3. TEHNICI DE STERILIZARE A OBIECTELOR N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIEDistrugerea microorganismelor sau sterilizarea este indispensabil pentru pregtirea materialului de lucru i a mediilor de cultur.Sterilizarea reprezint operaia de distrugere sau ndeprtarea tuturor formelor vegetative i de rezisten a microorganismelor patogene i apatogene.Un produs este considerat steril cnd nu mai conine forme de microorganisme ce pot fi revitalizate. Exist mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri de materiale ce trebuie tratate. Metode de realizare a sterilizrii:a) cu aer cald (140-200 oC);b) cu vapori sub presiune (120-140 oC);c) prin nclziri repetate (70-100 oC);d) filtrare prin materiale poroase;e) utilizarea radiaiilor (UV, IR, raze X, raze gamma, etc.)f) utilizarea agenilor chimici (oxid de etilen, formaldehid, etc.)g) preparare pe cale aseptic.Produsele sterilizate nu trebuie s conin microorganisme vii sub form vegetativ sau sporulent capabile s se dezvolte n condiii adecvate. Metoda de sterilizare se alege n funcie de proprietile fizico-chimice ale produsului supus sterilizrii evitndu-se eventualele modificri din punct de vedere al calitii acestuia.Metodele a)-c) sunt metode termice i se pot realiza prin nclzire uscat (a) i nclzire umed (b-c). Ultima variant este destul de eficient deoarece aburul i apa cald acioneaz prin hidratare cu coagularea i hidroliza proteinei bacteriene.Sterilizarea prin metoda d) se utilizeaz frecvent n cazul produselor termolabile i cnd cheltuielile prin (a-c) sunt foarte mari; se utilizeaz filtre (plci) poroase, Jena G5, de azbest-celuloz; cu membran.Sterilizarea prin e) dei prezint unele dezavantaje este aplicat tot mai mult n special pentru aerul din boxe sterile.Sterilizarea prin f) se aplic produselor termolabile la rece cu etilenoxid, formaldehid, fenol, etc. Se poate utiliza combinaia a)-c) i adugare de substane chimice ca: aldehid formic, ap oxigenat, acid 5-nitrofenilacrilic. Prepararea pe cale aseptic se folosete atunci cnd nu este posibila sterilizarea prin a)-e), realizndu-se n boxe sterile n care aerul din acestea se sterilizeaz prin d)-f).n laboratorul de microbiologie de analize de rutin, cldura reprezint modalitatea de sterilizare cea mai ntrebuinat.

STERILIZAREA PRIN CLDUR

Cldura umed. Sterilizarea prin cldur umed se efectueaz n autoclavul cu aburi prin procedeul de autoclavare.Principiu: n atmosfera de vapori de ap sub presiune, toate bacteriile (inclusiv formele sporulate) sunt omorte dup 20 minute la 1210C. Aceasta este metoda cea mai eficient de sterilizare.Autoclavul permite:- pregtirea materialului (medii de cultur, diferite obiecte) n vederea utilizrii n laborator, prin distrugerea microorganismelor;- decontaminarea materialelor dup folosirea n laborator (cel puin 30 minute la 1210C). Microorganismele din produsele patologice, eantioanele de ap i produse alimentare analizate, din culturile microbiene de laborator etc., trebuie neaprat distruse.Aceste dou operaii ar trebui efectuate de preferin n dou autoclave diferite sau, cel puin, n mod separat.Duratele de sterilizare sunt date doar pentru obiecte, medii de cultur sau alte substane ce trebuie sterilizate n autoclav pentru analizele de rutin.

Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat adesea cu ajutorul unor indicatori de sterilizare cum sunt hrtiile indicatoare: sunt comercializate benzi de hrtie special imprimate pentru a vira culoarea dac au fost ndeplinite condiiile de sterilizare.PasteurizareaSterilizarea trebuie s fie deosebit de pasteurizare, care reprezint doar un procedeu de conservare utilizat n industria alimentar. Pasteurizarea const n tratarea produsului la o temperatur n domeniul 56 0C 85 0C, o durat variabil de la cteva minute pn la o or, n mediu umed, n funcie de produs. n aceste condiii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse, dar nu i formele sporulate.TyndalizareaTyndalizarea const n 2 - 3 pasteurizri repetate, alternate cu perioade n care proba este meninut n condiii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni, care devin vulnerabili trecnd n stare vegetativ i sunt distrui prin pasteurizare. Tyndalizearea se poate realiza n baie de ap, de exemplu, n urmtoarele condiii: nclzire la 56 0C (pn la 80 0C) timp de 1 or, 3 - 7 zile consecutiv, cu un interval de 24 de ore.Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor n mediile ce conin substane termolabile. Cldura uscat Sterilizarea prin cldur uscat se efectueaz n sterilizatoarele cu aer cald (etuv).Cldura uscat nu poate distruge bacteriile i n special sporii bacterieni, dect la o temperatur mai ridicat ca n cazul cldurii umede. Tratamentul pentru sterilizare cu cldur uscat este de 4 ore la 140 0C sau 1 or la 180 0C.Un alt procedeu de sterilizare prin cldur uscat este flambarea, care se efectueaz n flacra becului de gaz pentru: extremitatea firului ansei, exteriorul pipetelor, gtul eprubetelor i al flacoanelor.

