1

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII

Ing. Hettig Andrea Klara

VITRIFICAREA OVOCITELOR PROVENITE DE LA SUINE: EFECTUL CONCENTRAŢIEI DE

CRIOPROTECTOR ŞI A TIMPULUI DE EXPUNERE

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT Conducător ştiinţific

Prof. dr. ing. Miclea Vasile

Cluj-Napoca

2011

2

CUPRINS INTRODUCERE ............................................................................................................... 4 PARTEA I .......................................................................................................................... 4 CAPITOLUL 1. BAZELE CRIOBIOLOGIEI .............................................................. 4

1.1. ELEMENTELE CRIOBIOLOGIEI.......................................................................... 4 1.2. STRUCTURA OVOCITEI ŞI EFECTELE NEGATIVE ALE CRIOCONSERVĂRII..................................................................................................... 4

CAPITOLUL 2 .................................................................................................................. 5 AGENŢII CRIOROTECTORI UTILIZAŢI ÎN PROCESUL DE............................... 5 VITRIFICARE .................................................................................................................. 5

2.1. CRIOPROTECTORI PERMEABILI SAU INTERNI ............................................. 5 2.2. CRIOPROTECTORI IMPERMEABILI SAU EXTERNI ....................................... 6

CAPITOLUL 3 .................................................................................................................. 6 EFECTELE CRIOPROTECTORILOR......................................................................... 6

3.1. TOXICITATEA ŞI DAUNELE PRODUSE DE CRIOPROTECTORI ................... 6 3.1.1. Influenţa timpului de expunere, a concentraţiei şi a temperaturii asupra toxicităţii substanţelor crioprotectoare....................................................................... 6 3.1.2. Evitarea daunelor şi a toxicităţii....................................................................... 7

CAPITOLUL 4 .................................................................................................................. 7 CRIOCONSERVAREA PRIN VITRIFICARE – METODE UZUALE ..................... 7 PARTEA II ........................................................................................................................ 7 CERCETĂRI PROPRII ................................................................................................... 7 SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII ................................................................ 7 SCHEMA EXPERIMENTALĂ GENERALĂ ............................................................... 8 CAPITOLUL 5 .................................................................................................................. 8 METODE DE VITRIFICARE UTILIZATE ................................................................. 8

5.1 VITRIFICAREA PRIN METODA SOPS A OVOCITELOR SUINE IMATURE ... 8 5.1.1. Material biologic............................................................................................... 8 5.1.2. Medii utilizate.................................................................................................... 9 5.1.3. Metoda de lucru................................................................................................. 9

5.1.3.1. Recoltarea ovarelor şi a ovocitelor............................................................. 9 5.1.3.2. Vitrificarea ovocitelor prin metoda SOPS ................................................. 9 5.1.3.3. Decongelarea ovocitelor........................................................................... 10 5.1.3.4. Spălarea ovocitelor şi evaluarea morfologică .......................................... 10 5.1.3.5. Denudarea ovocitelor vitrificate şi evaluarea viabilităţii prin colorarea cu diacetat de fluoresceină şi iodură de propidiu...................................................... 10

5.2 VITRIFICAREA PE SUBSTRAT SOLID (SSV) A OVOCITELOR SUINE IMATURE..................................................................................................................... 10

3

5.2.1.Crioconservarea ovocitelor prin metoda vitrificării pe substrat solid (SSV) .. 10 5.2.2. Decongelarea şi evaluarea ovocitelor ............................................................ 11

5.3. VITRIFICAREA PRIN METODA SOPS A OVOCITELOR SUINE MATURATE IN VITRO................................................................................................ 11

5.3.1. Materialul biologic.......................................................................................... 11 5.3.2. Medii utilizate.................................................................................................. 11 5.3.3. Metoda de lucru............................................................................................... 12

5.3.3.1. Recoltarea şi maturarea ovocitelor ........................................................... 12 5.3.3.2. Crioconservarea ovocitelor maturate in vitro prin metoda SOPS............ 12 5.3.3.3. Evaluarea morfologică post-vitrificare a ovocitelor maturate in vitro..... 12 5.3.3.4. Evaluarea viabilităţii post-vitrificare a ovocitelor maturate in vitro........ 12

CAPITOLUL 6 ................................................................................................................ 13 REZULTATE ŞI DISCUŢII .......................................................................................... 13

6.1. INFLUENŢA CONCENTRAŢIEI DE CRIOPROTECTORI ŞI A TIMPULUI DE EXPUNERE ASUPRA VITRIFICĂRII PRIN METODA SOPS A OVOCITELOR SUINE IMATURE.............................................................................. 13 6.2. INFLUENŢA CONCENTRAŢIEI DE CRIOPROTECTORI ŞI A TIMPULUI DE EXPUNERE ASUPRA VITRIFICĂRII PRIN METODA SSV A OVOCITELOR SUINE IMATURE ........................................................................................................ 15 6.3. ANALIZA COMPARATIVĂ A REZULTATELOR VITRIFICĂRII PRIN TEHNICILE SOPS ŞI SSV A OVOCITELOR SUINE IMATURE .............................. 16 6.4. VITRIFICAREA PRIN METODA SOPS A OVOCITELOR SUINE MATURATE IN VITRO................................................................................................ 17

CAPITOLUL 7. ............................................................................................................... 18 CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI ....................................................... 18 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ ..................................................................................... 21

4

INTRODUCERE

Deşi istoria vitrificării datează de mai mult de trei sferturi de secol, domeniul este probabil, încă în faza incipientă pentru a fi utilizat la nivelul întregului său potenţial. Ca întotdeauna, natura “ajută” cercetătorii în descoperirea abordări noi în vitrificare, dar în cea mai mare parte, procesele din natură rămân ascunse şi dificile pentru a fi imitate în mod direct.

Vitrificare este o abordare viabilă pentru crioconservarea unei game largi de sisteme vii. Principiile sale fizice şi biologice continuă să fie mai bine înţelese, iar acest lucru conduce la aplicaţii din ce în ce mai numeroase şi de succes.

Cu toate acestea, specialiştii în criobiologia reproducţiei, posedă atât mijloace cât şi motivaţia de a răspunde la una din cele mai interesante provocări ale criobiologiei: aducerea celulelor într-o stare de animaţie suspendată şi repornirea metabolismului acestora, astfel încât să devină posibilă începerea unei noi vieţi.

PARTEA I

CAPITOLUL 1. BAZELE CRIOBIOLOGIEI

1.1. ELEMENTELE CRIOBIOLOGIEI Criobiologia reprezintă unul dintre domeniile biologice care a cunoscut o dezvoltare

spectaculoasă în ultimele decenii. Domeniul are ca şi obiect de studiu totalitatea modificărilor pe care le suferă celulele, ţesuturile, organele şi organismele integre (bios = viaţă), atunci când sunt supuse acţiunii temperaturilor scăzute în general (grecescul crios = frig) şi a celor negative, în special. Partea aplicativă a acestui domeniu poartă denumirea de crioconservare şi reprezintă totalitatea metodelor, mijloacelor şi tehnicilor prin care, cu ajutorul frigului, se urmăreşte conservarea de lungă durată a vieţii indiferent de forma sub care aceasta se prezintă (celule, ţesuturi, organe, organisme integre). Crioconservarea se bazează pe principiul că temperaturile scăzute determină, la nivel intracelular, o reducere a mişcării moleculare şi, implicit, o scădere semnificativă a metabolismului până la nivele extreme, rezultând aşa numita anabioză (Ladoşi, 1997).

1.2. STRUCTURA OVOCITEI ŞI EFECTELE NEGATIVE ALE CRIOCONSERVĂRII Ovocitele sunt mai dificile de crioconservat decât embrionii, datorită faptului că acestea

sunt celule sferice, mari, cu o suprafaţă mică (raportat la volum) şi conductivitate hidraulică scăzută (Leibo, 1980). Ovocita este cea mai mare celulă din corpul majorităţii speciilor de mamifere (Wassarman, 1988). Aproximativ 80% din volumul acestora este apă. Atunci când sunt răcite la temperaturi sub 0°C, se poate forma gheaţă intracelulară, probabilitate care este dependentă de rata scăderii temperaturii (Leibo et al.,1978).

Deteriorările pot fi atât la nivel intracelular (nucleu, citoplasma cu organitele celulare: mitocondrii, actine/microfilamente, fus de diviziune, microtubuli) cât şi extracelular (zona pellucida).

5

CAPITOLUL 2

AGENŢII CRIOROTECTORI UTILIZAŢI ÎN PROCESUL DE

VITRIFICARE

Vitrificarea este o solidificare a soluţiilor fără formarea cristalelor de gheaţă prin creşterea vâscozităţii în timpul scăderii temperaturii.

Lipsa totală a cristalelor de gheaţă din timpul vitrificării este datorată concentraţiei mari de crioprotectori. Cristalele mici de gheaţă formate la decongelarea lichidelor vitroase (devitrificarea) nu sunt considerate periculoase atâta timp cât nu are loc recristalizarea mediului (unirea cristalelor mici de gheaţă şi formarea cristalelor mari) (Ada Cean, 2009). Crioprotectorii folosiţi la crioconservarea entităţilor biologice (ovocite, spermatozoizi, embrioni) sunt clasificate în două grupe mari:

crioprotectori permeabili sau interni crioprotectori impermeabili sau externi

2.1. CRIOPROTECTORI PERMEABILI SAU INTERNI Crioprotectori permeabili sau interni, au o greutate moleculară mică ce le face posibilă

trecerea prin membrana celulară, oferind protecţie internă ovocitelor, embrionilor împotriva frigului; crioprotectorii interni formează legături de hidrogen cu moleculele de apă, prevenind astfel formarea cristalelor de gheaţă şi a efectului de soluţie.

