Preparate enzimatice şi culturi starter Curs nr. 1

PREPARATE ENZIMATICE ŞI CULTURI STARTER

Industria alimentară este în fapt o biotehnologie. Materiile prime agroalimentare sunt produse biologice şi implicit conservarea lor până la procesare sau până la consum implică controlul şi monitorizarea riguroasă a activităţii enzimelor proprii ţesuturilor vegetale şi animale, sau a activităţii enzimelor elaborate de microflora specifică.

Biotehnologia este un domeniu de o vastă interdisciplinaritate, situându-se la interferenţa dintre biologie, microbiologie, biochimie şi inginerie genetică.

Enzimele proprii ţesuturilor vegetale şi animale sunt esenţiale în transformările pe care materiile prime folosite în industria alimentară le parcurg până la produsul finit(ex: maturarea fructelor şi legumelor, germinarea seminţelor folosite ca materii prime în industria panificaţiei sau a berii, maturarea brânzeturilor şi a preparatelor din carne, maturarea vinurilor şi a băuturilor distilate aromate).

Enzimele pot avea şi un rol deteriorativ cu implicaţii în modificarea caracterelor senzoriale şă implicit cu pierderea valorii nutritive şi tehnologice a materiilor prime agroalimentare.

Alături de enzimele existente în ţesuturile vegetale şi animale netratate termic un rol important îl joacă şi microorganismele. Unele microorganisme fac parte din culturi selecţionate, se adaugă într-un mediu de cultură în mod intenţionat, iar activitatea lor este exploatată şi direcţionată către obţinerea unui produs alimentar cu valoare biologică ridicată (produse lactate acide, vin, bere, oţet, alcool etilic, brânzeturi, preparate din carne, produse farmaceutice, etc).

Altă categorie de microorganisme pot determina alterarea materiilor prime sau a produselor alimentare. Acest motiv stă la baza impunerii unor norme de igienă foarte riguroase.

În ultima perioadă, rolul biotehnologiilor a fost foarte bine conturat de tendinţe moderne aplicate sub formă de preparate enzimatice mixte ca adaosuri exogene în industria brânzeturilor, preparatelor din carne, etc. În egală măsură, şi nu mai puţin importante, în conturarea tendinţelor moderne sunt mocroorganismele. Ele se folosesc sub formă de culturi starter, singulare sau mixte, în industria laptelui, cărnii, etc.

PREPARATE ENZIMATICEEnzimele se mai numesc şi biocatalizatori de natură proteică, solubili, coloidali,

sensibili la acţiunea căldurii şi puternic dependenţi de condiţiile de mediu. Enzimele sunt sintetizate de celule vii.

Într-un metabolism desfăşurarea secvenţială a fiecărei etape este posibilă numai sub acţiunea biocatalizatorilor. Enzimele pot fi de natură vegetală, animală sau microbiană (fungică sau bacteriană).

1

NAD+H2OlactazăColin acetil transferaza

Preparate enzimatice şi culturi startercurs nr 2

Clasificarea enzimelor

Această clasificare a enzimelor este realizată de comisia de enzime a uniunii internaţionale de chimie pură şi aplicată(IUPAC):I. Oxido-reductazele catalizează reacţiile de oxidă reducere prin transfer de H2 sau electroni prin combinarea unui substrat de O2.

alcool etilic etanal+NADH+H+

II. Transferaze: catalizează transferul unei grupări chimice, alta decât protonul de la un substrat la altul.

Acetil-CoA+colină acetil colină+CoA

III. Hidrolaze: catalizează hidroliza legăturilor peptidice, glucozilice, a esterilor din diferite substraturi prin adiţia apei

lactoză galactoză+glucoză

Maltoză 2 glucoză

IV. Liazele : catalizează scindarea legăturilor din molecule pe alte căi decât în prezenţa apei

fructozodifosfat glicerinaldehid difosfat+fosfohidroxiacetonă

V. Izomeraze: catalizează izomerizarea optică, geometrică şi în funcţie de tipul de rearanjare moleculară racemaze, cistrans, izomeraze, etc

L-alanină D-alanină

VI. Ligaze: catalizează formarea legăturilor covalente dintre molecule cu consum energetic preluat din compuşi macroergici

glutamat’NH3 glutamină

Unităţi de măsură ale activităţii enzimaticePractic activitatea enzimatică se poate determina în trei variante:

- măsurarea cineticii de reacţie într-un anumit interval de timp- măsurarea gradului de consumare a substratului- determinarea concentraţiei produsului/produşilor de reacţieUnităţile de măsură admise în activitatea evaluării enzimatice sunt:- unitatea de de activitate enzimatică(u) reprezintă cantitatea de enzime care catalizează transformarea a 1 substrat în timp de 1min în condiţii standard (T=50C, p= valoarea optimî pentru categoria de enzime testate)- Katal- reprezintă cantitatea de enzime ce catalizează transformarea a 1 substrat în timp de 1sec în condiţii standard

2

H2O

lactază

Colin acetil transferaza

ADP’P2

Glutamin sintetază

Alanin racemaza

aldolaza

H2O

maltază

Alcool dehidrogenază

ATP

Activitatea enzimatică poate fi caracterizată prin două noţiuni:- activitatea enzimatică specifică- reprezintă numărul de unităţi enzimatice conţinute într-un proteină.-activitatea enzimatică molară- reprezintă numărul de molecule de substrat transformate de către o moleculă de enzimă în unitatea de timp

Sursa de obţinere a preparatelorI. Ţesături animale: ficat, pancreas, inimă, rinichi, creier, mucoase recoltate de la nivelul stomacului sau a intestinelorII. Ţesuturi vegetale: cereale germinate, rădăcini, seminţe, frunze, sevă(latex)III. Microorganisme: bacterii, mucegaiuri, drojdii

