biochimie lab

17
BIOCHIMIE LABORATOR 1/08.03.2012 ANALIZA FOTOCOLORIMETRICĂ Analiza fotocolorimetrică este acea metodă de analiză cantitativă fizico-chimică care se bazează pe măsurarea intensitătii de culoare a unei soluţii, intensitate care este direct proporţională cu concentraţia substanţelor de analizat din soluţie. Consideraţii generale Orice rază de lumină care provine de la o sursă este alcătuită din radiaţii cu = 400 – 760 nm, ceea ce reprezintă domeniul vizibil, dar şi din radiaţii cu >760 nm – domeniul infraroşu (IR) şi <400 nm – domeniul ultraviolet (UV). Se numeşte radiaţie monocromatică o singură radiaţie caracterizată de o singură lungime de undă şi deci de o singură culoare. S-a constatat că, substanţele din care sunt alcătuite corpurile absorb din spectrul vizibil în mod selectiv radiaţiile, adică le absorb pe toate cu excepţia aceleia în care corpurile apar colorate. Pornind de la aceste date, fizicianul Lambert a emis legea de bază a fotocolorimetriei care spune că: straturi de soluţii (colorate) de aceeaşi grosime şi care conţin dizolvată o anumită cantitate de substanţă absorb în condiţii experimentale identice aceeaşi cantitate din lumina incidentă. Aceasta lege se transpune într-o ecuaţie matematică de forma: I t = I o 10 -k d unde: I t = intensitatea radiaţiei transmise I o = intensitatea radiaţiei care cade pe suprafaţa soluţiei k = coeficient de extincţie d = grosimea stratului de lichid absorbant S-a demonstrat experimental că coeficientul k este direct proporţional cu concentraţia substanţelor dizolvate în soluţie. 1

Upload: ghita-razvan-mihai

Post on 19-Dec-2015

96 views

Category:

Documents


3 download

DESCRIPTION

Agronomie

TRANSCRIPT

Page 1: Biochimie Lab

BIOCHIMIELABORATOR 1/08.03.2012

ANALIZA FOTOCOLORIMETRICĂ

Analiza fotocolorimetrică este acea metodă de analiză cantitativă fizico-chimică care se bazează pe măsurarea intensitătii de culoare a unei soluţii, intensitate care este direct proporţională cu concentraţia substanţelor de analizat din soluţie.

Consideraţii generaleOrice rază de lumină care provine de la o sursă este alcătuită din radiaţii cu = 400 –

760 nm, ceea ce reprezintă domeniul vizibil, dar şi din radiaţii cu >760 nm – domeniul infraroşu (IR) şi <400 nm – domeniul ultraviolet (UV).

Se numeşte radiaţie monocromatică o singură radiaţie caracterizată de o singură lungime de undă şi deci de o singură culoare.

S-a constatat că, substanţele din care sunt alcătuite corpurile absorb din spectrul vizibil în mod selectiv radiaţiile, adică le absorb pe toate cu excepţia aceleia în care corpurile apar colorate.

Pornind de la aceste date, fizicianul Lambert a emis legea de bază a fotocolorimetriei care spune că: straturi de soluţii (colorate) de aceeaşi grosime şi care conţin dizolvată o anumită cantitate de substanţă absorb în condiţii experimentale identice aceeaşi cantitate din lumina incidentă. Aceasta lege se transpune într-o ecuaţie matematică de forma:

It = Io 10 -k d unde:

It = intensitatea radiaţiei transmiseIo = intensitatea radiaţiei care cade pe suprafaţa soluţieik = coeficient de extincţied = grosimea stratului de lichid absorbant

S-a demonstrat experimental că coeficientul k este direct proporţional cu concentraţia substanţelor dizolvate în soluţie.

K = Ɛ c unde:

Ɛ = coeficient de proporţionalitatec = concentraţia substanţei dizolvate în soluţie.

Ii = Io 10 – Ɛ c d

Aceasta este legea Lambert- Beer, este legea fundamentală a analizei fotocolorimetrice

şi este valabilă pentru o radiaţie monocromatică.

