CAPITOLUL 1

CUPRINS

INTRODUCERE......................................................................................................2

1.CROMOSOMII - STRUCTUR I FUNCII.....................................................3

1.1.Genomul eucariot........................................................................................................4

1.2.Morfologia cromosomilor eucariotelor.......................................................................6

1.3.Tipuri de cromatin.....................................................................................................10

1.4.Compoziia i organizarea molecular a cromosomilor eucariotelor..........................13

1.5.Organizarea molecular a fibrei de cromatin............................................................15

1.6.Tipuri particulare de cromosomi.................................................................................18

2.DIVIZIUNEA MITOTIC I CICLUL CELULAR...........................................23

2.1.Definiie......................................................................................................................23

2.2.Descrierea fazelor ciclului celular...............................................................................24

3.MUTAGENEZA INDUS......................................................................................36

3.1.Agenii mutageni.........................................................................................................36

3.1.1.Agenii mutageni fizici...............................................................................................36

3.1.2.Agenii mutageni chimici............................................................................................37

3.1.3.Agenii mutageni biologici..........................................................................................38

3.2.Clasificarea mutaiilor.................................................................................................39

3.2.1.Mutaiile genice...........................................................................................................40

3.2.2.Mutaiile genomice......................................................................................................41

3.2.3.Mutaiile cromosomiale (aberaiile sau restructurrile cromosomiale).......................42

4.RADIAIILE MAGNETICE CA AGENT MUTAGEN.....................................45

4.1.Interaciunea radiaiilor magnetice cu sistemele vii....................................................45

4.2.Efectele biologice ale radiaiilor magnetice................................................................49

4.3.Magneii de tip Neodymium.......................................................................................52

5.MATERIAL I METODE DE LUCRU................................................................54

5.1.Materialul biologic - specia aleas..............................................................................54

5.2.Modul de lucru - aplicarea tratamentelor cu radiaii magnetice, testul de cretere al plantulelor, evidenierea cromosomilor n diviziune...................................................56

6.REZULTATE I DISCUII...................................................................................63

6.1.Frecvena celulelor n diviziune i distribuia pe faze de diviziune mitotic..............63

6.2.Frecvena aberaiilor cromosomiale n ana-telofaza mitozei......................................71

CONCLUZII.............................................................................................................74

BIBLIOGRAFIE......................................................................................................75

INTRODUCERE Aceast lucrare de licen are drept obiectiv investigarea i observarea efectelor morfologice i funcionale induse de radiaiile magnetice asupra organismului vegetal. Natura nonmagnetic a membranelor, celulelor i a esuturilor permite penetrarea cmpurilor magnetice cu o atenuare neglijabil i aciunea direct la diferite nivele ale structurilor i proceselor celulare. Rspunsul biologic n prezena cmpurilor magnetice este susinut ns de o larg baz de date experimentale i epidemiologice i este caracterizat prin curbe nelineare doz-rspuns, cu eficien semnificativ n intervale de amplitudine i sau frecven, definite prin ferestre de amplitudine i ferestre de frecvene. Ferestrele biologice pentru cmpurile magnetice sunt puse n eviden la diferite nivele de organizare structural sau la nivel funcional. Datele experimentale sunt prezentate n partea a doua, a acestei lucrri.

Lucrarea este alctuit din dou pri (partea toretic i partea practic) i prezint ase capitole. n partea teoretic am redactat informaiile teoretice necesare acestui studiu de licen, deoarece fr o baz toeretic nu poate exista ceva practic. Partea teoretic prezint patru capitole.

n primul capitol este vorba despre cromozomi, elemente dinamice i constante ale celulei, despre structura i morfologia acestora i despre rolul lor n organismele vii.

n cel de-al doilea capitol discutm despre diviziunea celular i fazele prin care trece un organism pentru a se divide. Capitolul trei conine informaii referitoare la agenii mutageni precum i informaii despre mutaii, despre modul n care ele ajung n organisme i despre modul n care acioneaz fa de acesta.

Capitolul patru este ocupat de radiaiile magnetice i de efectele lor asupra organismelor vii. ncepnd cu capitolul cinci v prezint partea practic, ce conine materialul (Triticum aestivum) i metodele folosite pentru realizarea experimentului, iar ultimul capitol, ase este ocupat de discuiile i concluziile referitoare la aceast lucrare.

Partea practic are ca scop observarea acestor efecte citogenetice induse de radiaiile magnetice prin realizarea unui experiment concret asupra unui organism vegetal, n cazul meu asupra speciei Triticum aestivum (grul).

1. CROMOZOMII - STRUCTUR I FUNCIIWaldeyer, n 1888, a introdus pentru prima dat n tiin noiunea de cromosom desemnnd prin aceasta un corpuscul colorat, vizibil n cursul diviziunii celulare. Prin elaborarea teoriei cromosomiale a ereditii, cunotinele despre cromosomi s-au mbuntit foarte mult. Astfel, se descoper faptul c cromozomii sunt structuri permanente n nucleul celulei, c sunt n numr relativ constant pentru fiecare specie de organisme, c exist un ciclu cromosomial n care alterneaz faza haploid (n) cu cea diploid (2n); faptul c cromozomii sunt suportul material al genelor, c genele sunt dispuse n ordine linear pe cromosomi i se transmit linkate, odat cu cromozomii n descenden celular i de la parini la descendeni; c cromozomii se pot recombina n diviziunea reducional, prin disjuncia lor independent, la formarea gameilor (recombinarea intercromosomial) i n acelai timp are loc i schimbul reciproc de gene ntre cromozomii omologi (prin recombinarea intracromosomial sau crossing-over).Prin apariia geneticii moleculare, cunotinele despre cromosomi s-au aprofundat, pn la stadiul structurii lor la nivel molecular i lmurirea mai exact a funciilor lor. Noiunea de cromosom, odat cu apariia geneticii moleculare s-a extins de la organismele eucariote i la cele procariote.

Deosebirea fundamental ntre procariote i eucariote, n ceea ce privete cromozomii, const n aceea c procariotele (viroizii, virusurile, bacteriile i algele albastre) au un singur cromosom, care este alctuit dintr-o singur macromolecul de ADN (n cazul dezoxiribovirusurilor) sau ARN (n cazul ribovirusurilor), inclus n citoplasma celular, n timp ce la organismele eucariote (toate plantele i animalele, inclusiv formele inferioare) exist mai muli cromosomi (minim 2 i maximum cteva sute). La eucariote, cromozomii sunt alctuii din ADN, ARN, proteine histonice i nonhistonice, lipide, ioni de Mg++ i Ca++.Cromozomii eucariotelor sunt inclui n nucleul celular care este separat de citoplasm printr-o membran nuclear. La eucariote cantitatea de ADN este mult mai mare n comparaie cu procariotele (de exemplu, cantitatea de ADN din cromozomii unei celule de mamifere este de circa 1000 ori mai mare dect cea de la bacterii) (Tudose I. Gh., 1992).1.1. Genomul eucariot

Genomul reprezint ntreaga cantitate de informaie genetic prezent ntr-o celul. La eucariote, materialul genetic, ca i carioplasma, n care exist n mod constant unul sau mai muli nucleoli, organit nuclear caracteristic eucariotelor, sunt delimitate de citoplasm printr-un nveli nuclear, dublu membranar, prevzut cu pori. Aadar, n celula eucariot se delimiteaz un spaiu genetic, spaiul nuclear.

Genomul eucariotelor prezint o organizare mult mai complex, fiind constituit din mai muli cromosomi (genofori, grupe de linkage).

Numrul cromozomilor este variabil printre eucariote, dar niciodat nu exist unul singur. Cantitatea de ADN este mult superioar, existnd n general o corelaie pozitiv ntre gradul de evoluie i coninutul de ADN al speciilor. Moleculele de ADN sunt lineare, dublu-catenare, helicale, permanent complexate cu proteinele histonice, formnd fibra nucleohistonic (fibra nucleozomal) de cca. 10 nm grosime. n constituia cromatinei pe lng cele dou componente de baz mai intr proteinele nehistonice, ARN, ioni de Ca2+, de Mg2+, fosfolipide .a.Cromatina se structuralizeaz ciclic, facilitnd distribuia echilibrat a informaiei genetice parentale n celulele fiice i se decondenseaz, stare necesar pentru realizarea funciilor auto- i heterocatalitice. ADN nuclear se caracterizeaz printr-un nalt grad de redundan; conine gene repetate i secvene mediu i nalt repetate, non-informaionale, dispuse n tandem. W. Gilbert (1978) a descoperit existena unor secvene nucleotidice intercalate n genele eucariotelor, care nu se exprim n produsul final, numite introni. Aceast discontinuitate n secvenele codificatoare a primit denumirea de discontinuitate genic, ceea ce constituie o alt nsuire proprie eucariotelor.Replicarea cromozomului eucariot se realizeaz ciclic, numai n perioada S a interfazei mitotice i premeiotice (deci discontinuu), este iniiat simultan din mai multe puncte ale sale i este de tip semiconservativ.Segmentele de inserie au fost semnalate i la unele eucariote, funciile lor fiind similare cu cele de la procariote.

La eucariote, pe lng genomul nuclear (format din setul de cromozomi prezeni n nucleul celulei) mai exist cel plastidial, mitocondrial i centriolar. Prin urmare celula eucariot are o organizare multigenomic, coninnd mai multe sisteme genetice, fiecare localizat ntr-o structur celular. Fenotipul celular este expresia sumei acestor sisteme genetice, fiecare asociat cu un mecanism propriu de replicare, transcriere i traducere, ale cror elemente sunt n bun parte specifice fiecrui sistem.Diviziunea celulelor eucariote somatice se realizeaz, de regul, prin mitoz, proces ciclic n cadrul cruia se succed, cu regularitate, fenomenele replicative i distributive. n cadrul perioadei mitotice (de diviziune propriu-zis), cromosomii trec prin etape succesive de spiralizare (condensare), iar clivarea cromosomilor (separarea cromatidelor) i distribuia echilibrat a produilor de replicaie n celulele fiice, se realizeaz prin intermediul aparatului mitotic, structur caracteristic celulelor eucariote.

Pentru organismele eucariote este caracteristic, de asemenea, reproducerea sexuat n urma fuziunii gametice rezult celula ou (zigotul) care reface condiia diploid; starea haploid este indus de meioz fenomen care la animale are loc, de regul, n gametange, la formarea gameilor, iar la plante mai adesea n sporange, la formarea sporilor, mai rar n gametange sau la germinarea zigotului. Aadar procesul sexual domin biologia eucariotelor, n cadrul cruia se realizeaz recombinarea genetic care va amplifica gama de variabilitate a organismelor.