ALTE PROCEDEE DE STERILIZARE

Sterilizarea prin filtrare Filtrarea const n trecerea unui produs lichid printr-un perete poros sau o membran care reine bacteriile. Se pot utiliza filtre de porelan (Chamberland), de sticl poroas sau membrane tip Millipore, cu pori de diferite dimensiuni.

Sterilizarea prin gaze toxice Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea materialului medico-chirurgical, a materialelor din plastic numite sterile, de unic folosin din industrie.Sterilizarea cu ajutorul radiaiilorRadiaiile ultraviolete - sunt radiaii cu utilizare curent n laboratorul de microbiologie; ele sunt bactericide, dar nu distrug sporii bacterieni. Acest tip de radiaii acioneaz n mod direct i au putere de penetraie sczut (civa milimetri). Lmpile germicide al cror efect se bazeaz pe aciunea radiaiilor UV cu lungimea de und de 254 nm sunt utilizate :- pentru sterilizarea apei- pentru sterilizarea incintelor i a aerului ambiantRadiaiile gammaRadiaiile gamma fac parte din categoria radiaiilor ionizante i au un efect puternic microbicid. Sunt dificil de produs i de utilizat i foarte periculoase datorit efectelor pe care le au asupra materiei vii.Acest tip de radiaii poate fi utilizat n sterilizarea materialului medical i microbiologic de folosin unic sau pentru sterilizarea unor deeuri.3.1. PREGTIREA I STERILIZAREA STICLRIEI N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIEPregtirea i sterilizarea materialului n vederea utilizrii n laboratorul de microbiologie este o operaie deosebit de important deoarece exactitatea rezultatelor precum i reuita desfurrii proceselor microbiologice depind n mare msur de rigurozitatea cu care se efectueaz.Principalele operaii de pregtire a sticlriei de laborator sunt:- splarea- uscarea- executarea dopurilor i ambalareaRecipientele pot fi pregtite cu dop din vat hidrofob pentru a nu pstra umezeala dup autoclavare. Din ce n ce mai folosite sunt dopurile din celuloz comprimat (comercializate), sterilizabile pan la 200 0C. Pentru nlocuirea eprubetelor cu dop de vat, n scopul pstrrii optime a culturilor, se pot utiliza tuburi prevzute cu capsule care se monteaz prin nurubare.Pentru evitarea contaminrii mediilor de cultur utilizate n analiza microbiologic sau n obinerea culturilor microbiologice, sticlria de laborator trebuie ambalat i sterilizat corespunztor. Sterilizarea se efectueaz la etuv (sau pupinel), iar materialele supuse acestei operaii trebuie s fie curate i mpachetate n hrtie sau aezate n conteinere metalice nchise. Sterilizarea uscat se poate aplica pentru articole din sticl (plci Petri, baloane, pipete, eprubete), obiecte din porelan, instrumentar metalic fr suduri n cositor, pulberi uscate etc. Aerul fiind slab conductor de cldur, sterilizatorul trebuie s uniformizeze temperatura i s asigure ptrunderea aerului fierbinte n obiectele de sterilizat. n calcularea timpului de sterilizare uscat trebuie avute n vedere urmtoarele etape: perioada de nclzire la temperatura de sterilizare, socotit n general o or; perioada de meninere a temperaturii de sterilizare; perioada de rcire n care scderea temperaturii trebuie realizat treptat pentru evitarea spargerii obiectelor de sticl prin oc termic, aproximativ 2 ore.

n practic se procedeaz la alegerea unei temperaturi de sterilizare de 180 oC i a unei durate de o or. Din exces de pruden se practic sterilizri la temperaturi mai ridicate sau de durate mai mari. n unele cazuri aceast practic este duntoare deoarece, de exemplu, vata ordinar - la durate i temperaturi mari de sterilizare uscat - elibereaz gudroane ce pot inhiba creterea microbian. Materiale utilizate:- pipete;- plci Petri;- eprubete;- flacoane Erlenmayer;- vat hidrofob;- tifon;- hrtie ambalaj i etuv.Mod de lucru:Se execut dopuri de vat hidrofob pentru eprubete, astfel nct s poat fi extrase uor n timpul inoculrii, iar densitatea materialului s asigure sterilitatea. Eprubetele se introduc n coul de srm i se acoper cu hrtie. Pipetele se astup la partea opus vrfului, cu un dop subire de vat care s rein microorganismele ce ar putea ptrunde n pipet pe la partea superioar. Pipetele se ambaleaz ntr-o fie de hrtie care se rsucete n jurul tubului de sticl, ncepnd de la vrf. Plcile Petri se ambaleaz n hrtie de ambalaj, n funcie de numrul necesar. Flacoanele Erlenmayer pentru medii de cultur se astup cu dop de vat nfurat n tifon. Toat sticlria se sterilizeaz 1 or la 180 oC la etuv, timp socotit din momentul atingerii temperaturii. Dup aceast perioad etuva se oprete i se ateapt rcirea materialului.4. EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELORStudiul morfologiei microbiene nu poate fi conceput fr utilizarea microscopului; examenul microscopic joac un rol important n studiul i identificarea germenilor, precum i n determinarea numrului acestora.Microscopul (grec. mikrs: mic; skopein: a observa) este un instrument optic care mrete imaginea unui obiect observat printr-un sistem de lentile.