1

Page 2: Biochimie Lab

Mărimi fotometrice

In analiza fotocolorimetriei se lucrează cu 3 mărimi:

- transmisia T = = = 10-εcd

- absorbţia A =

- extincţia E = lg = lg = εcd

Dacă în această relalţie considerăm că grosimea stratului de soluţie care absoarbe lumina este constantă – d = constant – atunci relaţia de mai sus devine:

E = Ɛ c

Aceasta relaţie poate fi transpusă într-o funcţie matematică de forma E = f(c), a carei reprezentare grafica este o dreapta care trece prin origine.

S-a constatat însă că la concentraţii mari de substanţa dizolvate în soluţie, dreapta graficului se aplatizează (capată un palier). Pe această porţiune nu mai este proporţionalitate directă între extincţie si concentraţie şi nu ne mai interesează din punct de vedere al metodei fotocolorimetrice.

BIOCHIMIE

2

Page 3: Biochimie Lab

LABORATOR 2/15.03.2012

FORMULA GENERALĂ DE CALCUL DIN ANALIZA FOTOCOLORIMETRICĂ

Dacă facem urmatoarele presupuneri:- fie C1 concentraţia cunoscută în compusul de analizat a unei soluţii sau probe de

analiza C1 = Cp

- fie C2 concentraţia în compusul de ananlizat, dar cunoscută dintr-o soluţie care porta numele de etalon C2 = Cet

- presupunem că E1 reprezintă extincţia, determinată cu ajutoul unui instrument optic, a soluţiei de analizat E1 = Ep

- fie E2 extincţia determinată cu ajutorul acestui aparat optic a soluţiei etalon E2 = Eet

= Cp = Cet

Aceasta este formula generală de calcul din analiza fotocolorimetrică.Aparatura folosită în analiza fotocolorimetrică – spectrofotometre. Cel mai utilizat este

spectofotometrul SPEKOL. Este un fotometru cu celulă fotoelectrică care functionează cu un singur fascicul de lumină provenit de la o lampă, iar măsurarea extincţiei se face prin metoda deviaţiei.

Metode de determinare a concentraţiei unei substante dintr-o solutie prin fotocolorimetrie

Există 2 metode:a) metoda folosind o soluţie etalonb) metoda folosind o curbă etalon

a) Metoda folosind o soluţie etalonConsideraţii generaleMai întâi, alături de proba de analizat vom prepara în laborator o soluţie etalon de

concentraţie cunoscută în compusul ce urmează să-l analizăm şi notăm această concentraţie. Apoi, peste probă şi peste soluţia etalon vom adăuga volume egale de anumiţi reactivi cu care compusul ce urmeaza să-l analizăm va da o reacţie de culoare. Vom citi apoi la SPEKOL intensitatea acestei reacţii de culoare sub formă de unitaţi de extincţie, pe care le vom introduce apoi in formula de calcul.

Caz particular/aplicaţie: determinarea fosforului dintr-o probţ de sange prin metoda cu soluţia etalon.

Mai întai preparăm o soluţie etalon de fosfor cu concentraţie cunoscută:

1 mol KH2PO4 (136 g) . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 atom P (31 g) X . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.004 g

X = g KH2PO4

3

Page 4: Biochimie Lab

Principiul metodei:Fosforul, atât din probă cât şi din soluţia etalon va reacţiona cu reactivul molibdat de

amoniu (NH4)2MoO4 cu care în mediul alcalin şi în prezenţa unei soluţii reducătoare formează un compus de culoare albastră a cărei intensitate de culoare se va citi la SPEKOL la lungimea de undă = 700 nm.

Tehnica de lucru:

agitare

t = 5 minute albastră INCOLOR ( = 700 nm)

Citirea şi calculul rezultatelor:

EM = 0.098

Eet = 0.279

Ep = 0.310

Cp = x Cet = x 4 = x 4 =

= 4,68 mg P la 100 ml sânge.

