1

Universitatea ``Vasile Alecsandri``BacauFacultatea de InginerieSpecializarea Inginerie Biochimica

PROIECT LA DISCIPLINA:,,BIOREACTOARE’’

Student: Coordonator: Pascu Alina

Prof.dr.ing. Nistor Ileana-Denisa Grupa 1141 A Prep.drd.ing. Muntianu Gabriela

2010

2

TEMA PROIECTLUI:„PROIECTAREA UNUI BIOREACTOR UTILIZAT LA OBŢINEREA PREPARATELOR ENZIMATICE

DESTINATE MATURĂRII BRÂNZETURILOR”

3

Cuprins

TEMA DE PROIECTARE.................................................................pag. 2

INTRODUCERE.................................................................................pag. 4

Capitolul 1. Elemente de inginerie tehnologică.....................................pag. 6

1.1. Caracteristicile materiilor prime şi auxiliare..........................................pag. 6

1.1.2. Tipuri de bacterii starter...............................................................................pag. 10

1.1.2. Aspergillus Niger.........................................................................................pag. 12

1.2. Caracteristicile produselor finite.............................................................pag. 14

1.2.1.Generalităţi despre produsele finite...............................................................pag. 14

1.2.2.Preparate enzimatice folosite la maturarea brânzeturilor..............................pag. 17

1.2.3. Acţiunea principalelor proteinaze în timpul maturării brânzei......................pag. 181.2.4.Alte enzime din lapte......................................................................................pag. 201.2.5 Maturarea brânzeturilor..................................................................................pag. 231.2.6.Condiţii de maturare a brânzeturilor şi tratarea acestora în timpul maturării..pag 251.2.7. Accelerarea maturării brânzeturilor...............................................................pag. 261.2.8. Enzime incapsulate........................................................................................pag. 261.3. Variante tehnologice de obţinere a produsului finit...................................pag. 281.4. Descrierea etapelor tehnologice....................................................................pag. 31

Capitolul 2. Bilanţul de materiale..........................................................pag. 35Capitolul 4. Bilanţul termic....................................................................pag. 38Capitolul 4. Alegerea şi dimensionarea bioreactorului........................pag. 40

4.1. Utilajul principal-descriere..............................................................................pag. 404.2. Dimensionarea bioreactorului.........................................................................pag. 43

Concluzii......................................................................................pag. 45Bibliografie..................................................................................pag. 46

4

Introducere

Enzimele reprezintă catalizatori organici de natură proteică cu structură

macromoleculară, elaborate de celula vie. Ele manifestă acţiune strict specifică şi au rol

primordial în metabolismul celular. Specificitatea enzimelor este determinată de structura

centrilor activi formaţi de anumite grupe funcţionale ale aminoacizilor şi alte grupe chimice.

Cataliza enzimatică ocupă un loc important în biotehnologiile moderne. Utilizarea lor

în diferite domenii permite perfecţionarea proceselor tehnologice, a metodelor de analiză,

asigură indici superiori şi randamente crescute în industrie, agricultură, facilitând progresul

tehnic.

Abilităţile catalitice ale enzimelor mult mai sporite faţă de catalizatorii chimici,

realizarea proceselor în condiţii moderate de pH, temperatură şi presiune, precum şi

specificitatea de substrat înaltă, fără echivalent în cataliza neenzimatică au influenţat

considerabil lărgirea sferei de aplicare a preparatelor enzimatice - diverse procese

tehnologice, cercetări ştiinţifice, medicină, etc. Pe larg se utilizează astăzi enzimele în ţările

cu biotehnologii avansate - Statele Unite ale Americii, Japonia, Germania, Federaţia Rusă.

Marea majoritate a enzimelor utilizate în diferite ramuri industriale este reprezentată de

hidrolaze care sunt în marea majoritate enzime exocelulare, uşor solubile în apă. Dintre

acestea largi aplicări are grupa enzimelor proteolitice datorită rolului cheie în diversitatea

transformărilor substanţelor proteice. Se utilizează proteaze de origine animală (pepsina,

tripsina, renina - cheagul), vegetală (papaina, ficina, bromelaina) şi microbiană (proteaze

produse de bacterii şi fungi microscopici).

Potenţialul genetic bogat al micromicetelor permite obţinerea unei diversităţi

surprinzătoare de metaboliţi cu structură chimică complexă şi însuşiri biologice specifice. Prin

frecvenţa înaltă de biosinteză a enzimelor hidrolitice extracelulare se evidenţiază

5

reprezentanţii genurilor Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Rhizopus, Mucor, Alternaria,

Sclerotinia, Botrytis, Chaetomium, Trichoderma. Performanţele fungilor faţă de alte

microorganisme în calitate de producători de hidrolaze este capacitatea de a metaboliza o

gamă largă de diverse substraturi ieftine şi accesibile şi de a secreta metaboliţii în mediul de

cultură cea ce reduce preţul de cost a produsului final, simplifică procesul tehnologic.

Rolul principal al proteazelor constă în hidroliza substanţelor polipeptidice cu structura

complexă pînă la fragmente cu masa moleculară joasă, ceea ce determină gama largă de

aplicare în industria alimentară, în procesele de fabricare a prafului de supe, a brânzeturilor, a

unor produse de carne, băuturilor proteinizate, în panificaţie.

Preparatele enzimatice cu acţiune de coagulare a laptelui sunt denumite uzual „cheag

microbian”.

Lipsa tot mai accentuată a cheagului de origină animală a dus la sporirea preocupărilor

pentru a găsi modalitatea de rezolvare a situaţiei în condiţiile în care producţia de brânzeturi

are tendinţe de creştere. La scară industrială se produc cheaguri microbiene, prin biosinteză cu

diferite micete.

6

1. Elemente de inginerie tehnologica

1.1 Caracteristicile materiilor prime şi auxiliare

Culturile starter sunt definite ca acele culturi care se obţin plecând de la o cultură pură stoc şi care prin trecerea prin culturi intermediare (pasaje) devin apte de a fi folosite pentru producerea unor alimente fermentate. Culturile starter pot fi formate numai dintr-un singur microorganism sau din mai multe microorganisme.

La folosirea culturilor starter în industria alimentară trebuie să se ţină seama de următoarele caracteristici:

-sa conţină un anumit număr de microorganisme viabile/g sau ml şi un numar cât mai redus de germeni nedoriţi;

-produşii metabolici să nu prezinte pericol pentru sănătatea omului;-să nu conţină şi să nu producă antibiotice care se utilizează în scop terapeutic la om;-să aibă anumite activităti specifice: de producere a acidului lactic, de reducere a

azotului etc;-microorganismele existente în cultură să fie declarate cu numele stiinţific întreg;

Un mediu de cultură este un amestec de substanţe care asigură toate componentele necesare pentru metabolismul celulei, şi anume:- Surse de carbon;- Azot;- Substante minerale;- Factori de creştere;

Mediile se folosesc pentru izolarea, multiplicarea şi conservarea microorganismelor sau pentru obţinerea prin cultivare a produselor de biosinteză microbiană. Mediile pot fi procurate de la firme producătoare sau pot fi preparate în laborator.

Cultura microorganismelor este utilizată pentru a creşte numărul de celule care se doresc a fi studiate. Microorganismele sunt adăugate în mediul de cultură ce conţine nutrienţi pentru creştere.

Cultura este incubată una sau mai multe zile, la temperatura optimă a fiecărui microorganism. În multe cazuri microorganismele sunt crescute pe plăci cu agar. Microorganismele se multiplică formând colonii. O colonie creşte în locul în care o singură

7

celulă a fost inoculată. O colonie este ca o clonă; ea poate fi pură daca nu exista în jurul ei alte tipuri de microorganisme în colonii ce o pot contamina.

Mediile de cultură selective sunt medii definite sau complexe, cu o compoziţie chimică bine definită, care permit dezvoltarea unui număr restrâns de microorganisme sau chiar a unei specii. . Aceste medii conţin pe lângă substanţe nutritive şi inhibitori ai altor microorganisme insoţitoare din microbiota din care se face izolarea culturii care se doreşte a fi selecţionată.

Microorganismele adăugate la fabricarea brânzeturilor pot fi împartite în 2 mari grupe: microorganisme starter şi microfloră secundară. Pe lângă acestea în timpul fabricaţiei se mai pot dezvolta în brânză şi microorganisme non-starter provenite din lapte sau din contaminări în timpul prelucrării.

Microflora starter este formată cu precădere din bacterii ce produc fermentaţia lactică, proces anaerob de metabolizare a glucidelor sub acţiunea echipamentului enzimatic al microorganismelor, având ca produs principal acidul lactic.

Microorganismele din cultura secundară nu contribuie la formarea acidului lactic, dar în general joacă un rol important în timpul maturării.

Bacteriile lactice întâlnite frecvent în culturile starter sunt: Lactoccocus lactis, Streptoccocus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, utilizate fie individual, fie în combinaţii în funcţie de sortimentul de brânză.

O serie de microorganisme cunoscute sub denumirea de microfloră secundară, pot fi adăugate alături de cultura starter. Din această categorie fac parte propionobacterii, brevibacterii şi specii de mucegaiuri(Penicillium). Aceste microorganisme sunt utilizate împreună cu bacteriile lactice şi sunt specifice unui anumit sortiment de brânzeturi.

Producerea de acid lactic de către microflora starter în timpul fabricării brânzeturilor determină o reducere a Ph-ului laptelui care combinată cu un tratament termic şi amestecare promovează sinereza prin expulzarea zerului din caş, contribuind semnificativ la unul din procesele de baza ale fabricării brânzeturilor.

Maturarea brânzeturilor este un proces complex ce implica un număr de reacţii biochimice la care iau parte şi concentraţii mari de microorganisme prezente în brânza. Atât conţinutul de acid lactic cât şi procentul de transformare a lactozei în acid lactic reprezintă doi indicatori foarte importanţi pentru evaluarea calităţii brânzeturilor. În timpul maturării, culturile de bacterii suferă procesul de autoliză, eliberând enzime intracelulare în reţeaua de brânza, iar aceste enzime vor continua să acţioneze asupra componenţilor caşului, dezvoltând aroma şi producând modificările dorite de textură în timpul maturării.

Bacteriile lacticeCaractere morfologice:bacteriile lactice prezinta heterogenitate morfologică.

Principalele forme sunt derivate de la forma coccus şi se găsesc sub forma de streptococi(g. Streptococcus si Lactococcus), de diplococi(g. Leuconostoc), de tetrade( g. Pediococcus), iar numeroase bacterii lactice se prezinta sub formă de bastonaşe.

Caractere fiziologice:bacteriile lactice folosesc ca sursă de carbon şi energie pentozele,hexozele şi diglucidele. Dintre acizi, acidul malic poate fi transformat în acid lactic,iar acidul citric în acetona şi diacetil.

8

Numeroşi lactobacili au fost identificaţi în timpul maturării brânzeturilor. Lactobacilii ocupă o nişă specifică în maturarea brânzeturilor. Lactobacilii au fost izolaţi din brânzeturi şi supuşi identificării, iar cele mai raspândite sunt subspeciile găsite( Lactobacillus casei, Lb. Fermentum, Lb. Brevis).

9

Prezenţa microorganismelor heterofermentative- Lb. Fermentum, Lb.brevis a determinat defecte de textură la brânza Cheddar. Adăugarea lactobacililor heterofermentativi determină îmbunătăţirea calităţii brânzeturilor, în special prin accelerarea proceselor de maturare.

Cultura secundarăPropionibacterium- bacterii G(+), catalazo-pozitive, anaerobe/facultativ aerobe,

nesporulate.Patru specii sunt asociate cu brânza Elveţiana: Propionibacterium freundenreichii, P. Thoenii, P. Jensenii si P. Acidopropionici. Fermentarea conduce la producerea de acid propionic,acid acetic si dioxid de carbon.

Culturi starterCulturile starter contribuie la maturarea brânzeturilor,unde enzimele sunt implicate

în proteoliza şi în transformarea aminoacizilor în compuşi de aromă.Se utilizează:-culturi starter mezofile: pentru brânza Cheddar, Gouda, Edam, Brie şi Camembert;- culturi starter termofile(50-55º C)- pentru brânzeturile tratate termic, brânzeturile

cu pastă tare.Microflora non-starter

Microflora non-starter reprezintă culturi mezofile de lactococi şi pediococi, care reprezintă o parte importantă a florei microbiene în majoritatea brânzeturilor în timpul maturării. Ele nu fac parte din microflora normală starter şi de regulă cresc în bune condiţii în lapte şi nu contribuie la producerea acidului în vanele de coagulare.

