METODOLOGII DE TESTARE TOXICOLOGICA

(Mitchell L. Schlossman, The chemistry and manufacture of cosmetics, 3rd ed, Allured

Publishing Corporation, 1988, USA ISBN 0-931710-75-8)

Metodele utilizate pentru testarea toxicologică a produselor cosmetice pot fi grupate în trei

categorii: in vivo (pe animale), in vitro (nu utilizează animale) şi teste clinice pe oameni.

Teste in vivo

Teste pentru toxicitate acută – teste care utilizează una sau mai multe doze din substanţa sau

articolul testate, administrate în decurs de 24 ore. Se efectuează pentru următoarele tipuri de iritaţii:

Iritaţie cutanată primară şi iritaţie oculară primară: au scopul de a determina efectele

iritative ale articolului testat după o singură expunere a pielii, respectiv a ochilor. Durata şi

intensitatea expunerii poate varia în funcţie de natura articolului testat şi de utilizarea prevăzută

pentru acesta. Testul Draize presupune aplicarea de pansamente ocluzive în cazul iritaţiei cutanate,

respectiv, în cazul iritaţiei oculare, tratarea a 6 iepuri, pentru 24 ore, cu observarea ulterioară a

efectelor.

Toxicitate orală acută şi cutanată acută (absorbţie transcutanată): urmăresc determinarea

efectelor sistemice ale articolului testat după o singură ingestie orală, respectiv expunere cutanată.

Ca animale de experienţă sunt utilizaţi şoareci sau şobolani cărora li se administrează doze corelate

cu greutatea corporală. Numărul uzual de animale este de 10, iar perioada de observare de 14 zile.

Toxicitate acută prin inhalare – are ca scop determinarea efectelor articolului testat, în formă

de aerosoli, în urma unei singure expuneri prin inhalare. Ca animale de exerienţă sunt utilizaţi

şoareci sau şobolani, în număr de 10, durata expunerii fiind de 1 oră iar perioada de observare de 14

zile.

Foto-toxicitate şi foto-iritaţie – acest test urmăreşte determinarea efectelor de iritaţiei

rezultate în urma unei singure expuneri cutanate la produsul testat, în combinaţie cu anumite lungimi

de undă ale radiaţiei UV (în urma absorbţiei radiaţiilor UV, anumite produse neiritative capătă

potenţial iritativ). Cele mai uzuale teste utilizează porcuşori de Guinea, supuşi unei singure

expuneri.

Teste de toxicitate subacută – utilizează doze repetate din articolul testat administrate timp

de mai multe zile sau săptămâni.

Iritaţie cutanată subacută sau cumulativă – are ca scop determinarea efectelor iritative

cumulative cauzate de expunerile repetate ale pielii la articolul testat. Intensitatea expunerilor poate

fi variată în funcţie de natura articolului şi de utilizarea prevăzută pentru acesta. Cel mai adesea se

utilizează iepuri, expunerile fiind timp de 14 zile.

Toxicitate cutanată subacută - are ca scop determinarea efectelor sistemice cumulative

cauzate de expunerile repetate ale pielii la articolul testat. Intensitatea expunerilor poate fi variată

funcţie de natura articolului şi de utilizarea prevăzută pentru acesta, pentru testare, cel mai frecvent

sunt folosiţi iepuri, expunerile întinzându-se pe o durată de 21 zile.

Iritaţie a mucoaselor (bucală, genitală) – urmăreşte determinarea efectelor iritative ale

articolului testat asupra mucoaselor, în urma expunerilor repetate. Frecvenţa şi intensitatea

expunerilor poate fi variată în funcţie de natura articolului şi de utilizarea prevăzută pentru acesta.

Cele mai uzuale teste folosesc iepuri, porcuşori de Guinea sau hamsteri, expunerile durând cel mult

5 zile.

Teste de sensibilizare – au ca scop determinarea potenţialului alergen şi de sensibilizare al

produsului testat. Aplicarea produsului poate fi: topică, prin injectare ori o combinaţie a celor două.

Pot fi folosiţi şi anumiţi adjuvanţi, cu rol de a excita sistemul imunitar. Frecvenţa şi intensitatea

expunerilor depind de tipul de test utilizat.