BIOCHIMIELaborator nr.3/22.03.2012

P E M (ml)Solutţe reducătoare 1 1 1Apă distilată 2 2 2.1Molibdat de amoniu 0.5 0.5 0.5Proba de analizat 0.1 - -Soluîia etalon de P - 0.1 -Na OH 4 ml 0.5 0.5 0.5

4

Page 5: Biochimie Lab

DETERMINAREA CONCENTRATIEI UNEI SUBSSTANTE DINT-O SOLUTIE PRIN METODA CU O CURBA ETALON

Consideraţii generaleSe prepară o soluţie stoc din compusul ce urmează să-l analizăm din care se vor

prepara un şir de soluţii diluate cu apă distilată. Pentru fiecare din aceste solutţi diluate se va calcula concentraţia şi se va dezvolta o reacţie de culoare cu reactivi specifici pentru compusul de analizat. Se va citi la SPEKOL extincţia acestor compuşi şi se va trasa graficul extincţie funcţie de concentraţie.

Caz particular: determinarea fosforului dintr-o probă de sânge prin metoda cu curba etalon

Se prepară o soluşie stoc de fosfor cu concentraţia:Cstoc = 10 mg P/100 ml sol.Din această soluţie stoc se prepară un şir de soluţii distilate folosind apa distilată, după

cum urmează:Nr.

EprubetăVolum soluţie

stoc (ml)Volum apă

(ml)Concentraţie(mgP/100 ml)

ExtincţieCE - Emartor

Factor depantă F

1 1 9 C1 = 1 E1 = 0,0502 2 8 C2 = 2 E2 = 0,1003 3 7 C3 = 3 E3 = 0.1484 4 6 C4 = 4 E4 = 0,2005 5 5 C5 = 5 E5 = 0,250 Cp = 0,212 x20,36 6 4 C6 = 6 E6 = 0,3007 7 3 C7 = 7 E7 = 0,3508 8 2 C8 = 8 E8 = 0,3909 9 1 C9 = 9 E9 = 0,45010 10 - C10 = 10 E10 = 0.510

100 mg P . . . . . . . . . . . . . . . 100 ml sol.X mg P . . . . . . . . . . . . . . . 1 ml sol.

X = = 0,1 mg P/ml

0,1 mg P . . . . . . . . . . . . . . . . 10 ml sol.Y mg P . . . . . . . . . . . . . . . . 100 ml sol.

Y = = 1 mg/100 ml sol.

Pentru fiecare din aceste soluţii diluate se va dezvolta o reacţie de culoare cu reactivi specifici pentru fosfor: 1 ml soluţie reducătoare + 2 ml apă distilată +0,5 ml soluţie molibdat de amoniu + câte 0,1 ml din fiecare soluţie + 0,5 ml NaOH. O să se dezvolte un şir de culori albastre a căror culoare se va citi la SPEKOL la = 700 nm.

Se obţin un şir de extincţii. Aceste valori sunt în tabel. Cu aceste valori de extincţie şi cu concentraţiile C1 , C2 . . . . C10 se trasează graficul extincţie funcţie de concentraţie.

5

Page 6: Biochimie Lab

Dacă se lucrează corect toate punctele de intersecţie trebuie să se găsească pe o dreaptă care trece prin origine. Dreapta aceasta se va numi curbă etalon pentru fosfor.

Apoi se lucrează proba de sânge cu conţinut de fosfor necunoscut: - într-o eprubetă cu 1 ml soluţie reducătoare + 2 ml apă distilată + 0,5 ml molibdat de amoniu + 0,1 ml sânge + 0,5 ml NaOH rezultă culoarea albastră. Se citeşte extincţia la SPEKOL la = 700 nm => o valoare = 0,212. Ep – EM = 0,212. Se caută pe axa OE a graficului. Din punctul Ep de pe axa OE se duce o paralela la axa OC până intersectează curba etalon şi din acest punct se coboară o perpendiculalară pe axa OC. Piciorul acelei perpendiculare este concentraţia probei.

Dacă se lucrează corect pe aceeaşi probă de analizat trebuie să dea aceeaşi valoare.Factor de pantă – F – este cotangenta unghiului pe care-l face fiecare punct de pe

dreaptă cu o paralela dusă la axa OC.