Microorganismele implicate în producerea brânzei şi maturarea brânzei pot fi împărţite în două grupe majore:1) Microorganisme (placa) care se adaugă în brânză după ce au fost selectate cu atenţie2) Bacterii lactice acide non-starter (NSLAB).Primul grup poate fi subîmpărţit în două grupe:culturi starter primare şi secundare.

Bacteriile acide lactice sunt implicate în producţia de acid pe parcursul procesului de fabricaţie şi contribuie la procesul de maturare. Microorganismele secundare nu contribuie la producţia de acid şi constau în :

(a) bacterii lactice acide non-starter (NSLAB) (b) alte bacterii, drojdii şi / sau mucegaiuri.Microorganismele şi funcţia lor în producţia de brânzeturi sunt rezumate în tabelul 1.1.

10

Tabelul 2. Microorganismele din brânză şi funcţia lor

Genul sau specia Functie cea mai importantaBacterii starterLactococcus Lactis Productia de acid si de aroma in timpul

maturariiLeuconoctoc spp. Metabolismul citratuluiLactobacillus delbrueckii Productia de acid; formarea aromei in timpul

maturariiStreptococcus thermophilus Productia de acid; formarea aromei in timpul

maturariiEnterococcus spp. Formarea aromei in timpul maturariiBacterii lactice non-starterLactobacillus casei Formarea aromei in timpul maturariiPediococcus spp. Formarea aromei in timpul maturariiFlora secundaraCorynebacterium spp.Brevibacterium linensPenicillium camemberti proteolizaPenicillium roqueforti proteolizaYeasts Conversia lactatului in dioxid de C si apa

1.1.1. Tipuri de bacterii starter

Două tipuri de bacterii starter sunt utilizate în procesul de producere a brânzei: termofile cu temperaturi optime de 42 ° C şi mezofile cu temperaturi optime de 30 ° C. Criteriile de selecţie pentru tipul- 0 (un anumit tip starter) de culturi starter mezofile în brânzeturile Cheddar sunt după cum urmează :

· Productia de acid la 21 şi 30-40 ° C· Toleranta la sare· Activitatea proteinazei si peptidazei

Bacteriile starter sunt bacteriile acidului lactic (LAB) şi funcţia lor este de a produce acid în timpul procesului de fermentare, acidifierea laptelui pentru brânză la un nivel corespunzător şi de asemenea, să contribuie la proteoliza în timpul coacerii. Ele prevăd, de asemenea un mediu adecvat cu privire la potenţialul redox, pH, umiditate şi conţinutul de sare pentru a permite activitatea enzimei din chimozina (cheag) şi culturi starter să procedeze favorabil în brânză.

În afară de plasmina din lapte şi cheag, bacteriile acidului lactic(LAB) reprezintă principala sursă de enzime proteolitice (proteinaze şi peptidaze) în brânzeturi. Ele transformă cazeina în peptide mici şi aminoacizi liberi, care contribuie la aromă şi pot servi ca precursori de aromă.

11

Bacteriile starter cresc rapid în lapte pentru brânză şi caş în timpul producţiei, ajungând la 108-109 ufc g-1, dar ulterior scad la aproximativ 1% din numărul maxim în termen de o luna de maturare datorită pH-ului scăzut, epuizării de lactoză şi concentraţia înalta de sare în caş. Moartea şi liza celulelor starter sunt importante deoarece enzimele proteolitice intracelulare sunt eliberate în brânză unde degradează oligopeptidele la peptide mici şi aminoacizi. Enzimele lor sunt implicate în transformarea proteinelor în aminoacizi şi acizi graşi de la care compuşii de aroma sunt produşi .

Bacteriile starter sunt membri din genurile Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc şi Enterococcus. De asemenea, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii şi helveticus Lactobacillus sunt considerate ca bacterii starter .

Culturile starter sunt îngheţate în volume (200-1000 litri) sau congelate-uscate care pot fi apoi adăugate direct la laptele pentru brânză. Inocularea laptelui minimizează riscul de contaminare şi formatorii de aromă ce contribuie la aroma de dezvoltare sunt cunoscuţi a fi prezenţi.

Culturile secundare pot fi definite ca acelea adăugate la brânză în alte scopuri decât producţia de acid şi în esenţă, pot servi ca o sursă suplimentară de enzime.

Culturile secundare NSLAB necesită două caracteristici importante. Prima este că tulpinile trebuie să ofere un echilibru de reacţii de maturare benefice în brânză. Adjuncţii sunt selectaţi pe baza de lipsă de defecte specifice. Al doilea este că tulpinile adjuncţilor trebuie să fie competitive împotriva NSLAB accidental în brânză Cheddar şi rămâne dominant în timpul coacerii pentru a nu afecta aroma. În multe cazuri, această caracteristică este obţinută prin selectarea NSLAB izolate de bună calitate.

Studiile au arătat că lactobacilii, folosiţi ca adjuvanţi, pot afecta dezvoltarea aromei în brânză Cheddar. Cele mai multe rapoarte ale cercetătorilor consolideaza proteoliza şi imbunătatirea intensitatii aromei . Astfel, selectarea tulpinii adjuvantului este crucială, pentru că îmbunătăţirea tulpinii de Lactococcus casei produc brânza Cheddar de înaltă calitate, în timp ce alte tulpini ale acestor specii a dus la brânză cu gust amar şi defecte. De obicei, includerea de tulpini adjuncte de culturi non-starter de lactobacili îmbunătăţesc intensitatea aromei, cresc aroma şi accelerează maturarea.

Culturile secundare implicate includ bacterii lactice acide nonstarter (NSLAB), care cresc pe plan intern, în cele mai multe soiuri de brânză, bacterii (Micrococcus, Corynebacterium), bacterii acid propionice (PAB), drojdii (Debaryomyces hansenii), matriţe (Penicillum camemberti) şi lactobacili heterofermentativi(tabelul 1.1). Cele mai multe dintre culturile secundare cresc în principal pe suprafaţa brânzei. Acestea sunt fie:

(a) contaminanţi accidentali(b) în mod deliberat adăugate (drojdii).Pentru anumite brânzeturi (Emmental) se utilizează şi Propionibacterium shermanii,

care fermentează acidul lactic cu producere de acid propionic, acid acetic şi dioxid de carbon, care provoacă ``desenul`` brânzei(ochiuri mari). Pentru brânzeturile de tip Lamburger se utilizează Brevibacterium linens, care contribuie la maturarea de suprafată a brânzei şi formează colonii roşii-orange.

Sporii mucegaiului Penicillium roqueforti se utilizează la fabricarea brânzeturilor cu mucegai în pastă, iar sporii de Penicillium Camemberti se utilizează pentru maturarea de suprafată a brânzeturilor de tip Camembert, Brie etc.

Microflora variază numeric în timp. Astfel,dacă în brânza iniţiala se găsesc între10000000 si 100000000 celule formatoare de colonii/g, pe măsura ce maturarea progresează , numărul de bacterii lactice se reduce, în funcţie de brânză şi în principal în dependenţă de gradul de eliminare al lactozei, de nivelul de NaCl din brînza şi/sau gradul de autoliză al bacteriilor lactice. Activitatea bacteriilor lactice este inhibată când micelul de NaCl în apa conţinută de brânză este mai mare de 5%.

12

Cultura starter de bacterii lactice se foloseşte după o prealabilă păstrare la frig(<10ºC)de cel puţin 5-6 h, în intervalul maxim de 48h de la preparare.

1.1.2. Aspergillus niger

Este o ciupercă filamentoasă ce apartine clasei Ascomycete. Prezintă o repartiţie mondială, dezvoltându-se pe materiile organice în descompunere în sol, în compost, cereale. Prezente în micromediul uman pe plante, fructe, în aer. Sporii sunt vehiculaţi în aer şi datorită dimensiunilor mici sunt inhalaţi intraalveolar. Sunt inofensivi pentru majoritatea populaţiei, fiind eliminaţi prin apărarea specifică. Se estimează ca se găsesc între 1-20 spori/metru cub şi inhalăm între 10-30 spori/zi. Un număr mic de specii sunt capabile să se dezvolte la 37°C (temperatura corpului uman) şi provoaca boli (aspergiloza). Există numeroase forme de aspergiloză, de la alergii la infecţii generalizate grave, adesea mortale. Severitatea aspergilozei depinde de numeroşi factori, printre care sistemul imunitar al persoanei joacă rol primordial.Sunt utilizate în industria agroalimentara şi în biotehnologii pentru fermentaţie, producţia de enzime, producţia de acizi organici şi antimicrobiană.

Aspergillus este sursa de acizi organici, enzime şi fermentaţie. Folosirea microorganismelor ca principală sursă de enzime se datorează faptului că se pot obţine cantităţi mari de biomasă în timp relativ scurt şi în condiţii bine controlate, cât şi faptului că se pot realiza nivele enzimatice crescute prin intervenţii asupra mediului de cultura şi a parametrilor de bioproces sau asupra materialului genetic al microorganismului în procesele fermentative fie în sistem submers, fie pe substraturi solide.

Tulpina Aspergillus niger CNMN FD 01 pe acest mediu formează intens colonii abundente cu diametrul de 5-6 cm, sporulente, netede, miceliul aerian lipseşte, iar cel de substrat este de culoare galbenă. Conidioforii sunt numeroşi, rotunzi, cafenii cu nuanţă neagră.

Particularităţile fiziologice – biochimice.Creşte în limitele detemperatură +5... +42 oC. Limitele valorilor pH-ului pentru dezvoltarea tulpinii 7,0 - 8,0.

Sursele de carbon. Asimilează activ: zaharoza, maltoza, lactoza, arabinoza si sorbita. Nu asimilează: dulcita, D-dextroza si glucoza.

Sursele de azot. Asimilează azotul amoniacal, nitraţii şi nitriţii de azot, bulionul peptonat.

Posedă capacitatea de a sintetiza enzime extracelulare: lipaze, amilaze, proteaze. Se păstrează pe medii agarizate de malţ sau Czapec înclinate, la temperatura de +3...+5oC. Termenul de reînsemânţare – 2 luni, reproducerea se realizează pe mediul de păstrare. Temperatura de creştere +28...+30oC, durata – 12 zile.

Surse de carbonMajoritatea microorganismelor utilizate în producerea de enzime sunt chemo-

organotrofe, ceea ce înseamnă că îşî procură energia şi carbonul din substanţe de natură organică. Doar o cantitate redusă de carbon poate fi asimilată de microorganisme sub formă de CO2 acesta fiind fixat de enzimele anaplerotice, cum sunt carboxikinaza si piruvat carboxilaza.

Sursele de carbon de natura organică includ biopolimeri ( amidon, pectina, celuloza ), monoglucide de tipul hexozelor ( glucoza ) si pentozelor ( xiloza ), diglucide, triglucide, oligiglucide, alcooli, polioli, acizi organici, acizi grasi, aminoacizi, peptide si polipeptide. Toti compuşii organici obţinuţi prin biosinteză sunt substraturi potentiale, dar microorganismele, în funcţie de genul şi specia cărora aparţin, preferă să utilizeze doar anumiţi compuşi.

13

Principala sursă de carbon pentru microorganisme o reprezintă glucidele. Glucoza, fructoza, galactoza sunt foarte uşor asimilate de către microorganisme. Maltoza , zaharoza, lactoza sunt asimilate doar dacă microorganismele posedă enzime capabile să le transforme în monoglucide. Deşi glucoza este utilizată des drept unică sursa de energie şi carbon în mediile de laborator, ea rareori se găseşte libera în mediile fermentative industriale.

Surse de azotAzotul din mediile în care se cultivă microorganismele are un rol anabolic, el

participând la biosinteza proteinelor structurale, a enzimelor funcţionale şi a acizilor nucleici. Microorganismele utilizate în procesele de obţinere a enzimelor nu sunt diazotrofe, deci nu sunt capabile de a fixa azotul atmosferic, motiv pentru care necesită prezenţa în mediul de cultură surse de azot organic sau anorganic.

