Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Stiinte Biologice Bucuresti

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC Proiect: PN-II-PT-PCCA-2013-4-0361 Valorificarea superioara a sub-produselor si reziduurilor vegetale pentru a asigura exploatarea durabila a resurselor naturale Acronim: HIVEGRES Contract nr. 145/2014 Etapa de raportare : Etapa I– Reciclarea reziduurilor si subproduselor vegetale si imbunatatirea randamentelor de extractie; tehnologii "safe-extraction"; evaluarea si stabilizareaprodusilor de extractie. Perioada de raportare 01.07.2014-04.12.2014 Cuprins Pag Consortiu, obiective 1 Rezumatul etapei I de implementare a proiectului 2 A1.1. Evaluarea calitatii reziduurilor vegetale / subproduselor de legume (rosii, morcovi) si fructe (Vaccinium vitis-idaea; Myrtilli fructus, Cynosbati fructus, Hippopheas fructus) ca surse optime pentru principiile active

3

1.1.1 Identificarea prin metode de analiza calitativa a principiilor active din materialele vegetale de interes 4 1.1.2 Determinarea continutului in principii active de tip antociani, carotenoide si xantofile din materialele vegetale

de interes 6

1.1.3 Determinarea capacitatii antioxidante a extractelor formulate care contin antociani, respectiv xantofile si carotenoide 14 A1.2. Dezvoltarea de metode de extractie a principiilor active (beta- carotenoide, antociani) 18 Concluzii 20 Proiectul HIVEGRES este realizat de un consortiu academic-industrial (IMM uri) format din :

• Institutul National CD pentru Stiinte Biologice Bucurest, coordonatorul proiectului, (CO) • Universitatea din Bucuresti, Facultatea de Chimie (P1) • Centrul de cercetare si prelucrare a plantelor medicinale Plantavorel SA, Piatra Neamt (P2) • Cosfel Actual S.R.L, Bucuresti (P3)

Scopul proiectului este acela de a obtine prin metode sigure un continut imbunatatit de compusi naturali cu valoare nutraceutica, care sa fie utilizati in obtinerea de produse alimentare ca si suplimente si aditivi de origine vegetala. (Domeniul 5: Agricultura, siguranta si securitate alimentara, directia prioritara 5.2. Modernizarea productiei alimentare si obtinerea de produse corespunzatoare principiilor dezvoltarii durabile si securitatii alimentare) Obiectivele proiectului HIVEGRES conform contract 145/01.07.2014:

• Valorificarea superioara, utilizarea durabila a resurselor naturale prin reciclarea reziduurilor si sub-produselor vegetale ca urmare a cresterii randamentului de extractie;

• Introducerea de noi instrumente pentru controlul si monitorizarea procesului de productie si pentru evaluarea calitatii produselor: retea de nano-biosenzori;

• Crearea de noi oportunitati pentru diversificarea produselor de tip alimente functionale si largirea segmentului de piata al partenerilor industriali –companii mici si mijlocii- din proiect catre industria alimentara, pe segmentul de piata care le implica.

Rezumatul etapei I de implementare a proiectului Activitatile specifice etapei I de raportare pentru proiectul HIVEGRES au fost A1.1.Evaluarea calitatii reziduurilor vegetale / subproduselor de legume (rosii, morcovi) si fructe (Vaccinium vitis-idaea; Myrtilli fructus, Cynosbati fructus, Hippopheas fructus) ca surse optime pentru principiile active respectiv A1.2. Dezvoltarea de metode de extractie a principiilor active (beta- carotenoide, antociani) in care au fost implicati toti partenerii din consortiul de realizare al proiectului, cu sarcini comune si, in unele cazuri, sarcini specifice.

Au fost obtinute toate rezultatele preconizate pentru aceasta etapa de realizare a proiectului. Rezultatele angajate contractual au vizat evaluarea materialului vegetal din punct de vedere al profilului compozitional/continutului si potentialei eficicacitati antioxidante a principiilor active de interes continute in materialele vegetale utilizate ca sursa de obtinere. Principiile active de interes in cadrul proiectului HIVEGRES sunt antocianii, xantofilele si carotenoizii. Materialul vegetal de baza a fost furnizat, conform contractului de catre partenerul P2 Plantavorel, si a constat in urmatoarele surse: maces, afin, merisor, morcov si rosii. In aceasta etapa nu au fost prevazute activitati de diseminare a rezultatelor.

