rezumatromantezadedoctorat_barthalaszlo

7/22/2019 rezumatromantezadedoctorat_barthalaszlo

1/31

1

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ - NAPOCA

Facultatea de Biologie iGeologie

Rezumatul tezei de doctorat

Studii de filogenie molecular la speciile europene de

AstragalusL. aparinnd secieiDissitiflori

Conductor tiinific Doctorand

Prof. Dr. Nicolae Drago Bartha Lszl

Cluj - Napoca

2012


2/31

2

Cuprinsul tezei de doctorat

1 ABREVIERI ............................................................................................................................................... 5

2 INTRODUCERE ......................................................................................................................................... 6

3 CONSIDERAII TEORETICE....................................................................................................................... 7

3.1 INFERENA NRUDIRII SPECIILOR FOLOSIND SECVENE ADN............................................. ................... 7

3.2 PREZENTAREA GENERAL A GENULUIASTRAGALUS.................................................................... ......... 9

3.2.1 ASTRAGALUS: o poveste de succes din punct de vedere al evoluiei................. .............................. 9

3.2.2 Poziia filogenetic a genuluiASTRAGALUS.............................................. ........................................ 9

3.2.3 Evoluia numrului de cromozom la genulASTRAGALUS.................................... ........................... 12

3.3 CLASIFICAREA GENULUIASTRAGALUS................................................................................. ................ 14

3.4 SECIA DISSITIFLORIA GENULUIASTRAGALUSCU REFERIRE SPECIAL LA SPECIILE EUROPENE........ 15

3.4.1 Incertitudini taxonomice la speciile europene deASTRAGALUS

aparinnd seciei Dissitiflori................................................................................................................. 16

3.4.2 Problema originii i nrudirii al endemitului localASTRAGALUS PETERFII.......................................... 16

3.5 STUDII ANTERIOARE DE FILOGENIE MOLECULAR PENTRU GENULASTRAGALUS

I MARKERII MOLECULARI FOLOSII........................................................................................................... 19

4 PRINCIPALELE OBIECTIVE ALE TEZEI ....................................................................................................... 21

5 MATERIALE I METODE......................................................................................................................... 22

5.1 EANTIONAREATAXONILOR....................................................................... ......................................... 22

5.2 MATERIAL VEGETAL I EXTRACIA ADN-ULUI...................................................................................... 235.3 DEZVOLTAREA I SELECIA MARKERILOR MOLECULARI. AMPLIFICAREA PCR..................................... 27

5.3.1 Dezvoltarea i selecia markerilor moleculari ................................... .......................................... 27

5.3.2 Amplificarea PCR............................................................................... .......................................... 28

5.4 CLONAREA I SECVENAREA....................................................................................................... ......... 32

5.5 ANALIZE FILOGENETICE............................................................................................................... ......... 33

5.5.1 Alinierea secvenelor ADN................................................................ ........................................... 33

5.5.2 Reconstrucia arborilor filogenetici pe baza secvenelor plastidiale.......................................... 33

5.5.3 Ceasul molecular pe baza secvenelor plastidiale....................................................................... 35

5.5.4 Analiza reelelor de secvene nrITS clonate........................................................... ..................... 35

5.5.5 Analiza arborilor filogenetici ale secvenelor nrITS clonate ........................................................ 36

5.6 ANALIZA MULTIVARIAT A CARACTERELOR MORFOMETRICE...................................... ...................... 36

6 REZULTATE ............................................................................................................................................ 39

6.1 SUCCESUL SECVENRII I ALINIEREA SECVENELOR................. ........................................................ 39

6.1.1 Regiunile plastidiale ycf1, ndhF-rpl32 i rpl32-trnL.................................... ................................. 39

6.1.2 nrITS............................................................................................................................................ 40

6.2 RECONSTRUCIA ARBORILOR FILOGENETICIA SECVENELOR PLASTIDIALE............................................. 49


3/31

3

6.2.1 Analiza parcimoniei maxime a matricelor de ycf1, ndhF-rpl32 i rpl32-trnL............................... 49

6.2.2 Analiza parcimoniei maxime i analiza Bayesian ale secvenelor plastidiale combinate.......... 50

6.2.3 Analiza Maximum Likelihood ale secvenelor plastidiale combinate.......................................... 52

6.3 ANALIZA CEASULUI MOLECULAR........................................................ ................................................. 57

6.4 ANALIZA REELELOR DE SECVENE NRITS.............................. ............................................................. 59

6.4.1 Reconstrucia reelei de parcimonie statistic a ribotipurilor..................................................... 59

6.4.2 Analiza NeighborNet a ribotipurilor..................................................... ....................................... 61

6.5 ANALIZA ARBORILOR FILOGENETICI BAZAI PE SECVENE NRITS........................................................ 63

6.6 ANALIZA MULTIVARIAT MORFOMETRIC A SPECIILOR DISSITIFLORISELECTATE........... .................. 65

7 DISCUII................................................................................................................................................ 68

7.1 FILOGENIA SPECIILORASTRAGALUSAPARINND SECIEI DISSITIFLORIDIN EUROPA:

IMPLICAII BIOGEOGRAFICE I ESTIMAREADIVERSIFICRII DE-A LUNGUL TIMPULUI............................... 68

7.2 STATUTUL NE-MONOFILETIC AL SECIILOR DISSITIFLORII ERIOCERAS.............................................. 72

7.3 SPECIAIE RETICULAT I EVOLUIA INCOMPLET CONJUGAT A NRITS-ULUI

NASTRAGALUSSECIA DISSITIFLORI............................................. ............................................................ 75

7.4 ORIGINEA I NRUDIREA SPECIEIA.PETERFII........................................................................ ............... 77

7.5 IMPLICAII TAXONOMICE PENTRU SPECII SELECTATE ALE SECIEI DISSITIFLORI................................. 78

7.6 IMPORTANA UTILIZRII COMBINATE ALE SECVENELOR YCF1, NDHF-RPL32 I RPL32-TRNL

N FILOGENIA SPECIILOR DEASTRAGALUS........................................................... ....................................... 79

8 CONCLUZII ............................................................................................................................................. 80

9 BIBLIOGRAFIE ........................................................................................................................................ 81

10 APENDICE ............................................................................................................................................ 91

10.1 APPENDIX 1. DISTRIBUIA SECVENELOR CLONATE NRITS DIN CADRUL GRUPURILOR

DE RIBOTIP IDENTIFICATE N ANALIZA REELELOR FILOGENETICE............................................................. 91

10.2 APPENDIX 2. SCHEMA BLOC A TESTULUI ILD IMPLEMENTAT N PAUP.............................................. 93

10.3 APPENDIX 3. SCHEMA BLOC A ANALIZEI BAYESIENE A SECVENELOR PLASTIDIALE..... .................... 93

10.4 APPENDIX 4. SCHEMA BLOC A ANALIZEI PARCIMONIEI MAXIME A SECVENELOR PLASTIDIALE...... 94

10.5 APPENDIX 5. ARBORELE STRICT CONSENSA CELOR CEI MAI PARCIMONIOI34 DE ARBORI

DERIVAI DIN ANALIZA PARCIMONIEI MAXIME A 35 SECVENE YCF1 ................................... .................... 9510.6 APPENDIX 6. ARBORELE STRICT CONSENSA CELOR CEI MAI PARCIMONIOI9 ARBORI

DERIVAI DIN ANALIZA PARCIMONIEI MAXIME A 35 SECVENE NDHF-RPL32 ........................................... 96


DERIVAI DIN ANALIZA PARCIMONIEI MAXIME A 35 SECVENE RPL32-TRNL ........................................... 97


DERIVAI DIN ANALIZA PARCIMONIEI MAXIME A 47 SECVENE YCF1 ......................................................98

11 MULUMIRI......................................................................................................................................... 99

12 PUBLICAII I PREZENTRI PE BAZA TEZEI......................................................................................... 100


4/31

4

Introducere

Astragaluseste genul cu cel mare numar de specii (ca. 2500 spp.) al angiospermelor.

Pe lng numrul mare de specii, diversitate genului se reflect i prin numrul mare al

endemitelor locale nlume sau radiaia speciilorn Anzi sau Asia Central.

Flora Romniei, de exemplu, conine trei specii endemice de Astragalus:A. peterfiiJv.,A.

roemeri Simonk., iA. pseudopurpureus Guul. Acestea sunt specii emblematice ale conservrii

naturii, ele avnd distribuii geografice restrnse. Prima crete n habitate stepice ale Cmpiei

Transilvane, n timp ce ultimele dou cresc n habitate montane ale Carpailor Orientali.

Explorarea nrudirilor acestor specii constituie obligaia studiilor botanice curente. Cu

ajutorul secvenrii ADN-ului i a metodelor folosite pentru reconstrucia arborilor filogenetici,

ndeplinirea acestor necesiti pare relativ simpl. n general, cu ct speciile sunt mai strns

nrudite, cu att mai mult se aseamn secvenele lor. Diferitele metode utilizate pentru inferena

filogenetic se bazeaz pe acest principiu. Un important aspect pe care astfel de studii l ntlnesc

este eantionarea taxonilor. Ce specii din cele aprox. 2500 s fie incluse? Tratrile taxonomice

anterioare bazate pe investigaii morfologice ori studii de filogenie molecular anterioare pot

servi ca referinnacest scop.

Interesul autorului n inferena filogenetic a plantelor a aprut ntimpul studiilor sale de

masterat i a fost influenat de cercettorii Universitii Babe -Bolyai i cei de ai Universitii din

Debrecen. La nceputul studiilor de doctorat investigaiile lui aveau ca principalul obiect

reconstrucia relaiilor filogenetice ale endemitului local Astragalus peterfii. ntre timp, autorul a

extins prelevare taxonilor la toat Europa,n ceea ce privete secia taxonomicde careA. peterfii

aparine. Obiectivul finalal studiilor sale de doctorat a devenit reconstrucia filogeniei speciilor

europene de Astragalus aparinnd seciei Dissitiflori. n aceast tez cele mai importanterezultate ale acestui studiu de trei ani sunt prezentate.


5/31

5

Consideraii teoretice

Inferena nrudirii speciilor folosind secvene de ADN

De mai mult de dou decenii secvenele ADN reprezint sursa cea mai important de

informaie pentru stabilirea nrudirilor speciilor la diferite nivele taxonomice i acest fapt pare s

nu se schimbe in viitor (Baldwin, 1992; Shaw et al., 2005). Un antecedent pentru acesta a fost

recunoaterea faptului c variaia secvenelor ntre specii reflect cu o certitudine mai bun

relaiile de nrudire ale acestora dect caracterele morfologice care nclin a fi foarte

homeoplastice datorit convergenei evolutive (Downie et al., 2000; Richardson et al., 2000).