S. Smith (1978) consider c diploidia este rezultatul seleciei K,, care a dus la creterea cantitii de ADN; consecinele genetice ale ciclului de via, parial sau preponderent diploid, sunt majore, n sensul, c la organismele haploide, orice mutant mai puin eficient va fi repede eliminat, n timp ce n organismele diploide va supravieui dac este recesiv sau chiar codominant. Uneori aceste gene conservante de organismele diploide pot deveni avantajoase n anumite condiii (Anghel I., Toma N., 1987).La nivelul genomului reglajul genetic se realizeaz prin aceea c gena nu funcioneaz singur, ci este dependent de mediul n care acioneaz; prin interaciuni multiple i complexe ntre toate genele genomului, ntre gene, cromosomi, citoplasma celular, organismul luat ca ntreg, precum i ntre organism i mediul su de via.De exemplu, la un organism animal toate celulele au, de regul, aceeai structur genetic, acelai genotip; dar, cu toate acestea, celulele se difereniaz n celule epidermice, sanguine, musculare, nervoase, hepatice etc. Aceast difereniere celular se realizeaz prin reglajul genetic la nivelul ntregului genom, prin interaciuni multiple i complexe ntre gene, cromosomi i citoplasma celular. Ca urmare, n unele celule sunt activate anumite gene, aceste celule devenind celule specializate cu anumite structuri i funcii. Mai simplu, n celula nervoas funcionez genele necesare structurii i funciei acestei celule, fiind represate genele pentru o celul hepatic, sanguin etc. (Tudose I. Gh., 1992).1.2. Morfologia cromosomilor eucariotelor

Studiul diviziunii celulare indirect (Francis, Dudith i Inz, 1997, citat de Bra I., Cmpeanu M., 2003) a evideniat att existena ct i comportamentul cromosomilor. Cromozomii au fost denumii astfel, n 1888, de ctre W. Waldeyer i, apoi, au fost identificai ca purttori (substrat) ai informaiei ereditare.Morfologia cromosomilor este variabil, att n funcie de faza din ciclul diviziunii celulare, ct i n funcie de specia la care aparin indivizii (plante sau animale) analizai. nc o precizare, extrem de important, este aceea n comparaie cu cei ai procariotelor. Organizarea tridimensional a cromosomilor n nucleul celular a reprezentat un subiect de interes, pentru biologi, de peste 100 de ani. Imediat dup descoperirea cromosomilor, Rabl (1885), i Boveri (1887), au demonstrat c n interfaz acetia ocup o poziie specific n interiorul nucleului. O alt aseriune, n conformitate cu care poziia braelor cromosomiale i a regiunii centromerice sunt strict delimitate, a fost verificat de Cremer i colab. (1982), Hilliker i Apples (1989) etc., care au confirmat c poziia cromosomilor din telofaz este pstrat n interfaz.

n interfaz, cromozomii celulelor somatice normale sunt invizibili la microscopul optic, deoarece au o extensie maxim, care le confer, un aspect filiform. Sunt alctuii din dou filamente paralele, alipite, numite cromatide.Examinate la microscopul optic, cromatidele etaleaz o structur helicoidal. O rotaie a helixului alctuiete un gir. Girii determin o suprapunere, n spaiu, a spirelor i, ca o consecin, o suprapunere de material cromatic. De aceea, cnd sunt privite dintr-o direcie, cromatidele dau impresia c sunt alctuite dintr-o succesiune de granule, numite cromomere. De aici s-a pornit o mare confuzie i anume: un timp s-a considerat c cromomerele reprezint o materializare a genelor. n consecin, cromatidele erau considerate ca fiind alctuite din uniti discrete cromomerele numite (la acea dat) i gene avnd, deci, o structur discontinu. Probe de ordin electronografic i genetic au dovedit c structura cromatidelor este continu. Cele dou cromatide ce alctuiesc cromosomul se numesc cromatide surori. Ele se unesc ntr-un singur punct al cromosomului. Din cauza diametrului inferior celui al cromosomului, centromerul realizeaz constricia cromozomial primar. La eucariote, centromerul nu se coloreaz cu colorani bazici. Poziia acestuia n cromosom este variabil, mprind cromosomul n dou brae. n funcie de lungimea real a braelor i apoi, a raportului dintre ele, se stabilete tipul cromosomului.

Dac centromerul este situat exact n centrul cromosomului, delimitnd dou brae perfect egale (raportul dintre brae r fiind 1), cromosomul este metacentric (prescurtat se noteaz cu M). Cnd centromerul mparte cromosomul n dou brae inegale, cu r avnd valori cuprinse ntre 1 1,7, cromosomul este median (m), iar cnd r are valori cuprinse ntre 1,7 3, cromosomul este submedian (sm). Cnd raportul braelor este cuprins ntre 3 7, cromosomul este subtelocentric (st), iar cnd raportul este mai mare dect 7 (r > 7), cromosomul este elocentric (T). n ceea ce privete poziia terminal a centromerului (adic n ceea ce privete posibilitatea existenei cromosomilor telocentrici) prerile sunt contradictorii. Unii autori afirm c centromerul nu se poate gsi niciodat n poziie terminal, n timp ce ali autori admit aceast posibilitate (Figura 1).Se cunosc, de asemenea, mai multe ipoteze explicative i de modelare a structurii moleculare a cromatidei. Orice ipotez, orice model molecular, trebuie s satisfac urmtoarele cerine:

cromatida s fie format din dou subuniti care s-i asigure posibilitatea de a se replica semiconservativ;

cromatida s acioneze ca o singur unitate, n schimburi reciproce de material genetic.

Cromozomii reprezint un caracter de diagnoz, de delimitare a speciei asemenea oricrui alt caracter de natur morfo-anatomic, fiziologo-biochimic, fenologic sau reproductiv. n acest sens, trebuie precizat c cromozomii fiecrei specii eucariote, de plante sau de animale, au particulariti morfologice i numerice caracteristice speciei.

Figura 1. Tipurile de cromosom - cromosom M (metacentric); 2 - cromosom m (median); 3 - cromosom sm (submedian); 4 - cromosom st (subterminal = subtelocentric); 5 - cromosom T (telocentric). Prin culoarea gri a coloanei se red zona n care se poate gsi centromerul. Desigur, braul de sus se scurteaz cu poriunea cu care se alungete cel de jos, n aa fel nct raportul dintre ele s se situeze ntre limitele precizate anterior (dup Bra I., 1999).Pe lng constricia primar, determinat a poziiei centromerului, cromozomii au i constricii secundare, cu rol n formarea nucleolului, fapt pentru care au primit i denumirea de organizatori nucleolari. Uneori, cromozomii au la unul din capete o constricie secundar prin care se delimiteaz un segment numit satelit (trabant). Asemenea cromozomii se ntlnesc la speciile Secale cereale (2n=14 cromozomii perechii a VII-a), i Zea mays (cromozomii perechii a VI-a).

Numrul nucleolilor dintr-un nucleu este egal cu numrul cromosomilor cu satelit. Cele dou specii menionate mai sus au, deci, cte doi nucleoli n nucleu.

Centromerul are rolul de a fixa cromosomul pe fibra fusului acromatic, n timpul diviziunii celulare. Prin diviziunea sa, care precede diviziunea cromosomului i separarea cromatidelor, n mitoz sau n cea de a doua diviziune meiotic, se asigur partiia cromosomului din cele dou cromatide surori. n cazurile n care, din diverse motive, cromosomul se rupe, fragmentele fr centromer (numite acentrice) nu se pot reface i se resorb.Un fragment acentric se pstreaz doar atunci cnd se ataeaz de un cromosom cu centromer. Sunt ns i cazuri (coccidii, scorpioni, specii de Luzula) n care unii cromosomi, extrem de scuri, ndeplinesc funcii centromerice n totalitate sau pe mare parte din lungimea lor. De fapt aceti cromosomi au centromerul difuz i poart denumirea de cromosomi policentrici. Ei sunt api, ns, de a se fixa pe toat lungimea lor de fibrele fusului acromatic.La capetele cromosomilor exist o zon (o poriune) care le mpiedic unirea. Respectiva poriune poart numele de telomer (telomere). Dincolo de rolul de a mpiedica unirea cromosomilor prin capetele lor, telomerele au acidul dezoxiribonucleic super condensat (super rsucit). S-a constatat c, la diverse specii, lungimea telomerelor este foarte diferit i c numrul de diviziuni succesive ale unei celule este n relaie de direct proporionalitate cu lungimea telomerelor. De pild, telomerele cromosomilor de cine sunt mai scurte dect ale omului, iar ale acestuia sunt mai scurte dect ale broatei estoase. Longevitatea medie, pe de alt parte, este de 20 30 de ani la cine, 70 80 ani la om i de aproximativ 300 ani la broasca estoas. Pe de alt parte, cu fiecare diviziune celular, lungimea telomerelor scade (fenomen complet explicat, prin procesul autoreplicrii semiconservative a acidului dezoxiribonucleic, autoreplicare n care una dintre catene rmne mereu n urm i nu reuete s se autoreplice complet). Cnd, n succesiunea de diviziuni, telomerul dispare, cromosomul se autolizeaz, celulele se distrug, individul piere.Schematic, deci, un cromosom apare astfel: telomer, satelit, constricie secundar, bra scurt, centromer (constricie primar), bra lung, telomer (Figura 2). Fiecare bra este alctuit din dou cromatide, fiecare cromatid coninnd dou cromoneme. Regiunea cromosomial din vecintatea centromerului poart numele de regiune proximal, iar cea de la capetele braelor poart numele de regiune distal. Aa cum am precizat anterior, cromomerele sunt, de fapt, nite artefacte.Precizam anterior c tipul cromozomilor reprezint un caracter de diagnoz, o caracteristic a speciei. Fr a contrazice aceast afirmaie, se cuvine precizat c tipul (forma) cromosomilor poate varia ntre anumite limite, n funie de specializarea i starea fiziologic a celulei. Uneori, n cadrul aceluiai individ, se constat i o variabilitate numeric a cromosomilor, tot n corelaie cu structura i funciile anumitor esuturi.

De regul, cel mai propice stadiu pentru investigarea numrului i tipului cromosomilor l reprezint metafaza diviziunii mitotice. Puternic spiralizai, ataai de fibrele fusului n zona ecuatorial, n aceast faz cromozomii etaleaz conformaia lor specific, form caracteristic speciei creia i aparine individul (pot avea form de bastona sau forma literelor V, J, I, O etc.) (Bra I., Cmpeanu M., 2003).

Fig. 2. Reprezentarea schematic a morfologiei i organizrii cromosomului la eucariote (dup Tudose I. Gh., 1992). 1.3. Tipuri de cromatinCromosomii, n lungimea lor, nu sunt identici din punct de vedere fizic, chimic i genetic. Prin fixare i colorare cu colorani bazici, diferitele segmente (raioane) ale cromosomului, sau chiar unii cromozomi n ntregime, dau o reacie diferit. Unele segmente se coloreaz intens numite heterocromatice, iar altele se coloreaz slab acestea se numesc eucromatice. Segmentele heterocromatice nu conin gene i sunt inerte din punct de vedere genetic, pe cnd segmentele eucromatice conin gene i sunt active din punct de vedere genetic. Introducerea artificial a segmentelor eucromatice n segmentele inerte genetic ale cromosomilor determin schimbri ale manifestrii genelor existente n ele. Segmentele hetero i eucromatice au nsuiri genetice diferite.n 1928, Heitz a clasificat materialul cromosomial n dou categorii:

1. Eucromatina materialul unor cromosomi sau regiuni cromosomiale izopicnotice, care n cursul diziunii celulare prezint un proces tipic, normal, de condensare i spiralizare, precum i o capacitate normal de colorare. Eucromatina se clasific n: eucromatin activ, care conine gene ce se trascriu; eucromatin permisiv, care este reprezentat de acea poriune de eucromatin ce nu devine activ dect dup acceptarea (permisiunea) unor semnale biochimice specifice (exemplu inducia hormonal).

Eucromatina, n cursul mitozei, se condenseaz dnd natere la morfologia caracteristic cromozomilor din metafaza mitozei. Ea prezint un ciclu de condensare i de decondensare n cursul diviziunii celulare, identic cu cel al cromosomilor. Replicaia ADN-ului n faza S a ciclului celular ncepe n comparaie cu heterocromatina (Tudose I. Gh., 1992).

