Capitolul 12

METODE ŞI TEHNICI MODERNE MOLECULAR - BIOLOGICE ŞI APLICAŢIILE LOR

12. 1. RECOMBINAREA ADN - ului

Teoria stabilitaţii genomului celular a fost zdruciunatǎ în anul 1951, odatǎ cu descoperirea elementelor transpozabile. Fenomenul destabilizării genomului celular a rǎmas inexplicabil până în momentul în care a fost posibil studiul moleculei de ADN.

Concentrarea studiilor asupra ADN a fǎcut posibilǎ injectarea genelor cu ajutorul virusurilor vectoare in celule, deschizînd perspectivele noii terapii cu gene (terapie geneticǎ = Gene Targeting). Respectivele virusuri (vectoare de gene) cu aspect de ,,ace” sînt introduse ţintit prin ,,împuşcare” (shotgun) într-un numǎr foarte mare de ,,ţinte celulare”, care includ linii foarte variate de organisme; Aceastǎ metodǎ a dus la o revoluţie tehnico-ştiinţificǎ a cǎrei consecinţǎ a fost construirea de noi genotopuri, la toate tipurile de bacterii, plante, animale.

Faptul cǎ informaţia geneticǎ a organismelor vii se gǎseşte acumulatǎ pe helixul ADN, iar acest material genetic poate fi izolat iar cele douǎ lanţuri ale dublului helix ADN separate şi apoi fiecare din cele douǎ lanţuri recombinate cu un alt lanţ de ADN străin complementar, dǎ posibilitatea creǎrii de noi organisme, atît în condiţii naturale,cât şi laborator.

Procese naturale de recombinare ADN (recombinare genetică)Joacă un rol foarte important în natură, reprezentând un factor evolutiv; existenţa acestor

procese se explică apariţia unor noi specii.Procese artificiale de recombinare ADN (tehnologia ADN-ului recombinat)Se realizează în condiţii de laborator, în vederea obţinerii de noi variante de

microorganisme şi plante, printr-un număr de metode ce formează tehnologia genetică, cunoscute la nivel internaţional sub numele de Genetic Engineering.

Descrierea compoziţiei şi structurii spaţiale a ADN de către J. D. Watson şi Fr. Crick din anii 1953 au reprezentat cunoştinţele fundamentale care au stat ulterior la baza noilor direcţii de cercetare, şi anume a tehnologiei genetice. Prima reuşită de recombinare a fost realizată în SUA în 1970. Aceste tehnici încearcă pe cale artificială combinatrea informaţiei genetice (a genelor) de la două organisme diferite, în vederea creării unui organism nou cu proprietaţi prestabile (ţintite); organismele rezultate sunt organismele recombinate care formează astăzi obiectul unor studii cu implicaţii deosebite în dezvoltarea ştiinţifică şi economică pe scară internaţională, cu mari perspective de viitor.

Aceste tehnici de recombinare genetică stau la baza cercetărilor fundamentale şi aplicare în biologia moleculară, farmacologie şi în medicina viitorului, în scopul ameliorării diagnosticului şi terapiei medicale într-un număr mare de boli. Aceste tehnici vor avea implicatii majore şi în dezvoltarea agriculturii, în ceea ce priveşte crearea unur specii noi de plante cu o mare eficienţă economică.

12.1.1. Principiul recombinării

Un proces natural de recombinare genetică există la organismele eucariote (cu set diploid de cromozomi) în cursul meiozei (diviziune reducţională). Meioza are loc în celulele germinale şi duce la reducerea setului dublu de cromozomi (set diploid) în set haploid (simplu). În prima fază se produce un schimb de fragmente cromatidiene între cromozomi omologi (M/P=materni/paterni) alăturaţi printr-un fenomen de ,,crossing-over”, ceea ce reprezintă un fenomen de recombinare genetică.

252

Într-un organism diploid cu un anumit număr de perechi de cromozomi omologi şi o singură pereche de cromozomi sexuali, fiecare cromozom în interfază apare format din cîte două cromatide (iar fiecare cromatiodă la rîndul ei dintr-o moleculă de ADN dublu helix). Prin încrucişarea cromatidelor (crossing-over) pe locul de încrucişare, lanţurile duble ADN ale celor două cromatide vor fi tăiate, vor interschimba fragmente de ADN, iar apoi capetele tăiate se vor lega altfel, rezultând cromatide recombinate (molecule ADN recombinate). La cromozomii umani există în medie două-trei asemenea fenomene de crossing-over şi interschimburi de fragmente ADN pe ambele cromatide ale unui cromozom. Aceste procese se produc atît de exact, încît nu se pierde nici un nucleoid. După interschimburile între cromatidele cromozomilor omologi se produce separarea acestor cromozomi cu cromatidele interschimbate şi împarţirea lor între cele două celule fiice.

În faza a II-a a meiozei urmează separarea cromatidelor în patru celule germinative mature. Aceste patru celule pot conţine:

c1 = numai material matern c2 = numai material patern c2 şi c3 = material cromatidian recombinat (rezultat din fenomenul de

crossing-over) matern şi patern.

12.1.2. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering)

Cu ani în urmă era posibilă doar cercetarea indirectă a ADN-ului asupra produselor ARN şi proteice, sau analiza genetică foarte laborioasă asupra funcţiei genelor prin cercetarea aspectelor fenotipice ale organismelor mutante şi ale progeniturii acestora. Tehnologia ADN-ului recombinat, care a apărut în jurul anilor ’70, a revoluţionat biochimia, oferind posibilitaţile cele mai eficiente pentru analizarea şi modificarea genelor (ADN) şi proteinelor din organismele vii. Pe baza acestei tehnologii, astăzi poate fi modificat într-un mod dinainte stabilit şi ţintit bagajul genetic al organismelor. Tehnicile de recombinare ADN stau la baza progreselor biotehnologiei moderne, aceste tehnici vizînd direct informaţia genetică a organismelor, utilizarea acestor metode putînd duce în viitor la înfrângerea barierei între specii. Prin procedeele de inginerie genetică se poate obţine, prin introducerea unei informaţii genetice într-un organism, un organism cu priorietăţi noi (de exemplu, obţinerea de noi soiuri de plante cu rezistenţă crescută şi agenţi dăunători).

Tehnologia ADN recombinant presupune următoarele etape: tăierea lanţurilor duble ADN în fragmente specifice, prin acţiunea

enzimelor de restricţie, astfel încât să fie obţinute în final fragmente ADN de lanţ unic; pe această cale, moleculele ADN cu greutate moleculară înalta sînt tăiate în molecule cu greutate moleculară mult mai mică. Concomitent cu ADN-ul de cercetat, vectorul (virusul) este supus şi el acţiunii aceloraşi enzime de restricţie, pentru că, în final, pe ambele lanţuri de acid nucleic (lanţ unic de cercetat şi lanţ unic al vectorului), să se obţină acelaşi tip de capete adezive:

fragmentul de acid nucleic de cercetat, cît şi cel al vectorului se leagă covalent (în cursul unui process de circularizare) în prezenţa ADN-ligazelor

introducerea, o data cu vectorul, a respectivului fragment de ADN selecţionat şi fixat pe vector în celula gazdă (celula bacteriană avirulentă de Esch. coli K12)

multiplicarea sincronă, o data cu celula gazdă, a vectorului şi a fragmentului ADN străin încorparat în genomul celulei gazdă. Apar în consecinţă un număr mare de celule purtătoare de copii identice de ADN recombinat. Acest process poartă numele de clonare. În cadrul acestui proces, celula bacteriană astfel ,,nou construită” (cu ADN recombinat)

reprezintă celula cap de colonă.

253

Construirea unui genom nou prin introducerea unei secvenţe ADN străine în genomul unei celule gazdă (de exemplu, bacteria, organisme multicelulare) reprezintă de fapt tehnica de inginerie genetică prin care se obţin genomuri modificate ce pot fi ulterior exprimate (transcrise şi translaţionate) de către celula gazdă, prin sinteza de noi proteine (caractere noi cîştigate de celula gazdă).

Termenul Genetic Engineering este adesea folosit drept similar celui de recombinare ADN, din care rezultă un nou genom (prin introducerea, în genomul unei celule, a unei secvenţe străine de ADN cu autorul vectorului), celula respectivă cîştigă caractere noi. Prin aceste metode genetice pot fi manipulate, modificate şi interschimbate sau nou recombinate atît secvenţele codificatoare, cît şi secvenţele de control ale unei gene. Este posibil să se facă noi combinaţii pentru secvenţele de control ale unei gene şi să se determine în acest fel exprimarea unei gene dorite, intr-o anumită celulă. Astfel, prin alegerea unei anumite secvenţe de control, se poate reuşi exprimarea practice permanentă a unei gene altminteri slab activă; în acest context proteinele, care în cantităţi mari în calula nou construită. Pentru creşterea acestei cantităţi de proteine se utilizează de regulă fragmente de ADNc (secvenţe codificatoare fără introni). Dacă se urmăreşte introducerea şi exprimarea unor gene eucariote în bacterii şi drojdii, se folosesc tot fragmente ADNc deoarece aceste microorganisme nu sînt capabile să îndepărteze prin fenomene de splicing din ARNm transcris secvenţele de introni.

Etapele metodei de inginerie genetică utilizată în vederea obţinerii unei anumite proteine în cantitate mare sînt următoarele: se porneşte de la matricea ADN; se obţine o copie de ADNc (în prezenţa reverstranscriptazei); se obţine un lanţ dublu ADN; respectivul lanţ dublu ADN este clonat; fragmentul ADNc clonat este înglobat în vectorul de exprimare; fragmentul ADNc înglobat în vector este introdus în celula receptor o

dată cu vectorul; în celula receptor se produce transcrierea şi translaţia fragmentului ADNc

strain (introdus), obţinându-se în final sinteza proteinei dorite.Folosind această metodă s-a reuşit ca celulele bacteriene, drojdiile şi celulele de

memifere să fie aduse în starea de a produce cantităţi mari de anumite proteine ţintă. În acest fel devine posibilă analiza proteinelor celulare, care, în mod normal se găsesc în organism în cantităţi foarte mici (doar urme) şi ar scăpa astfel cercetării. Proteinele sintetizate prin această metodă şi-au găsit utilizare în terapie şi profilaxie.

Pornindu-se de la aflarea expresiei anumitor gene s-a putut ajunge la descifrarea funcţiei unor proteine cu rol în procesele şi diviziune celulară, prin aceasta creîndu-se bazele pentru cercetarea şi găsirea cauzelor unor boli genetice.

12.1.3. Elemente de lucru utilizate în tehnologia ADN recombinat

Aceste elemente de lucru sunt reprezentate de:- enzimele de restricţie;- ADN-ligazele;- vectorii.

12.1. 3. 1. Enzimele de restricţie Sunt endonucleaze de origine bacteriană; ele clivează moleculele de ADN strain (de

exemplu, ADN viral pătruns în respectica celulă bacteriană) fără a cliva însă ADN-ul bacterian propriu, deoarece ADN-ul bacterian poartă un semn de recunoaştere (un password ) care este reprezentat de nişte situs-uri specifice metilate. Metilarea reprezintă un mecanism de apărare al celulei bacteriene faţă de propriile endonucleaze; într-o celulă bacteriană, un dublu helix ADN nou-sintetizat şi metilat numai pe un lanţ este recunoscut ca propriu de către celula

254

bacteriană, nefiind digerat de endonucleaze, iar în timp metilaze converteşte treptat ADN-hemimetilat în total metilat. Metilazele recunosc pe lanţul ADN bacterian aceleaşi secvenţe ca şi endonucleazele.Nucleazele bacteriene se clasifică în: exonuleaze care se fixează pe molecula de ADN numai la capătul ei; endonucleaze care nu se fixează la extermităţile moleculei ADN, ci se fixează în

interiorul moleculei de ADN, unde produc ruptura (tăierea). În această categorie se încadrează şi endonucleazele de restricţie.Endonucleazele de restricţie au acţiuni secvenţial-specifică; se fixează pe o anumită

secvenţă nucleotidică, despicând-o (clivare prin hidroloza legăturii fosfodiesterice) îndepărtând astfel respectivul segment dublu de ADN. Secvenţele de baze recunoscute de către aceste enzime sînt palindromice (aceleaşi, dar poziţionate în sens invers pe cele două fire ale dublului helix ADN), fiind citite de aceste enzime la fel pe cele două lanţuri şi rezultând un clivaj poziţionat simetric pe ambele lanţuri. Aceste endonucleaze se găsesc în număr mare la procariote.

S-au descris enzimele de restricţie I, II şi III, dintre care: enzimele I şi II recunosc secvenţele specifice şi se fixează pe acestea cu următoarele

particularitaţi: enzimele I taie nespecific 100-1000 de perechi de baze, în afara regiunii specifice în

direcţia 5’ 3’ pe lanţul ADN; enzimele II au locul recunoaştere, fixare şi tăiere (4-6 nucleoide) de obicei constant deci

au specificitate de secvenţă absolută, motiv pentru care sînt preferate în studiile de recombinare ADN;

enzimele III taie nespecific 20-30 de perechi de bază în direcţia 5’ 3’ pe lanţul ADN.Endonuleozele de restricţie sunt denumite după microorganismele din care se izolează:

enzime I Eco K şi B (izolate din E. coli); enzime II Eci RI (izolate din E. coli); pot recunoaşte situs-urile ţintă ale ADN ului

palindronic, dar în prealabil trebuie să fie rupte perechile de baze care ţin unite cele două lanţuri complementare ADN

Bam HI (izolate din Bacillus amilolichefaciens) Hpa I (izolate din Haemophilus parainfluenzae) Hin + III (izolate din Haemophilus influenzae)

Enzima II au fost supranumite şi, foarfeci moleculari”; ele recunosc o secvenţă de 4-6 nucleotide şi pot tăia cele două lanţuri ale helixului ADN, în mod: simetric, rezultând capete drepte; asimetric, rezultând capete coezive. Până în prezent s-au purificat peste 90 de enzime de restricţie.

Un segment de ADN obţinut prin acţiunea unei enzime de restricţie poate fi clivat main departe în segmente mai mici de către alte enzime de restricţie. Structurile acestor fragmente finale pot servi drept, amprente” (fingerprints) ale unei molecule de ADN.

Cromozomii complecşi care conţin sute de milioane de bace pot fi astfel secţionaţi şi apoi cartaţi stabilindu-li-se harta genelor, prin folosirea enzimelor de restricţie.

Prin enzimele de restricţie s-a descris şi un grup special de enzime care au fost numite izoschizomeri; acestea recunosc aceleaşi secvenţe nucleotidice, deşi fiecare taie asemenea secvenţe localizate, însă în poziţii diferite pe respectivul lanţ ADN.

Descrierea enzimelor endonucleaze de restricţie a făcut posibilă revoluţia ştiinţifică biologică şi dezvoltarea tehnologiei ADN recombinat (modificări ţintite în structiura genelor şi proteinelor şi analiza acestora bazată pe enzimologia acizilor nucleici).

12.1. 3. 2. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele)ADN-ligazele nu pot lega două lanţuri unice de ADN, ci doar două lanţuri ADN ce

aparţin aceleiaşi molecule ADN duble helix.

