Universitatea de Medicin i Farmacie Gr.T.Popa Iai

Facultatea de Farmacie Disciplina de Chimie analitic

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Contribuii la identificarea unor substane medicamentoase prin separare cromatografic i

confirmare spectral, folosind o librrie de spectre pentru o anumit faz mobil

CONDUCTOR TIINIFIC, Prof. univ. dr. Vasile DORNEANU

DOCTORAND, Ing. chim. Jean NEGRU

IAI 2011

Universitatea de Medicin i Farmacie Gr.T.Popa Iai

Facultatea de Farmacie Disciplina de Chimie analitic

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Contribuii la identificarea unor substane medicamentoase prin separare cromatografic i

confirmare spectral, folosind o librrie de spectre pentru o anumit faz mobil

CONDUCTOR TIINIFIC, Prof. univ. dr. Vasile DORNEANU

DOCTORAND, Ing. chim. Jean NEGRU

IAI 2011

i

CUPRINS TEZ

CUPRINS 2 INTRODUCERE 8 Scopul i obiectivele tezei de doctorat 9 CAPITOLUL 1. GENERALITI. STRUCTUR CHIMIC. PROPRIETI CHIMICE I FARMACOLOGICE. 10 1.1. Generaliti 10 1.2. Mecanismele inflamaiei 10 1.3. Tratamentul inflamaiei 11 1.4. Clasificarea AINS 12 1.4.1. Reprezentani 12 1.5. Relaia structur activitate biologic 14 1.6. Aspecte farmacologice generale 15 1.6.1. Farmacocinetic 15 1.6.2. Farmacodinamie 16 1.6.3. Farmacotoxicologie 16 1.6.4. Farmacoterapie 17 1.7. Reprezentani 17 1.7.1. Nimesulid 17 1.7.1.1. Nomenclatur i structur 17 1.7.1.2. Proprieti fizico chimice 18 1.7.2. Meloxicam 19 1.7.2.1. Nomenclatur i structur 19 1.7.2.2. Proprieti fizico chimice 19 1.7.3. Piroxicam 19

1.7.3.1. Nomenclatur i structur 19 1.7.3.2. Proprieti fizico - chimice 19 1.7.4. Tenoxicam 20 1.7.4.1. Nomenclatur i structur 20 1.7.4.2. Proprieti fizico chimice 20 1.7.5. Ibuprofen 21 1.7.5.1. Nomenclatur i structur 21 1.7.5.2. Proprieti fizico chimice 21 1.7.6. Indometacin 22 1.7.6.1. Nomenclatur i structur 22 1.7.6.2. Proprieti fizico chimice 22 1.7.7. Diclofenac sodic 22 1.7.7.1. Nomenclatur i structur 22 1.7.7.2. Proprieti fizico chimice 22 1.7.8. Ketoprofen 23 1.7.8.1. Nomenclatur i structur 23

ii

1.7.8.2. Proprieti fizico chimice 23 1.7.9. Ketorolac 23 1.7.9.1. Nomenclatur i structur 23 1.7.9.2. Proprieti fizico chimice 23 1.7.10. Fenilbutazon 23 1.7.10.1. Nomenclatur i structur 23 1.7.10.2. Proprieti fizico chimice 24

CAPITOLUL 2. ABSORBIA LUMINII DE CTRE COMPUII ORGANICI25 2.1. Originea spectrului UV-VIS 25 2.2. Principiile spectrometriei de absorbie 27 2.2.1. Legea Lambert - Beer 27 2.2.2. Deviaii de la legea absorbiei 28 2.2.3. Sumarea absorbanelor 28 2.2.4. Spectre derivate 29 2.2.5. Acurateea fotometric 31 2.2.6. Absorbia selectiv a luminii 33 2.2.7. Modificri induse de substitueni n spectrele UV ale substanelor organice 34 2.2.8. Efectul conjugrii asupra spectrelor UV-VIS ale substanelor organice 34 2.2.9. Deplasri spectrale cauzate de solvent 35 2.3. Aplicaii ale spectrelor UV-VIS n analiza calitativ 37 2.3.1. Confirmarea identitii 37 2.3.2. Detecia n UVVIS cuplat cu HPLC 38 2.3.2.1. Determinarea lungimii de und optime de detecie 39 2.3.2.2. Biblioteci de spectre 42 2.3.3. Identificarea compuilor separai prin tehnica HPLC 42 2.3.3.1. Identificarea prin cutarea n biblioteca de spectre 42 2.3.3.2. Analiza compusului int utiliznd un tabel de calibrare 43 2.3.3.3. Analiza compuilor int utiliznd o bibliotec spectral 43 2.3.4. Puritatea picului cromatografic 44 2.3.4.1. Tehnici de determinare a puritii picului 45 2.3.4.2. Curba factorului de prag 46 2.3.4.3. Clasificarea unui pic din cromatogram ca fiind pur sau impur 47 CAPITOLUL 3. ANALIZA AINS PRIN CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE NALT PERFORMAN (HPLC) 49 3.1. Generaliti n cromatografia de lichide 49 3.2. Coloanele cromatografice pentru RP-LC 50 3.3. Aplicaii ale metodelor HPLC n analiza medicamentelor 51 3.4. Studiu bibliografic 51

iii

CAPITOLUL 4. EVALUAREA REZULTATELOR VALIDAREA METODELOR DE ANALIZ 57 4.1. Generaliti 57 4.2. Specificitatea / Selectivitatea 58 4.3. Stabilirea lungimii de und de detecie 58 4.4. Identificarea picului corespunztor analitului 58 4.5. Verificarea puritii picului 60 4.6. Liniaritatea 61 4.6.1. Liniaritatea funciei de rspuns 61 4.6.2. Calibrarea rspunsului detectorului 62 4.6.3. Liniaritatea rezultatelor 63 4.7. Limita de detecie i limita de cuantificare 63 4.7.1. Limita de detecie 63 4.7.2. Limita de cuantificare 64 4.8. Intervalul (domeniul) de lucru 65 4.9. Precizia i exactitatea 65 4.9.1. Precizia 65 4.9.1.1. Repetabilitatea 67 4.9.1.2. Precizia intermediar 67 4.9.1.3. Reproductibilitatea 68 4.9.2. Acurateea (Exactitatea) 68 4.10. Robusteea i stabilitatea metodei 69 CAPITOLUL 5. ALEGEREA PARAMETRILOR METODEI DE SEPARARE A AMESTECULUI DE AINS 70 5.1. Studiu bibliografic 70 5.1.1. Metode HPLC pentru analiza Meloxicamului (MEL) 70 5.1.2. Metode HPLC pentru analiza Nimesulidului (NIM) 71 5.1.3. Metode HPLC pentru analiza Diclofenacului sodic (DIC) 72 5.1.4. Metode HPLC pentru analiza Ibuprofenului (IBP) 73 5.1.5. Metode HPLC pentru analiza Ketorolacului (KET) 74 5.2. Material i metod 74 5.3. Studiul caracteristicilor fizico-chimice 75 5.4. Optimizarea lungimilor de und pentru detecia AINS 76 5.5. Selecia lungimii de und adecvate deteciei n UV-VIS 81 5.6. Construcia bibliotecii de spectre individuale 85 5.7. Influena debitului fazei mobile asupra separrii AINS 88 5.8. Influena compoziiei fazei mobile 90 5.9. Influena pH-lui fazei mobile apoase asupra separrii 92 5.10. Condiii finale de separare a amestecului de AINS prin HPLC 93 5.11. Alegerea lungimilor de und pentru detecia AINS n UV-VIS 94 5.12. Condiii finale de determinare a AINS prin HPLC 102

iv

CAPITOLUL 6. VALIDAREA ANALITIC A METODELOR CANTITATIVE PENTRU DETERMINAREA AINS 103 6.1. Caracteristici comune 103 6.2. Validarea metodei HPLC pentru determinarea MEL 103 6.2.1. Stabilirea lungimii de und de detecie 104 6.2.2. Identificarea picului corespunztor MEL 104 6.2.3. Linearitatea 106 6.2.4. Date statistice 108 6.2.5. LOD i LOQ 110 6.2.6. Precizia 110 6.2.6.1. Repetabilitatea 110 6.2.6.2. Precizia intermediar 112 6.2.6.3. Exactitatea (acurateea) 114 6.2.7. Concluzii referitoare la determinarea MEL prin HPLC 115 6.3. Validarea metodei HPLC pentru determinarea PIR 115 6.3.1. Stabilirea lungimii de und de detecie 116 6.3.2. Identificarea picului corespunztor PIR 116 6.3.3. Linearitatea 118 6.3.4. Date statistice 119 6.3.5. LOD i LOQ 121 6.3.6. Precizia 122 6.3.6.1. Repetabilitatea 122 6.3.6.2. Precizia intermediar 124 6.3.6.3. Exactitatea (acurateea) 125 6.3.7. Concluzii referitoare la determinarea MEL prin HPLC 126 6.4. Validarea metodei HPLC pentru determinarea TEN 127 6.4.1. Stabilirea lungimii de und de detecie 127 6.4.2. Identificarea picului corespunztor TEN 128 6.4.3. Linearitatea 129 6.4.4. Date statistice 131 6.4.5. LOD i LOQ 133 6.4.6. Precizia 133 6.4.6.1. Repetabilitatea 133 6.4.6.2. Precizia intermediar 136 6.4.6.3. Exactitatea (acurateea) 137 6.4.7. Concluzii referitoare la determinarea TEN prin HPLC 138 6.5. Validarea metodei HPLC pentru determinarea NIM 139 6.5.1. Stabilirea lungimii de und de detecie 139 6.5.2. Identificarea picului corespunztor NIM 139 6.5.3. Linearitatea 141 6.5.4. Date statistice 143 6.5.5. LOD i LOQ 145 6.5.6. Precizia 145 6.5.6.1. Repetabilitatea 145 6.5.6.2. Precizia intermediar 147 6.5.6.3. Exactitatea (acurateea) 149

v

6.5.7. Concluzii referitoare la determinarea NIM prin HPLC 150 6.6. Validarea metodei HPLC pentru determinarea IBP 151 6.6.1. Stabilirea lungimii de und de detecie 151 6.6.2. Identificarea picului corespunztor IBP 151 6.6.3. Linearitatea 153 6.6.4. Date statistice 154 6.6.5. LOD i LOQ 157 6.6.6. Precizia 157 6.6.6.1. Repetabilitatea 157 6.6.6.2. Precizia intermediar 159 6.6.6.3. Exactitatea (acurateea) 161 6.6.7. Concluzii referitoare la determinarea IBP prin HPLC 162 6.7. Validarea metodei HPLC pentru determinarea IND 162 6.7.1. Stabilirea lungimii de und de detecie 163 6.7.2. Identificarea picului corespunztor IND 163 6.7.3. Linearitatea 165 6.7.4. Date statistice 166 6.7.5. LOD i LOQ 168 6.7.6. Precizia 169 6.7.6.1. Repetabilitatea 169 6.7.6.2. Precizia intermediar 171 6.7.7.3. Exactitatea (acurateea) 172 6.7.7. Concluzii referitoare la determinarea IND prin HPLC 173 6.8. Validarea metodei HPLC pentru determinarea DIC 174 6.8.1. Stabilirea lungimii de und de detecie 174 6.8.2. Identificarea picului corespunztor DIC 174 6.8.3. Linearitatea 176 6.8.4. Date statistice 178 6.8.5. LOD i LOQ 180 6.8.6. Precizia 180 6.8.6.1. Repetabilitatea 180 6.8.6.2. Precizia intermediar 183 6.8.6.3. Exactitatea (acurateea) 184 6.8.7. Concluzii referitoare la determinarea DIC prin HPLC 185 6.9. Validarea metodei HPLC pentru determinarea KTP 186 6.9.1. Stabilirea lungimii de und de detecie 186 6.9.2. Identificarea picului corespunztor KTP 186 6.9.3. Linearitatea 188 6.9.4. Date statistice 190 6.9.5. LOD i LOQ 192 6.9.6. Precizia 192 6.9.6.1. Repetabilitatea 192 6.9.6.2. Precizia intermediar 194 6.9.6.3. Exactitatea (acurateea) 196 6.9.7. Concluzii referitoare la determinarea KTP prin HPLC 197 6.10. Validarea metodei HPLC pentru determinarea KET 198

