electro for ez a

SIMPOZIONUL ŞTIINŢIFIC INTERNAŢIONALCONSACRAT ANIVERSÃRII A 100 ANI DE LA NASTEREA PROF. UNIV.

GHERASIM RUDICHIŞINĂU, 1-2 MARTIE 2007

STUDIUL VARIABILITĂŢII GENETICE PROVOCATĂ LA MĂR PRIN HIBRIDĂRI

ARTIFICIALE, PRIN SELECŢIEASISTATĂ DE MARKERI MOLECULARI

Sestraş Radu1), Botez Constantin1), Pamfil Doru1),Sestraş Adriana2), Dan Cătălina1)

1)Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară, Facultatea de Horticultură Cluj-Napoca, Romania

2) Staţiunea de Cercetare Dezvoltare pentru Pomicultură, Cluj-Napoca, Romania

PRINCIPALELE OBIECTIVE ALE AMELIORĂRII MĂRULUI

Productivitatea (vigoarea pomilor, tipul de creştere, mărimea fructelor, numărul fructelor pe pom, perioada juvenilă etc.)

Calitatea fructelor (formă, culoare, caracteristicile pulpei, particularităţi organoleptice, valoare nutritivă)

Epoca de coacere a fructelor, epoca de înflorire

Rezistenţa la factori de stres (ger, secetă etc. ), la boli şi dăunători

Pretabilitatea fructelor la transport, păstrare, prelucrare

OBIECTIVELE DE AMELIORARE ABORDATE IN LUCRARE

Tipul de creştere şi fructificare (ideotipul, habitusul pomilor)

Rezistenţa la făinare

Rezistenţa la rapăn

METODE DE AMELIORARE A MĂRULUI

Selecţia în hibrizi naturaliSelecţia variaţiunilor mugurale (spontane, “sport”-uri)Inducerea artificială a mutaţiilorHibridarea (intraspecifică, interspecifică, intergenerică)Biotehnologiile şi ingineria genetică (micropropagarea, culturile de

embrioni, culturile de protoplaşti, embriogeneza somatică, transformarea genetică)

Selecţia MAS (Marker Assisted Selection), tehnici de lucru:PCR (Polymerase Chain Reaction),AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism),RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA),SSR (Simple Sequence Repeat)BSA (Bulk Segregant Analysis)

Materialul biologicutilizat pentru analizele moleculare a fost reprezentat de hibrizi F1 de măr, proveniţi dintr-o încrucişare semidialelă (după metoda a IV-a a lui Griffing), conform schemei:

Genitorii♀/♂ Goldenspur Liberty Florina

Starkrimson da da da

Goldenspur - da da

Liberty - - da

Florina - - -

-presupuneselecţia dintr-o populaţiesegregantă a formelor extreme.ADN-ul extras de la câte 5-6 plante/grup(din cadrul fiecărei combinaţii hibride) se amestecă,se amplifică, iar produşii de amplificare aparţinand celor două grupuri,separaţi electroforetic, sunt comparaţi.

Dacă apare un anumit polimorfism, se poate considera că markerul molecular (banda polimorfă) ce îl defineşte aparţine genei pentru care s-a făcut selecţia, deoarecepentru celelalte gene cele două grupuri sunt asemănătoare, fiind vorba de un amestecrandomizat de indivizi segreganţi.

Tehnica BSA(Bulk Segregant Analysis)

De exemplu, din prima combinaţie hibridă,Starkrimson x Goldenspur 5-6 hibrizi rezistenţi la rapăns-au selecţionat: 5-6 hibrizi sensibili la rapăn

5-6 hibrizi rezistenţi la făinare 5-6 hibrizi sensibili la făinare

5-6 hibrizi cu ideotip standard5-6 hibrizi cu ideotip spur

În mod similar s-a procedat la toate variantele (combinaţiile hibride)

IZOLAREA ADN-ULUI

Procesul de izolare a AND-ului cuprinde trei etape majore:1. Distrugerea integrităţii celulare (liza celulară) şi eliberarea ADN-ului într-un

omogenat, numit lizat celular.2. Purificarea unui anumit tip de ADN de restul ADN-ului prezent eventual în

lizat, precum şi de ARN, proteine şi alţi compuşi metabolici.3. Realizarea unei soluţii de ADN de concentraţie dorită şi de puritate cunoscută.

