MICROBIOLOGIE ALIMENTARĂLP.6

EXAMINAREA CARACTERELOR BIOCHIMICE SAU METABOLICE ÎN SCOPUL IDENTIFICĂRII BACTERIILOR.

Deoarece caracterele culturale şi morfologice, de cele mai multe ori, sunt insuficiente pentru identificarea tulpinilor bacteriene izolate (încadrarea lor în gen şi specie), este necesar să se efectueze în continuare examenul caracterelor biochimice sau metabolice.

Acest examen constă în evidenţierea echipamentului enzimatic al bacteriilor, diferit de la o specie bacteriană la alta, prin reacţii sau teste biochimice.

În funcţie de modalitatea de punere în evidenţă a acţiunii enzimelor metabolice asupra substratului specific fiecăreia, testele biochimice pot fi grupate în 2 categorii:

1. teste care evidenţiază în mod direct acţiunea enzimelor, prin însăşi modificarea fizică sau chimică a substratului (ex. lichefierea gelatinei, lichefierea serului coagulat etc.).

2. teste care evidenţiază indirect acţiunea enzimelor prin punerea în evidenţă, cu ajutorul diferiţilor reactivi, a metaboliţilor rezultaţi din scindarea substratului (ex. triptofanaza nu se pune în evidenţă printr-o modificare vizibilă a triptofanului din mediu, ci prin punerea în evidenţă a indolului, metabolit rezultat din descompunerea triptofanului).

Clasificarea reacţiilor biochimiceÎn funcţie de natura enzimelor bacteriene şi a substraturilor asupra cărora acţionează,

reacţiile biochimice pot fi împărţite în cinci grupe:1. reacţii prin care se pun în evidenţă enzimele active faţă de

substanţele hidrocarbonate (glicide şi polialcooli);2. reacţii prin care se pun în evidenţă enzimele active faţă de substanţe

organice care conţin în molecula lor azot (de la uree la proteinele macromoleculare);3. reacţii prin care se pun în evidenţă enzimele bacteriene oxidante sau

reducătoare;4. reacţii de evidenţiere a posibilităţii de utilizare ca sursă de hrană a

unui anumit substrat nutritiv (ex., posibilitatea de a folosi citraţii ca unucă sursă de carbon);5. sistemele multitest și microtest de identificare a bacteriilor.

1. Reacţii de punere în evidenţă a activităţii enzimatice faţă de glucide şi polialcooli

Acest grup de reacţii pune în evidenţă aşa-numitele proprietăţi bacteriene zaharolitice, glucidolitice, sau de fermentare a glucidelor.

Mai frecvent se testează activitatea bacteriilor față de: monoglucide: pentoze (arabinoza, ramnoza, xiloza);

hexoze (glucoza, fructoza, galactoza, manoza, sorboza); diglucide: zaharoza, lactoza, maltoza, trehaloza; triglucide: rafinoza, melizitoza; poliglucide: amidonul, dextrina, inulina, glicogenul; polialcooli: glicerol, manitol, sorbitol, inozitol; glucozide: salicina, esculina.

În acest scop, bacteriile se cultivă pe medii lichide sau pe medii solide la care s-a adăugat în proporţie de 0,5-1% substanţa hidrocarbonată ce constituie substratul enzimei pe care dorim să o evidenţiem şi o substanţă indicatoare de pH. Mediile se prepară la un pH ușor alcalin. Deoarece din fermentarea glucidelor rezultă acizi, substanța indicatoare va vira culoarea mediului oferind astfel un indiciu că bacteria a fermentat glucidul respectiv.

Examinarea proprietăţilor glucidolitice în apă peptonată cu o substanță indicatoare de pH (fig.1).

Apa peptonată se prepară din 100 ml apă distilată, peptonă 2 g şi clorură de sodiu 0,5 g. La mediul astfel preparat se adaugă un glucid și ca indicator de pH, albastru de bromtimol sau roșu fenol. Unele bacterii fermentează substanţele hidrocarbonate cu producţie de gaze. Pentru a pune în evidenţă acest caracter, în eprubeta cu mediu se introduce un tubuleț Durham cu gura în jos, astfel încât să se umple cu mediu.

Tehnica de lucru: tulpina bacteriană de identificat se însămânţează în tuburi cu apă peptonată conţinând glucidele faţă de care vrem să-i testăm activitatea fermentativă. Tuburile însămânţate se incubează la 370 C, 1-2 zile.