vi

6.10.1. Stabilirea lungimii de und de detecie 198 6.10.2. Identificarea picului corespunztor KET 198 6.10.3. Linearitatea 200 6.10.4. Date statistice 201 6.10.5. LOD i LOQ 204 6.10.6. Precizia 204 6.10.6.1. Repetabilitatea 204 6.10.6.2. Precizia intermediar 206 6.10.6.3. Exactitatea (acurateea) 208 6.10.7. Concluzii referitoare la determinarea KET prin HPLC 208 6.11. Validarea metodei HPLC pentru determinarea FB 210 6.11.1. Stabilirea lungimii de und de detecie 210 6.11.2. Identificarea picului corespunztor FB 210 6.11.3. Linearitatea 210 6.11.4. Date statistice 214 6.11.5. LOD i LOQ 215 6.11.6. Precizia 216 6.11.6.1. Repetabilitatea 216 6.11.6.2. Precizia intermediar 218 6.11.6.3. Exactitatea (acurateea) 220 6.11.7. Concluzii referitoare la determinarea FB prin HPLC 221 CAPITOLUL 7. DETERMINAREA AINS DIN FORME FARMACEUTICE 222 7.1. Determinarea MEL din comprimate prin HPLC 222 7.1.1. Determinarea uniformitii masei 222 7.1.2. Prepararea soluiei de lucru 222 7.2. Determinarea PIR din comprimate prin HPLC 223 7.2.1. Determinarea uniformitii masei 223 7.2.2. Prepararea soluiei de lucru 223 7.3. Determinarea TEN din comprimate prin HPLC 225 7.3.1. Determinarea uniformitii masei 225 7.3.2. Prepararea soluiei de lucru 225 7.4. Determinarea NIM din comprimate prin HPLC 226 7.4.1. Determinarea uniformitii masei 226 7.4.2. Prepararea soluiei de lucru 227 7.5. Determinarea IBP din capsule prin HPLC 228 7.5.1. Determinarea uniformitii masei 228 7.5.2. Prepararea soluiei de lucru 229 7.6. Determinarea IND prin HPLC din capsule 230 7.6.1. Determinarea uniformitii masei 230 7.6.2. Prepararea soluiei de lucru 230 7.7. Determinarea DIC din comprimate prin HPLC 232 7.7.1.Determinarea uniformitii masei 232 7.7.2. Prepararea soluiei de lucru 232 7.8. Determinarea KTP prin HPLC din capsule 233 7.8.1. Determinarea uniformitii masei 233

vii

7.8.2. Prepararea soluiei de lucru 233 7.9. Determinarea KET trometamin din comprimate prin HPLC 235 7.9.1. Determinarea uniformitii masei 235 7.9.2. Prepararea soluiei de lucru 235 CAPITOLUL 8. METOD HPLC RAPID PENTRU DOZAREA KETOPROFENULUI DIN PLASMA UMAN 237 8.1. Introducere i obiective 237 8.2. Material i metod 237 8.2.1. Soluiile etalon 237 8.2.2. Echipamentul 238 8.2.3 Soluii stoc, soluii de lucru, soluii de control 238 8.2.4. Pregtirea probei 238 8.2.5. Validarea metodei 238 8.3. Rezultate i discuii 239 8.3.1. Studiu bibliografic 239 8.3.2. Metoda HPLC de testare 239 8.3.3. Validarea metodei 240 8.4. Concluzii 242 CAPITOLUL 9. BIBLIOGRAFIE 243 CONCLUZII GENERALE 252 ANEXE 255

viii

1

INTRODUCERE

Antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS) reprezint o clas de medicamente care cuprinde numeroase substane active cu structur chimic variat, dar care au efecte comune: analgezic, antipiretic, antiinflamator.

Mecanismul de aciune principal al AINS este reprezentat de blocarea ciclooxigenazei (COX), cu inhibarea sintezei de mediatori proinflamatori (leucotriene - LT, tromboxan - TX, prostaglandine - PG). Formarea mediatorilor proinflamatori pornete de la hidrolizarea glicerofosfolipidelor membranare, sub aciunea fosfolipazei A2 PLA2 (dar i a PLC), care duce la formarea de acid arahidonic. Acidul arahidonic este ulterior metabolizat pe 2 ci: cea a ciclooxigenazei (COX) i cea a lipooxigenazei (LOX). COX catalizeaz ciclizarea oxidativ a acidului arahidonic, cu formarea precursori ai prostaglandinelor i tromboxanilor. Aciunea LOX asupra acidului arahidonic determin formare de hidroperoxizi (HPETE), din care se vor sintetiza ulterior LT. Toi aceti mediatori proinflamatori PG, LT, TX sunt grupate sub denumirea de eicosanoide.

Prin blocarea COX, AINS blocheaz formarea de PG, ceea ce explic efectul lor antiinflamator, analgezic i antipiretic (inflamaia, durerea i febra fiind mediate de PG la nivelul esuturilor inflamatorii, nociceptorilor i respectiv hipotalamusului).

Majoritatea AINS sunt inhibitori neselectivi ai COX, ceea ce reprezint un dezavantaj deoarece inhibarea COX-1 duce la apariia de efecte adverse. n ultimele decenii au fost sintetizai i inhibitori selectivi de COX-2 (coxibi), care prezint mai puine reacii adverse digestive, dar nu au efecte antiagregante plachetare.

Pentru separarea, identificarea i determinarea cantitativ a medicamentelor AINS exist numeroase metode de analiz, dar marea majoritate se refer la determinarea unuia singur sau a unui numr restrns de componeni.

2

Scopul i obiectivele tezei de doctorat Scopul acestei lucrri este de a realiza, valida i aplica n

practic o metod unic de determinare cantitativ pentru unele AINS (meloxicam, piroxicam, tenoxicam, nimesulid, ibuprofen, indometacin, diclofenac, ketoprofen, ketorolac, fenilbutazon) prin cromatografie de lichide de nalt performan.

Obiectivele propuse n cadrul acestui studiu sunt:

1) Efectuarea unui studiu a literaturii de specialitate referitoare la metodele de determinare cantitativ a AINS luate n studiu;

2) Elaborarea metodei de analiz cantitativ prin cromatografie de lichide de nalt performan pentru determinarea AINS studiate astfel nct performanele metodei analitice s fie maxime (selectivitate, sensibilitate, precizie, exactitate etc.), dar n acelai timp metoda s fie ct mai rapid;

3) Validarea metodelor de analiz a medicamentelor, n conformitate cu reglementrile naionale i europene; n acest sens vor fi verificai o serie de parametri precum: liniaritatea, selectivitatea, precizia, exactitatea, limita de detecie i limita de cuantificare. Pentru fiecare metod validat va fi realizat un raport de validare, n care vor fi consemnate toate caracteristicile i performanele metodei analitice

4) Aplicarea metodelor analitice n controlul medicamentelor.

Adaptarea metodologiei pentru determinarea substanelor medicamentoase din formele farmaceutice introduse n terapie.

Precizm c numerotarea tabelelor i figurilor este identic cu

cea din tez de doctorat integral, cu excepia tabelelor de date comparative ale rezultatelor validrii metodei pentru toate AINS-urile studiate i ale determinrii acestora din forme farmaceutice, care sunt prezentate doar n rezumatul lucrrii de doctorat (i care prezint litera R alturi de numrul de ordine)

3

CAPITOLUL 1. GENERALITI. STRUCTUR CHIMIC. PROPRIETI

CHIMICE I FARMACOLOGICE

Capitolul cuprinde generaliti privind antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS), mecanismele inflamaiei i tratamentul acesteia, clasificarea AINS, relaia structur activitate biologic, aspecte farmacologice generale, reprezentani (descriere general structur i unele proprieti fizico - chimice).

CAPITOLUL 2. ABSORBIA LUMINII DE CTRE COMPUII ORGANICI

Capitolul 2 prezint aspecte privind originea spectrelor UV VIS, principiile spectrometriei de absorbie (legea Lambert Beer, deviaii de la legea absorbiei, sumarea absorbanelor, spectre derivate, acurateea fotometric, absorbia selectiv a luminii, modificri induse de substitueni n spectrele UV VIS ale substanelor organice, efectul conjugrii asupra spectrelor UV VIS ale substanelor organice, deplasri spectrale cauzate de solvent), aplicaiile spectrelor UV VIS n analiza calitativ (confirmarea identitii, detecia n UV VIS cuplat cu HPLC determinarea lungimii de und optime de detecie biblioteci de spectre; identificarea compuilor separai prin tehnica HPLC identificarea prin cutri n biblioteci de spectre, analiza compusului int utiliznd un tabel de calibrare, analizarea compuilor int utiliznd o bibliotec spectral, puritatea picului cromatografic tehnici de determinare a puritii picului, curba factorului de prag, clasificarea unui pic din cromatogram ca fiind impur).

4

CAPITOLUL 3. ANALIZA AINS PRIN CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE

NALT PERFORMAN (HPLC)

Cromatografia de lichide (LC) sau cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC) este una dintre tehnicile cele mai folosite n prezent la separarea constituenilor unui amestec de substane. n teza de doctorat sunt prezentate sumar unele dintre cele mai importante metode de analiz prin cromatografie de lichide de nalt performan (HPLC). Se constat faptul c marea majoritate a metodelor de determinare a AINS prin HPLC folosesc ca faz staionar coloane de tipul C18 (n diverse variante constructive lungime, diametru intern, mrimea particulelor). Ca faz mobil se folosesc amestecuri de solveni formate n principal din MeOH, ACN sau ambele mpreun ap sau cu soluii apoase a unor sruri (acetat de sodiu, acetat de amoniu, fosfat monosodic, fosfat monopotasic etc.) aduse la valori diverse ale pH-ului cu acizi cum sunt acidul formic, acidul acetic, acidul fosforic. Metodele prezentate lucreaz n modul izocrat sau n gradient, n funcie de numrul i tipul de componeni separai. n ceea ce privete sistemele de detecie, marea majoritate a metodelor folosesc spectrofotometria n UV, la valori ale lungimii de und corespunztoare maximelor de absorbie, sau la valori intermediare corespunztor maximelor de absorbie a componentelor separate. n alte metode se folosete ca sistem de detecie spectrometria de mas, fluorescena sau detecia electrochimic.

Metodele prezentate sunt utilizate pentru determinarea AINS din diverse matrici (forme farmaceutice sau medii biologice). n cazul determinrilor din medii biologice (urin, ser, plasm, esut) se folosesc diferite variante de purificare a probei (extracie n faz solid, extracie n faz lichid folosind ca sisteme de extracie diveri solveni cum sunt eterul, cloroformul, diclormetanul etc. sau deproteinizarea simpl cu ACN, MeOH sau acizi acid percloric, acid tricloracetic etc.).

5

CAPITOLUL 4. EVALUAREA REZULTATELOR VALIDAREA

METODELOR DE ANALIZ

Validarea metodelor analitice este o problem important n analiza medicamentelor, ce trebuie rezolvat n conformitate cu reglementrile organismelor internaionale de reglementare, cum ar fi Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Agency (EMEA) i International Conference of Harmonization (ICH). Procesul de validare confirm c procedura de analiz utilizat este adecvat pentru scopurile prestabilite i demonstreaz fiabilitatea rezultatelor obinute. Prin urmare, validarea metodei este esenial n analiza medicamentelor.

n laboratoarele de analiz, validarea are la baz standarde, cum ar fi: Bunele practici de producie (Good Manufacturing Practices - cGMP), Bunele practici de laborator (Good Laboratory Practices - GLP), Bunele practici clinice (Good Clinical Practices - GCP) etc. Exist i alte condiii necesare privind calitatea i acreditarea standardelor prevzute de Organizaia Internaional a Standardelor (International Standards Organization - ISO) seriile 9000 i 17025, Normele Europene (European Norm - EN 45001), Agenia de Protecie a Mediului (Environmental Protection Agency EPA), FDA etc.

Pentru instituirea unei metode de analiz se au n vedere, de regul, urmtorii parametri:

(a) Specificitatea / Selectivitatea; (b) Linearitatea; (c) Limita de detecie (LOD); (d) Limita de cuantificare (LOQ); (e) Intervalul (domeniul de lucru); (f) Precizia (repetabilitatea i precizia intermediar); (g) Acurateea (h) Stabilitatea i robusteea.

6

CONTRIBUIE ORIGINAL

CAPITOLUL 5. ALEGEREA PARAMETRILOR METODEI DE SEPARARE

A AMESTECULUI DE AINS

n literatura de specialitate nu exist o singur metod cromatografic de separare i determinare cantitativ pentru AINS. Unele dintre metodele publicate descriu separri de amestecuri de AINS sau AINS mpreun cu substane medicamentoase din alte clase terapeutice, ns majoritatea separrilor publicate sunt optimizate pentru fiecare compus n parte. Aplicaiile descrise se pot mpri n cteva categorii, i anume: dozarea AINS din materii prime farmaceutice, dozarea AINS din forme farmaceutice, dozarea AINS din probe biologice (n special snge, plasm, urin).

n acest capitol, vom prezenta modalitatea de elaborare a metodei pentru separarea unui amestec de AINS prin HPLC. Ne vom axa n principal pe variaiile spectrale i ale ariilor picurilor obinute ce apar n urma modificrii unor parametri de lucru, cum sunt debitul i compoziia fazei mobile. Un numr de 10 AINS din diverse clase chimice fac obiectul prezentei cercetri, avnd drept scop crearea unei metode simple de separare cromatografic din amestec (metoda de screening), precum i a validrii acestei metode sau a unor alternative optimizate pentru determinri cantitative individuale ale acestora. S-a urmrit crearea unei metode capabile s ruleze pe un sistem cromatografic uzual, avnd un detector economic (de tip UV-VIS) i implicnd o coloan de separare dintre cele mai rspndite, cum este coloana cu faz staionar C18.