255

Aceste enzime catalizează formarea unei legături fosfodiesterice între gruparea 3’-OH a unei extermităţi a unui lanţ ADN şi gruparea 5’-fosfat de la extermitatea celuilalt lanţ.Procesul de legare (linkare) mediat de ADN-ligaze este esenţial pentru sinteza normală a ADN, procesul de reparare a ADN, procesul de recombinare genetică..

12.1.3.3. VectoriiSe deosebesc două categorii majore de vectori: A. Vectori de expresie; B. Vectorispeciali.

Vectorii de expresie Vectorii folosiţi pentru sinteza unor cantităţi mari de proteine:

- plasmide: factorul F, factorul R, factorul Col;- bacteriofagi: fagul λ; φ80; fagul μ- cosmide (fragmente de φ* λ+ plasmid )- fragemide (φ+plasmid)- secvenţe de inserţie (SI) 0,8-1,4 kb.

Vectori de transcriere (pentru sinteza ARN):- plasmid + φ promotor (SP6)- plasmid +2 φ promotori (SP6 ş T7)

Vectori speciali:- retrovirusuri- retrovirus+plasmid Ti

A. Vectori de expresiea1). Vectori folosiţi pentru sinteza unor cantitaţi mari de proteine.

PlasmideleReprezintă o clasă majoră de elemente genetice mobile. Sunt prezente atît celulele

procariote (bacterii), cît şi la eucariote. La procariote sunt molecule de ADN dublu helix circular din dimensiuni de la două la cîteva sute de kilobaze; reprezintă material genetic extracromozomial (cromozomi accesorii). Spre diferenţă de ADN-ul cromozomial, esenţial pentru supravieţuirea celulei, ADN-ul extracromozomial poate disparea la un moment dat din celulă, fără ca absenţa acestuia să afecteze viaţa celulara. În unele celule pot exista simultan 1*20 copii ale unei plasmide. În celula bacteriană, genomul celular este reprezentat de materialul genetic cromozomial genetic cromozomial şi extracromozomial (inconstant). Greutatea moleculară a unui plasmid variază între 1,5-200 x 10 daltoni (5% din greutatea cromozomială).

Un plasmid este constituit dintr-un segment format din una sau mai multe gene, care imprimă o proprietate sau mai multe proprietăţi celulei bacteriene (de exemplu, rezistenţă sau multirezistenţă la antibiotice);un segment care asigură transferul plasmidic de la o celulă la alta (factor de transfer).

În 1976, plasmidele erau definite de Novick drept ,,repliconi stabili moşteniţi în stare extracromozomială, capabili a se replica independent de cromozom”. În 1981, Dhillon şi Colob. propun pentru plasmide termenul de ,,repliconi accesori” (neesenţiali), dar astăzi se ştie că aceşti repliconi joacă un rol important în procesele de selecţie şi de adaptare a celulelor bacteriene, ca răspuns la modificarile din mediul extern.

Plasmidele s-au dovedit a fi unelte foarte valoroase în cercetarile efectuate în scopul aprofundării unor procese fundamentale de biologie moleculară (replicarea ADN, incompatibilitatea).

Astăzi plasmidele sunt considerate ,,entităţi fundamentale ale celulei bacteriene”, reprezentînd o parte vitală a pool-ului de gene, determinînd potenţialul de adaptare al celulei

256

gazdă la condiţiile de mediu. Prin cîştigarea plasmidelor, celulele bacteriene au fost înzestrate cu noi căi enzimatice în cursul evoluţiei. Zestrea plasmidică este un atribut de tulpină (şi nu de specie).

Plasmidele pot fi: neintegrate, libere în citoplasma celulei. Se mai numesc şi autonome (de exemplu, factorii

de bacteriocinogenie ColE1 colE8, Col I, Col V). aceste plasmide de replica autonom, asincron şi mai frecvent decît ADN-ul cromozomial; în acest caz există 10-20 de copii per celulă;

integrate (epizomi), inserate în cromozomul bacterian (de exemplu, factori de bacteriocinogenie pentru sinteza piocinelor). De replica concomitent cu ADN cromozomial şi există în una-două copii per celulă.

În 1972, Clowes delimita două grupe majore de gene plasmidice (plasmid-borngenes): agregate, exclusiv de origine extracromozomială; au potenţial de răspândire foarte larg a

anumitor caractere printe bacterii; s-au dezvoltat primele, din ele derivînd apoi cointegratele. Sînt sisteme economice pentru conservarea anumitor mesaje genetice care se transmit masei de celule dar în caz de nevoie, în cursul procesului de adaptare la noi condiţii de mediu. Una sau mai multe plasmide (neconjugative, de exemplu factorul Col) se transmit 100% de la o celulă la alta cu ajutorul factorul F (plasmid conjugativ); în cazul tratamentului celulei receptor cu un factor curing (acridin oranj etc.) se pierde doar factorul F, dar rămân factorii Col (linkaj reversibil).

cointegrate reprezintă elemente genetice compuse din doi sau mai mulţi repliconi aşezaţi într-o continuitate liniară, în care fiecare replicon îşi păstrează independenţa fizică a replicării deoarece fiecare replicon are propriul său replicator (de exemplu, cointegratul F. ColV. ColB. trp.cys.)

Cointegratele sunt sisteme funcţionale mai eficiente decît cele ale agregatelor din punct de vedere al transferului şi stabilităţii caracterelor linkate. În raport cu caracterele fenotipice exprimate, se cunosc pînă în prezent următoarele tipuri de plasmide: de rezistenţă la agenţii microbieni; de rezistenţă la raze u.v. (codifică enzime care intervin în mecanismele de reparare a ADN

celular); pentru sinteza bacteriocinelor; pentru sinteza agenţilor antitumorali: de exemplu, agrocina 84 (sintetizată de tulpina

bacteriană de Agrobacterium radiobacter) cu acţiune bactericidă asupra bacteriei abrobacter tumefaciens (agent de colonizare, adeziune, hemolizine, enterotoxine, factori chelatori de ioni de fier);

codificatoare de enzime ale unor căi metabolice, fixate de azot (de exemplu, la tulpini de Klebsiella), degradarea camforului, toluenului (tulpina de Pseudomonas);

plasmide ,,criptice” ale unor caractere somatice (nu au putut fi încă indetinficate).

Factorul FEste plasmidul care induce conjugarea la bacterii. Acest fenomen presupune un

transfer de material genetic de la celula donoare, la celula receptoare, prin intermediul factorului F (factor plasmidic-vector), numit şi factor de fertilitate.

Celula donoare conţine factorul F liber în citoplasmă este notată F+, sau inclus în cromozomi (Hfr); celula receptoare (F-) este celula care primeşte factorul F.

Reiese de aici că trasnferul de material genetic este polarizat de la celula F+ sau Hfr către celula F-, începând de la capătul 5’ al ADN-ului.

Factorul Col

257

Reprezintă plasmidul responsabil de sinteza colicinelor (bacteriocine produse de tulpinile bacteriene de Escherichia coli).

În general bacteriocinele sunt principii actici sintetizate de bacterii, cu acţiune bactericidă asupra unor bacterii din aceeaşi specie, specii inrudite dar şi foarte îndepărtate. Bacteriocinele se subdivid în două categorii: necorpusculare (nonparticulare) cu greutate moleculară mica, de natură chimică

enzimatică, analogi adenin-nucleozidici, proteică dau de natură complexă glicoproteică. corpusculară (particulară) cu greutate moleculară mare, prezentînd aspecte omologe cu

diferite, componente fagice defective (capete goale de fagi, structuri de cozi goale sau pline, cozi fagice incomplete umplute cu un lanţ scurt de ADN).

Printre bacteriocinele cele mai studiate şi mai bine cunoscute astăzi se numără colocinele şi cloacina DF13. Producerea de bacteriocine se datorează prezenţei plasmidului de bacteriocinogenie în respectivea celulă bacteriană.

Plasmidul (factor genetic responsabil de sinteza de bacteriocină) poate fi: nonintegrat (replicon accesoriu), liber în citoplasmă; de exemplu, factorii Col E1, E2, E3,

E6, EI, EV,şi ColDf 13; integrat în cromozom; de exempli, factorul pentru sinteza aeruginocinelor,colicinelor I-2,

V- K94, şi piocinelor.Plasmidele nonintegrate se subdivid în: nonconjugate: se transmit numai cu ajutorul factorului F sau al unui fag

transductant, au o greutate moleculară joasă, între (4,2-8) x 10 megadaltoni prezintă un număr mic de greutate moleculară joasă, de obicei în număr mare de copii (15-60) per ADN cromozomial (de exemplu, factorii Col E1, E1a, E2, E3, E7, A, K, CloDF13);

conjugative: se transmit singure prin conjugare, au greutate moleculară (40-80)x10 megadaltoni, au un număr, mare de gene funcţionale (100-200), de obicei prezente în 1-2 copii per celulă (de exemplu, factorii Col, Col Ib, Col IB, Col I, Col V).

Structura plasmidelor Col nonintegrate conjugative şi nonconjugative a fost studiată cu ajutorul endonucleozelor de restricţie; acest studiu a demonstrat că ambele tipuri de plasmide conţin în structura lor:- un grup de gene (cluster) ,,rep” esenţial pentru replicarea autonomă; locus-ul de

origine pentru replicarea plasmidului este prezent într-un punct pe această zonă;- o genă responsabilă de sinteza proteinei (colicină);- o genă responsabilă pentru sinteza proteinei de imunitate (evidenţiată la

plasmidele Col E1, E2, E3, CloDf13).Plasmidele conjugative posedă în plus: un extra grup (extracluster) de gene (G – T)

implicate transfer. Acest grup de gene conţine circa 20% din SADN-ul plasmidic.În general, celulele bacteriocinogene sunt immune la propria bacteriocină datorită

prezenţei de imunitate mai sus mentionate. Ruperea acestei imunităţi se produce doar în prezenţa unei concentraţii foarte înalte de bacteriocină, acest fenomen purtând numele de fenomenul de rupere a imunităţii (break-down immunity).

Există însă şi cazuri particulare în care unele bacteriocine (welchicinele) sunt active chiar şi pe celulele producătoare (în acest caz explicaţia fiind absenţa genei de imunitate pe plasmidul de bacteriocinogenie).

În funcţie de interrelaţiile de factorul Col cu alţi factori plasmidiali din celula bacteriană, s-au descris: agregate; de exemplu linkajele: F. ColE2 şi Col Ib. Col E1, în ultimul agregat

factorul Col Ib jucând rol de factor de transfer. Aceste aggregate au origine exclusiv extracromozomială şi posedă un potenţial foarte înalt de răspândire a proprietăţii de bacteriogenie în populaţia bacteriană;

cointegrate; de exemplu, combinaţia F. Col V. trp.cys.Se pare că proprietatea de colicinogenie este mai rar răspândită la tulpinile bacteriene de

origine umană, dar este prevalentă în flora apelor menajere şi în populaţia de enterobacterii de

258

la animalele domestice. Cu referire specială la rolul plasmidelor de bacteriocinogenie în organismul uman şi animal, trebuie menţionate următoarele: factorul Col v codifică sinteza unui sistem de chelare (fixate, legare şi transport) al

fierului din mediul extern, de către celula bacteriană, ducînd astfel la creşterea virulenţei bacteriilor. În acest sens, sistemul aerobactinei este considerat astăzi un mijloc crucial de supravieţuire şi proliferare a celulelor bacteriene invasive;

factorul Col V conferă tulpinilor bacteriene capacitate de supravieţuire în ser in vitro, crescând rezistenţa acestora la efectul bactericid al serului;

factorul Col conferă capacitatea de adeziune celulelor bacteriene pe epiteliul intestinal (atribut al virulenţei celulei bacteriene);

la tulpinile de Esch. coli enterale autohtone, factorul Col are rol protector determinând producerea de colocine cu acţiune îndreptată împotriva unor bacterii enterale patogene (de exemplu, Shigella), îngreunîndu-le acestora implantarea;

în culturi celulare s-a remarcat o acţiune de inactivare a toxinei tulpinilor de E coli enterotoxigene de către colicina sintetizată de alte tulpini de Myzobacterium smegmatis are o acţiune citocidă asupra celulelor eucariote tumorale (inhibă creşterea celulelor tumorale umane,animale), dar rămîne fără efect asupra celulelor normale din aceeaşi specie (datorită selectivităţii de membrană) prezintă agrocina (bacteriocină); tulpinile bacteriene de Agrobacterium radiobacter produc bacteriocina agrocină 84, capabilă să omoare tulpina bacteriană Agrobacteruim tumefaciens (purtătoare de plasmid Ti), care determină o stare canceroasă (boala cocoşului) la plante dicitiledonate. Se presupune că structuri nucleozidice analogigrocinei 84 cu acţiuni citocidă pe celulele canceroase ar fi mai răspândite în natură decît se cunoaşte astăzi;

plasmidele Col sunt considerate a fi entităţi fundamentale pentru multe celule bacteriene ţinându-se cont de faptul că sunt implicate în multe activităţi celulare.Pe baza cunoştinţelor actuale despre plasmidele Col se poate aprecia că acestea reprezintă o parte vitală din pool-ul de gene al speciilor bacteriene. Cele două posibilităţi de linkaj al plasmidelor de bacteriocinogenie (system aggregate şi cointegrate) pot fi considerate aspecte particulare ale potenţialului de adaptare în cursul evoluţiei.

Gradele diferite de complexitate prezente de diferitele sisteme de bacteriocinogenie pot imprima şi explica potenţialul de adaptabilitate al celulei gazdă la condiţiile permanent în schimbare din: - datele acumulate pîna în prezent pledează pentru o strînsă relaţie filogenetică între

plasmidele de bacteriocinogenie (factorul Col), pe de o parte şi factorii plasmidiali F şi R, pe de altă parte;

- prezenţa şi similaritatea genelor ,,kill” şi ,,de imunitate” în plasmide de bacteriocinogenie şi fagi pledeaza pentru o strînsă interrelaţie în cursul evoluţiei între aceşti determinanţi genetici;

- fenomenul de bacteriocinogenie este considerat a fi un split-phenotype al răspunsului celular SOS la agenţi inductori (raze u.v., mitomicina C, acid nalidixic). Genele celulare rec A şi lex A posedă o capacitate complexă de a regla diferite răspunsuri celulare SOS, incluzînd aici şi fenomenul de bacteriocinogenie, în scopul asigurării supravieţuirii şi adaptării celulare la condiţiile de mediu extern. A fost dovedit rolul multiplu de copii plasmidice autonome/integrate per celulă;

- datele prezente sugerează că fenomenul de bacteriocinogenie semnifică o cale enzimatică specifică cîstigată în cursul evoluţiei;

- studiul fenomenului de bacteriocinogenie a permis aprofundarea unor aspecte fundamentale de biologie moleculară (replicarea ADN-ului plasmidic, controlul replicării, fenomenul de incompatibilitate plasmidială, interrelaţiile evolutive între celula gazdă şi factorul Col).

