Laborator ImunobiologieCitometrie in flux

Introducere

In cazul organsimelor superioare initierea si controlul raspunsului imun sunt rezulatatul

interactiunilor complexe dintre populatiile de limfocite T si B, si subpopulatiilor lor. Investigarea

functiilor fiecarei subpopulatii de limfocite, estimarea gravitatii dezechilibrelor imunologice in

cazurile patologice au devenit posibile incepand cu anii '70, odata cu perfectionarea tehnicilor de

laborator (citometrie de flux) ce permit decelarea unor markeri de membrana specifici,

caracteristici acestor populatii si subpopulatii, care le diferentiaza intre ele. Acesti markeri sunt

reprezentati prin receptorii de suprafata (dintre care cei mai specializati sunt receptoriii de

antigen) si molecule care mediaza raspunsul acestor celule la mitogeni. Printre tehnicile de

laborator care permit evidentierea tipurilor de limfocite se afla si citometria de flux.

Citometria de flux

Citometria de flux reprezintă o abordare tehnică nouă, de mare complexitate care pemite

determinarea simultană a mai multor parametri fizici şi chimici ai unei singure celule aflate în

mişcare într-un curent lichid. Parametrii măsuraţi inculd mărimea relativă a celulei,

granularitatea sau complexitatea internă şi intensitatea flourescenţei. Aceste caracteristici sunt

determinate folosind un sistem optic-electronic care înregistrează modul în care celula

dispersează lumina incidentă a laserului şi emite flourescenţa.

Un citometru de flux este compus din 3 sisteme principale: sistemul fluidic, sistemul

optic şi sistemul electronic.

Sistemul fluidic (hidraulic)

Rolul sistemului fluidic este de a transporta celulele în curentul lichid spre fasciculul

laser. Pentru o iluminare optimă curentul lichid care transportă particulele trebuie poziţionat în

centrul razei laser. Doar o singură celulă sau particulă trebuie să se deplaseze prin raza laser.

În acest scop proba este injectata într-un curent al unui fluid de înveliş (sheet fluid) in

camera de flux. Designul camerei de flux face că proba să fie concentrată în centrul fluidului de

înveliş pentru că apoi fasciculul laser să interacţioneze cu particulele ( James V.Watson., 2004).

Proba reprezentata de celule pe baza principiilor referitoare la fluxul laminar rămâne

separată de fluidul de inveliş. Fluidul de inveliş asigura migrarea celulelor şi le direcţionează

spre centrul curentului (fig. 1).

Împrăştierea luminii.

Împrăştierea luminii se produce atunci când o particulă (celula) determina dispersia

(imprastierea) razei laser incidentă. Măsura în care acest lucru se întamplă depinde de

proprietăţile fizice ale particulei, în special de mărimea şi de complexitatea internă a acesteia.

Factorii care afectează împrăştierea luminii sunt: membrana celulară, nucleul, şi orice material

granular din interiorul celulei. Forma celulei şi topografia suprafeţei acesteia contribuie de

asemenea la dispersia luminii.

Lumina dispersată înainte (Forward scatter light - FSC)

Lumina dispersată înainte este proporţională cu suprafaţa şi mărimea celulei. FSC măsoară

lumina difractată şi este detectată în cea mai mare parte pe axa incidentă a razei laser în direcţia

înainte de o fotodiodă. FSC este o metodă potrivită de detectare a particulelor mai mari

independent de flourescenţa lor şi prin urmare este adesea folosită în imunofenotipare pentru a

declanşa semnalul de prelucrare.

 

Lumina dispersată lateral (Side-scatter light - SSC)

Este proporţională cu granularitatea celulei sau complexitatea internă. SSC reprezintă în cea mai

mare parte o măsura a luminii reflectate şi refractate ce apare la orice interfaţa a celulei unde

există o schimbare în indexul de refractie. SSC este colectată la aproximativ 90 de grade fata de

raza laser incidenta si redirecţionata prin intermediul unui separator de fascicule spre un detector

adecvat (fig.2 ).

Fig.2 . Modalitati de dispersie a a luminii

Corelarea măsurătorilor realizate prin FSC şi SSC permite diferenţierea tipurilor celulare dintr-o

populaţie celulară heterogenă. Subpopulaţii majore leucocitare pot fi diferenţiate folosind FSC şi

SSC ( fig.3 ).

Fig.3 Distributia in dot plot a subpopulatiilor bazate pe masuratorile FSC şi SSC

Fluorescenţa

Un compus flourescent absoarbe energia luminoasă într-un spectru de lungimi de undă

caracteristic compusului respectiv. Absorţia luminii determina o stare de excitatie energetica a

compusului flourescent. Aceasta stare de incarcare energetica este instabila si ca urmare

compusul respectiv revine rapid la starea anterioară emiţând excesul de energie (emisie de fotoni

intr-o anumit spectru de unde). Tranziţia energetică este denumită flourescenţă. Laserul cu argon

este folosit în mod curent deoarece lumina pe care o emite (având o lungime de undă de 488nm)

exicită mai mult multi flourocromi.