Surse de ioni anorganiciCirca 8% din substanţa uscată a celulelor microbiene este reprezentată de ioni

anorganici. Macronutrienţii ( N, P,S,Mg, K ) sunt necesari în cantităţi de ordinul concentraţiilor milimolare. Micronutrienţii (Na, Ca, Fe, Co, Zn, Cu, Mn ) sunt necesari în concentraţii micromolare sau chiar mai mici şi joacă roluri metabolice specifice. Caţiva ioni metalici ( Ag, As, Ba, Ce, Cd, Hg, Li, Pb ) pot fi toxici pentru microorganisme la concentraţii de circa 100 μmoli-l-1. Cele mai multe dintre mediile fermentative industriale şi apa folosită pentru diluarea lor conţine ioni anorganici în proporţii adecvate creşterii microorganismelor, încât suplimentarea acestora cu minerale nu este necesară. Mediile fermentative conţin70.....90% apă, care acţionează ca solvent pentru nutrienţii conţinuţi de medii şi furnizează elementele necesare a fi prezente în concentraţii foarte mici.

14

1.2. Caracteristicile produselor finite

1.2.1. Generalităţi despre preparatele enzimatice

Industria alimentară este în fapt o biotehnologie. Materiile prime agroalimentare sunt produse biologice şi implicit conservarea lor până la procesare sau până la consum implică controlul şi monitorizarea riguroasă a activităţii enzimelor proprii ţesuturilor vegetale şi animale, sau a activităţii enzimelor elaborate de microflora specifică.

Biotehnologia este un domeniu de o vastă interdisciplinaritate, situându-se la interferenţa dintre biologie, microbiologie, biochimie şi inginerie genetică.

Enzimele proprii ţesuturilor vegetale şi animale sunt esenţiale în transformările pe care materiile prime folosite în industria alimentară le parcurg până la produsul finit(ex: maturarea fructelor şi legumelor, germinarea seminţelor folosite ca materii prime în industria panificaţiei sau a berii, maturarea brânzeturilor şi a preparatelor din carne, maturarea vinurilor şi a băuturilor distilate aromate).

Enzimele pot avea şi un rol deteriorativ cu implicaţii în modificarea caracterelor senzoriale şi implicit cu pierderea valorii nutritive şi tehnologice a materiilor prime agroalimentare.

Alături de enzimele existente în ţesuturile vegetale şi animale netratate termic un rol important îl joacă şi microorganismele. Unele microorganisme fac parte din culturi selecţionate, se adaugă într-un mediu de cultură în mod intenţionat, iar activitatea lor este exploatată şi direcţionată către obţinerea unui produs alimentar cu valoare biologică ridicată (produse lactate acide, vin, bere, oţet, alcool etilic, brânzeturi, preparate din carne, produse farmaceutice, etc).

Altă categorie de microorganisme pot determina alterarea materiilor prime sau a produselor alimentare. Acest motiv stă la baza impunerii unor norme de igienă foarte riguroase.

În ultima perioadă, rolul biotehnologiilor a fost foarte bine conturat de tendinţe moderne aplicate sub formă de preparate enzimatice mixte ca adaosuri exogene în industria brânzeturilor, preparatelor din carne, etc. În egală măsură, şi nu mai puţin importante, în conturarea tendinţelor moderne sunt mocroorganismele. Ele se folosesc sub formă de culturi starter, singulare sau mixte, în industria laptelui, cărnii, etc.

Activitatea catalitica a enzimelor ,extrem de importantă din punct de vedere fiziologic,prezintă şi o deosebită importanţă practică. O serie de industrii care prelucrează materii prime de origine vegetală sau animală au de-a face în procesele lor tehnologice cu reacţii catalizate de enzime care sunt proprii acestor materii prime sau sunt elaborate de microorganismele ce se dezvoltă în/pe ele.

15

Alte domenii; 6

Morarit, panificatie; 5

Sucuri, vinuri; 10

Bere; 4

Amidon; 30

Distilate; 5

Produse lactate;

5Detergenti; 35

Figura 2.Ponderea utilizării preparatelor enzimatice

Pectinaze; 10

Alte enzime; 4

Glucozizomeraze;

14

Proteaze f ungice;

4

Amilaze fungice;

18

Amilaze bcteriene;

10

Proteaze

bacteriene;

35

Proteaze

de

coagulare;

5

Figura 3. Principalele tipuri de preparate enzimatice.

Reacţii enzimatice similare pot avea loc însă şi cu enzime izolate sau cu sisteme enzimatice extrase din diverse surse bogate în enzime şi introduse apoi în procesele tehnologice în scopul realizării unor transformări dorite. Aceste enzime sau sisteme enzimatice izolate din mediile în care au fost elaborate se numesc preparate enzimatice. Ele se caracterizează printr-o puritate mai mică sau mai mare în funcţie de cantitatea şi tipul compuşilor proveniţi din sursa enzimatică ce le însoţesc. Cu alte cuvinte, preparatele enzimatice pot fi mai mult sau mai puţin pure.

Preparatele enzimatice ca atare se obţin din următoarele materii prime: Ţesuturi animale: ficat, pancreas, mucoasă stomacală, inimă, rinichi;Ţesuturi vegetale: seminţe, cereale germinate şi negerminate, rădăcini, sevă, latexuri, frunze;Microorganisme: bacterii, drojdii, mucegaiuri;

Cea mai importantă sursă de enzime o constituie microorganismele deoarece:- se pot obţine în cantităţi mari(biomasa) prin cultivarea în instalaţii speciale

pe medii de cultură ieftine(tărâţă de grâu, extract de porumb, melasă, şroturi de soia sau floarea soarelui);

- ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt faţă de cel al plantelor sau animalelor;

- producţia de enzime de către microorganisme poate fi mărită prin selectare şi utilizarea de tulpini mutante, înalt performante(productive) şi prin stabilirea condiţiilor optime fizice şi chimice pentru producerea de enzime;

- preparatele enzimatice obţinute pot avea activităţi diferite, cu predominanţa unei activităţi.

Sursele de enzime de origine animală şi vegetală prezinta urmatoarele avantaje/dezavantaje:

- sunt sigure din punct de vedere al inocuităţii preparatelor enzimatice care se obţin;

- asigură obţinerea cu preponderenţă a unui anumit tip de enzimă;- sunt limitate cantitativ;- preparatele enzimatice obţinute sunt mai termosensibile;

Pentru selectarea unui microorganism care să producă enzima sau sistemul enzimatic dorit, trebuie mai intâi să se testeze dacă microorganismele luate în lucru pot să metabolizeze substanţa şi dacă printre reacţiile de metabolism se află şi reacţiile ce produc transformarea dorită a substanţei. În cazul când un microorganism îndeplineşte aceste condiţii, poate fi luat în lucru mai departe, selectarea efectuându-se după următoarele criterii:

- microorganismul să nu fie patogen;- să nu elaboreze endo-, exo-, micotoxine;- să nu posede activitate antibiotică sau potenţial alergen;- să producă cu precădere şi în cantităţi mari enzima sau complexul enzimatic

dorit; se preferă mutantele constitutive nerepresibile prin produs final;- să se dezvolte autoprotejat pe medii de cultură ieftine;- să elaboreze enzima sau enzimele intracelular sau extracelular conform

utilizării celei mai eficiente a preparatului enzimatic;- procesul de dezvoltare şi biosinteza a enzimelor să dureze cât mai puţin;- să se preteze prelucrării tehnologice uşoare a mediului de cultură după

biosinteza , încât separarea biomasei de faza lichidă să se efectueze cât mai simplu;

Preparatele enzimatice de origine microbiană trebuie să îndeplinească condiţiile:- să fie libere de microorganisme patogene( bacterii din genul Salmonella

absente în 25 g probă,coliformi maximum 30 germeni în 10 g proba ) si toxine microbiene;

- să fie lipsite de activitate antibiotică, factori alergeni sau alţi metaboliţi;- să nu fie impurificate cu metale grele (As maximum 3 mg/kg, Pb maximum

10 mg/kg) ;La producţia de preparate enzimatice de origine microbiană interesează ;- sursa de microorganism folosită, care trebuie selecţionată după anumite

criterii;- inocuitatea microorganismului producător de enzime(acesta trebuie să fie

recunoscut ca sigur din punct de vedere al inocuitaţii). Printre speciile de microorganisme ce se folosesc menţionăm Aspergillus Niger, Aspergillus oryzae,Mucor miehei, Saccharomyces cerevisiae etc.

- productivitatea sursei,care trebuie să fie maximă în condiţiile de fermentaţie industrială ;

- stabilitatea genetică, în sensul păstrării caracteristicilor iniţiale în timpul conservării şi preparării culturilor de producţie ;

În vederea obţinerii preparatelor enzimatice trebuie ales un material biologic bogat în enzime cu o înalta activitate catalitică; materialul trebuie să fie ieftin, uşor accesibil şi să se prelucreze uşor.

Numărul preparatelor enzimatice utilizate în scopuri practice a crescut în ultimul timp datorită marilor avantaje pe care le prezintă transformarea diferitelor substanţe.Enzimele se mai numesc şi biocatalizatori de natură proteică, solubili, coloidali, sensibili la acţiunea căldurii şi puternic dependenţi de condiţiile de mediu. Enzimele sunt sintetizate de celule vii.

Într-un metabolism desfăşurarea secvenţială a fiecărei etape este posibilă numai sub acţiunea biocatalizatorilor. Enzimele pot fi de natură vegetală, animală sau microbiană (fungică sau bacteriană).

1.2.2. Preparate enzimatice folosite la maturarea brânzeturilor

1. Hidrolazele

Făcând excepţie de importanţa lor fiziologică, importanţa lor tehnologică constă în:- hidroliza controlată a lipidelor din unele alimente în curs de finisare

(maturare), cum ar fi brânzeturile,salamurile crude, în care acizii graşi eliberaţi pot participa la aroma produsului respectiv, sau se vor constitui ca substraturi pentru formarea altor compuşi de aromă ;

- degradarea necontrolată a lipidelor;O serie de preparate enzimatice se folosesc, în principal, la maturarea unor brânzeturi.

Aceste preparate enzimatice pot fi:- lipaza pancreatică de vacă;- lipaza gastrică;-esterazele pregastrice;-esteraza microbiană din Mucor miehei, Penicillium caseicolum, Pseudomonas

fluorescens, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae.În ceea ce priveşte modul de acţiune al diferitelor enzime lipolitice, se menţionează

următoarele aspecte:- lipazele acţionează în principal asupra trigliceridelor , având afinitate pentru

acizii graşi cu lanţ lung din structura trigliceridelor. Lipazele, având în structura lor o parte hidrofilă şi una lipofilă, pot acţiona şi la interfaţa ulei/apa, deci asupra emulsiilor de tip U/A care se formează în tractul intestinal sau în vitro;

- esterazele acţionează în principal asupra gliceridelor care au acizi graşi cu lanţ scurt în structura lor;

2. Proteinaze şi peptidaze

Proteoliza în brânză în timpul maturării este catalizată de enzimele din:a)coagulant (chimozină, pepsină) b)proteinaze din lapte (plasmină) c) bacterii starterd) culturi non-starter,adjuvanţi accidentali

e) inocul secundar (în unele soiuri), de exemplu, Penicilium (P.) roqueforti, camemberti P., linii Brevibacterium (Br.), Lactobacillus spp. (O dezvoltare recentă în Cheddar)

f) proteinaze exogene şi / sau peptidaze sau celule bacteriene atenuate au fost investigate recent ca un mijloc de accelerare a maturării sau accentuarea aromei .

Progresele de proteoliză în cele mai multe brânzeturi maturate pot fi rezumate după cum urmează: hidroliza iniţială a cazeinei este catalizată în principal de coagulantul rezidual şi într-o măsură mai mică, de plasmină şi catepsine D, probabil şi alte celule somatice proteinaze. Acestea rezultă în formarea de peptidaze mari şi mijlocii, care sunt ulterior degradate de coagulante şi de enzimele din culturile starter si non-starter. Peptidele mici şi aminoacizii liberi sunt produse de acţiunea de proteinaze bacteriene şi peptidaze.

Proteoliza este evenimentul cel mai important şi cel mai complex . Proteoliza este foarte importantă pentru textura brânzei prin hidrolizarea para-cazeinei matrice care dă brânzei structura sa. O corelaţie înaltă există între intensitatea aromei brânzei Cheddar şi concentraţia de aminoacizi liberi. Datorită caracteristicilor, cum ar fi înalta activitate proteolitică şi lipolitică, unele specii de drojdii joacă un rol important în formarea de precursori de aromă, cum ar fi aminoacizi, acizi graşi şi esteri.

Aminoacizii principali în brânză Cheddar sunt glicina,leucina,serina, arginina,metionina. Aminoacizii contribuie direct la aroma brânzei cum unii aminoacizi au gust dulce (de exemplu, glicina,serina,metionina,alanina), acru (de exemplu, aspartanul), sau amar (de exemplu, valina,leucina) .