Aceşti compuşi chimici se pot difuza prin membrana celulară, permeabilizând celula şi echilibrându-se cu citoplasma. Înlocuiesc marea majoritate a cantităţii de apă intracelulară fără să deshidrateze total celula. Crioprotectorii interni solidifică la temperaturi mai joase decât apa, reducând astfel substanţial cantitatea de gheaţă intracelulară formată la o temperatură dată. Această descreştere a cantităţii de gheaţă intracelulară diminuează deteriorările cauzate de perturbarea fizică a organitelor şi a membranei celulare. În plus, crioprotectori sunt şi o soluţie tampon ce oferă protecţie împotriva stresului sărurilor. Acţionând ca solvent, reduce concentraţia soluţiei în fracţiunea de apă rămasă în interiorul celulei până când sistemul este răcit la o temperatură suficient de scăzută (Swain şi Smith, 2010). Mulţi agenţi crioprotectori au fost utilizaţi cu succes în conservarea spermatozoizilor, embrionilor şi a ovocitelor. Succesul utilizării fiecărui tip de crioprotector în parte, depinde de viteza cu care aceştia traversează membrana celulară, rată dictată de diferiţi factori, cum ar fi spre exemplu vâscozitatea. Totuşi permeabilitatea nu depinde numai de crioprotectorul în sine ci şi de proprietăţile membranei celulare, ce, variază în funcţie de tipul şi stadiul celular (Pedro et al., 2005). Din categoria crioprotectorilor permeabili cei mai importanţi sunt: etilen glicolul (EG), dimetil sulfoxidul (DMSO), propilen glicolul (1,2 propandiol, propilen diol, PROH) şi glicerolul. Din punct de vedere a toxicităţii, etilen glicolul este cel mai puţin toxic dintre crioprotectorii permeabili şi prezintă o permeabilitate mai mare în ceea ce priveşte traversarea membranară, motiv pentru care, a fost integrat în protocolul de vitrifcare din prezentul studiu.

6

2.2. CRIOPROTECTORI IMPERMEABILI SAU EXTERNI

Crioprotectori externi, au o greutate moleculară mare neputând traversa membrana celulară, dar oferă o protecţie externă celulelor. Crioprotectorii permeabili facilitează vitrificarea, stabilizează membrana în timpul decongelării, reduce şocul osmotic în timpul îndepărtării crioprotectorului intern din celule (Tucker şi Liebermann, 2007). Aceşti compuşi cresc osmolaritatea spaţiului extracelular, ce duce la deshidratarea celulei şi deci la reducerea riscului formării cristalelor de gheaţă intracelulare. De asemenea a fost postulat că, unii crioprotectori impermeabili se absorb pe suprafaţa membranară, inhibând formarea cristalelor de gheaţă din imediata vecinătate a celulei prin menţinerea gheţii în stare amorfă. Astfel, agenţi crioprotectori externi, sunt des incluse în compoziţia mediilor de decongelare a celulelor pentru a preveni şocul osmotic. Şocul osmotic este descris ca un fenomen, ce apare atunci când presiunea osmotică a compartimentării intracelulare este mai mare decât cel extracelular, şi se datorează deshidratării celulare. În timpul dezgheţării, datorită influxului de apă pot avea loc lezări şi traumatizări ale celulelor.

Din această categorie de crioprotectori fac parte: macromoleculele (ficolul, polivinil pirolidona, polivinil alcoolul, polietilen glicolul), zaharurile (trehaloza, sucraza, glucoza, latoza, lactoza). În prezentul studiu s-a utilizat trehaloza ca şi crioprotector extern.

CAPITOLUL 3

EFECTELE CRIOPROTECTORILOR

3.1. TOXICITATEA ŞI DAUNELE PRODUSE DE CRIOPROTECTORI În ceea ce priveşte criobiologia gameţilor, de obicei, sunt efectuate măsuri de evaluare a adecvării sau toxicităţii a unui agent crioprotector. La spermatozoizi, aceste măsuri includ urmărirea efectului asupra mobilităţii, capacitării şi a capacităţii fertilizante. La ovocite, se evaluează deteriorările produse de crioprotectori asupra fusului de diviziune, citoscheletul actinelor, aranjarea cromozomilor şi asupra capacitării fertilizante. Cu privire la embrioni, studiile de toxicitate sunt îndreptate spre evaluarea dezvoltării embrionare ulterioare şi asupra efectelor pe diferite căi moleculare şi biochimice de semnalizare. Din păcate, mecanismele exacte prin care se manifestă toxicitatea agenţilor crioprotectori sunt necunoscute. Exemple de leziuni induse de expunerea în mod abuziv la diferiţi crioprotectori ar fi înlăturarea şi fuziunea membranelor celulare şi activitate enzimatică precară. Ele duc la modificări ale structurilor şi funcţiilor organitelor şi la perturbarea interacţiunilor proteice (Fahy et al., 1990; Anchordouguy et al., 1987).

3.1.1. Influenţa timpului de expunere, a concentraţiei şi a temperaturii asupra toxicităţii substanţelor crioprotectoare

Condiţiile în care are loc expunerea la crioprotector pot influenţa toxicitatea acestora asupra gameţilor. Factori, cum ar fi timpul de expunere, concentraţia de crioprotector, precum şi temperatura de expunere au repercusiuni asupra efectului agentului crioprotector respectiv. Agenţii crioprotectori nu sunt toxici în cazul în care celulele sunt expuse la acţiunea lor un timp scurt, însă o expunere mai îndelungată, sau o concentraţie ridicată, poate duce la metabolizarea agentului crioprotector, ceea ce se concretizează în afectarea funcţiei şi a viabilităţii celulare.

7

3.1.2. Evitarea daunelor şi a toxicităţii Alegerea unui crioprotector adecvat, optimizarea concentraţia acestuia, precum şi

monitorizarea timpului şi a temperaturii de expunere, influenţează potenţiale daune pe care un crioprotector le poate provoca într-o celulă. Prin urmare, o abordare simplă pentru a reduce toxicitatea presupune combinarea diferiţilor crioprotectori, atât permeabili cât şi impermeabili, reducându-se astfel concentraţia individuală şi atenuarea daunelor provocate, menţinând în acelaşi timp efectele generale de protecţie.

Modul de introducere şi de evacuare a crioprotectorilor este un alt mijloc de a reduce toxicitatea sau daunele rezultate. Adăugarea progresivă a agenţilor crioprotectori, sau eliminarea treptată a acestor compuşi în timpul decongelării, ajută la reducerea stresului osmotic.

CAPITOLUL 4

CRIOCONSERVAREA PRIN VITRIFICARE – METODE UZUALE Odată cu dezvoltarea cunoştinţelor în domeniul criobiologiei şi în special al

crioconservării rapide, au apărut numeroase tehnici de vitrificare a ovocitelor şi embrionilor tuturor speciilor de animale, precum şi a gameţilor şi embrionilor umani. Cele mai folosite metode sunt: vitrificarea în paiete deschise (OPS), paiete super fine (SOPS), cryoloop, pe substrat solid (SSV), cryotip, cryotop, în paiete hemy-straw, în paiete închise.

În prezentul studiu, ovocitele suine imature au fost vitrificate cu paiete (metoda SOPS şi pe substrat solid (metoda SSV).

PARTEA II

CERCETĂRI PROPRII

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII Cercetările urmăresc îmbunătăţirea rezultatelor vitrificării ovocitelor provenite de la suine utilizând metodele SOPS şi SSV. Pentru realizarea scopului menţionat s-au fixat următoarele obiective:

1. Determinarea concentraţiei optime de etilen glicol pentru vitrificarea ovocitelor suine imature prin metoda SOPS.

2. Stabilirea timpului optim de echilibrare a ovocitelor suine imature crioconservate prin metoda SOPS în funcţie de concentraţia etilen glicolului în mediul de vitrificare.

3. Determinarea concentraţiei optime de etilen glicol pentru vitrificarea ovocitelor suine imature prin metoda SSV.

4. Stabilirea timpului optim de echilibrare a ovocitelor suine imature crioconservate prin metoda SSV în funcţie de concentraţia etilen glicolului în mediul de vitrificare.

8

5. Determinarea efectului concentraţiei de crioprotector şi a timpului de echilibrare în funcţie de metoda de vitrificare utilizată.

6. Crioconservarea ovocitelor suine maturate in vitro aplicând cea mai bună tehnică de vitrificare, concentraţie de crioprotector şi timpul de echilibrare optim.

SCHEMA EXPERIMENTALĂ GENERALĂ

Fig. 1. Schema experimentală generală

CAPITOLUL 5

METODE DE VITRIFICARE UTILIZATE

5.1 VITRIFICAREA PRIN METODA SOPS A OVOCITELOR SUINE IMATURE

5.1.1. Material biologic Materialul biologic utilizat este reprezentat de ovocite suine imature, recoltate din ovare

obţinute de la abatorul SC. Turism Vâlcele SRL judeţul Cluj. Pentru prelevarea ovarelor s-au selectat scrofiţe prepubere aparţinând hibrizilor comerciali, cu greutate maximă de până la 110 kg. Pentru vitrificarea ovocitelor suine imature prin metoda SOPS s-au folosit un număr de 5.337 de gameţi.

VITRIFICAREA OVOCITELOR

SUINE

IMATURE

MATURATE IN

VITRO

Vitrificarea ovocitelor prin metoda SOPS

Vitrificarea ovocitelor prin

metoda SSV

Determinarea influenţei

concentraţiei de EG

Determinarea influenţei timpului

de echilibrare

Determinarea influenţei

concentraţiei de EG

Determinarea influenţei timpului

de echilibrare

Ovocite nedenudate

Ovocite denudate

9

5.1.2. Medii utilizate Mediul de transport

Pentru transportul ovarelor s-a folosit o soluţie salină de 0,9% NaCl în apă pură, suplimentat cu antibiotice (penicilină, streptomicină şi gentamicină).

Mediul de recoltare a ovocitelor Mediu de recoltare a ovocitelor este mediul stoc M 199 1x conţinând Earle’s salts, aprovizionat de la Sigma.

Medii de congelare Mediul de bază (MB), este folosit la toate variantele experimentale şi conţine: tampon fosfat salin (PBS) 10x, apă deionizată şi ser fetal bovin (FSB). Mediul de previtrificare: este compus din mediu de bază (MB, crioprotectorul ce oferă ovocitelor protecţie internă, reprezentată în cazul nostru de etilen glicol (EG) şi un crioprotector de protecţie externă, trehaloza Mediul de vitrificare: conţine aceleaşi substanţe pe care le conţine şi mediul de previtrificare, diferenţele fiind date de concentraţia acestora, în funcţie de variantele experimentale.

Mediile de decongelare Mediile de decongelare conţin tampon fosfat salin (PBS) şi trehaloză. Se utilizează 3 medii de decongelare având concentraţii descrescătoare de trehaloză.

Mediul de spălare a ovocitelor Mediul de spălare are în componenţa sa tampon fosfat salin (PBS) suplimentat cu 0,4 % albumină serică bovină (BSA).

Mediu de colorare a ovocitelor Mediul de colorare este alcătuit din PBS şi doi coloranţi fluorescenţi, respectiv diacetat de fluoresceină (FDA) şi iodură de propidiu (PI).

