Enzimologie – Curs 3

1

1.5. Monitorizarea activității enzimatice

1.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Activitatea catalitică a enzimelor poate fi controlată de o serie de factori: pH,

tăriea ionică, temperatura, de ioni sau de alte molecule.

Influența pH-ului

Activitatea unei enzime depinde de pH-ul mediului de reacție din două motive:

prezența în centrul activ al enzimei de grupările donoare sau acceptoare de protoni și

menținerea ansamblului structural enzimatic. Grupările acceptoare/donoare de protoni

(Tabelul 1) pot fi titrate, dependențele activității enzimatice cu pH-ul au în majoritatea

cazurilor o formă de clopot, cu un maxim la pH-ul optim. Profilul de pH optim poate fi

privit ca o combinație de curbe de titrare a grupărilor încărcate care sunt esențiale pentru

cataliză, majoritatea provenind din aminoacizii componenți ai enzimei. Cofactorii pot fi

de asemenea influența acest profil. Un tip de grupare va fi activă în stare protonată, altele

în stare deprotonată și de aceea curbele de titrare ale acestora formează părțile laterale ale

profilului dependent de pH. De exemplu, o grupare carboxil poate fi activă în stare

protonată și tranziția de la forma protonată la cea deprotonată (în domeniul de pH acid)

formează partea din stânga a profilului, în timp ce deprotonarea unei grupări amino

contribuie la partea din dreapta (de declin) a profilului. Dacă pentru fiecare zonă este

responsabilă numai o singură grupare rezultă o curbă de titrare clasică cu un singur punct

de inflexiune ce corespunde valorii pKa a restului titrat. Această valoare a pKa-ului poate

servi la identificarea grupării implicate în mecanismul catalitic, dar trebuie luat în calcul

și faptul că această valoare poate fi schimbată (cu 1-2 unități de pH) prin simplu fapt că

acest aminoacid este parte integrantă a structurii tridimensionale a enzimei. În plus, în

majoritatea situațiilor pot fi implicate (în actul enzimatic) mai multe resturi catalitice și

profilul din acea zonă poate fi o suprapunere a unor curbe de titrare.

Tabel 1. Valorile pKa ale grupărilor

funcționale din diverși aminoacizi

Aminoacidul pKa

Acidul aspartic

Acidul glutamic

Histidina

Cisteină

Serină

Tirozină

Treonină

Lizină

Arginină

3,86

4,32

6,09

8,30

9,15

10,10

10,40

10,53

12,30

Cel mai adesea expunerea enzimei la valori extreme de pH poate conduce la

schimbări structurale ireversibile (scăderea activității enzimatice). Majoritatea enzimelor

au un pH optim în mediu neutru (într-un domeniu de pH 6,5-8,5). Enzimele care preferă

condiții extreme, ca pepsina (la pH de aproximativ 1) și fosfataza alcalină (9-10), trebuie

testate în domeniul de pH adecvat.

Deoarece activitatea enzimatică este influențată de schimbările de pH, valoarea

acestui parametru trebuie menținută constantă pe parcursul determinării. Pe de altă parte,

Enzimologie – Curs 3

2

componentele din amestecul de testat sau soluția enzimei pot influența valoarea pH-ului.

În unele situații reacția enzimatică poate determina un salt/o scădere a pH-ului și din

acest motiv trebuie măsurată valoarea finală a acestuia la sfârșitul reacției.

Profilele catalitice dependente de pH sunt în general reversibile. Când enzima este

incubată la pH marginal, la care activitatea este minimă, aceasta va recăpăta activitatea

maximă când este deplasată la pH-ul optim al acesteia. În schimb, procesele dependente

de pH care privesc structura tridimensională a enzimei sunt cel mai adesea ireversibile.

Un profil al stabilității în funcție de pH poate distinge între schimbările de pH reversibile

și ireversibile. În acest context, cantități mici de enzimă sunt preincubate (de exemplu o

oră) la valori de pH diferite, după care activitatea este măsurată la pH-ul optim. Activități

identice sunt obținute atâta timp cât schimbările de pH sunt reversibile, dar după o

schimbare ireversibilă enzima nu mai poate reveni la activitatea optimă. Curba de

stabilitate a enzimei în funcție de pH se “întinde” pe un domeniu mai larg comparativ cu

profilul pH-ului optim. Cum enzima are activitatea maximă la o valoare de pH optimă se

va folosi o soluție tampon cu aceeași valoare de pH pentru majoritatea determinărilor de

activitate enzimatică. Uneori, unele determinări enzimatice nu sunt efectuate la pH-ul

optim. De exemplu, măsurătorile de activitate ale alcool dehidrogenazei se efectuează la

pH alcalin (diferit de pH-ul optim) care permite deplasarea echilibrului de reacție spre

produsul de reacție.

