OBIECTIVUL GENERAL 5. : Managementul durabil al resurselor genetice animale

Obiectivul specific 5.1: Ameliorarea genetică a populaţiilor de animale (rase, linii) cu status normal

Numărul/codul proiectului : ADER 5.1.3.

Denumirea proiectului:

Contract nr.: 5.1.3./22.10.2015

Anul începerii: 2015; Anul finalizării: 2018; Durata (luni): 38

CUANTIFICAREA STATISTICO-INFORMAŢIONALĂ A BIODIVERSITĂŢII LA

RASELE DE OVINE CRESCUTE ÎN ROMÂNIA CU AJUTORUL MARKERILOR

GENETICI

Contractor: SCDCOC Popăuți-Botoşani – Conducător proiect (CP)

Agent economic: S.C. AGRO IND COM S.R.L. Botoşani – Partener 1 (P1)

• Elaborarea metodologiei experimentale privind estimarea resurselor genetice la specia

ovină cu ajutorul statisticii informaționale;

• Identificarea și analiza unor markeri genetico-biochimici, imunogenetici și genetico-

moleculari la ovine;

• Comensurarea relațiilor genetice dintre rasele de ovine pe baze genetico-biochimice,

imunogenetice și genetico-moleculare cu ajutorul corelației informaționale și a distanței

genetice;

• Cuantificarea diversității genetice la rasele de ovine pe baze genetico-biochimice,

imunogenetice și genetico-moleculare cu ajutorul energiei informaționale și al entropiei

informaționale;

• Transpunerea în produs software a metodologiei de cuantificare a diversității genetice la

ovine cu ajutorul conceptelor de statistică informațională;

• Fundamentarea (conceptualizarea) metodologiei de cuantificare statistico-informațională a

biodiversității la specia ovină utilizând markerii genetici.

CONŢINUTUL TEMATIC:

- Principală ţintă a proiectului a fost evaluarea polimorfismului unor markeri genetici la

specia ovină, care sa contribuie la un management sustenabil al patrimoniului genetic şi

conservarea biodiversităţii, prin concepte de statistică informaţională.

- Pentru atingerea obiectivelor proiectului cercetările au fost efectuate pe populatii de

ovine din rase autohtone Karakul de Botoşani, Ţurcană, Ţigaie, Merinos din diferite exploataţii

zootehnice.

Obiectivul principal al proiectului:

- Eşantionarea animalelor şi recoltarea probelor biologice pentru analizele programate a

fost făcută în funcţie de cerinţele experimentului pe criterii de vârstă, sex, varietate de

culoare, linie zootehnică, tip morfo-productiv, ecotip etc.

1. Metode de analiză a sistemelor genetico-biochimice:

▪ Identificarea fenotipurilor hemoglobinei, transferinei, albuminei etc, a fost realizată prin

metode electroforetice specifice; Polimorfismul celor şase proteine majore din lapte, patru din

fracţiunea cazeinică (alfa S1-cazeina, beta-cazeina, alfa S2-cazeina şi K-cazeina) şi două din

lactoserum (alfa-lactoalbumina şi beta-lactoglobulina) a fost analizat prin tehnica focalizării

izoelectrice (IEF);

▪ Identificarea fenotipurilor elementelor minerale (potasiu, sodiu etc.) a fost realizată

prin metoda flamfotometrică.

Metodele de analiză de laborator folosite

2. Metode de analiză a sistemelor imunogenetice:

▪ Identificarea fenotipurilor factorilor de grupă sanguină a fost realizată prin metoda

imunoserologică a testului hemolitic şi a hemaglutinării.

3. Metode de analiză a polimorfismului ADN:

▪ Identificarea markerilor moleculari de tip SNP din gena calpastatinei, gena responabilă de

Sindromul Spider Lamb, genele asociate cu prolificitatea, genele care codifica proteinele din

lapte (alfa S1-cazeina şi beta-lactoglobulina) a fost realizată prin metoda PCR-RFLP;

▪ Caracterizarea profilului polimorf al alfa s1-cazeinei, evidenţiat prin electroforeza IEF la

indivizi din rasa Merinos, a fost realizată prin amplificarea şi secvenţierea întregii regiuni

codificatoare a genei;

3. Metode de analiză a polimorfismului ADN:

▪ Identificarea polimorfismelor din gena PRNP, asociată cu rezistenţa sau susceptibilitatea la

scrapie a ovinelor, a fost realizata prin trei metode: Real-Time PCR (folosind un kit comercial)