Autenticitatea lor e valabil n special n cazul markerilorfilogenetici necodificatori care n general

nu sunt supuiseleciei, i de accea descriu cu o accuratee mai mareistoria speciilor (Kolariket

al., 2010).

Doi factori cheie adiionali au mai contribuit la popularitatea inferenei filogenetice bazat

pe secvene: obinerea secvenelor prin tehnici de rutini dezvoltare metodelor computaionale,

respectiv a algoritmilor.

Filogeniile au implicaii directe asupra clasificrii filogenetice: o clad a unui arbore este o

unitate filogenetic creia i se poate asocia un grad taxonomic dac clada respectiv e susinut i

morfologic (Chatrouet al., 2012). Un important considerent al acestei abordri este confidena

statistic a cladei. n general numai cladele bine susinute statistic se iaun considerare. Pe de altparte suportul statistic, rezoluia i coninutul de specii al oricrei clade poatevarian funcie de

metoda filogenetic aplicat sau cnd markeri adiionali sunt incluin analize. De aceea, pe lng

suportul statistic i morfologic, congruena i stabilitatea cladelor este de asemenea important

cnd unei clade i se asociaz o unitate taxonomic.

La angiospermerata substituiei nucleotodice a genomului plastidial depeten general

de trei ori pe cea a genomului mitocondrial, n timp cerata substituiei nucleotodice a genomului

nuclear depete de 1216 ori pe cea a genomului mitocondrial (Weng et al., 2012)), i

referinele incluse). Prin urmare, n contrast cu animalele, secvenele mitocondriale beneficeaz

de mai puin importan nfilogenia molecular a plantelor.

Markerii ADN plastidiali, chiar dac sunt mai puin variabili dect cei nucleari, prezint

anumite avantaje fa de acetia. Ei n mod normal reflect modul clasic (bifurcat)al speciaiei pe

un arbore filogenetic datorit trsturii lor single-copy ceea ce asigur i inexistena

recombinaiei.Un alt avantajlconstituie accesul la amorse universale (Xuet al., 2012). Acestea

fac aceti tipi de markeri ideali pentru testarea monofiliei (n specialdeasupra la nivelul speciilor)

chiar dac ei se motenesc doar maternal.


6/31

6

Filogeniile bazate pe secvene plastidiale conducns frecvent la arbori bogai n politomii

din cauza variaiei lor insuficiente. Astfel de cazuri se explic prin diversificaia recent sau/i

rapid a respectivelor grupuri de plante sau prin utilizarea markerilor inadecvai.

Relaiile filogenetice, n special cele aproapiate de vrfurile unui arbore filogenetic (la nivel

de specie), nu se pot dezvluidin plin cu markeri motenii uniparental atunci cnd hibridarea,

introgresarea, transferul de genuri (precum i alte procese de outputsimilar) au ajustat speciaia.

Hibridarea i alopoliploidizarea (hibridare urmat de poliploidizare) sunt cunoscute ca i

fore majore care au ajustat evoluia i speciaia plantelor (Grant, 1981;Soltis and Soltis, 2009).

Astfel de procese se pot identifica prin filogenii derivate cu markeri motenii biparental dac

copiile unei regiuni nucleare provenind din diferite specii printe sunt regsite ntr-un organism

hibrid i ele fiindsuficient divergente naintea hibridrii. Dac una dintre copii este omogenizat

fa de cealalt copie un fenomen frecvent ntlnitn cazul regiunii nrITS (internal transcribed

spacer) al ADN-ului nuclear ribozomal incongruenele dintre filogeniile bazate pe secvene

plastidiale respectiv nucleare nc mai pot servi ca dovad pentru hibridare sau eventual

alopoliploidizare. Incongruenele dintre filogeniile bazate pe secvenele nucleare i cele

plastidiale (sau paralogia oricrui marker nuclear) poate fins cauzat i de incomplete lineage

sorting (reinerea polimorfismuluiancestral) i recombinare (Rieseberg and Brunsfeld, 1992;Xu

et al., 2012). Discriminarea speciaiei prin hibridare (reticulaie) de retenia polimorfismului

ancestral este de multe ori dificil i reprezint o provocare pentru specialitii n domeniulfilogeniei (Wendel and Doyle, 1998; Willyardet al., 2009).

n ciuda popularitii n creterea markerilor nucleari low/single-copy, regiunea nrITS este

nc unul din cei mai utilizai markeri filogenetici. Se compune din regiunile ITS1 i ITS2 legate

ntre ele de gena pentru ARNr 5.8S (Calonje et al., 2008). ITS1 i ITS2 se transcriu n decursul

transcrierii ARN-ului dar se degradeaz dup, de aceea pot fi considerai markeri nucleari neutrali.

Datorit numrului mare de copii n genom, lungimii relativ scurte i existenei amorselor

universale, amplificarea regiunii nrITS prin PCR e relativ simpl chiar i din probe ADN parial

degradate (de exemplu extrase din material de ierbar). Cu toate acestea, copii le ale acestui

marker nu sunt mereu omogenizate din deplin sau nu urmresc cele dou genomuri n hibrizi

(Zimmer iWen, 2012), i referinele incluse) datorit procesului evoluiei n conjugate (concerted

evolution) fcnd acest marker un instrumentmai puin promitoar dect genele nuclare low-

copy.


7/31

7

Prezentarea general a genuluiAstragalus

Astragalus: o poveste de succes din punct de vedere al evoluiei

Genul Astragalus cuprinde n jur de 2,500 de specii fiind cel mai mare gen al

angiospermelor (Lock and Schrire, 2005). Majoritatea speciilor Astragalus sunt pereniale, altele

fiind ianuale. Speciile ale acestui gen sunt prezente pe aproape toate continentele (excluznd

Australia) i ocup mai mult regiunile rcoroase, aride i continentale ale emisferei nordice i ale

Americii de Sud (Lock and Schrire, 2005). Genul ajunge la cea mai mare diversitate n Asia central

i sud-estic (ca. 1500 specii), regiunea Sino-Himalaia (ca. 500 specii), partea vestic a Americii de

Nord (ca. 400-500 specii) i n Anzi n America de Sud (ca. 100 specii) (Kazempour Osalooet al.,

2003). Astragalus este divers i n regiunile climatice tip mediteraneene n Europa de sud

(incluznd Asia Mic) i zona de coastdin vestul Americii de Nord.

Dei numrul de baz al cromozomilor este 2n=16 pentru Astragalus, numere mari de

cromozomi au fost raportate n studii citologice din toate prile arealului genului (Ledingham,

1960; Ledingham and Rever, 1963; Masoudet al., 2009). Aceasta sugereaz un rol important al

poliploidizrii n evoluia genului. Pe lng poliploidizarea, radiaiaadaptativ la o scar global

(Kazempour Osalooet al., 2003)probabil a contribuit la numrul mare de specii i rata mare al

endemitelor n genul Astragalus. Un al treilea factor care poate avea un rol semnificativn

diversificaia speciilor l constituie raritatea sau chiar absena hibridrii (Liston, 1992; Juddet al.,

2008; Kazemiet al., 2009)n combinaie cu autogamia larg rspndit n gen (D. Podlech,personal

communication (2010)), ceea ce putea facilita izolarea speciilor. Deoarece hibridarea nu a fost

nc raportat pentru gen, putem presupune c nici hibridarea nici alopoliploidizarea nu au

contribuit nc la speciaie n Astragalus. Aceste fenomene, au ajustat astfel,n profunzime

evoluia angiospermelor (Grant, 1981;Soltis and Soltis, 2009).

SeciaDissitifloria genuluiAstragaluscu referire specialla speciile

europene

Secia Dissitiflorieste una din seciile cu cel mai mare numr de specii (ca. 160 spp.) ale

genului Astragalus. Face parte din subgenul parafiletic Cercidothrix care cuprinde speciile cu

indumentum bifurcat (Ranjbar, 2004). Aceast secie a fost ntemeiat de A. P. de Candolle n anul

1825. Mai trziu (1868) Bunge a introdus acceai secie sub numele Xiphidium (Ranjbar, 2004).

Lectotipizare a fost ndeplinit de Podlech (1990). Prin urmare secia o are peA. variusca specie

tip.

Principalul centru de speciaie al seciei Dissitiflori se afl n munii Asiei Centrale(Goncharovet al., 1946), ns arealul su acoper ntreagaEurasia (Ghahremani-Nejad, 2004).n


8/31

8

Europa secia prezint a distribuie disitinct i cuprinde aprox. 50 de specii, n timp ce Flora

Romniei cuprinde7-8 taxoni (Ciocrlan, 2009). Diverse endemite locale europene de Astragalus

aparin acestei secii, cum ar fi A. hispanicus Coss. ex Bunge n Spnia, A. aquilanus Anzal. iA.

vesicarius L. subsp. pastellianus Pollini (Arcang.) n Italia, A. peterfii Jv. n Romnia, A.

tarchankuticusBoriss. nUcraina. Sect. Dissitiflorie considerabil de diverspe Peninsula Balcanic

i n Asia Mic.

Imaginile inflorescenei speciilor selectate aparinnd seciei sunt prezentate pe Fig.3.

Relaiile de nrudire, fie morfologice, fie filogenetice, ale speciilor aparinnd acestei secii

nu au fost nc studiate. De altfel, taxonomia seciei, n special din Europa, prezint numeroase

neclariti generate de nomenclatura controversat a unor specii.

Incertitudini taxonomice la speciile europene de Astragalusaparinnd seciei

Dissitiflori

Unul din grupurile de specii problematice ale seciei din punct de vedere taxonomic l

constituie agregatul A. vesicarius L. care, conform celei mai recente circumscrieri incluznd

Europa, dar excluznd fosta Uniunea Sovietic, include trei subspecii: A. vesicarius L. subsp.

vesicarius(incl.A. albidusWaldst. & Kit.), A. vesicariussubsp.pastellianusiA. vesicariussubsp.

carniolicus(A. Kern.) Chater (Podlech, 2008). Dintre acesteaA. vesicariussubsp. vesicariusare cea

mai vast (ns disiunct) distribuie, din Peninsula Iberc pn nUcraina, n timp ceA. vesicarius

subsp.pastellianuseste endemic pentru Nord-estul Italiei i A. vesicariussubsp. carniolicuseste

limitat la Italia Nord-estic, Croaia i Slovenia. Pe lng cele trei subspecii menionate mai sus,

doi taxoni au fost afiliai repetat cu (ori chiar inclui n) grupul vesicarius:A. pseudoglaucusKlokov

iA. tarchankitucus Boriss.A. pseudoglaucus este limitat la rmulNord-vestic al Mrii Negre

(Bulgaria, Romnia, Ucrainai probabilRepublica Moldova), iA. tarchankuticus, crete exclusivn

Crimeea, pe Peninsula Tarhankut, de unde a fost original descris (Borissova, 1951). n Flora

Europaea ele sunt tratate ca posibile subspecii al taxonului A. vesicarius (Chater, 1968). Mai

trziu, combinaia nou deA. vesicariussubsp.pseudoglaucus(Klokov) Ciocrlan a fost introdus

(Ciocrlan and Srbu, 2001). Mai recent,A. tarchankuticusa fost sinonimizat cuA. albicaulisD.C.

n timp ceA. pseudoglaucusa fost sinonimizat cuA. vesicarius(Podlech, 2011), astfel confirmnd

opinia lui Ciocrlan iSrbu(2001)asupra acestui taxon bazat pe consideraii morfologice.