Influența solventului, tăriei ionice și a soluțiilor tampon utilizate

Solventul joacă un rol important pentru activitatea enzimatică. Enzimele legate

sau „conectate” la membrana celulară preferă un mediu nepolar. De exemplu lipazele

sunt enzime active în solvenți organici. Marea parte a enzimelor preferă mediul apos

(celular) și din acest motiv sunt instabile și se denaturează în solvenți organici. Din acest

motiv soluțiile apoase (tampon) sunt folosite exclusiv în determinările de activitate

enzimatică. Oricum, în unele situații, prezența solvenților organici nu poate fi evitată. O

serie de substrate enzimatice și metaboliți sunt insolubili în apă, în special la concentrații

ridicate și din acest motiv trebuie dizolvate sub forma unor soluții stoc în solvenți mai

puțin polari (etanol, acetonă, tetrahidrofuran sau DMSO). Cantități mici din aceste soluții

de natură organică pot fi adăugate la soluțiile apoase folosite la determinările de

activitate, iar enzima poate tolera aceste concentrații moderate (de remarcat faptul că se

vor utiliza solvenți organici care sunt miscibili cu apa). Uneori, solvenții organici

(etanolul) sunt folosiți drept agenți antimicrobieni sau pentru a micșora temperatura de

înghețare.

Tăria ionică potrivită pentru măsurarea activității enzimatice este dictată de

molaritatea soluției tampon utilizate. Cel mai frecvent se folosește o soluție tampon cu o

concentrație de 0,1 M, valoare care reprezintă o tărie ionică mică comparativ cu aceea

întâlnită în celulă. O tărie ionică ridicată (1 M) poate conduce la inactivarea enzimei, cu

unele excepții (enzimele provenite din organismele termofile și halofile). Natura ionilor

din soluția tampon poate fi un factor determinant pentru inactivarea sau destabilizarea

enzimelor. Soluțiile tampon având în componență substanțe de natura organică pot fi mai

stabile, dar în majoritatea cazurilor trebuie căutat tamponul potrivit pentru fiecare

enzima. De exemplu, în cazul folosirii fosfatului de potasiu trebuie să se știe faptul că

tamponul are capacitate de legare pentru o serie de cationi divalenți. Tris (2-Amino-2-

(hidroximetil)-propan-1,3-diolul), un alt compus folosit la prepararea soluțiilor tampon,

Enzimologie – Curs 3

3

poate uneori dezactiva enzimele. Alături de compatibilitatea tampon-enzimă trebuie să se

considere și capacitatea de tamponare optimă (între 1-2 unități de pH) a acestui compus.

Influența temperaturii

Ca și în cazul pH-ului nu se poate postula o temperatură ideală pentru toate

reacțiile catalizate de enzime. De obicei, pentru o enzimă se va măsura activitatea la

diferite valori ale temperaturii, menținând pH-ul constant (și în domeniul optim). De fapt,

în acest caz intervin două procese. Odată cu creșterea temperaturii, viteza mișcării

moleculelor (vitezei de reacție) crește cu un factor de 2-3 la fiecare creștere a temperaturii

cu 10 grade. În schimb, odată cu creșterea temperaturii apare tendința enzimelor de a se

denatura și implicit a se dezactiva. Procesul de denaturare a enzimelor depinde de doi

factori: temperatură și timp. La temperaturi înalte are loc o inactivare rapidă, însă și la

temperaturi moderate poate avea loc o inactivare mai lentă. De exemplu, alcool

dehidrogenaza poate fi inactivată și la o temperatură de 37 ºC. Din acest motiv activitatea

poate fi influențată de timpul scurs până la măsurarea activității. În majoritatea cazurilor

se va încerca scurtarea timpului de procesare a unui extract enzimatic în scopul păstrării

activității. În general se utilizează 3 temperaturi (25, 30 și 37 ºC).

Comparativ cu catalizatorii chimici enzimele asistă/catalizează reacțiile

biochimice în condiții fiziologice de temperatură. Modificarea temperaturii medului de

incubare afectează viteza reacțiilor enzimatice prin modificarea stabilității enzimei,

afinității acesteia pentru substrat sau față de alți compuși care influențează viteza

reacțiilor enzimatice.