Protocolul de lucru/Etape parcurse

1. S-au mojarat în azot lichid aproximativ 0,5 g de frunze tinere/probă până la obţinerea unei pudre fine.

2. Pudra a fost transferată în tuburi Eppendorf, cu 700 µl tampon de extracţie (menţinut la 650°C); tuburile au fost inversate de câteva ori.

3. Probele au fost puse apoi pe baia marină la 650°C timp de 25 minute, inversând tuburile pentru asigurarea uneitemperaturi constante. După baia marină, tuburile au fost lăsatesă se răcească la temperatura camerei.

4. S-au adaugat 700 µl de cloroform: alcoolizoamilic (24 : 1), s-a omogenizat prin răsturnarea tuburilor de 20-25 de ori, până la obţinerea unei emulsii omogene.

5. Centrifugarea s-a făcut la 11.000 rpm timp de 15 minute.

6. Faza apoasă (de deasupra) a fost transferată într-un alt tub steril. Când faza apoasă este tulbure, se recomandărepetarea extracţiei cu cloroform: alcool izoamilic (etapele 4-6).

7. S-au adăugat 0,5 volume NaCl la soluţiarecuperată în pasul anterior şi s-a omogenizat conţinutultuburilor.

8. S-au adăugat 2 volume de alcool etilic95% menţinut în congelator la -200°C şi tuburile au fost trecute în frigider la 4-60°C timp de 15-20 minute, până când filamentele de ADN au devenit vizibile însoluţie.

9. S-a centrifugat la 3.000 rpm timp de 3 minute, după care s-a mărit viteza la 11.000 rpm pentru încă 5 minute.

10. S-a îndepărtat cu grijă supernatantulfără a desprinde sendimentul de ADN de pe pereţii saufundul tubului Eppendorf.

11. S-au adăugat 700 µl alcool etilic 76% menţinut la 0-40°C.

12. A urmat o nouă centrifugare la 10.000 rpm timp de 5 minute, după care s-a îndepărtat cu grijă supernatantul.

13. Tuburile deschise au fost puse în hotasterilă până la evaporarea alcoolului, aproximativ 20-30 minute.

14. Sendimentul de ADN a fost redizolvatîn 50 µl de soluţie tampon TE.

ELECTROFOREZA ADNElectroforeza orizontală a ADN-ului este o metodă standard de

separare, identificare şi purificare a fragmentelor ADN pe baza migrăriiacestora într-un câmp electric.

1. Pregătirea gelurilor de agaroză-s-a pregătit matricea pentru turnarea gelului.-s-a preparat tamponul de electroforeză – TBE 0.5 x, într-o cantitate

suficientă pentru a umple cuva de electroforeză şi pentru a prepara gelul.-în vasul Erlenmayer s-au turnat 100 ml tampon TBE 0.5 x şi 1,4 g de

agaroză, care s-a introdus apoi în cuptorul cu microunde timp de 2 minute, până la dizolvarea completă a agarozei.

-gelul s-a răcit la 650°C (30 de minute, la temperatura camerei), şi s-a turnat apoi în matriţă.

-După solidificare, s-au scos pieptenii şi s-a îndepărtat banda adezivă de pe matriţă.

-Gelul a fost aşezat pe platforma cuvei de electroforeză, unde în prealabil s-a turnat tamponul de electroforeză, astfel încât un strat de aproximativ 1 mm de lichid să fie peste gel.

2. Pregătirea probelor de ADN

-probele pentru migrat au fost distribuite în tuburi de microcentrifugă. Volumul final a fost de 10 µl (în funcţie de volumul godeului şi de cantitatea de ADN);

-fiecare probă a fost pipetată în câte un godeu, cu o micropipetă; vârful pipetei s-a schimbat pentru fiecare probă.