Cele 10 AINS luate n studiu sunt: 1. Nimesulid abreviat NIM, obinut ca donaie prin amabilitatea S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. 07000047, produs n 03.2007, valabil pn n 03.2010.

7

2. Meloxicam abreviat MEL, obinut ca donaie prin amabilitatea S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. ROMXE/80606, produs n 08.2008, valabil pn n 05.2012. 3. Piroxicam abreviat PIR, obinut ca donaie prin amabilitatea S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. PRX2009115, produs n 10.2009, valabil pn n 10.2012. 4. Tenoxicam abreviat TEN, obinut ca donaie prin amabilitatea S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. 920060508, produs n 06.2008, valabil pn n 06.2013. 5. Ibuprofen abreviat IBU, obinut ca donaie prin amabilitatea S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. IBU0708801, produs n 08.2007, valabil pn n 07.2012. 6. Indometacin abreviat IND, obinut ca donaie prin amabilitatea S.C. Fiterman Pharma S.A., lot nr. T09-104, produs n 08.2009, valabil pn n 07.2013. 7. Diclofenac Sodiu abreviat DIC, obinut ca donaie prin amabilitatea S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. 100806-2, produs n 08.2010, valabil pn n 08.2014. 8. Ketoprofen abreviat KTP, obinut ca donaie prin amabilitatea S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. 149.530, produs n 01.2009, valabil pn n 01.2014. 9. Ketorolac abreviat KET, obinut ca donaie prin amabilitatea S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. ABDH006236, produs n 11.2010, valabil pn n 10.2013. 10. Fenilbutazon abreviat FB, obinut ca donaie prin amabilitatea S.C. Fiterman Pharma S.A., lot nr. BTZ 2008351, produs n 07.2008, valabil pn n 07.2011.

Pentru a putea concepe metoda de separare dorit, se vor

folosi informaiile despre parametrii fizico-chimici disponibile n literatura de specialitate, precum i experiena proprie acumulat n cadrul Laboratorului de Cromatografie, Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai.

Urmrind informaiile relevante pentru separarea cromatografic, i anume: solubilitatea, caracterul lipofil/hidrofil (nepolar sau polar), caracterul acid, bazic sau neutru, ale moleculelor luate n studiu, i bazndu-ne pe datele din literatura de specialitate, am considerat adecvat s alegem ca modalitate de lucru separarea cromatografic pe faz staionar invers (coloan C18), folosind

8

drept faz mobil un amestec de MeOH, ACN i ap sau soluie tampon acetat, cu detecie n UV.

Dup valorile coeficientului de partiie octanol/ap (logP) citate n literatura de specialitate i determinate experimental pentru mediu neutru (pH = 7,4) se poate observa cum aceste substane se grupeaz n jurul a dou valori: 1 (TEN, KTP, KET) i 3,7 (FB, IBP, IND, DIC). Celelalte trei AINS, respectiv NIM, MEL i PIR au valori diferite i mprtiate ntre cele dou grupuri. Apropierile remarcate conduc la predicia c analiii fiecruia din cele dou grupuri, dac se gsesc mpreun n amestec, vor fi foarte greu de separat n condiii de eluie izocrat.

Solubilitatea AINS luate n studiu este mai mare n solveni polari (metanol, etanol) dect n ap. Avnd n vedere faptul c spectrul de absorbie al unei substane poate suferi diverse modificri (deplasare batocrom sau hipsocrom, efect hipercromic sau hipocromic), am considerat necesar ca, n ceea ce privete alegerea compoziiei finale a fazei mobile, primul pas s l constituie studiul spectrelor de absorbie a antiinflamatoarelor n diveri solveni.

Pentru aceasta, au fost preparate soluii de concentraie aproximativ de 0,01mg/mL, n cteva variante de solvent: ap, MeOH, ACN i soluie apoas tamponat (tampon acetat) de pH = 5. Concentraia de 0,01mg/mL este astfel aleas nct s permit dizolvarea tuturor AINS i n ap. Dup prepararea soluiilor de lucru, s-a trecut la msurarea extinciei n UV-VIS folosind un Spectrofotometru UV-VIS Agilent Technologies, model 8453, Germania. Msurtorile spectrale i de absorban (extincie) au fost efectuate pe domeniul 190 500nm, deoarece unele dintre AINS luate n lucru absorb radiaie luminoas i n zona spectral VIS.

Pentru exemplificare, prezentm spectrul pentru TEN msurat n cei 4 solveni (figura 5.6).

Se constat mai multe aspecte. n primul rnd, pentru toi compuii studiai se obin mai multe maxime de absorbie, cel mai puternic (maximul principal) la lungimi de und de pn la 210nm. Acestea sunt succedate de maxime secundare sau teriare la lungimi de und mai mari. Deoarece n domeniul de lungimi de und 190 210nm, specifice maximelor principale, absorb puternic majoritatea solvenilor organici utilizai n HPLC (MeOH, ACN etc.), utilitatea acestora pentru detectarea concentraiilor mici de analii este ndoielnic. Din acest motiv, se vor avea n vedere maximele de

9

absorbie ce se obin la valori mai mari ale lungimii de und (maximele secundare) la stabilirea parametrilor de detecie.

Fig. 5.6. Spectrele msurate pentru TEN n diferii solveni

n al doilea rnd, se poate observa c efectele de deplasare ale

maximelor spectrale (i ne referim acum strict la maximul secundar) nu au efect semnificativ ntre ap i solventul apos tampon (ap + sare + acid) la pH = 5, ceea ce nseamn c prin corecia de pH nu s-a alterat maximul secundar de absorbie. Aceast constatare permite s tratm tamponul apos din punct de vedere al influenei spectrale, similar cu apa. Totui, o alt influen este notabil: efectul hipocromic (reducerea intensitii de absorbie) este semnificativ la anumite AINS (KET, PIR), nesemnificativ la alte AINS (DIC, MEL, TEN) iar, n cazul IBP, apare efectul invers, de hipercromie (intensificarea intensitii de absorbie).

Un alt aspect interesant este specific spectrului oxicamilor. Acetia prezint dou maxime secundare, unul de intensitate mai mic, n intervalul 240 260nm, i unul de intensitate mai mare, n domeniul 350 400nm. Dintre AINS-urile studiate, oxicamii sunt singurii care au aceast particularitate i poate fi util n situaiile n care anumite AINS au tendina s coelueze (din cauza valorii logP foarte apropiate). O soluie simpl de decelare este selecia spectral: presupunnd c KTP sau/i KET vor coelua cu TEN (toate au logP foarte apropiate de 1), alegerea unei lungimi de und de detecie de 350 360nm va permite detecia i chiar cuantificarea exclusiv a

10

TEN, deoarece KTP i KET nu absorb deloc n aceast zon spectral.

Nu n ultimul rnd, n cazul folosirii MeOH sau ACN ca solvent, lungimile de und rmn la aceleai valori (pentru IBP) sau se deplaseaz spre valori mai mari deplasare batocrom (pentru DIC) sau mai mici deplasare hipsocrom (pentru KTP, PIR, MEL i TEN). Aceste deviaii vor fi investigate ulterior, pentru a vedea influena amestecurilor ap sau tampon apos/solvent organic (MeOH sau ACN) n diverse proporii, asupra poziiilor maximelor spectrale.

n tabelul 5.3 sunt prezentate sinoptic lungimile de und (poziiile) ale maximelor spectrale secundare cu utilitate n detecia cromatografic.

Tabelul 5.3. Lungimile de und corespunztoare maximelor

spectrale secundare pentru DIC, IBP, KTP, PIR, MEL i TEN, n ap, MeOH, ACN i tampon acetat pH = 5

Solvent Compus studiat Ap Metanol Acetonitril Tampon pH 5

DIC 276 282 284 276 IBP 221 219 219 221 KTP 260 254 252 260 PIR 359 326 324 331

MEL 364 357 346 364 TEN 374 358 355 373

Urmrind abaterile maximelor spectrale secundare pentru

AINS studiate la dizolvarea n solveni organici (MeOH i ACN), n tabelul 5.3, se poate observa c valorile acestora sunt foarte apropiate (cel mult 3nm diferen), cu excepia MEL (maximul secundar n MeOH s-a nregistrat la 357nm, fa de cel n ACN nregistrat la 346nm). Pentru a putea anticipa lungimile de und optime pentru detecia HPLC n domeniul spectral UV-VIS, AINS luate n studiu au fost testate spectrofotometric dup dizolvarea n amestecuri tampon apos/MeOH cu procent de modificator organic variabil (0, 30, 50, 70, 100%). n figura 5.12 este reprezentat, pentru exemplificare, modificrile spectrale suferite de TEN n funcie de compoziia amestecului de solvatare, ce simuleaz posibile compoziii ale fazei mobile HPLC.

11

Fig. 5.12. Spectrele msurate pentru TEN n amestec

tampon apos/MeOH

Examinnd spectrele analizate, se poate concluziona faptul c aceti compui prezint modificri semnificative ale absorbanei n funcie de raportul n care se afl solvenii (tampon apos/MeOH) i anume valori mai mari ale absorbanei pentru KTP i PIR la dizolvare n MeOH 100%, mai mici pentru DIC (50%) i TEN (30%) i, respectiv, pentru IBP (0%).

Compuii menionai au fost studiai i la dizolvare n soluie tampon acetat 0,1M (pH = 3,6) observndu-se o uoar cretere a absorbanei fa de soluii tampon acetat pH = 5. n acest studiu au fost incluse i celelalte AINS: NIM, IND, KET i FB. Urmrind evoluia modificrilor spectrale n amestecuri similare fazelor mobile HPLC, se recomand pentru detecia n UV alegerea urmtoarelor semnale (canale) de achiziie: 255nm, 275nm, 360nm i, cu totul special, 220nm pentru IBP.

Pentru urmtoarele teste s-a utilizat un cromatograf de lichide model HP 1090, echipat cu detector cu ir de diode. Analizele au fost efectuate pe o coloan de separare cu faz staionar invers model Zorbax StableBond SB-C18 4,6 x 150mm, 5m la un debit de 0,7mL/min i cu o faz mobil format din ACN/tampon acetat 0,1 M (pH = 3,6)/MeOH n raport 35/40/25. Aceast faz mobil a fost iniial aleas a avea pH = 3,6 pentru a asigura trecerea DIC (forma sodic) n forma acid. DIC (forma sodic) are un pKa = 4. Ulterior, pH-ul va fi crescut la 5,6, valoare similar studiilor preliminare.

12

Pentru nregistrarea spectrelor celor 10 AINS n vederea construirii bibliotecii de spectre care va fi stocat de software-ul HPLC-ului pe computerul sistemului cromatografic, s-a procedat la cromatografierea individual a fiecrui AINS. Soluia aleas (construcia bibliotecii de spectre n condiii dinamice) are drept scop final apropierea ct mai puternic posibil de forma real a spectrelor n timpul separrii. Stocarea unor spectre obinute n condiii statice ar fi putut avea consecine nedorite asupra confirmrii identitii compuilor separai sau asupra puritii spectrale.

n plus, cromatografierea individual a AINS n condiiile metodei ce nu se modific permite determinarea timpilor de retenie corespunztori fiecrui component n parte i stabilirea ordinii de eluie n timpul separrii. Deasemeni, prin compararea timpilor de retenie se pot anticipa suprapunerile (coeluiile) nedorite. Aceast etap a fost finalizat cu ajutorul unei serii de soluii etalon de concentraii cunoscute: TEN (49g/ml); PIR (49,25g/ml); MEL (49g/ml); DIC (49g/ml); KET (49g/ml); KTP (53,5g/ml); IBP (500g/ml); NIM (50g/ml); FB (50,75g/ml); IND (46,75g/ml).

n figura 5.14 sunt prezentate cromatograma i spectrul de absorbie nregistrate pentru DIC. Conform timpilor de retenie determinai, se poate stabili ordinea de eluie a acestor AINS n condiiile metodei utilizate.