1.2.3. Acţiunea principalelor proteinaze în timpul maturării brânzei

Rata, amploarea şi natura proteolizei în timpul maturării brânzei, precum şi cantitatea şi natura produselor de degradare, variază în funcţie de enzimele implicate, tipul de brânză, precum şi condiţiile mediului de maturare. Proteoliza primară în brânză poate fi definită ca degradarea individuală a diferitelor proteine care constituie matricea brânzei, ce reprezinta schimbările β-, γ-, α-cazeinelor în peptide şi alte trupe minore care pot fi detectate de electroforeze de poliacrilamidă.

Chimozina / CheagChimozina a fost folosită ca enzima coagulantă a laptelui pentru producţia industrială

de brânză. Chimozina, enzima principală folosită la coagularea laptelui, hidrolizează iniţial legătura Phe105-Met106 de к-NC, ceea ce duce la eliberarea de fragmente negative C- terminal(CMP), astfel iniţiază coagularea laptelui .

Coagulantul contribuie indirect la dezvoltarea de aromă a brânzei Cheddar prin producerea de peptide mari şi mijlocii care acţionează ca substraturi pentru culturile starter (şi, eventual, non starter) proteinaze şi peptidaze care produc peptide mici şi aminoacizi liberi din aceste substraturi. Aminoacizii eliberati pot contribui direct la aroma sau pot servi ca precursori de compuşi de aromă. Coagulantul poate produce, de asemenea, peptide amare.

Chimozina este cea mai stabilă la valori de pH între 5,3 şi 6,3. În condiţii acide (pH 3-4), enzima pierde activitatea rapid, probabil cauzată de auto-degradare. Solubilitatea chimozinei este afectată de pH, temperatură şi tăria ionică a soluţiei.

PlasminaPlasmina (PL) contribuie la proteoliză în timpul maturării unor soiuri de brânză, în

funcţie de temperatură şi de pH-ul de gătit în timpul maturării. Enzima este rezistentă la căldură şi supravieţuieşte tratamentelor UHT . Plasmina ar putea fi o enzimă valoroasă pentru maturarea accelerată şi dezvoltarea aromei în brânzeturi naturale. Prezenţa de plasminogen şi de plasmină în lapte are o mare influenţă asupra calităţii laptelui şi a brânzeturilor maturate.

Plasmina poate afecta în mod semnificativ proprietăţile laptelui pentru fabricarea brânzei, în special în ceea ce priveşte maturarea brânzei. De asemenea, s-a raportat că creşterea proteolizei ca urmare a activităţii plasminei în brânză are ca rezultat îmbunătăţirea aromei şi a calităţii de ansamblu.

Plasmina există în lapte şi în forme active şi inactive, ambele fiind asociate cu micele de cazeină. Activatorii plasminogenului sunt de asemenea asociaţi cu micele de cazeină din lapte. În brânzeturi maturate la mare temperatură (> 50 ° C), plasmina joacă un rol important deoarece chimozina este inactivată în aceste brânzeturi.

Figura 4. Reprezentarea schematică a sistemului enzimatic al plasminei în lapte

Proteoliza este caracteristică la cele mai multe soiuri de brânză şi este indispensabilă pentru gust bun şi dezvoltări texturale. Proteinazele utilizate în prelucrarea brânzei includ:

a plasmină, b cheag,c proteinaze (peretele celular şi / sau intracelular) de bacterii starter şi nonstarter.

Aproximativ 6% din cheagul adaugat în lapte pentru brânză rămâne în caşul după fabricaţie şi contribuie în mod semnificativ la proteoliza în timpul coacerii. Combinaţii neutre de proteinaze individuale şi peptidaze microbiene intensifică aroma brânzei şi atunci când sunt utilizate în combinaţii cu cheaguri microbiene reduc intensitatea de amărăciune cauzată de acesta din urmă. Proteazele acide în izolare provoaca amărăciune intensa. Diferite lipaze animale sau microbiene au dat aroma pronunţata brânzei, amărăciunea şi râncezirea a scăzut puternic, în timp ce lipazele în combinaţie cu proteinaze şi / sau peptidaze dau gust bun brânzei, cu un nivel scăzut de amărăciune. Într-o abordare mai echilibrată la accelerarea de maturare a brânzei folosind amestecuri de proteinaze şi peptidaze, celulele atenuate de pornire sau extracte de celule-free (CFE) sunt favorizate.

Sistemul proteolitic de bacterii de acid lactic este esenţial pentru creşterea lor în lapte şi contribuie în mod semnificativ la dezvoltarea aromei în produsele din lapte fermentat. Sistemul este compus din proteinaze proteolitice, care scindează iniţial proteina din lapte la peptide; peptidazele care despică peptidele la peptide mici şi aminoacizi, precum şi sistemul de transport responsabil pentru absorbţia celulara de peptide mici şi aminoacizi. Bacteria acidului lactic are un sistem complex proteolitic capabil de conversia cazeinei din lapte in aminoacizii liberi şi peptidele necesare pentru creşterea acestora. Aceste proteinaze includ proteinaze extracelulare, endopeptidaze, aminopeptidaze, tripeptidaze şi peptidaze specifice,

care sunt toate serin-proteaze. În afară de proteinaze lactice streptococice, multe alte proteinaze de origine nonlactostreptococica au fost raportate.

Folosirea enzimelor pentru accelerarea maturării brânzeturilor presupune costuri relativ scăzute, acţiune specifică şi posibilitatea stabilirii proprietăţilor senzoriale, dar poate prezenta dificultăţi de încorporare uniformă a enzimelor şi risc de supramaturare.

Maturarea brânzeturilor începe în vana de prelucrare, faza fermentării lactice se desfăsoară rapid în timpul pregătirii pentru coagulare si coagularea laptelui. Prin introducerea în laptele pasteurizat de culturi selecţionate de bacterii lactice se poate dirija procesul de maturare a brânzeturilor; obţinându-se produse cu caracteristici calitative constante şi uniforme, prevenind influenta variaţiilor zilnice de ordin microbiologic ale laptelui de colectare asupra calităţii brânzeturilor. Toate operaţiile ulterioare momentului obţinerii coagulului, au drept scop aducerea coagulului într-o masă compactă, asigurându-se totodată condiţii favorabile dezvoltării bacteriilor lactice specifice, care să aibă activitate enzimatică necesară transformărilor dorite a principalelor componente din brânză.

În procesul de maturare a brânzeturilor se pot distinge două faze: prima fază, reprezentată de primele 10 zile de maturare, se caracterizează printr-o modificare lentă a valorilor parametrilor, iar în a doua fază, după 10 zile de maturare în condiţiile respective, parametrii suferă modificări semnificative.

În altă ordine de idei, analizând compoziţia brânzeturilor se poate estima timpul de maturare al acestora.

1.2.4. Alte enzime din lapte

Alte enzime utilizate pentru aplicarea de produse lactate sunt:(a) proteaze pentru a reduce proprietăţile alergice ale produselor din lapte de

vacă pentru sugari(b) lipazele pentru dezvoltarea de arome lipolitice în brânzeturi de

specialitate.Proprietăţile funcţionale ale proteinelor din lapte pot fi îmbunătăţite prin proteoliza

limitată prin modificarea enzimatică a proteinelor din lapte. O cazeină acidă-solubila, fără aroma şi potrivită pentru încorporarea în băuturi şi alte alimente acide a fost elaborată de către proteoliza limitată. Antigenitatea de cazeină este distrusă de proteoliza şi hidrolizatul este potrivit pentru utilizarea în produsele alimentare de lapte pe bază de proteine pentru sugari alergici la lapte de vacă.

Proteaza alcalina(plasmina sanguina).Aparţine serin proteazelor şi prezintă o activitate enzimatică de tip tripsinic. Această

enzimă este asociată cu micele de cazeină. Are activitate maximă la 37 ºC şi la Ph= 7,5- 8,0. Proteaza alcalină are o termorezistenţă relativ ridicată. Este o enzimă de origine sanguină care ajunge din plasma sanguina , via epitelium-ul glandei mamare. Se găseşte în lapte atât sub formă activă cât şi sub formă inactivă.

Proteaza alcalină degradează preferenţial ß-cazeina .k-Cazeina este cea mai rezistentă la acţiunea proteazei alcaline. Datorită faptului că

atât plasmina cât şi plasminogenul sunt legate de cazeină şi datorită faptului că rezistă în mare măsură pasteurizării, enzima va ramâne în coagul şi va participa la maturarea brânzeturilor, acţiunea sa crescând odată cu creşterea Ph-ului brânzei.

Acest lucru este vizibil în cazul brânzei Camembert, unde acţiunea enzimei se intensifică la sfârşitul maturării, deoarece mucegaiul P. Camemberti consumă acidul lactic şi provoacă ridicarea Ph-ului la 6,5-7, când activitatea plasminei este optimă. Activitatea enzimei în brânză va fi influenţată şi de concentraţia în NaCl, temperatura de maturare şi umiditatea brânzei.

Deoarece plasmina rezistă tratamentului UHT, ea va produce un defect important în laptele concentrat sterilizat UHT, gelificarea fiind consecinţa modificării suprafeţei micelelor de cazeină, ceea ce conduce la asocierea lor în agregate cu formare de gel.

LipoproteinlipazaEste o enzimă asociată cu membrana globulelor de grăsime, ea fiind activată de

cofactori termostabili şi inhibată de un inhibitor. Lipoproteinlipaza produce râncezirea lipolitică spontană a laptelui, momentul apariţiei râncezirii fiind determinat de concentraţia laptelui în enzimă, raportul activator/inhibitor şi de factorii care promovează eliberarea enzimei din membrana globulelor de grăsime. Poate contribui la maturarea brânzeturilor în condiţiile fabricării acestora din lapte crud sau termizat(63ºC/30 sec).

EsterazeleCele din lapte de vaca au temperatura optimă de 37ºC si ph-ul optim la 8,0. Esterazele

din lapte au caracter lipofil şi au specificitate mai mare faţă de acizii cu lanţ scurt din structura trigliceridelor. Acţionează mai bine în emulsie de tipul A/U. Pot participa la maturarea brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă(P. Camemberti), daca acestea sunt obţinute din lapte crud sau termizat.

Proteaza acidaCea din lapte prezintă activitate maxima la ph= 3,5-4,0 si la 50ºC, şi degradeaza

preferenţial α-cazeina,comparabil cu chimozina. Enzima poate contribui la maturarea brânzeturilor, daca se foloseşte lapte nepasteurizat sau termizat.

PeptidazaÎn lapte s-a pus în evidenţă o dipeptidază care hidrolizează peptidele L-L la ph alcalin . Peptidele ce conţin D-aminoacizi nu sunt hidrolizate.Condiţiile de activitate sunt:

temperatura 45-50ºC şi ph=7,8-8,3. Enzima poate interveni la maturarea brânzeturilor cumucegai la suprafaţă, în condiţiile în care s-a folosit lapte crud sau termizat.

Fosfataza acidaSe găseşte în lapte în stare liberă şi asociată cu membrana globulelor de grăsime şi

este implicată în defosforilarea cazeinei, cauzând creşterea punctului izoelectric, cu influenţă asupra coagulării cu cheag. Enzima rezistă la pasteurizare normală. Poate conduce la desfacerea miceliilor de cazeină tocmai datorită defosforilării.Contribuie în mică masură la maturarea brânzeturilor, dacă se foloseşte lapte crud sau termizat.

Lipoliza aduce o contribuţie importantă la aromele brânzei, datorită enzimelor lipolitice din culturile starter. Aroma caracteristică piperata de brânză cu mucegai se datorează acizilor graşi cu lanţ scurt şi metil cetonelor. Cele mai multe dintre lipolize în brânza cu mucegai sunt catalizate de lipaza Penicillium roqueforti, cu o contribuţie mai mică a lipazei din lapte. Procesul NOVO pentru producţia de enzime modificate de brânză, foloseşte brânză de vârstă medie, care este emulsionata, omogenizata, pasteurizata şi după care se adaugă lipaza din R. miehei, cu sau fără proteinază şi amestecul este maturat la o temperatură înaltă pentru 1-4 zile. Amestecul este reîncălzit, rezultă o pastă care este potrivita pentru a fi inclusă în supe, sosuri sau snacks-uri. Tehnologia producţiei de enzime modificate ale brânzei a fost dezvoltată pentru a produce o gamă largă de arome caracteristice brânzei şi intensificări de aromă. Susţinerile că enzimele exogene sunt eficiente în accelerarea maturării nu a condus la utilizarea lor la scară largă, probabil din cauza costului ridicat al acestora, dificultăţi în distribuirea uniforma în caş şi posibil pericol de supra-maturare a brânzei.

