COMPUSI CHIMICI DE BIOSINTEZA

ACIDUL CITRIC

Acidul citric

a fost izolat pentru prima dată din sucul de lămâie de către chimistul suedez Carl Scheele în 1784;

este un produs intermediar de metabolism aproape universal, fiind prezent în urme în aproape toate plantele şi animalele;

prima producţie comercială din fructe de lămâie a fost înregistrată în Anglia în 1826;

în 1893 Wehmer remarcă acumularea de acid citric într-un mediu cu conținut de zaharuri în prezența fungiei Citromyces

in 1917 Curie descoperă că anumite tulpini de Aspergillus niger prezintă o creştere abundentă, iar în timpul creşterii produc cantităţi mari de acid citric;

în 1923, în SUA., are loc dezvoltarea primei producţii industriale de acid citric si se datorează companiei Pfizer;

Domenii de utilizare - se bazează pe proprietățile sale acidulante, conservante, antioxidante, potențare de arome, dar și de chelare

Microorganisme producătoare pe substraturi zaharoase: Mucor piriformis, Penicillium luteum, P.citrinum, P.

restrictum, Talaromyces sp., Apergillus niger, A. clavatus, A. wentii, A. fumaricus, A. awamori, A. nidulans, A. fonsecaeus, A. luchensis, A. phoenicus,Trichoderma viride etc.

din fracţiuni de n-parafine: Arthrobacter paraffineus, specii de Corynebacterium, Penicillium restrictum şi diferite specii de drojdii din familia Candida (lipolytica, oleophila, citrica)

au fost utilizate la scară industrială pe diferite substraturi speciile Candida incluzând C. tropicalis, C. catenula, C. guilliermondii şi C. intermedia– dezavantaj: produc alaturi de acid citric cantitati destul de importante de acid i-citric;

importanţă practică prezintă numai Aspergillus niger, datorită obţinerii unor randamente ridicate de acid citric dintr-o gamă destul de variată de substraturi zaharoase.

Biochimia acidului citric

Ciclul Krebs

Materii prime

Sursă de carbon - gamă bogată de materii prime cu conţinut de mono- sau dizaharide (glucoza, fructoza, zaharoza, maltoză) ca melasa de sfeclă, respectiv trestie de zahăr, hidrolizate de amidon, melasă de citrice, deşeuri de fructe (ananas, fructe palmier după extracţia uleiului) subproduse din industria berii.

se impune purificarea melasei, care poate fi realizată fie prin reţinere pe schimbători de ioni, cărbune activ, bentonită, fie prin precipitare cu ferocianură de potasiu şi acid sulfuric la 80-1000C/15 min.

mutanţi de Yarrowia lipolytica au fost testaţi cu succes pe substraturi cu glicerină rezultată de la fabricarea de biodiesel, ape reziduale de la fabricarea uleiului de măsline, sau deşeuri de ananas.

Materiile prime complexe, nu necesită suplimentare de sursă de azot. In mediile simple sursa de azot este asigurată de amoniac sau săruri de amoniu (azotat sau sulfat), care pot fi suplimentate cu surse organice de azot (extract de porumb, hidrolizate proteice).

Tehnologii de fermentaţie Cultura de suprafaţă

Materia primă: melasă, purificată, diluată până la o concentraţie de zahăr de aprox. 15%, iar pH = 5-7;

Inocularea se realizează direct cu spori; Fermentator celular - celulele fermentatorului au o capacitate de 50 –

100 L şi o suprafaţă de 5 m2, grosimea stratului de mediu 5 - 20 cm; Temperatura 28-300C; pH-ul după 24 h scade la valoare 2; Aerare cu aer steril, umiditate 45-60%, debit variabil funcţie de faza de

creştere; Producţia de acid citric incepe după 2-4 zile; Durata: 8 – 15 zile; Randament 70-95% (57-77% din cel teoretic); Productivitatea trebuie să fie de peste 1 kg ac. citric/ (m2 strat

micelar×zi).

