Download - lp 9 imuno.pdf
-
7/25/2019 lp 9 imuno.pdf
1/5
LABORATOR NR. 9 [IMUNOLOGIE I IMUNOPATOLOGIE, ANUL III, MV ]
1
REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI
Micro R.F.C.
Reacia de fixare a complementului este utilizatca i test de confirmare n diagnosticul bolilor
infecioase bacteriene sau parazitare, la diferite specii de animale i la om. Micro-RFCul este o metodcare permite utilizarea unor cantiti mult mai mici de reactivi, comparatic cu RFC-ul realizat n eprubete.
Principiul metodei
Reacia se bazeaz pe proprietatea complementului de a se fixa numai pe anticorpii
sensibilizai din complexele de tip antigen-anticorp. Complexele imune fixeaz ireversibilcomplementul. Deoarece reaciile pozitive nu pot fi vizualizate dac interacioneaz doar un antigen cuanticorpii din serul de testat n prezena complementului, este necesar utilizarea unui revelator subforma unui sistem hemolitic preparat din eritrocite de berbec i ser hemolitic anti-oaie. n concluzie,reacia presupune utilizarea a 2 complexe de tip antigen anticorp (din care doar u nul este sigur prezent)i complementul (alexina) care se va fixa pe unul din cele 2.
Materialele necesare
Antigene preparate i standardizate (n stare lichid sau liofilizate) care se dilueaz conformintruciunilor productorului.
Ser de cercetat
Complement de cobai (alexin)liofilizat sau congelat la -400Co Din cauza labilitii accentuate a complementului, acesta trebuie titrat la fiecare utilizare
n RFC.
Eritrocite de berbecdiluate 2,5 % n tampon veronal
Ser hemoliticser de iepure cu anticorpi anti-hematie de berbec (hemolizin)o se dilueaz n funcie de titru
o n reacie se utilizeaz 2UH
Ser de control pozitiv omologat (cu titru cunoscut i etalonat)
Ser de control negativ omologat
Soluie fiziologic(diliuant) 0,85% clorur de sodiu, pH 7,0-7,2.
Materiale supuse examinrii- probe de ser sanguin fr urme de hemoliz sau de contaminarebacterien sau fungic i fr eritrocite n suspensie, n volum de 100-500 l.
Reacia propriu - zis:1. Serurile de cercetat (suspecte), n care se suspicioneaz prezena unor anticorpi specifici, precum
i serurile martor se trateaz termic, 30 minute la temperaturi cuprinse ntre 56-60C, pentruinactivarea complementului propriu;
2. serul de testat inactivat se pune n contact cu o suspensie de antigen corespunztor anticorpilorsuspicionai;
3. se adaug o anumitcantitate de complement (ser de cobai);4. se incubeaz la termostat sau pe baie de ap pentru a se forma complexele antigen anticorp;5. se adaug sistemul indicator (revelator) al reaciei - sistemul hemolitic format din hematii de oaie
(atg) i ser hemolitic anti- hematii de oaie (atc);6. se incubeaz la termostat sau pe baie de ap7. se interpreteaz rezultatele.
-
7/25/2019 lp 9 imuno.pdf
2/5
LABORATOR NR. 9 [IMUNOLOGIE I IMUNOPATOLOGIE, ANUL III, MV ]
2
n cazul n care n serul de cercetat exist anticorpii specifici suspectai (Reacie +),complementul se va fixa pe anticorpii sensibilizai din complexele imune microbiene i nu va mai fidisponibil a se fixa de alte complexe atg/ atc prezenten sistemul de reacie (sistemul hemolitic).
Fixarea complementului pe complexele imune este urmat de liza celulelor bacteriene, n timp cehematiile din sistemul hemolitic rmn integre.
n concluzie, n reacia pozitiv, hemoliza este absent.
n cazul n care n serul de cercetat nu exist anticorpii specifici suspectai (Reacie -), nprima etap nu se formeaz complexe imune. Complementul, adugat tot n prima etap, va rmne liber
i se va fixa pe anticorpii sensibilizai sistemul hemolitic.Fixarea complementului pe aceste complexele imune este urmat de liza hematiilor.n concluzie, n reacia negativ, hemoliza esteprezent.