Interpretare: reacţia pozitivă se manifestă prin virarea culorii mediului acidifiat, de la albastru la galben

când indicatorul de pH este albastru de bromtimol și de la roșu la galben când indicatorul este roșu fenol;

prezența gazelor în tubul Durham atestă fermentarea glucidului cu producție de gaz. reacția negativă echivalează cu lipsa modificărilor .

Fig.1 Culturi bacteriene în apă peptonată cu glucoză și roșu fenol: primul tub – bacteria fermentează glucoza fără producție de gaz; al doilea tub – reacție negativă; al treilea tub - bacteria fermentează glucoza cu producție de gaz.

Testarea proprietăţilor fermentative ale bacteriilor pe medii solide cu substanțe hidrocarbonate se bazează pe același principiu: modificarea culorii indicatorului de pH introdus în mediu, ca urmare a acidifierii.

Medii solide utilizate pentru testarea proprietăţilor fermentative ale bacteriilor:Mediul Levine – (agar cu lactoză, eozină și albastru de metilen) – fig.2:

-coloniile bacteriilor care nu fermentează lactoza sunt roz-pal;-coloniile bacteriilor care fermentează lactoza au o culoare negricioasă și luciu

metalic verzui.

Fig.2 Aspectul culturilor pe mediul Levine: 1 și 2 – bacterii lactoză negative; 3 – bacterie lactoză pozitivă.

Mediul Chapman – (agar hiperclorurat – 75 g NaCl‰, manitol, roșu fenol) –mediu selectiv pentru stafilococi prin concentrația mare de sare (stafilococii fiind halofili) și de diferențiere a acestora pe baza capacității de a fermenta manitolul (fig.3):

- safilococii manitol pozitivi, acidifiază mediul virând culoarea din roșu în galben;

- stafilococii manitol negativi nu modifică culoarea mediului.

Fig.3 Mediul Chapman: în stânga, o tulpină de stafilococ manitol pozitivă; săgeata indică o cultură de stafilococ manitol negativă.

Testul de hidroliză a amidonuluiBacteriile se însămânţează într-o placă cu geloză care conţine 0,2% amidon solubil. După

dezvoltarea culturii suprafaţa mediului se acoperă cu soluţie Lügol sau cu soluţie saturată de iod. Mediul se va colora în albastru-violaceu datorită amidonului, iar în jurul coloniilor se vor observa zone necolorate.

2. Reacţii de punere în evidenţă a activităţii enzimatice faţă de substanţele organice ce conţin azot

A. Testul ureazei (fig.4)Acest test este utilizat pentru identificarea bacteriilor capabile să hidrolizeze ureea utilizând

enzima numită urează. Punerea în evidenţă a acestei enzime se face pe diferite medii de cultură lichide sau solide care conţin ca substrat uree, cum este, de exemplu, mediul Christensen.

Mediul Christensen – (agar cu roșu fenol,glucoză (1 g), KH2PO4 (2 g))PH-ul se ajustează la 6,8

După sterilizarea mediului se adaugă, înainte de solidificare, 20 ml dintr-o soluţie de uree 20%, sterilizată prin filtrare. Datorită reacţiei slab acide, mediul are o culoare gălbuie (roșu fenol este galben în mediu acid și devine roșu în mediu alcalin).

În urma însămânţării unei bacterii care hidrolizează ureea transformând-o în două molecule de amoniac alcalin, mediul, iniţial galben, se colorează în roșu.

Fig. 4 Testul ureazei pe mediul Christensen: tubul din stânga – bacterie urează negativă; tubul din mijloc – bacterie urează pozitivă (Proteus mirabilis); tubul din dreapta – mediu steril.

B. Metode pentru punerea în evidenţă a produşilor rezultaţi din dezintegrarea unor aminoacizi

1. Metode pentru punerea în evidenţă a indolului (fig.5).Unele bacterii cultivate în bulion sau în apă peptonată au proprietatea de a dezintegra

triptofanul. Triptofanaza oxidează lanţul lateral al triptofanului, rezultând indolul.

Cea mai utilizată metodă de evidențiere a acestui catabolit utilizează soluția Erlich-Kovacs – o soluție de culoare gălbuie, care în prezența indolului se colorează în roșu.