Ladderul s-a aplicat în primul şi ultimul godeu;-s-au conectat cablurile electrice: cel roşu la anod (-) şi cel negru la catod (+);-s-a programat sursa de putere (58V, timp de 2 h şi 30 minute, fără a depăşi 5V/cm).După expirarea timpului gelul a fost colorat prin imersie într-o soluţie de apă distilată şi bromură de etidiu (0,5 µg /ml), timp de 20-30 minute, pe un agitator mecanic.

Imaginea gelului a fost preluată cu sistemul ALPHA IMAGE 2.200 şi salvată în baza de date electronică (ca imagine JPG şi ca fişier TIFF).

3019.3 g/mol5`- GAC CGC TTG T - 3`OPA- 17R 44

3085.1 g/mol5`- TGC GCG CGG G- 3`270- UBCR 59

2924.2 g/mol5`- TTC CCC CCA G - 3`MIC-13R 56

2924.2 g/mol5`- CTG TAC CCC C - 3`70.08R 54

2964.2 g/mol5`- CGC ATT CCG C - 3`70.04R 53

3044.2 g/mol5`- ACG GTG CCT G - 3`70.03R 52

GreutateamolecularăSecvenţa primeruluiPrimer

PRIMERII UTILIZAŢI ÎN AMPLIFICAREA ADN-ULUI

0,4851,101,47796,9Făinare – Sensibil12

0,4661,461,45729,5Făinare – Rezistent11

0,0831,631,76484,5Rapăn – Sensibil10

0,0851,831,79650,3Rapăn – Rezistent9

0,2011,321,47302,8Ideotip – Spur8

0,1191,551,72554,5Ideotip – StandardStarkrimsonx

Liberty

7



0,0601,841,76431,5Rapăn – Sensibil4

0,0131,361,77684,5Rapăn – Rezistent3

0,0871,671,68314,3Ideotip – Spur2


Goldenspur

1

320 (Polizaharide-contaminări

<0,1)

R260/230 (Resturi

alcool <1,5)

R260/280 (ADN/prot

>1,7)

ImpurificăriCantitatea

ng/µldsADN

Caracteristicile hibrizilor F1

(selecţie fenotipică)

Combinaţia hibridă(♀ x ♂)

Nr. var

Cantitatea şi calitatea ADN-ului extras din frunze tinere la hibrizii F1 de măr



0,1561,391,401984,3Rapăn – Sensibil22

0,1661,441,75575,8Rapăn – Rezistent21

0,0411,871,86502,0Ideotip – Spur20

0,0411,991,88675,7Ideotip – StandardGoldenspurx

Liberty

19



0,1791,641,74645,3Rapăn – Sensibil16

0,0562,161,87693,4Rapăn – Rezistent15

0,1091,801,85936,7Ideotip – Spur14


Florina

13


<0,1)

R260/230 (Resturi

alcool <1,5)

R260/280 (ADN/prot

>1,7)


ng/µldsADN




Nr. var




0,2111,571,72963,5Rapăn – Sensibil34

0,2751,451,68898,4Rapăn – Rezistent33

0,2951,461,66902,2Ideotip – Spur32

0,0811,691,88846,9Ideotip – StandardLibertyx

Florina

31



0,0901,561,81516,9Rapăn – Sensibil28

0,0581,722,371283,3Rapăn – Rezistent27

0,0492,011,95982,2Ideotip – Spur26

0,0651,971,93793,7Ideotip – StandardGoldenspurx

Florina

25


<0,1)

R260/230 (Resturi

alcool <1,5)

R260/280 (ADN/prot

>1,7)


ng/µldsADN




Nr. var


0,0941,351,85461,3Florina;rezistent rapăn Vf – standard

40

0,0421,872,12694,3Liberty;rezistent rapăn Vf – semispur

39

01,662,14229,1Goldenspur;spur – sensibil la rapăn

38

0,0081,851,95451,4Starkrimson;spur – tolerant făinare

37


<0,1)

R260/230 (Resturi

alcool <1,5)

R260/280 (ADN/prot

>1,7)


ng/µldsADN

Soiul folosit ca genitor/Caracteristicile

soiurilor genitoareNr. var

ADN-ul extras a variat atât între genitori, cât şi în cadrul combinaţiilor hibride. Diferenţele pentru conţinutul de ADN, au oscilat la genitori între 229,1 ng/µl dsADN(Goldenspur) şi 694,3 ng/µl dsADN (Liberty), iar la combinaţiile hibride între 302,8 ng/µldsADN (Starkrimson x Liberty, ideotip spur) şi 1984,3 ng/µl dsADN (Goldenspur x Liberty, hibrizi sensibili la rapăn).