Factorul R

259

Fenomenul de rezistenţă la drog a fost descris de către Ehrlich în perioada anilor1910-1913. Rezistenţa celulelor bacteriene la antibiotice prezintă două aspecte:

rezistenţa naturală – proprietate intrinsecă a speciei, stabilă, de natură cromozomială; rezistenţa dobîndită – caracter cîştigat în urma unei terapii cu antibiotice (prin cîştigarea

de plasmid R, mutaţie, sau în urma unui process de recombinare).Plasmidele R (factori de rezistenţă multiplă la antibiotice) au fost descries atît la germeni

gram-pozitivi cît şi gram-negativi. Au fost semnalate întîia oară în Japonia, bacilii Gram negative (Akiba,1959). Factorii R sunt molecule de ADN, dublu catenar formând anse închise covalent autonome în citoplasma celulară bacteriană. Au sisteme proprii de replicare şi pot exista în mai multe copii.

Posedă unul sau mai mulţi determinanţi de rezistenţă (markeri). Se pot transfera: vertical la descendenţi (ereditate extracromozomială) orizontal între specii.

Acest ADN plasmadial codifică sinteza de proteine (enzime) prin intermediul unui ARNm.Factorii R sunt:- conjugativi (autotransferabili), au greutate moleculară de 20 x 106 2000 x 106 daltoni,

sunt alcătuiţi din trei secvenţe nucleotidice cointegrate, şi anume: factorul RTF (factor de transfer de rezistenţă similar factorului F) care iniţiază

transferul plasmidului de la celula donoare la celula receptoare; factorul codificator al autoreplicării plasmidului (replicator); determinanţii de rezistenţă la antibiotice de la 1 pâna la 20 de markeri.

Cu cât plastidele sunt mai mari, cu atât replicarea lor se produce mai lent (I -2 copii/celulă).- nonconjugativi (netransferabili), posedă un ADN circular, fără factorul RTF, conţinând

numai replicatorul şi determinanţii de rezistenţă. Au greutatea moleculară de 0,5x106 până la 5,5x106 daltoni, codifică rezistenţa la unul-două antibiotice, replicarea este mai rapidă pe generaţie, se formează uşor copii multiple.

Transferul plasmidelor R se face între celulele bacteriene, depăşind barierele de specie, gen şi chiar de familie. Se realizează prin mecanisme de:

- transfer clasic (conjugarea la bacili gram negativi, transducţie la stafilococi şi transformare)

- recombinare (pe baza omologiei ADN gazdă-ADN străin) prin crossing-over la nivelulcromozomului bacterian. Acest fenomen de recombinare este foarte rar.Plasmidele R pot fi pierdute:

- spontan; se pot pierde unul sau mai mulţi markeri de rezistenţă, de exemplu princonservarea tulpinilor bacteriene la +4 C câteva luni.;

- sub influenţa unor factori fizici (raze u.v.), chimici (acridinoranj, acriflavină).Reasortarea plasmidelor R (din punct de vedere al numărului, proprietăţilor si sediului markerilor) se realizează prin elemente transpozabile tip transpozomi. Transpozomii sunt elemente genetice mobile ce poartă gene determinate de rezistenţă la antibiotice; ei se pot exciza dintr-un ADN şi autoinsera în altul (într-un plasmid sau cromozom). Se pot integra în situs-uri diferite, pe aceeaşi moleculă de ADN. Prin mecanismele lor de translocare (cromozom-plasmid, plasmid-cromozom) determină un schimb larg de determinanţii R intre specii.

Au fost descrişi transpozomi care codifică rezistenţa la β- lactamine (penicilina, ampicilina), la trimetoprim/sulfametoxozol, neomicină/kanamicină, gentamicină/tobramicină, eritomicină etc. Unii trenspozomi au dimensiuni foarte mari, codificând rezistenţa la un număr foarte mare de antibiotice.

260

Referitor la circuitul plasmidelor R în natură trebuie menţionat că flora intestinală comensală şi saprofîtă (oportunist patogenă) la om şi la animale este izvorul natural de bacili gram-negativi; la nivelul acestor germeni microbieni are loc cel mai important schimb de plasmide R între specii. Mecanismele de rearanjare a markerilor de rezistenţă plasmidici şi transferul plasmidic explică formarea rapidă a rezervorului de bacterii multi-rezistente. Epidemiile apar atunci când aceste plasmide R cu markeri multipli de rezistenţă ajung la bacterii înalt patogene şi cu înaltă contagiozitate. Răspândirea plasmidelor R este favorizată de utilizarea necontrolată şi abuzivă a antibioticelor, condiţii ce determină selectarea şi vehicularea în cadrul infecţiilor intraspitaliceşti a unor tulpini bacteriene cu un spectru foarte larg de antibiorezistenţă, ce creează mari dificultăţi terapeutice.

BacteriofagiiSunt virusuri care infectează bacteriile. Se fixează pe membrana celulei bacteriene, unde

îşi abandonează învelişul proteic, injectându-şi materialul genetic în celula bacteriană. Virusurile împrumută aparatul metabolismului celular bacterian, pentru propria replicare, sunt deci paraziţi obligatorii ai celulelor, multiplicându-se pe socoteala acestora. In natură, virusurile apar în general drept paraziţi obligatorii ai organismelor şi celulelor vii (bacterii, plante, animale, celule umane). Materialul genetic ai virusurilor constă din ADN sau ARN, în formă liniară sau circulară închisă. Materialul genetic viral, după injectare în celula bacteriană, poate evolua pe una din cele două căi:

- poate fi integrat în genomul bacterian (cale lizogenă)- poate trece imediat la multiplicare folosind aparatul enzimatic de sinteză al celulei

bacteriene gazdă (receptoare). Noii fagi sintetizaţi prin acest ciclu „litic" ,în urma lizei celulare, sunt eliberaţi în mediul extern, de unde pătrund şi parazitează alte celule bacteriene.

Fagul λEste foarte bine studiat şi utilizat ca vector. Cu ajutorul sistemului proteic reglator este

capabil să aleagă între cele două posibilităţi de evoluţie mai sus prezentate. Alegerea căii de multiplicare este determinată de starea de nutriţie şi sănătate a celulei receptor (gazdă). Gazda fagului λ este celula bacteriană de E. coli.; genomul acestui fag este reprezentat de un lanţ dublu ADN. Din ADN-ul fagului λ poate fi îndepărtată o cantitate de 40% fără ca funcţiile vitale ale acestui fag să fie evident influenţate. Datorită acestui aspect este posibil ca în fagul să poată fi introdus ADN străin. Membrana proteică a fagului are o capacitate limitată de acceptare de ADN, deci cantitatea de ADN străin ce poate fi înglobată este limitată. După introducerea ADN străin prin membrana proteică fagului λ se poate trece la injectarea acestui fag (în care este înglobat ADN-ul străin) în celulele bacteriene de E coli.

Bacteriofagii au un sistem propriu de transport pentru fragmentele ADN străine care pot fi astfel introduse pe cale naturală şi multiplicate în celula gazdă. Fagii lizogeni pot media (ca şi factorii plasmidici F) schimburi de gene. Astfel fagul λ (ADN) se poate insera pe cromozomul celulei de E coli între genele gal şi bio. Când se formează virionii progeni, excizia nu este totdeauna precisă, în acelaşi loc. În unul din 105 virioni, ADN-ul fagului λ conţine fie operonul gal, fie operonul bio. Infecţia cu asemenea fagi se numeşte λ gal sau λ bio; ea introduce genele celulei bacteriene de E coli, alături de genele fagului λ într-o nouă celulă infectată de respectivul fag.

Fagul φ 80

261

Este înrudit cu fagul; se insera lângă operonul trp şi poate purta gena trp de la o celulă infectată la alta.

Fagul µ Se insera în orice loc pe cromozomul celulei de E. coli; transportă totdeauna un

fragment din acest cromozom. Aceşti fagi transductori (ca şi factorul plasmidic F) sunt elemente genetice mobile care declanşează interschimbul între genele bacteriene, accelerând în acest fel evoluţia bacteriană.

CosmideSunt plasmide în care a fost introdus un anumit fragment de ADN din fagul λ . Cosmidele

sunt îmbrăcate în membrana proteică a acestui fag. Prin infecţie fagică (pătrunderea fagului în celulă), cosmidul este injectat în respectiva celulă gazdă. În celula gazdă, cosmidul se replică apoi ca un plasmid.

FagemideReprezintă o nouă clasă de vectori în care o parte din genomul unui fag cu lanţ unic ADN

(de exemplu_M13) este combinat cu un plasmid ADN. Fagemidul se multiplică în celula gazdă ca un plasmid cu lanţ dublu ADN. Dacă în momentul introducerii fagului se injectează în celula gazdă şi un fag helper, atunci famegidul se multiplică ca un fag cu lanţ unic ADN.

Secvenţe de inserţie (SI)Sunt elemente transpozabile. Transpoziţia este fenomenul prin care copii (elemente

transpozabile) ale unor secvenţe specifice de ADN dmtr-un genom, se deplasează de-a lungul aceluiaşi lanţ de ADN sau pe cel al altui genom, având capacitatea de a se insera pe unul sau mai multe situs-uri specifice.

S-au descris două tipuri de elemente transpozabile:- secvenţe de inserţie (SI) cu dimensiuni de 0,8-1,4 kilobaze (kilobaza (kb)=1000 perechi

de baze);- transpozonii (Tn) cu dimensiuni de 3-20 kb (numiţi şi gene săritoare).

2) Vectorii de transcriere.Reprezintă o clasă specială a vectorilor de expresie. Se folosesc pentru sinteza ARN.

Prototipul acestor vectori de transcriere este format dintr-un plasmid în care a fost înglobat un fag, promotor (SP6) sau chiar doi fagi promotori (fagii SP6 şi T7).

Vectorul format din plasmid cu un fag promotor ( φ SP6)Acest vector poartă numele de SP6. Celula gazdă pentru φ SP6 este celula bacteriană de Salmonella typhimurium; promotorul φ SP6 reprezintă secvenţa start ADN de unde porneşte transcrierea (deci sinteza ARNm-ului). în spatele promotorului φ SP6 se găseşte o zonă formată dintr-un număr de secvenţe nucleotidice (zona MC S= muItiple cloning site), care oferă mai multe locuri de tăiere pentru multe enzime de restricţie (Fig. 140).

Fig. 140 - Vector format din plasmid şi fag promotor SP6.

262

Este de menţionat că zona MCS reprezintă porţiunea din sistemul vector unde pot fi înglobate de plasmid noi fragmente de ADN. După tăierea zonei MCS în două, de către o enzimă de restricţie, şi înglobarea unui fragment de ADN dublu lanţ (fragment ADN sau ADNc) în mijlocul zonei MCS (fig.134), zona MCS este tăiată din nou de către alte enzime ADNc de restricţie, vectorul linearizîndu-se (fig.141).

Fig. 141 - Tăierea zonei MCS şi înglobarea unui nou fragment ADN

Fig. 142 - Vector linearizat

De obicei ADN-ul înglobat este cel care urmează a fi transcris în ARN. Transcrierea cu ajutorul unui singur fag promotor este unidirecţională.

Vectorul format dintr-un plasmid şi doi fagi promotori (SP6 şi T7).

Acest sistem cu doi promotori este vector bidirecţional, deoarece cei doi promotori dirijează transcrierea în sensuri opuse (fig. 143 şi fig. 144).

Fig. 143 - Vector format dintr-un plasmid şi doi fagi promotori

Fig. 144 - Tăierea cu ajutorul enzimelor de

263

restricţie a celor două zone MCS şi transcrierea în sens opus a celor două lanţuri ADN cu ajutorul fagilor SP6 şi T7

Pentru utilizarea acestui sistem de transcriere bidirecţională se aleg două enzime diferite de restricţie; aceste două enzime acţionează pe situs-uri diferite pe zona MCS, după tăierea prealabilă a acestei zone în două segmente între care a fost înglobat noul segment ADN. Astfel prima enzimă taie primul fragment MCS între fagul SP6 şi ADN-ul înglobat, iar a doua enzimă taie al doilea fragment MCS între fagul T7 şi ADN-ul înglobat. Promotorii SP6 şi T7 sunt astfel orientaţi încât primul să conducă transcrierea unui lanţ din ADN dublu-lanţ înglobat într-un sens iar al doilea promotor, transcrierea celuilalt lanţ ADN (al aceluiaşi ADN dublu lanţ nou-înglobat) în sens opus (fig. 145). Acest sistem vector cu doi promotori care acţionează în două sensuri opuse, permiţând transcrierea concomitentă a celor două lanţuri a ADN (dublu-lanţ) nou-înglobat, se numeşte vector bidirecţional.

Fig. 145 -

Tăietura I – Vector

linearizat. Utilizarea sistemului SP6

pentru

transcrierea unuia din lanţurile ADN înglobate.

Alegerea vectorilorSe face după mărimea fragmentului ADN care urmează a fi înglobat într-o celulă.

Lungimea fragmentului ADN sau ARN se stabileşte după numărul de perechi de baze:1 kb (kilobază) = 1000 baze (sau 500 perechi de baze);1 mb (megabaze) = 1 milion de baze (sau 500 000 perechi de baze).

Cosmidele se folosesc drept vehicule pentru fragmente foarte mari de ADN (de 30-45 kb). În ultima vreme s-au putut construi cosmide-vectori în care s-au putut îngloba fragmente mari de ADN de 100 kb - 1 mb, de pildă vectori YAC (yeast artificial chromosome), numiţi şi minicromozomi. Un vector tip YAC se comportă în celulele de drojdii ca un cromozom care se dublează înainte de diviziunea celulară, iar, în cursul acestei diviziuni, îşi împarte materialul ADN între cele două celule fiice. Aceste cosmide ajută la studiul poziţiei genelor pe harta genetică a cromozomului sau pe fragmente lungi de ADN.

Vectorii de expresie reprezintă vectori construiţi anume care conţin în structura lor multe secvente de control optim pentru transcrierea şi translaţia genelor. Fiecare fragment de ADNc străin care va fi înglobat de către vector se va fixa pe acest vector tocmai în apropierea acestei secvenţe de control (cu rol de promotor); aceasta secvenţă de control (promotor) va porni apoi transcrierea secventei ADNc strain inglobat. S-au construit un numar mare de vectori de expresie care să fie propice pentru diferite tipuri de celule. Secvenţele de control nu sunt

264

aceleaşi pentru diferitele tipuri de celule. Vectorii de expresie trebuie selectionaţi pentru fiecare tip de celulă în care urmează a fi introdusă o gena straină pentru a se obtine sinteza unei anumite proteine. Astfel, prin alegerea unor vectori de expresie adecvaţi, s-a reuşit introducerea unor fragmente ADNc străin (de la eucariote) în celula bacteriană şi sinteza ulterioară a urmatoarelor proteine:- insulina;-eritropoetina;- factorul VIII de coagulare;-somatotropina;-activator de plasminogen;-vaccinuri pentru boli bacteriene şi virale;-anticorpi monoclonali;- factori imunologici (factori de necroza a tumorilor, interferon, interleukine);-hiradin (antitrombotic); până de curând principiul activ se extragea direct din râme.

B. Vectori speciali

b1. Retrovirusurile Sunt virusuri ARN cu o treaptă ADN în replicare (de exemplu: HIV, VISNA). Multe

retrovirusuri sunt oncogene, putADN determina formarea unor tumori in organismul gazda (virusul sarcomului Rous, virusul leucemiei aviare).