Microorganismele reprezină cea mai bună sursă de preparate enzimatice deoarece:-ciclul de dezvoltare(viaţă) este mult mai scurt decât în cazul plantelor sau a animalelor-se pot obţine în cantităţi mari denumite şi biomase prin cultivare în instalaţii cu un principiu constructiv simplu şi folosind medii de cultură relativ ieftine cum ar fi: tărâţe, zer, şirot de seminţe de floarea soarelui sau soia, extracte de porumb, melasă- producţia de enzime generată de microorganisme poate fi mult mai optimatizată cu folosirea unor tulpini mutante, înalt performante, obţinute în urma dorinţei de a eficientiza parametrii procesului fermantativ- preparate enzimatice obţinute, în unele cazuri, prezintă stabilităţi mai bune la temperaturi ridicate, acest avantaj vizează transferuri enzimatice care se impun ca desfăşurare la temperaturi situate la 75-900C(industria spirtului)În cazul adoptării ca sursă a microorganismelor se impun câteva condiţii : -preparatele enzimatice de origine microbiană trebuie să fie libere de toxine sau de substanţe cu efect antibiotic, prin urmare trebuie să fie produse de microorganisme nepatogene fără potenţial alergent, toxicogen, antibiotic.

3

Preparate enzimatice şi culturi startercurs nr 3

SCHEMA TEHNOLOGICĂ GENERALĂ DE OBŢINERE A

PREPARATELOR ENZIMATICE DIN DIVERSE SURSE

Avantajele prelucrării surselor de enzime de origine animală şi vegetală : sunt sigure din punct de vedere a inocuităţii şi permit obţinerea certă a enzimelor singulare (a unui singur tip de enzimă).

Dezavantaje: - vegetalele şi animalele prezintă un ciclu de viaţă lung, prin urmare obţinerea enzimelor este limitată din punct de vedere cantitativ;- preparatele enzimatice obţinute din aceste surse sunt mai termosensibile.

Tehnologia de obţinere a preparatelor enzimaticeImplică operaţiile schiţate în figură, iar tehnicile de prelucrare indicate conduc în special la trei categorii de preparate enzimatice:preparatul enzimatic brut este caracterizat de o umiditate scăzută, de o conservabilitate mai ridicată în timp; preparate enzimatice lichide concentrate – sunt amestecuri de enzime în formă apoasă ce sunt caracterizate de o conservabilitate mai scăzută; pentru obţinerea celui de-al treilea tip de preparat enzimatic se parcurge etapa de fracţionare care presupune separarea enzimelor din preparate mixte şi foarte adesea concentrarea şi/sau uscarea. Aceste preparate enzimatice sunt performante, se folosesc în etape biochimice care necesită o dozare foarte riguroasă, condiţionate de acţiunea, în cele mai multe cazuri, a unei singure enzime. În

4

Ţesuturi vegetaleŢesuturi animaleMicroorganisme(+enzime extracelulare)

Preparat enzimaticde uz industrial

Condiţionare

Standardizare

Concentrarea

Uscarea

Liza pereţilor celulari(omogenizare)

Extracţia Fracţionare

Preparate parţial purificate

Preparat enzimatic

Preparat brut

formă uscată aceste preparate au acţiune foarte precisă şi posibilitate de dozare foarte riguroasă.

În cazul preparatelor enzimatice de origine microbiană înainte de etapa de liză a pereţilor celulari atât în cazul obţinerii enzimelor intracelulare, cât şi a celor extracelulare, se impune în prealabil o cultivare avansată. Această cultivare avansată are ca obiectiv principal obţinerea unei cantităţi masive de biomasă. În acest scop se recurge la două tehnici de fermentare:- fermentaţia de suprafaţă care se bazează pe popularea unui mediu solid cu un microorganism aerob (mucegaiuri);- fermentaţia în profunzime care se realizează într-un mediu lichid, plasat într-un reactor, la care toţi parametrii de funcţionare sunt riguros monitorizaţi.

Aspecte privind obţinerea preparatelor enzimatice din sursă microbiană:Microorganismul ales în vederea cultivării şi obţinerii preparatelor enzimatice trebuie

atent selecţionat după anumite criterii. Dintre speciile preferate pentru obţinerea microorganismelor amintim: Aspergillius niger, Aspergillius orizae, Mucor miehei, Saccharomyces cerevisiae, Penicillium emersoni, Kluyveromyces lactic, Bacillus amylolichefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophillus.

Microorganismul selectat trebuie să fie recunoscut din punct de vedere al inocuităţii. La sfârşitul fermentaţiei tehnicile curente presupun inactivarea microorganismului cu păstrarea intactă a activităţii enzimatice.

Trebuie aleasă tehnica care să presupună productivitate maximă în condiţii industriale. În acest scop se preferă o tulpină care să nu modifice în foarte mare măsură vâscozitatea mediului în cursul dezvoltării celulare în aşa fel încât să se poată realiza la nivelul reactorului o omogenizare cât mai riguroasă în vederea asigurării parametrilor de cultivare în toată masa supusă fermentaţiei.

În cazul selectării unor tulpini înalt productive păstrarea în stare pură, în vederea recultivării, trebuie să se desfăşoare în condiţiile menţinerii purităţii genetice. În cazul păstrării pe perioade mai lungi a tulpinilor selecţionate se recurge la tehnici ale ingineriei genetice care să identifice eventualele mutaţii la nivel celular. În condiţii controlate se poate recurge la hibridizări în scopul ameliorării potenţialului enzimatic celular.