1.- vas preparare substrat; 2.- filtru de aer; 3.- saturator; 4.- preincalzitor aer; 5.- fermentator celular; 6.- vas colector mediu; 7, 11, 13.- filtre; 8.- vas spalarea micelii; 9.- vas colector filtrat; 10.- vas precipitare citrat de calciu; 12.- vas acidulare; 14.- rezervor acid brut; 15.- filtru presa; 16.- evaporator; 17.- cristalizor

Schema de principiu a instalatiei de fabricare a acidului citric din melasa prin cultura de suprafata

Cultura submersă înlătură principalele dezavantaje ale culturii de suprafaţă, necesită manoperă

mai mică, ocupă un spaţiu mai redus şi conduce la productivităţi mai mari; fermentatoarele, de diferite tipuri constructive (cu amestecare mecanică, tip

coloană sau air-lift) sunt confecţionate din oţel inoxidabil de înaltă puritate, datorită mediului puternic acid şi a capacităţii acidului citric de a dizolva ioni metalici; sunt echipate cu sisteme eficiente de aerare;

sursă de carbon: - se utilizează atât melasă cât şi hidrolizate de amidon, a căror concentraţie în substrat se fixează la 15-20%.

inoculul se prepară într-un reactor de mică capacitate, în care condiţiile sunt modificate în sensul favorizării unei etape rapide de creştere, etapă care durează 18-30 h.

Fermentaţiile se desfăşoară în fermentatoare de 100-200 m3, la temperaturi de cca. 300C.

Principalii factori de influenţă în fermentaţia citrică sunt: compoziţia mediului de cultură (natura şi concentraţia sursei de

carbon, concentraţia de azot şi fosfor, concentraţia de microelemente Zn, Mn, Fe, Cu, metale grele şi metale alcaline). Anumiţi nutrienţi trebuie să fie în exces (zaharide, protoni, oxigen), altele trebuie limitate in mediu (azot şi fosfor), iar unele componente ale materiei prime trebuie să rămână sub anumite limite bine definite (de ex. urmele de metale, în special Mn).

Monozaharidele (glucoza şi fructoza), care rezultă din hidroliza zaharozei din melasă nu sunt echivalente din punct de vedere al asimilării de către fungie. Fructoza este asimilată mai lent, iar viteza sa de asimilare scade semnificativ o dată cu acumularea în mediu a acidului citric.

Compoziţia substratului în culturile submerse

Component, g/L Etapa de sporulare/ creştere

Etapa de producţie

Zaharoză 140 140

Bactoagar 20 0

NH4NO3 2.5 2.5

KH2PO4 1.0 2.5

MgSO4×7H2O 0.25 0.25

Ioni de Cu 4.8×10-3 6×10-5

Ioni de Zn 3.8×10-3 2.5×10-4

Ioni de Fe 2.2×10-3 1.3×10-3

Ioni de Mn 1×10-3 1×10-3

morfologia fungilor filamentoşi variază între peleţi şi filamente libere, funcţie de condiţiile de cultură, respectiv de tulpina producătoare. Amestecarea intensă este asociată cu formarea de filamente scurte, groase şi puternic legate, care au o productivitate ridicată de acid citric. O amestecare intensă poate conduce la ruperea filamentelor. În culturile de Aspergillus niger s-au observat cicluri de fragmentare micelială şi recreştere, fenomene favorabile producţiei de acid citric.

Formarea de peleţi prezintă ca avantaj o mai facilă amestecare, consumul energetic fiind mai redus. Trecerea de la forma de peleţi la un miceliu filamentos conduce la o scădere cu 50% a concentraţiei de oxigen dizolvat la un debit constant de aer.

pH-ul mediului de cultură este important în două etape diferite ale fermentaţiei. În etapa de germinaţie a sporilor pH-ul mediului trebuie să fie mai mare de 5, în timp ce în etapa de producere a acidului citric necesită un mediu puternic acid, pH ≤ 2. pH-ul puternic acid previne contaminarea culturii cu alte microorganisme şi inhibă formarea unor produse secundare nedorite (acid gluconic, oxalic), facilitând separarea acidului citric din mediul de fermentaţie.

Aerarea este un factor semnificativ care afectează costul de producţie. Producătorii de acid citric au constatat faptul că variaţii ale gradului de aerare în culturile discontinue poate avea efecte dramatice asupra producţiei de acid. În practica industrială se realizează un grad relativ redus de aerare în etapa iniţială (0.1 m3/(m3 mediu×min)), mărindu-se apoi în etapa de creştere la 0.5 – 1 m3/(m3 mediu ×min). La un asemenea grad de aerare apare fenomenul de spumare pentru limitarea căruia se utilizează diferite dispozitive şi agenţi antispumanţi.

