Universitatea Tehnica “Gh. Asachi”, IasiFacultatea de Inginerie Chimica si Protectia MediuluiSpecializarea: Materiale moleculare înalt performante

ACIDUL HIALURONIC

Masteranda Dobria Mihaela Gabriela

1. Structura, obtinerea si proprietăţile acidului hialuronic

StructuraAcidul hialuronic este o polizaharidă descoperita de Karl Meyer şi J.W. Palmer în 1934.

Aceasta polizaharidă este compusă prin repetarea unor unităţi dizaharidice, acidul D-glucuronic (1,3) şi N-acetil-D-glucozamin legate prin legături glicozidice (1,4) (figura 1), care pot fi între 200 – 20 000 unităţi glicozidice pe lanţ.

Fig 1. Structura HA nativ

Masa sa moleculară poate să ajungă până la 107 g·mol-1. În soluţie, moleculele de HA formează o “reţea” continuă, foarte hidratată, posedând proprietăţi reologice, de rezistenţă, de presiune osmotică si de excluziune. Aşadar, HA este o polizaharidă cu masă moleculară mare, făcând parte din marea familie de polimeri numită glicozoaminoglicani (GAG).

GAG sunt molecule polizaharidice neramificate formate din unităţi dizaharidice repetitive care au pe suprafata lor numeroase sarcini negative date de radicalii sulfat şi carboxil. O unitate repetitivă este formata dintr-un glucid aminat (N-acetil-galactozamina sau N-acetil-glucozamina) si un acid uronic. Sarcinile negative au urmatoarele roluri:

Atrag ionii de Na+ care vor atrage la rândul lor apa şi se va realiza structura de gel puternic hidratat.

Sarcinile negative se resping între ele si prin urmare, moleculele de GAG ocupă un volum mare în raport cu greutatea lor moleculara. În spaţii se va găsi faza lichida a gelului, fapt care permite mobilitatea celulelor, proliferarea şi nutriţia lor.

      Marea majoritate a GAG, cu exceptia acidului hialuronic, se leagă covalent de miezuri proteice, formând proteoglicani.      Clasificarea GAG se face in 5 clase, în funcţie de tipul unităţii repetitive, numărul de grupări sulfat şi localizarea lor.

1. Acidul hialuronic (hialuronan), format din acid glucuronic si N-acetil-glucozamina. Este singurul nesulfatat, deci sarcinile sale negative vor proveni doar de la gruparile carboxil.

2. Dermatan sulfatul, format din acid iduronic si N-acetil-galactozamina3. Heparina (heparan sulfatul), format din acid iduronic si N-acetil-glucozamina4. Condroitin sulfatul, format din acid glucuronic si N-acetil-galactozamina5. Keratan sulfatul este o exceptie, el fiind format din galactoza si N-acetil-glucozamina.Conformaţia zaharidelor individuale din HA este un factor de asemenea important

contribuind la forma generală a macromoleculei. Acidul glucuronic si N-acetilglucozamina din macromolecula de HA apar predominant în forma scaun. Aceasta limiteaza flexibilitatea lanţului zaharidic care este o trăsătură comună a familiei de polimeri GAG. În funcţie de aceste

2

constrângeri , HA poate avea în soluţie pe lângă segmentele de catenă rigide şi segmente foarte flexibile.

HA este un polimer natural compus din unităţi dizaharidice ale acidului glucuronic si N-acetilglucozamina. Masa moleculară a HA nativ este de obicei de ordinul milioanelor. Fiecare unitate dizaharidică a HA conţine trei poziţii posibile pentru modificare: o grupa hidroxilică, una carboxilică şi alta acetamidică.

Hialuronanul se găseşte în matricele extracelulare ale ţesuturilor vertebratelor, în general, în asociaţie cu proteinele, dar cu precădere în lichidul sinovial, umoarea vitroasă a ochilor şi in cordonul ombilical. Rolul său a fost considerat înainte doar acela de a umple spaţiile intracelulare, datorită capacităţii sale de a reţine apa, însă în prezent este stabilit faptul că HA intervine în numeroase procese biologice fundamentale cum ar fi: reproducerea, adeziunea, diferenţierea celulară şi inflamaţiile. El este în aceeaşi măsură cunoscut atât pentru proprietăţile fizico-chimice cât şi a celor biologice, proprietăţi ce depind puternic de lungimea lanţului polimeric. Astfel că, în funcţie de lungimea lanţului de HA, proprietăţile acestuia pot fi chiar antagoniste.

