lp 6 dg molecular hiv
DESCRIPTION
lp virusologie bucurestiTRANSCRIPT
Diagnosticul molecular in virusologie
AMPLIFICAREA TINTEI–PCR–NASBA (nucleic acid sequenced based amplification)
AMPLIFICAREA SEMNALULUI–B-DNA (branched DNA)
PCRPOLYMERASE
CHAIN REACTION
Metoda utilizata pentru detectia ADN-ului de orice tip.
-se bazeaza pe obtinerea unui numar mare de catene tinta prin repetatea unui nr. n de cicluri, ce contin in principal 3 etape:
- denaturarea
- aditia primerilor la capetele secventei tinta
- extensia primerilor
PCR Amplifies a Targeted Sequence
Target Sequence
DNA StrandDouble HelixDNA StrandSupercoiled
DNA Strand
Chromosome
PCR- 2 – CUPLAREA PRIMERILOR LA CAPETELE SECVENTEI TINTA
Target Sequence
Target Sequence
Primer 1Primer 2
Biotin
Biotin
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
PCR -3 – Elongarea primerilor sub actiunea Taq Polimerazei
Secventa tinta
Primer 1
Primer 2
Biotina
Biotina
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
ADN Polimeraza Taq
Secventa tinta
End of the 1st PCR Cycle - Results in Two Copies of Target Sequence
Target Sequence
Target Sequence
Biotin
Biotin
Target Amplification
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
20 1,048,576
30 1,073,741,822
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
Reverse Transcription - Step 1 – Aditia Primer la secventa tinta ARN
Target RNA Sequence
Primer
Biotin
5’
3’
5’
3’
Reverse Transcription - Step 2 – Reverstranscriptaze Catalizeaza extensia Primerului prin incorporarea nucleotidelor
complementare
Target RNA Sequence
PrimerBiotin
5’
3’
5’
3’
rTth DNA Polymerase
End of Reverse Transcription - Step 3 – Rezulta sinteza ADNcomplementar (cDNA)
pe secventa tinta ARN
Target RNA Sequence
cDNA
Biotin
Centrifuge and/or Microcentrifuge (min. RCF 12,500 x g), some tests require a refrigerated, high speed centrifuge (min. RCF 24,000 x g)
•Screw-cap tube racks (to hold Master Mix tubes)
Dedicated Pipettor and Screw-cap Tube Rack, Multichannel Pipettor and Tips
DETECTIA AMPLICONULUI
• Electroforeza in gel de agar, colorare cu bromura de ethidiu si comparare cu markeri de GM cunoscuta
• Hibridizare cu sonde moleculare marcate complementare si apoi detectie (+/- spectrofotometrica)
Detectie
spectrofotometrica Add Stop Solution and Measure Absorbance
CaptureProbe
Microwell Plate
Addition of Substrate
Tetramethylbenzidine(TMB) Substrate
Biotin
BSA
AMPLICON
BSA
AMPLICON
HydrogenPeroxide
Avidin-horseradish peroxidase (Av-HRP conjugate)
Hibridizare
DIAGNOSTIC SEROLOGICTESTE DE TRIAJ- sensibilitate inaltaELISATESTE RAPIDE
TESTE DE CONFIRMARE- specificitate inaltaWESTERN BLOTRADIOIMUNOPRECIPITAREA (RIPA)IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA
DETECTIA VIRUSULUI SAU A PRODUSELOR VIRALE
IZOLARE VIRALADETECTIA ANTIGENEMIEI p24DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL(ARN HIV PLASMATIC SAU ADN HIV PROVIRAL LIMFOCITAR)
Utilizarea metodelor moleculare in infectia HIV
• Fereastra serologica
• Nou-nascuti din mame seropozitive HIV
• Initierea si monitorizarea terapiei antiretrovirale
• iv>5-10.000 corelat cu nr. CD4 si status clinic• iv>30-50.000 indiferent de nr. CD4 si status clinic• Monitorizarea: reducerea iv sub 50 copii ARN
HIV/ml la 24 sapt
Precizati tipul de reactie reprezentata mai sus si principiul tehnicii.
In ce viroze aceasta tehnica este de electie?
• MC, 25 ani . Se apreciaza ca se gaseste in fereastra serologica pentru infectia HIV. Ce semnifica aceasta notiune si ce etapa urmeaza in diagnostic.
Nou nascut din mama seropozitiva HIV.
Care este testul de electie folosit pentru diagnosticul infectiei, precizand si etapele sale.