Schema instalaţiei submerse de fabricare a acidului citric 1.substrat; 2, 9. coloane demineralizare; 2a. pasteurizator; 2b. răcitor; 3. inocul; 4. fermentator; 5, 6, 8, filtre; 7. vas acidulare; 10. coloana decolorare carbune activ; 11, 14. evaporator; 11a, 14a, cristalizor; 12, 15. centrifuga; 13. vas dizolvare, 16. uscător; 17. ambalare

Cultura în fază solidă

Utilizarea microorganismului producător (miceliu de Aspergillus niger) în formă imobilizată pe diferite suporturi (spumă poliuretanică, perle de alginat, agar, colagen, gel de poliacrilamidă etc), atât în culturi de suprafaţă cât şi în culturi submerse, conduce la obținerea unor viteze mai mari de producere a acidului citric, în special la concentraţii mai mari de glucoză. De asemenea, este atractivă posibilitatea recirculării biomasei.

- s-a dezvoltat în Japonia pe deșeuri de fructe și de orez. Ulterior au fost testate resturile de sfeclă, respectiv trestie de zahăr, care au un preț scăzut dar oferă o suprafață mare de dezvoltare pentru microorganisme. După sterilizare cu abur, suportul este îmbibat cu mediul de cultură, în care drept sursă de carbon se folosește amidon sau celuloză și se inoculează prin sprayere cu spori de A. niger. Fungia produce suficiente celulaze și amilaze pentru hidroliza sursei de carbon. Temperatura de incubare este de cca. 300C. Durata procesului este de 4-5 zile. Dezavantajul procedeului constă în randamentele scăzute.

Separarea acidului citric din mediile de fermentaţie

Metoda precipitării

Dezavantajele procedeului: • consum mare de reactivi chimici (var-579 kg/t, acid sulfuric-765 kg/t) și 18 m3 de apă; •obtinerea unor cantitati importante de deseuri (sulfat de calciu-aprox.1t/t acid citric)

Procedee alternative

Extracţia cu solvenţi, insolubili sau cu o solubilitate extrem de redusă în apă. Drept solvenţi a fost testată o gamă variată de compuşi organici (alcooli, cetone, esteri, eteri, compuşi organo-fosforici, amine), datorită însă toxicităţii acestora, doar procedeele utilizând amine au aviz favorabil de utilizare pentru industria alimentară, respectiv farmaceutică.

Separarea pe schimbători de ioni este fezabilă doar în cazul utilizării unor materii prime cu puritate ridicată. Se pot utiliza anioniţi slab bazici, impregnaţi cu amine terţiare sau piridină, sau anioniţi puternic bazici, cu grupe funcţionale cuaternare de amoniu. Necesarul mare de efluent, obţinerea de soluţii diluate de acid citric şi necesitatea regenerării schimbătorului de ioni rămân ca principalele tare ale procedeului.

Extracţia reactivă cu membrane lichide, respectiv membrane emulsionate lichide în care diverşi extractanţi organici complexează reversibil cu acizii. Drept extractanţi pentru acidul citric se pot utiliza aminele terţiare care au dat cele mai bune rezultate în extracţia cu solvenţi.

Dintre avantajele procedeului se pot enumera: realizarea unor grade avansate de recuperare (de peste 97%) chiar şi

la o singură contactare, cu posibilitatea realizării unei concentrări concomitent cu etapa de extracţie,

consumul energetic mai redus, generarea unor cantităţi mai reduse de deşeuri, precum şi un volum mai mic al instalaţiei de separare. Utilizarea membranelor lichide suportate nu a fost adoptată la scară

industrială, în principal datorită stabilităţii reduse a membranei în timp. Datorită obţinerii unor grade avansate de recuperare şi a realizării concomitent a concentrării acidului citric, procedeul are mari perspective în recuperarea acidului citric din soluţii diluate.

Separarea prin electrodializă, utilizând membrane bipolare, realizează un grad avansat de recuperare. Procedeul nu cunoaşte încă o aplicare la scară industrială în special datorită consumului relativ ridicat de energie, a costului şi duratei de viaţă a membranelor.

O separare şi concentrare continuă a acidului citric din mediile de fermentaţie se poate realiza prin ultra-, respectiv nanofiltrare.

Aceste procedee membranare pot fi extrem de benefice la scară industrială pentru recuperarea acidului citric datorită avantajelor pe care le prezintă: ◦ consum energetic scăzut, ◦ lipsa de deşeuri în comparaţie cu metodele chimice convenţionale şi ◦ posibilitatea realizării lor în flux continuu.

Cu toate acestea necesită încă studii de verificare şi optimizare la scară pilot şi industrială.