Tehnica de lucru:Din cultura de 24 de ore a bacteriei de testat se transferă într-un tub de reacție 1-2 ml, la

care se adaugă câteva picături de reactiv Erlich-Kovacs, încât acesta să formeze un inel cu o grosime de 1-2 mm. Reacția se citește imediat în funcție de culoarea inelului de reactiv

Interpretare: reacția este pozitivă când inelul de reactiv virează în roșu; reacția este negativăcând culoarea reactivului nu se modifică.

Punerea în evidenţă a indolului cu hârtie indicator: o bandă de hârtie de filtru imbibată cu reactivul Erlich-Kovacs (benzile se găsesc în comerț gata de folosire) se introduce în tub după însămânțarea bacteriei de testat, fixând-o între dop și gura tubului. Banda nu terbuie să atingă mediul de cultură. Reacția este pozitivă când capătul liber al benzii se înroșește.

Fig. 5 Testul indolului: stânga – reacție negativă; dreapta – reacție pozitivă.

2. Metode pentru punerea în evidenţă a H2S Hidrogenul sulfurat (H2S) este un produs rezultat din dezintegrarea aminoacizilor care

conţin sulf (cistină, cisteină, metionină) sub acţiunea fermenţilor unor bacterii. Producţia de H2S se pune în evidenţă prin mai multe metode.

Metoda cultivării pe medii cu acetat de plumbLa 100 ml agar nutritiv se adaugă 1 g acetat de Pb. Mediul se repartizează în tuburi şi se

sterilizează. Bacteriile se însămânţează pe suprafaţa mediului înclinat sau turnat în plăci Petri. Dacă bacteria testată produce H2S, mediul se înegreşte în jurul coloniei datorită sulfurii de Pb care rezultă din combinarea H2S şi a acetatului de Pb.

Metoda benzilor cu acetat de plumb – identică ca tehnică de lucru cu metoda

descrisă la testul indolului. Benzile sunt îmbibate cu cu o soluţie 10% de acetat de Pb.Dacă bacteria produce H2S, banda se înegreşte în porţiunea inferioară după 24 ore sau mai

multe zile de incubare la 37ºC.

C. Tehnici de evidențiere a proprietăților proteolitice Testul de gelatinoliză

Unele bacterii posedă enzime proteolitice, fiind capabile să producă liza gelatinei.Pentru efectuarea acestui test se prepară un mediu din bulion încălzit la 55ºC, în care se

dizolvă gelatină 10-15%. Mediul obținut are o consistență solidă până la temperatura de 22ºC.Mediul se toarnă în tuburi și se solidifică în poziție orizontală apoi este însămânţat prin

înţepare, introducând acul drept în centrul coloanei, astfel încât să ajungă până la fundul tubului. Tuburile se incubează în poziţie verticală, la temperatura de 20-22ºC şi se controlează

caracterul creşterii şi al lichefierii la diferite intervale de timp (prima zi, a zecea şi a 12-a zi).Rezultatul testului: poate avea loc creșterea bacteriei cu sau fără lichefierea mediului cu

gelatină (fig.6).Dacă bacteria nu se dezvoltă la 20ºC poate fi cultivat în gelatină la 37ºC. În acest caz,

pentru citirea rezultatului eprubeta se răceşte introducând-o la frigider, notându-se apoi gradul de lichefiere în comparaţie cu mediul neînsămânţat.

Fig.6 Testul de gelatinoliză: sus – test pozitiv; jos – test negativ.

Testul de lichefiere a serului coagulatSerul recoltat în mod aseptic se distribuie în tuburi sterile apoi se coagulează la 70-75ºC în

coagulator, aşezând tuburile în poziţie înclinată. După coagulare, mediul capătă o culoare alb-cenuşie.

Bacteriile se dezvoltă pe suprafaţă iar proteoliza se manifestă prin lichefierea mediului şi formarea unor depresiuni în dreptul coloniilor.

3. Teste prin care se pun în evidenţă enzimele oxidante şi reducătoare

Testul de reducere a unor substanţe colorateUnele bacterii au proprietatea de a decolora (reduce) anumiţi coloranţi organici,

transformându-i în leucobaze incolore. Reacția este reversibilă, astfel că, ulterior, în prezenţa oxigenului, redobândesc culoarea iniţială.