Preparate enzimatice şi culturi startercurs nr 4

ASPECTE BIOLOGICE ALE FERMENTAŢIEI PRINCIPALE

În cursul fermentaţiei microorganismului utilizat ca sursă se va dezvolta şi va produce enzimă, cele două procese putănd şă se desfăşoare simultan sau uneori complet diferenţiate în timp.

În acest sens se caracterizează trei situaţii:creşterea în biomasă şi producţia de enzime sunt asociate, se desfăşoară simultan.producţia de enzime începe să fie mai consistentă după o perioadă de dezvoltare a biomasei şi continuă uneori după ce biomasa a ajuns la masă constantă.există un interval de latenţă între peroiada de creştere şi perioada de elaborare a enzimei.

5

Aspecte biochimice ale fermentaţiei principale:Celulele microbiene utilizează foarte mult O2 pentru producţia de biomasă şi respectiv

de enzime (3-10 tone de O2 pentru un fermentator de 100m3), precum şi substanţe nutritive din mediu. Rezultatul acestor consumuri constă în producţia de biomasă, de CO2 şi căldură. Cantitatea de căldură elaborată este situată între 2*106 şi 6,5*106 KJ/h, iar cantitatea de metaboliţi, respectiv de enzime elaborate, este de 0,1 până la 40 g/l. Nu în puţine situaţii microorganismele elaborează enzime intracelulare care impun tehnici specifice de extracţie.

Ca materii prime pentru medii de fermentaţie se pot folosi:- sursă de C: amidon, celuloză, pulpă de sfeclă, maltodextrine, glucoză, fructoză.- sursă de N: proteine, hidrolizate proteice, extracte de drojdie.- surse minerale: săruri de Mg, Fe, Ca, P, K, Mn, Zn.

Alegerea materiei prime este deosebit de importantă pentru obţinerea unui randament maxim în cazul fermentaţiilor industriale. În mod particular pentru obţinerea enzimelor destinate îndustriei alimentare un element determinant constă uşurinţa de a controla gradul de puritate a unui lot de materii prime. În anumite situaţii se impune un pretratament termic sau enzimatic de aducere a mediului industrial la caracteristicile optime.

Procedeul nealimentar de conducere a fermentaţiei:În acest caz toate ingredientele din mediu sunt transferate în fermentator (reactor), iar

înainte de a se introduce inoculul (cltura de celule de producţie de puritate absolută) mediul se corectează din punct de vedere a valorii de pH şi se aduce la temperatura optimă de însămânţare. Pe parcursul fermentaţiei se recurge la prelevare de probe în mod steril, probe care vor indica:- evoluţia vâscozităţii mediului- creşterea cantităţii de biomasă- consumul nutrienţilor de bază din mediu (glucide, proteine)- evoluţia conţinutului de O2 de la nivelul mediului- conţinutul de enzime, respectiv activitatea enzimatică a mediului.

Prin construcţia reactorului, acesta permite ataşare de:- senzori care pot să indice valoarea pH-ului şi respectiv să o regleze prin adaos de acid sau bază;- senzori de temperatură care să comande reglarea temperaturii mediului prin reglarea debitului de circulaţie a apei reci prin mantaua sau serpentina de răcire cu care este dotat reactorul;- senzori de reglare a presiunii care să comande deschiderea unor supape de evacuare a CO2

în aşa fel încât la nivelul reactorului să se menţină o presiune situată între 1 şi 3 barri;- senzor de dozare a conţinutul de CO2 care poate să indice coeficientul de respiraţie, notat cu QR, care indică corelaţia între cantitatea de O2 asimilată şi cantitatea de CO2 dezvoltată.

1)

2)

3)

6

Procedeul alimentar de conducere a fermentaţiei:În acest procedeu se umple fermentatorul doar cu 30% din volumul util de mediu

nutritiv, apoi se introduce inoculul de producţie şi restul de mediu de fermentare. Se consideră finalizată fermentaţia după un timp stabilit experimental. Acest procedeu se aplică în cazul în care sinteza enzimelor este dependentă de concentraţii ridicate ale unuia dintre componenţii mediului sau în cazul în care creşterea microorganismelor ar putea induce şi creşterea vâscozităţii mediului. În cazul acestui procedeu alimentarea cu mediu proaspăt (70%) poate fi repetată efectuându-se în schimb evacuări programate cu condiţia ca în fermentator să rămână după fiecare evacuare 30% mediu fermentat care va constitui inoculul de producţie pentru şarje succesive.

Procedeul continuu de conducere a fermentaţiei:Acest procedeu necesită alimentarea continuă a fermentatorului cu mediu şi folosirea

unei unei culturi concentrate de microorganisme. În acest caz bioreactorul constă într-o instalaţie alcătuită din fermentator cuplat la o unitate de ultrafiltrare. Această unitate de ultrafiltrare are rolul de a recicla biomasa produsă. Tipul constructiv al unui astfel de bioreactor şi implicita opţiune de a evacua la debit constant mediul fermentat prezintă următoarele avantaje: - detoxifierea mediului de cultură prin eliminarea permanentă a metaboliţilor formaţi; - dozarea exactă a cantităţii de mediu proaspăt în funcţie de cantitatea de permeat care străbate membrana de ultrafiltrare; - celulele au posibilitatea biologică de a se multiplica până la concentraţii relativ mari (în cazul drojdiilor 300g substanţă uscată/l biomasă). Aceste concentraţii permit îndeplinirea condiţiei de “barieră biologică” la contaminări externe. - permeatul rezultat conţine enzime extracelulare, nu conţine celule şi poate fi dirijat direct către pasul următor, şi anume acela de purificare sau concentrare.