ObţinereaAcidul hialuronic poate fi obţinut, prin

extracţie din diverse ţesuturi animale, cum ar fi creasta de cocoş, cordonul ombilical, umoarea vitroasă a ochiului,

fermentaţii bacteriene având ca sursă familia Streptococcus.

În ambele cazuri el trebuie purificat. HA obţinut prin aceste procedee posedă o masă moleculară foarte mare care îi conferă o vâscozitate ridicată.

Studiile recente pe oligozaharide HA în complex cu HA degradat enzimatic au arătat că şi lanţurile scurte de HA pot fi stabilizate într-o varietate de conformaţii pentru a se lega de proteine. Aceste observaţii conduc la ipoteze cum că proteinele pot acţiona pentru organizarea HA, fixând şi favorizând anumiţi conformeri ai polimerului, ducând la formarea unor structuri bine ordonate cu funcţionalităţi specifice. Acest lucru este ilustrat în figura 2 unde trei populaţii distincte de HA sunt vizibile pe o singură celula a muşchiului neted. Acestea includ fâşii de HA pe suprafaţa celulară, care sunt asociate cu receptori de HA tip CD44, dar şi fire lungi de HA. Pe suprafaţa celulei se mai găsesc şi baghete de HA care sunt imunoreactive. Interesant este faptul că leucocitele mononucleare aderă la firele de HA (prin receptorii de tip CD44 de pe suprafaţa celulei) dar nu se asociază cu fâşiile sau fibrele de HA, astfel indicându-se existenţa unor populaţii de HA diferite din punct de vedere structural şi funcţional.

3

Figura 2. Trei populaţii diferite de HA într-o singură celulă de muşchi neted

Proprietăţile soluţiei de HA Proprietăţile HA sunt greu de determinat cu ajutorul metodelor clasice în care au fost

dezvoltate analize simple pentru proteine şi care cer proprietăţi apropiate de soluţiile ideale Newtoniene. Comportamentul acidului hialuronic nu se apropie nici pe de parte de “idealul” Newtonian. Sandy Ogston, Torvard Laurent, Endre Balazs şi mai târziu Bob Cleland au elaborat teorii şi structuri experimentale care stau la baza cercetării proprietăţilor biofizice ale HA.

În soluţie apoasă HA este descris ca un ghem statistic cu o rigiditate intrinsecă considerabilă. Această rezistenţă a fost atribuită legăturilor de hidrogen intramoleculare de-a lungul a două legături glicozidice. S-a arătat ca solventul şi lungimea lanţului joacă un rol important în formarea legăturilor de hidrogen.

Fig. 3 Comportamentul acidului hialuronic în soluţie diluată şi respectiv concentrată

Metoda FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) este o metodă puternică de determinare a proprietăţilor soluţiilor concentrate de polimeri, cum ar fi HA, de asemenea este şi o metodă de echilibru care se aplica soluţiilor fără gradient de concentraţie, în absenţa curgerii şi fortelor de forfecare.

Fluorescence Recovery After Photobleaching

Există cativa factori care pot contribui la proprietătile solutiei de HA, cum ar fi:1. interacţiunile electrostatice dintre grupele carboxilice; 2. legăturile de hidrogen dintre zaharidele adiacente;3. domeniul de suprapunere şi încalcire a polimerului;4. asocierea lanţ-lanţ prin mecanisme ce au la baza interacţiuni hidrofobe.