Cantitatea şi calitatea ADN-ului extras din frunze tinere la soiurile genitoare

Rezistenţă rapăn (Vf) – ideotip standard/wFlorina40Rezistenţă rapăn (Vf) – ideotip semispurLiberty 39Spur – sensibilitate la rapănGoldenspur38Spur – toleranţă la făinareStarkrimson37Ideotip – spur Goldenspur x Florina26Ideotip – standardGoldenspur x Florina25Rapăn – sensibiliGoldenspur x Liberty22Rapăn – rezistenţiGoldenspur x Liberty21Fainare – sensibiliStarkrimson x Liberty12Făinare – rezistenţiStarkrimson x Liberty11

Selecţia fenotipică a 5-6 hibrizi/Particularităţile plantelor selecţionate

CombinaţiaHibridă/Soiul genitor

Nr. variantei

40- var. Florina39- var. LibertyP54- primer 70.0838- var. GoldenspurP53- primer 70.0437- var. StarkrimsonP52- primer 70.03

40- var.Florina39- var.LibertyP59- primer 270 UBC38-var.GoldenspurP44- primer OPA-1737-var.StarkrimsonP56- primer MIC-13

Pentru rezistenţa la rapăn sau făinare, polimorfismul poate fi considerat util atunci când există bandă la soiul rezistent şi lipseşte de la soiul sensibil (sau banda este prezentă la ideotipul dorit).

Primerul P56 nu a asigurat obţinerea produşilor de amplificare. La migrarea cu primerul P44 au fost obţinuţi 28 de produşi de amplificare, dintre care nici unul polimorf. În cazul primerului P59 au fost evidenţiate 27 de benzi, dintre care 18% (5 benzi) polimorfe.

În profilul în care au fost migrate şi amplificate variantele 11 şi 12, pentru comportarea la atacul de făinare al hibrizilor din combinaţia Starkrimson x Liberty, au fost obţinuţi produşi de amplificare în cazul primerului P53 (o bandă polimorfă), în timp ce primerul P56 nu a dat produşi de reacţie.

P52- primer 70.03; P53- primer 70.04P54- primer 70.08; P56- primer MIC-13P44- primer OPA-17; P59- primer 270 UBC25-var. Goldenspur x Florina (ideotip standard)26-var. Goldenspur x Florina (ideotip spur)

P52- primer 70.03; P53- primer 70.04;P54- primer 70.08; P56- primer MIC-13P44- primer OPA-17; P59- primer 270 UBC11-var. Starkrimson x Liberty (rezistent făinare)12-var. Starkrimson x Liberty (sensibil făinare)

În privinţa ideotipului, pentru variantele 25 şi 26, au fost obţinuţi produşi de amplificare polimorfi în cazul primerului P44 şi P59 (câte o bandă polimorfă în cazul fiecăruia), în timp ce primerul P56 nu a dat produşi de amplificare.

11- var. Starkrimson x Liberty (rezistent făinare); 12- var. Starkrimson x Liberty (sensibil făinare)21- var. Goldenspur x Liberty (rezistent la rapăn); 22- var. Goldenspur x Liberty (sensibil la rapăn)

25- var. Goldenspur x Florina (ideotip standard); 26- var. Goldenspur x Florina (ideotip spur)37- var. Starkrimson; 38- var. Goldenspur; 39- var. Liberty; 40- var. Florina

P52- primer 70.03; P53- primer 70.04; P54- primer 70.08;P56- primer MIC-13; P44- primer OPA-17; P59- primer 270 UBC