5.1.3. Metoda de lucru

5.1.3.1. Recoltarea ovarelor şi a ovocitelor După sacrificarea scroafelor, ovarele sunt colectate într-un recipient termoizolant ce

conţine o soluţie salină de NaCl 0,9% la temperatura de 37ºC. Acestea sunt transportate în laborator într-un interval de 4-6 ore. În laborator se detaşează de restul de oviduct şi bursă ovariană după care sunt spălate şi puse într-un recipient ce conţine soluţie salină suplimentată cu antibiotice. Ovocitele au fost recoltate prin metoda puncţiei, doar din foliculi nonatretici ce au diametru cuprins între 2-5 mm. Cu ajutorul unei seringi de 10 ml prevăzută cu un ac de 18G, se pătrunde în corticala ovariană şi pătrunderea în cât mai mulţi foliculi. După recoltarea ovocitelor din foliculi, acestea sunt evaluate la stereomicroscop şi transferate într-o altă placă cu mediu de recoltare în scopul spălării acestora de resturile foliculare.

5.1.3.2. Vitrificarea ovocitelor prin metoda SOPS Ovocitele spălate de două ori în mediu TCM sunt supuse echilibrării cu agenţii

crioprotectori în doi paşi: previtrificare şi vitrificare. Previtrificarea: grupuri de câte 10 ovocite sunt luate cu o pipetă Pasteur şi puse în

picături de 30 μl de mediu de previtrificare. Ovocitele sunt menţinute în mediile de previtrificare timp de 4 minute.

Vitrificarea: ovocitele sunt transferate în micropicăturile de mediu de vitrificare ce conţine concentraţia finală de etilen glicol şi trehaloză. Picăturile au dimensiuni de 2 µl.

10

După expirarea timpului de expunere la concentraţiile finale de EG şi trehaloză (specific fiecărei variante experimentale), ovocitele sunt încărcare în paietele SOPS, prin simpla atingere a micropicăturii cu vârfului pipetei. Mediul împreună cu ovocitele sunt urcate în paiete prin capilaritate. Tubul cu paietele este apoi transferat în container şi stocat până la evaluare.

5.1.3.3. Decongelarea ovocitelor Paietele se scot pe rând din tubul ce conţine azot, se ţine în aer timp de 5 secunde, după

care ovocitele sunt trecute succesiv prin mediile de decongelare (Vajta, 2000). Evacuarea ovocitelor se face prin atingerea mediului cu vârfului paietei SOPS. Printr-un fenomen invers capilarităţii ovocitele sunt evacuate în picături şi sunt lăsate timp de 5 minute (Somfai, 2007) în fiecare mediu în parte. După trecerea ovocitelor şi prin ultimul mediu de decongelare, ovocitele sunt luate cu o pipetă în mediul de spălare.

5.1.3.4. Spălarea ovocitelor şi evaluarea morfologică Ovocitele sunt spălate de 3 ori în picături de 60 µl de PBS suplimentat cu BSA 0,4%.

pentru a scăpa de urmele de crioprotectori. După spălare, ovocitele sunt examinate în vederea evaluării morfologice. Examinarea s-a realizat la un microscop cu inversie Olympus. Au fost cuantificate ovocitele care au prezentat straturile cumulusului aderente, bine ataşate de ovocită, zonă pellucida intactă, membrană bine delimitată, ovoplasma uniform granulată i compactă

5.1.3.5. Denudarea ovocitelor vitrificate şi evaluarea viabilităţii prin colorarea cu diacetat de fluoresceină şi iodură de propidiu

Denudarea ovocitei s-a realizat astfel: 15-20 de ovocitele au fost plasate în 30 µl PBS, după care s-a luat încă 200 µl PBS într-o micropipetă şi s-a pipetat peste ovocite. Prin mişcări repetate de pipetare majoritatea celulelor cumulus s-au desprins de ovocită.

Colorarea ovocitelor a fost realizată după denudare. Într-o primă etapă pe o placă Petri sunt puse picături de 30 µl în care sunt plasate grupuri de 10-15 ovocite. Placa cu picăturile sunt transferate la termostat la 37˚C pentru un timp de 10 minute, după care sunt evaluate la microscop prevăzut cu lampă UV. Cele vii, sunt verzi fluorescenţi datorita activităţii enzimatice (colorate cu FDA) şi necolorate cu PI datorită integrităţii membranare. Cele moarte nu se colorează cu FDA, dar se colorează cu PI.

5.2 VITRIFICAREA PE SUBSTRAT SOLID (SSV) A OVOCITELOR SUINE IMATURE Materialul biologic, mediile utilizate precum şi marea parte a metodei de lucru sunt aceleaşi ca la metoda SOPS, motiv pentru care vor fi descrise doar procedurile ce diferă. Pentru vitrificarea ovocitelor suine imature prin metoda SSV s-au folosit un număr de 5.164 de gameţi.

5.2.1.Crioconservarea ovocitelor prin metoda vitrificării pe substrat solid (SSV) Previtrificare: grupuri de câte 10 ovocite sunt luate cu o pipetă Pasteur şi puse în picături de 30 μl de mediu de previtrificare. Ovocitele sunt menţinute în mediile de previtrificare timp de 4 minute, în cazul tuturor variantelor experimentale

11

Vitrificare: după expirarea timpului de previtrificare, ovocitele sunt transferate în micropicăturile de vitrificare de 2μl, ce sunt plasate pe folii de aluminiu, reprezentând substratul solid. După expirarea timpului de echilibrare (specific fiecărei variante experimentale) a ovocitelor în mediul de vitrificare, folia este luată de un colţ cu ajutorul unei pense lungi şi este plasată într-un tub, ce este imersat în azot lichid, urmând ca apoi tubul prevăzut cu găuri, să fie închis şi transferat şi stocat până la decongelare şi evaluare, în containerul cu azot lichid.

5.2.2. Decongelarea şi evaluarea ovocitelor La decongelare foliile de aluminiu au fost luate una câte una din tubul cu azot lichid şi au fost puse pe placa de încălzire, ce a fost încălzită în prealabil la temperatura de 37ºC. Astfel, picăturile cu ovocite s-au dezgheţat pe folia de aluminiu şi cu ajutorul unei pipete automate au fost luate şi plasate în mediile de decongelare. După menţinerea ovocitelor în fiecare mediu de decongelare timp de 5 minute, acestea au fost spălate în PBS, colorate cu coloranţii fluorescenţi şi evaluate atât din punct de vedere morfologic cât şi din punct de vedere al viabilităţii. Procedeul este acelaşi ca la ovocitele vitrificate prin metoda SOPS, motiv pentru care nu vor fi descrise şi în acest capitol.

5.3. VITRIFICAREA PRIN METODA SOPS A OVOCITELOR SUINE MATURATE IN VITRO

5.3.1. Materialul biologic Materialul biologic este reprezentat de ovocitele suine imature recoltate din ovarele de scroafe abatorizate.

5.3.2. Medii utilizate Mediul de transport al ovarelor şi mediile de recoltare

Sunt identice cu cele descrise in subcapitolul 5.2.2, motiv pentru care acestea nu vor fi redate şi în capitolul acesta. În cele ce urmează se vor descrie subpunctele specifice acestui capitol.

Mediul de maturare ovocitară Mediul de maturare a fost reprezentat de M 199 suplimentat cu L-glutamină (0,1 g/l), piruvat de sodiu (0,1 mg/ml), Folligon (10 UI/ml) ca înlocuitor al hormonului hipofizar FSH, Chorulon (10 UI/ml) ca înlocuitor al LH din vivo (Intervet), ser fetal de viţel 10%, penicilină (100 UI/ml), streptomicină (100 μg/ml). Verificarea şi corectarea pH-ului s-a realizat la valoarea de 7,4. Picături de 30 µl de mediul de maturare a fost distribuit în placi Petri. Peste picături a fost pus ulei mineral pentru a evita evaporarea acestor cantităţi mici de mediu.

Mediul de crioconservare: Este reprezentat de mediul de bază la care se adaugă crioprotectorii. Mediul de previtrificare conţine MB, 15% EG şi 0,25M trehaloză. Mediul de vitrificare conţine MB, 45% EG şi 0,5M trehaloză

Mediul de decongelare Este acelaşi ca şi în cazul vitrificării ovocitelor imature.

Mediul de colorare

12

Mediul de colorare diferă faţă ceea utilizată în cazul ovocitelor imature prin faptul că acesta conţine un al treilea colorant: Hoechst 33258.

5.3.3. Metoda de lucru

5.3.3.1. Recoltarea şi maturarea ovocitelor Metoda de recoltare a ovocitelor este aceeaşi ca şi ceea descrisă în subcapitolul 5.1.3. Ovocitele au fost alese pentru maturare pe baza evaluării morfologice. Înainte de plasarea ovocitelor în mediul de maturare, plăcile Petri au fost lăsate în incubator timp de 3 ore. Grupuri de câte 10 ovocite au fost plasate în picăturile de medii de maturare. Plăcile Petri cu ovocite au fost lăsate în incubator la temperatura de 37°C, cu 5% CO2 în aer, timp de 44 ore.

5.3.3.2. Crioconservarea ovocitelor maturate in vitro prin metoda SOPS Deoarece cele mai bune rezultate în cazul vitrificării ovocitelor imature s-a obţinut prin metoda SOPS, cu 45% etilen glicol în mediul de vitrificare, cu un timp de echilibrare de 40 secunde, am recurs la aceşti parametri şi în cazul vitrificării ovocitelor maturate in vitro. Aşadar, după 44 ore de maturare, ovocitele au fost transferate din picăturile de maturare în picături de 60 μl de PBS suplimentat cu BSA (0,4%). Ovocitele au fost spălate în acest mediu de 2 ori după care au fost supuse procesului de vitrificare. Procedura este aceeaşi ca şi în cazul vitrificării ovocitelor imature prin metoda SOPS.

5.3.3.3. Evaluarea morfologică post-vitrificare a ovocitelor maturate in vitro Complexele ovocită-cumulus au fost observate la microscop. În vederea evaluării morfologiei ovocitelor s-au utilizat următorii indicatori: creşterea diametrului complexului ovocită-cumulus şi a spaţiului perivitelin, mucifierea şi expandarea celulelor cumulus ooforus. După evaluarea morfologică, ovocitele sunt supuse denudării, ce se realizează mecanic, prin pipetări repetate. Ovocitele astfel pregătite, sunt supuse apoi evaluării viabilităţii.

5.3.3.4. Evaluarea viabilităţii post-vitrificare a ovocitelor maturate in vitro Pentru a se obţine şi un alt punct de vedere asupra rezultatelor vitrificării ovocitelor suine maturate in vitro, s-a realizat în paralel colorarea fluorescentă a acestora, utilizându-se cei trei coloranţi fluorescenţi. Fiecare dintre aceştia indică un alt aspect referitor la viabilitatea celulară. Consecutiv denudării ovocitele au fost incubate în mediul care conţinea coloranţii fluorescenţi (FDA, PI şi Hoechst 33258) timp de 10 minute şi apoi observate în lumină ultravioletă la microscopul inversat iar imaginile preluate cu ajutorul programului Cell F* (Olympus). S-a înregistrat numărul de celule care prezentau fluorescenţă verde sau roşie precum şi cele în al căror spaţiu perivitelin s-a observat primul globul polar ce s-a colorat albastru.