S-a arătat ca metoda FRAP permite calculul concentraţiilor soluţiilor de HA peste concentraţia critică la care are loc suprapunerea lanţurilor macromoleculare. Deci, această

4

metodă este potrivită studiilor de încalcire şi asociere lanţ-lanţ. Deoarece proprietăţile reologice şi hidrodinamice ale soluţiei depind de efectele electrostatice şi ionice ale reţelei de HA, s-a studiat sensibilitatea acestora in funcţie de tipul şi valenţa contraionului. Influenţa legăturilor de hidrogen a fost studiată prin compararea proprietăţilor soluţiilor în apa deionizată, 0,5 M NaCl si 0,5 M NaOH. S-a arătat ca electrolitul a ecranat interacţiunile electrostatice iar ioni HO - au influenţat rigiditatea lanţurilor de HA. Prezenţa asocierilor lanţ-lanţ, care poate implica interacţiuni hidrofobe, a fost studiată în condiţii fiziologice, în solvenţi cu polaritate diferită. Asocierile intermoleculare lanţ-lanţ au fost deasemenea studiate prin folosirea de oligozaharide HA ca şi compusi competitori (cu masa moleculară mică).

2. Importanţă şi aplicaţii

Există o familie de enzime numite Hialuronidaze (HA-ze), care sunt capabile să hidrolizeze HA după diverse mecanisme. O importanţă deosebită a cuplului HA/HA-ze a fost demonstrată în unele boli, ca artrita reumatică, dar mai ales în cancer.

În decursul timpului, HA a făcut posibile diverse aplicaţii în domeniul medical, farmaceutic şi cosmetic. Datorită proprietăţilor fizico-chimice unice, el este folosit pentru aplicaţii ca lubrefianţi (pentru articulaţii şi oftalmologie), pentru construirea de biomateriale pentru ingineria ţesuturilor, pentru elaborarea de dispozitive cu eliberare controlată a principiilor active si pentru fabricarea de produse cosmetice de înfrumuseţare cu proprietăţi de hidratare a pielii.

5

Figura 3. HA utilizat în domeniul cosmetic

Aplicaţii posibile ale HA nemodificat

OftalmologiePicăturile apoase de pus în ochi au dezavantajul că mai mult de 75% din soluţia aplicată

se pierde prin drenaj în primele 2 minute. De aceea se adaugă polimeri soluţiei cu rolul de a mări vâscozitatea si de a creste astfel timpul de stationare al medicamentului. Gurny si colaboratorii au aratat ca solutiile de HA au capacitatea unica de a prelungi timpul de stationare al pilocarpinei in apropierea precorneei. Acestia au sugerat ca HA interactioneaza direct cu membrana celulara a tesutului corneal.

Eliberarea controlată de medicamenteÎn unele experimente s-a observat ca HA marcat izotopic s-a deplasat din fluidul sinovial

în nodulii limfatici. După injectarea intravenoasă în şoarece a unei cantităţi mari de HA marcat s-a observat ca după un timp HA se găseşte în nodulii limfatici. Această observaţie a arătat potenţialul HA de a fi folosit ca purtător de medicamente prin sistemul limfatic către locul ţintă pentru tratarea diferitelor tumori maligne.

DermatologieDatorita permeabilităţii slabe si naturii lipofilice a pielii umane, foarte puţine

medicamente pot fi livrate transdermal pentru atingerea nivelelor terapeutice în piele. În ultimii ani s-au obţinut rezultate promiţătoare în tratamentul artritei şi cancerului de piele cu ajutorul unor medicamente pe bază de HA. Rezultate foarte bune obţinându-se în cazul diclofenacului.

ChirurgiePrevenţia formării postoperatorii a adeziunilor este o problemă mereu actuală.

S-a arătat că soluţiile de HA reduc adeziunile după chirurgia abdominală şi ortopedică. Mitchell şi colaboratorii au arătat că adeziunile pericardice postoperatorii sunt mult diminuate dacă se administrează animalului o solutie de 0,4% HA in timpul pericardiotomiei. Mecanismul real prin care soluţiile de HA previn formarea adeziunii este încă necunoscut.

ImplanturiBioincompatibilitatea unor implanturi mamare, cum ar fi gelurile siliconice, a dus la

căutarea de noi alternative. Lin şi colaboratorii au studiat posibilitatea folosirii HA ca material de umplere. S-a arătat că implanturile pe bază de HA au aceeaşi consistenţă ca gelurile siliconice, dar permit o mai bună vizualizare a structurii sânului în jurul implantului. După primul an de la implantare în animal nu s-a observat nici o reacţie adversă.