Alte enzime minore având aplicaţii limitate în prelucrarea laptelui includ glucozooxidază, catalaza, superoxid dismutaza, oxidază sulfhidril, lactoperoxidază şi lisosomi. Glucozooxidaza şi catalaza sunt adesea folosite împreună în alimente selectate pentru conservare. Superoxid dismutaza este un antioxidant pentru alimente şi generează apa oxigenata, dar este mult mai eficace atunci când catalaza este prezentă. Generaţia termica

indusă de grupuri volatile de sulfhidril este considerată a fi responsabilă pentru pregatirea aromei laptelui procesat în temperatură ultraînaltă (UHT). Utilizarea de oxidază sulfhidril în condiţii aseptice poate elimina acest defect. Mecanismul natural inhibitoar în laptele crud se datorează prezenţei unor niveluri scăzute de lactoperoxidază (LP), care poate fi activat prin adăugarea externă de urme de apă oxigenată şi tiocianat. A fost raportat că potenţialul sistemului de lactoperoxidază şi activarea acestuia îmbunătăţeşte calitatea păstrarii laptelui. Laptele de vacă poate fi prevăzut cu factori de protecţie prin adaosul de lizozim, făcându-l potrivit ca un lapte pentru sugari. Lizozimul acţionează ca un conservant prin reducerea numărului de bacterii din lapte fără a afecta activitatea L. bifidus. Domeniul de aplicare a enzimelor minore la lapte şi produse lactate a fost recent revizuit.

Fabricarea brânzei şi maturarea presupune acţiunea unor enzime (de la cheag şi lapte) şi a microorganismelor selectate, atât direct, în timpul creşterii, şi indirect, prin intermediul enzimelor după moarte şi liză. Modificările microbiologice la brânză în timpul coacerii include moartea şi liza celulelor starter şi o creştere a florei adventive cum ar fi bacteriile non- starter ale acidului lactic. Textura brânzei se înmoaie în timpul maturării ca o consecinţă a hidrolizei miceliilor cazeinei în timpul proteolizei si modificări ale pH-ului (care, la rândul lor pot provoca alte modificări, cum ar fi migraţia şi precipitarea de fosfat de calciu). Modificările biochimice care au loc în timpul coacerii pot fi grupate în evenimente primare care includ metabolismul lactozei reziduale şi de lactat şi citrat, lipoliza şi proteoliza. În urma acestor evenimente primare, evenimentele biochimice secundare sunt foarte importante pentru dezvoltarea de compuşi volatili de aroma şi includ metabolismul acizilor graşi şi al aminoacizilor. Un echilibru între produsele primare şi secundare s-a dovedit a fi responsabil pentru aroma şi textura brânzei tipice (Kheadr et al 2003.,).

Brânza coagulată cu cheag este maturată pentru o perioadă cuprinsă între două săptămâni şi doi sau mai mulţi ani, de exemplu extra-maturea brânzei Cheddar, în timpul căreia şi textura şi aroma caracteristice soiului se dezvoltă. Maturarea de obicei implică modificări ale microorganismelor din brânză, inclusiv moartea şi liza celulelor starter, dezvoltarea microorganismelor non-starter accidentală şi în multe brânzeturi, creşterea microorganismelor secundare .

Maturarea brânzei Cheddar este afectată în principal de rata şi gradul de proteoliză. Enzime din mai multe surse contribuie la proteoliza şi dezvoltarea de textură şi aromă în timpul coacerii. Aceste enzime provin din lapte (în principal plasmina), coagulant (cheag), microorganisme din culturi starter şi non-starter .

În timpul maturării brânzei, trei mari evenimente biochimice primare au loc- lipoliza, glicoliză şi proteoliza, fiecare dintre acestea fiind implicată în formarea aromei. Acesta din urmă este cel mai important şi de asemenea, cel mai complex .

Glicoliza este conversia lactozei în acid lactic şi se datorează creşterii bacteriilor starter şi produsul lactat dă brânzei gustul proaspăt acid general. Acestea pot produce de asemenea, acetat de diacetil şi acetaldehidă, care sunt compuşi importanţi în formarea aromei în brânzeturi proaspete; diacetil este de asemenea, un compus de aromă important în brânzeturi dure.

Lipoliza rezultă din hidroliza grăsimei din lapte şi producţia de acizi graşi liberi şi glicerină. Acizii graşi pot fi în continuare metabolizaţi la metil cetone şi grăsimi, de asemenea, şi acţionează ca un solvent pentru multe dintre aromele compuşilor produşi în brânză .

Sursele de proteinază din brânză este laptele în sine, chimozina (cheag), bacterii lactice acide(placa), bacterii lactice acide non-starter (NSLAB) şi microorganismele secundare (micrococci, drojdii si mucegaiuri). Proteinaza laptelui este plasmina şi este semnificativă în brânză atunci când chimozina este inactivată în timpul gătirii brânzei.

Peptidele mici produse din hidroliza de cazeină pot fi defalcate în aminoacizi mai mici, peptide, amine, alcooli şi compuşi de sulf, care contribuie la formarea aromei, prin autoliza de placa care eliberează proteinaze şi peptidaze. Combinarea perfectă a acestor compusi este responsabilă pentru aroma diferită a brânzeturlor. Pentru o prezentare generală a căilor biochimice în timpul maturării brânzei se referă fig. 1.1.

Figura 5. Privire de ansamblu privind transformările biochimice în timpul maturării brânzeturilor

Preparatele enzimatice cu acţiunea de coagulare a laptelui sunt cunoscute sub denumirea de ``cheag microbian``.

Lipsa tot mai accentuată a cheagului de origină animală a dus la sporirea preocupărilor pentru a găsi modalitatea de rezolvare a situaţiei în condiţiile în care producţia de brânzeturi are tendinţe de creştere. La scară industrială se produc cheaguri microbiene, prin biosinteză cu diferite micete.

1.2.5. Maturarea brânzeturilor

Maturarea brânzeturilor este ansamblul de fenomene chimice, microbiologice şi enzimatice care asigură produsului totalitatea caracteristicilor organoleptice specifice sortimentului.

Procesul de maturare are loc în anumite condiţii de microclimat, într-un timp mai mult sau mai puţin îndelungat, în raport cu sortimentul fabricat, timp în care principalii componenţi: lactoza, substanţele proteice şi grăsimile suferă o serie de transformări. Lactoza este fermentată în acid lactic în totalitate în primele 10 zile de maturare. În continuare acidul lactic sub influenţa unor microorganisme este transformat în acid propionic, acid acetic şi dioxid de carbon, contribuind la formarea aromei şi desenului pastei. Grăsimea suferă modificari mai importante, în special în cazul brânzeturilor cu mucegai, cu formare în prima etapă de acizi graşi şi glicerină şi în faza următoare de aldehide şi cetone care asigură un gust particular acestor brânzeturi. Substanţele proteice în timpul maturării suferă o hidroliză

enzimatică cu formare de compuşi mai simpli şi usor digerabili. Gradul de transformare a substanţelor proteice este în relaţie directă cu durata maturării.

Procesul de maturare cuprinde trei faze:-prematurarea, când are loc acidifierea pastei prin transformarea lactozei în acid lactic,

o slabă degradare a cazeinei şi formarea găurilor specifice la anumite brânzeturi, prin acţiunea bacteriilor propionice;

- maturarea propriu-zisa, cunoscuta sub denumirea de ``affinage``, în care continuă transformările biochimice, dar cu o viteza mai redusă şi în care se definitivează aroma specifică brânzei respective ;

Activitatea enzimelor implicate în maturare este influenţata de: compoziţia brânzei crude, structura micelelor de cazeină şi a grăsimii, umiditatea brânzei, ph-ul brânzei, temperatura de maturare, potenţialul redox al brânzei, conţinutul de NaCl din brânza. Enzimele implicate în maturare sunt cele proteolitice şi lipolitice, cu specificaţia că, imediat după adaugarea de culturi lactice, are loc transformarea lactozei în acid lactic. Consecinţa acumulării de acid lactic este scăderea ph-ului, care trebuie să fie diferit la 24h, în funcţie de felul brânzei:

-brânzeturi cu ph=5 şi peste 5(brânzeturi cu încalzirea la temperaturi ridicate);-ph=5 şi sub 5( brânzeturi moi , Cheddar şi brânzeturile la fermentarea cărora participă

mucegaiurile).În timpul maturării brânzeturile sunt supuse unor tratamente şi îngrijirii speciale-

întoarcere,spălări cu soluţii cu 2-3% sare.Cu excepţia brânzei proaspete, caşul se maturează la diferite temperaturi şi durate de

timp până la atingerea aromei caracteristice, texturii şi profilului. Agentii de maturare ai brânzei sunt:

- bacteriile şli enzimele din lapte;- culturile lactice;- specie;- lipaze;

- mucegaiuri sau drojdii adăugate;

- contaminanţii din mediul inconjurător;Astfel, conţinutul microbiologic de caş, compoziţia biochimică a caşului, precum

şi temperatura şi umiditatea influenţează produsul final. Această etapă finală variază de la câteva săptămâni până la ani în funcţie de soiul de brânză.

Enzimele cele mai populare folosite pentru a închega laptele se numesc proteaze.Acesta funcţionează prin distrugerea unei proteine din lapte numită cazeina Kappa. O altă enzimă importanta este cheagul. Cheagul este un acid lactic, utilizat pentru a ajuta la accelerarea procesului cu proteaze, dar se găseşte în membrana de stomac a unui viţel! Ea vine în multe forme diferite derivate din animale, vegetale şi cele produse genetic! Enzima activă în cadrul cheagului este numită chimozina şi o dată adăugata în lapte, începe coagularea acestuia.

- Transformarea de cazeină, defalcată din proteaze la paracazeină sub influenţacheagului.

- Precipitarea paracazeinei în prezenţa ionilor de calciu.Toate acestea au loc din cauza temperaturilor specifice, acidiătii şi calciului, din cauza

naturii sale ionice, în lapte. Cu toate acestea, cea mai bună temperatură pentru reacţia normală a cheaguluilui este de 40 ° C, dar temperaturile mai mici sunt utilizate în mod normal în practică, în principal pentru a evita duritatea excesivă de coagulare.

Proteoliza apare în toate soiurile de brânză şi este o condiţie prealabilă pentru dezvoltare aromei caracteristice, care poate fi reglementată prin utilizarea adecvată a agenţilor

de mai sus. Maturarea brânzei este în esenţă un proces enzimatic, care poate fi accelerat prin creşterea activităţii enzimelor cheie. Acest lucru are avantajul de a iniţia mai multe acţiuni specifice pentru dezvoltarea aromei faţă de utilizarea de temperaturi ridicate care pot duce la accelerarea reacţiilor adverse nespecifice, şi în consecinţă, în afara dezvoltarea aromei. Enzimele pot fi adăugate pentru a dezvolta arome specifice în brânzeturi. Căile care duc la formarea de compuşi de aromă sunt în mare parte necunoscute, şi, prin urmare, utilizarea de enzime exogene pentru a accelera maturarea este în cea mai mare parte un proces empiric. Diferite enzime microbiene folosite pentru a accelera maturarea brânzei sunt prezentate în tabelul 2.

Enzimele proteolitice ale bacteriilor de acid lactic în produsele din lapte fermentate.

1.2.6. Condiţii de maturare a brânzeturilor şi tratarea acestora în timpul maturării.

Maturarea brânzeturilor se face în încăperi condiţionate, pe stelaje fixe sau mobile, temperatura de maturare fiind de 20-26ºC pentru brânzeturilor de format mare (maturare caldă) şi de 15-20 ºC pentru cele de format mic. Definitivarea maturării se face în încaperi cu temperatura de 10-14 ºC. În timpul maturării se păstrează o anumită umiditate relativă , care este în funcţie de tipul de brânză:

-la brânzeturile Camembert, Brie, Roquefort, pentru asigurarea dezvoltării mucegaiului sunt necesare umiditaţi relative mai mari(φ>90%);

- la celelalte tipuri de brânzeturi se recomandă la început o umiditate relativă mai mare, pentru a favoriza difuzia sării în interior, apoi o umiditate relativă mai scăzută, pentru a preveni dezvoltarea mucegaiurilor şi a mucilagiilor la suprafaţa brânzei(φ<80%);

Ventilaţia activă este necesară când se urmăreşte zvântarea brânzeturilor, mai ales după scoaterea acestora din saramură. O ventilaţie mai redusă este recomandabilă la brânzeturile cu mucegai şi pastă moale.