2. Heterocromatina materialul unor cromozomi sau regiuni cromozomiale heteropicnotice, care are o structur dens, compact n telofaz, interfaz i profaza timpurie; se coloreaz mai intens i este vizibil i n nucleele interfazice.Segmentele heterocromatice sunt rspndite pe toat lungimea cromosomului, dar mai fregvent sunt dispuse n jurul centromerului, formnd heterocromatina centromeric, sau la capetele cromosomilor i n apropierea regiunii organizatoriilor nucleolari. n aceste segmente mai frecvent au loc rupturile, n comparaie cu segmentele eucromatice sau la limita dintre ele. Heterocromatina intr n alctuirea cromosomilor sexuali i a cromosomilor suplimentari (cromosomii B), care se ntlnesc la unele specii. Aceti cromosomi i de asemenea, segmentele heterocromatice ale cromosomilor obinuii, n timpul ntregului ciclu celular i n mod special n interfaz, pot s se afle n stare condensat. La broatele estoase sau la viermi, n aceast stare se poate afla ntregul set cromozomial (Tudose I. Gh., 1992).Principalele nsuiri prin care se deosebesc cele dou substane sunt:

Capacitatea de colorare. Eucromatina prezint o capacitate de colorare normal, doar n timpul diviziunii celulei, n timp ce heterocromatina se coloreaz mai intens i este vizibil i n nucleii interfazici sub denumirea de cromocentri. Gradul de condensare. Eucromatina nu este condensat n interfaz spre deosebire de heterocromatin care rmne condensat, constituind un caz particular de mpachetare i condensare difereniat a cromozomului.

Timpul de replicare. Eucromatina se replic la nceputul perioadei de sintez S, iar heterocromatina are comportare alociclic, se replic mai tardiv. Componena de secvene ADN. Eucromatina conine secvene de ADN unice, iar heterocromatina este format din ADN nalt repetitiv.La Drosophila melanogaster, autosomii i cromosomul X prezint zone heterocromatice extinse, iar cromosomul Y este n ntregime heterocromatic. Drosophila hydei are ntregul cromosom Y i un bra din cromosomul X (cromosom metacentric) heterocromatinizai. n cromosomii uriai din glandele salivare, heterocromatina i centromerii autosomilor, mpreun cu cromosomul X, formeaz un cromocentru.Uneori fragmentele de cromatin se asociaz i formeaz ansamble mai mari, cromocentri, ce apar sub forma unor aglomerri amorfe, n care pot fi uor identificate fragmentele ce intr n componena lor. n fapt, segmentele heterocromatice se gsesc ntr-o stare de hiperspiralizare.Replicarea ADN-ului, n zonele eucromatice i heterocromatice, se desfuar asincron.

n ceea ce privete heterocromatina, ns, apar i unele aspecte deosebit de interesante. De pild, n stadiile timpurii de dezvoltare embrionar, heterocromatina lipsete. Deci, ca o concluzie fireasc, se poate accepta c ea nu se transmite de la o generaie la alta, ci se formeaz ntr-un anumit stadiu al ontogeniei. Dup ultimele observaii i experimente, se pare c orice regiune a cromosomului poate deveni, la un moment dat, heterocromatin. n consecin, heterocromatina i eucromatina trebuiesc privite nu ca uniti distincte i discontinue ale cromosomilor, ci stri ale cromatinei, dinamice att n timp ct i n spaiu.

Sunt i autori care consider c exist o heterocromatin nativ, reprezentat prin segmente cromosomiale heterocromatinizate, nc de la naterea organismului i o heterocromatin funcional, care se individualizeaz temporar.O alt clasificare a tipurilor de heterocromatin a fost propus de Brown, n 1965. n conformitate cu aceast clasificare, heterocromatina poate fi constitutiv i facultativ (Bra I., Cmpeanu M., 2003). Heterocromatina constitutiv cromatina care apare mai intens colorat dect eucromatina (heteropicnoza pozitiv) sau colorate mai puin intens dect eucromatina (heteropicnoza negativ) indiferent de starea sau dezvoltarea fiziologic. Un exemplu este satelitul ADN-ului din regiunile centromerice (Figura 3).

Figura 3. Heterocromatina constitutiv: zonele din apropierea centromerilor.(http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Cromoeuc/swan5.jpg) Heterocromatina facultativ cromatina care apare mult mai intens colorat dect eucromatina sau mai puin intens colorat dect eucromatina n funcie de starea fiziologic sau de perioada de dezvoltare. Cromosomul X la unele specii de animale cum ar fi la lcusta (Schistocerca gregaria) ce apare mult mai intens colorat dect restul cromosomilor n timpul profazei I a meiozei (Figura 4) (Lewin B., 1996).

Figura 4. Schistocerca gregaria: heteropicnoza pozitiv a cromosomului X. (http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Cromoeuc/swan4.jpg)Corpusculul Barr (cromatina sexual) din nucleii interfazici ai celulelor de la femelele mamiferelor reprezint unul din cromozomii X heterocromatizai. Fenomenul se numete compensare de doz (Ti I., 1994).

La om toi cromsomii X care sunt n plus cu unul apar mai intens colorai dect restul cromosomilor (heteropicnoza pozitiv) n nucleul celulelor n interfaz. Prin urmare, femeile normale care au doi cromosomi X, au unul din cromosomii X mai intens colorat i care este inactivat. Cu toate acestea, pe parcursul primelor etape ale dezvoltrii embrionare (n primele 16 zile de gestaie la om) ambii cromosomi X sunt inactivi (Figura 5).

Figura 5. Interfaz: cromatina sezual cromozomul X la femei este inactiv (corpuscul Barr).(http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Cromoeuc/mujer.jpg)(http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Cromoeuc/varon.jpg)Diferenele n secvene: n unele eucariote, ADN-ul satelit sau ADN-ul minoritar care prezint un coninut n G + C diferit de ADN-ul principal sau majoritar, este constituit din segvene scurte de ADN care se repet de milioane de ori. n special la oareci s-a demonstrat c ADN-ul cu satelit este localizat n regiunea centromeric, acest ADN satelit fiind un exemplu de heterocromatin constitutiv a crei prezen i aciune sunt constante n cromosomi (Lewin B., 2001).1.4. Compoziia i organizarea molecular a cromosomilor eucariotelorn structura chimic a cromozomului eucariotic, respectiv a cromatinei, intr patru tipuri principale de molecule: ADN (13 16%), ARN (12 13%), proteine histonice i nonhistonice (68 72%). Pe lang acestea n structura acestor cromozomi mai intr mici cantiti de lipide, ioni de Ca2+ i Mg2+.ADN-ul reprezint elementul structural esenial al cromosomului eucariot. n el se afl stocat sub form de codoni, informaia genetic a speciei, care va fi transmis prin autoreplicare.Cantitatea de ADN variaz la organisme att din punct de vedere filogenetic ct i ontogenetic. De exemplu, n genomul haploid al unei celule umane se afl 3 x 109 nucleotide ADN, cantitate care se poate compara informaional cu cea a unei cri care ar avea un milion de pagini. Aceast cantitate de ADN poate fi inclus ntr-un volum cu latura de 1,5 m (1,5 x 10-4 cm) (Raicu P., 1991).

n general se poate aprecia c odata cu creterea complexitii evolutive a organismelor a crescut i cantitatea de ADN. Mrirea cantitii de ADN s-a realizat prin: poliploidie, aneuploidie, duplicaia genelor, mrirea cantitii de ADN repetitiv, n mare parte noninformaional. Descoperirea ADN repetitiv a constituit un punct nodal n explicarea variaiei ADN nuclear, la eucariote.

Pe baza analizei cineticii de renaturare, ADN de la eucariote s-a grupat n patru clase de secvene.

1. Secvene unice de ADN. Sunt secvene care se afl ntr-o singur copie n genomul haploid. Acestea renatureaz ultimele i conin majoritatea genelor dar i gene noninformaionale. Se afl dispuse n eucromatin.2. Secvene de ADN intermediar repetitiv. Repetitivitatea acestor secvene variaz ntre 100 100.000 de ori. La nivelul unor secvene ADN intermediar repetitiv se afl gene care modific: ARN r, ARN s, ARN t i ARN m pentru sinteza proteinelor histonice. Acest tip de ADN, controleaz activitatea genelor structurale ct i activitatea genelor responsabile de sinteza ARN r i ARN s.

3. Secvene de ADN nalt repetitive. Sunt fracii de ADN care renatureaz rapid i se repet pn la 106 per genom haploid. Unitatea repetitiv este o secven format din cteva nucleotide. Acest tip de ADN se afl localizat n heterocromatina constitutiv, avnd o larg rspndire n gnomul eucariotelor. n ierarhia controlului genetic al funcionrii cromozomului, ADN nalt repetitiv determin macrostructura cromozomului i a cariotipului cu implicaii n controlul speciaiei i evoluiei genomului.4. Palindroamele reprezint secvene de nucleotide repetate invers cu un nalt grad de conservare. n condiii de renaturare, aceste secvene renatureaz rapid formnd nite structuri n form de agraf. La Triticum aestivum secvenele de tip palindromic reprezint 3 5% din genom.

ADN satelit este alt tip de ADN format din secvene simple repetitive bogate n perechi de nucleotide A = T i atunci se dispune dup ultracentrifugare, n condiii speciale, deasupra benzii principale de ADN, fie bogate n perechi de nucleotide C = G i atunci se dispune sub banda principal de ADN.

Secvenele de ADN satelit sunt formate din 10 15 perechi de nucleotide, grupate i repetate n tandem de 106 108 ori per genom haploid (Raicu P., 1991).

Cantitatea de ADN satelit variaz n cadrul genomului la diferite specii. Bunoar la oarece ADN satelit este bogat n perechi de baze A = T i reprezint 10% din genom, n timp ce la alte specii, el reprezint chiar 80% din genom. La om, el reprezint 4% din genom. ADN satelit este localizat n heterocromatin la centromer, telomere i construcii secundare (Ti I., 1994). 1.5. Organizarea molecular a fibrei de cromatinCelulele eucariote dein materialul genetic nuclear sub form de cromosomi. Cromosomii celulelor tinere (nainte de faza de autoreplicare a ADN-ului), dein o singur macromolecul de ADN bicatenar alctuind cromosomii unicromatidici. Dup faza S de replicare a ADN-ului, cromosomii devin bicromatidici posednd dou macromolecule de ADN bicatenar. Un astfel de cromosom bicatenar de mrime mijlocie, de aproximativ 5 m, deine un ADN de aproximativ 3 cm lungime. Aceast uria macromolecul este mpachetat deci, doar de 5 m (0,0005 cm).Macromoleculele de ADN sunt strns plicaturate de nivelul cromosomilor datorit interaciunii cu proteinele histonice formnd complexe nucleoproteice. Aceste complexe se datoresc interaciunilor dintre sarcinile negative ale radicalilor fosforici ai ADN-ului i sarcinile pozitive ale aminoacizilor din proteinele histonice de natur bazic. Plicatura fibrei de cromatin raportat la axul logitudinal al cromosomului, poate fi transversal, longitudinal sau combinat. Plicaturarea combinat determin superrsuciri asigurnd condensarea materialului genetic n timpul diviziunii celulare, att la cromosomii bicromatidici, ct i la cei unicromatidici. n urma cercetrilor iniiate de R. A. Kornberg (1974) s-a stabilit c fibra de cromatin cu un diametru de 200 300 , este alctuit din nucleozomi dispui cap la cap. Ei alctuiesc o spiral ce las n interiorul su un spaiu cu un diametru de 110 .Nucleozomul este unitatea fundamental de organizare a fibrei de cromatin. El are forma unui cilindru turtit, cu un diametru de 110 i nlime de 57 , este format din proteine histonice. Aceste proteine au greuti moleculare mici (cuprinse ntre 11.000 21.000) (Figura 6).