Fotoalergie şi fotosensibilizare - au ca scop determinarea potenţialului alergogen şi de

sensibilizare al produsului testat, în urma expunerilor repetate şi în combinaţie cu radiaţia

ultravioletă. Sunt utilizaţi de obicei porcuşori de Guinea, expuşi timp de mai multe săptămâni,

urmând apoi o perioadă de pauză şi o fază de “provocare”

Teste de toxicitate subcronică – sunt considerate acele teste care utilizează doze repetate din

produsul testat, administrate timp de câteva săptămâni la câteva luni (de la 28 la 90 zile). Înaintea

efectuării testului trebuie să se decidă asupra unor variabile ca: dozarea, prepararea articolului testat,

calea de administrare, numărul de animale, greutatea corporală, constatările clinice urmărite,

observaţiile histopatologice şi generale ce trebuie efectuate etc.

Toxicitate subcronică orală – urmăreşte determinarea efectelor fiziologice şi biochimice ale

articolului testat, în urma administrării orale repetate. Animalele utilizate sunt de obicei şobolani,

doza stabilindu-se funcţie de greutatea corporală. De regulă, în cazul testării substanţelor ce vor fi

utilizate pentru aplicare cutanată se alege calea de administrare orală pentru a asigura o expunere

sistemică.

Toxicitate cutanată subcronică sau absorbţie transcutanată – au ca scop determinarea

efectelor cumulative sistemice în urma expunerilor cutanate repetate. Sunt utilizaţi de obicei iepuri,

dozele administrate fiind în funcţie de greutatea corporală.

Toxicitate subcronică prin inhalare – are ca scop determinarea efectelor fiziologice şi

biochimice ale articolului testat aflat sub formă de aerosoli, în urma unor multiple expuneri prin

inhalare.

Teste de toxicitate cronică – utilizează doze repetate, timp de unul sau mai mulţi ani (de

regulă 1 sau 2 ani). Înaintea efectuării testului trebuie să se decidă asupra unor variabile ca: dozarea,

prepararea articolului testat, calea de administrare, numărul de animale, greutatea corporală,

constatările clinice, observaţiile histopatologice şi generale ce trebuiesc efectuate etc.

Dintre aceste teste fac parte: testele de toxicitate cronică orală, toxicitate cutanată cronică

sau absorbţie transcutanată, toxicitate cronică prin inhalare, care se deosebesc de testele de

toxicitate subcronică prin expunerea repetată şi îndelungată şi prin folosirea în testele de laborator a

2 specii de mamifere (una fiind o specie de rozătoare). În plus se mai efectuează testul de

carcinogenicitate care are ca scop urmărirea animalelor de experienţă pe o perioadă lungă de timp

(durata testului poate varia de la 18 luni la 2 ani) în vederea depistării leziunilor neoplazice formate

în timpul sau după expunerea la diferite doze din produsul testat. Testul se efectuează, de regulă, pe

2 specii de mamifere, cărora li se administrează doze dependente de greutatea corporală. Căile de

administrare sunt cele uzuale: orală, cutanată sau prin inhalare.

Alte teste

Teratogenitate – pentru determinarea potenţialului unui produs de a produce în organismul

fătului anomalii/malformaţii stucturale sau de altă natură, în urma expunerii mamei purtătoare la

acel produs. În mod normal se utilizează 2 specii de mamifere (şobolan şi iepure), calea de

administrare fiind orală. Animalele de experienţă (femelele gestante se împart în grupuri cărora li se

administrează doze progresiv crescătoare din produsul testat (1 doză/grup), pe o perioadă ce acoperă

cel puţin perioada de organogeneză. Înainte de data naşterii, femelele sunt eutanasiate, uterul extras

şi se efectuează evaluarea stării fătului (mort sau viu). Fătul este apoi scos şi conservat într-o

manieră care să permită evaluarea transformărilor/malformaţiilor ţesuturilor moi şi a celui osos.

Efecte asupra reproducerii şi fertilităţii – furnizează informaţii referitoare la efectele

produsului testat asupra principalelor faze ale procesului de reproducere, dar şi asupra etapelor de

alăptare, înţărcare, creştere şi dezvoltare a urmaşilor. Produsul se administrează oral la şobolani sau

şoareci. În studiile pe o generaţie articolul de testat este administrat părinţilor înaintea împerecherii,

în timpul sarcinii şi până la înţărcare. În studiile multigeneraţie, produsul este în continuare

administrat urmaşilor selectaţi, în timpul creşterii până la stadiul de adult, împerecherii şi producerii

propriilor urmaşi, până ce aceştia împlinesc 21 de zile.