Fig. 5.14. Cromatograma i spectrul DIC (49g/mL)

Pentru studiul influenei debitului asupra separrii

cromatografice a amestecului ce conine apte AINS (DIC, PIR, KTP, NIM, FB, IND i IBP), s-au efectuat analize n aceleai condiii:

min5 10 15 20 25

mAU

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

DAD1 A, Sig=255,4 Ref =450,80 (AINFLAJ\A_INF_04.D)

1.1

26

2.1

05 2

.562

5.0

60

7.9

81

13.

814

26.

222

nm220 240 260 280 300 320 340 360 380

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

160

DAD1, 2.188 (174 mAU,Bln) of A_INF_04.D

13

coloan cromatografic de tipul Zorbax StableBond SB-C18 (4,6 x 150mm), 5m, cu o faz mobil format din amestec de ACN/Ap/MeOH (35/40/25, v/v/v) i s-a variat doar debitul fazei mobile. n urma separrii cromatografice la valori diferite ale debitului se obin urmtoarele cromatograme (figura 5.22).

Fig. 5.22. Separarea unui amestec de apte AINS la debit de

0,7mL/min i 0,5mL/min

Spectrele de absorbie ale PIR i IND obinute n aceast faz mobil, la cele dou debite, sunt reprezentate n figura 5.23. Se observ c, la reducerea debitului, are loc o micorare a abundenei semnalului (efect hipocromic), vizibil i n reprezentrile spectrale exemplificate n figura 5.23.

De asemenea, se mai observ faptul c la scderea debitului fazei mobile nu apar deplasri batocrome sau hipsocrome, ns fenomenul de aplatizare (scderea nlimii picului cromatografic) conduce implicit la o scdere a sensibilitii metodei. Principalul efect negativ se va resimi la calculul parametrilor de performan LOD i LOQ, dependeni n mod particular de nlimea semnalului cromatografic. Un alt efect nedorit este lirea la baz a picului cromatografic ce conduce inevitabil la scderea rezoluiei separrii. Este, de aceea, necesar continuarea optimizrii metodei de separare prin alte modificri, nu prin reducerea debitului de faz mobil.

14

Fig. 5.23. Spectrele de absorbie pentru PIR i IND, la dou debite

diferite (n rou - 0,7mL/min, n albastru 0,5mL/min)

n tabelul 5.4 sunt centralizate modificrile pe care le produce asupra picurilor cromatografice de IND i PIR scderea debitului fazei mobile de la 0,7mL/min la 0,5mL/min.

Tabelul 5.4. Influena modificrii debitului de faz mobil asupra picurilor cromatografice ale PIR i IND

Compus Debit (ml/min) Timp de retenie (min) Lime

0,7 4,286 0,2236 PIR 0,5 6,039 0,3054 0,7 12,438 0,4047 IND 0,5 17,298 0,557

n urma interpretrii acestor date, se desprind urmtoarele

concluzii: (1) alura spectrelor i poziia maximelor de absorbie nu se modific, n schimb absorbana scade odat cu scderea debitului fazei mobile; (2) odat cu scderea debitului fazei mobile crete limea picului la baza cromatogramei.

Pentru a studia influena compoziiei fazei organice din faza mobil asupra separrii cromatografice a amestecului celor apte AINS exemplificate (DIC, PIR, KTP, NIM, FB, IND i IBP), s-a ales ca faz mobil un amestec format din ACN, MeOH i ap. n analizele efectuate, debitul a fost meninut constant, la o valoare de

15

0,7mL/min, la fel i proporia de ap din compoziia fazei mobile, la 40%. Au fost modificate doar proporiile de MeOH i ACN, astfel nct coninutul n metanol s creasc n pai de cte 10%, de la 0 la 30%. Cromatogramele obinute sunt reprezentate n figura 5.24.

Fig. 5.24. Influena proporiei ntre cei doi modificatori organici din

faza mobil (ACN/MeOH) asupra separrii AINS exemplificate (DIC, PIR, KTP, NIM, FB, IND i IBP)

Studiind variaiile spectrale se desprind urmtoarele concluzii:

(-) indiferent de raportul dintre ACN i MeOH, poziia maximului de absorbie situat n jurul valorii de 320nm este constant; (-) cu ct coninutul n MeOH crete, poziia maximului de absorbie situat n intervalul 260 270nm se deplaseaz treptat spre valori mai mici ale lungimii de und; (-) indiferent de proporia dintre cei doi solveni organici, n spectrul de absorbie al IND exist un platou relativ constant n intervalul 240260nm.

O dat cu creterea coninutului de MeOH n faza mobil se constat:

1. creterea timpilor de retenie, fapt ce poate fi explicat printr-o solubilitate mai mic a acestor componente n MeOH dect n ACN;

16

2. pentru primii trei compui aria picurilor este relativ constant n timp ce nlimea picurilor scade iar limea crete;

3. pentru cel de al patrulea compus aria i nlimea picului scade, n timp ce limea crete.

4. pentru ultimii doi compui separai apare o anomalie, i anume: aria, nlimea i limea picurilor nu prezint o modificare uniform.

Avnd n vedere faptul c n aceast prob exist un numr de 7 componeni i avnd n vedere observaiile (3) i (4) se poate afirma faptul c din ultimii patru compui care elueaz, unul sufer o deplasare mai rapid prin coloan dect ceilali trei, n fiecare situaie n parte obinndu-se picuri suprapuse, deci impure. n consecin, metoda n cauz nu poate fi aplicat n situaia n care n proba de analizat se gsesc toi aceti patru compui.

Pentru studierea influenei pH-ului fazei mobile apoase asupra

separrii cromatografice, n compoziia fazei mobile a fost meninut constant raportul ntre componenii acesteia, modificndu-se numai pH-ul fazei apoase. Astfel, s-a nlocuit apa din compoziia fazei mobile cu o soluie tampon acetat cu o valoare a pH-ului de 4,6. S-a utilizat soluie de tampon acetat, volatil, ce ar permite utilizarea fazei mobile i n determinri lichid cromatografice cu detecie prin spectrometrie de mas.

n exemplul ce urmeaz, compoziia fazei mobile utilizate este ACN/tampon acetat (pH = 4,6)/MeOH n raport 30/40/30, debitul fazei mobile fiind de 0,7mL/min. n figura 5.26 sunt reprezentate cele dou cromatograme (faz mobil cu ap vs. faza mobil cu tampon de pH = 4,6).

Dac se utilizeaz soluie tampon de pH = 4,6 n loc de ap se pot concluziona urmtoarele: (-) timpii de retenie scad, ceea ce nseamn un timp de analiz total mai mic; (-) pentru primii trei compui calitatea separrii scade, picurile obinndu-se suprapuse, din acest motiv un studiu al modificrilor ariei, nlimii sau limii picurilor nu este util; (-) pentru compusul 4 apare o scdere semnificativ a ariei, nlimii i limii picului; (-) pentru ultimii doi compui separai aria este relativ constant, n timp ce se observ o cretere a nlimii picurilor compensat de scderea limii acestora.

17

Fig. 5.26. Separarea cromatografic a unui amestec de apte AINS (a) faza mobil: ACN/Ap/MeOH, i (b) faza mobil ACN/tampon

acetat (pH = 4,6)/MeOH raport 30/40/30 (v/v/v), debitul fazei mobile: 0,7mL/min

Conform datelor experimentale prezentate n cadrul acestui

capitol, se pot desprinde unele concluzii, cum ar fi: A. n compoziia fazei mobile este indicat s se foloseasc un tampon de pH n loc de ap, obinndu-se o scdere a timpului total de analiz i simetrie mai bun a unor picuri; B. n compoziia fazei mobile este indicat s se foloseasc drept modificator organic un amestec de MeOH i ACN, nu doar un singur solvent, deoarece astfel crete rezoluia separrii; C. Debitul fazei mobile trebuie s fie de 0,7 0,8mL/min; la valori mai mici crete timpul total de analiz, iar la valori mai mari scade rezoluia, aprnd coeluii. D. Analizele se vor efectua la mai multe lungimi de und (corespunztoare maximelor de absorbie); n acest mod se vor obine sensibiliti maxime pentru fiecare component separat, creterea rezoluiei i a simetriei picurilor.

Urmtoarele teste s-au realizat pe o coloan Eclipse XDB C18 (150 x 4,6mm, 5m). Faza mobil (debit 0,8mL/min) este constituit din amestec ACN/MeOH/tampon acetat pH = 5 (30/30/40, v/v/v).

Din cromatogramele nregistrate s-a determinat timpul de retenie pentru fiecare compus n parte i s-a nregistrat spectrul de absorbie n UV-VIS. Prin analiza spectral s-a determinat lungimea de und corespunztoare maximului de absorbie pentru fiecare component n parte. Spectrul de absorbie nregistrat pentru fiecare

18

component a fost inclus ntr-o bibliotec de spectre, ce va servi la identificarea acestora din amestecuri sau din probe reale. n 5.36 se exemplific cromatograma i spectrul pentru FB.

Fig. 5.36. Cromatograma i spectrul de absorbie pentru FB n condiiile metodei

Analiznd datele experimentale astfel obinute, se aleg

lungimile de und la care se va face detecia (tabelul 5.7).

Tabelul 5.7. Lungimile de und corespunztoare maximelor de absorbie i lungimile de und alese pentru detecia n HPLC

Nr.crt. Component analizat max (nm) detecie (nm)

1 IBP 230 230 2 KTP 259 270 3 FB 268 270 4 IND 270 270 5 DIC 280 280 6 NIM 300 300 7 KET 320 320 8 PIR 360 370 9 MEL 364 360

10 TEN 372 370 n continuare, au fost analizate amestecuri de mai muli

componeni, la lungimi de und corespunztoare, pentru a evidenia mai bine ordinea de eluie a componenilor separai.

n figura 5.37 au fost nregistrate cromatograme la lungimile de und de detecie pentru TEN (370nm), MEL (360nm), KTP (270nm), DIC (280nm), IND (270nm) i IBP (230nm).

19

Fig. 5.37. Ordinea de eluie: TEN (1), MEL (2), KTP (3),

DIC (4), IND (5) i IBP (6).

n vederea obinerii de informaii asupra performanei separrii, au fost analizate soluii ce conin un amestec al celor 6 componeni la aceeai valoare a concentraiei (10g/mL), obinndu-se informaii asupra performanei separrii (tabelele 5.8 5.13).

Tabelul 5.8. Performana separrii la 230nm

Compus Tr (min) Arie picnlime

pic Lime

pic Rezoluie Simetrie Selectivitate

TEN 2,125 15,8 3,1 0,0811 - 0,466 - MEL 2,587 33,1 4,6 0,1089 2,92 0,585 1,22 KTP 3,345 60,6 6,8 0,1296 3,67 0,58 1,29 DIC 6,027 53,9 3,3 0,1979 8,44 0,591 1,80 IND 7,241 135,5 7,3 0,2574 2,76 0,622 1,20 IBP 9,28 39,9 2 0,2531 3,98 0,558 1,28

20

Tabelul 5.9. Performana separrii la 270nm

Compus Tr (min) Arie pic

nlime pic

Lime pic Rezoluie Simetrie Selectivitate

TEN 2,126 52,1 7,8 0,1032 0,586 MEL 2,587 34,3 4,9 0,1077 2,59 0,603 1,22 KTP 3,345 88 10,3 0,1287 3,73 0,614 1,29 DIC 6,026 39,6 2,6 0,1963 8,61 0,59 1,80 IND 7,241 108,5 6 0,27 2,79 0,619 1,20

Tabelul 5.10. Performana separrii la 280nm

Compus Tr (min) Arie pic

nlime pic

Lime pic Rezoluie Simetrie Selectivitate

TEN 2,126 50,2 7,3 0,1087 0,577 - MEL 2,586 30,4 4,2 0,1125 2,55 0,591 1,22 KTP 3,346 50,3 5,8 0,1297 3,71 0,62 1,29 DIC 6,027 50,5 3,3 0,2134 8,62 0,584 1,80 IND 7,24 90,1 4,9 0,2542 2,80 0,619 1,20

Tabelul 5.11. Performana separrii la 300nm

Compus Tr (min)

Arie pic

nlime pic

Lime pic Rezoluie Simetrie Selectivitate

TEN 2,126 40,5 6 0,1081 - 0,569 - MEL 2,588 24,5 3,4 0,1119 2,56 0,617 1,22 KTP 3,347 13,4 1,6 0,118 3,74 0,657 1,29 DIC 6,024 28,1 1,8 0,1945 8,64 0,583 1,80 IND 7,246 39,8 2,1 0,2513 2,82 0,658 1,20

Tabelul 5.12. Performana separrii la 360nm

Compus Tr (min)

Arie pic

nlime pic

Lime pic Rezoluie Simetrie Selectivitate

TEN 2,126 58,3 8,6 0,1012 - 0,589 - MEL 2,587 64,5 9 0,1093 2,56 0,59 1,22 IND 7,242 17,7 0,94 0,2392 12,98 0,617 2,80

21

Tabelul 5.13. Performana separrii la 370nm

Compus Tr (min)Arie pic

nlime pic

Lime pic Rezoluie Simetrie Selectivitate

TEN 2,126 63,9 9,5 0,1107 - 0,571 - MEL 2,587 63,9 8,9 0,1064 2,55 0,588 1,22 IND 7,22 12,4 0,64 0,2372 14,55 0,454 2,79

Analiznd datele experimentale prezentate n tabelele 5.8

5.13 se constat rezoluia dintre picurile separate este mai mare ca 2,5. Aceasta nseamn c metoda propus conduce la o separare bun, cel puin n ceea ce privete aceti 6 compui (figura 5.38).