Problema originii i nrudirii al endemitului localAstragalus peterfii

Fiind o specie emblematic de a conservare naturii din Romnia, Astragalus peterfii Jv.

este un endemit local al Cmpiei Transilvane. A fost descoperit n anul 1916 de briologul PterfiMrton lng satulSuatu (jud. Cluj), fiinddedicat celui care a gasit-o, de ctre autorul speciei


9/31

9

JvorkaSndor. O rezervaie botanic a fost nfiinat pentru protejarea speciei n anul 1932 pe

locul clasic al acesteia de ctre profesorul Alexandru Borza. Pentru cteva deceni acest sit a rmas

singura ocuren cunoscut a speciei, iar n anul 1962 o a doua populaie a fost identificat la

civakilometri deprtare, lng satul Cianu (Bdruet al., 2000).Astragalus peterfiifigureaz

pe o serie de liste roii i n cadrul unor acorduri pentru conservarea biodiversitii (Directiva

Habitate, Lista Roie IUCN, Convenia din BernaiLista Roie Naional a Romniei). Este o specie

octoploid (2n=64) (Ledingham and Rever, 1963)a seciei Dissitiflori(Podlech, 2008).

Problema originii i a afinitilor lui A. peterfiia provocat o serie de ipoteze, derivate mai

mult din investigaii morfologice. Prima remarc pe acest subiect a fost facut chiar de autorul

speciei. Dup Jvorka (1916),Astragalus peterfiieste strns nrudit cuA. glaucusM. B., crescnd

lng oraul Odessa (Ucraina). Studiind variabilitatea genetic a speciei folosind analize

biochimice, Borza (1998)a gsit un tipar al izoenzimelor sugernd o origine alopoloploid pentru

A. peterfii. El a mai comparatA. peterfiicu zece alte specii de Astragalusdin Romnia pe baza

polimorfismului proteinelor din semine pentru a studia relaiile filogenetice dintre ele (Borzaet

al., 1994). Niciuna dintre speciile studiate nu a fost dezvluit ca fiind strns nrudit cu A.

peterfii, rezultat ateptat, deoarece niciuna dintre taxonii investigai nu aparinea seciei

Dissitiflori. Pnzaru (2006)a avansat o nou teorie referitoare la taxonomia speciei, susinnd c

Astragalus peterfii este de fapt sinonimul taxonului A. vesicarius subsp. pastellianus, endemitul

local Nord-Italian.Consideraiile anterioare confirm interesul general n problema originii i a nrudirilor speciei A.

peterfii.

Studiul literaturii taxonomice sugereaz prezena unui posibilul complex de speciensecia

Dissitifloria genuluiAstragalusincluznd probabilA. pseudoglaucus,A. tarchankuticus,A. peterfii

i membrii ai agregatului A. vesicarius. Lmurireacomplexelor de specii este de obicei dificil i

necesit integrarea informaiilor din diferite surse, de ex. genomul plastidial i cel nuclear, sau

morfometrie.

Studiile de filogenie molecular asupra genului Astragalus din ultimele dou decenii au

avut ca obiectiv circumscrierea genului, incluznd studiile exploratoare care au reconstruit

afinitiile principale a genului i relaiile intersecionale (Wojciechowski et al., 1993;

Wojciechowskiet al., 1999;Kazempour Osalooet al., 2003, 2005;Wojciechowski, 2005;Kazemiet

al., 2009;Zhanget al., 2009). Aceste studii iniiale ajut lanelegerea relaiilor filogenetice la un

nivel profund, exemplificat de exemplu prin studiul lui Rihai et al.(2011)care a vizat reconstrucia

filogeniei seciei Caprinial genuluiAstragalus. Aceast tendin a fost meninut de Javanmardi et

al. (2012) ai crui studiu avea ca scop reconstrucia filogeniei seciei Alopecuroidei al genului


10/31

10

Astragalus. Prezenta tez ncearc s-i continue i ea sus-numita direcie prin tentativa de a

reconstrui filogenia speciilor (europene) deAstragalusaparinnd seciei Dissitiflori.

Fig. 3. Imaginile inflorescenei taxonilor selectai aparinnd seciei Dissitiflori a genului Astragalus.1 - A. peterfii, 2 - A. pseudoglaucus, 3A - A. vesicarius subsp. albidus, 3B - A. vesicarius subsp.pastellianus, 4 -A. varius, 5 -A. tarchankuticus, 6 -A. pallescens, 7 -A. ucrainicus, 8 -A. subuliformis, 9 -

A. asper. (Fotografii fcute de Bartha Lszl cu excepia celei deA. peterfiifcut deMolnr V. Attila)


11/31

11

Principalele obiective ale tezei:

gsirea sau dezvoltarea de markeri moleculari pentru genul Astragalus suficient devariabili pentru rezolvarea nrudirilorspeciilor la nivel de secie.

avansarea unei prime ipoteze filogenetice pentru speciile europene de Astragalusaparinnd seciei Dissitifloribazat pe secvene plastidiale.

estimarea diversificaiei seciei din Europa n timp. examinarea existenei speciaiei reticulate n secie/gen utiliznd markeri molecular

nucleari.

explorarea rudelor endemitului localA. peterfii. lmurirea/decelarea unui complex probabil de specii cu ajutorul filogeniei de plastid,

date de secvenanuclear i morfometrie multivariat.


12/31

12

Material i metode

Eantionarea taxonilor

Planul de eantionare al taxonilor a vizat includerea a ctor mai multori taxoni europeni

aparinnd seciei Dissitiflori. Pentru a crea un cadru filogenetic mai bun a fost necesar

includerea unor specii din Asia (Asia Mic, Caucaz, Asia Central). Pentru selectarea taxonilor au

fost urmate clasificrile lui Podlech (2008, 2011) i a lui Sytin (2009). Au mai fost incluse dou

specii (A. reduncusi A. subarcuatus) care aparin unei secii strns nrudite cu sec. Dissitiflori,

cea Erioceras. Pentru selectarea outgrupurilor s-au luat n considerare studiile anterioare de

filogenie molecular asupra genuluiAstragalus, cele ale lui Kazempour Osaloo et al.(2003, 2005).

Conform acestor studii, una din speciile strns nrudite cu secia Dissitiflorieste A. dolichophyllus

Pall.(sect. Trachycercis), iar una din speciile nrudite la distan desec. Dissitiflorio constituieA.

glycyphyllos L. (sect. Glycyphyllus). Datorit accesului la materialul vegetal al ambelor specii,

acestea au fost selectate pentru outgroupuri.

Materialul vegetal iextraciaADN-ului

Pentru extracia ADN-ului genomic am folosit att material provenind din ierbare ct i

material proaspt colectat. n ultimul caz, frunzele au fost uscate i stocate n silicagel pn la

momentul extragerii. n cazul unei probe de Astragalus vesicariussubsp.pastellianus , ADN-ul a

fost comandat din banca ADN (Botanical Garden, Berlin-Dahlem). Pentru extracia ADN-ului am

folosit kitul ZR Plant/Seed DNA Kit (Zymo Research) .

Dezvoltarea iselecia markerilor moleculari

Selecia markerilor plastidiali a fost precedat de testarea a cinci regiuni candidate (ndhF-

rpl32, rpl32-trnL, trnH-psbA, accD-psaI andpetA-psbJ) folosind amorsele regsite de la Shaw et al.

(2007). Amplificarea i secvenarea regiunelor trnH-psbA, accD-psaI and petA-psbJ s-a reuit cu

amorsele regsite din literatur. Amplificarea markerilor ndhF-rpl32and rpl32-trnLs-a efectuat cu

o eficien foarte sczut, ns suficient pentru conceperea unor amorse noi tip forward i

reversepentru aceste dou regiuni. n plus, fa de cele cinci regiuni menionate pn acum, au

mai fost concepute amorse noi specifice familiei Fabaceaepentru o poriune de aprox. 1.5 kbde

la sfritul 3 a regiunii plastidiale ycf1 (hypothetical open reading frame 1) pe baza secvenelor

ycf1 de CicerL., GlycineL., MedicagoL. and PhaseolusL. ycf1 regsite nGenBank.


13/31

13

Dintre cele ase regiuni testate ycf1, ndhF-rpl32 i rpl32-trnLau prut a fi cele mai variabile,

prin urmare ele au fost alese pentru investigaii urmtoare.

n ceea ce privete markerii nucleari, am nceput s lucrez cu regiunea popular nrITS i am

ncercat s dezvolt un marker nuclear tip single/low-copy pentru genulAstragalus. Acesta a fost

regiunea LEAFY (LFY) care s-a demonstrat a fi singly-copy n studii anterioare la diferite grupe de

plante (Zimmer and Wen, 2012), i referinele incluse). Trstura single-copya markerului LFY a

fost testat pentru cteva specii diploide (A. hispanicus, A. varius, A. vesicariussubsp. albidus).

Dup primele reaciiPCR, secvenri i clonri, a rezultat c acest marker nu este single-copyn

genulAstragalus: trei copii/paraloage au fost identificate n cazul celor trei specii menionate mai

sus. Prin urmare, utilizarea acestui marker a fost omisdin investigaii urmtoare.

Au fost analizai markerii plastidiali ADN provenind de la cte un specimen pentru fiecare

specie, n timp ce regiunea nrITS a fost eantionat de la cel puin douspecimene per specie.

Datele ADN plastidiale au fost suplimentate cu date ADN nucleare provenind de la specii cu

taxonomie incert sau poziie filogenetic necunoscut (vezi seciuneaConsideraii teoretice).

Clonarea i secvenarea

Secvenarea direct a regiunii nrITS a relevat peak-uri duble clar vizibilepentru majoritatea

probelorsugernd astfel prezena a mai multor tipuri de sevenn individul respectiv. Pentru a

detecta variabilitatea intra-individuala regiunii nrITS, s-a realizat clonarea folosind kitul pGEM-TVector System I (Promega) pentru ligare i kitul GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) pentru

izolarea ADN-ului plazmidial. Regiunea nrITS a fost clonat din 23 probeaparinnd a21 populaii

(12 taxoni) cu o medie de7.82.5 secvene clonate per specimen.

Toate secvenrile ADN au fost efectuatela Macrogen Inc. (Coreea de Sud).