Viscosuplimentarea reprezintă o tehnică relativ recentă şi constă în injectarea unui lichid conţinând acid  hialuronic în articulaţia genunchiului. Acidul hialuronic reprezintă o substanţă naturală, componentă a lichidului sinovial (lichidul care se găseşte în articulaţie) şi care are efect de lubrefiere, pentru a permite extremităţilor oaselor să alunece una pe cealalată, absoarbind şocurile transmise în articulaţie prin încărcare.

6

3. Biodegradarea acidului hialuronic

Biodegradarea acidului hialuronic este un process treptat. În spaţiul extracelular a majorităţii ţesuturilor se găseşte HA cu masă moleculară mare. Împreună cu alte structuri macomoleculare HA contribuie la proprietăţile mecanice ale reţelei. Prin urmare, pentru a fi eliberat din această reţea solidă, polimerul trebuie să fie cel puţin parţial degradat prin mecanisme mediate de receptori sau prin endocitoză. În compartimentul lizozomal, acidul hialuronic este hidrolizat la oligozaharide de către hialuronidazele intracelulare, fragementele fiind în cele din urmă degradate la monozaharide de către exo-glucozidazele aflate în lizozomi.

În ţesuturile tari, cum ar fi osul sau cartilajul, cu sau fără drenaj limfatic, HA este degradat "in situ", împreună cu alte molecule ECM (colagen şi proteoglacani). În pielii şi articulaţii, doar o fracţiune minoră (aproximativ 20-30%) de HA este stocat şi degradat în ţesuturi Aproximativ 50% din HA din organism se găseşte în ţesuturile pielii.

Fig. 4 Principalele căi de catabolizare a acidului hialuronic

Degradarea enzimaticăCea mai importantă degradare a HA în mediul biologic este catalizată de enzimele numite

„hialuronidaze” sau „liaze”. Conform mecanismului de degradare, hialuronidazele sunt împărţite în trei categorii:

(1) hialuronat-4-glicanohidrolaze, care hidrolizează legăturile -N-acetil-glucozaminice;

(2) hialuronat-3-glicanohidrolaze; (3) hialuronat-liaze.

7

Asemănător hidrolizei acide, HA este hidrolizat enzimatic de către hialuronidaze printr-un mecanism statistic de degradare.

Fig 4. Acţiunea hialuronidazei bacteriale asupra hialuronanului (Ac = acetat).

Degradarea enzimatică a hialuronanului are loc de obicei în soluţie tampon de acetat de sodiu la care se adaugă acid acetic pentru a se obţine un pH ≈ 4,8-6,0, unde majoritatea acestor enzime sunt active. Temperatura de degradare este de obicei 37 oC.

Degradarea prin metode non-enzimatice

În ciuda faptului că HA este un compus stabil în condiţii normale, scindarea lanţurilor de polimer se pot face şi prin intermediul unor metode non-enzimatice fie prin reacţii cimice dar şi prin metode fizice în condiţii critice precum:

uscarea prin congelare; forfecare amestecare, agitare

Celulele formează specii reactive de oxigen (ROS) ca o consecinţă a respiraţiei anaerobe normale. Răspunzători de scindarea lanţului polimeric al acidului hialuronic sunt doar cateva dintre aceste specii precum:

anioni superoxid - -radical liber de oxigen care are un electron in plus, fiind foarte reactiv si toxic;

radicalul hidroxil - acest radical are un electron nepereche în orbita sa electronică cea mai îndepărtată, care se uneşte cu alţi electroni, formând legături chimice;

Ion hipoclorit est ClO- ;

Specii derivate din peroxinitriţi.Aceste specii reactive de oxigen sunt implicate în câteva procese biodegenerative şi

inflamatorii precum artrita. Depolimerizarea acidului hialuronic în fluidul sinovial în timpul debutului precoce al artritei este considerat a fi cauzată de ROS şi nu de hialuronidază. Fluidul sinovial normal este vâscoelastic datorită prezinţei de HA de masa moleculară mare. Sinoviocitele secretă continuu macromolecule în fluidul sinovial, inclusiv HA. Fluidul este împins în afara cavităţii articulaţei în microcapilare integrate în sinoviu, pe măsură ce presiunea creşte. Pe această cale moleculele de HA ies prin pori interstiţiali de drenaj în căptuşeala sinovială (garnitura articulară de 30 – 90 nm), scăzând motilitatea asemenea moleculelor de HA mai mici (Fig. 5).