Dezavantajele acestui procedeu sunt următoarele:- membranele folosite la unitatea de ultrafiltrare trebuie să fie rezistente la tratamente de sterilizare cu aburi sub presiune şi la tratamente cu dezinfectanţi chimici.- costurile energetice ale unei astfel de instalaţii sunt destul de ridicate.- membrana de ultrafiltrare se poate colmata şi atunci funcţionarea bioreactorului este întreruptă.- chiar la densităţi mari de celule la nivelul membranei se poate produce o liză celulară, fenomen care impune necesitatea unei purjări a bioreactorului şi implicit scade vârsta medie a celulelor care rămân în sistem.

Extracţia se diferenţiază în funcţie de procedeu. În principiu după terminarea fermentaţiei se separă partea solidă, insolubilă (celule microbine şi precipitate) de partea lichidă care conţine enzimele extracelulare. Separarea se poate realiza prin centrifugare, filtrare sau ultrafiltrare, iar soluţia sterilă obţinută se supune apoi unui procedeu de concentrare. Dacă enzimele obţinute se vor comercializa în forma unor preparate lichide atunci concentratul se va stabiliza fie prin adaos de polioli (sorbitol sau glicerol), fie prin adaos de săruri (NaCl sau MgSO4). De asemenea în scopul stabilizării biologice se optează şi pentru adaosuri de bacteriostatici de origine alimentară sau folosiţi şi în alimentaţie cum ar fi benzoatul, sorbatul sau ascorbatul. În cazul în care enzimele se vor comercializa în forma unor preparate enzimatice pulbere atunci concentratele se suplimentează cu un suport de natura amidonului sau dextrinelor, se supun din nou unui tratament de filtrare sterilizantă, după care se usucă prin atomizare.

Preparate enzimatice şi culturi starter

7

Curs nr 5

Extracţia enzimelor intracelulare

Pentru a obţine şi enzime intracelulare biomasa din fermentator separată de faza lichidă este supusă lizei. Liza peretelui celular poate fi realizată fie sub acţiunea enzimelor proprii microorganismelor, fie sub acţiunea enzimelor exogene adăugate în fermentator co scopul precis de a elibera enzime intracelulare de peretele celular, sau de structurile cu rol de sinteză. În cazul în care enzima este periplasmică este suficient un şoc osmotic pentru a elibera citoplasma sau se poate recurge la tehnica unei lize mecanice ceea ce presupune ca biomasa să suporte iniţial o presiune foarte mare situată între 600- 1000 barri, presiune urmată apoi de o detentă bruscă.

Modalităţi de comercializare a preparatelor enzimatice:Preparatele enzimatice se comercializează de regulă sub formă de pulbere. Aceste

pulberi au ca bază un suport care poate fi amidon, maltodextrine, zahăr sau sare. La aceste preparate se controlează granulometria şi, respectiv umiditatea. Din punct de vedere al umidităţii pulberile trebuie să aibă o umiditate de max60%. Suportul folosit nu trebuie să fie hidroscopic, pentru a se evita formarea de cocoloaşe la momentul întrebuinţării.

În preparatele enzimatice pulbere şi în preparatele enzimatice lichide conţinutul de enzimă este raportat la suport şi, de aceea cantitatea de preparat comercial este sesizabil mai mare decât de enzimă activă.

Preparatele comerciale microgranulate se obţin din enzime extrase prin ultrafiltrare şi, în această situaţie se folosesc suporturi, cantitatea de suport fiind calculată în aşa fel încât să se ajungă la o valoare impusă care poartă denumirea de titru enzimatic. Amestecul respectiv este pulverizat împreună cu un agent de legătură numit liant, care reprezintă cam 0,1-0,5% din masa suportului. Picăturile pulverizate şi fixate pe suport sunt uscate apoi într-un tunel de aer cu o temperatură situată între 70-90oC, valoare stabilită în funcţie de termosensibilitatea enzimelor.

Preparatele comerciale lichide sunt formulate în general cu polioli (sorbitol, glicerol) care se folosesc cam în proporţie de 20-50% faţă de preparatul lichid?. Tot la preparatele comerciale lichide se recomandă folosirea unui agent cu efect bacteriostatic, în principiu se foloseşte benzoatul de Na (C7H5O2Na) în proporţie de 0,1-0,2%.

Preparate enzimatice şi culture starter

8

Curs nr. 6

PROCESE FERMENTATIVE

Procesele fermentative reprezintă secvenţele cele mai importante în cadrul biotehnologiilor. Fie că se doreşte obţinerea cantităţii de biomasă în scopul extragerii de la nivelul acesteia a enzimelor extra şi intracelulare, fie că se doreşte obţinerea biomasei în scopul purificării, conservării şi folosirii sub formă de culturi starter, controlarea procesului fermentativ prezintă un aspect important.

Pentru derularea în condiţii optime a procesului fermentativ parametrii de fermentare trebuie în mod continuu monitorizaţi, în mod continuu ajustate la valori optime conform principiului general schiţat în următoarea figură:

Dispozitivele utilizate reglează pe fiecare etapă a procesului parametrii către valori optime şi sunt foarte sensibile la variaţii datorită caracteristicilor de fidelitate, rapiditate în emiterea răspunsului, fiabilitate, exactitate şi precizie. În sistemele fermentative moderne se evaluează următorii parametri:

Vâscozitatea mediului – se impune datorită faptului că pe parcursul fermentaţiei se modifică caracteristicile reologice ale mediului (de curgere). Modificarea vâscozităţii mediului se poate datora fie consumului unui nutrient (glicerol), fie acumulării de produşi de fermentaţie cum ar fi poliglucidele, dextranul sau xantanul. O altă cauză care ar putea determina vâscozitatea mediului ar putea fi creşterea numărului de celule – creşterea biomasei la nivelul mediului.