Analize filogenetice

Alinierea secvenelor ADN

Secvenele ndhF-rpl32, rpl32-trnL i clonele nrITS au fost exportate direct din

cromatograme n fiiere de format FASTA folosind ChromasLite v.2.01 (Technelysium Pty).

Fragmentele ycf1 ale aceleiai probe taxonomice (obinute cu diferite amorese interne de

secvenare) au fost asamblate utilizndBioEdit (Hall, 1999).

Secvenele au fost aliniate n MEGA5 (Tamuraet al., 2011)pe baza algoritmuluiClustalW

urmat de editri manuale n cazul regiunilor ADN plastidiale.n cazulycf1, pe parcursul coreciilor

manuale ale alinierii, poziiile codon au fost luate n considerare. Translaia pentru aceasta


14/31

14

regiune a fost realizat n MEGA5 folosind codul plastidului plantei i a condus la o aliniere

neconinnd codoni STOP.

SecvenelenrITS clonate care au prezentat deleiineateptat de lungi i/sau multe mutaii

punctiformeau fost clasificate ca pseudogene i excluse din analizele urmtoare.

Reconstrucia arborilor filogenetici pe baza secvenelor plastidiale

Pentru o mai simpl abordare, matricile plastidiale separate au fost analizate doar pe baza

criteriului parcimoniei cu scopul de a nelege capacitatea de rezolvare a acestor markeri i de a

releva posibilele semnalele conflictuale dintre acestea. Prin urmare, topologiile arborilor strict

consensus derivate din analiza PM matricilor plastidiale separate au fost n primul rnd

comparate. Strategia a constat n aplicarea diferitelor metode de reconstrucie (parcimonie

maxim (PM), inferen Bayesian (IB) i maximum likelihood (ML)) doar pentru un set final

combinat care exclude speciile cu poziii puternic contrastante ntre arborii strict consensus a

regiunilor plastidiale separate(cu sau fr suport statistic).

MrModeltest v2. (Nylander, 2004)a fost utilizat pentru selectarea modelelor de substituie

a nucleotidelor pentru cele trei regiuni ADN folosind criteriul AIC. Analiza Bayesian a fost fcut

pe un set partiionat cu modele de substituie a nucleotidelor date n Tabelul 5 , constnd n dou

analize simultane de 10.000.000 generaii de Monte Carlo Markov lanuri, salvnd fiecare al

10.000 arbore ntr-un fiier. Fiecare analiz a folosit 4 lanuri simultane (unul rece i altele trei

nclzite la un parametru de nclzire de 0.2). Phylograma consens Majority Rule de 50% a fost

generat nMrBayes folosind 25% caburn-in.

Analiza parcimoniei maxime s-a realizat n PAUP* i a fost bazat pe cutarea euristic

utiliznd 1000 de adiii aleatorii de secvene replicate i cu setrile tree bisection-reconnection

(TBR) branch swapping i cu opiuneaMULTREES activ, MAXTREES setatla 50.000 i o limit

de 10 arbori reinui pentru fiecare replic. Caracterele au fost tratate egal iar breele au fost

tratate ca informaii lips. Suportul statistical nodurilor arborilor a fost evaluat pe baza metodei

Bootstrapp; 1000 pseudo-replici au fost realizate nPAUP*cu MAXTREES (re-)setatla 1000 i cu

reinerea unui arbore per replic.

Analiza maximum likelihood s-a bazat pe RAxML (Stamatakis, 2006) folosind RAxML GUI

versiunea 1.2 (Silvestro and Michalak, 2011)utiliznd modelul GTR + a evoluiei secvenelor.

Toate cutrile euristice i analizele Bayesiene au fost realizate pe University of Oslo

Bioportal (https://www.bioportal.uio.no/). Arborii filogenetici au fost vizualizai i editai n

TrieeView (Page, 1996), versiunea FigTree 1.3.1 (A. Rambaut; http://tree.bio.ed.ac.uk

/software/figtree/), MrEnt(Zuccon and Zuccon, 2006)iCorelDRAW X3.


15/31

15

Analiza reelelor nrITS

Datorit numrului mare de clone i prezenei paraloagelor nrITS divergente n unele

probe, s-au abordat prioritar reelele filogenetice n analiza nrITS naintea arborilor filogenetici.

Programul Collapse v.1.2 (Posada, 2006) a fost folosit pentru definirea tipurilor unice de

secvene (ribotipuri) n setul nrITS i pentru evaluarea distribuiei acestor ribotipuri n i ntre

indivizi. Tipurile unice de ribotipuri definite au fost mai apoi incluse n analiza parcimoniei reelei.

Analizadistance network(split graphs) a fost fcutpentru matricea ribotipurilor cu scopul

de a contura posibilele grupri din setul nrITS i pentru a evalua ncrederea n grupri folosind

Bootstrapping cu 1000 de replicaii. Reeaua filogenetic construit n acest scop a fost bazat pe

algoritmulNeighborNet (NN)(Bryant and Moulton, 2004)aa cum a fost implementat n SplitsTree

v.4.10 (Huson and Bryant, 2006)folosind distane necorectatepairwise(p), excluznd caracterele

constante i irelevante (non-informative).

Rezultate

Succesul secvenrii i alinierea secvenelor

Regiunile plastidialeycf1, ndhF-rpl32 irpl32-trnL

Amplificarea i secvenarea ycf1 a fost fcut cu succes n cazul fiecrei (47) specii int

Astragalus plus Oxytropis pilosa. Regiunea ycf1 flancat de amorsele de amplificare a fost

complet recuperat prin asamblarea fragmentelor obinute prin secvenarea intern a primerilor

care aparineau aceleai probei taxonomice. Lungimea regiunii asamblate a variat de la 1460 de

perechi de baze(A. argyroides) la 1517 perechi de baze(A. zingeri).

Amplificarea ndhF-rpl32 irpl32-trnL a euat n cazul mai multor, n principal probe de la

ierbar, conducnd la un numr maxim de 11 secvene lips n cazul rpl32-trnL. Caracteristicile

secvenelor regiunilor plastidiale i evalurile cutrilor euristice PM sunt prezentate pe scurt n

Tabelul 5.

nrITS

Matricea original nrITS aliniat coninea 181 secvene, 598 caractere i 56 situri

nucleotidice variabile. Programul Collapse a recuperat 54 ribotipuri unice din cele 181 de clone

nrITS.


16/31

16

Table 5. Caracteristicile secvenelor i evaluarea cutrilor euristice a setului de plastid

ycf1 ndhF-rpl32 rpl32-trnL combinate

lungimea secvenei 14601517 630704 738809

lungimea alinierii 1553 803 915 3271

nr. de secvene lips 0 7 11 18

nr. de situri variabile 128 51 45 159

nr. de situri informative parcimonic 45 11 9 65

nr. arborilor cei mai parcimonioi 27559

lungimea arborelui 276

CI 0.8696

RI 0.9130

modelul evolutiv al secvenelor (subAIC) GTR+G+I GTR GTR GTR+G+I/GTR/GTR


17/31

17

Reconstrucia arborilor filogenetici bazat pe secvenele plastidiale

Cutarea euristic a setului de date plastidiale combinat i complet, conform criteriului

parcimoniei a furnizat 27559 arbori egali parcimonic cu 276 pai n lungime. Cladele A i B (

revelate deja de analizele anterioare a matricilor de date separate) au fost recuperate cu un

procentaj Bootstrapmare(87% irespectiv 96%). Includerea/excludereaA. medius,A. reduncusi

A. ucrainicusn clada A nu a fost consistent pe parcursul analizelor parcimonice a datelor

plastidiale separate. Pentru acest arbore, totui, aceste specii sunt ferm excluse din foarte bine

confirmata clad A. Cladele A i B mpreun cu o a treia clad (cuprinzndA. fissuralis, A.

subuliformis iA. ucrainicus) plus trei specii adiionale (A. balkaricus, A. medius iA. reduncus)

aparin unei politomii bazele nesusinute statistic. Aceast politomieeste sor cu A. argyroides

care nsi se ramific dupA. dolichophyllus i prin urmareA. argyroides constituie prima

genealogie divergent aspeciei Dissitiflori. Clada A se ramific n mai multe subclade unele dintre

ele fiind denumitentr-o manier succesiv (de exemplu cladele A, A1, A1.1). Clada B nu fost

rezolvat la fel de bine precum cladaA.

n ambele clade A i B exist numeroase relaii surprinztoare ce merit a fi menionate.

Astragalus subarcuatus (clasificat tradiional n sect. Erioceras) a fos dedus cu o ncredere

statistic nalt (BS=94%) ca sor cuA. temirensis. Alt taxonErioceras(A. reduncus) este parte a

anterior menionatei politomii bazale.

Cea mai surprinztoare relaie din clada B const n relaia de nrudireputernic susinut

(BS=91) a celor dou specii(fiind egal cu clada B1).

Examinarea atent a cladelor (i a distribuiei speciilor) a dus la recunoaterea faptului c

cladele A, B i B1 indic a larg structur geografic: clada A are o distribuie predominant Est

European ('clada estic') n timp ce clada B (excluznd clada B1) are o distribuie majoritar

Mediterranean('cladsud-vestic'), iar clada B1 este clar limitat la Europa de Esti Asia.

Topologiafilogramei consensderivat din analizaBayesian este larg congruent cu cea a

arborelui PM strict consensus. Cladele A, B i B1 sunt puternic consistente n ceea ce privetearborii parcimoniei i analizei Bayesiene din punctul de vedere al coninutului speciei i a

suportului statistic al nrudirilor intrinseci. Ramura lung a arborelui Bayesian ce o duce la

politomia cladei B is este evident mult mai lungfa de restul ramificaiilor interne ale arborelui.


18/31

18

Fig. 9. Compararea schematic a topologiilor parcimoniei maxime i a celei Bayesiene. Numereleadiacente ramurilor/cladelor reprezint procentajul Bootstrap i valorile probabilitii posterioare

Bayesiane. Speciile cuprinse i nrudirile dintre acestea n cadrul cladelor A, B iB1 sunt prezentate namnunt n teza de doctoratele fiind confideniale.

Network analysis of nrITS sequences

Analiza NeighborNet a ribotipurilor (Fig. 13) a indicat o evoluie non-tree-like a

secvenelor indicnd c procese evoluionare mai complexe au acionat. apte grupuri pot fi

separate n reea(denumite de la A laG), care corespund cu gruprile delimitate n reeaua TCS.

Astfel, coninutul secvenelor gruprilor din reeleleTCS iNeighborNetau corespuns.

Valorile Bootstrap au fost mari (BS=89-100%) pentru cinci din cele 7 grupuri i joase pentru

grupurile de ribotipuriE (BS=64%) i(BS=66%).