13

CAPITOLUL 6

REZULTATE ŞI DISCUŢII

6.1. INFLUENŢA CONCENTRAŢIEI DE CRIOPROTECTORI ŞI A TIMPULUI DE EXPUNERE ASUPRA VITRIFICĂRII PRIN METODA SOPS A OVOCITELOR SUINE IMATURE

Rezultatele evaluării morfologice ale ovocitelor suine imature vitrificate prin metoda SOPS

În figura 2 sunt prezentate rezultatele obţinute în urma evaluării morfologice a ovocitelor vitrificate cu 35%, 40%, 45% şi 50% etilen glicol în mediul de vitrificare şi timp de echilibrare în mediu de 30, 40, 50 şi 60 secunde.

Aşa cum reiese şi din figura 2, cele mai bune rezultate cu privire la integritatea morfologică post-congelare s-au obţinut în cazul vitrificării ovocitelor cu 45% etilen glicol în mediul de vitrificare şi timp de echilibrare de 40 secunde. Valoarea procentuală medie efectuat pe cinci repetiţii este de 77,66% ± 0,75. Aşadar, mai mult de 70% din totalul ovocitelor supuse vitrificării au prezentat după decongelare o granulaţie uniformă a ovoplasmei, celulele cumulus ooforus bine ataşate celulei şi zona pellucida integră.

35%40%

45%50%

30 se c

40 sec

50 se c

60 se c

20

30

40

50

60

70

80%

Fig. 2. Rezultatele evaluării morfologice ale ovocitelor vitrificate prin metoda SOPS cu diferite concentraţii de EG şi timpi de echilibrare

La această concentraţie de crioprotector şi timp de expunere majoritatea ovocitelor

realizează schimbul transmembranar apă şi crioprotectorul permeabil (EG), realizându-se astfel gelificarea ovoplasmei şi intrarea acesteia în stare solidă, vitroasă în momentul scăderii temperaturii.

Uşor sub această valoare (76,58 ± 2,10) este cea obţinută în cazul utilizării mediului de vitrificare cu 40% EG şi timp de echilibrare de 50 secunde. Demn de menţionat sunt şi

14

procentele de 75,54% ± 1,29, obţinute în urma vitrificării ovocitelor cu 40% EG în mediul şi timp de expunere de 60 secunde.

Toate aceste valori menţionate, reprezintă vârfurile din figura 2. De asemenea, se poate observa foarte bine inferioritatea rezultatelor obţinute la concentraţiile de 35% şi 50% de EG, indiferent de timpul de echilibrare.

Rezultatele evaluării viabilităţii ovocitelor suine imature vitrificate prin metoda SOPS Rezultatele cu privire la viabilitatea post-congelare a ovocitelor vitrificate cu 35%, 40%,

45% şi 50% etilen glicol în mediul de vitrificare şi timp de echilibrare în mediu de 30, 40, 50 şi 60 secunde, sunt prezentate în figura 3.

35%40%

45%50%

30 sec

40 sec

50 sec

60 sec

0

10

20

30

40

50%

Fig. 3. Rezultatele evaluării viabilităţii ovocitelor vitrificate prin metoda SOPS cu diferite

concentraţii de EG şi timpi de echilibrare Ca şi în cazul morfologiei, cele mai multe ovocite vii s-au înregistrat în cazul vitrificării acestora cu 45% EG în mediu şi 40 secunde timp de echilibrare. Valoarea procentuală medie pe cinci repetiţii este de 46,80% ± 0,32, evidenţiindu-se foarte bine punctul cel mai înalt în figura 3. Ovocitele prezentau o activitate enzimatică intensă, esterificând diacetatul de flouaresceină şi colorându-se verde la lumina UV a microscopului. Cu 1,01% sub valoarea mai sus menţionată este varianta experimentală cu 45% EG în mediul de vitrificare şi timp de echilibrare 50 secunde. Această valoare reprezintă al doilea vârf în figura 3. Prin crioconservarea în mediul de vitrificare cu 40% EG, valorile procentuale medii ale ovocitelor vii după decongelare sunt reduse cu 10%-17%. În cazul concentraţiei de 35% se reduc cu 15%- 19% faţă de valorile celor cu 45%. Aceste concentraţii de crioprotector nu sunt suficiente pentru a aduce celulele în stare vitroasă în momentul imersării în azot lichid. indiferent de timpul de expunere. Se pot observa forte bine valorile cele mai mici obţinute în cazul vitrificării ovocitelor suine imature cu 50% etilen glicol, indiferent de timpii de echilibrare. Acest fenomen se explică prin faptul că la această concentraţie ridicată, creşte toxicitatea crioprotectorului, ne mai având efecte benefice asupra vitrificării.

15

6.2. INFLUENŢA CONCENTRAŢIEI DE CRIOPROTECTORI ŞI A TIMPULUI DE EXPUNERE ASUPRA VITRIFICĂRII PRIN METODA SSV A OVOCITELOR SUINE IMATURE

Rezultatele evaluării morfologice ale ovocitelor suine imature vitrificate prin metoda SSV

În figura 4 sunt prezentate sugestiv, rezultatele obţinute în urma evaluării morfologice a ovocitelor vitrificate cu 35%, 40%, 45% şi 50% etilen glicol în mediul şi timp de echilibrare în mediu de 30, 40, 50 şi 60 secunde.

35%40%

45%50%

30sec

40sec

50sec

60sec

01020304050

60

70

80%

Fig. 4. Rezultatele evaluării morfologice ale ovocitelor vitrificate prin metoda SSV cu diferite

concentraţii de EG şi timpi de echilibrare

Vitrificarea ovocitelor suine imature cu concentraţia etilen glicolului de 45% la timp de echilibrare de 40 secunde a dat cele mai bune rezultate cu privire la integritatea morfologică a acestora. Procentul mediu la aceşti parametri este de 74,81% ± 1,26. Urmată de această valoare este ceea obţinută în cazul vitrificării cu mediu ce conţine 40% etilen glicol şi timpul de expunere este de 40 secunde (72,83% ± 1,23).

Rezultatele evaluării viabilităţii ovocitelor suine imature vitrificate prin metoda SSV În figura 5 sunt prezentate rezultatele cu privire la viabilitatea post-congelare a

ovocitelor vitrificate cu 35%, 40%, 45% şi 50% etilen glicol în mediul de vitrificare şi timp de echilibrare în mediu de 30, 40, 50 şi 60 secunde.

16

35%40%

45%50%

30sec

40sec

50se c

60se c

0

10

20

30

40

50%

Fig. 5. Rezultatele evaluării viabilităţii ovocitelor vitrificate prin metoda SSV cu diferite

concentraţii de EG şi timpi de echilibrare

Valoarea maximă cu privire la viabilitatea post-congelare este de 42,54% ± 0,26, reprezentând punctul cel mai înalt din figura 5. Această valoare s-a obţinut în cazul vitrificării ovocitelor în mediu cu 45% etilen glicol şi timp de expunere de 40 secunde.

6.3. ANALIZA COMPARATIVĂ A REZULTATELOR VITRIFICĂRII PRIN TEHNICILE SOPS ŞI SSV A OVOCITELOR SUINE IMATURE În cazul ambelor metode vitrifcare (SOPS şi SSV) cele mai bune rezultate s-au obţinut în urma vitrificării ovocitelor suine imature, în mediu cu 45% etilen glicol şi timp de echilibrare de 40 secunde. Rezultatele vitrificării cu 35%, 40% şi 50% etilen glicol, sunt inferioare celor obţinute la 45%, motiv pentru care în figura 6 sunt trecute comparaţiile dintre metode, doar cu concentraţia de 45% cu cei patru timpi de echilibrare. (30. 40, 50 şi 60 secunde).

17

70.0677.66

69.360.39

74.81 72.28 73.6771.29

40.1739.3640.9645.79

42.5446.80

30.03 30.41

0102030405060708090

45%

30 se

c SOPS

45%

30sec

SSV

45%

40sec

SOPS

45%

40sec

SSV

45%

50sec

SOPS

45%

50sec

SSV

45%

60sec

SOPS

45%

60sec

SSV

%

Morfologie Viabilitate Fig. 6. Analiza comparativă a rezultatelor vitrificării cu 45% EG prin metoda SOPS şi SSV

Rezultatele cele mai bune atât din punct de vedere a morfologiei cât şi din punct de vedere a viabilităţii post-congelare s-au obţinut prin vitrificarea ovocitelor prin metoda SOPS, cu timp de echilibrare de 40 secunde.

6.4. VITRIFICAREA PRIN METODA SOPS A OVOCITELOR SUINE MATURATE IN VITRO

O influenţă majoră în reuşita vitrificării, o are stadiul de maturare al ovocitei. Părerile

privind vitrificarea ovocitelor imature sau maturate în prealabil sunt împărţite. Unii autori susţin că vitrificarea ovocitelor suine este mai reuşită când acestea adică sunt imature, iar alţi autori susţin contrariul. Ovocitele maturate au fost crioconservate în paiete (SOPS), prin vitrificare în mediu cu 45% etilen glicol şi 0,5M trehaloză şi 40 secunde timp de expunere la acţiunea crioprotectorilor. Această metodă şi variantă experimentală a dat rezultatele cele mai bune în cazul vitrificării ovocitelor imature, motiv pentru care, a fost desemnată pentru crioconservarea ovocitelor suine maturate in vitro.

O parte din ovocitele maturate au avut ataşate la zona pellucida celulele cumulus ooforus (complex ovocită- cumulus- COC integru) şi o altă parte au fost denudate înainte de vitrificare.

în figura 7 sunt prezentate rezultatele evaluării (morfologice, a viabilităţii şi a prezenţei globului polar în spaţiul perivitelin), obţinute în urma vitrificării ovocitelor suine mature, în prezenţa celulelor cumulus ooforus şi denudate.

