a U.S.A.M.V.-Bucure ti, Conf.dr.Mirela Burcea U.S.A.M.V.-Bucure ti, Conf.dr.Mirela Burcea U.S.A.M.V.-Bucure ti, Conf.dr.Mirela Burcea U.S.A.M.V.-Bucure ti, Conf.dr.Mirela Burcea U.S.A.M.V.-Bucure ti, Conf.dr.Mirela Burcea U.S.A.M.V.-Bucure ti, Conf.dr.Mirela Burcea U.S.A.M.V.-Bucure ti, Conf.dr.Mirela Burcea U.S.A.M.V.-Bucure ti, Conf.dr.Mirela Burcea I.C.C.F.-Bucure ti I.C.C.F.-Bucure ti I.C.C.F.-Bucure ti I.C.C.F.-Bucure ti I.C.C.F.-Bucure ti Izolate proprii (portocal ) Izolate proprii (bace de struguri) Izolate proprii (bace de struguri) I.C.D.P.P.-Bucure ti, Ing.dr. Liliana Aurora tefan Lab. de Genetic al Fac. de Biologie Prof. dr. Tatiana Vassu Prof. dr. Tatiana Vassu Prof. dr. Tatiana Vassu Prof. dr. Tatiana Vassu

Fig. 10 Metschnikowia pulcherrima L28 (400 x): Celule vegetative i asc cu ascospor

Fig. 11 Metschnikowia pulcherrima L29 (400 x) Celule vegetative i asc cu ascospor

Fig. 12 Fermentarea glucidelor: glucoz , sucroz , maltoz , trehaloz , lactoz

Fig. 13 Dezvoltarea la 4 grade Celsius

Fig. 14 YNB f r surs de carbon

Fig. 15 YNB cu sucroz

Fig. 16 YNB cu glicerol

Fig. 17 YNB cu galactoz

Fig. 18 YNB cu manitol

Fig. 19 YNB cu celobioz

Mediul YNB f r glucide YNB cu sucroz YNB cu glicerol YNB cu galactoz YNB cu manitol YNB cu celobioz YNB cu amidon YNB cu trehaloz Acetat de potasiu

Saccharomyces chevalieri L30 + + + + + +

Saccharomyces chevalieri L9 + + + + + + +

L28 + + + + + + +

L29 + + + + + + +

Saccharomyces cerevisiae 208 + + + + +

Pichia anomala L33 + + + +

Fig. 20 Rezultatele testului Auxacolor 2: Tulpina L28

Fig. 21 Rezultatele testului Auxacolor 2: Tulpina L29

Tulpina L28 L29 Tulpina L28 L29

Martor CEL + +

GLU + + TRE + +

MAL + + ADO + +

SAC + + MEL + +

GAL + + XYL -

LAC ARA -

RAF HEX + +

INO POX/PR O + +

Glu= glucoz , Mal= maltoz , Sac= zaharoz , Gal= galactoz , Lac= lactoz , Raf= rafinoz , Ino= inozitol, Cel= celobioz , Tre= trehaloz , Ado= adonitol, Mel= melezitoz , Xyl= xiloz , Ara= arabinoz , Hex= N-acetilgalactozaminidaza (hexozaminidaza), Pox= fenoloxidaza, Pro= prolin-arilamidaza.

Fig. 22 1 zi (fa ; verso)

Fig. 23 5 zi (fa ; verso)

Fig. 24 10 zi (fa ; verso)

Fig. 25 25 zi (fa ; verso)

Fig. 26 30 zi (fa ; verso)

Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

Tulpini de levuri Saccharomyces cerevisiae (L2) S. cerevisiae var. ellipsoideus (L8) S. chevalieri (F9) S. cerevisiae (L12) S.florentinus (L13) Pichia membranaefaciens (L16) Kloekera apiculata (L17) Saccharomyces sp.(Ll8) Candida glabrata (L20) C. tropicalis (L21) C. guilliermondii (L24) Candida sp. (L25) C. guilliermondii (L26) Saccharomyces sp. (L27) Metschnikowia pulcherrima (L28) Metschnikowia pulcherrima (L29) S. chevalieri (L30)

F40 ++ ++ ++ ++ ++ + + ++++ ++++ ++

Tulpini fungice Penicillium sp. F42 F43 F45 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + ++++ ++++ ++ ++ ++ ++ ++ + + ++++ ++++ ++ ++ ++ ++ ++ + + ++++ ++++ ++

F46 ++ ++ ++ ++ ++ + + ++++ ++++ ++

-= nu inhib deloc; + = inhib foarte pu in; ++ = inhib moderat; +++ = inhib bine; ++++ = inhib foarte bine

Proprietati antifungice

4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

F40 F42 F43 F45L2 L9 L13

F46L17 L20 L24 L26 F40 L28 L30

Tulpinile de levuri testate

Fig. 27 Interac ia dintre diferite tulpinide levuri i fungii filamento i de depozit din genul Penicillium sp.

Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Levuri anta goniste L2 L8 L9 L12 L18 L20 L26 L28 L29 L30

Diametrul (mm) coloniilor de Penicillium sp. (10 zile) F40 36 36 33 36 34 46 50 12 10 36 F42 35 34 34 37 35 50 47 11 12 34 F43 36 35 37 35 36 48 46 10 12 35 F45 35 34 35 37 34 48 50 12 10 35 F46 36 37 36 36 35 50 49 11 11 36 M 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60

E (%) 40,6 41,3 41,6 39,6 42 19,3 20,3 81,3 82 41,3

n privin a stabilirii eficacit ii in vitro a microorganismelor antagoniste asupra tulpinilor de fungi fitopatogeni s-a folosit formula: E (%) = (J martor - J interac iune)/ J martor x 100

unde: E(%)= eficacitatea (%) J martor = diametrul coloniilor martor (mm) J interac iune = diametrul coloniei patogenului n urma interac iunii cu antagonistul (mm).

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 L2 L8 L12 L18 L20 L26 L28 Tu lpi nil L9

Eficacitatea (%)

Fungi de depozit

Fungi de depozit L29 L30

e de levu ri te st ate

Fig. 28 Eficacitatea tulpinilor de levuri antagoniste

Pentru ca o tulpin de levuri s fie ncadrat n categoria agen ilor biologici de combatere, aceasta trebuie s ntruneasc o serie de condi ii i anume:

s produc sursa de inocul n cantitate mare; s supravie uiasc n condi ii de mediu extern; s fie tolerant fa de al i antagonisti; s germineze i s creasc rapid pentru ocuparea substratului organic; s produc substan e eficace i stabile chiar dac se cultiv pe un substrat mai sarac pe care cre terea este foarte slab ; s nu afecteze planta prin ac iunea substan elor produse; s aib valorile optime ale temperaturii, pH-ului i umidit ii diferite de cele ale patogenului;

Biomasa de levuri ob inut pe diferite medii de cre tere, dup 48 i 72 ore de la cultivare Mediul de cultur mediul cu decoct de porumb mediul Weindling mediul Czapek mediul mal -agar mediul YM Agar mediul YM Lichid mediul cu ape glicerinoase din uleiuri vegetale (25%; 50%; 100%) mediul cu ape glicerinoase din gr sime tehnic (25%; 50%; 100%) Biomasa g/l 48 ore 15,4 12,1 0,1 10,7 20,8 22,2 28,1 28,0 72 ore 15,8 12,3 0,2 10,8 22,6 30,4 33,8 33,8

Randamentele n biomas ale diferitelor variante experimentale testate Varianta Experimental Flacoane Erlenmeyer (0,5) Bioreactor 3 litri (5 l) Bioreactor 15 litri (25 l) *media a cel pu in trei determin ri Biomasa umed levuri (g/l) 29,92 1,64 30,15 2,21 29,64 2,26*

Biomasa uscat levuri (g/l) 7,75 0,74 7,84 0,93 7,56 0,87

*

Influen a temperaturii asupra cre terii levurilor pe mediu lichid, aerat i agitat

Temperatura (oC) 25 28 30

Biomasa umed

*

(g/l)

Biomasa uscat 4,620,57

*

(g/l)

21,17 0.84 28,72 1,66 24,47 1,04

6,67 0,61 5,74 0,69

* media a cel pu in trei determin ri

Efectul ratei de aerare asupra randamentului de biosintez n biomasa de levuri

Rata de aerare (l aer/l mediu/min) 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 * media a cel pu in trei determin ri

Biomasa umed * (g/l) 10,23 1,37 11,35 1,08 12,41 1,67 12,67 1,22 11,88 1,16

Biomasa uscat * (g/l) 3,42 0,42 3,94 0,37 4,42 0,54 4,58 0,48 3,87 0,35

Ingredient Biomas Alcool polivinilic Carboximetilceluloz sodic Lecitin Dispersil Acid citric Dextroz Celuloz

P ri 1,0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 1,5 0,3

Caracteristicile biopreparatelor realizate la scar pilot cu biomas uscat n prezen de antioxidan i i formulat ca pulbere umectabil

Nr. crt. 1.

Varianta experimental sta ie pilot ini ial (imediat dup amestecare) sta ie pilot 30 zile de la producere sta ie pilot 60 zile de la producere biopreparat realizat la nivel de laborator

Num r levuri viabile (ufc/g) 1,22x108 1,20x108 1,17x108 1,7x108

Suspendabilitate (%) 93

Umectabilitate (min)