Figura 6. Schema structurii nucleozomului i organizrii fibrei de cromatin 300 .(http://medidacte.timone.univ-mrs.fr/Learnet/webcours/genetique/structure_chromo/AMC2JPG/AMC2-5.jpg)Miezul nucleozomului este format din 8 molecule histonice (octamer), cte dou din: H2A, H2B, H3, H4.Primele dou tipuri sunt bogate n lizin, iar ultimele dou sunt bogate n arginin.Molecula de ADN nfoar de dou ori (la extremiti), cilindrul histonic, apoi trece la urmtorul cilindru realiznd din nou dou nfurri .a.m.d.

Cercetrile au artat c nfurrile ADN-ului se datoreaz n special, histonelor H3 i H4, bogate n arginin. Lungimea celor dou spire de ADN ce nfoar un nucleozom este de 140 perechi de nucleotide. De fiecare spir sunt fixate cele 4 molecule histonice (Figura 7), astfel c nucleozomul n condii propice, se poate divide n dou pri simetrice (jumtate de nucleozom), sau se poate lineariza.

Figura 7. Schema plierii i deplierii nucleozomului.(http://61.167.199.237:8011/software/biochemistrybook/chapt23/807-2.jpg)Aceast linearizare permite autoreplicarea sau transcrierea secvenei ADN sau nfurat pe nucleozom, dup care structura se repliaz refcnd nucleozomul. Dup cum se observ, n starea linearizat histonele rmn ataate de una din catenele ADN i anume, de matria conductoare.Lungimea secvenei de ADN dintre 2 nucleozomi variaz ntre 20 100 perechi de nucleotide. De aceast secven ,,de legtur dintre nucleozomi este fixat o molecul de histon de tipul H1. Molecula acestei histone are o zon central globular i dou extremiti: una cu funcia aminic i cealalt cu funcia carboxilic a lanului polipeptidic. Regiunea globular se leag de un loc anumit pe fiecare nucleozom, iar extremitile se ntind trecnd peste ADN-ul de legtur i ancorndu-se de miezul nucleozomilor nvecinai (Figura 8).

Figura 8. Plasarea histonei H1 pentru legarea nucleozomului n cadrul filamentului subire de cromatin.(http://kc.njnu.edu.cn/swxbx/shuangyu/8.files/image017.gif)Proteinele H1 prezint o compoziie foarte variabil, manifest chiar n aceeai celul. n funcie de variabilitatea lor, histonele H1, s-au mprit la rndul lor, n 5 grupe. Variabilitaea structural a fibrei de cromatin se datorete i legrii de histonele H2 a ubiquitinei. Aceasta este o protein foarte stabil, alctuit din 75 de aminoacizi. Ea se fixeaz numai n interfaz pe segmentele de cromatin ce dein gene active, adic cele ce emit diverse molecule de ARN.Alturi de ubiquitin, de-a lungul fibrei de cromatin se gsete o serie de proteine nonhistonice, cu rol n procesul de transcriere. Mai abundente sunt cele cu mobilitate mare (high mobility group = HMG), HMG14 i HMG17, ce sunt asociate tot cu segvenele de ADN ce reprezint gene active.

mpachetarea nucleozomilor n fibra de cromosomi depinde i de concentraia ionilor de Mg++. Exist regiuni de cromatin n care ADN-ul nu este organizat n nucleozomi. Acest ADN nenfurat n jurul octamerilor histonici, este foarte sensibil la aciunea dezoxiribonucleazelor. Aceste zone ,,hipersensibile apar de-a lungul cromatinei la intervale de cteva mii de perechi de nucleotide ale moleculei de ADN. n aceste zone se afl legate de molecula de ADN, un tip special de proteine nonhistonice, care ntrerup structura regulat, nucleozomic a firului de cromatin (Coman N., 2003). 1.7. Tipuri particulare de cromosomi

Pe lng tipurile obinuite de cromosomi din nucleul celulelor somatice (autosomi i heterosomi), au fost identificate i alte tipuri de cromosomi, care se deosebesc prin mrime, form, compartare, structur i funcii. Cromosomii ,,neobinuii au fost observai n celule alturi de cromosomii obinuii, sau n celule care ndeplinesc funcii speciale.n cadrul cromosomilor uriai se disting dou categorii: cromosomi politenici i cromosomii tip ,,perie de lamp.

Cromosomi politeni sau cromosomii uriai

Cromosomii politeni au fost identificai n glandele salivare ale larvelor de diptere (Chironomus). La microscop cromosomii politeni de la Drosophila melanogaster apar ntr-o dispoziie n care se disting cinci brae lungi i unul scurt (cromosomul IV). Cromosomii omologi sunt ntr-o sinaps somatic strns, ntr-un punct denumit cromocentru.Cromosomii politeni (Figura 9) se formeaz prin cicluri repetate de diviziune endoreduplicativ a cromatidelor, avnd aspectul unui mnunchi multifibrilar.Numrul fibrelor variaz n funcie de specie i poate atinge valoarea extrem de 2000 m cu o lungime de 100 200 m i cu un diametru de 15 25 m.

Figura 9. Cromozomi politeni de Drosophila melanogaster. Imaginea a fost obinut prin contrast de faz. Cromocentru este n colul din dreapta sus. Sgeata indic sfritul cromozomului X . Imaginea marit (B) prezint benzile i interbenzile.

(http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Drosophila_polytene_chromosomes_2.jpg)Pe cromosomi politeni se disting desene caracteristice, care reprezint criteriul identificrii lor. Poriunile ntunecate poart denumirea de benzi n timp ce poriunile mai clare sunt interbenzi. n anumite locuri ale cromosomilor uriai se observ uneori structuri mai puin compacte, parc se deslneaz, formnd n jurul cromosomului formaiuni caracteristice denumite inelele lui Balbiani sau puffuri (Figura 10). n ultimul timp s-au gsit cromosomi ntructva similari ca structur cu cei uriai i la plante n unele esuturi. Se presupune c modul de aranjare a cromatinei n cromosomii uriai de la Drosophila melanogaster este similar i la mamifere, doar c proteinele cu care este asociat ADN-ul sunt nonhistonice.

Figura 10. Inelele lui Balbiani.(http://www.expertsmind.com/CMSImages/2054_polytene%20chromosomes.png) Cromosomii tip ,,perie de lampn celulele specializate, ovocite, sau n celulele unor glande, cromosomii pot avea o morfologie foarte diferit de cea a cromosomilor de tip A.

n ovocitele vertebratelor, n profaza meiozei lung de cteva luni, au fost observai cromosomii perie de lamp. Denumirea este dat de spirele cromatidice proiectate spre exterior, cte una din fiecare cromatid.

Cromosomii perie de lamp sunt ,,bivaleni meiotici, fiind formai din dou perechi de cromatide surori. Spirele cresc n profaza I, descresc n metafaza I i revin la configuraia condensat, normal, n celelalte faze, ca urmare a condensrii puternice a cromosomilor. Cromosomii perie de lamp sunt cromosomii cei mai lungi, ajungnd la dimensiuni de 1000 m la amfibieni. Sunt aproximativ de 30 de ori mai slab spiralizai n profaza I dect n alte faze ale meiozei (Figura 11).

Figura 11. Cromosomii tip ,,perie de lamp.(http://kc.njnu.edu.cn/swxbx/shuangyu/8.files/image029.gif) Cromosomii suplimentari (cromosomi B)

La multe specii de plante i la unele animale, alturi de autosomi se ntlnesc cromosomi suplimentari sau cromosomii B (Butnaru G. i colab., 2004).n metafaza mitozei, cromosomii de tip B sunt puternic heterocromatizai (deci intens colorai), de dimensiuni mici i form acrocentric. Ei se afl dispui la periferia plcii metafazice i nu se distribuie egal n metafaz, astfel nct,n celulele somatice numrul lor variaz (Figura 12). Fiind puin activi din punct de vedere genetic, prezena cromosomilor suplimentari nu influeneaz aproape deloc morfologia i dezvoltarea organismului. Importana lor genetic nu este nc bine precizat. S-a constatat de exemplu, c la soiurile selecionate de porumb i secar, numrul cromozomilor B este mai mic dect la soiurile primitive, care sunt ns mai rezistente la condiiile de mediu. Se consider c aceti cromosomi suplimentari au importan n realizarea proceselor adaptative.

Figura 12. Cariotip de Festuca pratensis (2n=14), ce deine cromosomi suplimentari, mici, acrocentrici. (http://www.plant.siu.edu/PLB479/images/Fig6_8.jpg)

Cromosomi sexualiLa multe organisme, care se nmulesc sexuat, se poate distinge o pereche de cromosomi sexuali, cu morfologie identic pentru un sex i neidentific pentru cellalt sex. De exemplu, la Drosophila melanogaster din cele 4 perechi, una (perechea I-a), este reprezentat de cromosomi cu morfologie identic pentru sexul femel (XX) i neidentic pentru sexul mascul (XY).Cromosomul X este acrocentric i are puine zone heterocrocentrice, iar cromosomul Y este submetacentric i puternic heterocromatinizat. Aceti cromosomi, numii i heterocromozomi, sunt implicai n determinismul cromosomial al sexelor. Restul cromosomilor, care formeaz perechi omoloage, identici ca morfologie, au fost denumii autozomi.Notnd simbolic cromosomii autozomi prin A, formula cariotipului la Drosophila melanogaster este 6AA + XY pentru mascul. La om, formula cariotipului este 44 A + XX la femeie i 44 A + XY la barbat (Coman N., 2003).2. DIVIZIUNEA MITOTIC I CICLUL CELULAR

Diviziunea nucleului a fost observat pentru prima dat n 1832, de ctre Dumortier, la alga Conferva aurea. Prin diviziunea nucleului se asigur distribuia egal a genelor la cele dou celule fiice, aceasta fiind condiionat de existena ADN dublu catenar i de mecanismul semiconservativ de replicare a acestuia.

n diviziunea celular se disting dou categorii de evenimente: evenimente reproductive, prin care sunt dublate structurile funcionale ale celulei, esenial fiind dublarea cromosomilor, i evenimente distributive, prin care materialul rezultat n urma replicaiei este repartizat celulelor fiice (Tudose I. Gh., 1992).Celulele fiice rezultate n urma diviziunii celulare, pot urma un proces de difereniere sau pot da natere, n urma repetrii diviziunii, la alte celule noi. Posibilitatea de a se divide este pstrat i de ctre celulele difereniate, dar ea se realizeaz n fapt, foarte rar, i numai atunci cnd este indus secundar. Celulele nedifereniate, meristematice, pstreaz ns permanent aceast capacitate de a se divide.Diviziunea mitotic a fost pentru prima dat, descris n anul 1879, la celula animal, de ctre Flemming i n 1884 la celula vegetal, de ctre Strasburger (Snustad P. D., i colab., 1997).

2.1. DefiniieMitoza (gr. mitosis = fir) sau diviziunea ecvaional, este modalitatea de diviziune celular prin care, dintr-o celul somatic rezult dou celule fiice cu numr egal de cromosomi, att ntre ele, ct i cu celula mam. Mitoza este diviziunea celular care are loc n celule somatice i asigur transmiterea fidel a caracterelor la celulele fiice; ea poate suferi ns, diferite influene care adaug aparentei stabiliti a caracterelor, noi valene. n reproducerea celulelor, apar greeli,, - fenomene mutaionale pe care evoluia le poate perpetua sau nu.

Caracteristica principal a diviziunii celulare este diviziunea nucleului, urmat de i diviziunea citoplasmei. Relaia nucleu citoplasm (evideniat nc din 1893, de ctre Strasburger) prezint implicaii majore n determinarea momentului diviziunii.