Interpretarea rezultatelor:
Reacie pozitiv
4 lips complet a hemolizei3 hemoliz(25%)
Reacie dubioas
2 hemoliz(50%)1 hemoliz(75%)
Reacie negativ
- hemoliz complet(100%)
-
7/25/2019 lp 9 imuno.pdf
3/5
LABORATOR NR. 9 [IMUNOLOGIE I IMUNOPATOLOGIE, ANUL III, MV ]
3
-
7/25/2019 lp 9 imuno.pdf
4/5
LABORATOR NR. 9 [IMUNOLOGIE I IMUNOPATOLOGIE, ANUL III, MV ]
4
Modul de lucru bruceloz
Titrarea complementuluise efectueaz n tuburi cu fundul n U cu volum de 4 ml.Titrul complementului (unitatea exact de complement) este reprezentat de cea mai mic doz
care produce hemoliz complet.
TuburiMartori
hemolizComplement
1/100 (ml)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 H0 H100
0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11 0,12 0,13 0,14 0,15 0,16 0 0,400
Tampon
veronal (ml)0,36 0,35 0,34 0,33 0,32 0,31 0,30 0,29 0,28 0,27 0,26 0,25 0,24 0,400 0
Antigen diluat
(1 unitate) (ml)0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Se agit tuburile i se incubeaz pe baie de ap la 37C, 30 minute
Sistem
hemolitic0,40
0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40
Se agit tuburile i se incubeaz pe baie de ap la 37
C, 30 minute
Prepararea sistemului hemolitic se realizeaz prin amestecul n pri egale de hemolizin isuspensie 2,5% eritrocite de berbec.
Inactivarea serurilor de cercetat i a martorilor:
Nediluate 30 minute la baie marin la 6020C
Diluate - 50 minute la baie marin la 5820C (sau n funcie de specie)
Condiiile de inactivare a serurilor sanguine ale unor specii de animalexSpecia Timpul (min.) Temperatura (
C)
Taurine, iepure, cobai, porumbel 30 56Ovine-caprine 60-75 60Ecvine 30 62Suine 30-45 60Cine 30 (20) 60-65
Diluarea serurilor de cercetat i a martorilor
se ulilizeaz diluia (50l ser de testat + 150 l tampon veronal), apoi se inactiveaz.
Desfurarea reaciei:
Diluia
serului 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
M
AcMC1 MC2 MC3 MC4
M
SH
M
Ag
Ser diluat
(l)25 25 25 25 25 25 25 25 25 - - - - - -
Antigen (l) 25 25 25 25 25 25 25 25 - 25 25 25 25 - 25Complement
(l)25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 - 25
Tampon
veronal (l)- - - - - - - - 25 25 25 25 25 75 25
Se agit placa, se acoper i se incubeaz peste noapte la 4
C
SH (l) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Se agit placa, se acoper i se incubeaz la 37C, 30 minute
Validarea, citirea i interpretarea rezultatelor
Se centrifugheaz placa la 1600 rpm timp de 5 minute pentru a sedimenta rapid hematiile nelizaten timpul reaciei i interpretarea gradului de hemoliz.Validarea:
martor atg hemoliz 100%
-
7/25/2019 lp 9 imuno.pdf
5/5
LABORATOR NR. 9 [IMUNOLOGIE I IMUNOPATOLOGIE, ANUL III, MV ]
5
martor SH 0% hemolizmartor negativ - hemoliz 100%martor pozitiv titru specificat de productor
Interpretarea:
Diluia de serGradul de reinere al hemolizei
25% (+) 50% (++) 75% (+++) 100% (++++)
8,3 10 11,6 13,3
16,6 20 23,3 26,6
1/8 33,3 40 46,6 53,3
1/16 66,6 80 93,3 107
1/32 133 160 187 213
1/64 266 320 373 426
1/128 532 640 746 852
1/256 1065 1280 1492 1705
Un rezultat mai mare sau egal cu 20 este considerat pozitiv.