În vederea executării acestui test se pot utiliza diferite substanţe colorate: albastru de metilen, clorura de trifeniltetrazolium (CTT), verde malachit, indigo-carmin etc. Mai frecvent se întrebuinţează albastru de metilen, procedându-se astfel: la 5 ml cultură în bulion de 24 ore se adaugă o picătură din soluţia apoasă de albastru de metilen 1%. După omogenizare se acoperă suprafaţa mediului cu câteva picături de ulei de parafină pentru a împiedica pătrunderea oxigenului.Se incubează la 370 C și se urmărește reacția din oră în oră:

reacția pozitivă constă în decolorarea mediului în decurs de 1-3 ore; reacția negativă – culoarea mediului rămâne nemodificată (albastră).

Teste pentru punerea în evidență a căii de metabolizare a glucozei

1. Testul Voges-Proskauer (VP)- pune în evidență fermentarea glucozei pe cale butilenglicolică, prin depistarea acetilmetilcarbinolului, un metabolit rezultat din oxidarea butilenglicolului .

Se cultivă bacteria de examinat în mediul Clark=Lubs (peptonă -5 g, glucoză -5 g, fosfat bipotasic -2 g, apă distilată -1.000 ml)

La cultura de 5 zile se adaugă un volum egal de hiroxid de potasiu 10%. Tuburile se ţin sub observaţie timp de 6 ore, la 37ºC. În cazul reacţiei pozitive, în acest interval de timp, apare o culoare roşie.

2. Testul roşului metil (RM)Testul evidențiază fermentarea glucozei pe cale acidă mixtă (cu producere de acid lactic,

acetic, formic, succinic,) care are ca rezultat acidifierea mediului la pH<4,5. Testul se execută în acelaşi mediu ca şi reacţia Voges-Proskauer. La 5 ml cultură de 48 ore se adaugă 5 picături dintr-o soluție de roșu-metil (0,1 g roşu-metil, 300 ml alcool şi 500 ml apă distilată), care are culoarea roșie la pH sub 5,0 și galbenăla pH peste 5,8. În cazul reacţiei pozitive mediul se colorează în roşu, iar în cazul reacţiei negative, în galben (fig.7). O cultură testată nu poate fi pozitivă decât la unul din cele două teste: VP+sau RM+.

Fig. 7 Testul roșului metil

Testul catalazeiCatalaza este o enzimă prezentă la unele bacterii, cu ajutorul căreia acestea descompun

peroxidul de hidrogen în apă și oxigen, conform reacției: Testul se poate efectua folosind culturi pe mediu lichid sau solid. În primul caz se amestecă

5 ml din cultura în bulion de 24 ore, cu 3 ml soluţie de H2O2 3%.Reacţia pozitivă se manifestă printr-o efervescenţă accentuată cu formarea de spumozități

la suprafața culturii. Reacţia devine mai evidentă dacă se adaugă în prealabil la cultura în bulion, o cantitate egală dintr-o soluţie de săpun 10%.

În cazul culturilor pe medii solide, se recoltează cu acul de însămânţare o cantitate mică de cultură, care se omogenizează într-o picătură de apă oxigenată depusă în prealabil pe suprafața unei lame de sticlă, sau se depune 1 ml de apă oxigenată pe suprafaţa culturii (fig.8).

Pentru acest test nu se folosesc culturi de pe agar cu sânge.

A B

Fig. 8 Testul catalazei: A- reacție pe lamă (stânga–test negativ; dreapta – test pozitiv); B – test efectuat în placă, reacție pozitivă.

Testul oxidazeiTestul evidențiază citocromoxidaza, enzimă prezentă la bacteriile aerobe, care realizează

transferul electronilor de hidrogen, oxigenului molecular.Cultura de 2-4 zile pe mediu solid se acoperă cu soluţie apoasă 1% de

tetrametylparafenilendiamin-hidroclorid, proaspăt preparată.Rezultat: coloniile bacteriene oxidazo-pozitive se colorează în roz-roşu sau purpuriu-brun

până la negru, în timp de 15 minute.Se pot utiliza și benzile sau rondelele de hârtie de filtru îmbibate cu reactiv, reacția fiind

efectuată direct pe un fragment de hârtie umectat în prealabil cu apă distilată (fig.10).

Fig.10 Testul oxidazei: stânga – reacție negativă; dreapta – reacție pozitivă.