18

38.21

79.1792.34

41.99

94.72

49.77

0

20

40

60

80

100

COC Denudate

%

Morfologie Viabi l i tate GP

Fig. 7. Rezultatele evaluărilor morfologice, a viabilităţii şi a prezenţei GP la COC şi a

ovocitelor denudate şi vitrificate

În urma evaluării morfologice, a rezultat un procent mediu de 92,34%, COC cu celulele cumulus ooforus expandat, granulaţie uniformă a citoplasmei, zona pellucida intactă, spaţiu perivitelin uşor mărit, caracteristic stadiului MII. Din punct de vedere statistic, aceste valori, sunt semnificativ mai mari (p< 0,001) în comparaţie cu cele obţinute în urma vitrificării ovocitelor denudate (41,99%) şi a celor imature. În ceea ce priveşte viabilitatea din totalul de 212 COC, vitrificate prin tehnica SOPS, 94,72%, au fost numărate vii în urma evaluării prin tripla coloraţie Procentul mediu privind viabilitatea post-congelare al ovocitelor denudate şi vitrificate (38,21%), este cu mult sub cele obţinute la vitrificarea COC.

CAPITOLUL 7.

CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI În urma vitrificării a 10.849 ovocite provenite de la suine prin două metode diferite de

crioconservare, respectiv în paiete (SOPS) şi pe substrat solid (SSV) cu patru concentraţii de etilen glicol (35%, 40%, 45%, 50%) şi patru timpi de expunere (30, 40, 50 şi 60 secunde) s-au desprins următoarele concluzii:

7.1. Concluzii privind determinarea influenţei concentraţiei de crioprotectori şi a timpului de expunere asupra vitrificării prin metoda SOPS a ovocitelor suine imature • Concentraţia de 45% EG în mediul de vitrificare la timp de expunere de 40 secunde,

are cea mai favorabilă acţiune asupra capacităţii ovocitelor crioconservate de a-şi păstra structura morfologică integră şi viabilitatea după decongelare.

• Concentraţiile de 35% şi 50% EG în mediul de vitrificare indiferent de timpul de expunere, nu reuşesc să păstreze structura morfologică şi viabilitatea ovocitelor crioconservate. Ovocitele improprii pentru a fi utilizate în lucrările de fecundaţie in vitro cresc brusc atingând procente ridicate.

• Influenţa timpului de echilibrare asupra reuşitei crioconservării ovocitelor suine imature este dependentă de concentraţia de etilen glicol în mediul de vitrificare.

19

• Timpii optimi de echilibrare din cadrul fiecărei concentraţii a EG în mediul de vitrificare determină diferenţe superioare şi asigurate statistic, comparativ celorlalte loturi.

7.2. Concluzii privind influenţa concentraţiei de crioprotectori şi a timpului de expunere asupra vitrificării prin metoda SSV a ovocitelor suine imature • Echilibrarea ovocitelor în medii cu 45% EG, independent de perioada de timp

experimentată, dă cele mai bune rezultate. • Concentraţia de 35% EG în mediul de vitrificare, indiferent de timpul de echilibrare,

nu asigură condiţiile necesare deshidratării suficient a ovocitelor, iar ca urmare structura morfologică se deteriorează determinând pierderea calităţii acestora.

• Utilizarea mediilor de vitrificare cu 50% EG, la oricare dintre timpii de echilibrare, are efect toxic, calitatea morfologică şi viabilitatea ovocitelor reducându-se la diferenţe asigurate statistic faţă de celelalte variante experimentale.

• În general, creşterea concentraţiei de crioprotector reduce timpul de echilibrare a ovocitelor atingând un optim după care calitatea ovocitelor vitrificate scade puternic.

7.3. Concluzii privind analiza comparativă a rezultatelor vitrificării ovocitelor suine imature prin metodele SOPS şi SSV • Metoda SOPS este superioară metodei SSV deoarece determină păstrarea integrităţii

morfologice şi a viabilităţii ovocitelor suine imature vitrificate la majoritatea variantelor experimentale.

• Metoda SSV prezintă valori superioare metodei SOPS în privinţa păstrării integrităţii morfologice a ovocitelor vitrificate în cazul concentraţiei de 50% EG independent de timpul de echilibrare.

• Diferenţele dintre metode privind păstrarea integrităţii morfologice şi a viabilităţii ovocitelor sunt datorate specificului tehnicii aplicate. În cazul SSV timpul în care se ajunge la temperatura de - 196°C este mai lung comparativ vitrificării prin SOPS ceea ce explică superioritatea ultimei metode.

7.4. Concluzii privind vitrificarea prin metoda SOPS a ovocitelor suine maturate in vitro • Vitrificarea ovocitelor suine maturate in vitro, duce la păstrarea structurii morfologice,

precum şi o sporire a numărului de ovocite vii post-vitrificare. • Crioconservarea ovocitelor suine maturate şi nedenudate dă rezultate superioare celor

obţinute prin vitrificarea ovocitelor maturate şi denudate. Prezenţa celulelor cumulus ooforus favorizează schimburile dintre mediul de vitrificare şi ovocite determinând sporirea gradului de reuşită a vitrificării.

Recomandări: • Utilizarea timpilor de echilibrare şi a mediilor de vitrificare care au concentraţii

optime de crioprotectori, specifice fiecăreia dintre metodele experimentale. • Vitrificarea ovocitelor suine imature prin metoda SOPS folosind concentraţii de 45%

EG şi timpi de echilibrare de 40 secunde. • Crioconservarea ovocitelor suine maturate in vitro prin metoda SOPS în mediu de

vitrificare cu 45% EG şi timp de echilibrare 40 secunde.

20

• Vitrificarea ovocitelor suine maturate in vitro care au cumulus ooforus integru (nedenudate).

• În cazul scăderii concentraţiei de EG în mediul de vitrificare este necesară sporirea duratei de echilibrare pentru a optimiza rezultatele crioconservării ovocitelor suine.

• Pentru optimizarea tehnicii de lucru, este necesar ca numărul de ovocite din micropicăturile de mediu de vitrificare cu volum de 2,5µl să fie optim, respectiv reducerea acestora să se coreleze cu cheltuielile efectuate.

Elemente de originalitate: • Îmbunătăţirea tehnicii de vitrificare prin reducerea numărului de ovocite suine pe

micropicăturile de mediu şi depistarea situaţiilor de pierdere a calităţi acestuia pe baza culorii, în momentul scăderii temperaturii.

• Determinarea concentraţiei de 45% etilen glicol şi a timpului de echilibrare de 40 secunde ca şi parametrii optimi pentru reuşita vitrificării ovocitelor suine imature prin metoda SOPS şi SSV.

• Stabilirea procentului de păstrare a integrităţii morfologice şi a viabilităţii ovocitelor suine imature vitrificate prin metodele SOPS şi SSV, la concentraţii de 35%, 40%, 45%, 50% etilen glicol şi timpi de echilibrare de 30, 40,50 şi 60 secunde.

• Precizarea influenţei timpului de echilibrare a ovocitelor suine imature în medii de vitrificare care au concentraţii specifice de crioprotector, asupra morfologiei şi viabilităţii acestora.

• Utilizarea celei mai bune concentraţii de etilen glicol şi a timpului optim de vitrificare a ovocitelor suine imature este o soluţie de urmat pentru crioconservarea ovocitelor suine maturate in vitro.

21

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. ANCHORDOGUY T.J., A.S. RUDOLPH, F.F. CARPENTER, J.H. CROWE, 1987, Modes of interaction of cryoprotectants with membrane phospholipids during freezing, Cryobiology, 24: 324 –331. 2. CEAN ADA (căs. TELEA), 2009, Teză de doctorat, Cercetări privind congelarea rapidă a embrionilor de mamifere, USAMVB Timişoara. 3. LEIBO S.P., 1980, Water permeability and its activation energy of fertilized and unfertilized mouse ova, Journal Membrane Biology, 53:179-188. 4. FAHY G.M., T.H. LILLEY, H. LINSDELL, M.S. DOUGLAS, H.T. MERYMAN, 1990, Cryoprotectant toxicity and cryoprotectant toxicity reduction: in search of molecular mechanisms, Cryobiology, 27: 247 –268. 5. LEIBO S.P., J.J. MCGRATH AND E.G. CRAVALHO, 1978, Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate, Cryobiology, 15:257-271. 6. PEDRO P.B., E. YOKOYAMA, S.E. ZHU, 2005, Permeability of mouse oocytes and embryos at various developmental stages to five cryoprotectants, Journal of Reproduction and Development, 51: 235 –246. 7. SOMFAI, T., M. OZAWA, J. NOGUCHI, H. KANEKO, N.W.K. KARJA, M. FARHUDIN, A. DINNYES,T. NAGAI, K. KIKUCHI, 2007, Developmental competence of in vitro-fertilized porcine oocytes after in vitro maturation and solid surface vitrification: effect of cryopreservation on oocyte antioxidative system and cell cycle stage, Cryobiology 55: 115–126. 8. TUCKER M., N.J. LIEBERMAN, 2007, Vitrification in assisted reproduction, Ed. Informa Healthcare. 9. VAJTA G., 2000, Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals, Animal Reproduction Science, 60-61:357-364. 10. WASSARMAN P., 1988, The mammalian ovum, Page 69 in The Physiology of Reproduction. E. Knobil and J. Neill, eds. Raven Press, New York.

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE

DOCTORAL SCHOOL FACULTY OF ANIMAL HUSBANDRY AND BIOTECHNOLOGIES

Eng. Hettig Andrea Klara

PhD THESIS

VITRIFICATION OF SWINE OOCYTES: EFFECT OF CRYOPROTECTANT CONCENTRATION AND

EXPOSURE TIME Scientific coordinator,

Prof. dr. ing. Miclea Vasile

Cluj-Napoca 2011

2

TABLE OF CONTENT INTRODUCTION..............................................................................................................4 PART I ................................................................................................................................4 CHAPTER 1 CRYOBIOLOGY BASIS ..........................................................................4

1.1. CRYOBIOLOGY ELEMENTS................................................................................4 1.2. STRUCTURA OVOCITEI ŞI EFECTELE NEGATIVE ALE CRIOCONSERVĂRII .....................................................................................................4

CHAPTER 2 .......................................................................................................................5 CRYOPROTECTIV AGENTS USED IN VITRIFICATION.......................................5

2.1. PENETRATING OR PERMEABLE CRYOPROTECTANTS................................5 2.2. NON-PENETRATING OR PERMEABLE CRYOPROTECTANTS......................5

CHAPTER 3. THE CRIOPROTECTANTS EFFECTS................................................6 3.1. CRYOPROTECTANT TOXICITY AND DAMAGE..............................................6

3.1.1. The effects of exposure time, concentration, and temperature on toxicity ........6 3.1.2. Avoiding damage and toxicity............................................................................6

CAPITOLUL 4...................................................................................................................7 PART II...............................................................................................................................7 OWN RESEARCHES .......................................................................................................7 GOAL AND OBJECTIVES..............................................................................................7 EXPERIMENTAL DESIGN ............................................................................................8 CHAPITER 5. VITRIFICATION METHODES USED................................................8

