Coloratii compuseMetodele compuse de colorare a microbilor se bazeaza pe unele caractere chimice ale celulei bacteriene. Cele mai uzuale coloratii compuse sunt: Coloratia Gram prin care microbii sunt clasificati in Gram-pozitivi si Gram-negativi Coloratia Ziehl-Neelsem prin care germenii se impart in acido-alcoolo-rezistenti si neacido-alcoolo-rezistentiTehnica coloratiei GramUnele bacterii colorate cu derivati bazici de pararozanilina si mordensate cu iod rezista la decolorarea cu alcool-acetona, in timp ce altele nu rezista.De aici necesitatea recoltarii frotiului cu fucsina care recoloreaza bacteriile care nu au retinut prima colorare. Bacteriile care rezista la decolorarea cu alcool-acetona sunt numite Gram pozitive (G+) si apar colorate in violet; restul bacteriilor se decoloreaza sub actiunea alcool-acetonei si se recoloreaza cu fucsina decolorata, aparand colorate in rosu si sunt numite Gram negative (G-)Principiul acestei metode consta in formarea unui complex intre celula microbiana, cu un colorant din grupul trifenil metanului ( violetul de gentiana sau violetul de metil) si iodul, complex care este insolubil in alcool-acetona.Tehnica coloratiei Gram:1. Colorarea: se acopera frotiul uscat si fixat cu solutia de violet de gentiana sau violet de metil; se tine 1-2 minute, se varsa colorantul si se spala frotiul cu apa de la robinet2. Mordansarea: se acopera frotiul cu solutie Lugol, se tine cateva secunde si se varsa, dupa care se acopera din nou cu solutie Lugol care se tine 4-5 minute, dupa care se indeparteaza solutia din nou.3. Decolorarea: fara a spala frotiul, se acopera cu alcool-acetona , inclinandu-se lama pentru a usura actiunea decolorantului. Se decoloreaza pana ce culoarea nu mai trece in solutie si frotiul devine alb , timp de 15-20 secunde. Se spala cu apa de la robinet pentru a opri actiune decolorantului.4. Recoltarea: se acopera frotiul cu fucsina fenicata si se mentie 1-2 minute, dupa care se spala cu apa, se usuca si se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie.Coloratii specialeAcestea se realizeaza pentru punerea in evidenta a capsulei, a sporilor, a cililor, a nucleului.Coloratia sporilor bacterieniLa unele bacteria forma vegetative adica de crestere si de multiplicare, se poate transforma intr-un spor bacteriile respective fiind sporogene.Sporul bacerian poate fi pus in evident fie prin metode obisnuite (coloratia Gram) sau prin metode speciale. In cazul coloratiei Gram corpul baceriei apare colorat, iar sporul , ca o formative refringenta inconjurata de o membrane groasa. Coloratia cu verde malachiteFrotiurile fixate prin caldura se acopera cu o solutie apoasa de verde malachit. Se incalzeste frotiul pana se emit vapori se lasa sa se raceasca si apoi se indeparteaza colorantul. Operatia se repeta de 3 ori, dupa care lama se lasa sa se raceasca se spala cu apa de robinet si se coloreaza cu fucsina diluata. La examenul microscopic corpul bacteriilor apare colorat in rosu, iar sporii in verde.Coloratia capsulePunerea in evident a capsule se poate face prin reactia Gram, cand corpul bacteriei apare colorat in timp ce capsula se prezinta ca o forma necolorata, luminoasa in jurul capsului bacteriene.Se acopera frotiul cu o solute de albastru de metilen Loffer, si se lasa timp de 2-3 minute. Se varsa apoi colorantul, se spala cu apa de robinet , se usuca si se observa cu obiectivul cu imersie. Capsula se va colora metacromatic in roz, in timp ce corpul bacterian se va colora in albastru.Coloratiile cililorCilii constituie organite de locomotie, filamentoase, flexibile care au afinitate scazuta pentru colorantii obisnuiti. Metoda Leiferson: se acopera frotiul cu solutie coloranta si se lasa 15 minute la temperatura camerei, dupa care se spala , se usuca si se examineaza la obiectivul cu imersie. Cilii se vad colorati in roz sau rosu iar corpul bacteriei apare necolorat sau colorat in roz pal.