Evaluarea calorică de la nivelul mediului . Majoritatea reacţiilor metabolice care presupun dezvoltarea biomasei sunt reacţii exergonice, căldura degajată din proces fiind direct proporţională cu numărul de celule vii. Căldura dezvoltată poate fi măsurată în bioreactoare izolate termic prin mai multe tehnici cum ar fi calorimetria dinamică, calorimetria în flux, calorimetria continuă. Căldura acumulată în proces reprezintă o sumă de călduri dezvoltate sau pierdute:

, Kj/dm3

Qf= căldura rezultată prin fermentaţieQag= căldura generată prin agitareQa= căldura pierdută prin aerareQm= căldura pierdută în mediu

Reglare

bioreactor

Captare semnal (senzori)

Acţionare

Comparare cu valoare optimă

9

Evaluarea cantităţii de CO 2 generate. Cea mai recomandată tehnică (Owens) de trasare a cineticii de dezvoltare celulară este considerată a fi cea care se bazează pe determinarea cantităţii de CO2 dezvoltat prin fermentaţie. Una dintre tehnicile cele mai cunoscute se bazează pe măsurarea conductivităţii într-un mediu cu geloză în care este captat CO2. Principiul metodei se bazează pe reducerea conductivităţii mediului prin înlocuirea ionilor OH- (hidroxil) în mod progresiv cu ioni CO3

2-

(carbonat). Evaluarea consumului de substrat şi formarea de produşi de

fermentaţie. Creşterea şi multiplicarea celulelor microbiene într-un mediu adecvat presupune în mod firesc consumul de substrat şi acumularea de produşi rezultaţi din metabolism. Dacă procesul fermentativ are ca obiectiv formarea de biomasă atunci substratul consumat se va regăsi în celulele nou formate, iar substanţa uscată solubilă din mediu se va regăsi în substanţa uscată a biomasei.

Parametrii evaluaţi sunt clasificaţi în următoarele categorii:- parametri fizici (temperatură, viteza de agitare, putere de agitare,

debit de gaz, volum de mediu de cultură, debit de substanţe suplimantare, viscozitate, capacitate de spumare);

- parametri chimci (pH, potenţial redox, oxigen dizolvat, CO2 dizolvat, conţinutul de compuşi volatili, determinări al componentelor chimice din mediu sau ale produşilor de fermentaţie);

- parametri microbiologici.

Preparate enzimatice şi culturi starterCurs nr . 7

Parametri microbiologici. Tehnici de evaluarea creşterii microorganismelor.

În timp ce la mucegaiurile inferioare, la care prin creştere are loc diviziunea nucleelor şi nu a celulelor genomice, creşterea se apreciază prin determinare masică a biomasei formate, la alte microorganisme, la care concomitent cu diviziunea celulară are loc şi diviziunea nucleară, creşterea se apreciază fie prin determinarea globală a biomasei formate, fie prin determinarea numărului de celule. De obicei pentru obţinerea unor rezultate detaliate asupra stării celulelor care formează populaţia se recomandă folosirea în paralel a mai multor metode şi compararea rezultatelor obţinute.

Schema cuprinzând metodele directe şi indirecte de evaluare a creşterii microorganismelor:

10

Metode indirecte de evaluare a populaţiei microbiene:1. Determinarea concentraţiei de celule2. Numărarea electronică a celulelor3. Metode culturale

1. Determinarea concentraţiei de celule:Examenul direct presupune execuţia de preparate umede sau de preparate fixate şi colorate. Pentru numărare se utilizează lame calibrate (citometrul Thoma) sau lame normale din sticlă (se aplică tehnica de numărare Breed în special pentru bacterii). În funcţie de numărul mediu de celule şi în funcţie de gradul de diluţie al probei, rezultatul se exprimă în număr de celule/ml. În prezent sau dezvoltat tehnici noi de analiză, derivate cu metodele clasice, tehnici care în paralel cu evaluarea numărului de celule permit şi evaluarea stării fiziologice aa celulelor:- microscopia în fluorescenţă utilizează coloranţi specifici pentru diferenţierea celulelor vii de cele moarte;- microscopia în imunofluorescenţă permite detectarea unor categorii particulare de microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici.

Microscopia permite caracterizarea celulelor şi evaluarea cantitativă, evidenţiindu-se prin simplitate şi prin rapiditate.

Pentru celulele care au tendinţa de a forma agregate se recomandă dispersarea lor într-o soluţie care conţine agent dispersant, iar pentru celulele care prezintă mobilitate se recomandă imobilizarea lor într-o soluţie de formaldehidă 2%.