5.1 IMMATURE SWINE OOCYTES VITRIFICATION BY THE SOPS TECHNIQUE..........................................................................................................................................8

5.1.1. Biological material ............................................................................................8 5.1.2. Used media.........................................................................................................8 5.1.3. Working methods ...............................................................................................9

5.1.3.1. Ovaries and oocytes collection ...................................................................9 5.1.3.2. Oocyte vitrification by the SOPS method ..................................................9 5.1.3.3. Oocytes warming ........................................................................................9 5.1.3.4. Oocyte washing and morphological evaluation..........................................9 5.1.3.5. Oocyte denuding and viability evaluation through FDA and PI staining.10

5.2. IMMATURE SWINE OOCYTES VITRIFICATION BY THE SSV TECHNIQUE........................................................................................................................................10

5.2.3.1.Crioconservarea ovocitelor prin tehnica vitrificării pe substrat solid (SSV)................................................................................................................................10 5.2.3.2. Oocyte warming and evaluation ...............................................................10

5.3. SOPS VITRIFICATION OF IN VITRO MATURATED OOCYTES....................10 5.3.1. Biological material ..........................................................................................10 5.3.2. Used media.......................................................................................................11 5.3.3. Working methods .............................................................................................11

5.3.3.Oocyte collection and maturation .................................................................11

3

5.3.3.2. Vitrification by the SOPS method ............................................................11 5.3.3.3. Morphological assessments of in vitro maturated oocytes after vitrification.............................................................................................................11 5.3.3.4 Viability assessments of in vitro maturated oocytes after vitrification .....11

CHAPTER 6. RESULTS AND DISCUSSION .............................................................12 6.1. INFLUENCE OF CRIOPROTECTANT CONCENTRATION AND EQUILIBRATION TIME ON SOPS VITRIFIED IMMATURE SWINE OOCYTES .12 6.2. THE INFLUENCE OF CRIOPROTECTANT CONCENTRATION AND EQUILIBRATION TIME ON SSV VITRIFIED IMMATURE SWINE OOCYTES ....13 6.3. COMPARATIVE ANALISYS OF IMMATURE SWINE OOCYTES VITRIFICATION RESULTS BY SOPS AND SSV METHODS ..................................15 6.4. SOPS VITRIFICATION OF IN VITRO MATURATED SWINE OOCYTES .......15

CHAPTER 7. GENERAL CONCLUSIOSN AND RECOMMENDATIONS...........16

4

INTRODUCTION

Although the history of the concept goes back more than three quarters of a century, the field is probably still in the infancy of its full potential. As always, nature may have preceded biologists in discovering viable approaches to vitrification, but for the most part nature’s examples remain both recondite and difficult to emulate directly.

Vitrification is a viable approach to cryopreservation of a wide range of living systems. Its physical and biological principles are continuing to become better understood, and this is leading to more numerous and more successful applications.

Nevertheless, reproductive cryobiologists have ample means and ample incentive to follow nature’s lead and develop their own approaches to answering one of biology’s most interesting challenges, the goal of arresting life in a state of suspended animation and restarting it at the right time to enable new lives to begin (Tucker, 2007).

PART I

CHAPTER 1 CRYOBIOLOGY BASIS

1.1. CRYOBIOLOGY ELEMENTS Cryobiology is one of the biological fields that have grown spectacularly in recent

decades. The objectives of this domain are all the changes which suffers cells, tissues, organs and organisms (bios= life), when they are exposed to low temperatures in generally and negative (crios = cold), especially.

Cryopreservation is based on the principle that low temperatures determine the intracellular level, a reduction in molecular motion and thus a significant decrease in metabolism to extreme levels, resulting the so-called anabiosis (Ladoşi, 1997).

1.2. STRUCTURA OVOCITEI ŞI EFECTELE NEGATIVE ALE CRIOCONSERVĂRII Oocytes are more difficult to cryopreserv than embryos, because they are spherical

cells, large, with a small area (reported to the volume) and low hydraulic conductivity (Leibo, 1980). The oocyte is the largest cell in the body of most species of mammals (Wassarman, 1988). Approximately 80% of their volume is water. When cooled to temperatures below 0°C, intracellular ice can form, which is likely dependent on the temperature-decreasing rate (Leibo et al., 1978).

The damages produced by cryopreservation can be both intracellular (regarding to nucleus, cytoplasm with cell organelles: mitochondria, actin/microfilaments, microtubules/spindle) and extracellular (zona pellucida).

5

CHAPTER 2

CRYOPROTECTIV AGENTS USED IN VITRIFICATION

Vitrification is the solidification of the solutions without ice crystal formation by increasing the viscosity during the decreasing temperature.

The total absence of ice crystals during vitrification is due to the high concentrations of cryoprotectant. Small crystals of ice are not considered dangerous as long as there is no recrystallization environment (union of small crystals of ice crystals forming large) (Ada Cean, 2009). The cryoprotectors used for biological entities preservation are divided in two major groups:

penetrating or permeable cryoprotectants non-penetrating cryoprotectants

2.1. PENETRATING OR PERMEABLE CRYOPROTECTANTS Penetrating cryoprotectants are generally small, nonionic compounds with a high

solubility in water at low temperatures. Given time, these chemical compounds can diff use through cellular membranes, permeating the cell and equilibrating within the cytoplasm, replacing the bulk of intracellular water without over-dehydrating the cell. Permeating cryoprotectants solidify at lower temperatures than water and thus subsequently reduce the amount of intracellular ice formation at a given temperature. This decreased amount of intra cellular ice-crystal formation mitigates damage resulting from physical perturbations to cellular organelles and membranes. Additionally, penetrating cryoprotectants provide buffering against salt-induced stress by acting as solvent, reducing the solute concentration in the remaining water fraction inside the cell until the system it is cooled to a low enough temperature. Success using each type of permeating cryoprotectant depends in part on the speed at which they can cross cellular membranes, and this rate is dictated by various factors, such as viscosity. However, permeation is dependent not only upon the cryoprotectant itself but also upon the membrane properties of the cell, which vary between cell types as well as cell stages. (Pedro et al., 2005). The most important permeable cryoprotectants are: ethylene glycol (EG), dimethyl sulfoxide (DMSO), propylene glycol (PROH) and glycerol. Ethylene glycol is the less toxic compared to the other permeable cryoprotectants, reason why it id used in our vitrification protocol.

2.2. NON-PENETRATING OR PERMEABLE CRYOPROTECTANTS Non-penetrating cryoprotectants are generally long chain polymers too large to diff use into cells. These compounds act to increase osmolarity of the extracellular space, which results in cellular dehydration and thus reduces the chance of intracellular ice crystal formation. It is also postulated that some non-permeating cryoprotectants may absorb on membrane surfaces, inhibiting ice crystal formation in the immediate vicinity of the cell by keeping ice in the amorphous state. Additionally, non-penetrating cryoprotectants are oft en included in media used for warming/thawing of cells to help to avoid osmotic

6

shock. Osmotic shock describes the phenomenon that occurs when the osmotic pressure of the intracellular compartment is greater than the extracellular compartment, which occurs because of cellular dehydration. Upon thawing, traumatic cell expansion and lysis can occur following the accompanying water influx.

The most important impermeable cryoprotectants are macromolecules (Ficoll, polyvinyl pirrolydone, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol), sugars (trehalose, sucrose, glucose, lactose, lactose). In the present study, trehalose was used in the vitrification protocol.

CHAPTER 3. THE CRIOPROTECTANTS EFFECTS

3.1. CRYOPROTECTANT TOXICITY AND DAMAGE Regarding reproductive biology and assessing suitability/toxicity of a

cryoprotective agent, certain endpoint measures are commonly assessed. In sperm, these endpoints often include effects on motility, capacitation, and ability to fertilize. In oocytes, assessment of damage from cryoprotectants oft en focuses on the meiotic spindle, actin cytoskeleton, chromosomal arrangement, and ability to fertilize. Regarding embryos, toxicity studies tend to examine ability to continue embryonic development, or effects on various molecular and biochemical signaling pathways. Unfortunately, the exact mechanisms by which the toxicity of cryoprotective agents arises are unknown. Examples of damage induced by improper exposure to various cryoprotectants range from removal or fusing of cellular membranes to impair enzyme activity, altered organelle structure/function, and perturbed protein interactions (Fahy, 1986; Fahy et al., 1990; Anchordouguy et al., 1987).

3.1.1. The effects of exposure time, concentration, and temperature on toxicity The conditions under which cryoprotectant exposure occurs can influence their

toxicity for reproductive cells. Factors such as time of exposure, concentration of cryoprotectant, as well as temperature of exposure all influence the effect of the particular protecting agent.

While cryoprotectants themselves are generally nontoxic when exposed to cells for short periods, extended exposure or exposure at elevated concentrations can result in metabolism of the cryoprotectant agents, which can subsequently disrupt cellular function and viability.

3.1.2. Avoiding damage and toxicity Selection of a suitable cryoprotectant and optimizing its concentration, as well as

monitoring the time and temperature of exposure, all influence the potential damage a cryoprotectant may cause to a cell. Therefore, a common approach to reduce toxicity has emerged that entails combining various cryoprotectants, both permeating and non-permeating, thereby reducing individual concentrations and mitigating damage while maintaining the overall protective effects.

Methods of introducing and removing cryoprotectants offer another means to reduce toxicity or resulting damage. Stepwise addition of cryoprotective agents, or gradually increasing concentrations, has been useful. Additionally, stepwise removal of these

7

compounds upon warming/thawing helps to minimize osmotic stress. Furthermore, altering the ionic composition of the carrier solution in which the cryoprotectant was dissolved offers another means of mitigating damage. Specifically, replacing sodium with choline attenuates damage from the solute effect and may benefit from increasing solution viscosity.

CAPITOLUL 4 CRIOCONSERVAREA PRIN VITRIFICARE – METODE UZUALE

With the development of cryobiology and especially the fast cryopreservation, there

are numerous techniques for vitrification of oocytes and embryos of all species of animals and human gametes and embryos

The most used technique are: vitrification in open pull straw (OPS), super fine open pull straw (SOPS), cryoloop, on solid surface (SSV), cryotip cryotop, the hemy-straw system and closed pull straws.

Super fine open pull straw (SOPS) and solid surface vitrification (SSV) techniques are used in our research, for immature swine oocytes vitrification.

PART II

OWN RESEARCHES

GOAL AND OBJECTIVES The researches aimed at improving the method of cryopreservation of swine oocytes by the SOPS and SSV technique

To achieve that goal the following objectives were set: 1. Define the optimal ethylene glycol concentration on immature swine oocytes

vitrification by the SOPS technique. 2. Establish the optimal exposure time on immature swine oocytes vitrification by

the SOPS technique considering the concentration of the ethylene glycol in the vitrification medium.