4. Teste prin care se pune în evidenţă posibilitatea metabolizării anumitor substanţe

Testul folosirii ca unică sursă de carbon a citratului de amoniu sau de sodiu din mediul Simmons

Mediul de cultură are următoarea compoziţie: - clorură de sodiu (5 g), - sulfat de magneziu (0,2 g), - fosfat de amoniu biacid (1 g), - citrat de amoniu sau sodiu cristalizat (2,77 g), - apă distilată (1.000 ml); geloză (20 g).

Amestecul se încălzeşte până la topirea gelozei, se ajustează pH-ul la 7,2 , se adaugă 10 ml soluţie alcoolică 1,5% de albastru de bromtimol. Se sterilizează timp de 15 minute la 120ºC. La preparare mediul are culoarea verde. Bacteriile capabile să metabolizeze citratul de amoniu sau sodiu, dau culturi care alcalinizează mediul virând culoarea din verde, în albastru intens. Bacteriile care nu utilizează citrații, nu modifică culoarea mediului (fig.11).

Fig.11 Testul folosirii ca unică sursă de carbon a citratului de amoniu sau de sodiu.

5. Sistemele multitest și microtest de identificare a bacteriilor A. Sistemele multitest ( mediile politrope) s-au impus în practica diagnosticului

bacteriologic deoarece permit efectuarea concomitentă a mai multor teste de identificare a bacteriilor pe un singur mediu de cultură. Dintre acestea, mediile TSI, MIU și MILF se utilizează îndeosebi pentru identificarea preliminară a enterobacteriaceelor.

Mediul TSI (Triple Sugar Iron)Compoziţia mediului: - extract de carne (3 g), - extract de drojdie (3 g), - peptonă bacto (1

g), - lactoză (10 g), - sucroză (10 g), - glucoză (1 g), - sulfat feros (0,02 g), - clorură de sodiu (5 g) + proteos peptonă (5 g); lactoză (10 g), - tiosulfat de sodiu (0,3 g), - agar (15 g), - roşu fenol (0,024 g sau 2,4 ml soluţie 1/100), - apă distilată (1.000 ml).

Se ajustează pH-ul la 7,4; se repartizează câte 5-6 ml în tuburi Wassermann și se autoclavează 20 minute. Se solidifică în coloană 2,5 cm și în pantă, 4 cm. Mediul are culoare roz închis.

Însămânţarea se face prin înţepare în porțiunea dreaptă și prin striere pe suprafața înclinată Tuburile însămânţate se incubează la 37ºC, timp de 24 ore.

Interpretare (fig. 12): - fementarea glucozei se consideră pozitivă dacă în porţiunea dreaptă a mediului culoarea virează în galben. Dacă fermentarea a avut loc cu producţie de gaz, se observă bule de gaz sau gaz în cantitate mare, care detaşează mediul de fundul eprubetei.;

- fermentarea lactozei/ zaharozei se manifestă prin virarea în galben a porțiunii înclinate a mediului.

- producţia de H2S este pozitivă dacă mediul se înnegreşte în zona de trecere între porţiunea dreaptă şi cea înclinată.

Fig. 12 Aspecte culturale pe mediul TSI: tubul1 (G+;L+; H2S-); tubul 2 (G+;L-; H2S-);tubul 3(G?;L-; H2S+); tubul 4 (G-;L-; H2S-).

Mediul MILF (mobilitate, indol, lizin decarboxilaza,fenilalanin-dezaminaza).Compoziţie: - extract de drojdie (3 g), - glucoză (0,75 g), - L-lizină (5 g), - DL-triptofan (1 g),

- DL-fenilalanină (4 g), - NaCl (5 g), - agar (3 g), - bromcrezol purpur 1/500 (8 ml), - apă distilată (1.000 ml).

Ingredientele se dizolvă la cald şi după ajustarea pH-ului la 6,8 mediul se repartizează în eprubete 10/10 mm şi se sterilizează 30 minute la 110ºC. După sterilizare, mediul trebuie să fie perfect limpede. Solidificarea se face în poziţie verticală iar însămânţarea se execută prin înţepare pe toată înălţimea coloanei. Tuburile se incubează 24 ore la 37ºC.