8

Fig. 5 Drenarea HA-ului din fluidul sinovial în sistemul limfatic

Concluzii

Metabolizarea HA-ului este dinamică. Unele celule, precum condrocitele sintetizează şi catbolizează HA astfel încât să menţină o concentraţie constantă în organism. Alte celule, de exemplu, celulele cutanate, sintetizează HA mai mult decât catabolizează.

Hialuronidaza şi ROS pot depolimeriza HA+ul suficient de mult pentru a putea fi eliberat din matricea extracelulară. Apoi, acesta este fie imediat absorbit în celule şi degradat de lizozomi fie este transferat în sistemul limfatic şi condus spre ficat, glande limfatice sau rinichi spre a fi catabolizate. Produşi finali de degradare, acidul glucuronic şi N –acetilglucozamina pot fi reutilizaţi pentru biosinteza de HA. În această manieră, acidul hialuronic din organismul uman este îndepartat metabolic şi înlocuit zilnic.

9

4. Metode de degradare şi modificare a HA

HA poate fi degradat la fragmente mai mici prin: metode chimice (condiţii acide sau alcaline), fizice (agitare cu viteză mare, forfecare), sonicare, clivaj radicalic enzimatice.

Clivajul radicalic al HA are o mare importanţă în artrită şi îmbătrânire. S-a arătat că radicalii hidroxil sunt factorul esenţial în iniţierea degradării HA prin scindarea legăturii glicozidice. Cu cât concentraţia în radicali liberi este mai mare cu atât scăderea masei moleculare a HA este mai mare.

Degradarea cu ultrasuneteSoluţiile de HA sunt degradate de ultrasunete. Mecanismul şi cinetica degradării nu sunt

încă pe deplin cunoscute. S-a observat o relaţie liniară între inversul pătratului Mw şi timpul de reacţie. Sonicarea degradează HA într-un mod nestatistic, care duce la o distribuţie bimodală a masei moleculare medii gravimetrice. S-a sugerat că lanţurile mari de HA sunt degradate mai lent decât cele mici. S-a ajuns la concluzia că oricare ar fi energia ultrasunetelor, lanţurile de HA nu pot fi degradate la monomeri. În urma procesului de degradare cu ultrasunete se obţin lanţuri cu masă moleculară mai mare de 10 kDa.

Degradarea termică şi în funcţie de pHPrin metoda difuziei luminii s-a arătat că soluţiile de HA se degradează statistic atât în

mediu acid cât şi în mediu bazic. La pH alcalin legăturile de hidrogen care stau la baza organizării structurale a lanţurilor de HA sunt distruse, ceea ce duce la pierderea rigidităţii intrinseci şi formarea unui ghem mai compact şi mai flexibil. S-a arătat că vâscozitatea hialuronatului de sodiu, chiar şi în apă distilată, scade în funcţie de timp si exponenţial în funcţie de temperatură. În procesul de uscare prin îngheţare a HA s-a observat depolimerizarea radicalică a probei. La temperaturi înalte în prezenţa tiolilor sau metalelor tranziţionale, HA se degradează datorită radicalilor reactivi hidroxil. Degradarea HA în prezenţa ionului Fe 2+ se bazează pe procesul de oxidare în prezenţa oxigenului şi a Fe2+, proces în care se generează anionul-radical superoxid, O2

●−.

Ca agent reducator, O2●− regenerează Fe2+, iar agentul oxidant H2O2 este produs în reacţia cu un

hidroperoxid (HO2●).