2. Numărarea electronică a celulelor

Estimarea numărului de celule

Determinarea volumetrică a biomasei

Estimarea globală a biomasei

- Biomasă s.u.- Măsurare

CeluleSurse de C O2 Surse Alţi şi energie de N nutrienţi

Produşi CO2 H2O Căldură

- Metode microscopice- Metode culturale- Metode electronice

- Analizechimice- pH

Determinare constituienţi celulari (proteine intracelulare, ATP, NADH+)

Analiză conductometricăAnaliză în IR

Calorimetrie (în flux)Dinamică

Senzori selectivi Analize chimiceSenzori selectivi

Analize chimiceDeter. vâscozitate

11

Analize chimiceIndice de refracţieVâscozitate

Numărarea electronică a celulelor se adoptă mai ales pentru suspensii microbiene lichide şi se recomandă folosirea aparatului de tip Coulter care are ca principiu de funcţionare:

De o parte şi de alta a unui tub prevăzut cu un orificiu calibrat sunt dispuşi doi electrozi de platină imersaţi într-un electrolit. Bornele electrozilor sunt conectate la tensiune continuă la partea superioară a tubului, cuplată la o pompă de vid ce determină aspiraţia, iar celulele din exteriorul tubului trec pe rând prin orificiu, deplasând cu fiecare trecere un volum de electrolit egal cu volumul unei celule. Trecerile determină o creştere tranzitorie a rezistenţei circuitului, ceea ce generează un impuls electric cu o aplitudine proporţională cu volumul celulei. Deoarece impulsurile sunt de foarte scurtă durată, aparatul permite determinarea unui număr mare de celule într-un timp scurt. Mai mult este posibilă şi clasarea celulelor în funcţie de dimensiunile, respectiv, volumul lor. Această tehnică, deşi sofisticată, se aplică cu succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, evaluând nu numai analiza numărului lor, ci şi vârsta celulelor numărate corelată cu volumul.

Citometria în fluxAceasta permite numărarea celulelor şi evaluarea stării lor

fiziologice prin măsurarea fluorescenţei emise de celule marcate în prealabil cu un colorant specific.

Principiul de funcţionare a citometrului în flux:

celule

vidA

electrozi

Probă pentru analize

rezultate

Celule microbiene

Numărare cu citometru

12

După colorare celulele sunt direcţionate printr-un orificiu îngust, trec una câte una prin faţa unei surse luminoase. Fluorescenţa emisă de fiecare celulă este captată printr-un fotomultiplicator şi analizată. Rezultatele sunt înregistrate pe o histogramă care redă numărul de evenimente în funcţie de intensitatea fluorescenţei emise. Această histogramă redă în consecinţă un profil al unei populaţii. Pragul de sensibilitate al metodei aplicată cel mai adesea la populaţii de drojdii este de 102 celule/ml iar rapiditatea metodei este cam de 2 minute. Această tehincă a fost cu succes adoptată la numărarea celulelor de must de struguri.

13

Preparate şi culturi starterCurs nr 8

3. Metode culturale

În prezent sunt cunoscute mai multe tehnici bazate pe cultivarea de microorganisme şi evaluarea de celule:

- metoda culturală Koch- metoda titrului- metoda diluţiei

Avantajele constau în stabilirea facilă, uşoară a numărului de celule vii.

Dezavantajele constau într-un volum mare de muncă (destinat sterilizării sticlăriei, a ustensilelor şi a mediilor de cultură, timpul de incubare necesar dezvoltării microorganismelor fiind diferenţiat în funcţie de natura lor).

În cazul metodei Koch evaluarea numărului de celule se realizează indirect, în funcţie de numărul de colonii dezvoltate în câte două plăci Petri (MMA, BCA), inoculate în paralel.

Metoda Koch poate fi combinată cu metoda diluţiei, deoarece plăcile se inoculează deobicei după minim 3 diluţii succesive ale suspensiei de celule (reconstitue proba de analizat). Rezultatul se exprimă în număr de microorganisme/ mm, când există certitudinea dezvoltării individuale a celulelor, şi de cele mai multe ori în ufc/ l, unde ufc= unităţi formatoare de colonii.

Metoda titrului se bazează pe un calcul statistic a numărului cel mai probabil de microorganisme.

Metodele culturale sunt în prezent mult simplificate prin utilizarea Petrifilm-urilor care sunt discuri pe care este plasat mediul de cultură specific, deshidratat şi acoperit cu o folie permisivă la aer. La inocularea a 1 ml suspensie de celule, apa conţinută de suspensie rehidratează stratul de mediu, iar prin incubare creşterea microorganismelor este posibilă.

Determinarea globală a biomasei

14

Determinarea globală a biomasei permite estimarea celulelor dezvoltate în mediu. Ca variante tehnice se adoptă determinarea globală a biomasei substanţei uscate sau determinarea volumetrică a biomasei.

Determinarea globală a biomasei substanţei uscatăBiomasa microbiană recuperată de obicei prin centrifugare este

spălată succesiv de 2- 3 ori cu soluţie NaCl 0,9%, în scopul îndepărtării impurităţilor şi a mediului de fermentare antrenat de celule, apoi uscată la temeperatura de 1050C până la greutate constantă.

Această tehnică nu se aplică decât în cazul mediilor în care singurele particule în suspensie sunt microorganismele.

Dezavantajul acestei metode constă în faptul că nu se poate face o diferenţiere între celulele vi şi cele autolizate la nivelul biomasei.

În cazul mediilor lichide cu o densitate redusă de celule se recurge la filtrare prin membrane cu dimensiunea porilor mai mică decât a celulelor dezvoltate (0,22- 0,45 µm), apoi se recurge la uscarea membranelor la 1050C sau în cuptor de microunde şi aflarea prin diferenţă a biomasei depuse.

Determinarea volumetrică a biomaseiDeterminarea volumetrică a biomasei repreintă estimarea volumului

ocupat de biomasa separată prin centrigugare în tuburi de centrigugare gradate.

Metode indirecte

Metodele indirecte de evaluare a populaţiei microbiene se bazează pe manerarea concentraţiei unor componenţi celulari şi, considerând concentraţia acestora per celulă aproximativ constantă, stabilirea prin echivalenţă a concentraţiei biomasei.â

1. Determinarea constituienţilor celulari repreintă tehinca de evaluare cantitativă a unor componenţi aflaţi în concentraţie constantă la nivelul celulei componenţi cum ar fi: ATP, ADN, ARN, NADH.