Ciclul celular mitotic, la plante i animale, cuprinde n principal urmtoarele procese: duplicarea cromosomilor unicromatidici (i a centrozomului la animale) i deplasarea spre poli a cromosomilor fii, dup care, urmeaz diviziunea citoplasmei. n procesul mitozei se organizeaz aparatul mitotic alctuit din structuri cromatice i acromatice, care este complet n metafaz. Pentru realizarea acestuia, sunt necesare proteine specifice, a cror sintez necesit un mare consum de energie.

Totalitatea proceselor prin care trece celula somatic de la formare i pn la scindarea ei n dou celule fiice, cu numr de cromosomi egal cu numrul de cromosomi al celulei din care au provenit, alctuiesc ciclul celular (Butnaru G. i colab., 2004).

2.2. Descrierea fazelor ciclului celular

Ciclul celular cuprinde cinci faze: interfaza, profaza, metafaza, anafaza i telofaza (Figura 13).

Figura 13. Ciclul celular mitotic (dup Alberts B. i colab., 1994).G1 faza de gol (gap); S faza de sintez ADN; G2 faza premergtoare mitozei

a. Interfaza

Interfaza (din gr. ,,inter ntre i gr. ,,phasis aspect) reprezint intervalul dintre dou mitoze consecutive. n interfaz, celula se pregtete de diviziune, aceasta ns nu nseamn c ea se afl n stare de repaus, dimpotriv, este cea mai activ din punct de vedere metabolic n ciclul celular, n care au loc o serie de procese eseniale pentru declanarea diviziunii celulare.

n aceast etap a ciclului celular, nucleul reprezint o structur optic uniform, cromosomii sunt despiralizai, vizibili fiind doar nucleolii.

Interfaza este format din trei perioade (subfaze), iar fiecare dintre ele se caracterizeaz printr-o serie de particulariti.

Perioada G1 (presintetic) (din eng. ,,G-gap gol)

n perioada G1 nu se produce sinteza ADN-ului (cantitatea de ADN este 2n), dar se sintetizeaz intensiv ARNm, proteinele, enzimele.

n afar de aceasta, n celul se acumuleaz ATP, iar numrul de organite celulare crete.

Perioada G1 constituie 25 50% din timpul interfazei (4 10 ore). La o serie de celule (celulele maligne), plasmodiul mixomicetei (Fusarium) poate lipsi.

Perioada S (sintetic) (din eng. ,,S synthesis sintez)

n aceast perioad are loc reduplicarea ADN-ului, cantitatea lui variind ntre 2c i 4c (dup numrul de cromatide). Paralel cu sinteza ARNr continu sinteza ARNm.

Perioada S ocup 35 40% (5 8 ore) de interfaz. Ea nu poate lipsi n ciclul celular.

Perioada G2 (postsintetic)

n aceast perioad continu sinteza ARN-ului i a proteinelor. Se sintetizeaz n cantiti mari tubulinele, actina i miozina, acestea fiind necesare dividerii celulare.

Perioada G2 are o durat de 20 30% (3 5 ore) din interfaz. Dup interfaz celula se divide.

Reproducerea celulelor asigur creterea, multiplicarea, diferenierea i regenerarea esuturilor i n cele din urm, continuitatea vieii.

Celulele procariote se reproduc ca rezultat al dividerii simple, fie prin trangulaie (bacteriile gram-negative), lamel median (bacteriile gram-pozitive), sau prin nmugurire (la rizobii).

n prealabil, n celula iniial are loc reduplicarea moleculei de ADN cu participarea nemijlocit a plasmalemei, astfel celulele-fiice primesc aceeai informaie ereditar localizat n nucleotid.

Celulele eucariote se reproduc pe dou ci:

prin diviziune direct (amitoz);

prin diviziune indirect (cariochinez i citochinez).

Diviziunea direct prezint o simpl scindare a nucleului i a citoplasmei, iar diviziunea indirect poate fi: tipic sau ecvaional (mitoza); alotipic sau reducional (meioza).Pe parcursul interfazei (Figura 14), cromosomii sunt hidratai, despiralizai i nu se observ la microscopul optic (Iancu P., 2008).

Figura 14. Aspectul nucleului n interfaz, n celulele meristemului radicular la Allium cepa L. (2n=16) (dup Hartl L. D. i Jones W.E., 1998). n afar de celulele la care ciclul mitotic se desfoar n mod normal, exist celule n repaus sau n perioada G0, asemntoare fazei G1, dar diferit prin faptul c celulele nu pot intra n faza S. n faza G0 intr celulele neproliferative. Uneori, celulele se pot afla n repaus n faza 4C (exemplu: celulele embrionare din semine), astfel nct, intr direct din G0 n G2; alteori, din G0 pot intra n G1 timpuriu (Lewin B., 1996).

n explicarea cauzelor ce determin intrarea celulei n diviziune mitotic (trecerea din G2 n mitoz) exist diferite ipoteze. Se pare c declanarea mitozei este determinat de modificarea raportului nucleu / citoplasm.

Schmucker, Dean i Hinshelwood consider c declanarea mitozei este determinat de modificarea raporturilor ntre coninutul nucleului i membrana sa. Dup Haberlandt, diviziunea poate fi declanat introducnd n celulele sntoase anumii necrohormoni provenii din celulele rnite. Schmucker presupune c mitoza este indus de o radiaie specific a razelor mitotice (cu intensitate foarte redus i lungime scurt de und) emise de celulele vii; ele acioneaz asupra celulelor care au atins un anumit stadiu pregtitor. n ultimul timp, este susinut cauzalitatea chimic a diviziunii celulare; declanarea mitozei este produs de anumite substane organice (stimulatoare de cretere n concentraie mare) i substane anorganice (de exemplu cobaltul inhib trecerea celulelor din interfaz n profaz). Se pare c intervine o kinaz (protein preexistent cu dou subuniti: una ce se activeaz la modificrile de la nceputul mitozei i o ciclin ce se acumuleaz n interfaz i este distrus n mitoz) (Lewin B., 2001).

b. Profaza

Este cea mai lung etap a diviziunii celulare. n cadrul ei, fibrele de cromatin se condenseaz treptat devenind cromosomi profazei, care la nceput, sunt slab colorabili. Fiecare cromosom este format din dou filamente strns unite, numite cromatide. Natura dubl a cromosomilor profazici este consecina autoreproducerii materialului genetic nuclear n interfaz. Cromatidele fiecrui cromosom profazic se unesc ntre ele, ntr-o anumit poriune, numit centromer. Centromerul are o poziie variabil de la un cromosom la altul, dar constant pentru acelai cromosom.

La nceputul acestei faze, cromosomii se prezint sub form de filamente subiri, lungi, alctuind un spirem. n profaza timpurie (Figura 15) ei se dispun n tot spaiul nuclear (n celulele vii se observ uor, avnd indicele de refracie 1,50 fa de cel al carioplasmei de 1,37). n profaza trzie (Figura 16), gradul de spiralizare al cromosomilor crete i ei devin mai scuri i mai compaci, aprnd formai din dou cromatide, foarte apropiate ntre ele i nfurate una n jurul celeilalte.

Spiralizarea treptat a cromatidelor duce la ngroarea i scurtarea progresiv a cromosomilor. Astfel, la sfritul profazei, poriunea centromeric se recunoate sub forma unei gtuituri a cromosomilor, denumit trangulaie primar sau centric. Poziia cromosomilor n cariolimf, n timpul profazei, este ntmpltoare. Totui, n cazul celulelor la care numrul cromosomilor este mic i interfaza scurt, se constat c fiecare cromosom ocup n profaz aceeai poziie ca i n diviziunea anterioar. Asemenea observaii vin n sprijinul ipotezei c i la eucariote materialul genetic este organizat n uriae molecule circulare de ADN.

La celulele cu centrozomi, centriolii duplicai din telofaza anterioar, se deplaseaz spre cei doi poli opui ai celulei. n aceast deplasare sunt implicate unele filamente astrale ale centrosferei. Aceste filamente astrale leag centrozomii ntre ei i se alungesc treptat de la un pol la cellalt al celulei. Numrul acestor filamente se mrete treptat, formndu-se n firul fusului de diviziune (Figura 23 a) sau aparatul acromatic. n dreptul ecuatorului celulei, filamentele fusului sunt mai ndeprtate unele de altele. Ele vor ajunge n metafaz, s lege, fie centriolii ntre ei, fie un centriol cu centromerul unui cromosom.

Filamentele fusului de diviziune sunt organizate de poriunile tubulare ale centriolilor. Sunt de fapt, mnunchiuri de microtubuli, de natur proteic, cu proprieti contractile, asociate cu ARN i lipide.

Figura 15. Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n profaz timpurie (dup Hartl L. D. i Jones W. E., 1998).

Figura 16. Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n profaz trzie (dup Hartl L. D. i Jones W. E., 1998). La celulele vegetale, unde nu exist centrozomi, fusul de diviziune se formeaz datorit existenei unor centre mitotice, centre reprezentate de regiuni citoplasmatice polare, cu funcie cinetic. Aceste tipuri de mitoze au fost denumite anastrale, spre deosebire de mitozele cu centrozomi, denumite astrale.

Spre sfritul profazei cromosomii se ndeprteaz unii de alii i ajung la marginea membranei nucleare, care la rndul ei, ncepe s se dezorganizeze. Tot acum ncep s se dezorganizeze i nucleolii. La sfritul profazei scurtarea i ngroarea cromosomilor a devenit maxim, unii cromosomi putnd s devin de 25 de ori mai scuri dect la nceputul profazei.

Profaza ocup circa 50% (30 minute) din mitoz. Ea se ncheie n momentul n care membrana nuclear s-a destrmat i carioplasma se amestec cu citoplasma formnd mixoplasma, a crei fluiditate crescut, permite micarea cromosomilor.

Stadiul final al profazei prometafaza, se caracterizeaz prin totala dezorganizare a membranei nucleare, care se fragmenteaz n poriuni relativ mari, ce pstreaz infrastructura de membran dubl i rmn, n parte, n interiorul fusului de diviziune, participnd mai trziu la formarea membranelor nucleilor fii. Cromosomii exercit micri neregulate ntre polii celulei i planul ecuatorial al acesteia (Coman N., 2003).

c. Metafaza

Etap n care cromosomii sunt delimitai i se aranjeaz n regiunea ecuatorului unde formeaz placa metafazic (Figura 17). Metafaza este stadiul n care se pot stabili, cu deosebit precizie, numrul, forma, mrimea cromosomilor specifici fiecrei specii.

Cromosomii se ataeaz de centromer cu fibrele fusului de diviziune (pe fiecare fibr cte un cromosom). Cele dou cromatide ale fiecrui cromosom sunt aezate una lng alta i sunt unite n regiunea centromerului. Cnd metafaza se apropie de sfrit, centromerii ncep s se divid, iar de fiecare jumtate rmne prins cte o cromatid (Figura 18).

n metafaz poate s continue degradarea membranei nucleare.

Aadar, particularitile metafazei sunt urmtoarele:

aranjarea cromosomilor la ecuatorul celulei;

formarea plcii metafazice;

aranjarea cromosomilor n form de stea (cu centromerul spre centru);

fixarea cromosomilor prin intermediul fusului de diviziune (fusul de diviziune este alctuit din fibrele centriolo-cromosomiale i fibrele centriolo-centriolare) (Figura 23 b).

Metafaza dureaz circa 13% (8 minute) din mitoz.

Figura 17. Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n metafaz timpurie (dup Hartl L. D. i Jones W. E., 1998).