F = ctg = =

Pentru fiecare punct de pe dreaptă se calculează un factor F:

F1 = ; F2 = . . . . . . .F10 =

Se face media lor aritmetică:

Fmediu = =

Se mai poate calcula prin a treia metodă concentraţia probei:Cp = Ep x

= 20,3

6

Page 7: Biochimie Lab

BIOCHIMIELaborator nr.4/29.03.2012

[Glucide] Dozarea glucozei din sânge (Metoda fotocolorimetrică)

Consideraţii generaleGlucoza este principala sursă de energie din organismul animal, iar principala rezervă

de glucoza din organism – glicogenul hepatic.Din glicogenul hepatic printr-un proces de fosforilare (rupere sub actiunea H3PO4) se

formează G1P (glucoza 1 fosfat) şi acesta formează mai departe G6P printr-un proces de izomerizare, iar acesta se transformă în glucoză care este preluată de sânge şi dusă la ţesuturi (ficat) unde este degradată şi rezultă energia sub formă de ATP.

Continutul fiziologic de glucoză din sânge se numeşte glicemie şi se exprimă în mg glucoză la 100 ml sânge. Pentru menţinerea glicemiei în limitele fiziologice intervin hormonii insulină şi glucagon, dar si hormonii adrenalina, noradrenalina, ACTH (corticoadenotrop) si hormonul de crestere (chiar si tiroxina).

Determinarea glucozei din sange prezinta importanta deoarece se pot diagnostica starile de diabet zaharat la toate animalele domestice, dar si corelatii ale nivelului de glucoza cu alte afectiuni metabolice – cetoza (acumulare de corpi cetonici) si totodata se poate aprecia si starea de denutritie a animalului.

Principiul metodei de dozareGlucoza din sange reactioneaza cu reactivul – ORTOTOLUIDINA cu care la cald si in

mediu de acid acetic glacial formeaza un amesctec de glicozilamina si baza Schiff, amestec de culoare verde si a carui intensitate de culoare se va citi la specol la λ=610 nm.

Tehnica de lucru:

7

Page 8: Biochimie Lab

Fierbe t=10’ Verde incolor

Calculul rezultatelor:

Cp = x Cet

Glicemia difera de la specie la specie si pe specii are urmatoarele valori:- la om : 80 – 110- la bovine : 40 – 70- la cabaline : 58 – 115- la suine : 55 – 100- la ovine : 50 – 82- la iepure : 113 – 156

Glicemia depinde si de temperatura corporala la unele specii:- la pasare t=42C, glicemia = 230 mg/100 ml sg

- la marmota t=9C vara si 7C iarna, glicemia 8-9 mg /100 ml sg

Mai este influentata si de starea de gestatie si stres.Hiperglicemie – in afectiuni :

- afectiuni pancreatice : insuficienta in secretia de insulina = diabet zaharat- intoxicatii (Pb, Hg, alimente)- hepatite- nefrite- boli infectioase (unele) si- dezechilibre endocrine (hipertiroidism)

Hipoglicemie – in afectiuni : - stari de denutritie (lipsa glucide in hrana)- disfunctii ale hipofizei si ficatului- disfunctii ale glandei suprarenale

Buletin de analiza Proba sg bovinλ= 610nmEM= 0,043Eet=0,057Ep=0.444

Cp=

BIOCHIMIELaborator nr.5/05.04.2012

Reactivi Proba Etalon Martor (ml)Proba de sange 0,1 - -Solutia etalonGlucoza

- 0.1 -

Apa distilata - - 0.1ortotoluidina 3 3 3

8

Page 9: Biochimie Lab

Dozarea lactozei din lapteConsideraţii generaleLactoza este principalul diglucid reducător din lapte unde se găseşte în proporţie 2–6 %.Este sintetizat în glanda mamară din β – galactopiranoză si α glucopiranoză.

Este scindată în intestinul subţire de enzima lactoză.