Grupul A a fost cel mai segregat din punct de vedere topologic n graficele split

NeighborNet i cel mai susinut din punct de vedere statistic(BS=100%) dintre toate gruprile.

Secvenele nrITS obinute de la A. asper, A. ucrainicusi A. vesicarius au aparinut fiecare

unui singur grup de ribotip (C, G, i respectiv E), n timp ce secvenele celorlalte 5 specii s -au


19/31

19

grupat n 2-4 grupuri diferite. Astragalus peterfii conine cel mai mare numr de grupuri de

ribotipuri identificate; cu toate acestea, un numr incomparabil mai mare de clone a fost

secvenat n cazul acestei specii.

Numrul speciilor diferite care au n comun un grup de ribotip au variat de la dou la patru.

Secvenele din grupurile de ribotipuriC i F au aparinut exclusiv unei specii(A. asper, i respectiv

A. varius) n timp ce restul grupurilor de ribotip au fost comune pentru specii diferite. Interesant

de menionat, este c grupurile A i B sunt grupurile de ribotip dominante aA. pallescens, A.

peterfiiiA. pseudoglaucus.

Frecvena secvenelornrITS aparinnd unui grup dat de ribotip n cadrul speciei a indicat

diferene considerabile. Unele grupuri au fost mai caracteristice pentru anumite specii prin

includerea mai multor secvene din specia respectiv, de exemplu grupul de ribotip E cuprinde

secvenele recuperate n special de laA. vesicarius(grupul de ribotip specific vesicarius).


20/31

20

Fig. 13. Reeaua filogenetic bazat peanaliza NeighborNet a ribotipurilor. Secvenele au fostgrupatepe baza similaritii genetice i suntredate cu majuscule de la A la G. Valorile reprezint

procentajeleBootstrap a 1000 replicaiiBootstrap.


21/31

21

Discuii

Filogenia speciilor Astragalus aparinnd seciei Dissitiflori din

Europa: implicaii biogeografice i estimarea diversificrii de-a

lungul timpului

Prima ipotez filogenetic plastidialpentru speciile Europene ale genuluiAstragalussect.

Dissitifloris-a bazat pe o eantionare comprehensiv i a relevat mai multe aspecte neateptate

ale diversificrii acestui grup. Structura geografic larg dezvluit pentru cladele A, B i B1 a

indicat trei mari patternuri biogeografice pentru aceast secie: o distribuie major Est

european i asiatic reprezentat de clada A, o distribuie majoritar mediterranean (care se

extinde pnn Europa Central-Vestici nCaucaz) reprezentat de cladaB (exclznd cladaB1) i

o minor ramificaie a cladei B(clada B1) reprezentnd distribuiaEst europeaniasiatica celor

dou specii surori. Iniial a fost tentant avansarea ipotezei unei diversificaii mai timpurii pentru

clada A spre deosebire de cladaB, i a unei diversificaii mai rapide a cladeiB comparate cu clada

A. Argumentele acestei ipoteze sunt urmtoarele: rezoluia mai mare (cu nrudiri mai puternic

susinute) a cladei A comparate cu politomia nerezolvat a cladei B i ramura lung ducnd la

clada B comparat cu ramurile interne scurte ale cladei A (reflectate de ex. de filograma

maximum likelihooda secvenelor plastidiale).

Politomiile (lipsa rezoluiei) arborilor filogenetici (n special la noduri adnci) sunt n general

privite drept consecine a speciaiei rapide, utilizarea markerilor inadecvai(insuficient variabili)

sau conflicte de caractere date de speciaia multifurcat(Riggins and Seigler, 2012).n cazul cladei

B, speciaia multifurcat este exclus deoarece markerii plastidiali aparin aceluiai grup de

linkeage i este foarte posibil smprteasc aceeai istorie filogenetic. Combinaia a trei

markeri plastidiali folosii a fost eficient pentru o clad (A) dar nepotrivit pentru cealaltclad

(B) a unui moderat de mare grup taxonomic. Aceasta implic o mai rapid speciaie a speciilor din

clada B comparat cu speciile din clada A sau eterogenitatea n rata de substituie a nucleotidelor

specific cladelor, un fenomen ntlnit la plante(Wenget al., 2012). Caracteristica n general mai

puin rezolvat a cladei B se datoreaz de fapt divergenei (variaiei) secvenelor din aceast

clad, fapt confirmat de asemenea de analiza pairwise a distanelor ntre secvene. Distanele

pairwise calculate n Mega 5.0 cu modelul Maximum Composite Likelihood au variat ntre

0.0010.005 (medie general0.003)n cazul cladei B, pe cnd n cazul cladeiA aceast valoare s-a

nscris ntre0.0010.012 (media general 0.005).

n final, un cadru temporal mai restrns n care clada B e posibil s se fi divergat nu a fost

confirmat de analiza ceasului molecular. Conform uneia dintre cronogramele rezultatediversificarea ambelor clade a avut loc n Pleistocen. n cadrul cladei B vrsta cea mai tnr


22/31

22

(crown) a fost dat cladei B1 (aproximativ 500.000 ani), n concordan cu ipotetizata ramificare

'secundar' a cladei B conform diversificrii a dou specii din Europa de Est/Asia.

Statutul non-monofiletic al seciilorDissitiflorii Erioceras

Ambele specii ale sect. Erioceras, selectate iniial pentru outgroup, sunt nseraten sect.

Dissitiflori determinnd caracterul non-monofiletic (parafiletic) al celei din urm. Astragalus

subarcuatuseste profundnseratn clada Ai a fost rezolvat cu un mare suport statistic (MP

BS=94%, BI PP=1.00, ML BS=98%)ca sor aA. temirensis,n timp ceA. reduncuseeste printre cele

mai devremederivate specii a filogeniilor plastidiale, ramificate mai trziu dect speci i Dissitiflori

(e.g.A. argyroidesiA. balkaricus)pe baza filogramei maximum likelihood. Cu scopul de a obine

monofiliasect. Dissitiflori, ambele specii trebuie transferate n aceast secie. Darinvestigaii mai

comprehensive sunt necesare pentru delimitarea acestor secii nainte de a se realiza redefinirea

lor. Mai multe specii din centrul de diversificare a seciei Dissitiflori trebuie incluse i secia

Eriocerastrebuie de asemenea eantionat mai detaliat.

n cazul unei eventuale redefiniri a sect. Dissitiflori, trebuie luat n considerare diferitele

alternative ce conduc la o secie mai larg vs. mai restrns definit. O abordarea mai larg ar

implica includerea speciilor de Erioceras taxa, n timp ce divizarea seciei recunoscute actual n

secii/subsecii ar implica asociaii taxonomice, de exemplu foarte compactei clade B. Urmnd

monofilia, diagnosticabilitateamorfologiceste un important criteriu auxiliar pentru clasificareagrupurilor (Chatrou et al., 2012). Astfel pn la identificarea unui caracter morfologic sau unei

combinaii de caractere care s susin aceast clad, orice ncercri de a-i acorda un poziie

taxonomiccladei B nu are fundament. Pe de alt parte, deciziile taxonomice nu ar trebui luate

exclusiv pe baza filogeneniilor plastidiale. Crearea unei filogenii fundamentale bazate pe cel puin

un marker nuclear low-copyeste foarte recomandat.

Urmrirea unor caractere morfologice pe clada B nu a dus la recunoaterea a cel puin unui

caracter constant care s poat servi ca sinapomorfie pentru aceast clad n comparaiile

membrilor cu, de exemplu speciile cladei A. Ca un pas urmtor, asfel de caractere adiionale

(calitative) morfo-anatomice, care sunt considerate a nu fi influenate de factorii environmentali,

ar trebui investigate. Micromorfologia polenului ntrunete acest criteriu i este recomandat n

studiul comparatic al speciilor cuprinse n cladele A i B.


23/31

23

Fig. 17. Fotografii a foliolelor speciilor selectate asect. Erioceras (1 - A. reduncus; 2 - A. subarcuatus) isect. Dissitiflori(3 -A. temirensis; 4 -A. pseudoglaucus; 5 -A. vesicarius; iA. peterfii) pentru a evideniadiferenele de caracteren indumentumdintre cele dou secii.

Speciaie reticulat i evoluia incomplet conjugat a nrITS-ului

nAstragalussecia Dissitiflori

n ciuda contribuiilor majore n filogeniaAstragalusi genului sorOxytropis, bazat parialsau total pe nrITS, studiile (Wojciechowskiet al., 1999;Jorgensenet al., 2003; Kazempour Osaloo

et al., 2003, 2005;Wojciechowski, 2005;Kazemiet al., 2009;Archambault and Strmvik, 2012),

nu raporteaz clonarea acestui marker. Astfel, prezentul studiu poate fi considerat ca prima

lucrare ce prezint paralogie serioas a regiunii nrITS ntr-un grupAstragalus folosind clonare

extensiv. Scherson et al.(2005)a investigat noi regiuni nucleare pentru reconstrucia filogeniei la

nivele taxonomice joase nAstragalus din Lumea Nou. Au confirmat prin clonare, prezena unor

diferite copii a dou regiuni nucleare (ARG10 iFENR) iSNPs n locusul nuclear tRALS n unele

specii Astragalus din America. Acest tipar a fost interpretat totui, ca o consecin a


24/31

24

evenimentelor de duplicaie, i prezena aleleor la regiuniledate, fr semnificaie filogenetic.

Prin urmare, interpretarea noastr a prezenei paralogiei nnrITS nAstragaluseste prima care ia

n considerare reticulaia ca o posibil surs a paralogiei.Mai mult, structura reticulat anrITS n

poliploiziiA. pallescens(2n=32 (Philippovet al., 2008)),A. peterfii(2n=64(Ledingham and Rever,

1963)) iA. pseudoglaucus (2n=64 (Pavlova and Kozhuharov (1993), under A. glaucus)) este

sugestiv pentru originea lor alopoliploid. Astfel, alopoliploidia laAstragaluseste pentru prima

dat avansat ca ipotez bazat pe informaiilemoleculare.

Structura reticulat a setului de date nrITS sugereaz puternic c procesele evoluionare

diferite de ramificaii dihotomice au avut loc n secia Dissitiflori. Persistena simultan a

grupurilor dominante de ribotipuri A i B ntr-un singur genom indic evoluia incomplet

conjugat (Campbellet al., 1997) a nrITS. Copiile A i B pot persista n posibilii parentali sau n

descendenii lor formnd un grup unic de ribotip(un singur grup per specie, conform conceptului

actual). Evoluia ntrziat sau incomplet conjugata fost ndelungcunoscut la alte grupuri de

plante (ambele cu diploide sau poliploide). Exemple clasice ale evoluiei incomplet conjugate n

ceea ce privete ADN ribozomal nuclear includ Amelanchier (Campbellet al., 1997), Arabidopsis

suecica (O'Kane et al., 1996), Brassica napus (Bennett and Smith, 1991), Paeonia (Sang et al.,

1995)dar noi cazuri sunt n continuare descoperite i se pare c omogenizarea incomplet a nrITS

este regula mai curnd dect excepia (Liu et al., 2006). Factori precum prezena array-urilor

diferite de nrITS la diferii cromozomi (de exemplu datorit alopoliploidiei), reproducereaasexuat, i habitatul peren (Sang et al., 1995; Campbell et al., 1997) pot promova susinerea

polimorfismului nrITS (de exempluprin mitigarea crossing over-ului (Hilliset al., 1991)).