Cofactorii enzimatici

Cofactorii metalici

Studiile cristalografice au dovedit faptul că enzimele sunt proteine cu lanțuri de

100-2500 de aminoacizi. Enzime ca chimiotripsina sau triozfosfat izomeraza (enzima

care catalizează interconversia compușilor difosforilați cu 3 atomi de carbon) sunt active

fără a avea nevoie de alți compuși/ioni. În general, pentru o activitate corespunzătoare,

enzimele au nevoie de o componentă neproteică (cofactor). Un grup de cofactori sunt

ionii metalici. În cele mai multe cazuri ionii metalici stabilizează conformația enzimei în

forma catalitic activă. Un exemplu îl constituie fosforilaza, enzima care catalizează prima

etapa de clivare a glicogenului din mușchii scheletici. Aceasta enzimă permite degradarea

rezervelor de carbohidrați. Contracția mușchilor scheletici este o consecință a expulzării

Ca2+ din reticulul sarcoplasmatic fapt care duce la activarea fosforilazei (poate fi dictată

și de hormoni-adrenalina) și implicit la producerea ATP-ului.

Carboxipeptidazele, enzime care catalizează scindarea legăturii peptidice la

capătul C-terminal al substratului, necesită ioni de zinc pentru activitatea catalitică.

Îndepărtarea zincului (prin complexare cu EDTA) poate avea drept consecință inactivarea

enzimei. Activitatea poate fi redobândită la adăugarea ionilor de zinc. Aldolaza si

anhidraza carbonică necesită de asemenea ioni de zinc pentru o activitate catalitică

corespunzătoare. Kinazele, enzime care transferă o grupare -fosforil de la ATP la o

moleculă acceptor, necesită ionii de magneziu care se leagă, în acest caz, de substrat

(ATP) și nu de enzimă (Figura 1, Pagina 3).

Enzimologie – Curs 3

4

Figura 1. Fosforilarea glucozei de către hexokinază.

Enzima necesită ATP și ioni de magneziu

Nucleaza din stafilococi, enzimă care hidrolizează ADN-ul si ARN-ul, leagă Ca2+ un ion

esențial pentru reacția enzimatică. Și ureaza conține ioni de nichel (Figura 2), fapt care a

fost dovedit la 50 de ani de la cristalizare.

Necesitatea prezenței acestor cofactori explică de ce

organismele au nevoie de cantități mici din aceste

molecule (ioni) în dieta lor. Natura metalo-enzimelor

poate explica uneori efectele toxice ale metalelor grele

asupra unor plante/organisme. De exemplu, ionii de

Cd2+ și Hg2+ poate înlocui ionul de Zn2+ din situsul

catalitic al aceleiași enzime (din ARN polimeraza)

determinând pierderea activității acesteia.

Figura 2. Centru catalitic al ureazei

Există și alte exemple în care ionii metalici sunt indispensabili enzimelor (Tabelul 2).

Tabel 2. Exemple de ioni metalici necesari unor enzime

Cofactorii organici

A doua clasă de cofactori este reprezentată de cofactorii organici (marea partea

sunt derivați din clasa vitaminelor B) ce interacționează slab cu apoenzimele. Între cele

Metalul Enzima

Na

K

Mg

Fe

Zn

Mo

Cu

Ni

-D-glucohidrolaza din intestin

Piruvat kinaza

Hexokinaza, Piruvat-kinaza, Adenozintrifosfataza

Catalaza, Peroxidaza, Nitrogenaza

Alcooldehidrogenaza, Carboxipeptidaza

Xantinoxidaza, Nitrogenaza

Citocrom c oxidaza, Amin-oxidaza

Ureaza

MgADP-

Enzimologie – Curs 3

5

două componente se formează legături slabe de tipul punților de hidrogen sau

interacțiunilor hidrofobe.

Cofactorii strâns legați (prin legături covalente, dimetilglicin dehidrogenaza –

DMGDH și sarcozin dehidrogenaza – SARDH conțin FAD care este covalent legat în

poziția 8 la un rest de histidină al acestor enzime) poartă denumirea de grupări prostetice.

O enzimă care conține un cofactor sau o grupare prostetică poartă numele de holoenzimă,

iar una în care cofactorul este îndepărtat apoenzimă (Figura 3). Dacă din holoenzimă este

îndepărtat cofactorul dispare activitatea catalitică. Moleculele mici sau speciile care se

leagă reversibil la o enzimă se numesc liganzi (acest termen general poate include

substratul, compuși analogi cu structura asemănătoare substratului, inhibitorul sau

ionul/ionii metalici).

Figura 3. Prezența cofactorului este definitorie pentru activitatea enzimatică

Așadar, cofactorii se pot lega necovalent sau covalent de apoenzime. De exemplu,

FAD-ul este o grupare prostetică pentru lipoamid-dehidrogenaza și coenzimă pentru D-

amino-acid-oxidaza (DAAO).