Pincipiul metodei de dozareLactoza reacţionează cu fenolul în mediu de H2SO4 cu care formează un produs de

condensare de culoare galben cafenie a cărui intensitate de culoare se estimează fotocolorimetric la λ 490 nm.

Tehnica de lucruEste metoda fotocolorimetrică.

S-a lucrat metoda cu factor de pantă F=

La proba de lapte se diluează 1 la 1000 (1g lapte la 999 ml apă).

Reactiv P M mlProbă lapte 1 -

Apă distilată - 1

9

Page 10: Biochimie Lab

Fenol 80% 3 pic. 3 pic.Soluţie H2SO4

conc.2,5 2,5

Galbencafeniu

Galbui

agitare – t = 15 min racire

Calculul rezultatelor

Cp= x Ep = 6,67 x 0,131 = 0,87 g lactoza/100 ml (formula)

Interpretarea rezultatelorConţinutul fiziologic de lactoză se exprimă în grame la 100ml lapte şi pe specii au

următoarele valori:- laptele uman 6,5%- măgăriţă 6,2%- pisică 5%- scroafă 5,4%- vacă 4,7 %- oaia-capra 4,5 %- lapte praf 38 %B.I. Probă lapte vacăEp=0,524EM =0,393 0,231

BIOCHIMIELaborator 6/24.05.2012

Dozarea lipidelor totale din ser

10

Page 11: Biochimie Lab

Lipidele în sânge se găsesc heterogene ca structură, fiind formate din: trigliceride, colesterol, acizi grasi liberi sau esterificaţi şi fosfolipide.

Determinarea cantitativă a lipidelor din ser, respectiv din sânge, prezintă importanţă practică deoarece permite diagnosticarea modificărilor lipidice la nivelul ficatului (deoarece acesta este cel care are rolul central în reglarea metabolismului lipidic).

Principiul metodeiLipidele totale din sange sunt mai întâi hidrolizate cu acid sulfuric la fierbere când

rezultă glicerol sau glicerină şi acizi saturaţi care apoi darorită prezenţei H2SO4 în mediul de reacţie suferă o dehidrogenare şi trec în acizi graşi nesaturaţi.

Acizii graşi nesaturaţi formaţi cuplează un ion de H2+ din mediul de reacţie şi trec în

carbocation.Carbocationul format reacţionează cu reactivul numit fosfovanilină (este esterul

fosforic al vanilinei) şi la rece formează un compus colorat în roşu intens a cărui intensitate de culoare se citeşte la SPEKOLL la λ = 530 nm.

Tehnica de lucruMetoda este fotocolorimetrică şi se lucrează cu soluţie etalon de trioleina cu

concentraţia corespunzatoare la 1000 mg de lipide din 100 ml sânge.λ = 530 nmCet = 1000 mg lipide/100 ml sânge

11

Page 12: Biochimie Lab

Fierbere la 1000C t = 10 min

racire

roşu incolor

Cp = Cet

(mg lipide/ |100 ml ser 1000

Interpretarea rezultatelor

Concentraţia fiziologică de lipide din sânge se numeşte lipemie şi apare la toate speciile de animale. Este cuprinsă între 400 – 700 mg/100 ml sânge.

Valori crescute – hiperlipemie – apare în cazuri patologice:-deficit în catabolismul lipidelor la nivelul ficatului;-obstrucţie a căilor biliare;-nefroza;-diabet zaharat;-hiperlipidemie congenitală (ereditară);-o mobilizare crescută de acizi graşi din ţesutul adipos către ficat şi deci o biosinteză

crescută a lipidelor în ficat.Valori scăzute – hipolipemie:-infecţii acute şi cronice;-anemie;-necroza hepatică;-inaniţie;-hipertiroidism.

Buletin de analizăProbă de sânge bovin

Eet = 0,600EP = 0.208

CP = x 1000 = = 346,6 mg lipide/100 ml ser

reactivi P E M (ml)- proba de ser 0.1 - -- solutie etalon trioleina

0,1 -

- apa distilata - - 0,1- H2SO4 2 2 2- hidrolizate 0,1 0,1 0,1- fosfovanilina 2 2 2

12