În unele situaţii şi conţinutul unor categorii de proteine poate să ofere indicaţii valoroase.

Exemplificativ, principiul metodei de identifcarea a ATP-ului se bazează pe emisia luminoasă produsă prin oxidarea luciferinei în prezenţa ATP-ului. Această emisie se obţine în câteva secunde, conform ecuaţiei de mai jos, şi se determină spectofotometric.

Se consideră conţinutul mediu de ATP în celulele microbiene ca fiind aproximativ 5x10-6 gr ATP/ celulă sau 1mg ATP/ g s.u. biomasă.

Determinarea concentraţiei proteice intracelulare relevă capacitatea celulelor de a biosintetiza proteine.

Deoarece biosinteza de proteine este corelată cu creşterea în biomasă această tehnică poate să aibă acelaşi principiu cu metoda Khilda sau se poate baza pe hidroliza proteinelor şi dozarea aminoacizilor.

luciferazăATP + luciferină + O2

oxiluciferină + AMP + 2 (Pi) + lumină

15

Preparate şi culturi starterCurs nr 9

Culturi starter de micriorganisme utilizate în bioprocese

Def: Culturile starter sunt acele culturi care se obţin plecând de la o cultură pură stoc, cu trecere prin culturi intermediare (pasaje), devenind apte ulterior de a fi folosite pentru obţinerea unor produse alimentare fermentate.

O primă clasificare cu caracter general se realizează în baza numărului de specii conţinute de cultura starter. În acest sens culturile starter pot fi singulare (conţin o singură specie de microorganisme) sau mixte (conţin două sau mai multe specii de microorganisme).

Scopul folosirii culturilor starter este acela de a dirija procese biologice prin care se asigură produsului gradul de inocuitate dorit şi în multe situaţii se asigură şi conservabilitate.

Alte roluri constau în asigurarea unor însuşiri senzoriale specifice şi în unele cazuri asigurarea unor însuşiri nutritive deosebite.

Condiţii pe care trebuie să le îndeplinească culturile starter utilizate în industria alimentară:

1. Pentru a-şi satisface calitatea tehnologică, culturile starter trebuie să conţină un anumit număr de celule viabile pe unitatea de masă sau unitatea de volum, deoarece procesele biologice nu pot fi generate decât de celule active.

2. Pentru a satisface calitatea biologică culturile starter pot să conţină un număr minim, sau de dorit să nu conţină, germeni aparţinând unor specii străine de cultură (cuturile starter trebuie să conţină un număr redus de germeni).

3. Culturile starter nu trebuie să conţină celule care să genereze substanţe antibiotice utilizate în scop terapeutic.

4. Culturile starter trebuie să posede activităţi specifice în ceea ce priveşte elaborarea compuşilor doriţi, sau să posede activităţi specifice pe direcţia asimilării unor componenţi (culturi strater care elaborează ca activitate specifică acid lactic sau culturi care reduc conţinutul de azot aminoacidic).

5. Culturile starter trebuie să fie însoţite de pachete informaţionale. Trebuie să fie declarate cu nume ştiinţific întreg, speciile noi trebuie înregistrate şi respectiv verificate de instituţii specializate.

6. Depozitarea în vederea perpetuării şi a obţinerii în regim continuu a culturilor trebuie să se realizeze în colecţii cu nomenclator, respectiv în micoteci bine gestionate.

7. Înainte de utilizare în producţie culturile starter trebuie testate din punct de vedere al inocuităţii, în conformitate cu legislaţia în vigoare,

16

iar la intervale regulate culturile se oferă spre testare instituţiilor specializate în scopul depistării unor mutaţii nedorite.

8. Eventualele specii, identificate ca având potenţial patogen sau toxicogen, vor fi supuse unui control riguros realizat pe toate tulpinile folosite în industria alimentară pe termen lung în ceea ce priveşte toxicitatea, carcinogenitatea şi mutagenitatea.

Toate aceste condiţii impuse apar cu titlu de obligativitate absolută din următoarele motive:

- celulele provenite din culturi starter se pot consuma odată cu produsul alimentar;

- conţinutul intracelular rămas în stare nemodificată în urma diverselor tratamente de natură fizică, chimică sau biologică, se regăseşte în stare parţial modificată în produs la fel şi produşii metabolismului celular (produse alimentare fermentate şi supuse unor operaţii de creştere a conservabilităţii- pasteurizarea);

- multe produse alimentare sunt definite în proporţie de 99% de produşi ai metabolismului celular, chiar dacă microorganismele generatoare sunt eliminate din aceste produse, întreaga lor compoziţie chimică este dependentă de activitatea pe care celulele respective au desfăşurat-o în produs.

Preparate şi culturi starterCurs nr 10

Culturile starter folosite în industria laptelui

Din toate industriile care se bazează pe activitatea microorganismelor, cea mai mare beneficiară este industria laptelui. În general culturile starter de bacterii lactice sunt folosite deoarece elaborează o serie de metaboliţi, un beneficiu pentru produsele finite obţinute. Bacteriile lactice produc:

- acid lactic şi în general acizi organici care manifestă acţinuea de creştere a acidităţii;

- substanţe din categoria bacteriocine, care eliberate în mediul de cultură acţionează prin inhibarea bacteriilor de contaminare sensibile;

- peroxizi organici cu rol de protecţie a metabolismului benefic pentru produsul finit.Bacteriile lactice exploatate în interesul generării metaboliţilor

exemplificaţi şi a altor categorii responsabili de formarea gustului şi a aromei aduc produselor şi alte beneficii:

Bacteriile lactice intră în competiţie cu microorganismele de alterare şi cu eventuale microorganisme cu caracter patogen în ceea ce

17

priveşte consumul de substanţe nutritive şi, datorită acidifierii mediului ca o consecinţă a acumulării de acid lactic în principal microorganismele de alterare şi patogene sunt inhibate. Cele mai importante microorganisme vizate în sensul inhibării sunt staphilococii, salmonelele, Lysteria monocitogenes, Clostridium botilinum. Alături de aceste microorganisme sunt inhibate şi cele cu acţiune proteolitică şi respectiv cele cu acţiune decarbixilazică. Prin urmare în produsele finite obţinute se vor forma cantităţi reduse de amine biogene. Pentru consumul uman, produsele lactate acide reprezintă un aport benefic, deoarece aciditatea lactică favorizează acţiunea pepsinei (enzimă digestivă parte componentă a sucului gastric) care produce hidroliza proteinelor, produce coagularea cazeinei din lapte- degradată în continuare la rândul ei de tripsină (enzimă pancreatică).

Aciditatea pe care produsele lactate acide o transferă mediului intestinal blochează dezvoltarea microflorei patogene şi favorizează acţiunea bifidobacteriilor manifestată prin creşterea rezistenţei sistemului imunitar.

Particularităţi ale obţinerii culturilor starter de bacterii lactice destinate industriei laptelui

Laptele, mediu de cultură folosit în industria producătoare de culturi starter.

Laptele nu este un mediu complet ideal care să asigure multiplicarea bacteriilor lactice la randamente maxime. Motivele care stau la baza acestei afirmaţii sunt următoarele:

Laptele crud nu are o compoziţie optimă de substanţe nutritive azotate, de vitamine şi de alte categorii de factori de creştere indispensabili bacteriilor lactice. Susţinem acest motiv cu următoarele precizări:

există specii care se comportă diferit din punct de vedere al asimilării glucozei şi lactozei. Ca exemplu avem Lactobacillus bulgaricus şi Streptococcus thermophillus specii care se folosesc pentru obţinerea iaurtului lactoza doar dacă aceasta a fost în prealabil hidrolizată în prezenţa β- galactozidazei, adică în consecinţă pot să folosească drept carbohidrat doar glucoza.

Azotul neproteic din lapte nu este suficient pentru bacteriile lactice. În consecinţă acestea pentru a-şi furniza azotul aminoacidic suficient, trebuie să posede şi activitate proteolitică. Activitatea proteolitică constituie un criteriu de clasificare a tulpinilor de bacterii lactice în tulpini aşa-numite lente ş rapide. Diferenţele dintre aceste tulpini constau în absenţa şi, respectiv, prezenţa unor plasmide care conţin gene responsabile de sinteza proteinazelor şi a peptidazelor. Tulpinile lente utilizează peptidele hidrolizate de ele însele, deoarece posedă un echipament enzimatic cu acţiune proteolitică. Tulpinile lente pierd totuşi

18

această caracteristică după divizare, în cursul dezvoltării, în timp ce tulpinile rapide păstrează plasmidele respective după divizare.

Sursa de azot, respectiv, tipul de proteină solicitat este dependent de specia cultivată. De exemplu Lactobacillus bulgaricus preferă ca sursă de azot β-cazeina, pe care o găseşte în lapte, în schimb Leuconostocii preferă azotul din extractele de drojdie folosite ca suplimente. În general laptele conţine doar 5- 20% din totalul de aminiacizi şi a peptidelor necesari dezvoltării optime a Leuconostocilor şi a Streptococilor.

Adaosul de substanţe stimulatoare (extract de drojdie, extract din pancreas, sirop de porumb) are ca scop îmbogăţirea laptelui cu aminoacizi, peptone, vitamine, substanţe minerale sau suplimentarea laptelui cu enzime proteolitice necesare degradării proteinelor existente iniţial în lapte. În cazul bacteriilor lactice, este necesar ca laptele să conţină citrat de magneziu, respectiv citrat de mangan. Metalele aduse de aceste săruri constituie oligoelemente necesare dezvoltării în mod special a leuconostocilor. În ceea ce priveşte laptele folosit ca mediu de obţinere a bacteriilor propionice acestea trebuie să conţină pe lângă extract de drojdie şi factori de creştere cum ar fi biotină, acid pantotemic, tiamină.

SUBIECTE PECS

1. Definiţia şi clasificarea enzimelor

19

2. Unităţi de măsură ale acvităţii enzimatice3. Surse de obţinere a preparatelor enzimatice. Avantajele obţinerii

şi folosirii preparatelor emzimatice microbiene.4. Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor

enzimatice.5. Particularităţi ale procedeelor de obţinere a preparatelor

enzimatice microbiene.6.Aspecte biologice ale fermentaţiei principale7. Procedeul nealimenatat de desfăşurare a fermentaţiei.8. Procedeul alimentat de desfăşurare a fermentaţiei.9. Procedeul continuu de desfăşurare a fermentaţiei.10. Extracţia enzimelor intracelulare11. Modalităţi de comercializare a preparatelor enzimatice.12. Parametrii evaluaţi în sistemele fermentative.13. Determinarea concentraţiei de celule.14. Numărarea electronică a celulelor.15. Citometria în flux.16. Metode culturale de evaluare a preparatelor microbiene.17. Determinarea globală a biomasei.18. Definiţie. Condiţii pe care trebuie să le îndeplinească culturile

starter utilizate.19. Avantajele folosirii culturilor starter de bacterii lactice în

industria alimentară.20. Laptele ca mediu de obţinere a culturilor starter de bacterii

lactice.

20