Din punct de vedere structural coenzimele se împart în 4 clase:

- coenzime de natură alifatică;

- coenzime de natură aromatică;

- coenzime cu structura nucleozidică;

- coenzime cu structura nucleotidică.

Principalele coenzime de natură alifatică sunt glutationul, acidul lipoic și acidul

ascorbic.

O enzimă dependentă de glutation este glutation-homocistin-transdehidrogenaza

și permite formarea punților disulfidice prin conversia cisteinei la cistină. Glutationul

redus (G-SH) poate fi oxidat reversibil sub acțiunea glutation-reductazei.

Decarboxilarea oxidativă a acidului piruvic din țesuturile animale este realizată cu

ajutorul unui complex enzimatic. Una dintre enzime este dihidrolipo-transacetilaza care

conține amida acidului lipoic drept cofactor.

Conversia DOP-aminei la noradrenalină este catalizată de DOP-amin-hidroxilaza

care necesită acid ascorbic, O2 și ioni de cupru. Tirozina poate fi metabolizată la acid

homogentizinic care se elimină pe cale renală. Ultima etapă a acestei secvențe metabolice

este catalizată de o enzima specifică care este dependentă de ascorbat.

Majoritatea carboxilazelor, enzime implicate în procesul de încorporare a CO2,

necesită biotină, care este atașată printr-o legătură de tip amidic de enzimă (între gruparea

–COOH a biotinei și o grupare -amino din catena laterală a unei lizine din secvența

polipeptidică). Propionil-CoA-carboxilaza, o enzimă care este dependentă de biotină,

catalizează transformarea propionil-CoA în metil-malonil-CoA. Tiamin difosfatul joacă

rol de coenzimă pentru transcetolaza, enzima care intervine în metabolismul glucidic

(catalizeză transferul unui fragment de doi atomi de carbon din molecula fructozo-6-

fosfatului pe scheletul hidrocarbonat al glicerinaldehid-3-fosfatului). În cazul

aminotransferazelor, enzime implicate în interconversia oxo-acizilor și aminoacizilor,

piridoxal fosfatul este legat de enzimă sub forma unei baze Schiff.

Enzimologie – Curs 3

6

Decarboxilarea aminoacizilor, reacție din care rezultă aminele, se realizează cu

ajutorul unor enzime specifice care sunt dependente de piridoxal fosfat. Histidin-

decarboxilaza este o enzimă care convertește histidina la histamina, substanță cu

proprietăți vasopresoare și care reglează secreția de HCl din stomac prin stoparea

secreției de gastrina. Ornitin-decarboxilaza catalizează reacția de decarboxilare a

ornitinei cu formare de putresceină (precusorul poliamidelor spermidină și spermină

esențiale pentru reglarea celulară și pentru interacțiunile dintre acizii nucleici). Serin-

dezaminaza și serin-hidroximetil-transferaza, enzime care convertesc serina la piruvat,

respectiv glicocol, au piridoxalfosfatul (Figura 4) în calitate de cofactor.

Pteroenzimele folosesc drept cofactor acidul tetrahidrofolic pentru transferarea

grupărilor formil, hidroximetil.

Nucleozid-fosfații îndeplinesc rol de cofactori în reacțiile de transfosforilare,

enzimele ce catalizează aceste procese fiind denumite kinaze. Nucleozid-fosfații conțin în

moleculă atât baze purinice cât și pirimidinice.

Piridoxal-fosfatul biotina

Acidul lipoic

Tiamin difosfat

Figura 4. Structurile chimice ale unor cofactori prezenți în enzime

Unii cofactori sunt atașati tranzitoriu la diverse enzime și astfel joacă rol de cosubstrat.

Nicotin adenin dinucleotidul (NAD+, Figura 5 ) și nicotin adenin dinucleotid fosfatul

(NADP+) sunt exemple de cosubstrate. De exemplu, NAD+ este un agent de oxidare în

reacția catalizată de alcool dehidrogenaza (ADH):

Figura 5. Reacție enzimatică asistată de alcool dehidrogenaza (ADH)