Figura 18. Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n metafaz trzie (dup Hartl L. D. i Jones W. E., 1998). d. Anafaza

Anafaza se caracterizeaz prin formarea, din cromatidele surori, a cromosomilor fii i migrarea lor spre cei doi poli ai celulei. Formarea cromosomilor fii debuteaz n anafaza timpurie, cnd are loc clivarea centromerilor, cromatidele rmnnd nc apropiate unele de altele. O dat terminat clivarea centromerilor, ncepe separarea cromatidelor n lungul fisurii longitudinale evideniate n metafaz (Figura 19). La celulele animale, n anafaz, centromerul este duplicat funcional. Cnd i acest proces se ncheie, cromatidele fiice, fiecare cu cte un centromer propriu, ncep migrarea spre poli (Figura 20), devenind cromosomi fii.

Pentru a explica mecanismul micrii anafazice a cromosomilor au fost emise i alte ipoteze. Astfel, Lillie, Bernstein, Kuwada i Darlington, explic aceast micare prin existena unor fore electrice i magnetice. Metz, susine idea c, cromosomii ar poseda fore proprii de locomoie, putnd migra independent spre poli. Mazia a emis n 1961, ipoteza c micarea anafazic a cromosomilor s-ar datora unor fore de atracie i de repulsie ntre cromosomi i polii fusului; cromosomii fiind ncrcai electric pozitiv, se resping ntre ei, n acelai timp fiind atrai de poli, care sunt ncrcai electric negativ.

Figura 19. Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n anafaz timpurie (dup Hartl L. D. i Jones W. E., 1998).Milovidov i Perakis au artat c celulele aflate n diviziune i supuse aciunii unui cmp magnetic, nu sunt influenate de acesta, deci interaciunea cromosom pol nu implic fore de atracie sau respingere electromagnetic. Schaede, Burton i Haynes consider c micarea anafazic a cromosomilor este determinat de curenii citoplasmatici, direcionarea fiind realizat de aparatul mitotic (Lewin B., 2001).

Figura 20. Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n anafaz trzie (dup Hartl L. D. i Jones W. E., 1998)

Const n clivarea longitudinal a cromosomilor i deplasarea lor (fiecare cromosom este monocromatidic) spre polii opui ai celulei. Astfel, la polii celulei se formeaz dou seturi de cromosomi cu acceai constituie genetic ca i nucleul celulei-mam.

Anafaza dureaz circa 7% (4 minute) din timpul mitozei i se caracterizeaz prin:

deplasarea cromatidelor fiecrui cromosom spre polii celulei (viteza deplasrii este de 0,2 5,0 m / minut);

aranjarea cromatidelor n timpul deplasrii n conformitate cu poziia centromerului (Figura 23 c).

Exist diferite opinii referitoare la natura forelor care mobilizeaz cromosomii monocromatidici (cromatidele) spre polii celulei.

Conform ipotezei fiziologice, deplasarea cromosomilor, la desprinderea lor de centromer, are loc datorit polimerizrii n apropierea centriolilor a tubulinei (protein contractil) fusului de diviziune i depolimerizrii n regiunea centromerilor (chinetocorului).

Conform ipotezei fiziologice, deplasarea cromatidelor este rezultatul contraciilor proteinelor contractile ale microtubulilor (actina i miozina). Ambele ipoteze merit atenie, mai ales c unele celule (celulele plantelor superioare) nu au centrioli (Lewin B., 2001).e. Telofaza

Se caracterizeaz prin formarea la fiecare pol al celulei a cte un nucleu separat, care, dup despiralizarea cromosomilor, devine optic omogen. Spre sfritul telofazei apar nucleolii. Coninutul nucleolilor este similar cu cel al celulei-mam.

n concluzie: telofaza se caracterizeaz prin:

decondensarea cromosomilor;

formarea unei noi membrane nucleare;

formarea nucleolilor;

degradarea fusului de diviziune;

formarea centrului celular;

citochineza i formarea a dou celule-fiice identice cu celula-mam (Figura 23 d)

are loc i reorganizarea nucleolilor la nivelul regiunilor ce ndeplinesc funcia de organizatori nucleolari (Figura 21 i Figura 22).

Figura 21. Celul din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n telofaz timpurie (dup Hartl L. D. i Jones W. E., 1998).

Figura 22. Aspect al nucleilor fii, aparinnd unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n telofaz trzie (dup Hartl L. D. i Jones W. E., 1998).

Figura 23. Diviziunea mitotic n celula animal: a) profaza; b) metafaza; c) anafaza; d) telofaza

(http://alexutzu06.zoomshare.com/files/divcel2.gif)

Citochineza (din gr. ,,kytos cavitate, ,,kinesis micare) reprezint dividerea citoplasmei cu tot ansamblul de constituieni citoplasmatici i a membranei celulare.

n celula vegetal, cu perete celular rigid, diviziunea citoplasmatic are loc la apariia la centrul celulei a unui corpuscul plasmatic denumit fragmoplast, de forma unui inel care treptat i umple lumenul cu substane celulozo-pectice, care se transform n perete celular.

La plantele superioare, citochineza are loc centrifug. Dup Buvat, n zona ecuatorial a fragmoplastului, se dispun vezicule proteice, printre care se intercaleaz fragmente ale reticulului endoplasmic, ce migreaz n aceast regiune dinspre poli. mpreun cu elementele microtubulare, se formeaz o structur fibrilar. n jurul fibrelor microtubulare se aglomereaz vezicule mici golgiene (Figura 24 a, b). Veziculele se mresc, se contopesc i vin n contact cu pereii celulei mame, formnd lamela median (Figura 24 c). Celulele fiice formate, elaboreaz membrana primar, strbtut de plasmodesme (Figura 24 d, e). La animale, separarea celulelor fiice se face prin formarea unui inel contractil, deci prin trangulare (Figura 25 a, b).

a) b) c) d) e)Figura 24. Formarea peretelui despritor, ntre celulele-fiice, consecutiv diviziunii mitotice la plantele superioare (dup De Robertis, 1983).

a) b)

Figura 25. Separarea celulelor-fiice, prin intermediul formrii inelului contractil, consecutiv diviziunii mitotice, la organismele animale (dup De Robertis, 1983).Distribuia tuturor componentelor protoplasmatice este foarte precis i exact, realizat sub control genetic, fapt ce determin formarea a dou celule fiice cu aceiai alctuire structural i constituie genetic.

Semnificaia esenial a diviziunii celulare mitotice const n aceea c ea asigur continuitatea genetic de-a lungul generaiilor celulare succesive.

Ciclul celular, prin sporirea numrului de celule i procesele de biosintez ce le implic, asigur creterea organismului, asigurndu-se continuitatea genetic n ontogenez, de la o celul la alta, prin copierea mesajului genetic n interfaz i repartizarea acestui mesaj n condiii riguros exacte celulelor fiice prin mecanismul mitozei, n anafaz. n consecin, n privina informaiei genetice nucleare, toate celulele sunt identice. Prin desfurarea mitozei se asigur constana numeric, morfologic i structural a cromosomilor (Hlmgean L. i colab., 2004).

Poziia aparatului mitotic determin desfurarea egal sau inegal a citochinezei. Doar la Spirogyra, la care n mod normal nucleul este situat n mijlocul celulei, deplasarea nucleului are drept consecin o diviziune inegal a citoplasmei. Prin experiene de micromanipulare, Kawamura a stabilit c exist o relaie riguroas ntre aparatul mitotic i planul citochinezei, aceasta realizndu-se perpendicular pe ecuatorul fusului de diviziune.

n celulele normale, mitoza i citochineza sunt riguros coordonate. Dac are loc blocarea citochinezei, mitoza se desfoar normal, producndu-se o celul binucleat.

Odat cu replicarea cromosomilor, are loc i replicarea organitelor citoplasmatice sau separarea lor din celula mam n celulele fiice, dup care acestea i completeaz, prin noi sinteze, setul de organite intracitoplasmatice. n profaz, reticulul endoplasmic este transformat ntr-un sistem discontinuu de vezicule sferice, dispuse n special n regiunile periferice ale citoplasmei. n metafaz, mitocondriile se adun n jurul fusului; n anafaz, ele se grupeaz n jurul regiunii ecuatoriale, odat cu separarea celulelor fiice avnd loc i repartizarea acestora. n interfaza celulelor fiice, el revine la forma tipic.

n diviziunea mitotic, metafaza i anafaza sunt fazele cele mai scurte ale diviziunii, n timp ce profaza, uneori i telofaza, sunt cele mai lungi. Desfurarea n timp a mitozei depinde i de tipul celulei, vrst, starea fiziologic, condiii de mediu (mai ales temperatura). Influena temperaturii asupra ciclului mitotic a fost demonstrat de ctre Brown, la meristemul rdcinilor de mazre Pisum sativum L., unde viteza ciclului mitotic crete proporional cu temperatura (la 15 C dureaz 177 min., iar la 30 C doar 65,5 minute). Mitoza poate fi blocat prin aciunea ocurilor de temperatur, narcoticelor, otrvurilor etc. (Raicu P. i colab., 1974).

3. MUTAGENEZA INDUS

3.1. Ageni mutageni

Studiul mutaiilor naturale i a cauzelor care determin apariia lor a dus la elaborarea diferitelor metode pentru inducerea pe cale experimental a mutaiilor, prin folosirea unei game largi de ageni fizicii, chimici i biologici (Anghel I., Toma N., 1983).

3.1.1. Agenii mutageni fizici

Din aceast clas de ageni mutageni fac parte radiaiile i ocurile de temperatur.R. Prakken (1959) a clasificat radiaiile dup capacitatea lor de ionizare n dou categorii radiaii ionizate i radiaii neionizate (Figura 26).

Radiaiile ionizate. Radiaiile ionizate produc reacii radiochimice i pot fi de natur electromagnetic (razele X Rentgen i razele gamma) sau corpusculare: razele alfa (), razele beta (), protonii, neutronii leni i rapizi, diferite particule grele.

Razele Rentgen (X) se folosesc fregvent pentru inducerea mutaiilor, fiind produse de aparate Rentgen aflate n dotarea institutelor de cercetare, diagnostic sau tratament. Au o putere de penetraie mai mic dect a razelor gamma i mult mai mare dect radiaiile ultraviolete.

Radiaiile gamma () iau natere n momentul dezintegrrii unui element radioactiv, alturi de razele alfa (nuclei de heliu) i razele beta (electroni), nefiind deviate ntr-un cmp magnetic. Radiaiile gamma au o putere de penetraie foarte mare i, datorit capacitii mari de ionizare, sunt folosite pe scar larg n inducerea mutaiilor. n activitatea de inducere a mutaiilor i n terapia unor maladii ca surs de radiaii (gamma () se folosete cobaltul radioactiv (60C0).

Radiaiile corpusculare iau natere n timpul dezintegrrii unor elemente radioactive i sunt reprezentate de un flux de atomi sau particule elementare care se caracterizeaz prin mas, sarcina electric i viteza de deplasare. Din radiaiile corpusculare fac parte razele (electron), razele alfa (nuclei de heliu), protoni (nuclei de hidrogen), neutroni i diverse particule grele; n experienele de inducere sunt folosite razele , i neutronii.

Figura 26. Spectrul radiaiilor electromagnetice (LHritier, 1954, dup Anghel I., Toma N., 1983).Radiaiile neionizate. Radiaiile ultraviolete fac parte din spectrul solar indivizibil i sunt constituite din fotoni cu energie joas ( 3 5 ergi / m2) i lungimea de und cuprins ntre 136 i 4000 . Radiaiile ultraviolete se nscriu ntre lumina vizibil i razele Rentgen (Anghel I., Toma N., 1983).