Fig. 5.38. Cromatogramele nregistrate la lungimile de und folosite

la detecie, pentru TEN (1), MEL (2), KTP (3), DIC (4), IND (5) i IBP (6)

Pentru a obine sensibilitatea maxim pentru fiecare compus

n parte, se impune o comparaie ntre datele experimentale la diverse

22

lungimi de und. Astfel, n tabelul 5.14 se prezint variaia ariilor picurilor pentru fiecare component n parte la valori diferite ale lungimii de und.

Tabelul 5.14. Variaiile ariilor picurilor pentru TEN, MEL, KET, DIC, IND i IBP la valori diferite ale lungimii de und

Lungime de und (nm) Compus Tr (min) 230 270 280 300 360 370

TEN 2,1 15,8 52,1 50,2 40,5 58,3 63,9 MEL 2,5 33,1 34,3 30,4 24,5 64,5 63,9 KTP 3,3 60,6 88,0 50,3 13,4 9,1 3,4 DIC 6,0 53,9 39,6 50,5 28,1 N.A. N.A. IND 7,2 135,5 108,5 90,1 39,8 17,7 12,4 IBP 9,2 39,9 16,0 N.A. N.A. N.A. N.A.

Analiznd datele experimentale prezentate n tabelul 5.14 se

constat c cele mai mari valori ale ariilor picurilor nregistrate se regsesc la urmtoarele lungimi de und: TEN (370nm), MEL (360nm), KET (270nm), DIC (280nm), IND (270nm) i IBP (230nm). Aceste valori ale lungimii de und vor fi folosite ulterior pentru validarea metodei i pentru determinrile cantitative din probe.

Un studiu similar a fost efectuat i pentru celelalte AINS luate n studiu (PIR, KET, NIM, FB) (tabelul 5.15). Tabelul 5.15. Variaiile ariilor picurilor pentru PIR, KET, NIM i FB

la valori diferite ale lungimii de und

Lungime de und (nm) Compus Tr (min) 230 270 280 300 360 370 PIR 2,4 605,1 546,1 521,2 N.A. 893,2 810 KET 2,3 117,9 140 410 753,7 109,4 43,4 NIM 6,9 267,2 320,3 415,7 N.A. 250,9 190,3 FB 4,2 7770 6350 878,4 11,8 6,1 5,2 Din datele prezentate n tabelul 5.15 se observ c valorile

maxime ale ariilor picurilor se regsesc la urmtoarele lungimi de und: PIR (360nm), KET (320nm), NIM (300nm) i FB (270nm). Acestea vor fi folosite ulterior pentru validarea metodei i pentru determinrile cantitative din probe.

23

Avnd n vedere testele prezentate anterior, condiiile finale propuse pentru determinarea prin HPLC a celor zece AINS luate n studiu sunt: (1) coloan cromatografic Eclipse XDB C18 (150 x 4,6mm, 5m); (2) faza mobil (debit 0,8mL/min) constituit din amestec ACN/MeOH/tampon acetat pH = 5 n raport volumic de 30/30/40; (3) detecia se realizeaz n UV-VIS, concomitent, la urmtoarele valori ale lungimii de und:

230nm IBP 270nm KTP, IND i FB 280nm DIC 300nm NIM 320nm KET 360nm PIR i MEL 370nm TEN

24

CAPITOLUL 6. VALIDAREA ANALITIC A METODELOR CANTITATIVE PENTRU

DETERMINAREA AINS

Pentru determinarea AINS am dezvoltat o metod de analiz prin RP-HPLC utiliznd un cromatograf de lichide model Agilent Technologies Seria 1100 echipat cu detector spectrofotometric (UV-VIS) cu ir de diode. Dup stabilirea condiiilor optime de analiz (faz staionar, caracteristicile fazei mobile, debit, lungime de und de detecie), s-a procedat la validarea metodei, calculnd urmtorii parametri: identificarea AINS, linearitatea funciei de rspuns, linearitatea rezultatelor, LOD, LOQ, precizia (precizia sistemului, precizia metodei, precizia intermediar) i exactitatea.

Aparatur:

cromatograf de lichide tip Agilent Technologies 1100 prevzut cu detector cu ir de diode coloan cromatografic tip Eclipse XDB C18 (150 x 4,6mm, 5m) balan analitic tip Kern 770 baie de ultrasonare agitator magnetic sticlrie de laborator (pipete, baloane cotate etc.).

Reactivi:

ACN de puritate cromatografic (Merck); MeOH de puritate cromatografic (Merck); acetat de sodiu anhidru; acid acetic glacial; AINS etaloane de referin (a se vedea n Capitolul 5). ap bidistilat.

Metod

Soluiile standard s-au obinut prin dizolvarea unei cantiti de 25mg AINS (substan de referin) n 25mL MeOH (1mg/mL) i diluare cu faz mobil, dup dizolvare complet (aproximativ 5min.

25

n baie de ultrasonare). Orice diluie ce survine n cadrul pregtirii soluiilor standard se realizeaz cu faz mobil. Temperatura coloanei este meninut constant la 25C. Faza mobil: amestec de tampon acetat 0,1M (pH = 5)/ACN/MeOH n raport de 40/30/30. Pentru prepararea unui volum de 1L faz mobil se procedeaz astfel: se amestec 300mL ACN cu 300mL MeOH i cu 400mL soluie tampon acetat 0,1M (pH = 5). Debitul fazei mobile este de 0,8mL/min. Volumul de prob / soluie etalon injectat n HPLC este de 20L. Detecia se realizeaz la lungimea de und specific AINS cromatografiat.

Deoarece validrile tuturor celor 10 antiinflamatoare luate n studiu au fost efectuate urmnd aceeai procedur, n rezumatul tezei prezentm modul de efectuare a validrii metodei pentru unul singur urmnd ca pentru ceilali s prezentm doar rezultatele obinute, sub form de tabele de date.

Validarea metodei HPLC pentru determinarea MEL

Sistemul cromatografic a fost pregtit conform descrierii din subcapitolul 6.1. Reactivii, faza mobil, etaloanele i probele au fost pregtite conform metodei de lucru exprimate general n subcapitolul 6.1 i particularizate n continuare. Detecia se realizeaz la lungimea de und 360nm specific MEL.

Dup cum s-a menionat n Capitolul 5, referitor la identificarea picurilor cromatografice, o anumit substan se comport identic la analiza prin HPLC dac toate condiiile de lucru sunt identice. Astfel, pentru identificarea MEL din diferite probe, se compar timpul de retenie al picului din cromatograma probei cu cel obinut n cromatograma substanei de referin (valori ce trebuie s fie apropiate se accept o diferen, adesea, de 5%). Astfel, n cromatograma soluiei de referin s-a obinut un timp de retenie de 2,544min.; cum se accept o abatere de 5% (0,127min.) valorile timpului de retenie trebuie s fie n intervalul 2,417 2,671min.

n figura 6.1 se prezint comparativ cromatogramele pentru soluia de referin i respectiv pentru o prob. Aa cum se observ pentru soluia prob, timpul de retenie este de 2,564min., valoare ce se ncadreaz n limita de abatere impus ( 5%).

26

Fig. 6.1. Cromatograma MEL: soluie standard (sus) vs. prob (jos)

Pentru a crete precizia identificrii, n afara comparrii

timpilor de retenie din cromatograma probei i, respectiv, a soluiei de referin, se compar i spectrul de absorbie al picului din cromatograma probei cu cel al soluiei de referin (care este salvat n biblioteca de spectre). Pentru aceasta, este foarte important ca soluia prob i soluia de referin s fie analizate n aceleai condiii (faz staionar, compoziia fazei mobile, debit, temperatur, lungime de und de detecie, lungime de und de referin etc.).

n figura 6.3 se prezint comparativ spectrul de absorbie al MEL din soluia prob fa de cel din soluia de referin.

Pentru prepararea soluiei stoc de MEL se procedeaz astfel: o cantitate de 25mg MEL a fost dizolvat n 20mL MeOH pe baie de ultrasonare i, dup dizolvare complet, soluia a fost diluat la 25mL cu MeOH. Din soluia astfel preparat s-a mai realizat o diluie de 1/10, obinndu-se n final o soluie de concentraie 100g/mL. Calcularea concentraiei soluiei finale se face dup formula de calcul descris prin ecuaia 6.1.

27

Fig. 6.3. Compararea spectrelor de absorbie a MEL

(prob vs. soluie de referin) ( )

( )( )( ) mLgmLmLx

mLmg /100

505

2525 = (6.1)

Pornind din aceeai soluie stoc, s-au preparat (prin diluare cu

faza mobil) un numr de 3 seturi de soluii de lucru pentru studiul linearitii pe intervalul de concentraie 0,5 100g/mL. Fiecare dintre aceste probe a fost analizat n condiiile menionate i, din cromatogramele obinute, s-a determinat aria picurilor corespunztoare MEL.

Se reprezint grafic variaia ariei medii n funcie de concentraie i se determin intervalul de concentraie pentru care aceast variaie este linear. Se traseaz dreapta de regresie pentru acest interval i se determin coeficientul de corelaie (r), deviaia standard a pantei dreptei de regresie (s) i ecuaia dreptei Arie pic = f(c) (ecuaiile 6.2, 6.3).

Arie pic = a x Concentraia + b (6.2)

Arie pic = 6,3558 x Concentraia 0,8216; r2 = 0,9996 (6.3)

Aa cum se observ, pe domeniul de concentraie considerat

metoda este liniar (r2 = 0,9996).

28

Aadar, domeniul de linearitate al metodei este 0,5 100g/mL.

Pe de alt parte, avnd n vedere faptul c exist posibilitatea ca metoda dezvoltat s fie aplicat i pentru determinarea MEL din probe biologice (unde concentraia acestuia este mult mai mic), ne-am propus s ngustm domeniul de lucru. Astfel, am considerat ca domeniu de lucru intervalul 0,5 30g/mL. Pentru acest interval de concentraie am validat metoda.

n figura 6.4 este prezentat dreapta de calibrare obinut pentru MEL, pe domeniul de lucru.

Fig. 6.4. Dreapta de calibrare la determinarea MEL prin HPLC

Calculul statistic al dreptei de regresie (ecuaia 6.2) este redat

sumar n tabelul 6.3.

Tabelul 6.3. Calculul statistic al dreptei de regresie

Calculul statistic al regresiei Coeficient de corelaie (r) 0,9999 Coeficient de regresie (r2) 0,9998

Eroare standard a dreptei de regresie (SE) 1,1860 Intercept 0,6774

Pant 6,2136

Ecuaia dreptei de calibrare este redat mai jos (6.4):

Arie pic = 6,2136 x Concentraia + 0,6774R2 = 0,9998

0.0020.0040.0060.0080.00

100.00120.00140.00160.00180.00200.00

0 5 10 15 20 25 30 35

Concentraie (ug/mL)

Arie

pic

29

Arie pic = 6,2136 x Concentraia (g/mL) + 0,6774 (6.4)

sau, ecuaia 6.5:

Concentraia (g/mL) = Arie 0 ,67746 ,2136 (6.5)

Pentru evaluarea linearitii rezultatelor, se reprezint grafic

variaia concentraiei calculate (utiliznd ecuaia dreptei de calibrare) n funcie de concentraia teoretic.

Dup cum se observ din figura 6.5, ntre concentraia introdus teoretic i cea calculat folosind ecuaia dreptei de calibrare exist o corelaie liniar, panta acestei drepte fiind egal cu unitatea iar interceptul avnd valoarea 0,0002. Coeficientul de regresie al acestei drepte are valoarea r2 = 0,9998.

Fig. 6.5. Liniaritatea rezultatelor la determinarea MEL prin HPLC

Avnd n vedere faptul c interceptul are o valoare extrem de

mic, se poate afirma c aceast dreapt trece prin origine. Pe de alt parte, dreapta ce trece prin origine i are panta egal cu unitatea este prima bisectoare. Aceasta nseamn c ntre concentraia introdus (teoretic) i cea calculat utiliznd ecuaia dreptei de calibrare corelaia este foarte bun.