şi două metode alternative testate în cadrul cercetărilor efectuate. Una dintre metode se

bazează pe amplificarea şi secvenţierea întregii regiuni codificatoare a genei PRNP, iar

cealaltă pe amplificarea parţială şi microsecvenţiere prin metoda extensiei primerilor;

▪ Determinarea filiaţiei descendenţilor a fost realizată prin analiza unui panelul de 22 markeri

ADN microsateliţi. Metoda a fost testată şi validată pe un eşantion de ovine din rasa Karakul

de Botoşani;

▪ Evaluarea comparativă a unor indici de diversitate genetică relevanţi şi a distanţelor

genetice dintre patru rase autohtone: Karakul de Botoşani (KB), Ţurcană (Ţu), Ţigaie (Ţi),

Merinos Românesc (RoM) şi una străină - Merinos Spaniol (SpM) a fost realizată pe baza

rezultatelor de genotipare obţinute la 22 de loci microsateliţi, cu ajutorul unor programe

bioinformatice disponibile;

▪ A fost creat un produs software, care permite încărcarea datelor de identificare ale ovinelor,

a rezultatelor testelor genetice efectuate şi calcularea unor parametrii de diversitate genetică,

cum ar fi frecvenţa de genă şi genotip.

Metodele de analiză de laborator folosite

Principale rezultate obţinute. Concluzii

- Cuantificarea statistico-informațională a biodiversității unor rase de ovine crescute în

România a vizat evaluarea polimorfismului unor markeri genetico-biochimici, imunologici şi a

unor markeri ADN de tip SNP şi microsateliţi;

- De departe informaţiile cele mai precise privind polimorfismul genetic şi calcularea unor

parametrii de diversitate genetică şi a distanţelor genetice dintre rasele de ovine studiate au

fost obţinute prin analiza unor markeri ADN;

- Cei mai polimorfi markeri de tip SNP studiaţi la ovine s-au dovedit a fi cei localizati în

genele, beta-lactoglobulinei, alfa S1-cazeinei (responsabile de sinteza acestor proteine

specifice din lapte) şi în gena PRNP, care codifică o proteină responsabilă de funcţionarea

neuronilor şi care prin mutaţii determină sinteza unei proteine modificate numită prion,

asociată cu apariţia scrapiei la ovine;

- Un polimorfism foarte accentuat la rasele de ovine studiate s-a constatat în cazul

markerilor microsateliţi;

- Principale rezultate obţinute în cazul celor mai relevanţi markeri studiaţi vor fi sintetizate

în continuare.

Figura 1. Profil electroforetic IEF

evidenţiind polimorfismul proteinelor

majore din lapte la o parte din indivizii din

cele patru rase de ovine studiate: a.

Merinos; b. Karakul de Botoşani;

c.Ţurcană ; d. Ţigaie.

1. Analiza polimorfismului genetic al celor şase proteine majore din lapte la ovine

- Analizele au fost realizate pe eşantione de ovine din patru rase authohtone Karakul de

Botoşani (KB), Ţurcană (Ţu), Ţigaie (Ţi). Acestea au evidenţiat un monomorfism în cazul beta-

cazeinei, alfa S2-cazeinei, K-cazeinei şi alfa-lactoalbuminei (Figura 1).

- La toate rasele analizate s-a constatat un polimorfism al beta-lactoglobulinei, caracterizat

prin prezenţa a două alele A şi B (Figura 2).

Figura 2. Frecvenţele alelelor şi genotipurilor la rasele luate în studiu.

- La rasa Merinos, în cazul alfa S1-cazeinei X, s-a constatat un profil de migrare mult mai

catodic faţă de cel al variantei comune C, cauzat probabil de mutaţii în secvenţa de

aminoacizi a proteinei X care afectează punctul izolectric (Figura 3).

Figura 3. Profil electroforetic IEF evidenţiind

polimorfismul alfa S1-cazeinei la rasa Merinos (RoM):

Probele 1, 9 - genotip CX; Probele 2-8, 10 - genotip CC.

- Secvenţierea întregii regiuni codificatoare a alfa S1-cazeinei de la indivizii normali CC şi

polimorfi CX, a evidenţiat prezenţa unei substituţii nucleotidice de tip G/A în codonul 68 -

AGT/AAT. Ea determină în proteină substituţia unei serine (S) cu o asparagină (N). Aceasta

corespunde cu varianta genetică D (welsh), evidenţiată şi la alte rase de ovine din

străinătate.