Retrovirusurile ARN au capacitatea ca, o dată patrunse în organismul celulei gazdă să declanşeze, în prezenţa reverstranscriptazei, o transcriere inversă, adică de la ARN spre ADN, determinând astfel sinteza unui ADN dublu lant (după paltern-ul respectivului ARN viral). Acest ADN dublu lanţ se integrează apoi în cromozomul celulei gazdă (umană sau animală). Celula poartă în acest fel, integrată în cromozomul ei, informaţia pentru sinteza virusului ARN, care este declansată însă doar în anumite condiţii.

Retrovirusurile sunt mai mici decat celelalte virusuri; spre deosebire de virusurile ADN, ele nu ucid (nu lezeaza) celulele pe care le contaminează, motiv pentru care ele sunt folosite astăzi drept vectori în tehnicile de inginerie genetică şi de terapie genetică, în scopul transferului unor gene străine în celula ţintă. În aceste cazuri, retrovirusurile joacă rolul unor carcase pentru transportul respectivelor gene străine către o anumită celulă ţintă.

A fost imaginată o metodă eficace de prelucrare prealabilă a retrovirusului vector (Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Technology USA), prin care se elimină în prealabil un număr de gene virale, iar segmentul de virus rămas este combinat apoi cu gene care urmează a fi injectate ţintit într-o anumită celulă. În acest fel, virusul, lipsit de majoritatea genelor sale, devine inofensiv, deposedat de capacitatea lui infecţioasa, dar vector de o gena (de gene) nouă, pe care a fixat-o şi pe care o introduce în celula ţintă (mecanismul de transductie); injectat în celula ţinta, prin mecanismul de transcriere inversa, retrovirusul vector declansează actiunea reverstranscriptazei care determină sinteza ADN-ului corespunzator (replică a ARN-ului vector + gena fixată). Aceasta replică ADN se integrează în cromozomul celulei gazdă, conferind celulei gazdă o noua proprietate corespunzatoare noii gene fixate.

Retrovirusurile reprezintă astazi uneltele (vectorii) cele mai utilizate în ingineria genetică pentru transportul de gene către genomul unei celule tintă.

b 2. Retrovirusuri şi plasmidul Ti

265

Plasmidele Ti se găscsc în bacteriile Agrobacterium tumefaciens din sol. Prin infectarea unor leziuni ale plantelor cu această bacterie, plasmidele Ti ajunse în celulele vegetale determină apariţia unei tumori. Deci plasmidele Ti au efect tumorigen.

Prin utilizarea unui vector special, format dintr-un retrovirus şi un plasmid Ti, acesta din urmă, prin prelucrarea prealabila, pierde capacitatea de a mai produce tumori şi păstrează doar rolul de vector de gene către o celulă ţintă.

Procesul de transfectie si vectori specialiÎn biologia molecularaâă, introducerea unui ADN străin (gene) în celulele organismelor

superioare (plante, mamifere) poartă numele de tranfecţie. Introducerea acestor gene străine în organismul plantelor sau mamiferelor (animale, om) se face cu ajutorul unor vectori speciali: plasmide Ti şi retrovirasuri. Dintre aceşti vectori, retrovirusurile reprezintă astazi uneltele (vectorii) cele mai larg utilizate în ingineria genetică şi terapia genică, prin transport de gene către genomul unor celule ţintă.

Introducerea acestor gene străine în celule se mai poate face cu ajutorul particulelor de metal nobil (experienţe balistice biologice), dar aceste metode produc leziuni grave celulei.

Altă metodă constă în supunerea celulei unui câmp electric (electroporare), tratament prin care respectivele celule devin capabile (permeabile) să accepte macromoleculele din exterior. Se mai utilizează razele laser care produc orificii foarte fine în peretele celular rigid (la plante) prin care se injectează apoi molecula de ADN străin.

12.2. HIBRIDAREAEste o tehnica de recombinare de acizi nucleici, care vizeaza construirea unei molecule

de acid nucleic dublu lant din doua lanturi unice, separate, pe baza complementaritatii bazelor azotate. Imperecherea de baze complementare se poate face intre:

ADN - ADNADN - ARNARN - ARN

Totdeauna hibridizarea are loc intre doua lanturi unice de acid nucleic. Hibridizarea se foloseste ori de cate ori se urmareste identificarea secventelor nucleotidice pe un acid nucleic (secventa tinta).

12.2.1. Principiu

Se analizeaza o secventa de acid nucleic unic lant (secventa tinta). Analiza acestei secvente necunoscute se face fata de o sonda genetica (proba de acid nucleic) marcata (radioactive sau prin alte metode) cu o secventa de baze cunoscute. Daca sonda si secventa tinta sunt total sau partial complementare din punct de vedere al secventelor de baze nucleotidice, se formeaza o molecula hibrid de acid nucleic in care se identified secventele nucleotidice pe secventa tinta, in raport cu bazele (complementare) de pe secventa nucleotidica cunoscuta a sondei genetice.

Pentru lucru, ADN dublu lant trebuie intai denaturat (supus actiunii caldurii sau substantelor chimice alcaline) pentru a fi disociat in lanturi unice. Lantul unic va reprezenta apoi substratul pe care se va efectua hibridizarea cu sonda genetica.

12.2. 2. Denaturarea

266

Dupa cum s-a aratat, pentru analiza si identificarea secventelor nucleotidice ale unui acid nucleic tinta, acesta trebuie intai adus la forma de lanturi unice prin denaturare. Denaturarea reprezinta modificarea structurii acidului nucleic prin tratament cu caldura (temperatura de 100"C) sau substante chimice, sau supunerea in mediu alcalin (pH>l 1). Folosind aceste metode se realizeaza desfacerea legaturii de hidrogen dintre bazele complementare.

a). Denaturarea prin calduraReprezinta taierea lantului dublu ADN cu ajutorul temperaturii inalte. Punctul de topire

reprezinta temperatura la care 50% din respectivul acid nucleic dublu lant disociaza in unic lant. Acest punct de topire poate fi influentat de:

- o zona bogata in guanina-citozina, care cere totdeauna o temperatura mai inalta,deoarece aceste baze se leaga prin trei punti de hidrogen, in timp ce bazele adenina-timinase leaga doar prin doua punti de hidrogen;

- concentratia in NaCl a solutiei; o concentrate scazuta de NaCl determina destabilizareamoleculei de acid nucleic, aceasta necesitADN o temperatura de topire mai scazuta;

- concentratia cationilor.

b). Denaturarea chimicaSe face prin adaos de substante denaturante (formamida, uree) care determina scaderea

punctului de topire.

12.2.3. Renaturarea (annealing/reannealing)

Reprezinta o hibridizare. Prin scaderea temperaturii sau a pH-ului este favorizata refacerea gaturilor intre bazele complementare de pe cele doua lanturi unice de ADN - ARN sau ARN - ADN. Reactiile de renaturare se produc de regula la temperaturi care corespund unei iferente de 20-30 C fata de temperatura punctului de topire al dublului lant de acid nucleic. iaca temperatura insa scade brusc, lanturile raman separate.

Cantitatea de acid nucleic unic lant, care prin renaturarea trece in dublu lant, depinde de: - concentratia moleculara a acidului nucleic din solutie; - lungimea moleculei de acid nucleic; - zona bogata în guanina-citozina; concentratia în NaCl;- concentraţia de formamida.

12.2.4. Factorul stringentEste un important factor de hibridizare. Reprezintă intensitatea reactiei de hibridizare.

Dacă două lanţuri unice de acid nucleic sunt pe toată lungimea lor formate din baze implementare, iar conditiile de reacţie sunt favorabile, stringenta (intensitatea) reacţiei de ambinare este foarte puternică. Dacă pe cele două lanţuri de acid nucleic există doar zone parţiale cu baze complementare, stringentă este mai scazută (această situaţie apare în special atunci cADN cele două lanţuri de acid nucleic provin din două organisme diferite).

12.2.5. Tipuri de hibridări

a. Hibridare Blotting: a.1. Southern Blotting (ADN Blotting)

267

a.2. Norhern Blotting (ARN Blotting)a.3. Western Blotting (Protein blotting)a.4. Dot Blottinga.5.Slot Blotting

b. Hibridizare in situ;c. Hibridizare Colonială.

a. Hibridizare Blotting

Este o tehnică specială prin care acidul nucleic ţintă (de cercetat) este axtras din materialul de cercetat prin încălzire la 100 grade C şi răcire la gheaţă şi apoi depus pe o membrană(de nitroceluloză sau filtru de nylon) şi fixat. Hibridarea acestui acid nucleic necunoscut are loc direct pe filtru cu ajutorul sondei genetice (acid nucleic cunoscut şi marcat).

Noţiunea de "Blot" reprezintă fitrul+acidul nucleic fixat(imobilizat).Acţiunea de "Blotting" reprezintă trecerea acidului nucleic pe filtru.

Există mai multe variante de hibridare Blotting şi anume:

a.1. Southern BlottingA fost imaginată de Southern în 1975.Evidenţiază secvenţele specifice ale unor

fragmente de ADN separate prin gelelectroforeză.Etapele reacţiei:

- se extrage ADN dintr-un produs patologic lichid(ser sanguin care conţine acid nucleic viral) sau solid(celule,ţesuturi);

- ADN este tăiat cu enzime de restricţie;- fragmente de ADN(de circa 1000 perechi de baze)sînt supuse electroforezei şi separate

în funcţie de greutatea lor moleculară;- fragmentele ADN obţinute în gel sînt supuse denaturării;- trecerea fragmentelor de lanţ unic ADN de pe gelul sensibil(de nitroceluloză) care

fixează aceste fragmente de ADN.Pentru transferul respectivelor fragmente de ADN de pe gel pe fitru se folosesc diferite

metode,dintre care una este cea prin transfer capilar (Fig.146).Gelul (2) este pus pe hărtie de fitru (1) umedă(care a absorbit prin capilaritatea lichid din

vasul cu soluţie tampon); peste gel (2) se pune altă hîrtie de filtru (3) uscată, care se îngreunează prin aplicare,deasupra ei,a unei lame de sticlă (4) şi a unei greutăţi (5). Curentul de lichid care rezultă din soluţia tampon şi care se formează prin capilaritate,de la hîrtia de fitru umedă spre cea uscată,acţionează şi scoate prin spălare moleculele ADN din gel şi le trage către şi pe hîrtia de fitru superioară (4).

Fragmentele de lanţ unic ADN fixate pe hîrtia de fitru superioară prin acţiunea căldurii sînt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv).

Hibridizarea se realizează prin incubarea hîrtiei de fitru (3) într-o soluţie care conţine sonda genetică radioactivă (de exemplu, ADN marcat cu 32P); molecula-hibrid realizată va fi evidenţiată prin metoda autoradiografică sub formă de benzi.

Utilizarea practică a variantei Southern BlottingGelul (2) este pus pe hărtie de fitru (1) umedă(care a absorbit prin capilaritatea lichid din

vasul cu soluţie tampon); peste gel (2) se pune altă hîrtie de filtru (3) uscată, care se îngreunează prin aplicare,deasupra ei,a unei lame de sticlă (4) şi a unei greutăţi (5). Curentul de lichid care rezultă din soluţia tampon şi care se formează prin capilaritate,de la hîrtia de fitru umedă spre cea uscată,acţionează şi scoate prin spălare moleculele ADN din gel şi le trage către şi pe hîrtia de fitru superioară (4). Fragmentele de lanţ unic ADN fixate pe hîrtia de fitru superioară prin acţiunea căldurii sînt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv). Hibridizarea se realizează prin incubarea hîrtiei de fitru (3) într-o

268

soluţie care conţine sonda genetică radioactivă (de exemplu, ADN marcat cu 32P); molecula-hibrid realizată va fi evidenţiată prin metoda autoradiografică sub formă de benzi.

269

Fig. 146 - Hibridarea Southern Blotting Utilizarea practică a variantei Southern Blotting

Prin apariţia unei mutaţii în genomul celulelor germinative (modificarea unei baze), care se moşteneşte, respectiv ADN modificat, dacă va fi supus acţiunii enzimelor de restricţie,va prezenta una din următoarele două ipostaze posibile:- lanţul ADN rămîne netăiat,deoarece enzimele de restricţie nu mai recunosc situs-ul

specific;- din contră, poate apare un nou situs specific de tăiere pentru aceste enzime. În acest al

doilea caz, pot apărea în consecinţă noi tipare de fragmente ADN; acest fragment a fost numit "polimorfism de lungime al fragmentelor de restricţie" (RFLP). Studiul acestor fragmente şi a diferenţei dintre ele, cu ajutorul metodei Southern Blotting,a putut aduce noi informaţii în cercetările efectuate asupra unor boli genetice şi în medicina judiciară.

Astfel s-a putut demonstra că:- la germenii univitelini, aceste tipare RFLP sînt complet identice;- la rude, aceleaşi tipare RFLP sînt în mare parte identice;- în boli genetice se evidenţiază prezenţa unor gene defecte (pe baza unor fragmente ADN cu

un tipar individual);- prezenţa unor modificări genetice în cazul unor procese tumorale;- pe baza tiparelor RFLP s-au putut clasifica microorganismele (virusuri şi bacterii)- în medicina judiciară, pe baza pattern-urilor RFLP (ADN minisatelite=fragmente

hipervariabile din genom, care nu sînt transcriptibile) se poate face determinarea paternitaţii.

De asemenea, pe baza aceloraşi pattern-uri RFLP se pot face identificări de persoane în criminalistică, prin studiul unor probe de sânge sau spermă;

ADN de origine umană şi cel provenind de la cimpanzeu şi gorilă sînt omologate în proporţie de 97%(diferenţa constă în cromozomul X). Speciile de cimpanzeii sunt mult mai copiate de om decât alte specii de maimuţa.

În Africa de Sud a fost studiată originea speciei Quagga (Equus quagga), care a dispărut în 1883, şi pe baza studiilor filogenetice s-a stabilit că aceasta reprezintă forma originară a tuturor speciilor de zebră;

Studiul genelor pentru globină la primate (responsabile pentru sinteza proteinei hemoglobină) a demonstrat că aceste gene sînt localizate la un loc,într-un cluster pe cromozomii umani 11 şi 16. Dimensiunea acestor clusteri este asemănătoare la om, gorilă şi gibon.

a. 2. Northern BlottingAceastă variantă a hibridizării Blot pune în evidenţă secvenţe specifice ale unor

fragmente ARN departe prin gelelectroforeză.Etapele reacţiei sunt:

- ARN este extras din materialul de cercetat;- ARN este pus în prezenţa substanţei denaturatei (glicoxal dimetilsulfoxid formaidehidă

sau metilmercur); - ARN este supus separării electroforetice;- transferul moleculelor ARN pe filtru (nylon sau mitriceluloză);- hibridizarea ARN de pe filtru cu o sondă genetică ARN sau ADN;- evidenţierea moleculei hibrid construite. Aplicaţii practice ale variantei Northen Blotting- determinarea ribotipurilor tulpinilor bacteriene (în studii genetice, epidemiologice).- În epidemiologie, reprezintă o motodă foarte modernă şi utilă de cercetare pentru

determinarea filiaţiei cazurilor în epidemii, această metodă fiind mult mai sensibilă decât determinarea hizotipurilor de tulpini. Astfel, în actuala a VII -a pandemie de horelă, cu ajutorul metodei de ribotipare s-a putut demonstra că profilul genetic al tulpinilor de Vibrio cholerae biotip eltor, prezente în Asia şi Europa, este în mai mult de 70% din cazuri

270

identic.a. 3. Western Blotting (tehnica immunoassay)

Această variantă a hibridizării Blot nu reprezintă o reacţie de hibridizare propriu-zisă (anume construirea unei molecule ADN dublu lanţ din două lanţuri separate de ADN).

