lp 9 imuno.pdf

7/25/2019 lp 9 imuno.pdf

1/5

LABORATOR NR. 9 [IMUNOLOGIE I IMUNOPATOLOGIE, ANUL III, MV ]

1

REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI

Micro R.F.C.

Reacia de fixare a complementului este utilizatca i test de confirmare n diagnosticul bolilor

infecioase bacteriene sau parazitare, la diferite specii de animale i la om. Micro-RFCul este o metodcare permite utilizarea unor cantiti mult mai mici de reactivi, comparatic cu RFC-ul realizat n eprubete.

Principiul metodei

Reacia se bazeaz pe proprietatea complementului de a se fixa numai pe anticorpii

sensibilizai din complexele de tip antigen-anticorp. Complexele imune fixeaz ireversibilcomplementul. Deoarece reaciile pozitive nu pot fi vizualizate dac interacioneaz doar un antigen cuanticorpii din serul de testat n prezena complementului, este necesar utilizarea unui revelator subforma unui sistem hemolitic preparat din eritrocite de berbec i ser hemolitic anti-oaie. n concluzie,reacia presupune utilizarea a 2 complexe de tip antigen anticorp (din care doar u nul este sigur prezent)i complementul (alexina) care se va fixa pe unul din cele 2.

Materialele necesare

Antigene preparate i standardizate (n stare lichid sau liofilizate) care se dilueaz conformintruciunilor productorului.

Ser de cercetat

Complement de cobai (alexin)liofilizat sau congelat la -400Co Din cauza labilitii accentuate a complementului, acesta trebuie titrat la fiecare utilizare

n RFC.

Eritrocite de berbecdiluate 2,5 % n tampon veronal

Ser hemoliticser de iepure cu anticorpi anti-hematie de berbec (hemolizin)o se dilueaz n funcie de titru

o n reacie se utilizeaz 2UH

Ser de control pozitiv omologat (cu titru cunoscut i etalonat)

Ser de control negativ omologat

Soluie fiziologic(diliuant) 0,85% clorur de sodiu, pH 7,0-7,2.

Materiale supuse examinrii- probe de ser sanguin fr urme de hemoliz sau de contaminarebacterien sau fungic i fr eritrocite n suspensie, n volum de 100-500 l.

Reacia propriu - zis:1. Serurile de cercetat (suspecte), n care se suspicioneaz prezena unor anticorpi specifici, precum

i serurile martor se trateaz termic, 30 minute la temperaturi cuprinse ntre 56-60C, pentruinactivarea complementului propriu;

2. serul de testat inactivat se pune n contact cu o suspensie de antigen corespunztor anticorpilorsuspicionai;

3. se adaug o anumitcantitate de complement (ser de cobai);4. se incubeaz la termostat sau pe baie de ap pentru a se forma complexele antigen anticorp;5. se adaug sistemul indicator (revelator) al reaciei - sistemul hemolitic format din hematii de oaie

(atg) i ser hemolitic anti- hematii de oaie (atc);6. se incubeaz la termostat sau pe baie de ap7. se interpreteaz rezultatele.


2/5


2

n cazul n care n serul de cercetat exist anticorpii specifici suspectai (Reacie +),complementul se va fixa pe anticorpii sensibilizai din complexele imune microbiene i nu va mai fidisponibil a se fixa de alte complexe atg/ atc prezenten sistemul de reacie (sistemul hemolitic).

Fixarea complementului pe complexele imune este urmat de liza celulelor bacteriene, n timp cehematiile din sistemul hemolitic rmn integre.

n concluzie, n reacia pozitiv, hemoliza este absent.

n cazul n care n serul de cercetat nu exist anticorpii specifici suspectai (Reacie -), nprima etap nu se formeaz complexe imune. Complementul, adugat tot n prima etap, va rmne liber

i se va fixa pe anticorpii sensibilizai sistemul hemolitic.Fixarea complementului pe aceste complexele imune este urmat de liza hematiilor.n concluzie, n reacia negativ, hemoliza esteprezent.

Interpretarea rezultatelor:

Reacie pozitiv

4 lips complet a hemolizei3 hemoliz(25%)

Reacie dubioas

2 hemoliz(50%)1 hemoliz(75%)

Reacie negativ

- hemoliz complet(100%)


3/5


3


4/5


4

Modul de lucru bruceloz

Titrarea complementuluise efectueaz n tuburi cu fundul n U cu volum de 4 ml.Titrul complementului (unitatea exact de complement) este reprezentat de cea mai mic doz

care produce hemoliz complet.

TuburiMartori

hemolizComplement

1/100 (ml)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 H0 H100

0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11 0,12 0,13 0,14 0,15 0,16 0 0,400

Tampon

veronal (ml)0,36 0,35 0,34 0,33 0,32 0,31 0,30 0,29 0,28 0,27 0,26 0,25 0,24 0,400 0

Antigen diluat

(1 unitate) (ml)0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20

Se agit tuburile i se incubeaz pe baie de ap la 37C, 30 minute

Sistem

hemolitic0,40

0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40

Se agit tuburile i se incubeaz pe baie de ap la 37

C, 30 minute

Prepararea sistemului hemolitic se realizeaz prin amestecul n pri egale de hemolizin isuspensie 2,5% eritrocite de berbec.

Inactivarea serurilor de cercetat i a martorilor:

Nediluate 30 minute la baie marin la 6020C

Diluate - 50 minute la baie marin la 5820C (sau n funcie de specie)

Condiiile de inactivare a serurilor sanguine ale unor specii de animalexSpecia Timpul (min.) Temperatura (

C)

Taurine, iepure, cobai, porumbel 30 56Ovine-caprine 60-75 60Ecvine 30 62Suine 30-45 60Cine 30 (20) 60-65

Diluarea serurilor de cercetat i a martorilor

se ulilizeaz diluia (50l ser de testat + 150 l tampon veronal), apoi se inactiveaz.

Desfurarea reaciei:

Diluia

serului 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512

M

AcMC1 MC2 MC3 MC4

M

SH

M

Ag

Ser diluat

(l)25 25 25 25 25 25 25 25 25 - - - - - -

Antigen (l) 25 25 25 25 25 25 25 25 - 25 25 25 25 - 25Complement

(l)25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 - 25

Tampon

veronal (l)- - - - - - - - 25 25 25 25 25 75 25

Se agit placa, se acoper i se incubeaz peste noapte la 4

C

SH (l) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

Se agit placa, se acoper i se incubeaz la 37C, 30 minute

Validarea, citirea i interpretarea rezultatelor

Se centrifugheaz placa la 1600 rpm timp de 5 minute pentru a sedimenta rapid hematiile nelizaten timpul reaciei i interpretarea gradului de hemoliz.Validarea:

martor atg hemoliz 100%


5/5


5

martor SH 0% hemolizmartor negativ - hemoliz 100%martor pozitiv titru specificat de productor

Interpretarea:

Diluia de serGradul de reinere al hemolizei

25% (+) 50% (++) 75% (+++) 100% (++++)

8,3 10 11,6 13,3

16,6 20 23,3 26,6

1/8 33,3 40 46,6 53,3

1/16 66,6 80 93,3 107

1/32 133 160 187 213

1/64 266 320 373 426

1/128 532 640 746 852

1/256 1065 1280 1492 1705

Un rezultat mai mare sau egal cu 20 este considerat pozitiv.

lp 9 imuno.pdf

Documents