MICROSCOPUL OPTICMicroscopul optic se compune dintr-un stativ pe care sunt montate un sistem de transmisie optic, o platin port-obiect i un sistem de iluminare.Sistemul de transmisie optic

Ocularele au puterea de mrire de 5x, 7x, 10x, 15x, 20x i chiar 30x. n lucrrile curente cele mai des folosite sunt cele 7x i 10x. Ocularele au rolul de a mri imaginea preparatului, dar i de a aplatiza i lumina cmpul optic.Obiectivele reprezint un sistem optic bine centrat, constituit din una sau mai multe lentile destinate a forma o imagine real a obiectului. Puterea lor de mrire este invers proporional cu distana focal, adic cu distana dintre obiect i lentila pe care se formeaz imaginea. Calitatea esenial a obiectivelor este puterea lor de rezoluie. Aceasta la rndul ei depinde de mrimea deschiderii unghiului pe care l face conul de raze care intr n lentil precum i de indicele de refracie al mediului dintre obiect i lentil. Obiectivele sunt fixate prin nurubare pe un revolver port-obiectiv care permite selecionarea rapid a unuia din ele, prin simpla rotire. Gama de obiective necesare n microbiologie se compune din trei obiective cu puterea de mrire de 10x, 20x, 40x i un obiectiv cu imersie cu grosismentul 90x. Acest obiectiv se folosete n cazul n care obiectul ce trebuie examinat este mai mic sau dac este necesar a se observa amnunte foarte fine. La obiectivul cu imersie este necesar a se interpune ntre obiect i lentila frontal a obiectivului un lichid transparent (ulei de cedru, ulei de parafin, balsam de Canada etc.).

100 mdomeniul microscopiei optice celule epiteliale 10 m globule roii din snge bacterii tipice 1m domeniul microscopiei micoplasme electronice 100 nm virusuri