10

Reacţii chimice de modificare a HA

HilaniiDerivaţii reticulati ai HA sunt denumiţi hilani. Laurent şi colaboratorii au folosit 1,2,3,4-

diepoxibutan pentru reticularea lanţurilor de HA. O metodă generală de reticulare a HA se bazează pe reacţia dintre formaldehida (sau alţi agenti, cum ar fi dimetilureea, etilenoxid, poliaziridina sau poliizocianat) şi HA la pH neutru, care implică grupele hidroxil ale polizaharidei şi grupele aminice ale proteinei. Legăturile dintre proteină şi HA sunt demonstrate de comportamentul de jeleu al soluţiei. În condiţii favorabile, două până la opt lanţuri de HA sunt conectate. Masa moleculară a hilanilor obţinuţi prin această metodă variază între 8 x 10 6 si 24 x 106 kDa, iar conţinutul de proteină este de 0,4-0,8%.

Alţi derivaţi de HADe asemenea au fost studiaţi şi derivaţi nereticulaţi ai HA. Pentru sinteza esterilor

carboxilici ai HA s-a propus reacţia dintre sărurile cuaternare de amoniu a HA şi agenţi de alchilare în solvenţi aprotici. Gradul de esterificare variază între 0 si 100%. Esterii HA sunt insolubili în apă, iar proprietăţile fizico-chimice diferă de ale HA original. HA poate fi modificat cu polimeri sintetici, cum ar fi poliuretanii, polielefinele, poli(alcoolul vinilic), polimeri acrilici, poliamide, poliesteri si polisiloxani.

a)

b)

c)

d)

e)

f)

11

g) h)

Figura 5. Cromofori fotoreactivi legati de HA pentru reticulare: (a) acid cinamic; (b) 1-carboxialchil-uracil; (c) 7-carboxialcoxil-cumarina; (d) 1,2-O-etanotimina; (e) 1,2-O-etano-5-triclorometil-uracil; (f) 1,2-O-etano-6-cianouracil; (g) 1,2-O-etano-6-clorometiluracil; (h) 1,2-O-etano-6-triclorometiluracil.

Prezenţa unei grupe hidrazidice permite cuplarea unor medicamente.

12

Fig. 6. Unitatea dizaharidică a HA funcţionalizată cu hidrazide

3. Depolimerizarea hialuronatului de sodiu în fază eterogenă

În ultimii ani creşte fără încetare cererea pentru lanţuri de HA de mărimi foarte variate, în funcţie de aplicaţia urmărită dar care sunt inferioare HA-ului obţinut prin fermentaţie bacteriană. Pentru a obţine lanţuri de HA de mărimi dorite, se va folosi o reducere controlată a mărimii HA bacterian. Pentru aceasta se pot folosi numeroase procedee: metode enzimatice, metode chimice şi metode fizice. Datorită specificităţii ridicate ale enzimelor, metodele enzimatice prezintă avantajul de a nu provoca alterarea structurii chimice a polimerului. Enzimele utilizate sunt de origine animală.

Studiului constă în exploatarea posibilităţilor folosirii metodelor chimice şi/sau fizice pentru obţinerea HA de mărimi dorite (Mw < 50 kDa), cu o slabă polimolecularitate şi mai ales, cu o structură chimică nealterată.

Datorită proprietăţilor vâsco-elastice, HA-ul de mărime mare este utilizat în special în aplicaţiile vâscozometrice. Două criterii importante în acest domeniu sunt biodegradabilitatea slabă a HA-ului şi o vâscozitate a produsului compatibilă cu modul de utilizare al acestuia, spre exemplu, injectarea produsului cu o seringă. Biodegradabilitatea HA-ului este în general diminuată în funcţie de modificarea chimică a acestuia. Totuşi, utilizarea acestui tip de produs duce la introducerea în organism a unui compus care nu este în totalitate natural iar vâscozitatea HA-ului modificat chimic nu este cu mult mai mică decât a celui nemodificat.

Realizarea şi urmărirea studiuluiDiverse metode chimice şi fizice de degradare a HA-ului fac deja obiectul multor studii.