Această variantă foloseşte doar principiul reacţiei de hibridizare, şi anume desfaşurarea substratului de cercetat pe gel de electroforeză şi apoi trecerea acestuia pe o membrană de nitroceluloză,unde este apoi cuplat şi evidenţiat prin intermediul unor grupări chimice complementare.În acest caz de Western Blotting, substratul de cercetat nu este reprezentat de un acid nucleic ci de o proteină. Reacţia foloseşte la evidenţierea unor cantităţi foarte mici de proteine prezente în lichidele sau celulele unui organism, prin cuplarea acestora cu anticorpi specifici corespunzători (marcaţi).

Etapele reacţiei sunt următoarele:- proteina este supusă electroforezei în gel SDS*-policrilamidă;- transferul spoturilor proteice (antigene) pe membrana de nitroceluloză;- adaos de anticorpi specifici marcarţi (cu enzime sau radionuclizi);- spălarea anticorpilor rămaşi nefixaţi;- aplicarea deasupra membranei de nitroceluloză a unui film fotografic;- expunere şi developare;- citirea prin autoradiografie a benzilor de proteină cu ajutorul anticorpilor

specifici marcaţi şi fixaţi.Avantajul metodei este acela de a pune în evidenţa prezenţa unei anumite proteine, dintr-

o mixtură complexă.Această metodă este folosită pentru clonarea genelor.

a. 4. Dot BlottingSe execută pe o placă de plexiglas cu godeuri rotunde (fig.147). Este necesară extracţia

prealabilă a acidului nucleic din probele de cercetatare(ser,extracte celulare sau tisulare.Proba de acid nucleic extrasă se depune într-unul din godeurile rotunde ale plăcii de

plexiglas.În fiecare godeu se depune altă probă de acid nucleic,în total pe o placă depunîndu-se atîtea probe câte godeuri are placa. Apoi respectiva placă se acoperă cu hîrtie de filtru, care absoarbe aventualele probe de acid nucleic prezent. Nu se face nici o separare electroforetică; probele de acid nucleic de pe hîrtia de filtru sînt supuse apoi denaturării (prin încălzire la 100 gradeC şi răcire la gheaţă). Apoi probele de acid nucleic denaturat de pe filtru sînt hibridizate cu sonde genetice.

Fig. 147 - Tehnica Dot Bloptting

a. 5. Slot BlottingSe execută pe o placă

de plexiglas cu godeuri de formă dreptunghiulară (Schlitz-uri = tăieturi sau Slot-uri).

Principiul metodei este identic cu cel de la Dot Blotting. Aceste ultime două variante de hibridizare se folosesc atunci când se lucrează deodată cu un număr foarte mare de probe patologice nefracţionate (probe de ser, extract celulare

271

sau tisulare).12.2.6. Hibridizare in situ

Se efectuează direct pe celule şi ţesuturi. În cazul hibridizării Blotting este necesară extracţia prealabilă a acidului nucleic din proba de cercetat; prin această extracţie, se pierde însă informaţia asupra sediului exact al respectivului acid nucleic (ADN sau ARN) din anumite structuri celulare. Această informaţie se poate obţine numai cu ajutorul hibridizării in situ.Prin această ultimă metodă se poate realiza evaluarea exactă a distribuţiei anumitor secvenţe ADN sau ARN direct in situ simultan cu determinări calitative şi semicantitative.

Se folosesc fragmente de ţesuturi, amprente de celule, culturi celulare (prelucrate, aplicative şi fixate pe lame obiective). Fixarea se face cu xilol, etanol (100% şi apoi 70%). Lama obiectiv cu celule fixate corespunde filtrului cu acid nucleic legat prin hibridizare Blotting.

Reacţia de denaturare şi hibridizare se face pe lama obiectiv şi anume: după depunerea probei pe lama obiectiv, pentru denaturarea probei se foloseşte o încălzire puternică sau tratarea cu proteaze şi digitonină, ultima slăbind şi desfăcând citoscheletul şi rezultînd molecula ţintă de acid nucleic unic.Lama cu probă pentru denaturarea se acoperă cu o placă, realizîndu-se o cameră umedă. După denaturare, lama se spală (pentru îndepărtarea particulelor nelegate) şi abia apoi urmează hibridizarea cu sonda (ADN sau ARN) marcată; în cazul reuşitei hibridizării, secvenţele ţintă din acidul nucleic de cercetat (din ţesuturi) sînt evidenţiate la autoradiografie (prin cuplare cu secvenţele de acid nucleic complementare din probele marcate cu biotină). Biotina din sondă a fost fixată de un necleotid cu uracil; acest uracil se va împerechea în lanţul de acid nucleic ţintă cu o adenină;după ce se produce această reacţie de hibridizare, se face o spălare cu o soluţie tampon,care îndepartează moleculele nelegate de acid nucleic din probă.

Marcarea cu biotină este evidenţiată ulterior prin diferite variante de lucru (vezi "Sonde genetice.Marcarea").

Aplicaţiile practice in situ sunt:- evidenţierea şi localizarea diferiţilor agenţi infecţioşi în diferite celule şi ţesuturi

ale organismului: virusul hepatitei virale tip B, HIV, virusul Epstein-Barr, virusul cito-megaliei, virusul herpes simplex, virusul papilloma;

- cercetarea relaţiilor virus-procese oncogene (de exemplu, relaţia virusul hepatitei virale tip B-carcinom hepatic);

- diagnosticul pre- şi postnatal în boli genetice;- localizarea genelor defecte pe cromozom (de exemplu, în fibroza chistică, distrofia

musculară Duchenne);- identificarea anormalităţilor cromozomiale (de exemplu: trisomia 21, sindromul

Langdon Down, sindromul Turner);- stabilirea sexului la embrion;- cercetarea tiparelor de expresie genetică (stabilirea momentului activării anumitor

gene);- stabilirea hărţii genetice cromozomiale (stabilirea relativă a locus-ului fiecărei gene

pe cromozom);- hibridarea colonială.Pe plăci cu medii de cultură se însămînţează colonii bacteriene din două tipuri de clone:- o clonă bacteriană de origine(cu plasmid);- o clonă bacteriană cu ADN ţintă (cu plasmid+ fragmente de ADN ţintă).Prin replica plating se obţine copii ale acestor colonii din cele două clone pe un filtru de

nitroceluloză. Aceste copii de clone bacteriene (de pe fitru) sunt supuse lizei pentru a se obţine ADN.

ADN este supus denaturării pentru obţinerea lanţurilor unice de ADN. Lanţul unic ADN este supus hibridizării cu probele ADN cunoscut şi marcat radioactiv.

272

După fixarea probelor ADN radioactive(fixarea complementară)pe lanţul unic de ADN ţintă (de cercetat) se procedează la evidenţierea autoradiografică a marcării pe un film Roentgen.

Prin compararea imaginii radiografice se identifică şi se diferenţiază clonele bacteriene care conţin fragmente de ADN ţintă faţă de clonele bacteriene de origine. Clonele bacteriene care poartă ADN ţintă recombinant (plasmid + ADN ţintă) vor fi multiplicate mai departe (sincron se vor multiplica şi fragmentele de ADN straniu).

12.2.7. Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi biologie Această reacţie a pus bazele unui număr de tehnici care au ajutat la progresul cercetării

biologice fundamentale,cît şi la progresul diagnosticului medical într-un număr de boli.Astfel s-a reuşit:

- stabilirea concentraţiei anumitor secvenţe ADN sau ARN într-o mixtură de secvenţe;- determinarea numărului de copii dintr-o anumită secvenţă prezentă într-un dovedirea

gradului de înrudire între diferite organisme în raport cu numărul de secvenţe ADN identice;

- stabilirea activităţii genelor pentru care s-au pus în evidenţă moleculele de ARNm corespunzătoare;

- evidenţierea secvenţelor specifice ADN şi ARN în material biologic de cercetat (sânge, celule, ţesuturi);

- evidenţierea acidului nucleic viral;- în serul sanguin LCR, în vederea elucidării diagnosticului unor infecţii virale cronice:

evidenţierea acidului nucleic viral în aceste produse semnifică prezenţa particulei virale în organismul respectiv. Evidenţierea prezenţei acidului nucleic viral direct în produsele patologice (ser, LCR) sau în materialul citologic reprezintă o posibilitate de diagnostic rapid şi precoce, în vederea instituirii a unei terapii de urgenţă în special la persoanele bolnave de SIDA sau la cele imunosupresate (terapeutic) în urma unor transplante de organe.În aceste cazuri diagnosticul serologic de obicei nu poate fi de ajutor deoarece

pozitivarea serului în cazul infecţiei cu HIV se produce abia după câteva săptămâni de infecţie, iar în cazul imunosupresaţilor după câteva luni sau chiar deloc;

evidenţierea prezenţiei virale în tumori de origine virală; studiul efectuat asupra produsului de transcriere (ARNm) a unor secvenţe ADN

celulare glucogene nevirale a ajutat la complectarea şi aprofundarea diagnosticului de tumoră. Astfel o reacţie de tip imunohistochimic a putut pune în evidenţă un produs de transcriere (ARNm) specific de ţesut (de exemplu, prezenţa unui anumit ARNm corespunzător unei munoglobuline prezente în caz de limfoane maligne sau prezenţa unui anumit ARNm hormonal în anumite tumori neuroendocrine. Această metodă reprezintă o unealtă foarte eficientă pentru cercetarea activităţii genelor oncogene prin evidenţierea indirectă imunohistochimică a produselor lor de translaţie (ARNm corespunzător);

diagnosticul pre- şi postnatal al bolilor ereditare (la femei care doresc copii sau la care se pune problema întreruperii sarcinii);

determinarea defectelor metabolice; utilizarea metodelor ce folosesc sonde genetice pentru diagnosticarea infecţiilor virale

ale arborilor fructiferi (cu o precizie de diagnostic pentru o cantitatea de antigen de 2x10 nanograme);

aplicaţii în epidemiologia moleculară în vederea depistării unor noi markeri genetici (de exemplu, robotip, pulsotip);

se precizează ca în viitor metoda hibridizării să ofere posibilităţi pentru elucidarea mecanismelor de reglare a activităţii genelor.

273

12. 3. SONDE GENETICE

Cu ajutorul enzimelor de restricţie, astăzi se pot izola, teoretic, toate genele tuturor organismelor vii, în vederea obţinerii unei bănci de gene (le vivant mondial).

Principiul hibridizării în vitro a două ADN-uri complementare stă la baza metodei care foloseşte sondele moleculare(coduri de ADN cunoscute asociate cu un marker). Cu ajutorul unor asemenea sonde, la un individ dintr-o anumită specie se pot repera codurile complementare pe care sonda "le luminează" prin procesul de hibridizare moleculară. Cu ajutorul ADN-polimerazelor s-a reuşit şi amplificarea ulterioară a acestor fragmente de ADN bine determinate şi deci clonarea genelor pentru a face şi mai uşoară (mai sensibilă) reperea lor. Astăzi,graţie sondelor genetice, etichetarea, reperarea şi cartografierea genelor au devenit operaţii de rutină în marile laboratoare din lume, ceea ce va asigura în viitor progresul rapid al alcătuirii hărţilor cromozomiale complete ale genomului uman.

Sondele genetice (probe de acid nucleic tip ADN sau ARN marcate) reprezintă unealta esenţială de lucru în metoda de hibridizare pentru analiza secvenţelor nucleotidice din secvenţele "ţintă" ale ADN-ului de cercetat (genele). Aceste sonde genetice (proba de ADN sau ARN) sunt marcate (radioactiv sau nonradioactiv) pe un singur nucleotid (cu o secvenţă de baze cunoscute).

În prezent sondele genetice pentru cercetare şi diagnostic se pot comADNa şi cumpăra de la casele producătoare. Sondele genetice se prepară prin aceleaşi metode de hibridizare utilizate şi pentru secvenţierea (sequencing) acidului nucleic, şi anume prin metodele Blot (Western Blot,Southern Blot) şi metoda hibridizării in situ.

A. Prepararea probelor de acid nucleic(sonde genetice) pentru reacţiile de hibridizareSondele genetice pot fi: probe de ADN şi probe de ARN.

a. Prepararea probelor de ADN:a.1. Din fragmente ADN dublu lanţ clonate (în vederea obţinerii ulterioare de sonde

genetice).Aceste fragmente se obţin prin încorporarea de fragmente da ADN genomic(tăiate cu

ajutorul enzimelor de restricţie) sau de fragmente ADNc (sintetizate cu ajutorul reverstranscriptazei după modelul unei matriceARNm) într-un vector şi prin introducerea lor, o dată cu acest vector (recombinant), într-o celulă gazdă, unde vectorul se multiplică rezultînd în final o cantitate mare de ADN clonat.

Pentru hibridizări sînt în special de preferat fragmentele ADNc clonat, deoarece reprezintă secvenţe de ADN fără introni şi fără altă secvenţă care ar putea reacţiona nespecific. Moleculele ADNc sunt, iniţial, unic lanţ, dar prin diferite metode sunt transformate în ADN dublu lanţ şi apoi introduse în vectori şi multiplicate o dată cu aceştia în celula gazdă. În acest caz, într-o moleculă finală de ADNc dublu lanţ doar un lanţ conţine secvenţe corespunzătoare moleculei matriţă ARNm, iar celălalt lanţ ADNc reprezintă secvenţele complementare respectivului lanţ matriţă ARNm. Probele ADN dublu lanţ pot fi ulterior marcate în vederea obţinerii sondelor genetice (vezi „ Marcarea sondelor genetice”).

a.2. Sub forma de oligonucleotide ADN unic lanţ prin sinteza chimică în "maşini de gene".

În aceste maşini se pot realiza concomitent sinteza şi marcarea sondelor genetice.Aceste oligonucleotide ADN-unic lanţ reprezintă baza materială pentru:

sonde genetice; sinteza de gene; primeri pentru reacţii polimerazice în lanţ.

274

b.Prepararea probelor ARN (sonde genetice)b.1. În " maşini de gene":ca şi probele ADN unic lanţ.b.2. Prin metoda de transcriere in vitro cu ajutorul vectorilor de transcriere.

Această metodă de transcriere in vitro (sinteza ARNm după o matriţă ADN) se realizează cu ajutorul vectorilor de transcriere unudurecţionali şi bidirecţionali, ăn vederea obţinerii de probe ARN lanţ unic (sondă genetică), care se utilizează ulterior în reacţiile de hibridare.Prin această metodă, ADN este transcris în afara celulei, în ARN, ARN-ul respectiv putând fi marcat direct în cursul sintezei.