Tratamentele la care sunt supuse brânzeturile în cursul maturării pot fi:- tratarea suprafţtei cu sare, ştergerea uscată, răzuirea:

La brânzeturile tari:presărarea de sare pe suprafată, frecarea cu peria, spălarea cojii de saramură, răzuirea cojii când este prea groasă;

La brânzeturile moi cu mucilagii: întinderea mucilagiilor şi eventual spălarea cu saramură;

La brânzeturile cu mucegai în interior: curaţirea suprafeţei prin răzuire;

La brânzeturile semitari: spălarea cu saramură sau apă de var;-spălarea: toate brânzeturile, cu excepţia celor care se maturează cu B.linens, se spală cu

apă calduţă la anumite intervale, după care se aşează pe ``cant`` pentru uscare;-întoarcerea- este necesară pentru a împiedica deformarea, asigurând totodată o sărare şi o

maturare uniformă. La întoarcere are loc şi o schimbare de loc a brânzeturilor, cele mai maturate fiind aduse pe rafturile de jos ale stelajelor;

-parafinarea şi ambalarea în folii plastice în timpul maturării, care au drept scop reducerea pierderilor în greutate prin deshidratare în timpul maturării şi depozitării, reducerea manoperei de îngrijire şi întreţinere a brânzeturilor în timpul maturării şi depozitării acestora, creşterea conservabilităţii brânzeturilor.

Parafinarea se face, de regulă, spre sfârşitul maturării, când coaja este deja formată şiuscată.

Ambalarea în folii plastice se poate face înca de la terminarea preparării, pentru camaturarea să se facă în ambalaj.

1.2.7. Accelerarea maturării brânzeturilor

Căile de accelerare a maturării brânzeturilor constau în intensificarea reacţiilor de proteoliza,care se poate realiza pe următoarele căi:

- prin stimularea producţiei de enzime proteoilitice de către microorganismeleexistente în brânză, ceea ce se poate realiza prin temperatura de maturare. Această tehnică se aplică la brânzeturile tari şi semitari.

- Prin adaos de enzime proteolitice din diferite surse(Aspergillus oryzae,Bacillus subtilis);

Adaosul de enzime proteolitice se face prin una din următoarele metode:-soluţia de preparat enzimatic se adaugă în laptele destinat fabricării brânzeturilor

înainte de coagulare. În acest fel, repartizarea enzimei în coagul este omogenă iar durata de contact substrat-enzimă este maximă. Metoda prezintă dezavantajul că pierderea de enzimă în zer este foarte mare;

-soluţia de preparat enzimatic se poate adauga direct în coagul la formarea brânzei, în acest caz pentru a obţine o aromă comparabilă cu celălalt caz este necesară o cantitate de 9 ori mai mică de preparat enzimatic. Dezavantajul metodei este repartizarea neuniformă a preparatului enzimatic în coagul;

-soluţia de preparat enzimatic se poate introduce prin injectare în brânza deja formată. Metoda este pretabilă în cazul brânzeturilor cu pastă moale, de format mic;

-preparatul enzimatic se poate incapsula mai întâi în gelatina sau grăsimea din lapte, iar microcapsulele se distribuie în lapte înainte de coagulare.

1.2.8. Enzime incapsulate

Obiectivul producţiei de brânză a fost în primul rând conservarea de constituenţi din lapte, apoi stabililatea produsului. În timp ce stabilitatea la depozitare este în continuare importantă, ea nu mai este obiectivul principal al fabricarii brânzeturilor, o calitate inalta constantă fiind ţinta. Deoarece maturarea este scumpă, accelerarea de maturare, în special de umiditate mica, maturarea soiurilor lente este de dorit, cu condiţia ca echilibrul corect să poate fi menţinut (Fox et al.., 1996)

O perioadă de maturare este necesară pentru dezvoltarea aromei în majoritatea tipurilor de brânză şi se poate extinde până la 1-2 ani pentru unele soiuri de brânză tare.

Încercările de a scurta timpul de maturare folosind o gamă de sisteme de maturare au avut diferite grade de succes. Abordări care au fost utilizate includ adăugarea de enzime exogene sau şlamuri brânză de vaci, utilizarea de culturi starter modificate sau noi şi temperaturi ridicate de maturare.

Întrucât caracteristica aromei, gustul şi textura unei brânze este rezultatul acţiunii a numeroase enzime, utilizarea unei singure enzime pentru a accelera maturarea este de natură să perturbe echilibrul componentelor de aromă şi gust si provoacă defecte. Extractele celulare brute preparate din bacterii, drojdii sau mucegaiuri au fost studiate extensiv. Amestecuri de proteaze / peptidaze, proteaze / lipaze sau de proteaze / peptidaze / lipaze, de asemenea, au fost evaluate pentru a accelera maturarea a mai multe tipuri de brânzeturi. Toate aceste studii au fost efectuate cu ajutorul enzimelor proteolitice şi lipolitice liber adaugate laptelui pentru brânză, care poate afecta negativ gustul şi criteriile texturale ale brânzei care rezultă prin atacarea prematura a substraturilor în plus faţă de contaminarea zerului din brânză.

Utilizarea enzimelor microincapsulate a fost propusă pentru a reglementa reacţia enzimă / substrat şi, prin urmare, evita dezavantajele enzimelor libere. În 1978 disponibil doar comercial "de pe raft" proteinazele si lipazele alimentare au fost adăugate la brânză pentru a încerca să facă maturarea mai repede. Aceste enzime cu siguranţă fac brânză mai puternică, dar aroma lor a devenit dezechilibrată, cu o incidenţă ridicată de amărăciune. De asemenea, brânzeturile care conţin proteinaze aveau textura săraca, din cauza defalcării rapide şi excesive a cazeinei.

Proteinazele adăugate să spargă cazeina în brânză sunt necesare numai în cantităţi foarte mici, deoarece, la fel ca toate enzimele, ele sunt catalizatori şi o cantitate mică va converti o cantitate mare de substrat. Maturarea proteazelor, de asemenea, elimină rapid peptide solubile din cazeină. Aceste peptide sunt pierdute în zer atunci când brânza de vaci este separată, cauzând pierderi inacceptabile pentru a produce brânză. De asemenea, defalcarea timpurie a cazeinelor întrerupe ordonat structura lor, previne formarea corespunzătoare a gelului şi face brânza de vacă moale si nefuncţionala în etapele ulterioare ale acidifierii caşului, înainte de sărare şi apăsând în brânză. Adăugaţi la aceste probleme pierderea de enzime adăugate în zer şi este clar că adăugarea de proteinaze direct in lapte nu este o opţiune .

Serin proteinazele mamifere participa la procesele fiziologice, unele dintre cele mai cunoscute fiind digestia şi coagularea sângelui. Chemotripsina, subtilizina şi tripsina sunt o familie de diverse enzime care apar la animale, bacterii (cum ar fi fradiae şi Bacillus TA39Streptomyces) şi viruşi. Plasmina însuşi este o tripsină cum ar fi serin- proteinaza originară din sânge.

Enzimele microincapsulate sunt soluţia evidentă a problemei de mai sus, pentru a proteja cazeina din lapte. Opţiuni includ amidon, grăsimi sau capsule de gelatină, dar nici una dintre aceste nu are un mecanism satisfăcător de "eliberare" în brânză. Microcapsulele enzimatice separă fizic enzima din substrat în caş şi enzima este eliberată numai în caş la defalcarea capsulei în timpul maturării.

Câteva încercări au fost făcute pentru a reduce perioada de maturare prin adăugarea de enzime, dintre care unele au fost raportate să reducă la jumătate perioada de maturare normală de brânză . Adăugarea directa de enzime în lapte nu a avut succes din cauza pierderii de enzime din zer, distribuţia săracă de enzimă, randament redus şi calitatea brânzei slabă. Încorporarea de enzime incapsulate elimină problemele asociate cu adăugarea directă de enzime. Microcapsulele enzimatice separă fizic enzima din substrat în caş şi enzima este eliberată numai în timpul maturării.

1.3. Variante tehnologice de obţinere a produsului finit

Datorită utilizării proteazelor pe scară largă a crescut interesul faţă de obţinerea industrială a acestor enzime. Acest fapt a dus la cercetări în domeniu pentru obţinerea de tulpini înalt productive, pentru obţinerea acestor enzime în stare de puritate avansată şi pentru stabilirea parametrilor optimi de activitate.

O serie de proteaze sunt obţinute industrial şi comercializate ca preparate enzimatice care sunt utilizate în diferite sectoare ale industriei alimentare, farmaceutice, etc.

Figura 6. Schema tehnologică de obtinere în condţtii de laborator a preparatului enzimatic

proteic totalic total

L of zare

Făină de soia

2.5 g%

Amidon solubil

2 g %

Extract de porumb0.5 g %

KH PO2

4

0.2 M

MgSO ·4

7H O2

0.012 g %Apă

Mediul de cultură M4(mediu cu extract de porumb)

Acid/ BazăH SO /Na CO

Prehidroliza termică, T=100C, τ = 60 min.

Ajustare pH , pH optim= 5.52 4 2 3

Sterilizare, T= 135˚C, τ = 20 min.

Răcire T= 30˚C

Inocul

BIOSINTEZA ENZIMELOR PROTEOLITICECultură submersă în bioreactor cu aerare şi încălzire

T= 30-32˚C, τ = 48-60 h, pH= 5-5.5, agitare medie 600 rot/min, aerare0.8 l/l mediu/ min

Separare biomasă, Filtrare sub vid300 l/m2h

Biomasa fungică

Extract proteic total

Extract proteExtractUltrafiltrare Permeat

Separare

Cromatografie pe schimbător de ioni Proteaze neutre

Proteaze alcaline, η= 62 %

Precipitare (cu acetonă 75%)

Răcire, T= 4˚C, τ = 4 h.

Centrifugare τ 10min,8000rot/min. Supernatant

Dializă τ = 24 h

Filtrare sterilizantă(filtru G5)

i iliPreparat enzimatic proteolitic

Figura 7. Schema tehnologică de obţinere a proteazelor cu inocul de Aspergillus oryzae.

Receptie calitatica si cantitativa

Amestecare

Cultura stoc( cultura inalt activa)

Mediu de cultura

Reactivare400C Sterilizare

1300C

Apa retea

Cultura activa ( inocul sporifer sau vegetativ)

Tarate de grau, apa, extract de malt, peptona

Cultivare pe agitator ( vase Erlenmeyer)

Inocul de laborator

Cultivare in˝bioreactor˝intermediar 1

Tratament termic( sterilizare) T =1300C

Cultura starter intermediara

RacireT = 400C

Cultivare in˝bioreactor˝intermediar 2

Inoculare

Fermentare T= 300C

Cultura starter de productie

Mediu lichid de fermentatie

Centrifugare Biomasa (

10% din mediu lichidde

Lichid cultural fermentatie )

Concentrare( ultrafiltrare )

Preparat enzimatic concentrat

Figura 8. Schema tehnologică de obţinere a proteazelor cu inocul de Aspergillus oryzae.

Cheltuielile materiale destinate realizării unui mediu de cultură reprezintă o proporţie semnificativă din cheltuielile de producţie ale unui preparat enzimatic, ceea ce a făcut ca de-a lungul timpului, ingredientele unui mediu industrial să fie alese nu numai pe baza necesităţilor fiziologice ale microorganismelor ci şi pe baza preţului şi disponibilităţii lor.

Pentru a creşte şi a-şi desfăşura procesele metabolice, microorganismele au nevoie de surse de carbon, azot, săruri minerale, factori de creştere şi apă.

1.4. Descrierea etapelor tehnologice

Sterilizarea mediilor de cultură

Pentru buna desfăşurare a proceselor de obţinere a enzimelor cu ajutorul microorganismelor este esenţial să se prevină contaminarea acestora cu microorganisme străine. Pentru a distruge sau îndepărta microorganismele nedorite din mediile de cultură se practică sterilizarea acestora. De asemenea se sterilizează bioreactoarele, conductele, orificiile de intrare şi evacuare a gazelor, robineţii de luare a probelor. Sterilizarea se realizează prin autoclave sau filtrare sterilizantă. Sterilizarea este mai ieftină şi mai eficientă decât alte metode de sterilizare, de aceea este larg utilizată în industria obţinerii de preparate enzimatice, pentru distrugerea microorganismelor nedorite. În timpul sterilizării, ca urmare a temperaturii ridicate la care sunt încălzite mediile de cultura, pot să apară probleme de pierdere a biodisponibilităţii carbonului sau de apariţie de compuşi toxici sau inhibitori.