Unul dintre aceşti flourocromi este izotiociantul de flourescină (FITC). În spectrul de

absorbţie al FITC lungimea de undă 488 nm este aproape de maximul de absorbţie al FITC.

Excitaţiile la această lungime de undă vor determina o emisie inaltă a FITC. Dacă flourocromul

ar fi fost excitat de o altă lungime de undă din spectrului său de absorbitie, radiaţiile emise nu ar

avea aceeaşi intensitate.

Pot fi folosiţi simultan mai mulţi flourocromi dacă fiecare este excitat la o lungime de undă

de 488 nm şi dacă peak-urile lungimilor de unde emise nu sunt foarte de apropiate unele de altele

(un ex este combinaţia FITC cu ficoeritrina (PE)). Cu toate că maximul de absorbţie al PE nu

este la 488 nm, flourocromul este excitat suficient pentru a produce o emisie flourescentă pentru

detecţie. Mai important peak-ul lungimii de undă emise de FITC este 530 nm, şi 570 nm pentru

PE. Aceste valori sunt suficient de îndepărtate astfel încât fiecare semnal să poată fi detectat de

detectoare separate. Cantitatea de semnal flourescent detectat este proporţională cu numărul de

molecule de flourocrom de pe fiecare particulă. (fig 4,fig 5).

Fig.4 Spectrele de absorbtie ale unor flourocromi comuni( FITC, PE, PerCP, APC)

Fig.5 Spectrele de emisie ale flourocromilor FITC, PE, PerCP, APC

Dacă un colorant flourescent este conjugat cu un anticorp monoclonal acesta poate fi folosit

pentru a identifica un anumit tip celular bazat pe markerii antigenici de suprafaţă ai fiecărei

celule. ( D. Porro. 1993 )

Într-o populaţie heterogenă de celule, diferiţi flourocromi pot fi folosiţi pentru a distinge

populaţiile separate. Modelul de colorare al fiecărei populaţii combinat cu datele obţinute din

analiza FSC şi SSC pot fi folosite pentru a identifica celulele prezente în probă şi pentru a le

determina procentajul relativ. De asemenea celulele pot fi sortate.

Fig.6 Legare specifica flourocrom-anticorp pe suprafata antigenului

Sistemul optic

Sistemul optic constă în sistemul excitare (reprezentat de laser) şi sisteme optice reprezentate de

lentile care preiau lumina emisă de interacţiunea dintre particulă şi raza laser şi oglinzi şi filtre

optice specifice pentru fiecare lungime de undă a luminii colectate. Lentile au rolul de a forma şi

concentra raza laser.

Fig.7 Reprezentarea schematica a flowcitometrului

Sistemul electronic

Semnalele luminoase sunt generate pe măsură ce particula trece prin raza laser.

Semnalele luminoase sunt convertite în semnale electronice de către fotodetector.

Există două tipuri de fotodetectori BD în flowcitomeru: fotodiode şi tuburi

fotomultiplicatoare. Fotodioda este mai puţin sensibilă la semnalele luminoase decât PMT şi prin

urmare este folosită pentru a detecta semmalele puternice FSC. PMT sunt utilizate pentru a decta

semnalele mai slabe generate de SSC şi flourescenta.

Un puseu de tensiune se creează când particula intra în raza de laser şi începe să distribuie

lumina şi flourescenta. Odată ce semnalele luminoase sau fotonii se lovesc de o parte a PMT sau

de fotodiodă sunt convertite într-un număr proporţional de electroni care sunt multiplicaţi creind

un curent electric mai intens. Curentul electric trece prin amplificator şi este convertit într-un

puls de tensiune. Cel mai înalt punct al pulsului de tensiune are loc când particula este în centrul

razei laser şi valoarea maximă de dispersie şi flourescenţa este atinsă. Pe măsură ce particula

părăşete fasciculul, tensiunea revine la normal (fig 8).

Fig.8. Generarea puseului de tensiune la trecerea celulei bacteriene prin faţa razei laser

Dimensiunea puseului de tensiune depinde de numărul de fotoni detectaţi, voltajul PMT

creşte. Semnalele pot fi amplificate aplicând o tensiune PMT creind un curent electric mai mare.

Puseului de tensiune i se atribuie o valoare digitală prin intermediul Convertorului

Analog-to-Digital. ADC transformă un puls cuprins între 0-1,000mV într-un număr digital

reprezentând numărul canalelor cuprinse între 0-1,000mV. Semnalul luminos este apoi afişat în

poziţia corespunzătoare pe histogramă.