3.1.2. Agenii mutageni chimiciDe peste 45 ani de cnd C. Thom i R.W. Steinberg (1939) i A. Auerbach i J. M. Robson (1946) au relevat rolul mutagen al unor compui chimici, a fost testat un numr enorm de substane chimice pe diverse organisme pentru a determina capacitatea lor de a schimba materialul ereditar. Primele substane au fost acidul nitros, care a produs mutaii la Aspergillus i alilizotiocianatul (gazul mutar sau iperita), care a produs mutaii la Drosophila melanogaster. Sub influena iperitei, la Drosophila rata mutaiilor letale n loci, X-sex linked a crescut de la aproximativ 0,2% la musculiele de control la peste 24% la musculiele tratate.

nc de la primele utilizri ale substanelor chimice a fost sesizat strnsa asemnare ntre efectele razelor X i a compuilor chimici cu proprieti mutagene. Etapa de dezvoltare din cadrul ciclului vital n care un mutagen chimic are o aciune maxim asupra unui organism se numete etap (sau stadiul) de senzitivitate.

n cercetrile de inducere experimental a mutaiilor s-a testat o gam larg de ageni chimici, care se caracterizeaz prin capacitate diferit de a interaciona cu materialul genetic.

Dintre substanele chimice mutagene utilizate amintim: acidul nitros, hidroxilamin, agenii alkilani (iperita, dietilsulfatul, etilmetan-sulfonat, metilmetan-sulfonatul etc.), analogi ai bazelor azotate (5-bromuracilul, 5-brom-dezoxiuridina, 2-aminopurina etc.), antimetaboliii i precursorii lor (acidul folic, acidul glutamic), coloranii bazici (proflavina, acridina orange, pironina, albastru de metilen, albastru de toluidin etc.), antibiotice (azaserina, mitomicina C, streptomicina etc.) (Crciun T. i colab., 1991).

3.1.3. Agenii mutageni biologiciCercetrile privind efectul ageniilor mutageni biologici sunt foarte recente. S-a constatat c unele virusuri sau chiar unele insecte parazite pot provoca mutaii la gazdele lor prin produii lor metabolici. De asemenea, exist metabolii cu nsuiri mutagene pentru chiar mecanismele n care se produc. Acest fapt a permis explicarea frecvenei mai mari de modificri structurale n cromosomii seminelor ,,mbtrnite dect n cromosomii seminelor mai tinere.

n procesul evoluiei, alturi de produii mutageni de metabolism, s-au format i sisteme antimutagene care apr ereditatea organismului. Un astfel de antimutagen este enzima catalaza, care anihileaz rapid aciunea mutagen a peroxidului de hidrogen.

Problema folosirii mutagenilor biologici n procesele mutaionale este insuficient explorat, ceea ce necesit studii suplimentare (Nicolae I., 1978).

n ceea ce privete factorii mutageni biologici, unele microorganisme, virusuri, microplasme, pot provoca gap-uri n procesul de replicare al ADN-ului, ca urmare a competiiei acestora cu celula parazitar (Butnaru G. i colab., 1999).

Virusurile sunt parazii absolui de nivel genetic, care determin alterri n expresia genic, modificri structurale reprezentate la celulele eucariote prin pulverizri cromosomale de dimensiuni mari apoi aneuploidie, mixoploidie (celule diploide i poliploide n acelai esut) etc.

Virusurile pot provoca i transformarea malign a celulei gazd prin inseria genomului viral n cromosomii acesteia. Integrarea genomului viral se face prin intervenia unor enzime specifice, numite integraze, iar excizia sa sub aciunea altor enzime specifice, numite excizionaze (Gavril L., 1986).

Micoplasmele reprezint cele mai mici organisme cu organizare celular procariot, a cror dimensiune (125 250 nm) este apropiat de a celor mai mari virusuri, cum ar fi virusul Herpes simplex. Infeciile cronice cu micoplasme determin n celulele gazd remanieri cromosomiale precum gap-uri monocromatidice, rupturi cromosomiale, translocaii, cromosomi discentrici, fragmentarea complementului cromosomial etc. Aberaiile cromosomiale apar ca urmare a competiiei dintre micoplasme i celula gazd pentru precursorii acizilor nucleici. Prin ntreruperea sintezei ADN se ajunge la apariia unor gap-uri la nivelul cromatidelor (Gavril L., 1986).

3.2. Clasificarea mutaiilorOdat cu descoperirea fenomenului mutaional s-a pus problema clasificrii mutaiilor. La nceput au fost recunoscute doar mutaiile nsoite de efecte fenotipice vizibile, ulterior dovedindu-se c aceste tipuri reprezint doar o parte nensemnat din totalul mutaiilor care apar. Clasificarea diferitelor tipuri de mutaii are un caracter destul de relativ din cauza complexitii acestui fenomen i se face dup numeroase criterii.

n funcie de originea sau modul de apariie, mutaiile pot fi naturale (apar spontan) i artificiale (induse experimental), ntre acestea neexistnd deosebiri de ordin calitativ. (Nicolae I., 1978).

Mutaiile pot afecta att materialul genetic din nucleu (mutaii nucleare), ct i cel prezent n organitele celulare (mitocondriile, cloroplastele, plasmidele etc.), (mutaii extranucleare).

n funcie de fenomenul sau caracterul schimbat, mutaiile pot fi morfologice, fiziologice i biochimice (care le includ i pe cele semiletale i letale).

Mutaiile pot afecta celulele germinative (mutaii germinale) i celulele corpului (mutaii somatice).

Dac criteriul de clasificare este mesajul genetic al celulei iniiale, mutaiile pot fi directe sau nainte (forward mutations), caz n care produc schimbarea mesajului genetic iniial al celulei i de reversie, retromutaii (back mutations), caz n care prin schimbare, mesajul genetic revine la forma iniial.

n funcie de dimensiunea schimbrilor fenotipice, mutaiile au fost clasificate n macromutaii, caz n care schimbrile sunt evidente i micromutaii, cnd modificrile sunt greu de evideniat.

Conform clasificrii n care se ine cont de mrimea substratului ereditar afectat putem vorbi despre mutaii genice, cromosomiale, genomice (Ichim D. L., 2006).

3.2.1. Mutaiile geniceMutaiile genice reprezint modificri n secvena de nucleotide a ADN-ului n mod spontan; pot s apar n mod spontan sau sunt provocate de om.

Principalele tipuri de mutaii genice sunt:

substituia - se refer la nlocuirea unui nucleotid cu altul i poate fi de dou feluri: tranziie, transversie;

deleia - const n pierderea unuia sau a mai multor nucleotide, modificnd ntregul mesaj genetic;

inversia - const n inversarea ordinii unor nucleotide n catena polinucleotidic i induce modificri locale n secvena de nucleotide afectat;

adiia (adugarea sau inseria) unuia sau mai multor perechi de nucleotide.

Privite prin prisma schimbrilor pe care le produc n final (la sfritul procesului de translaie), mutaiile genice pot fi considerate:

nonsens (nonsense mutations), numite i mutaii terminatoare de caten (chain termination mutation);

mutaii cu sens greit (missense mutations), numite i mutaii nainte (forward mutations);

mutaii cu acelai sens (silenioase, silent mutations sau neutre);

mutaii de reversie (mutaii napoi, back mutations).

Se pare c mutaiile genice au constituit o surs de variabilitate important n selecia natural n procesul de evoluie a speciilor (Ichim D. L., 2006).

Mutaiile genice pot avea urmtoarele consecine: alela mutant s devin nefuncional; alela mutant ar putea codifica o protein anormal care, n competiie cu cea normal s i diminueze funcia obinuit; alela mutant ar putea codifica o protein funcional cu proprieti noi; alela ar putea ca n urma mutaiei s se combine cu o alt alel i s formeze o nou gen (Ghioghi G. I., Corneanu G., 2002).

3.2.2. Mutaiile genomiceMutaiile genomice presupun o modificare a numrului seturilor cromosomiale fundamentale, notate n mod convenional cu X i includ haploidia, poliploidiile i pseudopoliploidia.

Atunci cnd un individ se va dezvolta avnd ca surs un singur gamet (androgenez sau ginogenez, pseudogamie, embriogenie adventiv) n celulele sale se vor gsi n cromosomi i nu 2n. Prin urmare, fiind exclus fenomenul de alelism, implicit dominana i recesivitatea, un haploid fenotipizeaz totalitatea genelor pe care le conine. Prin diploidizarea unui haploid se obin aa-zisele linii pure.

Poliploidia, evideniat pentru prima dat de ctre Winkler (1916), reprezint mutaia genomic datorat multiplicrii numrului de genomuri (numrului fundamental de cromosomi). n practic sunt deosebit de frecvent utilizai triploizii, care pe lng faptul c manifest heterozis, prezint i avantajul de a nu produce semine. Cel mai frecvent utilizai sunt triploizii bananului, viei de vie, mrului, pepenului verde etc. Un caz bine studiat este acela al speciei Triticum aestivum, o specie nou, sintetic, foarte productiv. Tot la gru, japonezul Kihara a reuit s resintetizeze unele specii existente n natur, refcnd astfel drumuri parcurse de procesul speciaiei n genul Triticum.

Pseudopoliploidia reprezint fenomenul n care multiplicarea numrului de genomuri se datoreaz unei fisionri a cromosomilor i nu unor dereglri n procesul diviziunii celulare. n consecin, la un pseudopoliploid mrimea numrului de genomuri nu se regsete n mrirea adecvat a cantitii de ADN.

Unii autori includ aneuploidia n cadrul mutaiilor genomice. Bra, 1999, argumentnd c aneuploidia afecteaz 1 sau 2 cromosomi (rareori 3 sau 4) dintr-un genom i nu induce multiplicarea numrului de genomuri sau a numrului fundamental de cromosomi o consider o mutaie cromosomial, mai precis una numeric-cromosomial. Prezena unor cromosomi supranumerari sau lipsa lor se regsete n augumentarea sau diminuarea coninutului de ADN i n modificarea corespunztoare a numrului fundamental de brae. Se apreciaz c principala cauz a apariiei aneuploizilor o constituie perturbarea meiozei.

n consecin, iau natere gamei cu 1 - 2 cromosomi n plus sau n minus, fenomen ce duce la apariia de indivizi modificai (cu 1 - 2 cromosomi n plus sau n minus).

Avnd n vedere viabilitatea sczut a aneuploizilor dect a diploizilor, i importana lor economic este diminuat. n schimb, ei prezint o deosebit importan teoretic. Spre exemplu, geneticianul Sears a obinut n cazul speciei Trticum aestivum (2n=42) serii complete de 21 nulisomici, 21 tetrasomici, 21 monosomici i 21 trisomici. Autorul a constatat c lipsa unei perechi de cromosomi implic lipsa manifestrii unui (unor) caractere. n acest mod se pot stabili grupele de linkage i chiar hrile genetice (Bra I., Cmpeanu M., 2003).

3.2.3. Mutaiile cromosomiale (aberaiile sau restructurrile cromosomiale)Mutaiile cromosomiale sau restructurrile cromosomiale reprezint modificarea structurii i funciei cromosomilor, sub aciunea factorilor mutageni naturali sau artificiali.

Ele conduc la modificarea caracteristicilor fenotipice ale organismelor, avnd rol n diversificarea i evoluia speciilor.

n funcie de caracterul urmrit n analiza lor, aberaiile cromosomiale se pot clasifica dup mai multe criterii: momentul din ciclul celular cnd se produc (aberaii cromosomiale propriu-zise, aberaii cromatidale, aberaii subcromatidale), numrul de rupturi produse (aberaii one-hit, two-hit, multi-hit), comportarea ulterioar a rupturilor produse (aberaii complete i incomplete) numrul de cromosomi implicai n procesele de modificare a structurii lor (aberaii intracromosomiale i intercromosomiale), dup forma pe care o prezint structura celular la cei doi poli ai fusului (aberaii simetrice i asimetrice).