10 nm (100) proteine

1 nm (10) aminoacizi

atomi 0,1 nm (1)Figura 1. Domeniile microscopiei optice i electroniceSistemul de iluminare se compune din surs luminoas i dintr-un condensator.Condensatorul este o pies care se gsete imediat sub platina microscopului i care are rolul nu att de a strnge (condensa) razele luminoase venite de la sursa de lumin, ct de a mri seciunea conului de lumin pentru o mai bun claritate a imaginii.Sistemul de reglare Deplasarea platinei port-obiect sau a sistemului optic se efectueaz cu ajutorul unei cremaliere, prin intermediul a dou butoane: unul mare care d o micare ampl i rapid (viza macrometric) i altul mic, pentru reglajul fin ( viza micrometric).Modul de utilizare a microscopuluiPreparatul este plasat pe platina microscopului, avnd grij s fie bine fixat n dispozitivul de prindere. Este selectat obiectivul; n general, un examen debuteaz cu utilizarea obiectivului cel mai mic. n practic, se utilizeaz obiectivul 10x, apoi 20x pentru un preparat necunoscut sau pentru drojdii i mucegaiuri i obiectivul 40x pentru bacterii. Se regleaz distana lentilei obiectivului fa de preparat prin micarea vizei macrometrice i a celei micrometrice. (Obiectivele au o distan de reglare care descrete cu puterea lor). Cutarea imaginii este apoi efectuat prin manevrarea butonului care acioneaz cremaliera, iar dup fixarea imaginii se face o nou reglare a acesteia. Curarea sistemului optic se efectueaz regulat cu xylol i nu cu alcool etilic.Reglarea intensitii luminii condensatorului se face innd seama de puterea de mrire a obiectivelor; cu ct aceasta este mai mare, cu att poziia condensatorului este mai ridicat.5. PREPARAREA I STERILIZAREA MEDIILOR DE CULTUR Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie s asigure microorganismelor cantitatea necesar de ap, sursa de carbon, de azot, sruri minerale, factori de cretere, deci care s le furnizeze substanele i energia necesare n procesele de cretere, reproducere i ntreinerea funciilor vitale.Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: s corespund din punct de vedere nutritiv, s aib o concentraie a substanelor dizolvate care s nu influeneze negativ schimburile osmotice ale celulei s nu conin substane toxice s aib un anumit pH s fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel nct s se dezvolte numai celulele introduse prin inocul.Sterilizarea mediilor de cultur se poate realiza prin metode fluido-dinamice (filtrare, flotaie, centrifugare, termice, chimice i fizice (unde electroamgnetice)).Cea mai utilizat metod de sterilizare este sterilizarea cu abur pentru c este uor de realizat i permite obinerea unui nalt grad de sterilitate. Inconvenientele procedeului sunt generate de reaciile secundare pe care le sufer componentele mediului de cultur (hidrai de carbon, aminoacizi, proteine) n timpul sterilizrii i anume:a) denaturarea proteinelor i inactivarea enzimaticb) degradarea parial a vitaminelor i a anumii factori de creterec) supranclzirile pot iniia reacii de oxidare a fenolilor i a acidului ascorbic, de polimerizare a aldehidelor nesaturate, de caramelizare a hidrailor de carbon, brumificarea mediului sau de condensare a gruprilor aldehidice din zaharuri reductoare cu grupele aminice libere din aminoacizi sau proteine.Produii rezultai n urma reaciilor secundare sunt toxici pentru majoritatea microorganismelor i trebuie ca formarea lor s fie evitat n timpul sterilizrii. Din acest motiv se recomand sterilizarea separat a hidrailor de carbon i a compuilor cu azot i amestecarea ulterioar a lor.Mediile de cultur se folosesc n practica de laborator sau n practica industrial i sunt foarte difereniate n funcie de scopul urmrit. n tehnica de laborator mediile se folosesc pentru izolarea din mediul natural a diferitelor microorganisme, pentru obinerea de culturi pure, pentru ntreinerea culturilor selecionate. n scopuri industriale, mediile de cultur sunt utilizate pentru obinere de biomas sau a unor compui de natur microbian.Cerinele nutriionale ale celulelor de cultur depind de metabolismul lor. Una din ideile de baz ale logicii viului general valabil pe Pmnt este c biochimia tuturor entitilor vii are la baz chimia carbonului.Nutrienii ce constituie mediul de cultur sunt cunoscui sub denumirea consacrat de substrate. Dup aportul n constituieni celulari se numesc i surse de: C, H, N, O, P, microelemente i altele. Evident c un substrat poate fi concomitent sursa de C i N i similar.n ceea ce privete microorganismele, majoritatea celor cu aplicaii industriale obin carbonul celular din compui organici (de unde denumirea de heterotrofe). Pe lng rolul lui esenial de constituent major al materialului celular, carbonul din compuii organici este folosit i ca surs de energie.Ca surs de material celular, carbonul formeaz cca 50% din masa celular uscat a bacteriilor i fungilor. Domeniul compuilor organici cu carbon care pot fi utilizai este vast, iar versatilitatea lumii microbilor se manifest prin faptul c toi compuii cu carbon sintetizai sunt la rndul lor biodegradabili. Zaharurile i n mod special glucoza sunt sursele de carbon i energie cele mai folosite n mediile de cultur ale microorganismelor, dar n funcie de necesitile nutriionale speciale ale altor celule se mai folosesc derivai de zaharuri, alcooli, acizi grai, acizi organici, hidrocarburi i compui organici cu azot.La rndul su azotul reprezint 8-14% din masa molecular uscat a bacteriilor i fungilor. Majoritatea microorganismelor pot utiliza n primul rnd ionul de amoniu (NH4+) ca surs de N. De aceea n majoritatea mediilor de cultur de laborator sau industriale se folosesc sruri de amoniu ca surs de N. n funcie de nevoile metabolice existente mai pot fi folosite ca surse de N nitraii (dei se acumuleaz adesea nitrai toxici) uneori chiar N gazos sau produi organici cu azot (proteine sau peptide). De obicei mediile de cultur conin o sare de amoniu ca surs de N anorganic i un derivat industrial cu coninut de N organic. Sursele de N organic (derivat de soia, extract de drojdie, extract de porumb, snge uscat, extract de semine de bumbac, fracii solubile de la distilarea alcoolului i altele) aduc i un aport suplimentar n mediul de cultur de factori de cretere, ce vor fi prezentai ulterior.Sursa de H, este de obicei concomitent cu sursa de C n produsele organice. Sunt foarte rare cazurile de folosire a H gazos.Oxigenul este prezent i el n toi compuii organici celulari i apa celular. El este obinut din majoritatea compuilor organici ai mediului de cultur, dar n cazul metabolismului aerob este absolut necesar oxigenul din aer.Prezena P este esenial pentru creterea culturii i pentru o serie de alte procese metabolice, sursa consacrat fiind constituit de fosfai i uneori de unii derivai organici.S se obine de obicei din sulfai, iar K (principalul cation al celulei) este introdus de asemenea sub forma de sulfai sau de fosfai. Sursa important de Mg este sulfatul respectiv.n mediul de cultur se introduc adesea microelemente, soluii de sruri minerale care conin