Orificiile bioreactoarelor se sterilizează prin filtrare, utilizând filtre cu ceramică poroasă, carbon granulat sau membrane sintetice sau folosind cartuşe filtrante cu membrane microporoase. Sterilizarea termică a mediilor de cultură se realizează într-un regim temperatură/timp capabil să asigure omorârea celor mai rezistente microorganisme: bacterii sporulate. Deoarece sporii bacterieni rezistă la temperaturi de 100˚C, pentru omorârea lor este necesară încălzirea mediilor de cultură la temperaturi mai ridicate ( 120.....150˚C ). Durata încălzirii depinde de temperatura de încălzire şi de nivelul de contaminare al mediului. O încălzire inutilă trebuie evitată, atât din motive economice, cât şi pentru a minimaliza degradarea termică a nutrienţilor. Se consideră acceptat un tratament termic în care proporţia de supravieţuire a microorganismelor contaminante să fie de 1 la 1000. Când întreprinderile producătoare de enzime au doar câteva bioreactoare în dotare, sterilizarea mediilor se desfăşoară direct în bioreactoare. În acest scop, se injectează abur în manta sau direct în bioreactor. Când se atinge temperatura de 100˚C, orificiul de evacuare al aburului este închis, ceea ce creează o presiune pozitivă şi permite creşterea temperaturii. După sterilizare, mediul este răcit până la temperatura dorită prin introducerea de apă rece în manta. Formarea vacuumului este evitată prin introducerea de aer steril în partea superioară a bioreactorului. În timpul răcirii, mediul este amestecat pentru a facilita transferul de căldură. Acolo unde există mai multe fermentatoare în dotare, mediul este des sterilizat separat şi apoi transferat prin conducte sterile, în bioreactoarele deja sterilizate. Aceasta procedură aduce avantaje economice apreciabile prin scurtarea perioadei de funcţionare a bioreactoarelor, utilaje a căror funcţionare este costisitoare, durata de sterilizare a unui fermentator gol fiind mai mică decât a unuia plin cu mediu.

Fermentarea pe substrat solid

Sistemul de fermentare pe substrat solid simulează fermentaţiile produse spontan în natura. Acest proces a fost intens exploatat din punct de vedere economic în ţările asiatice. În statele occidentale, existenţa sa a fost aproape complet ignorată din momentul descoperirii fermentării submerse, la începutul anilor 40. În ultimii zece ani însă, interesul pentru acest tip de fermentare a renăscut şi procesul şi-a găsit numeroase aplicaţii, care pot fi împarţite în două categorii:

Aplicaţii socio-economice, ca obţinere de compost din deşeuri, obţinerea de furaje, valorificarea subproduselor ligno-celulozice sau a celor rezultate la prelucrarea produselor alimentare de bază;

Aplicaţii cu profil economic, ca producerea de enzime, acizi organici şi alimente fermentate

Sistemul de fermentare pe substrat solid a fost preferat celui submers, datorită avantajelor sale, dintre care evidenţiem urmatoarele:

- Condiţiile de dezvoltare a microorganismelor sunt mai asemănătoare celor din habitatul lor natural, din acest motiv ele sunt mai capabile să producă anumite enzime şi metaboliţi ce sunt de obicei obţinuţi industrial prin cultivare în sistem submers.

- Foloseşte medii relativ simple. Substraturile solide acţioneaza ca sursă de carbon, azot, săruri minerale, factori de creştere şi au capacitatea de a absorbi apa, ceea ce asigură necesităţile fiziologice ale microorganismelor.

- Deoarece sporii sunt utilizaţi direct în fermentare, nu mai sunt necesare tancuri de inoculare şi nici obţinerea de inocul vegetativ. Trebuie avut însă în vedere să se asigure o concentraţie de spori de cca 105....106/g mediu.

- Necesarul de oxigen pentru creşterea microorganismelor este asigurat de oxigenul din aer şi într-o mică măsură, de oxigen dizolvat în apa asociată cu particulele solide. Fermentatoarele în sistem solid nu mai necesită existenţa unui sistem de aerare ca în cazul fermentatoarelor în sistem submers, dar pentru ca transferul de oxigen să fie mai eficient, în substrat trebuie să se asigure formarea de canale de aer. Viteza de transfer a gazelor este mult mai mare în fermentaţiile pe mediu solid decât la cele în sistem submers, datorită raportului mai mare existent între aria interfeţei solid-lichid şi volumul de lichid.

- Spaţiul necesar echipamentului de fermentaţie este mic comparativ cu randamentul procesului, deoarece se utilizează mai puţină apă şi substratul este mai concentrat.

- Produsul dorit poate fi extras din fermentator prin adăugarea directă de solvent.

- În cazul producerii de enzime, datorită concentraţiei ridicate de enzimă în faza lichidă, se realizează un grad ridicat de recuperare cu un consum mic de energie.

- Datorita umidităţii scăzute a mediului posibilitatea de contaminare cu bacterii este mai mică.

- Complexitatea echipamentelor într-un laborator, staţie pilot, fabrica nu este mai mare decât cea pentru fermentarea convecţională.

- Consumul de energie la functionarea instalatiilor este mai mic comparativ cu cel al bioreactoarelor cu agitator.

La nivel industrial, fermentarea pe substrat solid are loc în sisteme simple sau sofisticate, în funcţie de condiţiile existente la nivel mondial.

Instalaţiile folosite pentru obţinerea preparatelor enzimatice sunt similare celor utilizate la obţinerea produselor fermentate. Cele mai utilizate instalaţii sunt:

- Fermentatorul cu plăci;

- Fermentatorul cu strat fix;

- Fermentatorul tip tobă rotativă;

- Fermentatorul tip tanc cu agitare.

Pentru această fermentaţie vom folosi fermentator tip tanc cu agitare.Într-un fermentator tip tanc cu agitare există unul sau mai multe transportatoare

elicoidale, care sunt plasate vertical pentru a permite amestecarea substratului. Uneori, trasportoarele se pot deplasa prin stratul de substrat pe şine orizontale plasate deasupra tancului. O altă configuraţie de tanc cu agitare se obţine cu o tobă care nu se roteşte, în care substratul este amestecat cu ajutorul unor palete pe un ax coaxial, rotit cu ajutorul unui motor.

Producerea de enzime la nivel industrial trebuie realizată cu eficienţa cât mai mare, motiv pentru care este de dorit ca durata procesului fermentativ să fie cât mai scurtă, enzima de interes să fie obţinuta în cantitate cât mai mare, iar cheltuielile de producţie să fie cât mai reduse. În practică este necesar să se faca un compromis între aceste deziderate, pentru a reuşi să se asigure microorganismelor condiţii optime de dezvoltare.

Necesităţile nutriţionale şi de aerare ale microorganismului producător de enzimă variază pe parcursul procesului fermentativ, deoarece cantitatea de biomasă creşte în timp iar condiţiile de mediu ( concentraţie de nutrienţi, pH, temperatură) se modifică. Pentru a fi siguri că necesitţile unei culturi sunt asigurate pe toată durata procesului fermentativ, trebuie controlaţi factorii care îi influenţează dezvoltarea. Un sistem de control automat al unui bioproces conţine următoarele elemente:- instrumente de urmărire şi masurare:- instrumente de control; instrumente de operare.

După producerea enzimei de către organismul dorit, procesul de fabricare a preparatelor enzimatice continuâ cu recuperarea enzimei şi purificarea ei, apoi cu stabilirea şi sandardizarea activităţii preparatului obţional. Aceste etape permit obţinerea unui produs finit capabil să satisfacă diversitatea necesităţilor de utilizare a preparatelor enzimatice. Etapa biologică de biosinteză este urmată de o serie de operaţii, care conduc la separarea enzimelor. In cazul fermentaţiilor desfăşurate pe substrat semisolid, biomasa agentului producător de enzime se întrepătrunde cu componentele mediului, celulele fiind fixate prin adsorbţie- absorbţie de particulele solide, ceea ce împiedică separarea lor. În această situaţie, prin aplicarea unui regim blând de uscare, ce previne inactivarea enzimelor, se pot obţine preparate enzimatice brute, care conţin un echipament enzimatic complex. Când se urmăreşte separarea unor enzime localizate intracelular se realizează mai întâi dezintegrarea pereţilor celulari şi a membranelor, după care se aplică operaţiile de extracţie şi separare a enzimei de resturile celulare. Mediile lichide după fermentare pot să conţină enzime în proporţie 1...5% din substanţa uscată iniţială a mediului, nutrienţi şi metaboliţi reziduali ( 5....10% din substanţa uscată a mediului ) şi o biomasa alcătuită din totalitatea celulelor inoculate şi dezvoltate în etapa de fermentare, care poate constitui 2...10% s.u. a mediului de cultură.

Pentru separarea particulelor de dimensiuni mari se folosesc frecvent operaţiile de tipul centrifugării, filtrării, sedimentării. Alegerea uneia din aceste operaţii este condiţionată de

natura agentului producător de enzime, de dimensiunea celulelor şi creşterea vegetativă. Biomasa de mucegai se separă cel mai facil prin filtrare. Separarea celulelor producătoare de enzime de mediul nutritiv se poate realiza de la începutul fermentaţiei prin utilizarea de membrane de dializă. Aceste culturi poartă denumirea de culturi ˝de dializă˝. Ruperea pereţilor celulari şi a membranelor reprezintă primul pas pentru eliberarea enzimelor din celule. Această operaţie poate fi realizată prin metode fizice, chimice sau biochimice ( enzimatice ).

Alegerea lichidului de extracţie depinde de enzimă, de solubilitatea ei, de tipul de ţesut în care se găseşte aceasta şi de faptul că este sau nu legată de membrana celulară. Volumul de extractant folosit trebuie să fie de aproximativ trei ori mai mare decât volumul biomasei din care se realizează extracţia. Cea mai simplă metodă de obţinere a preparatelor enzimatice solide este pulverizarea şi uscarea concentratului enzimatic. Pentru a obţine un produs finit având o puritate şi o stabilitate satisfăcătoare, lichidului enzimatic trebuie să i se aplice un număr minim de tratamente, cu o pierdere minimă de activitate.

Înainte de a fi oferite spre vânzare, enzimele sunt stabilizate, standardizate şi controlate din punct de vedere al siguranţei în manipulare şi pentru cele care vor fi utilizate la obţinerea produselor alimentare, din punct de vedere al siguranţei alimentare.

Ultrafiltrarea

În multe cazuri, în special când se pregătesc de vânzare enzimele extracelulare, soluţia limpede conţinând enzima este simplu concentrată apoi i se adaugă conservanţii şi produsul rezultat este vândut ca soluţie sau ca preparat uscat. Procesul de concentrare va fi cel mai ieftin procedeu compatibil cu menţinerea activităţii enzimatice. Pentru unele enzime, se poate aplica evaporarea în filtre rotative, urmată, dacă este necesar, de uscare prin pulverizare. Cea mai populară metodă de concentrare este totuşi ultrafiltrarea( procedeu prin care apa şi moleculele cu masă moleculară redusă sunt îndepartate prin trecerea sub presiune prin membrane care reţin enzima). Ultrafiltrarea diferă de filtrarea convenţională şi de microfiltrare în ceea ce priveşte dimensiunile particulelor care sunt reţinute. Ultrafiltrarea utilizează membrane cu pori asimetrici, subţiri, susţinute de structuri rigide. Membranele cu capacitatea de reţinere a proteinelor cu masă moleculara de 1000....100000 Da sunt utilizabile la presiuni de până la 2Mpa.