Diferenţele moleculare pentru rezistenţa la rapăn au fost puse în evidenţă de polimorfismul puternic dintre combinaţiile hibride cu un comportament extrem, care au reacţionat cu toţi cei şase primeri. Pentru ideotipul arhitectural al pomilor, primerii P59 şi P44 au evidenţiat markeri genetici dominanţi specifici genelor ce controlează creşterea şi fructificarea standard. În privinţa rezistenţei la făinare, primerul P53 a evidenţiat markeridominanţi pentru genele de rezistenţă, iar pentru comportarea la atacul de rapăn markeriidominanţi au marcat alele de sensibilitate, care trebuie să fie în linkage cu alela dominantă pentru a da produşi de amplificare.

Analizele moleculare realizate cu markerii specifici AL-07, AM-19 şi U1400 au pus în evidenţă prezenţa genei Vf, la hibrizii proveniţi din soiurile cu rezistenţă genetică (Liberty şi Florina), indiferent dacă hibrizii F1 au provenit din încrucişări între cele două soiuri rezistente, sau din încrucişări dintre acestea şi soiuri fără sursa de rezistenţă Vf, respectiv Starkrimson şi Golden spur.

Primerul AL 07 este un primer codominant care permite diferenţierea homozigoţilor de heterozigoţi, iar primerii AM 19 şi U1400 sunt primeri dominanţi care nu permit diferenţierea genotipurile homozigote de cele heterozigote.

Vfvf / 466 şi 724 pb10, 11

1-14 = F1 Liberty x Florina

vfvf / 724 pb6, 9

VfVf / 466 pb1, 2, 3, 4, 13

AL 07

VfVf Vfvf vfvf

AL 07

Rezultate obţinute la analiza moleculară cu primeri specificiîn combinaţia Liberty x Florina

1. Coloana 1 - Liberty (Vfvf)2. Coloana 2 - Florina (Vfvf)3. Coloanele 3, 4, 5 hibrizi homozigoţi recesivi (vfvf)4. Coloanele 6, 7, 8, 9, 10, 11 - hibrizi heterozigoţi (Vfvf)5. L - Ladder de 100 bp greutate moleculară6. C - Control negativ.

AL-07 AM-19 U1400

CONCLUZII ŞI RECOMANDĂRICONCLUZII ŞI RECOMANDĂRI

Tehnica Bulk Segregant Analysis poate fi utilizată cu succes în aplicarea selecţiei asistată de markeri moleculari la măr. Prin migrarea produşilor de reacţie în gelul de agaroză, genotipul plantelor (care determină rezistenţa sau sensibilitatea la rapăn, făinare, ideotipul arhitectural sau altă caracteristică urmărită), poate fi apreciat direct, prin prezenţa sau absenţa în gel a benzii specifice particularităţii analizate.

În ameliorarea mărului, completarea selecţiei fenotipice cu cea efectuată la nivel molecular (selecţia MAS - Marker Assisted Selection), conferă siguranţă şi eficienţă deosebită. Selecţia MAS poate fi efectuată în orice stadiu de creştere a plantelor, inclusiv în fază foarte tânără, când hibrizii sunt în seră, astfel că o mare parte din materialul biologic poate fi eliminat, fiind transferate în câmp numai plantele care prezintă caracteristicile dorite şi economisindu-se timp, suprafeţe de teren, muncă, respectiv fonduri băneşti considerabile.

Marcarea moleculară a genelor de interes este un prim pas în vederea izolării şi clonării genelor pentru obţinerea plantelor transgenice, în care să fie încorporate genele dorite.

Grant CNCSIS, tip A,Tema 16, Cod 752

“UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI PENTRU IDENTIFICAREA GENELOR CARE DETERMINĂ IDEOTIPUL

ARHITECTURAL ŞI REZISTENŢA LA BOLI A MĂRULUI”

Prof. Dr. Radu SestraşUniversitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară,Facultatea de Horticultură, Nr. 3-5,Str. Mănăştur, 400372 Cluj-Napoca, Romaniae-mail: [email protected]

electro for ez a

Documents