Concentraie calculat = Concentraie teoretic + 0,0002R2 = 0,9998

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 15 20 25 30 35

Concentraie teoretic

Conc

entra

ie c

alcu

lat

30

n ceea ce privete linearitatea metodei de determinare prin HPLC a MEL, n urma prelucrrii statistice a datelor experimentale, se obin urmtoarele rezultate: metoda este liniar n domeniul de concentraie ales (0,5 100g/mL); domeniul de lucru ales este 0,5 30g/mL; pe domeniul de lucru ales, ecuaia dreptei de regresie este dat de relaia 6.4:

Arie pic = 6,2136 x Concentraia + 0,6774

pe acest interval, coeficientul de regresie (r2) are valoarea 0,9998 iar eroarea standard a curbei de regresie (SE) are valoarea 1,1860.

LOD reprezint cantitatea minim de MEL ce se poate pune n eviden. Pentru determinarea LOD exist mai multe variante, n cazul de fa am folosit metoda de calcul a acesteia utiliznd deviaia standard i panta dreptei de regresie (LOD = 0,63g/mL).

LOQ reprezint cantitatea minim de MEL ce se poate cuantifica cu certitudine. Pentru determinarea LOQ exist mai multe variante, n cazul de fa am folosit metoda de calcul a acesteia utiliznd deviaia standard i panta dreptei de regresie (LOQ = 1,91g/mL).

Precizia. Repetabilitatea Repetabilitatea injeciei (Precizia sistemului) Pentru a examina precizia sistemului, aceeai soluie

coninnd MEL n concentraia de interes (20g/mL) s-a injectat de 10 ori obinndu-se tot attea cromatograme. Din cromatogramele rezultate s-au extras ariile picurilor, calculndu-se valoarea medie, deviaia standard i deviaia standard relativ. Rezultatele numerice ale analizelor repetitive se regsesc n tabelul 6.6.

Concluzie: avnd n vedere valoarea deviaiei standard relative obinute (RSD = 1,0999%) comparativ cu limita admis de 2%, se poate afirma c la determinarea prin HPLC a MEL, sistemul este precis.

31

Tabelul 6.6. Repetabilitatea injeciei (Precizia sistemului) pentru o concentraie de 20g/mL

Nr. determinrii Arie pic

1 123,61 2 127,37 3 125,65 4 127,96 5 125,53 6 127,01 7 126,63 8 125,22 9 127,95

10 127,24 Media 126,42

SD 1,3905 RSD 1,0999%

Repetabilitatea analizei (precizia metodei) Pentru stabilirea preciziei metodei de determinare a MEL s-a

ales varianta de lucru cu un minim de 9 determinri acoperind domeniul specific de concentraie (de exemplu 3 determinri la 3 valori ale concentraiei). Soluiile standard de validare sunt preparate ca mai jos, prin diluii din soluia stoc. Soluia stoc este preparat ca n subcapitolul 6.2.3. Din soluia stoc se prepar soluiile de lucru prin diluare cu faz mobil:

Pentru fiecare nivel de concentraie se prepar i se analizeaz un numr de trei probe, msurndu-se experimental aria picurilor.

Utiliznd ecuaia dreptei de calibrare i valorile ariilor corespunztoare picurilor MEL, se calculeaz concentraia (n g/mL) pentru fiecare prob n parte. Se determin concentraia calculat ca procent din valoarea concentraiei teoretice. Valorile obinute sunt prelucrate statistic. Astfel, sunt calculate: valoarea medie, deviaia standard, RSD i intervalul de ncredere pentru fiecare valoare individual ca i pentru valoarea medie. RSD trebuie s aib o valoare mai mic de 5%. Valorile experimentale obinute la studiul preciziei metodei de determinare a MEL prin HPLC sunt prezentate n tabelul 6.7.

32

Tabelul 6.7. Precizia metodei de determinare a MEL prin HPLC

Nr. det. Concentraie teoretic(g/mL) Arie pic Concentraie calculat

(g/mL) %

1 96,32 15,39 102,6 2 93,01 14,86 99,1 3

15 95,44 15,25 101,7

4 125,47 20,08 100,4 5 127,48 20,41 102,0 6

20 123,00 19,69 98,4

7 152,78 24,48 97,9 8 154,83 24,81 99,2 9

25 153,20 24,55 98,2

Media 99,94% SD 1,7833 Date statistice

RSD 1,7843%

Concluzie: conform datelor experimentale, dup prelucrarea statistic a acestora se observ c pe un interval de 25% fa de valoarea de interes, metoda este precis, RSD fiind sub limita impus de 5%.

Precizia intermediar Pentru calculul preciziei intermediare la determinarea MEL

prin HPLC, ntregul experiment s-a efectuat a doua zi, utiliznd reactivi diferii, modul de lucru fiind identic ca i n cazul determinrii preciziei metodei.

Pentru fiecare nivel de concentraie se prepar i se analizeaz un numr de trei probe, msurndu-se experimental aria picurilor.

Utiliznd ecuaia dreptei de calibrare i valorile ariilor corespunztoare picurilor MEL se calculeaz concentraia (n g/mL) pentru fiecare prob n parte. Se determin concentraia calculat ca procent din valoarea concentraiei teoretice. Valorile obinute sunt prelucrate statistic. Astfel, sunt calculate: valoarea medie, deviaia standard, RSD i intervalul de ncredere pentru fiecare valoare individual ca i pentru valoarea medie. RSD trebuie s aib o valoare mai mic de 5%. Datele primare folosite la calculele detaliate anterior se regsesc centralizate n tabelul 6.8.

33

Tabelul 6.8. Precizia intermediar la determinarea MEL prin HPLC - date primare -

Nr.det. Concentraie teoretic(g /mL) Arie pic

Concentraie calculat(g /mL) %

1 92,36 14,76 98,4 2 91,28 14,58 97,2 3

15 94,50 15,10 100,7

4 127,15 20,35 101,8 5 127,47 20,41 102,0 6

20 126,12 20,19 100,9

7 152,14 24,38 97,5 8 153,10 24,53 98,1 9

25 156,84 25,13 100,5

Media 99,68% SD 1,8747 Date statistice

RSD 1,8807%

Concluzie: conform datelor experimentale obinute, dup prelucrarea statistic a acestora se observ c pe un interval de 25% fa de valoarea de interes, metoda este precis, RSD fiind sub limita impus de 5%.

Exactitatea (acurateea) Exactitatea (acurateea) este o caracteristic ce reflect

apropierea rezultatelor analitice de valoarea adevrat. Exactitatea este deci o msur a deviaiei valorii medii gsit prin analiz, fa de valoarea adevrat.

Pentru determinarea acurateei metodei de determinare a MEL se lucreaz prin metoda adaosului: ntr-o soluie ce conine o cantitate cunoscut de standard, se introduc volume de soluie de MEL astfel nct s se obin concentraii de 75%, 100% i 125% din concentraia soluiei ce va fi testat (20g/mL). Procedeul s-a repetat de trei ori utiliznd soluii etalon preparate separat.

S-a preparat mai nti o soluie stoc de MEL din care, prin diluie s-au obinut soluiile de lucru. Soluia stoc se prepar ca n subcapitolul 6.2.3 (ecuaia 6.1). Soluiile preparate pentru studiul exactitii au fost injectate i analizate prin cromatografie de lichide de nalt performan n condiiile metodei. Cromatogramele obinute au fost integrate, determinndu-se astfel aria picurilor.

34

Utiliznd ecuaia dreptei de calibrare i valorile ariilor picurilor corespunztoare MEL s-a calculat concentraia (n g/mL) pentru fiecare prob n parte. S-a determinat regsirea, calculat ca procent din valoarea concentraiei teoretice, regsirea medie precum i domeniul n care variaz regsirea (tabelul 6.10).

Tabelul 6.10. Exactitatea metodei de determinare a MEL prin HPLC

Nr.det. Concentraie teoretic(g/mL) Arie pic

Concentraie calculat(g/mL) Regsire %

1 93,25 14,90 99,3 2 95,75 15,30 102,0 3

15 96,38 15,40 102,7

4 123,56 19,78 98,9 5 122,93 19,68 98,4 6

20 122,37 19,58 97,9

7 159,73 25,60 102,4 8 155,95 24,99 100,0 9

25 154,56 24,77 99,1

Regsire medie 100,08% Minim 97,90% Date statistice Maxim 102,70%

Concluzie: regsirea medie n studiul exactitii metodei de

determinare a MEL prin HPLC are valoarea de 100,08% pe intervalul 97,90 102,70%.

n urma validrii metodei de analiz pentru toate cele 10 antiinflamatoare luate n studiu s-au obinut valorile prezentate n urmtoarele tabele (R1 R6).

Dup cum se observ cu uurin din datele prezentate n tabelul R1, durata analizei este de aproximativ 10 minute, timp n care se pot separa toi cei 10 componeni.

Pe de alt parte, deoarece este puin probabil ca toi cei 10 compui s se afle simultan ntr-o prob, aceast metod unic poate fi aplicat cu succes pentru separarea, identificarea i determinarea cantitativ a oricrui compus dintre cei 10 studiai.

35

Tabelul R1. Timpi de retenie i lungimi de unde de detecie

AINS Timp de retenie (minute) Lungime de und de detecie

(nm) TEN 2,09 370 KET 2,27 320 PIR 2,35 360

MEL 2,54 360 KTP 3,21 270 FB 4,07 270

DIC 5,77 280 IND 6,97 270 NIM 7,29 300 IBP 8,94 230

Cercetri preliminare denot faptul c exist i alte

medicamente din aceast clas ce pot fi separate prin aceast metod. Metoda de analiz este liniar pentru toate cele 10 AINS

studiate, coeficienii de regresie fiind n toate cazurile mai mari de 0,9990 (tabelul R2). Pentru KET, DIC, NIM i IBP, domeniul de lucru pornete de la o concentraie mai mare dect n celelalte cazuri deoarece pentru compuii menionai ariile picurilor la concentraii mai mici de 1g/mL sunt mai mici dect limita de detecie, n unele cazuri avnd valori comparative cu zgomotul de fond.

Tabelul R2. Liniaritatea metodei

Domeniu (g/mL) AINS liniaritate lucru Coeficient de regresie (r2) Pant Intercept

TEN 0,5 100 0,5 30 0,9997 6,4225 -1,7089 KET 0,5 100 1 40 0,9995 6,8197 2,4048 PIR 0,5 100 0,5 30 0,9996 8,7939 -2,4259

MEL 0,5 100 0,5 30 0,9998 6,2136 0,6774 KTP 0,5 100 0,5 30 0,9995 8,871 -0,436 FB 0,5 100 0,5 30 0,9998 79,172 -5,551

DIC 1 100 1 40 0,9994 5,0394 -0,3782 IND 0,5 100 0,5 30 0,9993 10,494 0,8599 NIM 1 100 1 40 0,9993 4,0922 1,1131 IBP 1 100 1 40 0,9998 3,7781 0,1342

36

Conform datelor experimentale prezentate n tabelul R3, rezultatele calculate sunt n bun corelaie cu valorile teoretice, la reprezentarea grafic a acestei dependene se obin drepte cu pant unitar sau foarte apropiat de unitate, cu intercept foarte mic i cu valori ale coeficienilor de regresie foarte buni (mai mari de 0,9990).

Tabelul R3. Liniaritatea rezultatelor

AINS Pant Intercept Coeficient de regresie (r2)TEN 0,9835 0,2166 0,9998 KET 1,0000 0,0002 0,9995 PIR 1,0000 0,00004 0,9996

MEL 1,0000 0,0002 0,9998 KTP 0,9683 0,102 0,9991 FB 1,0001 -0,0007 0,9998

DIC 1,0000 -0,0003 0,9994 IND 1,0000 -0,000005 0,9993 NIM 1,0000 -0,000005 0,9993 IBP 1,0000 -0,0002 0,9998

Analiznd datele prezentate n tabelul R4 se concluzioneaz

ca n toate cazurile se obin valori bune pentru limita de detecie (0,31 1,48g/mL) i limita de cuantificare (1,57 4,50g/mL).

Tabelul R4. Limita de detecie i limita de cuantificare

AINS Limita de detecie (g/mL) Limita de cuantificare

(g/mL) TEN 0,63 1,91 KET 1,19 3,61 PIR 0,63 2,47

MEL 0,63 1,91 KTP 0,89 2,71 FB 0,52 1,57

DIC 0,31 3,98 IND 1,10 3,33 NIM 1,48 4,50 IBP 0,75 2,26

Metoda de separare i determinare cantitativ a celor 10

antiinflamatoare prezint o bun precizie, valorile experimentale

37

obinute pentru precizia sistemului ncadrndu-se n intervalul RSD = 0,5400 1,0999%, pentru precizia metodei n intervalul RSD = 1,2329 2,9573% i pentru precizia intermediar n intervalul RSD = 1,1444 2,3410% (tabelul R5).