3. Define the optimal ethylene glycol concentration on immature swine oocytes vitrification by the SSV technique.

4. Establish the optimal exposure time on immature swine oocytes vitrification by the SSV technique considering the concentration of the ethylene glycol in the vitrification medium.

5. Determine the effect of cryoprotectant concentration and exposure time depending on the vitrification technique used.

6. Vitrification of in vitro maturated swine oocytes, applying the best technique, cryoprotectant concentration and optimal equilibration time.

8

EXPERIMENTAL DESIGN

CHAPITER 5. VITRIFICATION METHODES USED

5.1 IMMATURE SWINE OOCYTES VITRIFICATION BY THE SOPS TECHNIQUE

5.1.1. Biological material The biological material used was represented by immature swine oocytes harvested

from prepuberal saws ovaries obtained from SC. Turism Vâlcele SRL slaughterhouse from Cluj County. For ovaries were collected from prepuberal gilts belonging to commercial hybrids, with maximum weight up to 110 kg.

5.1.2. Used media Transportation medium

For transport of the ovaries 0,9% NaCl saline solution in pure water, supplemented with antibiotics (penicillin, gentamycine and streptomycin) was used.

Oocytes collecting medium For oocytes collection, M 199 1X containing Earle’s salts, supplied by Sigma was

used. Cryopreservation media

Holding medium (MB), containing phosphate buffered solution (PBS) 10x, pure water and bovine fetal (FSB).

Previtrification medium: is composed of MB, ethylene glycol 15% (EG) for internal protection and trehalose (0,25M) for extracelullar protection.

Vitrification medium: contains the same substance that contains previtrificare medium, the differences being given by their concentration, depending on the experimental groups.

Warming solution: consist of PBS and trehalose with three decreasing concentration (0,5M, 0,25M and 0,125M).

SWINE OOCYTE

VITRIFICATIO

IMMATURE

IN VITRO MATURATED

SOPS technique

SSV technique

Defining the influence of EG concentration

Defining the optimal exposure

time

Defining the influence of EG concentration

Defining the optimal exposure

time

With cumulus ooforus cells

Denuded

9

Washing meium: composed of PBS supplemented with 0,4 % bovine serum albumine (BSA).

Stainig solution: is composed of PBS and two complementary dyes namely fluorescein diacetate (FDA) and propium iodide (PI).

5.1.3. Working methods

5.1.3.1. Ovaries and oocytes collection Ovaries were collected in a thermo-isolated container containing a 0,9% NaCl saline

solution at 37°C. They were transported to the laboratory within 4-6 hours. In the laboratory, the

oviductal tissue is detached from the ovaries washed and placed in a recipient with salt solution suplimented with antibiotics. Oocytes were collected by the follicular aspiratory method from the follicles with a 2-5 mm diameter. After collection oocytes assessment was performed.

5.1.3.2. Oocyte vitrification by the SOPS method Oocytes washed two times and equilibrated in cryopreservation media in a stepwise

manner. Previtrification: groups of 10 oocytes were taken with a Pasteur pipette, and placed

into 30 µl droplets of previtrification solution. Oocytes were maintained in the solution for 4 minutes.

Vitrification: oocytes were transferred into the vitrification micro-droplets (2µl) media containing the final concentration of ethylene glycol and trehalose.

After the exposure time expires (specific to each experimental variants), oocytes were loaded onto SOPS, with a touch of the micro-droplet with pipette tip. The medium with the oocytes were loaded by capillary action in the pipette. The pipettes are places in a tub with liquid nitrogen and then transferred and stored until evaluation in a container.

5.1.3.3. Oocytes warming The straw were taken from the tube containing nitrogen, and kept in air for 5

seconds, after which the oocytes are passed sequentially through thawing media with decreased concentration of trehalose (Vajta, 2005) and kept for 5 minutes (Somfai, 2007) in each medium. Oocytes evacuation was performed by the simply touch of the pipette tip to the media through a reverse capillary phenomena.

5.1.3.4. Oocyte washing and morphological evaluation Oocytes were washed three times in drops of 60 ml of PBS supplemented with 0.4%

BSA, to evacuate the remaining the cryoprotectant. After washing, oocytes were morphologically assessed by Olympus microscope with inversion. Oocytes that showed adherent cumulus layers, firmly attached to oocytes, zona pellucida intact, well-defined membrane, evenly granulated and compact ooplasm were considered morphologically normal cells and there were counted.

10

5.1.3.5. Oocyte denuding and viability evaluation through FDA and PI staining Oocyte denuding was achieved as follows: 15-20 oocytes were placed in 30 ml PBS,

after which 200 ml PBS that previously was taken into a micropipette and was pipetted over the oocytes. By repeated pipetting, most of the cumulus cells were separated from oocytes.

Oocytes staining were performed after denudation. In a first step on a Petri dish with 30 µl, droplets were placed groups of 10-15 oocytes. The Petri dish was then placed in the thermostat to 37˚C for 10 minutes, after which they are evaluated under a microscope equipped with UV lamp. The viable cells were green fluorescent due to enzymatic activity (stained with FDA) and uncolored with PI due to membrane integrity. The death cells were not stained with FDA but stained with PI.

5.2. IMMATURE SWINE OOCYTES VITRIFICATION BY THE SSV TECHNIQUE Biological material, media used and most of the working method are the same as

described at SOPS method, so that will be described only procedures that differs. For immature swine oocytes vitrification by the SSV technique were used 5164 gametes.

5.2.3.1.Crioconservarea ovocitelor prin tehnica vitrificării pe substrat solid (SSV) Previtrification: it is the same as described at the SOPS vitrification method. Vitrificarea: after previtrification, oocytes were transferred into the 2μl vitrification micro-droplets that were placed on aluminum foils, representing the solid substrate. After equilibration in the vitrification media (time specific or each experimental group) the aluminum foils were taken from a corner with a long forceps and placed in a tube that is immersed in liquid nitrogen, then the tube was closed and transferred and stored in a liquid nitrogen container until evaluation.

5.2.3.2. Oocyte warming and evaluation At thawing, aluminum foils were taken one by one from the tube with liquid nitrogen and were placed on heating plate, which was previously heated at 37 ° C. Thus, the droplets with oocytes were thawed on aluminum foil, with an automatic pipette were taken and placed in the thawing media. After maintaining the oocytes in each of the thawing media for 5 minutes, they were washed in PBS, stained with fluorescent dyes and evaluated (the morphology and viability). The procedure is the same like in the case of SOPS vitrified oocytes, so that will not be described in this chapter.

5.3. SOPS VITRIFICATION OF IN VITRO MATURATED OOCYTES

5.3.1. Biological material The biological material was represented by immature oocytes collected from ovaries of slaughtered sows.

11

5.3.2. Used media Transportation medium of the ovaries and collection medium are identical to those

described in subsection 5.2.2, which is why they will not be mentioned in this chapter. It will be described the specific points of this chapter.

Maturation medium For oocyte maturation, M 199 was supplemented with L-glutamine (3.4 g/l), Chorulon (10 IU/ml), Folligon (10 IU/ml), fetal bovine serum 10%, penicillin (100 μg /ml) and streptomycin (100 IU/ml). The pH was checked an corrected to 7,4.

Cryopreservation medium: consist of holding medium (HM) with cryoprotectants. The prevetrification medium was composed of HM, 15% EG and 0,25M trehalose. The composition of vitrification solution was HM, 45% EG and 0,5M trehalose.

Warming solution is the same we used for immature oocytes Staining solution: differs from that used for immature oocytes in that it contains

a third dye: Hoechst 33258.

5.3.3. Working methods

5.3.3.Oocyte collection and maturation Method of harvesting oocytes is the same as described in section 5.1.3.Oocytes with a uniform ooplasm and compact cumulus cell mass were washed with harvest medium. Then were placed in 30 μl droplets of maturation medium, covered in paraffin oil and incubated for 44 hours at 37°C in an atmosphere with 5% CO2.

5.3.3.2. Vitrification by the SOPS method Because the best results for immature oocytes was obtained by vitrification with the SOPS technique, with 45% ethylene glycol in the vitrification solution, with 40 seconds exposure time, we chose this technique and parameters for in vitro maturated oocytes preservation. Therefore, after 44 hours of maturation, oocytes were transferred from maturation drops in 60 μl of PBS supplemented with BSA (0.4%). Oocytes were washed two times and there were undergone to the vitrification process. The procedure is the same as in immature oocytes vitrification by the SOPS method.

5.3.3.3. Morphological assessments of in vitro maturated oocytes after vitrification Cumulus-oocyte complexes were observed under microscope. To assess the morphology of oocytes were used the following indicators: cumulus oocyte complex diameter extension, perivitelin space growth, cumulus ooforus cells expansion (according to the criteria developed by Downs, 1989). After morphological evaluation, oocytes were denuded mechanically by repeated pipetting. Thus prepared were undergone to viability assessment.

5.3.3.4 Viability assessments of in vitro maturated oocytes after vitrification The oocytes were transferred to PBS containing 1 µg/ml 3’, 6’ fluorescein diacetate (FDA), 50 µg/ml propidium iodide (PI), and 20 µg/ml Hoechst 33258, incubated for 15 minutes and viewed under the UV light of the inverted microscope. Live oocytes appeared green (FDA stained), and their chromosomes were labelled with the Hoechst

12

33342 being blue under UV light. The cytoplasm of dead oocytes ware not coloured with FDA but they were stained with PI, thus appearing red.

CHAPTER 6. RESULTS AND DISCUSSION

6.1. INFLUENCE OF CRIOPROTECTANT CONCENTRATION AND EQUILIBRATION TIME ON SOPS VITRIFIED IMMATURE SWINE OOCYTES

Results of morphological evaluation of SOPS vitrified swine immature oocytes In figure 2 are presented the results of morphological evaluation of oocytes vitrified

by 35%, 40%, 45% and 50% ethylene glycol in the vitrification medium and 30, 40, 50 and 60 seconds exposure time. As shown in Figure 2, the best results after the morphological integrity evaluation post-thawing were obtained when oocytes were vitrified with 45% ethylene glycol in the medium while exposure time is 40 seconds. The averaged value over five repetitions percentage is 77.66% ± 0.75. Therefore, more than 70% of oocytes after thawing showed a uniform ooplasm, well-attached cumulus cells attached and zona pellucida without rupture.

35%40%

45%50%

30 sec

40 sec

50 sec

60 se c

20

30

40

50

60

70

80%

Fig. 2. Morphological assessment of oocytes vitrified with different concentrations of EG and equilibration times

At this concentration of cryoprotectant and exposure for the majority of oocytes

achieved adequate membrane exchange between water and permeable crioprotectorul (EG), thus achieving ooplasm gelling and it becomes solid, vitreous at low temperatures. Slightly below this value (76.58 ± 2.10) is obtained oocytes were vitrified with 40% EG in the medium and exposed for 50 seconds.