Vectorii de transcriere (clasă aparte a vectorilor de expresie), nu se folosesc caşi ceilalţi vectori de expresie pentru sinteza de proteine, ci pentru sinteza de ARN. Vectorii de transcriere sunt formaţi dintr-un plasmid ADN, în care au fost înglobaţi un fag promotor (SP6) sau doi fagi promotori (SP6 şi T7). În cazul vectorilor cu un fag promotor (SP6), transcrierea in vitro va fi unidirecţională, iar în cazul vectorilor cu doi fagi promotori, bidirecţională. Promotorul reprezintă secvenţe de ADN de unde începe procesul de transcriere, deci sinteza ARNm.

b.2.1. Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6După înglobarea în sistemul SP6, ADN-ul străin este cel care urmează a fi transcris în

ARN. După linearizare se adaugă în mediu SP6-ARN-polimeraza şi patru ribonucleotide (dintre care trei nucleotide marcate şi unul nemarcat).ARN- polimeraza se va lega de promotorul SP6 pornind transcrierea genelor în direcţia SP6>fragment MCS>fragment ADN nou înglobat (fig. 148). Va fi transcris unul din cele două lanţuri de ADN nou înglobat. În sinteză, ARN-polimeraza va folosi ribonucleotidele marcate şi nemarcate, pentru formarea unei molecule ARNm conform matriţei ADN.

Fig. 148 - Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6

Având în vedere că transcrierea începe la nivelul promotorului SP6 şi se termină la locul de tăiere a enzimei de restricţie, înseamnă că prin utilizarea diferitelor enzime de restricţie se poate prestabili lungimea lanţului transcris şi se pot obţine lanţuri ARNm transcrise de lungimi prestabilite.

b.2.2.Transcrierea bidirecţională cu ajutorul vectorului bidirecţional cu doi promotori (φ SP6 şi φ T7).

Vectorul bidirecţional este format din ADN plasmidic, φ SP6, zona MCS şi φ T7 (vezi fig. 137). Cei doi promotori dirijeajă transcrierea în două sensuri opuse. Prin introducerea şi înglobarea într-un vector de transcriere bidirecţională a unui dublu lanţ ADN (de exemplu, ADNc între două segmente de MCS şi după linearizarea vectorului), se poate stabili de la început care din cele două lanţuri ADNc va fi transcris în ARN. Fiecare din cele două polimeraze necesare pentru transcrierea respectivului lanţ ARN şi anume, SP6 – ARN polimeraza şi T7 - ARN polimeraza , se leagă specific doar de promotorul corespunzător. După linearizare, în funcţie de enzima de restricţie folosită, cât şi de ARN-polimeraza utilizată pentru transcriere, se va sintetiza ARN sau ARN antisens.

275

Într-un dublu helix ADN:- un lanţ ADN este complementar cu ARNm de origine utilizat pentru sinteza ADNc;- al doilea lanţ conţine aceleaşi secvenţe de nucleotide ca şi ARNm de origine.

Prin transcrierea:- primului lanţ ADN, rezultă ARN sens identic şi cu acelaşi sens ca şi ARNm de

origine;- celui de-al doilea lanţ ADN, rezultă ARNm antisens = complementar faţă de

ARNm de origine: Acest ARN antisens se mai notwează ARNc (complementar) şi are sensul invers decât ARNm sens (normal).Probele de ARN obţinute în maşini de gene cât şi prin metoda transcrierii cu ajutorul

vectorilor fagici, pot fi marcate direct în soluţia de sinteză cu ajutorul nucleotidelor marcate (vezi „Marcarea”). Probele de lanţ unic ARN astfel obţinute şi marcate se utilizează ulterior în reacţii de hibridare, ca sonde genetice.

B. MarcareaSe face pe un sungur nucleotid, cu o substanţă care îl face vizibil din punct de vedere

biochimic sau imunohistochimic.

a. Marcarea radioactivăSe face cu radioizotopi 3H,35S, 125I, 32P.La alegerea izotopului trebuie ţinut cont de timpul

de înjumătăţire (timp necesar pentru ca substanţa radioactivă să se descompună în proporţie de 50%). Astfel, timpul de înjumătăţire pentru :

3H este de 12,35 ani;35S este de 87,4 ani; 125I este de 60 de zile; 32P este de 14,3 zile.Atomul radioactiv introdus în probă prin dezintegrare va emite radiaţii β care vor fi

evidenţiate la autoradiografie (impresionarea plăcii Roentgen la iluminarea cu radiaţii u.v.). Timpul de expunere a filmului la u.v. va fi diferit în funcţie de izotopul folosit:- pentru hibridarea Blotting se foloseşte proba marcată cu 32P;- pentru hibridarea in situ se foloseşte proba marcată cu 3H.În ultima vreme există tendinţa ca substanţele radioactive să fie abADNonate din cauza

efectului lor nociv asupra organismului şi înlocuirea lor cu substanţe neradioactive.

b. Marcarea neradioactivăSe face în două etape:

Etapa I – marcarea probelor cu biotină (cel mai frecvent), bromdeoxiuridină, digoxigenină.Etapa II – probele marcate sunt evidenţiate prin intermediul legării markerului de avidină (glicoproteină din ou)/streptovidină (sintetizată din ciuperca Streptomyces avidinii) şi anticorpi antimarker (de exemplu, antibiotina) marcaţi cu fluorocrom.

Etapa IMarkerul (biotina) se leagă printr-un lanţ de legare numit spacer de baza uracil din

nucleotid. Acest braţ de legare va uşura şi legarea ulterioară a biotinei de proteinele avidină/streptovidină, în etapa II. În mod normal uracilul se înglobează numai în ARN, nu şi în ADN, dar în condiţii de laborator, prin intermediul spacer-ului de la biotină se pot realiza două tipuri de legături:

- legătura cu nucleozidul natural;- legătura cu nucleozidul artificial.

De exemplu: Bio – UTP; Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat Bio – dUTP; Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat.

276

Pentru aceste structuri se folosesc în laborator trifosfaţii nucleozidelor. ATP-ul din nucleotidele ADN este transportor de energie pentru metabolismul celular.

Atât Bio – UTP, cât şi Bio – dUTP sunt derivate biotinate ale dezoxiuridin – trifosfstului şi , respectiv ribouridin – trifosfatului şi vor fi înglobate în locul dezoxitimidin – trifosfatului şi, respecti în ARN, în locul rbouridin – trifosfatului.

În momentul hibridării cu segmente ADN ţintă, nucleotidele cu uracil se împerechează, pe lanţul complementar de ADN ca şi pe lanţul ARN, tot cu un nucleotid cu adenină.

Etapa a II-aProbele de mai sus biotinate se evidenţiază prin legarea biotinei de avidină/streptovidină

sau anticorpi antibiotină marcaţi cu fluorocrom.Biotina prezintă o mare afinitate pentru avidină. Legătura bitină + avidină este foarte puternică şi aproape ireversibilă. Din cauza unor reacţii nespecifice se preferă streptovividina în locul avidinei.

În final, pentru a se evidenţia prezenţa complexului molecular hibrid biotină – avidină/streptovidină, acesta este marcat prin diferite metode.

C. Înglobarea nucleotidelor marcate în sonda geneticăSe realizează prin:

a. Metode enzimaticeb. Metode chimice.

a. Metode enzimaticeÎnglobarea nucleotidelor marcate radioactiv sau neradioactiv se face cu ajutorul unei

reacţii enzimatice, în prezenţa ionilor de Mg++.

I. Nick - translaţiaCea mai folosită metodă pentru marcarea sondelor este Nick-translaţia (translaţia prin

tăiere). În această metodă se folosesc două enzime: ADN-aza I şi ADN – polimeraza I.ADN- aza I este o enzimă de restricţie extrasă din pancreas de bou; ea taie legăturile

fosfodiesterice de ADN unic sau dublu lanţ; nu atacă ARN şi acţionează în prezenţa ionilor de Mg++ şi Mn++ (fig. 149).

Fig. 149 - Acţinea ADN- azei I pe dublul lanţ ADN îm prezenţa ionilor de Mg++ şi Mn++

ADN- polimeraza I (polimeraza Kornberg) este izolată din E. coli, are acţiune polimerazică 5' > 3', fixează nucleotidul ADN la capătul liber 3' (mai scurt) al moleculei ADN parţial dublu lanţ, în funcţie de complementaritatea faţă de nucleotidele de pe lanţul matriţă corespunzător (fig. 150). ADN – polimeraza I are şi o acţiune exonucleazică în ambele sensuri: 5 ' > 3' şi 3' > 5' ; această acţiune apare doar când în cursul sintezei unui ADN sunt introduse nucleotide false (fig. 151).

Fig. 150 - Acţiunea 5 ' > 3' polimerazică a ADN- polimeraza I

277

Fig. 151 - Acţiunea exonucleazică în ambele sensuri ale ADN – polimerazei I.

Astfel, după încorporarea nucleotidelor marcate, dublul lanţ ADN este denaturat (cele două lanţuri sunt separate); se vor obţine fragmente de lanţuri unice ADN marcate de diferite lungimi şi cu diferite secvenţe de baze (sonde genetice) (fig.152).

Fig. 152 - Schema Nick – translaţiei (după Hermaun , 1991).

II. Oligomarcare(RADNom Priming, RADNom Priming Oligolabelling,Feinberg-Vogelstein Technik)

Spre diferenţa de “nick-translatie”, in oligomarcare se folosesc drept matriţe lanturi unice de ADN rezultate dintr-o denaturare prealabila a unui lanţ ADN. Se foloseşte enzima Klenow Polimeraza care reprezinta un fragment de ADN-polimeraza. Klenow Polimeraza poseda activitate 5’ – 3’, si 3’- 5’ exonucleazica (dar nu prezinta activitate 5’- 3’ exonucleazica).

Se mai utilizează un amestec de hexanucleotide (oligonucleotide sintetizate cu ajutorul unei maşini de gene ); ele sunt structuri formate fiecare sir cate sase nucleoide care contin practic toate combinaţiile de secvenţe nucleotidice posibile, reprezentate de nucleotide ADN marcate (.) cît şi nemarcate (o), aflate de obicei in proporţie de la 1 la 3.

278

Numele metodei de RADNom Priming derivă de la utilizarea drept primeri a hexanucleotidelor cu secvenţe întamplătoare (randomized primer).III. Marcare terminala a lanturilor ADN (Endlabelling).

Pot fi marcate capetele 3’ si 5’ ale moleculei ADN şi ARN. Spre diferenţa de primele doua metode (1 şi 2), prin care sunt marcate moleculele de ADN probe (sonde genetice), în aceasta a treia metoda marcare se face numai la capetele moleculei ADN-proba rezultata ;de aceea, sensibilitatea moleculei de ADN rezultata prin această metoda este mult mai mică.Acest tip de marcare se efectueaza atat pe ADN unic lanţ cît şi dublu lanţ.Exista mai multe metode de marcare terminală.

Marcarea terminală 3’ a ADN:se face cu ajutorul enzimei transferaza terminala*.Această enzimă, în cazul de faţă, catalizează fixarea nucleotidului pe capatul 3’-OH liber

al moleculei ADN unic (sau dublu lanţ). Enzima nu are nevoie de nici o matriţa; va rezulta deci un ADN lanţ unic cu un capat 3’-OH liber (şi respectiv un ADN cu un capat format dintr-un lanţ 3’-OH care atârna în afara).

În aceasta metoda se foloseşte doar un singur nucleotide ADN marcat (de exemplu, cu biotina): dezoxiribouridinbiotinat (Bio-dUTP). Acest Bio-dUTP este legat prin acţiunea transferezei terminale de capetele 3’-OH ale unei molecule ADN dublu lanţ, deci pe fiecare din cele două lanturi, la capetele 3’-OH formînd o coada cu acelaşi nucleotide pe ambele lanturi ale dublului lanţ ADN (dar la capetele opuse). Lungimea acestei cozi este dependenta de concentraţia cationilor de Co++si de concentraţia nucleotidelor.

Cu ajutorul enzimei transferaza terminala se poate,de asemenea, ataşa, unei molecule dublu lanţ ADN , o coada cu nucleotide nemarcate,care conţin toata timina.Dupa denaturarea şi hibridicarea unei asemenea “probe marcate”, această coada cu timina poate fi evidenţiată indirect prin fixarea, în cursul hibridizarii, a unei cozi cu adenina marcata cu biotin ape lanţul ADN proba (adenine se va fixa prin complementaritate pe coada de timina).

În cazul acestei hibridizari, lanţul cu coada de timina reprezinta secvenţa ţinta, iar cel cu coada de adenine, secvenţa proba..

b) Metode chimiceReprezinta o marcare directa a acidului nucleic.

1. Marcarea cu fotobiotină.Un asemenea tip de marcare este bazat pe legarea biotinei printr-un braţ de legare

chimică, de acidul nucleic, pe o grupare chimica activate in prezenţa luminii (iluminare foarte scurta). Se formeaza o legatura stabile între biotina şi acidul nucleic (lanţ unic sau dublu).

2. Marcarea cu acridin oraj.Prin cuplarea între acridinester şi acidul nucleic se produce o legatură de

chemoluminiscenta care eliberează lumina. 12.4. CLONAREA ADN – ului

Clona bacteriana reprezinta un grup de celule bacteriene identice din punct de vedere genetic, care provin dintr-o singură celula bacteriană.Clonarea se poate realiza prin încorporarea (printr-o tehnică de recombinare ADN) a unui fragment de ADN străin într-un vector care ulterior este introdus şi multiplicat într-o celula gazdă.

În biologia moleculară, clonarea semnifică obţinerea unei culture de celule dintr-o celulă unică, astfel încat sa se obţină populaţie uniforma din punct de vedere genetic.

==================================================================

279

*Dezoximetil-nucleotid-terminal-transferaza; această enzimă se foloseşte şi în experienţe de clonare pentru obţinerea capetelor franjurate ale fragmentelor ADN

A. Etapele principale ale metodei de clonare Sunt urmatoarele:

extragerea unui fragment ADN, prin taierea ADN genomic, cu ajutorul enzimelor de restricţie;

introducerea fragmentului ADN într-un vector; introducerea vectorului recombinant (plasmid care a înglobat fragmentu ADN străin) în

celula gazdă; selectarea celulelor bacteriene care conţin vectorul recombinant.

Clonarea ADN se recomADNă atunci cADN este necesară izolarea şi multiplicarea unui segment de ADN (dintr-un genom). În majoritatea experimentelor de clonare, se folosesc celule bacteriene de E.coli.

1.Extragerea unui fragment ADN.Se lucreaza pe celule de Esch.coli.Se folosesc enzime de restricţie de tip sticky* şi un

plasmid care poarta doua gene (markeri de rezistenţa la doua antibiotice: ampicilina şi tetraciclina).