ionii metalici de care au nevoie metaloenzimele din celul. Concentraiile acestor sruri sunt extrem de reduse n mediu. n funcie de cerinele unor microorganisme se mai introduc vitamine i uneori aminoacizi.Odat stabilit formula mediului de cultur n funcie de cerinele nutriionale ale celulelor, urmtoarea etap este prepararea acestuia. Este numai aparent o operaie simpl, pentru c cere totui elaborarea unei proceduri dedicate, astfel ca fiecare cantitate de mediu preparat s fie identic cu celelalte, deci asigurarea unui nalt grad de reproductibilitate a compoziiei. Aceasta nseamn c trebuie urmrite cu atenie condiiile de conservare i manipulare a componentelor la temperaturi i umiditate controlate. n special n cazul mediilor pentru instalaia industrial, protocoalele de lucru trebuie s conin instruciuni ct mai clare, astfel nct s se evite producerea unor reacii nedorite ntre componentele mediului, cnd ingredientele sunt introduse ntr-o ordine greit (se poate ajunge la precipitarea unor componente, care odat scoase din soluie nu mai sunt accesibile celulelor de cultur, sau la eliminarea unor componente volatile, de exemplu amoniacul; se poate realiza complexarea unor sruri sau reacii de condensare ntre componentele organice, mai ales n timpul sterilizrii mediului).Este important ca mediul s fie suficient agitat n timpul preparrii, astfel nct s se solubilizeze toate componentele iar limitele de solubilitate ale substanelor s fie avute n vedere cu grij.Dup scopul utilizrii lor, mediile de cultur se mpart n: medii de cultur generale care asigur dezvoltarea unui mare numr de specii medii de cultur selective care permit dezvoltarea unui numr restrns de microorganisme medii de cultur de difereniere care permit separarea speciilor n funcie de anumite caractere biochimice medii de mbogire destinate separrii i cultivrii unor microorganisme pretenioase din punct de vedere nutritiv sau care se afl n numr redus medii de conservare medii de cultur industriale Din punct de vedere al compoziiei chimice, mediile de cultur se mpart n 3 categorii: medii naturale (empirice) de origine animal sau vegetal, cu o compoziie chimic nedefinit n mod exact; medii sintetice: acestea sunt soluii de substane chimice pure n ap distilat, cu o compoziie perfect determinat; medii semi-sintetice: sunt constituite din produse chimice bine definite, dar i din produse de origine natural (cu compoziie cunoscut).Constituenii principali ai mediilor de cultur sunt:1. Extracte de carne i macerateAceste produse, comercializate n form concentrat sub denumirea de extracte de carne, conin n principal proteine puin hidrolizate, glucide, sruri minerale, vitamine hidrosolubile. Compoziia lor variaz n funcie de carnea utilizat pentru preparare.2. Extracte de drojdieAceste extracte, comercializate sub form deshidratat, sunt preparate din drojdia de bere, fiind utilizate ca surs de aminoacizi i de vitamine hidrosolubile (vitamine din complexul B).3. Peptone i hidrolizatePeptonele reprezint un amestec de compui solubili n ap care provin n urma aciunii enzimelor asupra materialului proteic. Pot fi: pepton pepsic din carne, pepton tripsic din cazein (cu coninut crescut n triptofan), pepton pancreatic de cazein, pepton tripsic de carne, pepton papainic de soia, peptone compuse.Hidrolizatele sunt peptone obinute n urma aciunii compuilor anorganici asupra proteinelor (acid clorhidric de ex.). Cel mai des ntrebuinat este hidrolizatul acid de cazein, coninnd aminoacizii constitutivi ai cazeinei din lapte.4. Agar-agarul sau gelozaAgar-agarul denumit i geloz este un extract de alge roii (Rhodophyceae) din genul Gelidium i Gracilaria, recoltate n mrile Japoniei sau ale Noii Zeelande. Se dizolv n ap la o temperatur n jur de 900C i se solidific sub 450C, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de cultur. Nu este degradat de microorganismele obinuite. Este comercializat n forma sa iniial deshidratat, numit agar fibre (foarte impur), sub form de paiete (mai puin impur), sau sub form de pulbere.Numeroase firme sunt specializate n producerea i comercializarea mediilor de cultur de laborator (firma Difco, Merck, Biokar, Oxoid).Mediile fermentative sunt medii de cultur industriale destinate producerii unor cantiti mari de celule sau produi de metabolism. n compoziia acestor medii intr ca surse de carbon: melasa, produs secundar rezultat la fabricarea zahrului i care conine 45 - 55% zaharoz, diferite tipuri de finuri, cereale boabe, zer bogat n lactoz, tre etc. Dintre sursele de azot cel mai des folosite sunt: finurile proteice de soia, sulfatul de amoniu, ureea, ngrmntul complex. Ca sruri minerale se adaug fosfai, sulfai, cloruri etc. Pentru cultivarea microorganismelor care necesit factori de cretere, se adaug extract de porumb (obinut prin concentrarea apelor rezultate la nmuierea porumbului, bogat in aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelemente), extract de drojdie, extract din radicele de mal i germeni de gru i porumb. 5.1. PREPARAREA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU NTREINEREA BACTERIILOR, DROJDIILOR I MUCEGAIURILORMateriale utilizate:- balan cu precizie de 0,1 g;- pahare Berzelius;- sit azbest;- agar nutritiv pulbere;- mediu de cultur extract de mal - agar pulbere;- mediu extract de cartof-dextroz-agar pulbere;- eprubete cu dop, sterile;- pipete de 10 mL;- flacoane Erlenmayer;- bec de gaz;- autoclav cu gaze.Mod de lucru:Conform indicaiilor de pe flacoanele coninnd mediile de cultur pulverulente, se vor cntri cantitile necesare pentru a obine cte 1 litru din fiecare tip de mediu de cultur pentru eprubete i cte 300 mL mediu pentru baloanele Erlenmayer. n cazul n care nu exist medii deshidratate, procurate de la firme specializate, mediile se vor prepara prin cntrirea componentelor pentru volumul final dorit.Mediul de cultur se aduce la fierbere n paharele Berzelius de 1 L, pn la completa dizolvare a agarului, apoi se repartizeaz cte 10 mL n eprubete sterile, prevzute cu dop de vat, care se aeaz n couri de srm i se acoper cu hrtie. n mediu se determin pH-ul i, dac este necesar, se ajusteaz la valoarea dorit. Mediile cu agar nu trebuie s fie aduse la un pH mai mic de 6, deoarece agarul este parial hidrolizat n timpul sterilizrii la pH acid i nu se mai solidific la rcire. Cnd sunt necesare astfel de medii, pH-ul trebuie ajustat dup sterilizare.Baloanele Erlenmayer se astup cu dop de vat nvelit n tifon, se leag la gur cu hrtie i sfoar. Courile i baloanele Erlenmayer se introduc n autoclavul cu gaze, iar sterilizarea se face conform instruciunilor afiate lng aparat.Se nchide capacul autoclavului, se verific nivelul apei n vasul de nivel, se aprinde gazul i se ateapt apariia jetului de abur viu care este eliminat prin purj. Dup 10-15 minute de purjare se nchide robinetul purjei, iar presiunea indicat de manometru va urca pn la valoarea 1, unde va fi meninut timp de 20 min. prin micorarea flcrii.ntre presiune i temperatura din autoclav exist o corelaie, aa cum se prezint n tabelul urmtor:

Tabel 3. Corelaie ntre presiunea i temperatura din autoclav Temperatura, oCPresiunea, kg/m3Presiunea, atm

1000,000,00

1050,200,20

1100,430,42

1120,550,50

1150,690,67

1200,990,96

1211,001,00

1221,331,29

1281,551,50

1301,721,65

1352,162,09

1402,652,56

Dup acest interval se oprete gazul, se ateapt scderea presiunii pe manometru, se deschide purja i dup 5 minute se poate deschide capacul autoclavei.n general, mediile de cultur trebuie s ofere o suprafa de dezvoltare suficient pentru microorganisme. De aceea , dup sterilizare tuburile cu mediu se nclin pentru ca s rmn cu o suprafa mare de cretere. nclinarea se face prin sprijinirea eprubetelor pe o baghet suficient de groas, innd seama ca mediul negelificat s nu ude dopul de vat, ci s se opreasc la 2 - 3 cm de acesta. Prin rcire, vaporii ce ies din mediul cald, se condenseaz pe pereii mai reci ai eprubetelor i cad sub form de picturi pe mediu, adunndu-se pe fundul eprubetei. Din aceast cauz, eprubetele cu mediul rcit nu se aeaz n poziie orizontal, ci vertical, in couri de srm. Acestea se acoper apoi cu o hrtie i se leag cu sfoar.Pentru a nu prepara n fiecare zi medii, sau, dac este nevoie de mai multe feluri de medii n acelai timp, acestea se pregtesc o dat i apoi se depoziteaz pentru pstrare. Sticlele cu medii se eticheteaz, notndu-se tipul mediului i data preparrii. Pentru evitarea uscrii se recomand pstrarea mediilor nutritive n frigider.Sterilizarea mediului de cultur are ca scop ndeprtarea organismelor nedorite care pot avea un efect duntor asupra productivitii. Creterea rapid a contaminanilor poate reduce substanial concentraia nutrienilor disponibili pentru celulele de cultur. Dezvoltarea unor organisme strine poate conduce la consumul masiv al sursei de C i de N, al unor precursori eseniali, poate limita cantitatea de oxigen solubil n mediu disponibil n cazul bioproceselor aerobe, poate induce i alte modificri duntoare modificarea pH-ului, excreia de substane toxice. n aceste condiii se poate ajunge fie la inhibiia creterii celulelor de cultur fie la contaminarea i chiar descompunerea metabolitului de interes. Anumite mucegaiuri contaminante pot produce chiar importante creteri ale vscozitii mediului n detrimentul eficienei amestecrii. Sterilizarea mediilor se realizeaz n mod uzual prin tratament termic, filtrare, folosirea unor radiaii, tratament chimic sau diverse combinaii ale acestora. Utilizarea radiaiilor i tratamentelor chimice este rar n cazul mediilor industriale. Pentru unele componente ale mediilor labile la temperatur, filtrarea sterilizant prin membrane este cea mai recomandabil. Metoda cea mai folosit pentru sterilizarea mediilor industriale complexe este sterilizarea cu abur sub presiune. Durata acestei sterilizri, ceea ce implic perioada de nclzire treptat i de meninere a temperaturii de sterilizare sunt de asemenea probleme care trebuie studiate cu grij naintea procedeului industrial, astfel nct s se asigure att gradul avansat de sterilizare, ct i conservarea calitii mediului de cultur. nclzirea unor amestecuri complexe de substane chimice, anorganice sau organice la temperaturi mai mari de 120 0C i pentru perioade mai lungi de 20 de minute poate cauza distrugerea unor componente de mediu fie prin degradare termic direct, fie prin producerea unor reacii nedorite ntre componente, disprnd cel puin parial unele substraturi i aprnd n schimb produse toxice pentru cultur. Condiiile n care are loc sterilizarea pot afecta nu numai stabilitatea componentelor dar de asemenea disponibilitatea lor pentru organismul de cultur. Microelementele de exemplu pot exercita o influen asupra solubilitii nutrienilor majori. De asemenea temperatura i durata sterilizrii pot afecta solubilitatea unor componente ale mediului.