Tabelul R5. Precizia sistemului, metodei i precizia intermediar Precizie (%)

Sistem Metod Intermediar AINS RSD RSD Interval ncredere RSD

Interval ncredere

TEN 1,2867 2,9573 96,54 101,32 2,3410 97,18 100,97 KET 0,5400 1,2329 99,03 100,93 1,1981 99,33 101,18 PIR 0,9328 1,4965 98,91 101,22 1,4337 98,76 100,97

MEL 1,0999 1,7843 98,49 101,40 1,8807 98,15 101,21 KTP 0,5668 2,0637 97,71 100,87 1,9085 98,06 101,0FB 0,8287 1,1765 99,39 101,21 1,1444 98,77 100,52

DIC 0,8282 1,5080 98,49 100,80 1,5047 98,81 101,12 IND 0,6732 1,3233 98,37 100,39 1,3651 98,79 100,89 NIM 0,9876 1,3872 97,22 99,36 1,3148 98,25 100,27 IBP 0,8967 1,8375 97,83 100,64 1,7300 99,67 103,36

Metoda de separare i determinare cantitativ a celor 10

antiinflamatoare este exact, datele experimentale artnd o regsire medie n intervalul 98,31 100,43% cu minime n intervalul 96,3 98,5% i maxime n intervalul 101,1 103,0% (tabelul R6).

Tabelul R6. Exactitatea metodei

Regsire (%) AINS Medie Minim Maxim TEN 100,43 97,9 103,0 KET 98,89 98,2 101,8 PIR 100,41 97,7 101,7

MEL 100,08 97,9 102,7 KTP 100,52 98,1 101,9 FB 100,20 98,5 101,4

DIC 99,52 98,0 101,8 IND 99,80 98,3 101,5 NIM 98,31 96,3 101,1 IBP 99,61 97,4 101,4

38

CAPITOLUL 7. DETERMINAREA AINS DIN FORME FARMACEUTICE

Avnd n vedere faptul c pentru determinarea compuilor studiai din forme farmaceutice (comprimate sau capsule) se aplic acelai tipic, n rezumatul tezei se prezint modalitatea de determinare a coninutului n meloxicam / comprimat, iar pentru alte 9 antiinflamatoare (PIR, TEN, NIM, DIC, IND, IBP, KTP i KET) se prezint doar rezultatele obinute.

Determinarea MEL din comprimate prin HPLC Prepararea soluiei de lucru Dup determinarea masei medii, un numr de 20 comprimate

au fost triturate. Din pulberea obinut s-a luat n lucru o cantitate de aproximativ 0,7g (a grame corespunztor la 4 comprimate), echivalent la 60mg MEL.

Pulberea de comprimate s-a dizolvat ntr-un volum de 90mL MeOH timp de 30min pe baie de ultrasonare, amestecul fiind filtrat prin hrtie cantitativ. Hrtia de filtru se spal cu aproximativ 5mL MeOH. Soluia filtrat este adus cu MeOH la un volum de 100mL. Din soluia astfel obinut, un volum de 2,5mL se aduc cantitativ la 50mL cu faz mobil. n continuare, se mai efectueaz o diluie de 2/3 cu faz mobil. Se obine astfel o soluie coninnd MEL n concentraie de aproximativ 20g/mL (relaia 7.1):

( )( )

( )( )

( )( )

60 2,5 620 /

100 50 9mg mL mL

x x g mLmL mL mL

= (7.1) Din soluia astfel obinut, un volum de 20L se injecteaz n

condiiile descrise. Au fost preparate un numr de trei soluii de prob, fiecare din

acestea fiind analizate prin HPLC. Utiliznd ecuaia dreptei de regresie (6.4):

39

Arie pic = 6,2136 x Concentraia (g/mL) + 0,6774

s-a calculat concentraia MEL pe soluiile prob analizate cromatografic (Cp n g/mL) (relaia 7.2).

pArie 0 ,6774C

6 ,2136= (g/mL) (7.2)

innd cont de toate diluiile efectuate n cadrul pregtirii

probei pentru analiz, concentraia n MEL / comprimat va fi (conform relaiei 7.3):

0,6774 9 50 1100

6,2136 6 2,5 1000Arie MC

a= (mg/cp) (7.3)

unde: C mg MEL / comprimat;

A aria picului msurat; M masa medie a comprimatelor; a cantitatea de pulbere de comprimate luat n lucru.

Rezultatele obinute sunt reprezentate n tabelul 7.2.

Tabelul 7.2. Date experimentale obinute la analiza MEL din

comprimate de 15mg

Nr. det.

Masa mediecp (g)

a(g) pulbere

Arie pic

mg MEL/cp determinat (masa medie)

Regsire (%)

Acceptat (%)

1 137,9 15,05 100,32 2 134,7 14,7 97,98 3

0,1807 0,7956137,6 15,01 100,10

Medie 14,92 99,47 7,5% Concluzie: din datele experimentale prezentate n tabelul 7.2

se constat c valoarea medie a coninutului n MEL / comprimat (14,92mg/cp) se ncadreaz n limitele impuse de FR X (15mg 7,5 %, adic ntre 13,875 16,125mg).

Rezultatele obinute n cazul determinrii celorlalte AINS din forme farmaceutice se prezint n tabelul R7.

40

Tabelul R7. Rezultate experimentale obinute la determinarea unor antiinflamatoare nesteroidiene din forme farmaceutice prin HPLC

Cantitate (mg) AINS Denumire comercial / Productor Form declarat determinat

TEN Tenoxicam Neo-endusix,

Anfarm Hellas S.A., Pharmaceutical Industry

comprimat filmat 20 20,70

KET Ketorol, Dr. Reddys Laboratoires comprimat

filmat 10 9,83

PIR Piroxicam LPH LaborMed PHARMA comprimat 20 20,76

MEL Meloxicam LPH LaborMed PHARMA comprimat 15 14,92

KTP Ketoprofen SR, Terapia capsul 200 196,71 DIC Diclofenac, Terapia comprimat 50 49,17

IND Indometacin, Arena Group SA capsul 50 49,42

NIM Nimesulid LPH LaborMed PHARMA comprimat

filmat 100 102,50

IBP Paduden, Terapia capsul 200 198,72

Conform datelor experimentale obinute, toate formele farmaceutice analizate se ncadreaz n limitele de abateri prevzute de FR X, att n ceea ce privete uniformitatea masei ct i n ceea ce privete coninutul de substan activ.

41

CAPITOLUL 8. METOD HPLC RAPID PENTRU DOZAREA KETOPROFENULUI

DIN PLASMA UMAN

Scopul acestui studiu a fost de a dezvolta i valida o metod HPLC nou, simpl i eficient pentru cuantificarea KTP n plasma uman, pentru monitorizarea la nivel clinic.

Material i metod Soluiile etalon Substana etalon de referin de KTP a fost furnizat gratuit de

S.C. Terapia Ranbaxy SA (Cluj-Napoca, Romnia). Solvenii utilizai (ACN grad HPLC, acid trifluoroacetic i MeOH grad analitic) au fost produi de Merck KGaA (Darmstadt, Germania). Apa bidistilat, deionizat pentru injecii au fost produse de Unitatea (laboratorul) de perfuzii al Universitii de Medicin i Farmacie Cluj-Napoca (Romnia). Plasm uman martor a fost furnizat de Centrul de Transfuzie a Sngelui (Cluj-Napoca, Romnia), de la voluntari sntoi, brbai i femei.

Echipamentele utilizate au fost urmtoarele: balane standard de precizie analitic (Mettler-Toledo, Elveia), vortex (Scientific Industries, New York, SUA), baie de ultrasonare Elma Transsonic 700 / H (Singen, Germania), sistem Sistemul HPLC serie 1100 Agilent Technologies (Darmstadt, Germania). Separarea cromatografic a fost efectuat pe o coloan Zorbax SB-C18 (100 x 4.6 mm id, faza staionar cu particule de 3,5m), n condiii izocrate, folosind o faz mobil de 55:45 (v/v) amestec de ACN i 1% (v/v) acid trifluoroacetic n ap la 45C, la un debit de 1,5mL/min. Detecia KTP a fost efectuat la 257nm, utiliznd un detector UV.

Soluia stoc de KTP (1,27mg/mL) a fost preparat prin dizolvarea unei cantiti corespunztoare de KTP n MeOH. Soluia de lucru (15,32g/mL) a fost pregtit printr-o diluie corespunztoare n plasma uman fr medicamente. Aceast soluie a fost folosit pentru a pregti standardele de calibrare n plasm, cu concentraii de 0,153; 0,306; 0,613; 1,226; 1,532; 2,299; 4,597; 7,662 i, respectiv, 19,155g/mL. Probele de control, cu concentraii de

42

0,460g/mL (mic), 1,839g/mL (medie) i 6,130g/mL (mare), au fost preparate prin adugarea volumelor corespunztoare de soluie de lucru la plasma uman fr medicamente. Etaloanele de calibrare n plasm i soluiile de control rezultate au fost pipetate n tuburi din polipropilen de 15mL i stocate -20C pn n momentul analizei.

Soluiile pentru validarea diluiilor (VAL-DILconc 38,310g/mL) au fost proaspt preparate n ziua analizei, prin adugarea de 150L de soluie stoc la 4850L plasm martor.

Etaloanele i probele de plasm (0,2mL) au fost deproteinizate cu MeOH (0,6mL). Dup amestecare n vortex (10s) i centrifugare (6min la 6000rpm), supernatantul (0,15mL) a fost transferat n flacoane de autoinjector i, din acestea, alicote de 20L au fost apoi injectate n sistemul HPLC.

Specificitatea metodei a fost evaluat prin compararea

cromatogramelor obinute din probele de plasm cu coninut de KTP fa de cele obinute din diferitele probele de plasm martor (n = 6). Concentraia de KTP a fost determinat n mod automat de sistemul de date al instrumentului HPLC utiliznd ariile picurilor i metoda de calibrare cu standard extern. Curba de calibrare a fost determinat cu ajutorul analizei de regresie liniar (ecuaia 8.1):

Arie pic = a x Concentraia + b (rspuns ponderat liniar) (8.1)

unde: Concentraia - concentraia de analit (g/mL) Arie pic aria picului analitului a - panta curbei de calibrare b - interceptul.

Precizia intra-zi (exprimat ca i coeficient de variaie, CV%)

i acurateea (exprimat ca diferena relativ dintre concentraia obinut i ce teoretic, eroare %) au fost determinate prin analiza a cinci injecii diferite (n = 5) din fiecare prob de control (concentraie mic, medie i mare), n aceeai zi. Precizia inter-zile i acurateea au fost determinate prin analiza unei probe de control de la fiecare nivel de concentraie (sczut, mediu si ridicat), n cinci zile diferite (n = 5).

Limita inferioar de cuantificare (LLOQ) a fost stabilit ca fiind etalonul de calibrare cel mai mic care poate fi obinut cu o acuratee i o precizie mai mici de 20%.

43

Recuperrile absolute au fost msurate prin compararea rspunsului etalonului de plasm contaminat controlat cu KTP cu rspunsul etalonului n solvent ce are aceeai concentraie de KTP ca i plasma.

Pentru validarea diluiei probelor, o prob de VAL-DILconc a fost diluat 1:10 (v/v) cu plasm martor i analizat n timpul testelor inter-probe, n cinci zile diferite (n = 5). Cel puin ntr-o zi, cinci probe de VAL-DILconc (n = 5) au fost ulterior diluate 1:10 (v/v) i analizate n scopul de a evalua precizia i acurateea pe parcursul aceleai zile.

Ulterior a fost studiat stabilitatea KTP n plasm la nivelele inferioare i superioare (n = 5). Pentru testul de stabilitate pe termen scurt la temperatura camerei (RTS), probele au fost pregtite i se pstreaz la temperatura camerei timp de 4h, apoi prelucrate i analizate prin HPLC. Pentru testul de stabilitate post-preparare (PPS), probele au fost pregtite, prelucrate i termostatate la 25C n suportul de probe ale autosampler-ului HPLC timp de 12-24 ore nainte de a ncepe testarea cromatografic. Pentru studiul stabilitii pe termen lung (LTS), probele au fost depozitate la o temperatur mai mic de -20C i analizate pe parcursul a dou luni. Pentru studiul stabilitii la nghe - dezghe (FTS), probele au fost supuse la trei cicluri de operaii de nghe - dezghe n trei zile consecutive (n = 3). Cerina pentru stabilitatea medicamentului este ca diferena dintre concentraiile medii ale probelor analizate n diferite condiii i concentraiile nominale s se ncadreze n intervalul 15%.