În scopul eficienţei de clonare:a) pentru a împiedica circularizarea vectorului ADN străin, trebuie îndepartate grupările

fosfat de la extremitaţile 5’ ale moleculei deschise de ADN a vectorului, cu ajutorul fosfatzei alcaline.În acest fel, vectorul nu se va mai circulariza. Fosfataza alcalina se obţine din celule de Esch.coli sau celule de intestine de oaie;

b) pentru a permeabiliza membrane celulei bacteriene la respectivul plasmid vector, celula bacteriana trebuie tratata cu soluţie CaCl2 pentru a devenit compententa;

c) având in vedere faptul ca celulele bacteriene poseda sisteme care protejează celula de pătrunderea unui ADN străin, se folosesc pentru clonari celule bacteriene mutante (celule cu system de apărare mult diminuat).

2.Introducerea vectorului recombinant in celula gazda (competenta)Acest fenomen reprezinta procesul de trasformare. În soluţia nutritive în care se găsesc

celulele bacteriene, sincron cu multiplicarea celulelor bacteriene, se produce şi multiplicarea vectorilor recombinanti incorporate.

Ţinând cont de faptul că atît plasmidul cît şi fragmentele ADN au locuri (situs-uri) de tăiere complementare, atunci cînd vectorul deschis şi segmnetul ADN străin vor veni in contact, din zonele sticky, se vor lipi şi va rezulta lanţul ADN recombinant (fragmentul ADN a devenit inclus in vector). De obicei, pe plasmidul iniţial care poarta rezistenţa la antibiotice (tetra şi ampicilina) se incorporeaza fragmentul ADN străin pe locul unuia din cei doi markeri, eliminADN markerul respective(de obicei se elimina gena tetra şi ramane cea pentru ampicilina in momentul taierii lanţului ADN de atre enzimele de restricţie.

3.Testarea celulor bacteriene supuse procesului de transformare.Aceasta testare se face cu scopul de a controla daca celula bacteriana a incorporate

respectivul plasmid recombinant. În acest sens, bacteriile transformate (cele care au primit vector+ADN) se testeaza pe un mediu de cultura cu ampicilina; vor supravieţui numai acele celule bacteriene care au caştigat rezistenţa la ampicilina, prin acceptarea plasmidului recombinant, purtatorde gena pentru ampicilina (rezistenţa la ampicilina). Din aceste bacterii cu vectori recombinant, însămînţate pe mediu de cultura cu ampicilina vor creşte colonii bacteriene, din care fiecare va reprezenta o clonă.

4. Selectarea celulelor bacteriene purtătoare de vector recombinant.

280

Selectarea acestor celule purtătoare de plasmid cu ADN străin încorporate şi diferenţierea lor de celule (clone) fără ADN străin se face prin însămînţare, prin replica plating, a coloniilor bacteriene pe un mediu cu tetraciclina; pe acest mediu vor supravieţui doar clonele care nu conţin nici un fragment de ADN străin (celule rezistente la tetraciclina).

Tip sticky=enzime care taie cele două lanţuri ale helixului dna în mod franjurat datorită faptului ca şi-au pastrat gena purtatoare de aceasta rezistenţă (este vorba de plasmidul “gol” fără ADN străin ataşat), în timp ce clonele care au pierdut gena de rezistenţa la tetra (în momentul legării plasmidului de ADN STRĂIN), prin formarea unui plasmid recombinant, nu cresc pe acest mediu. Abia din acest moment se poate studia mai departe clona care conţine fragmentul ADN dorit, printr-o tehnică de hibridizare speciala, şi anume prin hidibridizare colonială. B. Biblioteca genomica ADN (secvenţe de exoni+introni)

Dacă genomul unui organism este secţionat cu enzime de restricţie, iar diferite fragmente de ADN sunt clonate (în celule bacteriene), se va obţine un numar de clone corespunzADN diferitelor amestecuri (vector plasmidic+segment ADN). Totalitatea acestor clone rezultate din genomul unui organism iniţial reprezintă biblioteca genomica ADN. Acest mod de clonare, care duce la formarea unei biblioteci genomice ADN prin tăierea genomului (cu ajutorul enzimelor de restricţie) potrivit principiului întamplării şi prin unirea fragmentelor rezultate, reprezinta tehnica “împuşcarii” (shotgun).

Clona ADN genomica a unuia şi aceluiaşi organism este totdeauna identical şi independenţa de tipul celular, deoarece toate celulele aceluiaşi organism posedă o înzestrare genetică identical.Din aceasta biblioteca se obţin secvenţe ADN necesare pentru tehnica de hibridizare; acestea vor fi folosite drept secvenţe ADN cu rol complementar (cu secvenţe ADN cunoscute), in vederea identificarii unor fragmente ADN noi, necunoscute, a caror secvenţe nucleotidice trebuie cercetare şi identificate.

Clonele genomice ADN vor conţine atat secvenţe de introni, cît şi exoni, corespunzătoare genomului celulei respective de origine.Clonele din biblioteca genomica ADN se folosesc pentru:

- cercetarea structurii complete a genelor;- cercetarea structurii exonilor şi intronilor;- cercetarea secvenţelor reglatoare.

C. Biblioteca ADNc (ADN copie dupa matriţa de ARNm matur)Reprezintă doar o informaţie pură formată numai din secvenţe de exoni.Spre diferenţa de

biblioteca genomica ADN, care rezultă din clonarea de fragmente ADNc se sintetizează artificial în laborator, pe o molecula de ARNm matur, drept copie complementară (în prezenţa enzimei reverstranscriptaza).

Produsul acţiunii acestei enzime va fi o molecula mixta (hibrid): ARNm-ADNc. Din acest hibrid, lanţul dublu ADNc se va forma din acest lanţ unic ADNc, prin doua posibilităţi:- în prezenta ADN-polimerazei (Klenow= ADN-polimeraza I extrasa din celula de

Esch.coli);- în vectori; vectorii recombinaţi(vector+ lanţ unic ADNc) vor determina ulterior formarea

de clone bacteriene ADNc.În timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate celulele aceluiaşi

organism, clonele ADNc sunt diferite pentru diferitele tipuri de celule ale aceluiaşi organism.În fiecare tip de celule, aceluiaşi tip de ADN genomic îi corespund alte gene active (exoni), ceea ce înseamnă ca în fiecare tip de celule poate apare un alt tip de ARNm matur, astfel încat, aceluiaşi organism, biblioteca ADNc rezultata variaza de la un tip celular la altul.

Clonele din biblioteca ADNc se folosesc în special în scopul analizei directe a secvenţelor de baze care codifica un anumit aminoacid sau produsul proteuc final (codificat de respectivul fragment ADNc). Secvenţa clonelor ADNc este studiată în special prin experimentele de hibridizare.

281

Astăzi, în terapia bolilor tumorale se intrevede posibilitatea identificarii şi distrugerii tintite a anumitor molecule ARNm, care induc translaţia informaţiei pentru sinteza unor substanţe oncogene.

Cu ajutorul experientelor de clonare s-a reuşit citirea de secvenţe de ADN de pe lanţul ADN al genomului unui organism.Pasul urmator îl reprezintă obţinerea unor modificariale acestor segvente ADN, cu ajutorul unor tehnici de inginerie genetică (procese artificiale de recombinare ADN), cît şi introducerea acestor segmente astfel modificate de ADN în celule sau organisme, unde aceste modificări urmeaza a se exprima.

12. 5. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR)

A fost numită de Lederberg, în 1993, “instrumental pentru democratizarea biologiei moleculară”.Această reacţie dă posibilitatea ca dintr-o mixture de ADN să poata fi “pescuită” o singura moleculara de ADN, şi aceasta sa fie ulterior amplificata enzimatic, cu mijloace tehnice relative simple.

Spectrul de aplicabilitate al PCR este foarte larg: de la medicina judiciara, diagnosticarea bolilor genetice pînă la “vanarea” şi identificarea de noi virusuri şi studii de ecologie şi arheologie (studiul ADN-ului) din fosile.

PCR este folosită pentru cercetarea unor cantităţi foarte mici de ADN dintr-un produs biologic.

Avantajele acestei reacţii sunt urmatoarele:- fiind foarte sensibilă, reacţia poate pune în evidenta chiar şi prezenţa unei singure

molecule de ADN, in probele de cercetat (produs biologic), deoarece reacţia ofera posibilitate multiplicarii (clonarii) ADN-ULUI chiar şi in afara celulei vii;

- reacţia permite chiar şi multiplicarea unei singure secvenţe de ADN.Astăzi exista masini automate (Thermai Cycler) pentru realizarea unor asemenea reacţii

repetate; o multiplicare suficienta de secvenţe de ADN este reprezentata de minimum 25 de cicluri de multiplicare; într-o masina automata se desfaşoara 30 de cicluri într-un interval de 4 ore.

A. Principiul reacţiei.Se foloseşte drept matriţa un ADN monocatenar. În condiţii de laborator în vitro, pe

acest lanţ unic de ADN se poate sintetiza un lanţ complementar cu ajutorul ADN-polimerazei şi în prezenta unui oligonucleotid (15-20 nucleotide) primer (armorsa). Pentru a porni sinteza noului lanţ ADN pe un lanţ ADN matriţa, ADN-polimeraza necesită prezenta pe matriţa a unui oligonucleotid primer cu capatul 3’-OH liber; la acest capăt urmeaza a se fixa nucleptidele ADN care vor forma noul lanţ.

B. Efectuarea reacţieiPCR poate porni de la punctul a sau b.

a. ADN genomic dublu lanţ (de cercetat) izolat din celule şi tăiat în fragmente cu ajutorul enzimelor de restricţie corespunzătoare;

b. Lanţ unic de ADNc, sintetizat în prealabil prin trascriere inverse a ARNm.La capatul 3’ al lanţului ADNc se ataşeaza o coada de nucleotide-guanina cu ajutorul

enzimei trasferaza terminala.Urmeaza desfaşurarea PCR cu doi primeri diferiţi utilizaţi simultan, câte unul corespunzator pentru fiecare lanţ ADN (rezultat din ADN-ul dublu lanţ denaturant). Dintre cei doi primeri, primul primer este nucleotide-timina, al doilea primer este nucleotide-citozina. Etapele reacţiei; denaturarea ADN-ului genomic (izolat din celule) dublu lanţ sau ADNc (sintetizat cu

ajutorul unei molecule de ARNm) la temperature înalta (95 grade C).Acest ADN conţine secvenţe care urmeaza a fi multiplicate (amplificate);

dupa scăderea temperaturii se adaugă primerul în exces. În aceste condiţii fixarea primerului pe ADN-ul unic lanţ reprezintă un proces de hibridizare ce are loc la

282

temperature scăzuta (36-65 grade C). Primerul delimiteaza capatul iniţial al fiecarei din cele doua secvenţe ADN unic lanţ (rezultate din denaturarea ADN-ului dublu lanţ) de multiplicat. Adaosul de primer se face în exces, pentru a se obţine o hibridizare primer lanţ unic de ADN şi nu o hibridizarea între lanţurile unice de ADN rezultate din denaturare.

reacţia de sinteza a noului lanţ ADN cu ajutorul ADN-polimerazei, în prezenta celor 4 tipuri de nucleotide ADN (adenine/timin/guanine/citidin deoxi-nucleozid trifosfat) pornind de la locul de fixare a primerului. ADN-polimeraza se leagă de capatul 3’ al primerului şi sintetizează noul lanţ în direcţia 5’->3’, folosind drept matriţa segmentul ADN lanţ unic de amplificat.Primerul va fi încorporate în noul lanţ de ADN format.În acest fel lanţul de ADN este dublat şi, o data cu acesta, un ciclu de PCR este terminat.

începe un nou ciclu cu denaturarea de aceasta dată a ADN-ului dublu lanţ nou sintetizat (în treapta anterior anterioara); mai departe, acest nou ciclu si acest ADN nou-sintetizat (prin sinteza mijlocita de ADN-polimeraza);

cu fiecare nou ciclu ( de denaturare/sinteză a ADN-ului) va fi dublata cantitatea de ADN rezultata din ciclul anterior.

Pentru sesizarea eventualelor erori sau neajunsuri ale reacţiei PCR, se recomandă;- repetarea de mai multe ori a respectivei reacţii pentru aceeaşi probă;- reacţia PCR sa fie însoţită, de fiecare dată, de controale negative.

C. Polimeraza utilizată în PCR.În anii 1980, se folosea ADN-polimeraza Klenow (fragment de ADN-polimeraza I de la

e. coli); fiind termolabila, această enzima a fost apoi înlocuită cu o ADN-polimeraza ternostabilă, izolată de la o bacterie termifila Thermus acquaticus.

Aceasta ADN-polimeraza a fost numită Taq-polimeraza. Taq-polimeraza este stabila până la 95 grade C.

La fiecare nou ciclu al PCR se adaugă Taq-polimeraza proaspătă.Optimum de activitate al acestei enzime este la 75-80 grade C; această activitate scade cu 50% la 60 grade C şi cu 90% la 37 grade C.

Dacă pentru PCR denaturarea ADN-ului se face la 95 grade C, noul adios de Taq-polimeraza declanşeaza de fiecare dată ciclu următor de sinteza ADN. În acest fel, se poate efectua reacţia în care toţi reactivii se pun de la început în recipient I până la sfarşitul reacţiei nu mai trebuie adaugate noi cantităţi.

Utilizarea Taq-polimeraza a făcut posibilă automatizarea totala a acestei produceri în maşinile Thermal Cyclers. În condiţii normale, cu ajutorul Taq-polimerazei se pot efectua consecutive 40 de cicluri PCR, obţinându-se o amplificare ADN de ordinal 10 la puterea 6-10 la puterea 7. Dacă se urmareşte o amplificare ADN mai mare decât cea corespunzatoare la 40 de cicluri PCR, trebuie începuta o noua serie de cicluri, cu ajutorul ADN-ului amplificat, obţinut şi diluat de 1000-10000 de ori.

În acest fel, cu ajutorul a doua serii câte 40 de cicluri PCR, se poate obţine o amplificare de 109 a cantitaţii de ADN. Pentru o multiplicare sufienta de secvenţe ADN sunt necesare 25-30 de cicluri de reacţii automatizate, care se efectuează, dupa cum am mai arătat, în aproximativ 4 ore.

D. Amplicabilitatea practica a PCR-ului.Produsele ADN obţinute prin PCR sunt separate electroforetic în funcţie de dimensiuni,

sub forma de benzi, în gelul de electroforeza, iar apoi benzile sunt făcute vizibile, în lumina U.V. prin tratarea prealabilă a gelului cu etidiumbromid. Apoi se realizeaza hibridizarea ADN-ului cu sonde genetice specifice prin metoda Souther Blotting. PCR are un spectru de aplicabilitate foarte larg.

a) În diagnosticul medical.În acest scop. ADN-ul extrage din celule proaspat lizate şi din celule fixate şi inglobate

în parafina. ADN-ul astfel extras este supus reacţiei polimerazei în lanţ şi apoi analizat cu ajutorul sondelor genetice prin reacţia de hibridizare. PCR este utilizat în: diagnosticul bolilor

283

ereditare (fibroza chistica, anemia Cooley, distrofia musculara Duchenne, fenilcetonuria). Diagnosticul bolilor ereditare, graţie PCR-ului, se poate face şi prenatal, în făt, prin determinarea ADN-ului din celulele trofoblastice; prin aceasta metoda se poate face determinarea prenatal pentru sexul copilului şi se poate pune şi diagnosticul unei eventuale boli genetice. În urma recoltarii de lichid amniotic este supus determinarii cu ajutorul PCR-ului sau al anticorpilor monoclonali, în acest fel fiind posibila determinarea de defecte genetice cromozomiale, metabolice (enzimopatii). diagnosticul bolilor infecţioase.