- La locusul alfa S1-cazeina a fost identificată cu frecvenţa 1 prezenţa alelei C la trei din

cele patru rase analizate, asociată în multe studii cu calităţi superioare de procesare a laptelui

şi randamente mai mari de obţinere a brânzeturilor;

2. Analiza polimorfismului genei PRNP la ovine

- Analiza polimorfismului genei PRNP la ovinele din rasele Karakul de Botoşani (KB),

Ţurcană (Ţu), Ţigaie (Ţi) au vizat testarea unor metode bazate pe analiza ADN de identificare

a mutaţiilor din codonii 136, 141, 154 şi 171, asociaţi cu rezistenţa sau susceptibilitatea la

scrapie;

- Genotiparea a fost realizată prin tehnicile Real-Time PCR (cu un kit comercial),

secvenţierea întregii regiuni codificatoare a genei PRNP, respectiv microsecvenţiere.

Figura 4. a. Produşi specifici obţinuţi prin amplificarea exonului 3 al genei PRNP la ovinele analizate. L - ladder

de 100 pb; b. Cromatogramă de secvenţiere evidenţiind codonii polimorfi 136, 141, 154, 171, asociaţi cu

genotipul ARR/ARQ; c. Cromatogramă de microsecvenţiere evidenţiind codonii polimorfi 136, 154 şi 171

asociaţi cu genotipul ARR/ARQ.

- Pe baza datelor de genotipare obţinute, indivizii au fost clasificaţi în mai multe clase de

risc conform nomenclaturii existente;

Figura 5. Date privind frecvenţele genotipurilor obţinute la ovinele genotipate la locusul PRNP, evidenţiate

pe clase de risc.

- Genotiparea la locusul PRNP a indivizilor din cadrul raselor de ovine luate în studiu a

permis stabilirea structurii genetice (calcularea frecvenţelor alelelor şi genotipurilor) la acest

locus;

- O parte dintre rezultatele obţinute sunt evidenţiate în Figura 5.

- În eşantionul de indivizi analizaţi din rasa Karakul de Botoşani au fost identificate cu

frecvenţa cea mai mare genotipuri din clasa de risc R3 (0,61), respectiv din clasa de risc R2

0,31). Genotipurile din clasele de risc R4 şi R5, care în mod normal trebuie eliminate de la

reproducţie, nu au fost identificate în eşantioanele analizate;

- În eşantionul de indivizi analizaţi din rasa Ţurcana au fost identificate predominat

genotipuri din clasa de risc R2 (0,60), respectiv din clasa de risc R3 (0,20);

- În eşantionul de indivizi analizaţi din rasa Ţigaie au fost identificate predominant

genotipuri din clasele de risc R1 (0,17), R2 (0,25), respectiv R3 (0,41).

3. Analiza polimorfismului markerilor microsateliţi la ovine

3.1 Analiza filiaţiei la ovine cu ajutorul markerilor microsateliţi

- Cercetările realizate în acest sens au vizat testarea şi validarea, pe un număr de 12

familii de ovine din rasa Karakul de Botoşani (din 5 varietaţi de culoare) a unei metode de

confirmare a filiaţiei pe baza amprentei ADN generată cu ajutorul a 22 de markeri microsateliţi

specifici ovinelor.

3.2. Evaluarea comparativă a unor indici de diversitate genetică relevanţi şi a

distanţelor genetice dintre unele rasele de ovine autohtone cu ajutorul

markerilor microsateliţi

- Evaluarea diversităţii genetice a ovinelor luate în studiu aparţinând la patru rase

autohtone: Karakul de Botoşani (KB), Ţurcană (Ţu), Ţigaie (Ţi), Merinos Românesc (RoM) şi

una străină - Merinos Spaniol (SpM) şi stabilirea distanţelor genetice a fost realizată pe baza

datelor de genotipare a 22 de markeri microsateliţi specifici.

- Markerii microsateliţi sunt reprezentaţi în genomul animalului sub forma unor secvenţe

nucleotidice repetitive în tandem şi prezintă o rată mare de mutaţii. De aceea, un microsatelit

de la un anumit locus poate coexista în mai multe forme variabile ca lungime în cadrul unei

rase / populaţii de animale.

3.1 Analiza filiaţiei la ovine cu ajutorul markerilor microsateliţi

- Analiza rezultatelor obţinute prin amprenta ADN generată prin amplificarea unui panel de

22 de markeri ADN microsateliţi specifici ovinelor, a permis stabilirea cu precizie a filiaţiei în

cele 12 familii de ovine din rasa Karakul de Botoşani luate în studiu (Figura 6).