Noteworthy are the percentages of 75.54% ± 1.29, obtained from oocytes vitrified with 40% in the medium and exposure time 60 seconds. All the above values represent peaks in figure 2, also it is seen well the inferiority results in extreme concentrations of ethylene glycol (35% and 50%) regardless equilibrating time.

Results of viability assessments of SOPS vitrified swine immature oocytes

13

The results on post-freezing viability of vitrified oocytes by 35%, 40%, 45% and 50%

ethylene glycol in the medium and 30, 40, 50 and 60 seconds exposure time, are presented in Figure 3.

As morphology, most oocytes were recorded live when they were exposed to vitrification media containing 45% EG for 40 seconds. Average percentage value of five repetitions is 46.80% ± 0.32, showed very well the highest point in Figure 3. Oocytes showed an intense enzyme activity, colored green at the UV light of the microscope.

35%40%

45%50%

30 sec

40 sec

50 sec

60 sec

0

10

20

30

40

50%

Fig.3. Viability assessment of SOPS vitrified oocytes with different concentrations

of EG and equilibration times

With 1.01% below the experimental version mentioned above are the results with 45% EG in the vitrification medium, while exposure time is 50 seconds. This value is the second peak highest in figure 3.By cryopreservation with 40%, EG the average percentage values of live oocytes after thawing are reduced by 10% -17%. If the concentration of 35% is reduced by 15% - 19% compared to values of 45%. These concentrations of cryoprotectants are not enough, regardless of exposure time, to bring cells in a vitreous solid state when immersed in liquid nitrogen.

It can be seen very well the lowest points obtained for immature swine oocytes vitrified with 50% ethylene glycol in the media, regardless of time of equilibration. This phenomenon is explained by the fact that at this high concentration increases the toxicity of cryoprotectant, and it has no longer beneficial effect.

6.2. THE INFLUENCE OF CRIOPROTECTANT CONCENTRATION AND EQUILIBRATION TIME ON SSV VITRIFIED IMMATURE SWINE OOCYTES

Results of morphological evaluation of SSV vitrified swine immature oocytes The results of morphological evaluation of oocytes vitrified by 35%, 40%, 45% and 50% ethylene glycol in the vitrification medium and 30, 40, 50 and 60 seconds exposure time are presented in figure 4.

14

35%40%

45%50%

30sec

40sec

50sec

60sec

01020304050

60

70

80%

Fig. 4. Morphological assessment of SSV vitrified oocytes with different

concentrations of EG and equilibration times

Immature swine oocytes vitrification with ethylene glycol concentration of 45% and 40 seconds exposure time, gave the best results on morphological integrity assessment. The average percentage of morphological normal oocytes after thawing is 74.81% ± 1.26. Followed by this value are the average obtained when ethylene glycol concentration was 40% with the same exposure time (72.83% ± 1.23).

Results of viability assessments of SSV vitrified swine immature oocytes In figure five, there are presented the results on post-freezing viability of oocytes

vitrified by 35%, 40%, 45% and 50% ethylene glycol in the media and 30, 40, 50 and 60 seconds exposure time.

35%40%

45%50%

30sec

40se c

50sec

60sec

0

10

20

30

40

50%

Fig.5. Viability assessment of SSV vitrified oocytes with different concentrations of EG

and equilibration times

The maximum value on post-freezing viability 42.54% ± 0.26 is representing the highest point in Figure 5. This value was obtained when oocytes were exposed 40 seconds to vitrification medium with 45% ethylene glycol.

15

6.3. COMPARATIVE ANALISYS OF IMMATURE SWINE OOCYTES VITRIFICATION RESULTS BY SOPS AND SSV METHODS

The best results for swine immature oocytes vitrification has been obtained, in case of both methods (SOPS vs. SSV), by using a concentration of 45% ethylene glycol in the media and 40 seconds equilibration time.

The vitrification results using 35%, 40% and 50% ethylene glycol in the media, are lower than those obtained with 45% EG, which is why in figure 6 are presented the analysis between the two method with 45% EG and the four exposure time.

70.0677.66

69.360.39

74.81 72.28 73.6771.29

40.1739.3640.9645.79

42.5446.80

30.03 30.41

0102030405060708090

45%

30 se

c SOPS

45%

30sec

SSV

45%

40sec

SOPS

45%

40sec

SSV

45%

50sec

SOPS

45%

50sec

SSV

45%

60sec

SOPS

45%

60sec

SSV

%

Morfologie Viabilitate Fig. 6. Morphology and viability of oocytes vitrified with 45% EG by SOPS and SSV

methods

As shown in figure 6, the best results both in terms of morphology and post-thawing viability of the oocytes were obtained by SOPS vitrification with 45% EG and 40 seconds exposure time.

6.4. SOPS VITRIFICATION OF IN VITRO MATURATED SWINE OOCYTES

A major influence on a successful vitrification has the oocyte stage. Opinions on immature or mature oocytes vitrification in advance are divided. Some authors claim that swine oocytes vitrification is successful if they are immature, and other authors argue the opposite. Mature oocytes were vitrified by the SOPS method with 45% ethylene glycol in the medium plus 0.5 M trehalose. The were maintained 40 seconds in the vitrification media. This method and experimental design gave the best results when immature oocytes were vitrified, therefore, has been designated for cryopreservation of in vitro maturated swine oocytes. Some of the oocytes were vitrified with the cumulus ooforus cells enclosed (COC- cumulus oocyte complex) and some of them were denuded before preservation.

In the figure below are presented the results regarding morphology and viability assessments and the presence of the first polar body (PB) in the perivitelin space.

16

38.21

79.1792.34

41.99

94.72

49.77

0

20

40

60

80

100

COC Denudate

%

Morfologie Viabilitate GP

Fig. 7. Morphology, viability and PB presence assessments after vitrification of COCs and denuded oocytes

The results of morphological assessment, shows that an average of 92.34% COCs

has cumulus ooforus cells expanded, uniform grained cytoplasm, intact zona pellucida, slightly increased perivitelin space, characteristic to the MII stage oocytes. Statistically, these values are significantly higher (p <0.001) compared with those obtained from denude oocytes (41.99%). Regarding viability, from 212 COCs vitrified by the SOPS technique, an average of 94.72% were counted viable by triple staining assessment. The average percentage of post-thawing viability of denuded oocytes is well below (38.21%), those achieved in vitrification COC.

CHAPTER 7. GENERAL CONCLUSIOSN AND RECOMMENDATIONS

An amount of 10.849 swine oocytes were vitrified by two different cryopreservation methods (SOPS and SSV) with four concentration of ethylene glycol (35%, 40%, 45%, 50%) and four exposure times (30, 40, 50 and 60 seconds). The following conclusions results: 7.1. Conclusions regarding cryoprotectant concentration and exposure time influence on SOPS vitrified immature swine oocytes

• The 45% ethylene glycol concentration in the vitrification medium and 40 seconds exposure time had the most favorable action on the ability of cryopreserved oocytes to keep their morphological structure integrity and viability after thawing, regardless of exposure time used.

• Concentrations of 35% and 50% ethylene glycol in vitrification medium regardless of exposure time, fail to preserve the morphological structure and viability of the vitrified thawed oocytes. Oocyte unsuitable for in vitro fertilization reaches suddenly high percentages.

• The influence of exposure time on the success of immature swine oocytes preservation is dependent on the concentration of ethylene glycol in the vitrification media.

• Optimal exposure times of each vitrification media determine statistically superior differences compared to other groups.

7.2. Conclusions regarding cryoprotectant concentration and exposure time influence on SSV vitrified immature swine oocytes

17

• Exposing oocytes to 45% EG in vitrification medium, gives the best results. regardless the period,

• Concentration of 35% EG in vitrification medium, at any equilibration period does not provide sufficient conditions for oocytes dehydration and their morphological structure deteriorates and causing quality loss.

• Vitrification media with 50% EG regardless exposure time has a toxic effect, on the viability and morphological quality of oocytes with statistically differences compared to other experimental groups.

• In general, increasing the concentration of cryoprotectant reduces equilibration period, reaching an optimum quality of vitrified oocytes, then decreases strongly.

7.3. Conclusions regarding comparative analisys of immature swine oocytes vitrification results by SOPS and SSV methods

• SOPS method is superior compared to the SSV method because maintains in most experimental variants the morphological integrity and viability of the vitrified swine immature oocytes

• SSV method shows higher values on SOPS method of preserving the morphological integrity of vitrified oocytes when 50% ethylene glycol was used, regardless time.

• Differences between methods of preserving morphological integrity and viability of oocytes are due to the specific technique used. SSV, reaches - 196 ° C later than the SOPS, which explains the superiority of the last method.

7.4. Conclusions regarding sops vitrification of in vitro maturated swine oocytes • In vitro maturated swine oocytes vitrification leads to an increasedand viability

after. • Cryopreservation of matured swine oocytes with cumulus ooforus cells attached

gives superior results compared to denuded oocytes The presence of these cells promote trade between vitrification media and the oocyte increasing the success of vitrification.

Recommendations

• Use time balancing and vitrification media have with optimal cryoprotectant concentrations, specific to each experimental method.

• Immature swine oocytes vitrification by the SOPS method using 45% ethylene glycol and 40 seconds equilibration times.

• Cryopreservation of in vitro maturated swine oocytes by SOPS method with 45% ethylene glycol and 40 seconds exposure time.

• Vitrification of in vitro maturated swine oocytes with cumulus ooforus cells attached.

• If the concentration of EG decrease in the vitrification medium is necessary to increase the exposure time to optimize the results.

• To optimize the technique, it is necessary that the number of oocytes from a 2.5 µl volume of vitrification media to be optimal, and correlated with spending cuts.

18

Originality elements • Improved vitrification technique by reducing the number of swine oocytes on

droplets and quality detection based on the aspect of the droplets when temperatures drop.

• Defining the 45% ethylene glycol concentration and 40 seconds equilibration time as the optimal parameters for immature swine oocytes successfully vitrification by the SOPS and SSV methods.

• Establish the optimal of concentrations of 35%, 40%, 45%, 50% ethylene glycol and equilibration times of 30, 40.50 and 60 seconds to maintain the morphological integrity and viability of SOPS and SSV vitrified immature swine oocytes.

• Specification of exposure time influence, for each concentration of ethylene glycol in the vitrification media.

• Vitrification of the maturated swine oocytes with the best concentration and exposure time defined for immature oocytes vitrification.