6. NSMNAREA CULTURILOR DE BACTERII, DROJDII I MUCEGAIURIPrincipiul metodei:Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultur n plci Petri sau n tuburi, att pentru studiul lor, pentru conservarea lor prin refrigerare, ct i pentru obinerea culturilor stoc i de lucru, n diversele procese biotehnologice. Operaia de trecere a unei culturi dintr-un vas de cultur n altul se numete repicare sau trecere, iar fragmentul de cultur ce se trece pe alt mediu se numete inoculum.

n jurul flcrii becului de gaz exist o zon steril cu diametrul de aproximativ 20 cm, n lipsa curenilor de aer. Toate manipulrile care necesit deschiderea recipientelor sterile sau coninnd culturi trebuie efectuate n aceast zon de protecie.

6.1. NSMNAREA N TUBURIMateriale utilizate:- culturi de Bacillus subtilis pe agar nutritiv;- culturi de Saccahromyces cerevisiae pe mediul extract de mal - agar;- culturi de Monascus purpureus, Aspergillus niger i Penicillium pe mediul extract de cartof - dextroz - agar;- fir de inoculare;- bec de gaz;- eprubete cu mediu sterilizat i nclinat (nutrient-agar, extract de mal-agar, extract de cartof-dextroz-agar);- termostat la 30 oC;- lamp bactericid.Mod de lucru:nsmnarea cu ansa Se terge suprafaa din interiorul niei de lucru cu un tampon mbibat cu alcool 95%. Se aprinde lampa bactericid i se las 15 minute pentru sterilizarea incintei de lucru. Se spal minile cu spun, apoi se cltesc cu alcool. Se aprinde becul de gaz i se regleaz flacra, care trebuie s aib conul de culoare albastr.Se ine eprubeta n care exist cultura ce trebuie repicat cu mna stng, n poziie oblic sau chiar orizontal. n mna dreapt se ine acul de repicat. Acesta se arde n flacra becului de gaz, inndu-l n poziie vertical pentru ca flacra s cuprind o poriune ct mai mare din el. Se ine n flacr pn ce mai mult de jumtate din ac se nroete, apoi se plimb de 2 -3 ori i restul acului pn la mner, n flacr.Dup aceea se apropie gura eprubetei de flacr i, cu degetul mic de la mna dreapt ndoit, se trage afar dopul de vat din gura eprubetei, apucndu-l de captul rmas afar. Nu i se d drumul dopului pe mas ci se ine tot timpul n mn. Se trece gura eprubetei de 2 -3 ori prin flacr. Se introduce acul fierbinte n eprubet i se rcete, nu n cultur, ci alturi, pe o poriune de agar fr cultur. Se ia apoi o foarte mic poriune (de 1 - 2 mm) din cultur pe vrful acului (se alege poriunea cea mai tipic i mai curat a culturii respective).Se scoate acul din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul de vat din mna dreapt. Se las jos eprubeta i se ia, tot cu mna stng, o alt eprubet cu mediu steril. Acul de repicat cu fragmentul de cultur, se ine mai departe n mna dreapt ferindu-l acum de flacr. Se procedeaz cu eprubeta a doua la fel cum s-a procedat cu prima, adic: se ine n poziie orizontal sau puin oblic n mna stng, se scoate dopul cu degetul cel mic de la mna dreapt ndoit, inndu-se tot timpul operaiei de repicare n mn. Se trece gura eprubetei prin flacr, se introduce acul de repicare cu fragmentul de cultur, atingnd uor mediul (n centrul eprubetei), pn ce partea din cultur rmne pe mediu. Uneori este bine ca fragmentul de cultur s fie puin afundat n mediu, pentru a face un contact mai strns cu el. Se scoate acul de repicat din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul din mna dreapt. Se trece i captul dopului care a fost inut cu mna prin flacr, dar foarte rapid. Se arde din nou acul n flacr pan la rou. Aceast operaie este absolut necesar i trebuie fcut cu rbdare, pentru a se evita infectarea mediilor urmtoare. Dup arderea acului se ia din nou eprubeta cu cultura ce trebuie repicat i se repet operaia de repicare cu o alt eprubet steril. Toate micrile descrise mai sus, din care const operaia de repicare, trebuie executate destul de repede pentru a nu permite infectarea mediilor sterile din eprubete. Ele trebuie fcute cu o oarecare ritmicitate i nu prelungite prea mult. De asemenea trebuie respectate o serie de indicaii, care la prima vedere par minore, dar de care depinde foarte mult reuita unei repicri. Astfel, trebuie avute n vedere: -inerea eprubetei n poziie orizontal n timpul repicrii pentru a evita cderea sporilor de ciuperci i bacterii din atmosfer pe mediu; -inerea acului de repicat n poziie vertical n flacr i nu orizontal, pentru ca arderea s se fac pe o poriune ct mai mare;-scoaterea dopului de vat cu degetul mic al minii drepte i inerea lui tot timpul n mn, pentru a-l feri de contaminri secundare;-arderea gurii eprubetei la scoaterea i introducerea dopului de vat, deoarece pe marginile exterioare ale eprubetei pot exista germeni de infecie secundar.Dup dezvoltarea culturii se observ aspectul, culoarea, tipul coloniilor, precum i eventuala prezen a contaminrii cu alte microorganisme.