Enzimologie – Curs 3

7

c =A

l ·

Activitatea enzimatica =modificari

timp=

c

min=

A

min · l ·

Activitatea pe litru serVolumul total din cuva

Volumul de enzima=

A

min · l · ·

1.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

Pentru măsurarea activității enzimatice a unor enzime din ser sau extracte de

origine animală, vegetală sau microbiană trebuie să se țină cont și de reacția chimică

mediată de aceste proteine. Viteza de reacție este o măsură a reacției enzimatice. Pentru

fiecare test enzimatic este necesar un control riguros al unor anumiți parametri (pH,

temperatură, presiune, prezența unor ioni metalici - Ca2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ sau a unor

compuși tiolici respectiv a unei concentrații optime de substrat), care sunt specifici pentru

fiecare enzimă. Majoritatea testelor enzimatice se efectuează la concentrații ale

substratului care să permită “saturarea” enzimei (de obicei această concentrație trebuie să

fie de 10-20 de ori mai mare decât constanta Michaelis). Viteza maximă, vmax, este un alt

parametru enzimatic. Unitatea de măsură pentru activitatea enzimatică este U. 1U este

cantitatea de enzimă care în condiții optime experimentale transformă 1 mol de substrat

pe minut. Pentru enzimele din ser activitatea enzimatică este exprimată în U/L. O altă

unitate de măsură pentru activitatea enzimatică este katalul. 1Katal (Kat) reprezintă

activitatea catalitică echivalentă cu transformarea unui mol de substrat pe secundă.

1U/L = 16.67 nKat/L (nKat = 10-9 mol/s)

Determinarea activității catalitice se face cu ajutorul unui test optic. Modificarea

concentrației substratului în decursul reacției enzimatice poate fi monitorizată pe baza

modificării absorbanței (turbidității, fluorescenței sau a altui parametru). Prin intermediul

legii Lambert-Beer poate fi calculată concentrația:

unde: A - absorbanța;

- coeficient molar de extincție;

l – lungimea cuvei;

c – concentrația.

În diagnoza clinică activitatea enzimatică din ser se exprimă în U/L și se

calculează astfel:

Pentru calcularea activității enzimatice este necesară cunoașterea volumului cuvei

respectiv al probei și lungimea de undă la care absoarbe un compus (format sau consumat

în decursul reacției enzimatice). Dat fiind faptul că volumul cuvei este 1 mL expresia de

sus trebuie înmulțită cu factorul 1000.

Adesea activitatea enzimatică se poate exprima și în µmol min-1 L-1.

În comparație cu metodele bazate pe absorbție (inclusiv turbidimetrice)

determinările fluorimetrice prezintă o sensibilitate crescută (cu circa două ordine de

magnitudine), dar aceste metode sunt mult mai delicate (datorită posibilelor interferențe;

necesită reactivi cu puritate deosebită). Limitarea metodelor fluorimetrice este dată în

Enzimologie – Curs 3

8

special de numărul relativ mic de compuși mici (fluorofori) care prezintă fenomenul de

emisie. În conformitate cu teoria, în momentul în care o moleculă absoarbe fotoni, unul

dintre electronii acesteia trece pe un nivel energetic superior (stare excitată). La revenirea

în starea fundamentală molecula emite lumină. Datorită pierderilor de energie, lumina

emisă are întotdeauna lungimea de undă mai mare decât aceea a luminii excitate.

Dintre compușii naturali și metaboliți doar câțiva (flavinele, triptofanul-respectiv

proteinele în care este prezent acest aminoacid) prezintă emisie detectabilă. Acizii

nucleici, nucleozidele, nucleotidele (AMP, ATP) sau NAD(P) nu prezintă emisie, dar

formele cofactorilor reduși (NAD(P)H) emit lumina. Din acest motiv unele teste

enzimatice pentru dehidrogenaze pot fi efectuate pe baza acestor proprietăți. Alături de

compușii menționați, un număr restrâns de metaboliți (acidul antranilic, acizii biliari sau

proteina fluorescentă) prezintă emisie semnificativă. Pentru a utiliza această metodă

pentru o serie mai largă de aplicații se folosesc cromofori artificiali (derivați de

fluoresceină, rezorufină sau cumarină).

O particularitate a fluorescenței este aceea că intensitatea și maximul picului de

emisie al unei molecule depinde de polaritatea mediului în care aceasta se află. Astfel,

după legarea covalentă sau necovalentă a altor componente (de exemplu substrat) sau a

enzimei, spectrele de fluorescență pot avea profile diferite. Un exemplu îl constituie

umbeliferona (7-hidroxi-cumarina) care prin atașarea la lipide sau carbohidrați (cu rol de

substrat, Figura 6) poate fi utilizată la determinări enzimatice în care scindarea

substratului poate fi vizualizată fluorimetric prin eliberearea produsului de reacție

rezultat. De asemenea, măsurătorile fluorimetrice pot servi la studiul modificării

conformaționale a enzimelor după legarea substratului (ligandului).

Figura 6. Reacție enzimatică utilizată pentru măsurarea activității β-galactozidazei

Enzima asistă scindarea lactozei (dizaharid) la glucoză și galactoză