Originea i nrudirile laA. peterfii

Rezultatele prezentului studiu sugereaz o origine alopoliploid a Astragalus peterfii

datorit prezenei a patru grupuri de ribotipuri distincte nrITS n genomul acestei specii

octoploide care este slab compatibil cu o origine exclusiv autopoliploid. n ceea ce privete

nrudirile moleculare filogenetice, filogenia plastidial a plasat A. peterfii cu A. pallescens iA.

tarchankuticus. Din aceste dou specii, totui, doar A. pallescens mprtete grupurile

dominantede ribotipurinrITS (tip A iB) cu A. peterfii, i mai mult, cu un aparent similarraport.

Analiza multipl discriminanta 14 caractere cantitative morfologice ale plantelor colectate depe

teren, totui, a relevat suprapunere substanialmorfologicntreA. peterfiiiA. pallescens, i o

distincie complet ntreA. peterfii iA. pseudoglaucus, iA. peterfii vs. A. tarchankuticus.

Considernd cele trei tipuri de informaii date mai sus , se poate concluziona c din setul de

taxoni studiai,A. pallescenseste cea mai apropiat rud aA. peterfii. Pentru crearea unei ipotezemai puternice pentru nrudirile filogenetice a A. peterfiieste necesar folosirea genelor nucleare


25/31

25

low-copy, care sunt mai puin susceptibile de a avea o evoluie conjugat (Zimmeret al., 1980;

Hilliset al., 1991).

Implicaii taxonomice pentru specii selectate din sect. Dissitiflori

Distribuia grupurilor de ribotipuri specifice n cadrul speciilor, n legtur cu filogenia

plastidial i informaiile derivate din analiza morfometriei multivariate, permit formularea unor

concluzii asupra taxonomiei acelor specii pentru care incertitudinile taxonomice au fost

evideniate n capitolul Introducere. De exemplu, toate secvenele nrITS a A. vesicarius aparin

grupului de ribotipuri E, secvenele nrITS a A. pseudoglaucus iA. pallescens sunt regsite n

principal n cadrul grupurilor A iB, ultimele dou specii difer n ceea ce privete plasarea n

filogenia plastidial i sunt degregate prin analiza morfometric multivariat.

Sinonimizarea specieiA. peterfii cu taxonul A. vesicarius subsp. pastellianus este nu este

susinut nici de plastid, nici de secvenele de nrITS. Aceasta, totui, nu infirm faptul c A.

vesicariusa putut contribui la formarea speciei de interes deoarece grupul de ribotipuri E (ntr-o

mic msur) a fost recuperat de asemenea de laA. peterfii.

Situaia este oarecum similar n cazul taxonilor A. pseudoglaucusiA. tarchankuticus. A.

pseudoglaucusa fostsinonimizatcu A. vesicariusde Ciocrlan iSrbu (2001)iPodlech (2011).

Dup prerea mea, includerea taxonului A. pseudoglaucusnA. vesicarius este neltoare i

infirmat de secvenele nrITS. Cu toate acestea,A. vesicarius poate fi implicat n formareaspeciei avnd rolul de donor de plastid ADN. Diferena semnificativ ntreA. pseudolaucusi A.

vesicariuscu privire la structura nrITS i poziia filogenetic este compensat de suprapunerea lor

n morfologie care susinediversitatea genetic ascuns n acest grup taxonomic.

Independena taxonomic ataxonuluiA. tarchankuticuseste de asemenea sprijint n ceea

ce privete A. albicualis cu care a fost sinonimizat (Podlech, 2011). Cele dou probe de A.

tarchankuticusau o secven nrITS clonat n grupul deribotipuri E i au majoritateasecvenelor

nrITS n grupulG. Contrar acesteia, secvenele nrITS ale celor dou probeA. tarchankuticussunt

grupate majoritar n grupurileA iDntr-un raport similar.

O alt consecin a diferenierii grupurilor de ribotipuri este confirmarea molecular a

complexului de specii dinseciaDissitiflori, format dinA. pallescens,A. peterfii,A. pseudoglaucus,

iA. tarchankuticus. Toate aceste specii au grupul de ribotipuriA ca presupus miez al array-urilor

nrITSi sunt cunoscute ca poliploizicu excepiaA. tarchankuticus.


26/31

26

Importana utilizrii combinate ale secvenelor ycf1, ndhF-rpl32 i

rpl32-trnL n filogenia speciilor deAstragalus

n prezentul studiu, regiunile plastidiale ycf1, ndhF-rpl32 i rpl32-trnL au fost folosite la

filogeniaAstragaluspentru prima dat. Scopul principal al folosirii acestor markeri a fost inferenarelaiilor de nrudire exclusiv la nivele taxonomice reduse (de exemplu la nivel intrasecie). Prin

urmare, variabilitatea lor este greu comparabil cu cea a markerilor plastidiali deja folosii la

nivele taxonomice mai nalte (de exemplu la nivele generice ori inter-secionale) n filogenia

Astragalus: trnL intron (Wojciechowskiet al., 1999), ndhF gene (Kazempour Osalooet al., 2003),

trnL-F region (Kazemiet al., 2009). Comparaia recent realizat de Dong et al.(2012)ntre23 de

regiuni plastidiale (printre altele, ycf1 irpl32-trnL, dar omindndhF-rpl32) a determinatycf1 ca

cel mai variabil, urmat de trnK i rpl32-trnL, confirmnd astfel potenialul acestor regiuni n

inferena filogenetic la plante.

n ciuda faptului cycf1+ndhF-rpl32+rpl32-trnL nu au putut decela speciile clar divergente

precumA. tarchankuticusde A. peterfii, au fost suficient de variabili pentru a delimita o serie de

clade bine susinute din secia Dissitiflori (vezi capitolul Rezultate) i chiar n complexul

recunoscut de specii.n opinia noastr, cele trei regiuni plastidialefolosite n acest studiu prezint

potenial pentru studii filogenetice nAstragalus, cum ar fi delimitrile seciilor.


27/31

27

Concluzii

Analiza filogenetic combinat a trei regiuni plastidiale eantionate n speciile europenede Astragalus aparinnd seciei Dissitiflori a furnizat o rezoluie suficient pentrudeducerea concluziilor ferme referitoare la diversificaia acestui grup taxonomic in

Europa.

Trstura cea mai important a filogeniei o constituie o ramificaie evolutiv ancestralrezultnd n dou clade principale(A i B). Apartenena speciilor la cladele A, B i B1 este

congruentcu distribuia lor geografica: clada A reflectnrudirea unor specii distibuite

mai mult n Europa de Est si Asia; clada B (exclusiv clada B1) reprezintnrudirea unor

specii de distribuie predominant mediteraneean, n timp ce clada B1 (a ramificaie

secundar a cladei B) reprezintnrudirea surprinztoare a dou specii, ambele cu o

distribuie contrastde Europa de Est i Asia.

Incongruena ntre filogenia plastidial i poziia filogenetic a speciilor aparinndtaxonului A. vesicariuss.l. pe arborele filogenetic bazat pe secvene nrITS sugereaz c

cladele A i B au interacionat n trecut sub forma hibridrii.

Secia Dissitiflorinu e monofiletic pentru c cele dou specii incluse din sec. Eriocerassunt nserate n filogenia seciei Dissitiflori.

Structura reticulat a markerului nrITS ntr-un grup de specii poliploide cu istoriecontroversat a nomenclaturii lor (A. peterfii, A. pallescens, A. pseudoglaucus, A.

tarchankuticus) susine originea lor alopoliploid. Structura reticulat a markerului nrITS a

fost dezvluit pentru prima dat la genul Astragalusn cadrul acestei teze de doctorat,

iar paralogia unui marker nuclear a fost explicat prin hibridare din trecut pentru prima

dat aici.

Diferenierea grupelor ribotipurilor n combinaie cu filogenia de plastid i analizamultivariat a caracterelor morfologice s-au dovedit n combinaie a fi o unealta util n

justificarea independenei taxonomice a unor specii cu statut taxonomic incert in secia

Dissitifloria genuluiAstragalus.


28/31

28

Referine

Alfaro, M. E., and Holder, M. T. 2006. The posterior and the prior in Bayesian phylogenetics.Annual Review of Ecology,Evolution, and Systematics. 37: 19-42.

lvarez, I., and Wendel, J. F. 2003. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Molecular Phylogeneticsand Evolution. 29(3): 417-434.

Archambault, A., and Strmvik, M. V. 2012. Evolutionary relationships in Oxytropis species, as estimated from thenuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) sequences point to multiple expansions into the Arctic.Botany.

Bdru, A. S., Dezsi, ., and Comes, O. 2000. Cercetri biogeografice asupra speciilor stepice-silvostepice deAstragalusL. din Depresiunea Transilvaniei (I) [A biogeographical study upon the steppe and steppe-woodland species of

AstragalusL. from the Transylvanian Depression (I)]. Studia Universitatis Babe-Bolyai Series Geografica. 45:117-130.

Baldwin, B. G. 1992. Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: Anexample from the compositae. Molecular Phylogenetics and Evolution. 1(1): 3-16.

Bennett, K. D., Tzedakis, P. C., and Willis, K. J. 1991. Quaternary refugia of north European trees. Journal ofBiogeography. 18: 103-115.

Bennett, R. I., and Smith, A. G. 1991. Use of a genomic clone for ribosomal RNA fromBrassica oleraceain RFLP analysisof Brassicaspecies. Plant Molecular Biology. 16(4): 685-688.Borissova, A. 1951. Astragali et Tragachantae Tauriae. Botanicheskie Materialy Gerbariya Botanicheskogo Instituti Imeni

V L Komarova Akademii Nauk SSSR. 14: 213-228.

Borza, T. 1998. Genetic polymorphism of some rare or endemic plants., Universitatea Babe-Bolyai, Cluj Napoca,Romania.

Borza, T., Drago, N., and Clejan, A. 1994. Considerations on some species ofAstragalus L. genus as revealed byelectrophoretic study of seed storage proteins.Contribuii Botanice. 97: 102.

Bryant, D., and Moulton, V. 2004. Neighbor-Net: an agglomerative method for the construction of phylogeneticnetworks. Molecular Biology and Evolution. 21(2): 255-265.