9.2. ESTIMAREA NUMRULUI DE CELULE MICROBIENE PRIN METODA CULTURAL Principiul metodei:Metoda cultural Koch const n nsmnarea unui volum cunoscut din suspensia de celule n/sau pe medii de cultur solidificate n plci Petri i, dup o perioad de incubare, se face numratoarea coloniilor considernd c fiecare colonie este rezultat prin multiplicarea unei singure celule. Metoda cultivrii n plci este foarte adesea folosit pentru determinarea numrului de microorganisme vii dintr-un produs i permite, n acelai timp, o analiz calitativ prin studiul caracterelor morfologice ale coloniilor dezvoltate. De obicei se utilizeaz diluiile decimale ale produsului de analizat.Rezultatul se exprim n UFC (uniti formatoare de colonii), deoarece pot exista mai multe celule aglomerate care formeaz o colonie, iar n cazul mucegaiurilor exist fragmente multicelulare de hife; n plus, exist destule celule izolate care nu formeaz colonii. Se vor alege plcile care conin ntre 30 i 300 colonii.

Figura 8. Estimarea numrului de celule microbiene prin metoda cultural

Materiale utilizate:- mediu de cultur: agar nutritiv sterilizat n flacoane Erlenmayer de 500 mL;- plci Petri sterile;- pipete sterile;- eprubete cu cte 9 ml ap steril;- probe de ap din diferite surse;- baie de ap la 45 oC;- termostat la 37 oC;- dispozitiv de numrat colonii.Mod de lucru:Mediul de cultur coninut n balonul Erlenmayer se pune la topit pe baie de ap. Dup fluidificarea complet, se termostateaza, tot pe baie de ap la 45 oC.Folosind pipeta steril, se pregtesc cte 3 diluii din probele de ap i apoi se recolteaz cte 1 cm3 din aceste diluii i, prin desfacerea plcii Petri sterile, se las s treac numai pipeta i se scurge coninutul.Peste volumul de suspensie se toarn mediul de cultur steril la 42-45 oC i, imediat, prin rotirea n plan orizontal a plcii, se face omogenizarea cu mediul i se las n repaos pentru solidificarea mediului i fixarea celulelor. Se recomand ca din aceeai diluie s se fac nsmnari n cte dou plci paralele.Plcile cu mediile nsmnate se introduc n termostat, reglat la temperatura de 37 oC, pentru dezvoltarea microorganismelor. Numrarea coloniilor se va face dup 72 ore. Pentru numrare se aleg plcile n care numrul de colonii este cuprins ntre 30 - 300, acolo unde este posibil. n cazul n care coloniile sunt dese, pentru a nlesni numrtoarea, placa Petri se inverseaz i se aeaz pe numrtorul de colonii TITRIPLAQUE. La metoda culturii, toate operaiunile se execut cu mult atenie evitndu-se orice surs de infectare cu microorganisme strine, care, ajungnd n plac ar influena rezultatul analizei.Numrul de uniti formatoare de colonii este dat de formula:

UFC/mL = nr. colonii coeficientul de diluie