Diagnosticul infecţiei HIV cu ajutorul PCR-ului se poate face în stadiile prococe ale infecţiei, prin identificarea prezentei acidului nucleic viral în sânge (şi anume acidul nucleic viral fixat în genomul celulei limfocitare umane), atunci când toate celelalte reacţii serologice sunt înca negative.PCR poate da un rezultat precoce pozitiv chiar şi în prezenţa unei singure celule infectate cu HIV ( din materialul de cercetat ).

Introducerea diagnosticului rapid al infecţiei HIV prin PCR este astazi absolut necesara în practică, în special în investigarea donatorilor de sânge şi de organe.

Pentru diagnosticarea infecţiei HIV într-o encefalita declanşată de acest virus, nu este necesara o proba de ţesut cerebral, ci este suficienta doar o proba de LCR.

În general, pentru un diagnostic prin PCR, recoltarea de probe reprezinta un stres minim pentru bolnav; în acest caz se folosesc drept probe; spalatura bucala (cu celule epiteliale), epitelii de fir de par, probe uscate de sânge. PCR mai este utilizat în diagnosticul urmatoarelor boli infecţioase: hepatita virala, infecţia cu virus herpes simplex, virus Epstein-Barr,virus papollima, Mycobacterium tbc., Pneumocistis carinii, Neisseria meningitides, Clostridium difficile. Recent, cu ajutorul reacţiei PCR au fost efectuate studii genetice asupra tulpinei de Vibro cholerae grup 0139 (izolata pentru întaia oara, pe glob, în 1992-1993, în Bengal), reuşind sa se demonstreze ca această tulpina ar reprezenta rezultatul unor modificări genetice suferite de tulpina Vibrio cholerae grup 01 biotip eltor, prin deletia, de pe ADN-ul cromozomial, a unui segment de 22 kb, concomitant cu inserţia unui segment nou de 35 kb.

PCR este utilizat şi în identificarea unor germeni microbieni ramaşi până astăzi necultivabili, de exemplu în boala Whipple.

Boala Whipple a fost semnalată pentru întâia oara în anul 1907; este primul exemplu din partologia umană în care s-a emis ipoteza prezenţei posibile a unei bacterii necultivabile, imposibil de identificat prin posibilitaţile clasice cunoscute. S-au postulat apoi şi alte boli de etiologie posibil microbiana fara a fi însa posibilă evidenţierea prezenţei unor microorganisme, probabil microbiană fără a fi însa posibilă evidenţierea vizuală, în aceste cazuri fiind necesare alte metode decât cultivarea pe medii de cultura, pentru detectarea şi identificarea agenţilor patogeni. Noile metode îşi au rădăcinile în filogenetica moleculara. Boala whipple se manifesta clinic prin astralgii migratorii, febra, dureri abdominale, diaree, pierderi în greutate, apariţia în ganglionii mezenterici de infiltrate macrofagice proeminente, depozite de grasime.

b. În medicina judiciarăPRR este folosit pentru evidenţierea identităţii unui fir de părsau a unei cantităţi foarte

mici de sânge sau spermă. Astăzi PCR poate fi folosită în combinaţie cu metoda fingerprinting în aceleaşi scopuri.

c. În studii ecologiceCu ajutorul PCR s-a reuşit evidenţierea unui număr de microorganisme în probe de

pământ şi apă; au fost analizate microorganisme care până astăzi nu au putut fi cultivate pe medii de cultură, cât şi microorganisme de sol care au suferit în timp modificări genetice.

d. În arheologiePCR a fost utilizată până în prezent şi pentru analiza ADN provenit din mumii egiptene

vechi de mai bine de 2400 de ani.

284

12. 6. SECVENŢIEREA ADN- ului

Analiza structurii ADN a început o dată cu anii '70, cu ajutorul metodei de secvenţiere ADN şi de analiză a secvenţelor nucleotidice din aceste structuri.Acest studiu a fost posibil datorită folosirii enzimelor de restricţie (endonucleaze), care pot tăia moleculele de ADN în fragmente de cîteva sute până la câteva mii de perechi de baze. Aceste fragmente obţinute pot fi apoi separate electroforetic şi analizate.

La Los Angeles şi la Heidelberg există în prezent bănci de date în care au fost strânse toate secvenţele ADN cunoscute până în prezent. Genomul multor virusuri a fost total secvenţiat. În 1995 a fost terminată secvenţierea completă a primului genom bacterian, cel de Haemophilus influenzae, urmat la scurt timp de cel de Mycoplasma genitalium. Curând vor fi terminate şi secvenţierile complete ale genomurilor bacteriene Escherichia coli, Bacillus subtilis, Methanobacterium thermoautotrophicum. La drojdii (drojdia de bere – Saccharomyces cerevisiae), a fost secvenţiat pentru prima dată un cromozom, şi anume cromozomul III, dovedindu-se că conţine 315 357 perechi de nucleotide şi 200 de gene; la această analiză s-a lucrat trei ani în 35 de laboratoare din lume.

Cu ajutorul acestei proceduri s-au obţinut informaţii şi asupra materialului genetic inclus în cele 23 de perechi de cromozomi umani, şi anume:

- locul relativ al genelor pe cromozomi;- identificarea unuio număr de gene;- cauzele unor boli genetice.

În prezent este în curs de desfăşurare proiectul de cercetare asupra genomului uman, genom care conţine circa trei miliarde de perechi de bze (50 000 – 100 000 de gene).

Astăzi se ştie că doar 3 % din genomul uman reprezintă gene funcţionale (exoni), restul de 97 % din genom reprezintă doar „balast genetic” a cărui semnificaţie este încă necunoscută.

A. PrincipiuSecvenţierea ADN (sequencing) înseamnă tăierea lanţului ADN în secvenţe şi analiza

ulterioară a secvenţelor de baze nucleotidice din aceste fragmente.Prin descifrarea acestor secvenţe de baze se poate ajunge la delimitarea genelor şi la

stabilirea secvenţelor de aminoacizi codificate de o singură genă. Ca urmare, analiza secvenţială a ADN-ului şi, indirect, cea a proteinelor corespunzătoare

pot furniza date cu privire la conformaţia proteinei, funcţiei proteice, înrudirii dintre proteine, cât şi asupra bolilor produse prin mutaţii. Secvenţierea ADN este o variantă a tehnicii de recombinare ADN cu ajutorul căreia se poate stabili secvenţa de baze din molecula ADN. Condiţia de baza pentru realizarea acestei secvenţieri este prezenţa unui număr suficient de copii ale moleculei de ADN. Acest lucru se poate realiza prin clonarea ADN sau prin metoda PCR.

B. MetodePentru secvenţiere se folosesc două metode:

a. Metoda enzimatică; tehnica Sanger (Chain Termination Tehnique).b. Metoda chimică; tehnica Maxam- Gilbert ( de obicei combinată cu metoda Sanger).

a. Metoda enzimaticăTehnica SangerPrincipiu: se determină secvenţele de baze nucleotidice pe copia de acid nucleic şi prin

complementaritate se deduce secvenţa de baze de pe lanţul de acid nucleic de origine.Etapele reacţiei:

- lantul dublu de acid nucleic (AN) aste adus la forma de AN unic lanţ;

285

- pe lanţul unic AN se fixează un primer (moleculă starter sau amorsă). Acest primer ste un oligonucleotid scurt, preparat semiautomat prin tăiere, cu ajutorul enzimelor de restricţie, a unui fragment ARN. Primerul este stfel selectat încât capătul 3' să se potrivească prin complementaritate, într-un punct, pe lanţul ADN de cercetat. Acest primer este înglobat într-un vector sau secvenţă cunoscută;

- are loc sinteza lanţului ADN complementar (după modelul matriţei AN) în prezenţa celor patru dezoxinucleotid trifosfaţi (dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dintre care unul este marcat, a unui didezoxinucleotid trifosfat (ddNTP) şi a ADN-polimerazei I sau reverstranscriptazei;

- sinteza lanţului ADN se va opri acolo unde în locul unui dNTP se va îngloba un ddNTP corespunzător. În acest punct se va opri reacţia polimerazei. Această reacţie de sinteză a ADN-ului se va desfăşura în patru variante, în fiecare din variante fiind marcat altul din cele patru dNTP-uri;

- cele patru molecule de ADN dublu lanţ obţinute sunt denaturatze prin căldură;- lanţul de acid nucleic nou sintetizat cu un nucleotid marcat este separat prin gel

elecroforeză;- în locul marcării radioactive, fiecare bază este colorată cu altă substanţă fluorescentă.

Apoi se face citirea bazelor colorate de pe gelul de electroforeză prin autoradiografie.b. Metoda chimică

Tehnica Maxam-GilbertSpre deosebire de tehnica Sanger, unde determinarea secvenţelor se face pe lanţul copie,

prin tehnica Maxam-Gilbert determinarea secvenţelor se face pe lanţul de acid nucleic de origine. Tehica se bazează pe o modificare chimicăaunei baze şi o tăiere specifică la nivelul altei baze (de exemplu adenina), de pe molecula ADN. Aceste reacţii au loc pe lanţul ADN originar. În ultimii ani, în S.U.A. în laboratoarele de Genetică ale Universităţii Berkeley, s-au realizat aparate automate pentru citirea secvenţelor de baze nucleotidice din acizii nucleici cu viteza de 7 000 – 8 000 secvenţe de baze pe zi.

12.7. FINGERPRINTING GENOMIC (amprente de ADN)

a. PrincipiuPe baza analizelor de secvenţiere a ADN-ului, s-a demonstrat că fiecare individ este

caracterizat printr-un fingerprinting genomic (un pattern individual al regiunilor hipervariabile din ADN-ul genomic, şi anume de pe zona ADN- urilor minisatelizate).

Genomul uman conţine trei miliarde de perechi de nucleotide, dintre care: 70 % reprezintă secvenţe unice identice la toţi indivizii; 30 % reprezintă secvenţe repetitive, şi anume:

- înalt repetitive 7 – 10 %; aceeaşi secvenţă de 300 perechi de nucleotide se repetă de 30 000 – 1 milion de ori dispersat, pe toată lungimea genomului;

- gene structurale pentru sinteza de ARNt, ARNr şi histone;- zona spacer ce conţine gene criptice (silenţioase);- ADN-uri satelite înalt repetitive, netranscriptibilr, necodificatoare

de proteine. 20 – 30 % moderat repetitive, fiecare secvenţă cu câteva sute până la 6 000 de perechi de

nucleotide se repetă în 20 – 30 000 de copii.

b.Tehnica RFLPCu ajutorul acestei tehnici se pun în evidenţă zonele de ADN variabil de la individ la

individ. Aceste tipare de fragmente de ADN individual sunt reprezentate de o amprentă RFLP specifcă ( polimorfismul de lungime al fragmentelor de restricţie).

286

Pentru determinarea acestor tipare individuale, se izolează ADN-ul genomic din celulele unui organism (diferite ţesuturi, rădăcini ale firului de păr, sânge, salivă, spermă).

Tehnica RFLP cuprinde următoarele etape:- ADN-ul extras este supus acţiunii enzimelor de restricţie;- Fragmentele de ADN (dublu catenar) sunt supuse migrării bidimensionale într-un gel

denaturat (conţinând un agent chimic denaturat ca ureea, concentraţie 5 %);- Benzile de ADN unic lanţ obţinute în gel sunt supuse colorării cu etidiumbromid;- Benzile ADN sunt vizualizate prin transiluminare la u.v.

Această tehnică evidenţiază atât prezenţa/asenţa fragmentelor de restricţie, cât şi polimorfismul de lungime al respectivelor fragmente. Determinarea RFLP pentru organismele eucariote, inclusiv omul, are semnificaţie, în mod deosebit, în cazul urmăririi transmiterii la descendenţi, a informaţiei genetice parentale (prin compararea fringerprint- urilor între generaţii). În cazul examinării singulare ( a informaţiei genetice per individ), se preferă metoda Southern Blotting a cărei capacitate discriminatorie este considerată mai bună.

c.Tehnica AFLPAceastă tehnică ce combină principiul analizei RFLP cu cel al reacţiei PCR înalt

specifică, detectează numai prezenţa sau absenţa fragmentelor de restricţie, dar nu face şi analiza polimorfismului de lungime a fragmentelor. Tehnica este considerată astăzi metoda universală pentru determinarea prezenţei/absenţei unei anumite amprente de ADN în orice sursă de origine bacteriană, vegetală, animală sau umană.d.Aplicaţii ale metodei amprentelor ADN În medicina judiciară:- în criminalistică; urmărirea criminalului poate fi condusă în funcţie de urmele găsite:

amprente individuale prezente în resturi de piele, păr, sânge, spermă. Dacă materialul genetic se află în cantitate foarte mică, se recurge la PCR pentru amplificarea cantităţii de ADN;

- diagnosticul paternităţii; având în vedere că variaţiile de ADN- urile minisatelite se moştenesc după legile mendeliene, metoda amprentelor ADN este utilă pentru dovedirea unei înrudiri (amprenta genetică diferă de la individ la individ, se potriveşte în mare parte la rude şi este identică la gemenii univitelini);

În medicina clinică- în boli genetice; în analiza de likage şi determinarea instabilităţii genetice;- în oncologie; pentru diagnosticul midificărilor genetice din celulele tumorale de la

persoane cu carcinom mamar (se prepară şi se compară amprente de ADN din celulele tumorale/elemente figurate sanguine cu condiţia ca în proba de sânge să nu existe celule modificate oncogen;

- urmărirea epidimiologică a circulaţiei agenţilor infecţioşi pentru determinarea pattern-urilor RFLP la virusuri şi tulpini bacteriene;

- stabilirea interrelaţilor virale şi bacteriene pe bază de amprente ADN, în vederea încadrării taxonomice a unor noi agenţi infecţioşi;

- prin introducerea tehnicii de fracţionare a segmentelor de restricţie şi separării acestora în gel cu gradient denaturat, se va putea, în viitor, măsura frecvenţa mutaţiilor în genomul uman,se va putea analiza instabilitatea genomului şi a relaţiei acestuia cu senescenţa şi neoplazia, se vor putea realiza analize de linkage şi cartare de noi gene implicate în boli genetice;

În biologie- stabilirea paternităţii unor păsări de pradă ale căror ouă au fost clocite de părinţi adoptivi;- stabilirea de relaţii genetice între diferite specii pe baza structurii ADN-ului, acest criteriu

fiind superior celui al sistematizării de până în prezent, efectuat pe bază simplelor caractere morfologice;

- stabilirea polimorfismului genetic în interiorul aceleiaşi specii (de exemplu, heterozigoţii);

287

- pe baza existenţei RFLP-urilor au fost amplificate şi analizate secvenţe nucleotidice din fragmente ADN provenite de la specii dispărute;

În arheologie- s-a analizat ADN-ul provenit de la mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani

(prin clonare şi secvenţierea unor fragmente ADN de circa 3400 de baze).

288