Bunge, A. 1868. Generis Astragali species Gerontogeae. Pars prior. Claves diagnosticae. Mmoires de l'Acadmieimpriale des sciences de St Petersbourg. 11(16): 1-140.

Calonje, M., Martn-Bravo, S., Dobe, C., Gong, W., Jordon-Thaden, I., Kiefer, C., Kiefer, M., Paule, J. R. S., and Koch, M.A. 2008. Non-coding nuclear DNA markers in phylogenetic reconstruction. Plant Systematics and Evolution.

282(3-4): 257-280.Campbell, C. S., Wojciechowski, M. F., Baldwin, B. G., Alice, L. A., and Donoghue, M. J. 1997. Persistent nuclear

ribosomal DNA sequence polymorphism in the Amelanchier agamic complex (Rosaceae). Molecular Biologyand Evolution. 14(1): 81-90.

Chase, M. W., De Bruijn, A. Y., Cox, A. V., Reeves, G., Rudall, P. J., Johnson, M. A. T., and Eguiarte, L. E. 2000.Phylogenetics of Asphodelaceae (Asparagales): an analysis of plastid rbcLand trnL-FDNA sequences.Annalsof Botany. 86(5): 935-951.

Chase, M. W., Williams, N. H., de Faria, A. D., Neubig, K. M., Amaral, M. d. C. E., and Whitten, W. M. 2009. Floralconvergence in Oncidiinae (Cymbidieae; Orchidaceae): an expanded concept of Gomesa and a new genusNohawilliamsia.Annals of Botany. 104(3): 387-402.

Chater, A. O. 1968.Astragalus L. InFlora Europaea. Edited byTutin, T. G., Heywood, V. H., Burges, N. A., Valentine, D.H., Walters, S. M., and Webb, D. A. Cambridge University Press, Cambridge. pp. 108-124.

Chatrou, L. W., Pirie, M. D., Erkens, R. H. J., Couvreur, T. L. P., Neubig, K. M., Abbott, J. R., Mols, J. B., Maas, J. W.,Saunders, R. M. K., and Chase, M. W. 2012. A new subfamilial and tribal classification of the pantropicalflowering plant family Annonaceae informed by molecular phylogenetics. Botanical Journal of the LinneanSociety. 169(1): 5-40.

Ciocrlan, V. 2009. Flora ilustrat a Romniei: Pteridophyta et Spermatophyta [Illustrated Flora of Romania:Pteridophytes and Spermatophytes]. Editura Ceres, Bucureti.

Ciocrlan, V., and Srbu, I. 2001. Taxonomia, variabilitatea i rspndirea unor specii deAstragalus L. n Flora Romniei.[Taxonomy, variability, and distribution of certain Astragalus L. species in the Flora of Romania]. BuletinulGrdinii Botanice Iai. 10: 59-61.

Clement, M., Posada, D., and Crandall, K. 2000. TCS: a computer program to estimate gene genealogies. MolecularEcology. 9: 1657-1659.

Dong, W., Liu, J., Yu, J., Wang, L., and Zhou, S. 2012. Highly variable chloroplast markers for evaluating plant phylogenyat low taxonomic levels and for DNA barcoding. PLoS ONE. 7(4): e35071.

Downie, S. R., Katz-Downie, D. S., and Watson, M. F. 2000. A phylogeny of the flowering plant family Apiaceae based onchloroplast DNA rpl16 and rpoC1 intron sequences: towards a suprageneric classification of subfamily

Apioideae.American Journal of Botany. 87(2): 273-292.Doyle, J. J., Doyle, J. L., Rauscher, J. T., and Brown, A. H. D. 2004. Diploid and polyploid reticulate evolution throughout

the history of the perennial soybeans (Glycinesubgenus Glycine). New Phytologist. 161(1): 121-132.


29/31

29

Drew, B. T., and Sytsma, K. J. 2011. Testing the monophyly and placement of Lepechinia in the tribe Mentheae(Lamiaceae). Systematic Botany. 36(4): 1038-1049.

Drummond, A. J., and Rambaut, A. 2007. BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees. BMC EvolutionaryBiology. 7: 214-222.

Drummond, A. J., Suchard, M. A., Xie, D., and Rambaut, A. 2012. Bayesian phylogenetics with BEAUti and the BEAST 1.7.Molecular Biology and Evolution.

Farris, J. S., Kllersj, M., Kluge, A. G., and Bult, C. 1994. Testing significance of incongruence.Cladistics. 10(3): 315-319.Ghahremani-Nejad, F. 2004. The sections ofAstragalus L. with bifurcating hairs in Iran. Turkish Journal of Botany. 28:

101-117.

Goncharov, N. F., Borisova, A. G., Gorshkova, S. G., Popov, M. G., and Vasilchenko, I. T. 1946.Astragalus. InFlora of theU.S.S.R. Edited byKomarov, V. L., and Shishkin, B. K. Izdatel'stvo Akademii Nauk S.S.S.R., Moscow, Leningrad.pp. 1-918. [Translated from Russian by Israel Prog. Sci. Trans., Jerusalem, 1965.].

Grant, V. 1981. Plant speciation. Columbia University Press, New York.Gurushidze, M., Fritsch, R. M., and Blattner, F. R. 2010. Species-level phylogeny ofAlliumsubgenus Melanocrommyum:

Incomplete lineage sorting, hybridization and trnF gene duplication.Taxon. 59(3): 829-840.Hall, T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows

95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41: 95-98.Hewitt, G. H. 2000. The genetic legacy of quaternary ice ages.Nature. 405: 907-913.Hillis, D., Moritz, C., Porter, C., and Baker, R. 1991. Evidence for biased gene conversion in concerted evolution of

ribosomal DNA. Science. 251(4991): 308-310.

Huson, D. H., and Bryant, D. 2006. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Molecular Biology andEvolution. 23: 254267.

Javanmardi, F., Kazempour Osaloo, S., Maassoumi, A. A., and Nejadsattrai, T. 2012. Molecular phylogeny ofAstragalussectionAlopecuroidei (Fabaceae) and its allies based on nrDNA ITS and three cpDNAs, matK, trnT-trnY andtrnH-psbA sequences. Biochemical Systematics and Ecology. 45: 171-178.

Jvorka, S. 1916.Astragalus peterfiiJv. spec. nova. Schedae ad Flora Hungaricae Exsiccatae. 4: 38-40.Jorgensen, J. L., Stehlik, I., Brochmann, C., and Conti, E. 2003. Implications of ITS sequences and RAPD markers for the

taxonomy and biogeography of the Oxytropis campestris and O. arctica (Fabaceae) complexes in Alaska.American Journal of Botany. 90(10): 1470-1480.

Judd, W. S., Campbell, C. S., Kellog, E. A., Stevens, P. F., and Donoghue, M. J. 2008. Plant systematics: a phylogeneticapproach. Sinauer Associates, Sunderland, MA.

Kazemi, M., Kazempour Osaloo, S., Maasoumi, A. A., and Pouyani, E. R. 2009. Molecular phylogeny of selected OldWorld Astragalus (Fabaceae): incongruence among chloroplst trnL-F, ndhF and nuclear ribosomal DNA ITSsequences. Nordic Journal of Botany. 27(5): 425-436.

Kazempour Osaloo, S., Maasoumi, A. A., and Murakami, N. 2003. Molecular systematics of the genusAstragalus L.(Fabaceae): Phylogenetic analyses of nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacers and chloroplastgene ndhF sequences. Plant Systematics and Evolution. 242: 1-32.

-. 2005. Molecular systematics of the Old WorldAstragalus (Fabaceae) as inferred from nrDNA ITS sequence data.Brittonia. 57(4): 367-381.

Kolarik, V., Zozomov-Lihov, J., and Mrtonfi, P. 2010. Systematics and evolutionary history ofthe Asterotricha groupof the genus Onosma(Boraginaceae) in central and southern Europe inferred from AFLP and nrDNA ITS data.Plant Systematics and Evolution. 290(1): 21-45.

Lavin, M., Herendeen, P. S., and Wojciechowski, M. F. 2005. Evolutionary rates analysis of Leguminosae implicates arapid diversification of lineages during the Tertiary.Systematic Biology. 54(4): 575-594.

Ledingham, G. F. 1960. Chromosome numbers inAstragalusand Oxytropis. Canadian Journal of Genetics and Cytology.2(2): 119-128.

Ledingham, G. F., and Rever, B. M. 1963. Chromosome numbers of some Southwest Asian species ofAstragalusand

Oxytropis(Leguminosae). Canadian Journal of Genetics and Cytology. 5(1): 18-32.Liston, A. 1992. Isozyme systematics ofAstragalusL. sect. Leptocarpisubsect. Californici(Fabaceae). Systematic Botany.

17(3): 367-379.Liu, Q., Ge, S., Tang, H., Zhang, X., Zhu, G., and Lu, B.-R. 2006. Phylogenetic relationships in Elymus(Poaceae: Triticeae)

based on the nuclear ribosomal internal transcribed spacer and chloroplast trnL-F sequences. NewPhytologist. 170(2): 411-420.

Lock, J. M., and Schrire, B. D. 2005. Galegeae. InLegumes of the World. Edited byLewis, G., Schrire, B., Mackinder, B.,and Lock, M. Kew, Richmond, Surrey. pp. 475-487.

Mjovsk, J., Uhrkov, A., Javorkov, D., Miieta, K., Krlik, E., Dbravcov, Z., Ferkov, V., Murn, A., ernukov,D., Hindkov, M., Schwarzov, T., and Zborsk, J. 2000. Prv doplnok karyotaxonomickho prehadu flrySlovenska [Karytaxonomical review of the flora of Slovakia].Acta Facultatis Rerum Naturalium UniversitatisComenianae, Botanica. Suppl. 1: 1-127.

Masoud, S., Zarre, S., and Ismeilzadeh, J. 2009. New chromosome number reports in tragacanthicAstragalus species.Caryologia. 62(1): 30-36.

Neubig, K., Whitten, W., Carlsward, B., Blanco, M., Endara, L., Williams, N., and Moore, M. 2008. Phylogenetic utility ofycf1 in orchids: a plastid gene more variable than matK. Plant Systematics and Evolution. 277(1): 75-84.


30/31

30

Neubig, K. M., Whitten, W. M., Williams, N. H., Blanco, M. A., Endara, L., Burleigh, J. G., Silvera, K., Cushman, J. C., andChase, M. W. 2012. Generic recircumscriptions of Oncidiinae(Orchidaceae: Cymbidieae) based on maximumlikelihood analysis of combined DNA datasets. Botanical Journal of the Linnean Society. 168(2): 117-146.

Nieto Feliner, G., and Rosell, J. A. 2007. Better the devil you know? Guidelines for insightful utilization of nrDNA ITS inspecies-level evolutionary studies in plants. Molecular Phylogenetics and Evolution. 44(2): 911-919.