Genotoxicitate – urmăreşte determinarea mutaţiilor genetice, a unor modificări ale structurii

cromozomilor sau ale genelor, ADN-ului etc. Există mai multe metode disponibile, majoritatea

utilizând rozătoare. Metodele uzuale urmăresc apariţia de aberaţii cromozomiale în celulele

spermatogoniale, aberaţii structurale ale cromozomilor din celulele măduvei osoase sau efectele

negative asupra cromozomilor ori aparatului mitotic al eritroblastelor.

Teste in vitro – sunt teste care nu utilizează animalul viu ca atare (testele efectuându-se deci

în afara organismului viu). Pentru experimente se pot folosi diverse sisteme, de la bacterii la diferite

sisteme fizio-chimice.

Principalele teste se referă la iritaţia primară a ochilor şi a pielii şi la genotoxicitate.

Iritaţia primară a ochilor (iritaţie oculară primară)

* HET-CAM / CAMVA (Hen's Egg Test Chorioallantoic Membrane / Chorioallantoic

Membrane Vascular Assay) - testele folosesc membrana corioalantoidă a ouălor de găină fecundate,

puternic vascularizată, urmărindu-se schimbările fiziologice ale acesteia în urma expunerii la

articolul testat (lichid sau solid): hiperemie, hemoragie, coagulare, tromboză. Cu cât materialul este

mai iritant cu atât reacţiile sunt mai rapide şi mai severe. Fiecărei observaţii i se atribuie o valoare

numerică şi apoi se extrapolează rezultatele pentru iritaţia probabilă a ochilor.

* Teste fizio-chimice – utilizează matrici proteice expuse la articolul testat, observându-se şi

măsurându-se modificările de opacitate care sunt corelate cu modificările opacităţii corneei.

Observaţiile sunt prelucrate şi interpretate într-o manieră similară cu cea de mai sus.

* Teste ce utilizează culturi de celule - acestea sunt expuse la produsul testat, măsurându-se

apoi modificările produse în celulă, de obicei pe baza unor reacţii de culoare.

* Teste pe ochi de cadavre de animale (de obicei de la vaci) - urmăresc modificări ale

corneei în urma expunerii la articolul testat, rezultatele fiind apoi extrapolate la om. Principala

problemă în acest caz o constituie obţinerea şi păstrarea în stare optimă a ochilor destinaţi testelor.

Iritaţie cutanată primară:

* Teste fizio-chimice – similare cu cele pentru iritaţia oculară.

* Teste pe membrane – membranele, constituite din matrici de natură proteică sunt expuse

articolului testat. Se măsoară timpul necesar trecerii produsului respectiv prin membrană, iar

rezultatele sunt extrapolate pentru aprecierea iritaţiei cutanate probabile.

* Teste ce utilizează culturi de celule – similare celor pentru determinarea iritaţiei oculare

Genotoxicitate – testele in vitro sunt considerate acelea care utilizează celule de mamifere,

bacterii, drojdii sau fungi şi au ca scop determinarea eventualelor mutaţii genetice, schimbări în

structura cromozomilor ori modificări ale genelor, ADN-ului etc.

Cele mai uzuale 3 teste sunt cele pentru:

* mutaţii genetice în celule de mamifere

* mutaţii inverse în celule bacteriene

* aberaţii cromozomiale în celule de mamifere

Teste clinice

Pe parcursul ultimilor ani, în scopul obţinerii unor informaţii cât mai exacte referitoare la

siguranţa produselor cosmetice introduse pe piaţă, industria cosmetică a înlocuit din ce în ce mai

mult testele pe animale cu cele clinice. Pentru a putea testa produsele finite pe subiecţi umani este

necesară estimarea prealabilă a siguranţei formulaţiei respective, pe baza informaţiilor cât mai

complete şi exacte despre siguranţa materiilor prime/ingredientelor utilizate (de la furnizorii

acestora) şi, de asemenea, testarea acestor ingrediente prin metode in vitro.

Teste uzuale de toxicitate pentru produsele cosmetice

Tip produs cosmetic A B C D E F G H I

Produse pentru baie

Deodorante / antiperspirante

Make-up zona ochilor

Tratament zona ochilor

Parfumuri

Produse pentru buze

Makeup faţă

Lac de unghii

Şampoane / balsamuri

Tratament piele corp

Tratament piele faţă

Produse pentru plajă

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

A = Teste umane tip pansament (“patch”) F = Toxicitate oculară

B = Iritaţie primară G = Factor de protecţie solară (când este nevoie)

C = Acnee H = Eficienţă

D = Fototoxicitate I = Toxicitate vaginală

E = Fotoalergie