Metodele chimice sunt: hidroliza acidă sau bazică sau, în plus, degradarea prin acţiunea diverşilor oxidanţi cum ar fi apa oxigenată, acidul hipocloros sau ionul peroxinitrat. Ca metode fizice amintim: tratamente termice, ultrasunetele, tratamentele cu microunde, iradieri cu raze UV sau . Totuşi, în cele mai multe cazuri, dacă aceste metode duc la diminuarea mărimii lanţului polimeric ele conduc în aceeaşi măsură şi la alterarea structuri chimice a acestuia. În anumite cazuri însă aceste degradări chimice sunt minore sau aproape inexistente, dar acest lucru presupune condiţii experimentale bine delimitate şi rezutate cu o slabă reducere a mărimii lanţului polimeric. În urma studiilor efectuate asupra diverselor polizaharide cele mai bune rezultate în degradarea nonezimatică s-au obţinut în cazul combinării metodelor chimice cu cele fizice, cum ar fi tratamentele cu ultrasunete a soluţiilor de HA care conţin ioni hipoclorit.

S-a urmărit combinarea hidrolizei acide în mediu eterogen cu un tratament termic moderat. Utilizarea mediului eterogen prezintă avantajul de a uşura aplicaţia, dar mai ales, recuperarea produsului final.

În protocolul de bază, HA de mărime mare este dispersat sub agitare într-un amestec (apă/solvent organic miscibil în apă) acidulat şi termostatat la o temperatură moderată. La un anumit timp, reacţia este oprită prin neutralizarea amestecului, iar produsul recuperat după decantare şi filtrare. Dacă este necesar, această etapă se repetă de mai multe ori. După această etapă, produsul este clătit de câte ori este nevoie pentru a elimina acidul şi sarea utilizate în amestec. Produsul final este uscat.

Hidroliza acidă, hidroliza bazică şi oxidarea cu H2O2, sunt trei reacţii foarte cunoscute pentru depolimerizarea HA în mediu apos. În ceea ce priveşte cinetica, hidroliza bazică este comparabilă cu hidroliza acidă. Oxidarea cu H2O2 este o reacţie foarte lentă, care după literatura de specialitate, poate fi catalizată de cationii metalelor tranziţionale. În acest caz s-a demonstrat că reacţia poate fi catalizată de ionii de Cu2+. Pe parcursul studiului realizat am observat că depolimerizarea oxidativă a HA-ului cu H2O2 necesită efectiv prezenţa ionilor de Cu2+. Atât polimolecularitatea ridicată a produselor, cât şi dificultatea de a filtra aceste produse face susceptibilă prezenţa complecşilor HA-Cu2+. Trebuie urmărit conţinutul de cupru în produsul final pentru a nu depaşi normele în vigoare. În acest scop am aprofundat studiul modificând pH

mediului de reacţie, ceea ce a dovedit că pH-ul este un parametru determinant, atât în plan cinetic, cât şi în plan calitativ.

În termeni de cinetică de reacţie, hidroliza acidă este comparabilă cu cea bazică, în timp ce, în plan calitativ hidroliza acidă este mai favorabilă în condiţiile unei bune neutralizari. O variantă a acestei metode este deja brevetată. Hidroliza bazică este mult mai degradantă şi implică folosirea unui tratament suplimentar al produsului final. Oxidarea cu peroxid de hidrogen este preferabilă celorlalte două metode, singura problemă, de altfel foarte importantă, fiind conţinutul de cupru din produsul final.

15

Bibliografie

1. Chemistry and Biology of Hyaluronan, H.G. Garg and C.A. Hales;2. http://en.wikipedia.org/wiki/Hyaluronan 3. Inhibition of hyaluronidase at high substrate concentration, Trias ASTERIOU, Jean-

Claude VINCENT and Brigitte DESCHREVEL.4. Studiul depolimerizării hialuronatului de sodiu în fază eterogenă realizat în

laboratorul ”Polimeri, Biopolimeri, Suprafeţe” (FRE 3101 CNRS – Universitatea Rouen) de către: Fériel AMAR – doctorandă în anul doi la Universitatea Rouen, Sanda BUCĂTARIU (ROTAR) – student Socrates/Erasmus, sub coordonarea ştiinţifică a doamnei profesoare Brigitte DESCHREVEL

16