Nylander, J. A. A. (2004) MrModeltest v2. Program distributed by the author. Evolutionary Biology Centre, UppsalaUniversity. In.

O'Kane, S., Schaal, B., and Al-Shehbaz, I. 1996. The origins ofArabidopsis suecica(Brassicaceae) as indicated by nuclearrDNA sequences. Systematic Botany. 21(4): 559-566.

Page, R. D. M. 1996. Treeview: An application to display phylogenetic trees on personal computers. ComputerApplications in the Biosciences. 12(4): 357358.

Pnzaru, P. 2006. Note sistematiche e distributive relative a Astragalus pastellianus Pollini e a A. peterfii Jv.(Leguminosae) [Taxonomic and distributive notes on Astragalus pastellianus Pollini and A. peterfii Jv.(Leguminosae)]. Bollettino del Museo Regionale di Scienze Naturali di Torino. 23: 721-727.

Parks, M., Cronn, R., and Liston, A. 2009. Increasing phylogenetic resolution at low taxonomic levels using massivelyparallel sequencing of chloroplast genomes. BMC Biology. 7(1): 84.

Pavlova, D., and Kozhuharov, S. 1993. Chromosome numbers ofBulgarian angiosperms. Fitologija. 44: 75-76.Philippov, E. G., Kulikov, P. V., and Knjasev, M. S. 2008. Chisla khromosom vidovAstragalus i Hedysarum (Fabaceae)

flory Rossii [Chromosome numbers ofAstragalusand Hedysarumspecies of the Russian flora]. BotanicheskijZhurnal. 93(10): 1614-1619.

Pirie, M. D., Vargas, M. P. B., Botermans, M., Bakker, F. T., and Chatrou, L. W. 2007. Ancient paralogy in the cpDNAtrnL-F region in Annonaceae: implications for plant molecular systematics. American Journal of Botany. 94(6):1003-1016.

Podlech, D. 1990. Die Typifizierung der altweltlichen Sektionender GattungAstragalusL. (Leguminosae). Mitteilungender Botanischen Staatssammlung Mu nchen. 29: 461-494.

-. 2008. The genusAstragalus L. (Fabaceae) in Europe with exclusion of the former Soviet Union. Feddes Repertorium.119(5-6): 310-387.

-. 2011. Thesaurus Astragalorum: Index of all taxa described within the genus Astragalus L. and other genera butbelonging to the genus Astragalus. Taxa of the Old World and related taxa of the New World, Ludwig-Maximilians-Universitt Mnchen.

Posada, D. (2006) Collapse: Describing haplotypes from sequence alignments, Version 1.2. Available from:http://darwin.uvigo.es/software/collapse.html. In.

Pretel Martnez, A. 1974. IOPB. Chromosome number reports. XLVI. Taxon. 23(5/6): 804-805.Ranjbar, M. 2004.Astragalussect. Dissitiflori(Fabaceae) in Iran. Nordic Journal of Botany. 24(5): 523-531.Ranjbar, M., and Karamian, R. 2002. Taxonomic study ofAstragalussect Erioceras(Fabaceae) in Iran. Additional notes

and key to the species. Nordic Journal of Botany. 22(6): 713-717.Riahi, M., Zarre, S., Maassoumi, A., Kazempour Osaloo, S., and Wojciechowski, M. F. 2011. Towards a phylogeny for

Astragalus section Caprini (Fabaceae) and its allies based on nuclear and plastid DNA sequences. PlantSystematics and Evolution. 293(1): 119-133.

Richardson, J. E., Fay, M. F., Cronk, Q. C. B., Bowman, D., and Chase, M. W. 2000. A phylogenetic analysis ofRhamnaceae using rbcL and trnL-F plastid DNA sequences.American Journal of Botany. 87(9): 1309-1324.

Rieseberg, L. H., and Brunsfeld, S. J. 1992. Molecular evidence and plant introgression. In Molecular Systematics ofPlants. Edited bySoltis, P. S., Soltis, D. E., and Doyle, J. J. Chapman & Hall, New York. pp. 151176.

Riggins, C. W., and Seigler, D. S. 2012. The genusArtemisia (Asteraceae: Anthemideae) at a continental crossroads:Molecular insights into migrations, disjunctions, and reticulations among Old and New World species from aBeringian perspective. Molecular Phylogenetics and Evolution. 64(3): 471-490.

Sang, T., Crawford, D. J., and Stuessy, T. F. 1995. Documentation of reticulate evolution in peonies (Paeonia) using

internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA: implications for biogeography andconcerted evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92(15): 6813-6817.

Scherson, R. A., Choi, H.-K., Cook, D. R., and Sanderson, M. J. 2005. Phylogenetics of New WorldAstragalus: Screeningof novel nuclear loci for the reconstruction of phylogenies at low taxonomic levels.Brittonia. 57(4): 354-366.

Scherson, R. A., Vidal, R., and Sanderson, M. J. 2008. Phylogeny, biogeography, and rates of diversification of NewWorld Astragalus (Leguminosae) with an emphasis on South American radiations. American Journal ofBotany. 95(8): 1030-1039.

Shaw, J., Lickey, E. B., Beck, J. T., Farmer, S. B., Liu, W., Miller, J., Siripun, K. C., Winder, C. T., Schilling, E. E., and Small, R.L. 2005. The tortoise and the hare II: relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences forphylogenetic analysis.American Journal of Botany. 92(1): 142-166.

Shaw, J., Lickey, E. B., Schilling, E. E., and Small, R. L. 2007. Comparison of whole chloroplast genome sequences tochoose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III.American

Journal of Botany. 94(3): 275-288.Silvestro, D., and Michalak, I. 2011. RaxmlGUI: a graphical front-end for RAxML. Organisms, Diversity & Evolution.

http://dx.doi.org/10.1007/s13127-13011-10056-13120.


31/31

Soltis, P. S., and Soltis, D. E. 2009. The role of hybridization in plant speciation.Annual Review of Plant Biology. 60: 561 588.

Stamatakis, A. 2006. RAxML-VI-HPC: maximum likelihood-based phylogenetic analyses with thousands of taxa andmixed models. Bioinformatics. 22(21): 2688-2690.

Stamatakis, A., Hoover, P., and Rougemont, J. 2008. A rapid Bootstrap algorithm for the RAxML web servers.SystematicBiology. 57(5): 758-771.

Stuessy, T. F. 2008. Plant taxonomy: The systematic evaluation of comparative data. Columbia University Press, NewYork.

Swofford, D. L. 2002. PAUP*: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and Other Methods). Sinauer Associates,Sunderland.

Sytin, A. K. 2009. Milk-vetches (Astragalus L., Fabaceae) ofEastern Europe and the Caucasus: systematics, geography,evolution. D.Sc. thesis, Institute of Botany, Russian Academy of Sciences, Sanct-Petersburg, Russia.

Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., and Kumar, S. 2011. MEGA5: Molecular evolutionarygenetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.Molecular Biology and Evolution. 28(10): 2731-2739.

Thompson, J. D. 2005. Plant evolution in the Mediterranean. Oxford University Press, Oxford.Vignal, A., Milan, D., SanCristobal, M., and Eggen, A. 2002. A review on SNP and other types of molecular markers and

their use in animal genetics. Genetics Selection Evolution. 34: 275305.Walker, J. D., and Geissman, J. W. 2009. Geologic time scale.Geological Society of America, GSA Today. 19: 60-61.Wendel, J. F., and Doyle, J. J. 1998. Phylogenetic incongruence: window into genome history and molecular evolution.

In Molecular systematics of plants II: DNA sequencing. Edited by Soltis, D. E., Soltis, P. S., and Doyle, J. J.Kluwer, Dordrecht, the Netherlands. pp. 265296.

Weng, M.-L., Ruhlman, T. A., Gibby, M., and Jansen, R. K. 2012. Phylogeny, rate variation, and genome size evolution ofPelargonium(Geraniaceae). Molecular Phylogenetics and Evolution. 64(3): 654-670.

White, T. J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genesfor phylogenetics. InPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Edited byInnis, M. A., Gelfand, D.H., Shinsky, J. J., and White, T. J. Academic Press, San Diego. pp. 315-322.

Willis, K. J. 1996. Where did all the flowers go? The fate of temperate European flora during glacial periods. Endeavour.20: 110-114.

Willyard, A., Cronn, R., and Liston, A. 2009. Reticulate evolution and incomplete lineage sorting among the ponderosapines. Molecular Phylogenetics and Evolution. 52(2): 498-511.

Wojciechowski, M. F. 2005.Astragalus (Fabaceae): A molecular phylogenetic perspective. Brittonia. 57(4): 382-396.Wojciechowski, M. F., Sanderson, M. J., Baldwin, B. G., and Donoghue, M. J. 1993. Monophyly of aneuploidAstragalus

(Fabaceae): evidence from nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences.American Journal ofBotany. 80(6): 711-722.

Wojciechowski, M. F., Sanderson, M. J., and Hu, J. 1999. Evidence on monophyly ofAstragalus (Fabaceae) and its majorsubgroups based on nuclear ribosomal DNA ITS and chloroplast DNA trnL intron data. Systematic Botany.24(3): 409-437.

Xu, B., Wu, N., Gao, X.-F., and Zhang, L.-B. 2012. Analysis of DNA sequences of six chloroplast and nuclear genessuggests incongruence, introgression, and incomplete lineage sorting in the evolution of Lespedeza(Fabaceae). Molecular Phylogenetics and Evolution. 62(1): 346-358.

Zhang, M., Kang, Y., Zhou, L., and Podlech, D. 2009. Phylogenetic origin of Phyllolobiumwith a further implication fordiversification ofAstragalusin China.Journal of Integrative Plant Biology. 51(9): 889-899.

Zimmer, E. A., Martin, S. L., Beverley, S. M., Kan, Y. W., and Wilson, A. C. 1980. Rapid duplication and loss of genescoding for the alpha chains of hemoglobin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77(4): 2158-2162.

Zimmer, E. A., and Wen, J. 2012. Using nuclear gene data for plant phylogenetics: Progress and prospects. Molecular

Phylogenetics and Evolution. 65(2): 774-785.Zippel, E., and Wilhalm, T. 2009. Origin and relationships ofAstragalus vesicariussubsp.pastellianus (Fabaceae) from

the Vinschgau Valley (Val Venosta, Italy). Gredleriana. 9: 119-134.Zuccon, A., and Zuccon, D. 2006. MrEnt v2.2. Program distributed by the authors. Department of Vertebrate Zoology &

Molecular Systematics Laboratory, Swedish Museum of Natural History, Stockholm.

Cuvinte cheie:Astragalus, Dissitiflori, Erioceras, filogenie, speciaie reticulat, ycf1.

rezumatromantezadedoctorat_barthalaszlo

Documents