Aberaiile cromosomiale propriu-zise sunt produse atunci cnd procesul de ruptur-reunire a cromosomilor are loc n stadiul presintetic G1, cnd cromosomii se prezint sub form monocromatidic i afecteaz ambele cromatide n acelai loc (Ichim D. L., 2006).

Anomalii structurale ale cromosomilor i cauzele lor (Socaciu C., 1996).

AnomaliaCauza

A. Aberaii de tip cromosomialLezionarea cromosomilor n faza G1

I. Intracromosomiale

1. Deleii de fragmente acentricedeleii cromosomiale terminale sau intercalare

2. Inele acentricedeleii ale cromatidelor (asocieri interbrae)

3. Cromosomi inelarideleii ale ambelor brae ale cromosomilor i unirea capetelor

4. Inversii pericentrice i paracentricersuciri de 180o ale segmentelor ntre dou puncte de deleie

5. Translocaia intracromosomialdislocare prin deleie a unui fragment i fixare pe cellalt bra al cromosomului

6. Discontinuiti cromosomialelipsa materialului genetic (ADN) pe poriunile afectate

7. Izocromosomi (cromosomi metacentrici neomologi)clivaj intercromatidic transversal la nivelul centromerului

II: Intercromosomiale simetrice sau asimetrice

1. Translocaii reciproceschimb de segmente acentrice distale din doi cromosomi neomologi

2. Fuziuni centrice intercromosomiale (translocaie robertsonian)fuziunea a doi cromosomi neomologi acentrici

3. Cromosomi policentricifuziune de fragmente centrice dup o deleie terminal

4. Cromosomi duplicaifixare pe cromosom a unui fragment acentric, dislocat prin deleie de la un cromosom omolog

B. Aberaii de tip cromatidicLezionarea cromatidelor surori

1. Fragmente izolatelezionarea unei cromatide

2. Translocaia intracromatidic (inversie pericentric)dislocare de fragmente de la fiecare bra al cromatidei i sudare la brae diferite

3. Ruptura cromosomialsepararea unui fragment cromatidic de restul cromosomilor

4. Lacuna cromosomialruptur cromatidic neexteriorizat n metafaz datorit plierii cromatinei

Aberaiile intracromosomiale sunt reprezentate prin modificarea structurii unui singur cromosom, fiind reprezentate de inversie, duplicaie, deleie i transpoziie.

Referitor la aberaiile intercromosomiale, acestea sunt reprezentate de translocaii (simpl, reciproc, complex), fuziunea centromeric.

Studiul principalelor tipuri de aberaii cromosomiale se realizeaz n timpul ana-telofazei, fiind reprezentate de: fragmente acentrice, minutes, inele acentrice, inele centrice, puni, arcuri. n interfaza urmtoare aciunii agentului mutagen sunt analizai micronucleii (Figura 27).

Mutaiile cromosomiale au o frecven redus n mitoz, fiind de 1:500 diviziuni celulare. Prin schimbarea grupelor de linkage a genelor, ele modific transmiterea normal a acestora n descenden i modific fenotipul organismelor. Prin selecia natural supravieuiesc genotipurile cu restructurri viabile. Mutaiile cromosomiale permit transferul unor gene sau grupe de gene de la o specie la alta.

Sears printr-un proces de translocaie a trasferat gena pentru rezisten de la Aegilops umbellulata la Triticum aestivum (Ichim D. L., 2006).

Figura 27. Principalele tipuri de aberaii cromosomiale (dup Soccaciu C., 1996).4. RADIAIILE MAGNETICE CA AGENT MUTAGEN4.1. Interaciunea radiaiilor magnetice cu sistemele viiDatele privind efectul radiaiilor UV asupra plantelor superioare terestre au fost sistematizate, n principal, pentru cteva specii importante pentru agricultur (specii care sunt sensibile la UV). Din aceast categorie fac parte soia, grul, orzul, cartoful, mazrea, fasolea etc. Exist i plante rezistente la UV (porumbul, varza). n acest sens au fost studiate aproximativ 300 de specii i varieti de plante (Teramura A. H., Sullivan J. H., 1991).

Efectele radiaiilor UV (n particular UV-B) asupra plantelor variaz att n fincie de specie ct i ntre diferite soiuri ale aceleai specii. Efectele radiaiilor UV asupra plantelor sensibile vizeaz, printre altele, reducerea dimensiunilor (reducerea suprafeei foliare, reducerea taliei). Dei odat cu creterea intensitii radiaiilor UV-B este afectat, de regul, n mod negativ creterea i dezvoltarea plantelor superioare, amploare efectului depinde de poziia taxonomic a plantei, de condiiile de cultur i de stadiul ontogenetic al dezvoltrii acesteia (Giller Y. E., 1991).

Dintre speciile de plante studiate, ntre 30% i 50% sunt afectate n mod negativ de creterea cantitii de radiaii UV-B. Restul speciilor testate fie nu au fost afectate, fie par a fi avantajate de nivelul crescut de radiaii UV-B (Tosserams M., 1998).

Efectele creterii cantitii de radiaii UV includ reducerea biomasei, inhibarea fotosintezei, inducerea produciei de compui vegetali secundari, schimbri fotomorfogenetice i fenologice. Bazele moleculare ale acestor modificri nu sunt nc pe deplin cunoscute. Rspunsurile pot fi cauzate de efectele directe ale radiaiilor UV-B asupra componentelor celulare eseniale (leziuni la nivelul ADN) i a membranelor, sub aciunea radicalilor liberi, reducerea transcripiei ARNm i a sintezei proteinelor i efecte asupra activitii enzimatice.

Aciunile radiaiilor UV-B pot fi mediate de fotoreceptori specifici, ca de exemplu flavine, sau regulatori de cretere (auxina). Sensibilitatea diferitelor plante, la radiaiile UV-B, poate varia mult n funcie de diferii factori.

Spre exemplu gramineele au tendina de a fi mult mai rezistente la aciunea radiaiilor UV-B dect alte plante ierboase, fapt pentru care efectele fotomorfogenetice sunt mult mai frecvent raportate la graminee. Plantele ce cresc n zone cu nivele relativ ridicate de UV-B (latitudine joas, altitudine nalt), par a fi mai puin sensibile, comparativ cu cele ce cresc n zone n care nivelele radiaiilor UV-B, din mediu, sunt relativ sczute (latitudine nalt, altitudine joas). Stadiul ontogenetic n care se afl individul este, de asemenea, important. n general, plantulele sunt mai sensibile dect plantule mature. Au fost evideniate, la unele specii i procese inhibitoare ale germinrii polenului i ale creterii tubului polinic, n urma creterii nivelului radiaiilor UV-B. Factorii mediului ambiant, ca de exemplu: nutrienii, disponibilitatea sursei de ap i concentraia CO2, pot diminua sau amplifica efectele negative ale radiaiilor UV-B.

n ceea ce privete sensibilitatea diferitelor infrastructuri s-a constatat c leziunile cele mai frecvente se produc la nivelul cloroplastelor. Pot aprea leziuni i la nivelul epidermei, ct i modificri ale stratului de cear (cuticular). Precum i modificri ale morfologiei frunzei. Nu se cunoate cu siguran efectul radiaiilor UV asupra sistemului de membrane tilacoidale.

Deoarece razele UV au energie mai joas dect radiaiile neionizate, penetreaz superior doar stratul celular superficial, la plantele superioare (Caldwell M. i colab., 1989).

Efecte fiziologice generale includ reducerea asimilrii carbonului n fotosintez, alterarea funciei stomatelor, a activitii fitohormonilor i a chimiei foliare.

Modificri ale procesului fotosintezei au fost evideniate de Bornman (1989); Tevini i Teramura (1989); Teramura i Sullivan (1994).

Radiaiile UV-B produc scderi nete ale fotosintezei, chiar dac exist diferene ntre diferitele specii i soiuri. La plantele superioare verzi, fotosinteza se realizeaz n cloroplaste. n afara potenialelor leziuni ale cloroplastelor (inclusiv la nivelul membranelor tilacoidale) i a fotodistrugerii pigmenilor fotosintetizani, radiaiile UV pot exercita efecte negative asupra centrului de reacie al fotosistemului II (PS II), care pare a fi principala ,,int.

Rata fotosintezei poate fi afectat i indirect prin alterri ale compoziiei pigmenilor ct i prin modificri anatomice ce pot afecta caracteristicile optice ale frunzelor.

Dintre compuii materiei vii care pot interaciona cu radiaiile neionizante, singurii care merit a fi luai n considerare, din punct de vedere practic, sunt compuii organici nesaturai (ceilali compui avnd o absorbie neglijabil mai ales n domeniul radiaiilor cu (>220 nm). Printre compuii organici nesaturai, cei mai importani sunt cei ce prezint legturi duble conjugate: cicluri benzenice, cicluri coninnd unul sau doi atomi de azot - acetia absorbind n domeniul radiaiilor UV ndeprtate. Porfirinele i unii steroizi, absorb n domeniul UV apropiat.

Important este aciunea radiaiilor neionizate asupra aminoacizilor i proteinelor, pe de o parte i asupra nucleotidelor i acizilor nucleici, pe de alt parte, iar n final asupra unor pigmeni cu o importan biologic fundamental (rodopsina, clorofila i retinolul) (Teramura A. H., Sullivan J. H., 1991).Aciunea asupra proteinelor. Gruprile cromorfe ale proteinelor sunt: gruparea triptofanului i a tirozinei, care absoarbe n domeniul de 250 nm i legturile peptidice de tip CONH care, dei au o absorban redus, prin numrul lor ridicat, aduc o contribuie important n fenomenul global al absorbiei. Absorbia maxim a proteinelor se situeaz n domeniul de 280 nm.

Una dintre eseniale ale radiaiilor UV asupra proteinelor, este denaturarea acestora.

Aciunea asupra acizilor nucleici. Asupra materialului genetic acioneaz radiaiilor UV cu cuprins ntre 200 - 300 nm. Acizii nucleici absorb puternic radiaiile cu cuprins ntre 240 - 260 nm. Att ADN ct i ARN absorb UV, cel mai intens, la 260 nm (Klug W., Cummings M., 1986).

Acesta este rezultatul direct al interaciunii ntre radiaiile UV avnd aceast lungime de und i inelele purinice i pirimidinice. Toate bazele azotate sunt bogate n duble legturi conjugate, ceea ce explic de ce moleculele de ADN i respectiv ARN, au o capacitate remarcabil de absorbie.

Cnd timina pierde legtura dubl de la nivelul inelului benzenic, n urma dimerizrii, pierde i capacitatea de a absorbi lumin la = 260 nm. Drept urmare, msurarea modificrii capacitii de absorbie la = 260 nm, d indicaii privitoare la raportul ntre monomerii i dimerii de timin din soluie. Rata scindrii dimerilor n monomeri, este mai mic dect rata dimerizrii. La o greutate egal, acizii nucleici absorb de 10 - 20 de ori mai mult energie dect proteinele (Isac M., 1987).

Bazele azotate avnd un spectru de absorbie n UV de 260 - 280 nm, sunt cele ce absorb radiaiile UV cu efectul mutagen cel mai puternic. Bazele pirimidinice (timina i citozina) sunt mai sensibile la iradierea cu UV dect cele purinice (adenina i guanina).

n timp ce o cuant de energie UV, din 100, absorbit de bazele pirimidinice este suficient pentru a altera macromolecula de ADN, pentru un efect similar bazele purinice absorb (de exemplu nucleosidele, nucleotidele i polinucleotidele), pot fi analizate cu ajuto