Celulele de ultrafiltrare sunt cilindrice şi sunt prevăzute cu agitator magnetic pentru a combate polarizările. Membrana este fixată pe un suport la baza vasului. Acest tip de celule de ultrafiltrare nu este potrivit pentru a fi utilizat pe scară largă, dar este folositor în studii preliminare şi pentru concentrarea eluanţilor din coloanele de separare de laborator. Celulele de ultrafiltrare industriale prezintă membrane tubulare cu diametre de 1...2 cm, care sunt grupate în mănunchiuri. Aceastea nu sunt la fel de compacte ca sistemele capilare ( suprafaţa/volum de cca 25 m-1 ) şi sunt scumpe, dar mai puţin susceptibile la colmatare cu particule de dimensiuni mari. Sisteme ieftine cu canale fine sunt disponibile ( suprafaţa/volum cca 500 m-1 ) şi sunt utilizate ca membrane suprapuse în diferite moduri pentru a produce curgerea laminară a lichidului prin membrane şi pentru a minimaliza polarizările. Membranele capilare reprezintă un tip de ultrafiltrare relativ ieftin şi având popularitatea în creştere, care utilizează membrane microtubulare cu 0,2....1,1 mm având suprafaţa mare de membrană într-o unitate de volum mică ( suprafaţa/volum 1000 m-1 ). Membranele sunt de obicei montate în module pentru manipulare convenabilă. Această configuraţie a membranelor poate fi uşor marită la scară. Modelele comerciale disponibile permit ultrafiltrarea cu viteza mare, de 600 dm3 per h.

Continua îmbunătăţire a performanţelor, durabilităţii şi siguranţei membranelor a fost un adevărat cadou pentru enzimologi, încurajând larga utilizare a diferitelor configuraţii de

ultrafiltrare. Problemele de colmatare pot fi depăşite prin tratarea membranelor cu detergenţi, proteaze sau având grijă, cu acizii sau baze. Costul iniţial al membranelor este ridicat, dar membranele moderne sunt rezistente şi eficiente. Ultrafiltrarea produce pierderi foarte mici ale activităţii enzimatic

2. Bilanţul de materiale

AmestecareTărâţe de grau substante amestecateExtract de malţPeptonăApă

Tărâţe de grâu + extract de malţ + peptonă + apă = substanţa amestecatăTărâţe de grâu + extract de malţ + peptonă + apă = 1537,23100g subst. Amest....5,5g tăraţe..........2,4g extract.....1g peptona.......90g apă1537,23g subst.amest....Xg tărâţe......Yg extract.........Zg peptonă......Mg apăX = 84,53g tărâţe de grâu Y = 36,89g extract de malţ Z = 15,37 g peptonăMg = 1383,50 g apă

Substanta amestecataSterilizare Mediu steril

Pierderi 0,5%

substanta amestecata = mediu steril + pierderisubstanta amestecata = 1529,55 + 0,005 × substanta amestecata substanta amestecata ( 1 – 0,005 ) = 1529,55

substanta amestecata

Raciremediu steril mediu de cultura

pierderi 0,5%

Mediu steril = mediu de cultura + pierderi Mediu steril = 1521,91 + 0,005×mediu steril Mediu steril (1 – 0,005 ) = 1521,91

Mediu steril

Mediu de cultura Cultura starter de productie

InoculareFermentare

mediu lichid de fermentatie pierderi 1%

mediu de cultura + cultura starter de productie = mediu lichid de fermentatie + pierderi

cultura starter de productie =

mediu de cultura + 0,05×mediu de cultura = mediu de fermentatie +

mediu de cultura (1+0,05−0,01) = 1582,7933

mediu de cultura

100g mediu de cultura......5,5g tarate de grau....2,4g extract de malt......1g peptona.....90g apa1521,91663g mediu de cultura....Xg tarate.........Yg extract....................Zg peptona.......Mg apa

X

Y

Z

M

Centrifugarebiomasa

Mediu lichid de lichid culturalFermentatie pierderi 0,5%

Mediu lichid de fermentatie = biomasa + lichid cultural + pierderi

Biomasa =

Mediu de fermentatie +lich.cultural+0,005×mediu de ferm.

Mediu lichid de fermentatie (1 − – 0,005) = 1416,6

Mediu lichid de fermentatie (1 – 0,1 – 0,005) = 1416,6

pre

Mediu lichid de fermentatie

lichid cultural Concentrare preparat enzimatic concentrat

ui

lichid cultural×Xlichid cultural = preparat enzimatic concentrat×Xpreparat enzimatic concentrat

lichid cultural × 0,15 = 250 × 0,85

lichid cultural =

pierderi = 1166,6

Materiale intrate Materiale iesite

Nr.crt. Denumire U.M. Cantitate Nr.crt. Denumire U.M. Cantitate1 Lichidul

culturalkg 1416,6 1 Preparat

enzimatic concentrat

kg 250

2 Pierderi kg 1166,62 Mediul de

fermentatiekg 1582,7933 3 Biomasa kg 158,279

4 Lichid cultural

kg 1416,6

5 Pierderi kg 7,913 Mediu de

culturakg 1521,91 6 Mediu de

fermenatiekg 1582,79

Cultura starter

kg 75,27 7 Pierderi kg 15,21

4 Mediu steril

kg 1529,55 8 Mediu de cultura

kg 1521,91

9 Pierderi kg 7,645 Substanta

amestecatakg 1537,23 10 Mediu steril kg 1529,55

11 Pierderi kg 7,686 Tarate de

graukg 84,53 12 Substanta

amestecatakg 1537,23

7 Extract de malt

kg 36,89

8 Peptonakg

15,37

9 Apa kg 1383,50

Total 9183,64 Total 9190,39

3. Bilant termic

Bilanţul termic se poate întocmi în cadrul proceselor de reactivare, sterilizare, răcire si fermentare.

Reactivare

4. Alegerea şi dimensionarea bioreactorului

4.1. Utilajul principal-descrierea constructivă şi funcţională

agitare.Bioreactorul corespunzător realizării fermentaţiei este fermentatorul tip tanc cu

Un bioreactor este un dispozitiv în care un substrat de valoare mică este utilizat decelule vii sau enzime pentru a genera un produs de valoare mai mare. Bioreactoarele sunt larg folosite pentru prelucrarea produselor alimentare, fermentaţie, tratarea deşeurilor, etc.

El este un rezervor mare din oţel inoxidabil folosit pentru a creşte microorganismele producătoare în producţia industrială de enzime şi alte substanţe chimice. După ce rezervorul este sterilizat cu abur, un inocul de celule de producători este introdus într-un mediu care este menţinut de sonde, în condiţii optime de temperatură, presiune, pH şi nivelul de oxigen pentru producţia de enzime. Un agitator amestecă mediul, care este în mod constant aerat. Este esenţial ca mediul de cultură să fie steril şi să conţină cerinţele nutriţionale corespunzătoare pentru microorganisme. Când nutrienţii au fost utilizaţi produsul este separat ; în cazul în care produsul este un compus extracelular, mediul poate fi eliminat în cursul fazei de creştere a microorganismelor,dar un produs intracelular trebuie să fie recoltat atunci când creşterea culturilor lot se opreşte. Unele bioreactoare sunt proiectate pentru culturi continue.

Figura 4.1. Bioreactor tip tanc ce foloseste deflectoarele şi un agitator pentru amestecarea optimă şi reciclează biomasă

Caracteristicile definitorii ale bioreactoarelor continue este un proces de hrănire perpetuu. Un mediu de cultură care este fie steril sau cuprins din microorganisme este alimentat continuu în bioreactor pentru a menţine starea de echilibru. Desigur, produsul este, de asemenea, tras continuu din reactor. Variabilele reacţiei şi a parametrilor de control rămân coerente, stabilind o constantă de timp în interiorul reactorului.Rezultatul este productivitatea continuă şi produsul.Aceste sisteme oferă un număr de avantaje, inclusiv:

• Creşterea potenţialului pentru automatizarea procesului.• Reducerea cheltuielilor forţelor de muncă, datorită automatizării.• Mai puţin timp non-productiv cheltuit în golire, umplere şi sterilizare reactor .•Produs de calitate datorită parametrilor de funcţionare invariabili.• Riscurile de toxicitate scăzute la personal, datorită automatizării.• Reducerea stresului privind instrumentele pentru sterilizare. Dezavantajele bioreactoarelor continue:•Flexibilitate minimă, deoarece sunt posibile numai uşoare variaţii în proces

(compoziţia mediului, concentraţia de oxigen şi temperatura).•Uniformitatea materiei prime de calitate este necesară pentru a se asigura că

procesul rămâne continuu.•Investiţii şi costuri mai ridicate în control şi echipamente de automatizare şi cresc

cheltuielile pentru sterilizarea continuă a mediului.

•Risc mai mare de mutaţii celulare şi contaminare, datorită perioadei de cultivare relativ scurtă. Motor

Substrat

Figura 9. Fermentator tip tanc cu agitare

4.2. Dimensionarea bioreactorului

Din bilanţul de materiale pentru fermentare aflăm volumul de lichid din bioreactor :

V = m ρ

Vlichid = 1521,91 2424 = 0,62 m3

Vlichid = Vutil

În reactor avem reacţie de amestecare.

Vom alege coeficientul de umplere între valorile: cu = 0,7 .. 0,8. Valoarea aleasă este cu =

0,8. Volumul reactorului se calculează astfel:

Vr = Vlichid cu

Vr = 0,62 0,8

Vr = 0,77 m3

Vr = Vt

Vt – volumul total

Din volumul reactorului putem calcula cotele de gabarit ale acestuia, respectiv

diametrul (Dr) şi înălţimea reactorului (Hr), precum şi înălţimea udată de masa de reacţie.

Relaţia dintre înălţimea şi diametrul reactorului este dată de coeficientul de supleţe,

care în cazul de faţă îl vom considera egal cu 2 :

Hr/Dr = 2 H = 2·D

Vr = Dr2 · Hr /4 = Dr2 ·2 ·Dr /4 = 0,5· ·Dr3

0,77 = 0,5·3,14·Dr3

Dr = 0,49m se adoptă Dr = 0,5 m

Hr = 2 m

Având în vedere faptul că avem un coeficient de umplere de 0,8 => înălţimea

lichidului în reactor va fi :

Hl = 0,5 m.

d = Dr/3

d = 0,49/3 = 0,16m

5. Concluzii

În cadrul acestei lucrări mi-am propus să scot în evidenţă multe amănunte importante prin proiectarea unui bioreactor utilizat la obţinerea preparatelor enzimatice utilizate în maturarea brânzeturilor, dar şi calculul bilanţului de materiale şi cel termic.

Preparatele enzimatice pot fi obţinute din surse vegetale, surse animale, microbiologice. Studiile privind obţinerea proteazelor acide au demarat în anul 1960, când au fost obţinute proteaze acide, termistabile, cu specii termofile ale genului Mucor ( cu temperatura optimă de dezvoltare 55....60˚C ). Începand din 1970 au fost iniţiate studii privind obţinerea de proteaze acide cu mucegaiuri din genul Aspergillus ( A. Niger, A. Oryzae) prin cultivarea în sistem SSF pe orez sau grâu. Preparatele enzimatice obţinute sunt complexe, conţin pe lângă proteaze si amilaze, celulaze. Proteazele acide se obţin industrial prin cultivarea în sistem SSF. Deşi se poate adopta pentru biosinteză şi procedeul culturilor submerse, în acest caz randamentele de obţinere a preparatului enzimatic sunt mai scăzute. În general, condiţiile optime de biosinteză a proteazelor sunt diferite de condiţiile optime de creştere, pentru fiecare agent producător impunându-se optimizarea condiţiilor fermentative.

Materia primă folosită în obţinerea enzimelor este Aspergillus Niger. Acest gen prezintă un deosebit interes, pe de o parte datorită aplicaţiilor biotehnologice precum şi datorită faptului că unii reprezentanţi sunt cunoscuti ca patogeni. Aspergillus este sursa de acizi organici, enzime şi fermentaţie. Folosirea microorganismelor ca principala sursă de enzime se datorează faptului că se pot obţine cantităţi mari de biomasă în timp relativ scurt şi în condiţii bine controlate, cât şi faptului că se pot realiza nivele enzimatice crescute prin intervenţii asupra mediului de cultură şi a parametrilor de bioproces sau asupra materialului genetic al microorganismului în procesele fermentative fie în sistem submers, fie pe substraturi solide.

Bibliografie

1. Viorica Maria Macovi,“Calcule de operatii si utilaje pentru procesarea termică si biochimică in biotehnologie”,Editura Alma,Galati ,20012. Gabriela Bahrim, “Biotehnologia Preparatelor Enzimatice“, EdituraACADEMICA, Galati, 20023. Jurcoane, “ Tratat de biotehnologie “, vol. 1, Editura Tehnica, Bucuresti,20044. G. Zarnea, “Bioingineria preparatelor enzimatice microbiene“, EdituraTehnica, Bucuresti5. Dabija A., Rusu L.,Alexa I.C. ,”Enzimologie industriala” ,Editura AlmaMater ,Bacau,2007.