Analiza datelor: colectarea şi afişarea

Odată ce datele au fost salvate, populaţia celulară poate fi afişata în cateva formate diferite. Un

singur parametru cum este FSC sau FITC (FL 1) poate fi afişat sub forma unei histograme cu un

singur parametru, unde axa orizontală reprezintă semnalul parametrului şi axa verticală

reprezintă numărul de evenimente. Fiecare eveniment este plasat în canalul corespunzător valorii

semnalului. Semnalele cu aceeaşi intenstate se acumulează în acelaşi canal.

Doi parametri pot fi afişati simultan în grafic. Un parametru este afişat pe axa X, şi celalalt

pe axa Y. Datele tridimensionale pot fi de asemenea vizualizate, astfel axele X şi Y reprezintă

parametrii iar axa Z afiseaza numărul de evenimente pe canal (fig 9).

Fig.9 Reprezentare grafica a datelor

Un principiu important în flowcitometrie este capacitatea de a analiza selectiv celule de

interes eliminand datele nedorite cum ar fi celule moarte sau resturile celulare. Această

procedură se numeşte distribuţie pe porţi. În mod normal celulele au fost sortate în funcţie de

caracteristicile fiziologice. De exemplu resturile celulare pot fi diferenţiate de celule unice prin

mărime (estimate prin intermediul parametrului forward scatter). În acelaşi timp celulele moarte

au un grad de dispersie a luminii în faţa, mai mic şi un grad de dispersie în lateral mai mare

decât al celulelor vii.

Pe histogramă, fiecare punct reprezintă o singură celulă care a trecut prin raza laser.

Punctele rosii/galbene reprezintă un număr mare de evenimete dintr-o populaţie celulară.

Culorile dau impresia unui aspect 3D. Histogramele de contur reprezintă o altă modalitate pentru

a demonstra acelaşi lucru. Graficul se aseamănă în acest caz cu o harta geografică care, în

principiu este foarte asemănătoare cu histograma density plot. Uneori populatiile celulare

discrete sunt mai uşor de vizualizat prin intermediul histogramelor contur.( H. E. Steen. 1983)

Fig.10 Utilizarea gateing pentru a selecta populatiile celulare

Strategiile noi de gating utilizează parametrii flourescenţi pe lângă cei de dispersie a

luminii. Sângele este folosit pentru a demonstra acest principiu.

Mai jos în stânga este reprezentată o histogramă FSC/SSC cu sânge uman lizat. Limfocitele,

monocitele, granulocitele au fost selectate în regiunile: regiunea 1 (R1), regiunea 2 (R2 ),

respectiv regiunea 3 (R3) ( prin regiune se inţelege aria desemnată pe histogramă pentru a afişa

datele.) În partea dreaptă aceeleaşi celule sunt analizate dar utilizând parametrul SSC reprezentat

pe axa Y şi markerul flourescent CD45 pe axa X. CD45 este un marker exprimat numai pe

leucocie, lipsind pe celulele sangvine. În termeni relativi limfocitele au un nivel mic al SSC şi

mare înalt al parametrului CD45 (R4), granulocitele au un nivel înalt al parametrului SSC şi

scazut al parametrului CD45 (R6) în timp ce monocitele sunt situate undeva la mijloc între cei

doi paramteri. Cea mai mare diferenta între limfocitele din R1 şi cele din R4 este absenţa

celulelor rosii facând preparatul mult mai pur (fig 11).

Fig.11 Utilizarea gateing pentru a evidentia populatiile sangvine

Limfocitele din punct de vedere al functiilor indeplinite si al receptorilor de suprafata se clasifica in:

Limfocite T (CD3+)

- limfocite T helper (CD4+) - limfocite T citotoxic CD8+- limfocte B (CD 19+)- celule natural killer (NK) (CD3-, CD16/56+)

Marcarea directa a celulelor

Acesta metoda este aplicabila in cazul in care fluorocromul este direct legat de anticorpul primar adica conjugatelor PE, FITC and Alexa Fluor®

1. Sangele periferic se recolteaza pe anticoagulant (EDTA sau heparina);2. Un volum de 100 µl se pipeteaza in tuburile de testat;3. Se adauga anticorpii la dilutiile recomandate (specificatiile tehnice ale

reactivilor respectivi) ; omogenizare si incubare la temperatura camerei timp de 30 de minute ;

4. Se spala celulele cu 2 ml PBS, se centrifugheaza la 400 g pentru 5 minute si se elimina supernatantul ;

5. Se adauga 2 ml tampon de liza proaspat preparat ; se incubeaza 10 minute la temperatura camerei ; se centrifugheaza la 400 g pentru 5 minute si se indeparteaza supernatantul;

6. Celulele se resuspenda in 0.2 ml de PBS7. Se achizitioneaza datele la citometru de flux