Rezultate i discuii Prin prezentul studiu se propune o pre-tratare simpl i rapid

a probelor de plasm, care include precipitarea proteinelor (PP) cu MeOH, centrifugare i injecie direct LC a unei poriuni (alicote) de supernatant.

Deoarece nivelurile plasmatice terapeutice de KTP sunt foarte mici (20g/mL), LLOQ stabilit n metoda noastr poate fi acceptat n scopuri de rutin pentru monitorizarea KTP la concentraii terapeutice, n plasma adulilor i copiilor.

Condiiile cromatografice, n special compoziia fazei mobile, au fost optimizate prin mai multe ncercri pentru a obine un semnal bun, timp de retenie scurt i, n consecin, o productivitate ridicat. Cele mai bune rezultate au fost obinute cu amestec de ACN i acid

44

trifluoroacetic 1% n ap (55:45, v/v) n condiii izocrate. n condiiile cromatografice alese, timpul de retenie al KTP a fost de 1,7 min i durata analizei a fost de 2,1 min.

Validarea metodei Metoda a fost validat n conformitate cu reglementrile

internaionale. Cromatogramele reprezentative pentru plasm fr KTP i plasma contaminat controlat cu KTP la LLOQ sunt prezentate n figura 8.2. Nu au existat compui (picuri) care s interfereze dintre componentele endogene plasmatice, la i n jurul timpului de retenie al KTP.

Fig. 8.2. Cromatogramele pentru plasm fr KTP (imaginea de sus),

plasma contaminat controlat cu KTP la limita inferioar de cuantificare (0,153g/mL) (mijloc) i o prob de plasm obinut de

la un pacient la 2 ore dup administrarea a 50mg KTP (concentraie gsite: 4,428g/mL) (imagine jos)

45

Curbele de calibrare au fost liniare n intervalul de concentraie 0,153 - 19,155g/mL n plasm uman, cu un coeficient de corelaie mai mare de 0,9997. LLOQ a fost 0,153g/mL. Valorile obinute n timpul procesului de validare al probelor de plasm (pentru precizie i acuratee intra- i inter-zi) sunt prezentate n tabelele 8.2 i 8.3.

Tabelul 8.2. Precizia intra-zi (CV%), acurateea (eroare %) i

gradul de recuperare - determinarea KTP n plasma uman (n = 5) -

Concentraia gsit

(medie) Grad de recuperare Concentraie

nominal (g/mL) g/mL SD

CV (%)

Eroare (%)

(%) SD 0,1532 0,1524 3,57 2,3 -0,5 101,1 2,1 0,4597 0,4416 17,47 4,0 -3,9 96,5 3,9 1,8389 1,7864 24,68 1,3 -2,9 100,3 1,3 6,1296 5,9327 28,72 0,5 -3,2 99,2 0,5

Tabelul 8.3. Precizia inter-zi (CV%), acurateea (eroare %) i

gradul de recuperare - determinarea KTP n plasma uman (n = 5) -

Concentraia gsit

(medie) Grad de recuperare Concentraie

nominal (g/mL) g/mL SD

CV (%)

Eroare (%)

(%) SD 0,1532 0,1606 9,61 6,0 4,8 103,6 3,5 0,4597 0,4448 5,13 1,2 -3,2 97,9 0,7 1,8389 1,7808 19,84 1,1 -3,2 99,6 1,5 6,1296 5,9578 88,27 1,5 -2,8 99,2 1,5

Toate valorile pentru acuratee i precizie au fost n limitele

recomandate. Valorile gradului de recuperare au fost cuprinse ntre 96,5 103,6%. Diluiile din plasm au putut fi fcute cu un CV% mai mic de 1,8% i o acuratee mai mic de 2,6% pentru determinrile n cadrul analizelor i printre analize (tabelul 8.4).

KTP a artat o bun stabilitate n probele de plasm la temperatura camerei timp de 4h (CV -5,0% la nivelul inferior i -3,5% la nivelul superior), precum i o bun stabilitate post-preparare n autosampler pentru cel puin 17 ore la 25C nainte de testarea

46

cromatografic (CV de -3,2% la nivelul inferior i -2,9% la nivelul superior).

Tabelul 8.4. Precizia (CV%), acurateea (eroare %) i gradul de recuperare

- validarea diluiei (n = 5) -

Concentraia gsit (medie)

Concentraie nominal (g/mL) g/mL SD

CV (%)

Bias (%)

Intra-zi 3,831 3,889 69,3 1,8 1,5 Inter-zi 3,831 3,932 29,3 0,7 2,6 KTP are o bun stabilitate pe termen lung n plasma stocat

sub -20C timp de 5 sptmni (CV de -2,1% la nivelul inferior i 0,1% la nivelul superior), precum i o bun stabilitate la succesiunea nghe - dezghe n plasma trecut prin trei cicluri de nghe - dezghe (CV de -7.5% la nivelul inferior i -2,2% la nivelul superior).

Metoda validat de analiz ce a fost dezvoltat s-a aplicat ntr-un studiu de farmacocinetic a KTP la voluntari sntoi. O cromatogram reprezentativ al unei probe de plasm obinut de la un voluntar sntos la 2 ore dup administrarea KTP, este prezentat n figura 8.2 (concentraia gsit: 4,428g/mL).

8.4. Concluzii Metoda dezvoltat n prezentul studiu este simpl, rapid,

precis i nu implic un cost deosebit. Prin comparaie cu alte metode de analiz HPLC publicate, pentru determinarea cantitativ a KTP n plasma uman sau animal, metoda propus de doctorandul n farmacie se comport mai bine n ceea ce privete viteza i costurile, atribute eseniale pentru metodele utilizate n analize de rutin. Aceast metod a fost validat n intervalul de concentraie 0,153-19,155g/mL, care acoper concentraiile plasmatice terapeutice (< 20g/mL) de KTP. Aceast metod se preteaz pentru o productivitate crescut i a fost aplicat cu succes ntr-un studiu farmacocinetic, dar poate avea aplicaii pe scar larg n monitorizarea KTP la concentraii de nivel terapeutic, a interaciunilor medicamentoase i n studii toxicologice.

47

CONCLUZII GENERALE

Lucrarea de doctorat, n afara capitolului introductiv i a scopului i obiectivelor tezei, este structurat n dou pari majore, o parte teoretic ce conine un numr de 4 capitole i o parte personal ce conine un numr de 4 capitole, concluziile generale, perspectivele de cercetare i bibliografia utilizat.

Partea teoretic prezint: n Capitolul 1 se prezint unele generaliti asupra

medicamentelor AINS, mecanismele inflamaiei, tratamentul acesteia, clasificarea AINS, relaia structur activitate biologic, unele aspecte farmacologice generale (farmacocinetic, farmacodinamie, farmacoterapie) precum i unele aspecte privind cele 10 medicamente antiinflamatoare studiate (MEL, PIR, TEN, NIM, IBP, IND, DIC, KTP, KET i FB) cum sunt: structura chimic, unele proprieti fizico chimice sau aspecte farmacologice particulare.

Capitolul 2 este dedicat prezentrii modului de absorbie a

luminii de ctre compuii organici. Se discut aspecte privind originea spectrului UV-VIS, principiile generale ale spectrometriei de absorbie i unele aplicaii ale acesteia n analiz, ca de exemplu confirmarea identitii substanelor, spectrofotometria n UV-VIS ca modalitate de detecie n HPLC, identificarea compuilor separai prin HPLC, puritatea picului cromatografic.

Capitolul 3 al tezei prezint aspecte asupra analizei

medicamentelor AINS prin HPLC (generaliti ale metodei HPLC, coloane cromatografice utilizate n HPLC, aplicaii ale HPLC n analiza medicamentelor i un studiu bibliografic asupra determinrii substanelor studiate prin aceast tehnic).

Ultimul capitol al prii teoretice, capitolul 4 prezint modul

de evaluare a rezultatelor obinute, anume validarea metodei analitice. Dup o prezentare general a noiunilor de validare, se prezint informaii asupra specificitii / selectivitii metodei, modul

48

de stabilire a lungimii de und, identificarea picului corespunztor analitului studiat, verificarea puritii picului, linearitatea metodei, linearitatea rezultatelor, limita de detecie, limita de cuantificare, intervalul de lucru, precizia i exactitatea, robustee i stabilitatea metodei.

Partea personal a tezei este constituit din urmtoarele

capitole: n Capitolul 5 se prezint modul n care a fost elaborat

metoda de separare prin HPLC. Se discut pentru nceput aspecte privind solubilitatea AINS studiate n diveri solveni, optimizarea prin spectrofotometrie n UV-VIS a lungimilor de und pentru detecia n HPLC, nregistrndu-se spectrele de absorbie n diferii solveni (MeOH, ACN, ap, soluii tampon, soluii apoase de metanol de diferite concentraii). n continuare, se arat modalitatea prin care se construiete o bibliotec spectral pentru a fi folosit la determinri calitative n cadrul analizei prin HPLC. n ceea ce privete separarea propriu-zis prin HPLC, se prezint influena pe care o are debitul fazei mobile i compoziia acesteia asupra performanelor separrii cromatografice. Odat stabilite condiiile de separare se discut modul de alegere judicioas a lungimilor de und de detecie pentru fiecare compus studiat n parte.

Capitolul 6 al tezei de doctorat este dedicat validrii metodei

unice de analiz elaborate pentru fiecare din cei 10 AINS studiai. Pentru fiecare compus studiat se prezint modul prin care se

face identificarea acestuia din soluii de probe, studiul linearitii (att linearitatea metodei ct i linearitatea rezultatelor), limitei de detecie, limitei de cuantificare, preciziei (precizia sistemului, precizia metodei, precizia intermediar) i exactitatea. La final, toate aceste date sunt grupate ca i concluzii ale validrii, pentru a scoate mai repede n eviden toi aceti parametri.

Dup cum s-a observat din datele experimentale obinute n urma validrii metodei pentru cele 10 medicamente AINS, durata analizei este de maxim 10 minute, timp n care se pot separa toi cei 10 componeni (dac se afl n concentraie mic, deoarece n acest caz limea la baz a picurilor este mic avnd astfel valori suficient de bune pentru rezoluie). Pe de alt parte, deoarece este puin probabil ca toi cei 10 compui s se afle simultan ntr-o prob,

49

aceast metod unic poate fi aplicat cu succes pentru separarea, identificarea i determinarea cantitativ a oricrui compus din cei 10 menionai. Cercetri preliminare denot faptul c exist i alte medicamente din aceast clas ce pot fi separate prin aceast metod.

n ceea ce privete linearitatea metodei, conform datelor experimentale obinute, pentru toate cele 10 medicamente antiinflamatoare studiate, metoda este liniar, coeficienii de regresie fiind n toate cazurile mai mari de 0,9990. Pentru KET, DIC, NIM i IBP, domeniul de lucru pornete de la o concentraie mai mare dect n celelalte cazuri deoarece pentru compuii menionai ariile picurilor la concentraii mai mici de 1g/mL sunt mai mici dect limita de detecie, n unele cazuri avnd valori comparative cu zgomotul de fond.

n acelai timp, n toate situaiile rezultatele calculate sunt n bun corelaie cu valorile teoretice, la reprezentarea grafic a acestei dependene se obin drepte cu pant unitar sau foarte apropiat de unitate, cu intercept foarte mic i cu valori ale coeficienilor de regresie foarte buni (mai mari de 0,9990).

Metoda elaborat i validrile efectuate confirm faptul c n toate cazurile se obin valori bune pentru limita de detecie (0,31 1,48g/mL) i limita de cuantificare (1,57 4,50g/mL).

De asemenea, metoda de separare i determinare cantitativ a celor 10 AINS prezint o bun precizie, valorile experimentale obinute pentru precizia sistemului ncadrndu-se n intervalul RSD = 0,5400 1,0999%, pentru precizia metodei n intervalul RSD = 1,2329 2,9573% i pentru precizia intermediar n intervalul RSD = 1,1444 2,3410%.

Metoda de separare i determinare cantitativ a celor 10 AINS este exact, datele experimentale artnd o regsire medie a acestor medicamente n intervalul 98,31 100,43% cu minime n intervalul 96,3 98,5% i maxime n intervalul 101,1 103,0%.

Capitolul 7 al tezei prezent o serie de aplicaii ale metodei de

determinare prin HPLC a medicamentelor antiinflamatoare studiate i anume determinarea: MEL din comprimate (Meloxicam LPH LaborMed PHARMA, 15 mg), PIR din comprimate (Piroxicam LPH LaborMed PHARMA, 20 mg), TEN din comprimate filmate (Tenoxicam Neo-endusix, Anfarm Hellas S.A., Pharmace