Interpretare: - mobilitatea se apreciază prin apariţia turbidităţii în toată coloana mediului. La tulpinile imobile dezvoltarea culturii are loc numai pe traiectul înţepăturii;

- reacţia indolului este pozitivă dacă banda de hârtie impregnată cu reactiv Erlich-Kovacs, intodusă în tub imediat după însămânţare, se colorează roz-roşu;

- pentru testarea producerii de fenildeaminază se adaugă câteva picături dintr-o soluţie apoasă de clorură ferică (FeO2Cl6 6H2O) acidifiată prin adăugarea de acid clorhidric soluţie 10%.Dacă testul este pozitiv, inelul format de reactiv se colorează în verde datorită reacţiei dintre sărurile ferice şi acidul fenilpiruvic apărut sub acţiunea fenildeaminazei produsă de bacterie.

- testul lizindecarboxilazei este pozitiv dacă are loc alcalinizarea mediului, vizibilă prin colorarea în violet, datorită trecerii lizinei în cadaverină prin pierderea grupării carboxilice. În cazul reacţiei negative, mediul are culoarea galbenă deoarece nu are loc decarboxilarea lizinei, iar acidul carbonic rezultat din metabolizarea glucozei existente în mediu produce o acidifiere care, nemaifiind tamponată de cadaverină ca în situaţia de mai sus, determină virarea culorii în galben.

Testul MIU (mobilitate indol uree)Compoziţia mediului de bază: - peptonă protease Difco (10 g), - extract de carne (5 g), -

clorură de sodiu (5 g), - fosfat monopotasic (2 g), - agar (3 g), - roşu fenol soluţie 1/500 (6 ml), - apă distilată (900 ml).

Se dizolvă substanţele, se ajustează pH-ul la 6,8-6,9 , se repartizează în baloane de 90 sau 180 ml.

La 91 ml mediu de bază topit se adaugă 10 ml soluţie uree-glucoză (20 uree g + 1 g glucoză la 100 ml apă), sterilizată în prealabil prin filtrare. Se solidifică în poziţie verticală. Mediul este galben- transparent. Însămânţarea se face prin înţepare în profunzimea coloanei de mediu. Pentru detectarea indolului se introduce o bandă impregnată cu reactiv Ehrlich, fixând-o cu ajutorul dopului astfel încât capătul colorat în galben să rămână la aproximativ 1 cm distanţă de suprafaţa mediului.

Interpretare: - mobilitatea se consideră pozitivă dacă mediul devine opalescent uniform şi negativă dacă apare cultura numai pe linia de însămânţare,

- testul ureazic este pozitiv când culoarea mediului este virată din galben în roşu, datorită formării NH3 care alcalinizează mediul;

- testul indolului este pozitiv dacă se schimbă culoarea reactivului de pe bandă, din galben, în roşu sau violet. Dacă lipsesc benzile, prezenţa indolului se poate pune în evidenţă prin adăugarea reactivului Ehrlich-Kovacs la suprafaţa mediului, după 24-48 ore de incubare.

B. SISTEMELE MICROTEST

Pentru a reduce volumul considerabil de muncă, materiale şi timp pe care la reclamă deseori testele utilizate în vederea încadrării taxonomice a unei tulpini nou izolate, în ultimi ani se recurge tot mai mult la miniaturizarea metodelor convenţionale de lucru, mai ales în cadrul examinării caracterelor metabolice ale bacteriilor. Iniţial propuse pentru identificarea enterobacteriaceelor, ele au fost extinse ulterior şi pentru alte grupări taxonomice. În aceste sisteme, testele sunt selectate într-o anumită formulă care să permită identificarea unui grup de microorganisme.

În ultimii ani au fost propuse numeroase sisteme microtest, cunoscute sub diverse denumiri comerciale (API; Enterotub II, ID32 etc.).

Sistemele API , de exemplu, permit efectuarea comcomitentă a 20 de teste biochimice și o bună identificare a celor mai importante bacterii de interes medical.

Acest sistem utilizează stripuri din material plastic, cu 20 de microtuburi în care se găsesc medii speciale deshidratate. Se efctuează o suspensie în ser fiziologic a 1-2 colonii de pe agar a bacteriei de identificat, care se distribuie apoi în godeurile (microtuburile) stripului. Pentru realizarea condițiilor de anaerobioză în unele godeuri (menționate în prospect), se adaugă ulei mineral steril. După o incubare de 24 de ore la 370 C, se citesc și se notează reacțiile pozitive pe baza modificărilor de culoare din fiecare godeu (fig 13). Identificarea bacteriei testate poate fi făcută pe baza unor tabele de identificare sau computerizat.

Fig.13 Sisteme de identificare API 20 E pentru identificarea enterobacteriaceelor.