- Amprenta ADN generată pentru fiecare individ în parte, organizaţi pe familii conform

fişelor de montă, a evidenţiat faptul că toate mamele (M1-M12) din cele 12 familii (F1-F12) de

ovine din rasa Karakul de Botoşani s-au calificat ca mame genetice ale descendenţilor

nominalizaţi, în conformitate cu fişele de montă;

- În cazul berbecilor, doar 3 dintre cei 12 masculi au fost excluşi ca taţi potenţiali ai

descendenţilor, restul de 9 fiind taţii genetici reali, în concordanţă cu fişele de montă;

- Procentul de taţi incompatibili nu a fost mare, având în vedere condiţiile de management

reproductiv mai dificil în cazul ovinelor. Metoda folosită pentru stabilirea filiaţiei s-a dovedit o

unealtă extrem de utilă care ar putea contribui substanţial la un management mai bun al

reproducţiei în fermele de ovine.

3.2. Evaluarea comparativă a unor indici de diversitate genetică relevanţi şi

a distanţelor genetice dintre unele rasele de ovine autohtone cu ajutorul

markerilor microsateliţi

- Analiza ,,population assignment” (Figura 7), a evidenţiat faptul că un procent de 94% dintre

indivizii studiaţi au fost atribuiţi corect rasei de provenienţă. Un individ din rasa Ţu a fost

atribuit rasei KB, explicat prin contribuţia acesteia la formarea rasei KB. Un individ din rasa

RoM a fost atribuit rasei SpM, iar unul din rasa SpM a fost atribuit rasei RoM, explicat prin

fondul lor de gene comun.

- În cazul rasei KB gradul de heterozigoţie observat

(Ho) a fost mai mic decât cel aşteptat (He), ceea ce

sugerează un anumit grad de consangvinizare. Cea

mai mare valoare a indicelui de heterozigoţie a fost

observată la rasa Ţi (0,771), iar cea mai mica la

rasa KB (0,672) (Figura 8);

- Rasa KB a prezentat un grad mare de diferenţiere

genetică faţă de rasele Ţu, Ţi, RoM şi SpM, cu valori

ale Fst între 0,056-0,066. Cea mai mare diferenţiere

între rasele autohtone luate în studiu s-a constatat

între Ţu şi RoM (0,071), în timp ce rasa RoM este mai

apropiată genetic de rasa Ţi. Cel mai mic grad de

diferenţiere genetică s-a constatat între rasele RoM şi

SpM (Figura 9);

- Calcularea distanţelor genetice Nei, a confirmat diferenţierea clară între rasele analizate

(Figura 10);

- Analiza structurii genetice a celor cinci rase luate în studiu a evidenţiat încă de la K=2 o

diferenţiere clară între KB versus Ţu, Ţi, RoM şi SpM. Diferenţierea se referă la formarea a

două clustere, care evidenţiază structura lor genetică diferită (Figura 11). Rasa KB are origine

Asiatică şi a fost obţinută prin încrucişarea în generaţii succesive a unor berbeci din rasa

Karakul cu populaţii locale de ovine din zona Moldovei. La K=2 celelalte patru rase luate în

studiu formează un singur cluster deoarece originea fondului lor de gene este Europeană.

Figura 11. Structura genetică comparativă la

K=2 a populaţiilor de ovine din cele cinci

rase analizate.

Figura 12. Structura genetică comparativă la

K=3 a patru (Ţu, Ţi, Ro-M şi Sp-M) din cele

cinci rase de ovine analizate.

- Structurarea genetică a raselor de ovine studiate Ţu, Ţi, RoM şi SpM (fără KB) devine mai

evidentă la K=3 şi K=4 (cel mai probabil numar de clustere conform valorii delta K). O primă

observaţie este diferenţiere clară între rasa RoM versus Ţu şi Ţi. Rasele Ţu şi Ţi evidenţiază

similarităţi genetice, explicate printr-un posibil flux de gene pe parcursul formării lor. Cele două

rase din grupul Merinos (RoM şi SpM) se diferenţiază genetic încă de la K=3.

- Analizele genetice efectuate în cadrul proiectului, folosind markeri genetici de

tip SNP şi microsateliţi, au permis pe de-o parte evaluarea polimorfismului câtorva

loci implicaţi în determinismul genetic al unor caractere fenotipice de interes, iar pe

de alte parte evaluarea diversităţii şi a distanţelor genetice între rasele de ovine

analizate;

- Folosirea ulterioară a unor metode de analiza genomică va permite estimarea

mai precisă a indicilor de diversitate genetică sau stabilirea distanţelor genetice între

rase / populaţii de animale, dar şi identificarea cu precizie a substratului genetic al

unor caractere fenotipice de interes, esenţiale în stabilizarea genetică a caracterelor

specifice fiecarei rase.

Recomandari