Evaluarea calitatii unei surse de principii active naturale utilizabila ca si sursa pentru suplimenti nutritionali implica respectarea unui anumit protocol care sa includa toti parametrii care pot influenta calitatea si eficacitatea produsului final in a carui formula de conditionare sunt incluse principiile active de interes, ceea ce inseamna:

• determinarea cantitativa si identificarea principiilor active de interes din sursa vegetala, • evaluarea ex vivo a eficacitatii acestor principii active, adica in cazul proiectului HIVEGRES

evaluarea capacitatii antioxidante, • evaluarea eficacitatii specifice a acestor principii active in raport cu markeri biologic relevanti din

punct de vedere al patologiilor asociate. Partenerul P2, Plantavorel SA, a efectuat analiza calitativa si identificarea unora dintre principiile active din toate materialele vegetale de interes. Pentru aceasta s-a utilizat metoda cromatografica pe strat subtire (CSS/TLC) care este o metoda de analiza specifica pentru determinarea calitativa a principiilor active din plantele medicinale si aromatice, metoda fiind indicata de referentiale de baza: Farmacopeea Romana, ed.X, Farmacopeea Europeana, ed. V cu adendumurile de la 1la 8, si ed.VI. Varianta de tehnica analitica de tip CSS utilizata in studiu este de tip cromatografie in strat subtire de inalta performanta (HPTLC). Au fost identificate urmatoarele principii active de interes pentru HIVEGRES in rosii, morcov, maces si merisor: ß caroten, licopen, iar in afin, maces si merisor delfinidin si cianidin. De asemenea au fost identificate si flavonoide, acizi polifenolcarboxilici, zaharuri si aminoacizi (proteine). Determinarea profilului compozitional si al continutului de principii active din materialele vegetale de interes realizata de catre coordonator,CO- INCDSB, s-a efectuat dupa realizarea unor extractii specifice pentru analiza cantitativa tinand seama de constantele de partitie si de solubilitatea specifica a compusilor de interes. Determinarea continutului in principii active s-a facut utilizand metode analitice dezvoltate in cadrul acestui proiect care au la baza tehnica de cromatografie de lichide de inalta performanta cu detectie tandem (camp de diode-spectrometrie de masa) si a condus la cuantificarea principiilor active identificate, antociani : delfinidin, peonidin 3-O-glucosida, pelargonidin, malvidin, cianidin si genistin in afin, merisor si maces precum si a carotenoidelor si xantofilelor, b-caroten, licopen si luteina din morcov, rosii si maces. Rezultatele cantitative, exprimate in microgram principiu activ per gram (sau 100 g) de material vegetal luat in lucru au demonstrat ca din punct de vedere al continutului in antociani totali afinul este cea mai buna sursa, oricare a fost formula de extract testata (hidro-alcoolic sau alcoolic acidulat). Din punct de vedere al continutului in carotenoide si xantofile macesul si morcovii sunt cele mai bune surse pentru b-caroten si luteina, in timp ce rosiile au continutul maxim de licopen. Evaluarea din punct de vedere al capacitatii antioxidante a fost facuta de catre CO-INCDSB si de catre partenerul P1, Universitatea din Bucuresti, rezultatele cele mai bune obtinandu-se pentru maces, indiferent de formula de extractie si pentru afin. Rezultatele foarte bune obtinute pentru activitatea antiradicalica a macesului se coreleaza si cu un continut ridicat de vitamina C determinat in extractele totale de maces. De asemenea partenerul membriiconsortiului au dezvoltat mai multe metode de extractie pentru principiile active de interes iar partenerul P3, COSFEL SA a inceput testarea acestora pentru ca ulterior sa fie optimizate pentru realizarea demonstratorului reactorului de extractie asistata de microunde. In acest scop in aceasta

etapa de executie s-a stabilit schema de principiu, s-a construit un model de reactor MAE si au fost determinate caracteristicile tehnice de operare ale reactorului de extractie asistat de microunde utilizand ca si material vegetal de testare morcovul. In urma acestor incercari s-a obtinut un randament de extractie de cca 87,6% in raport cu metoda clasica, reducandu-se timpul de extractie la 7% din cel necesar in metodele clasice de extractie, lichid-lichid (24 ore de macerare, timp total de operare cca 27 ore). A1.1. Evaluarea calitatii reziduurilor vegetale / subproduselor de legume (rosii, morcovi) si fructe (Vaccinium vitis-idaea; Myrtilli fructus, Cynosbati fructus, Hippopheas fructus) ca surse optime pentru principiile active Evaluarea calitatii unei surse de principii active naturale utilizabila ca si suplimenti nutritionali implica respectarea unui anumit protocol care sa includa toti parametrii care pot influenta calitatea si eficacitatea produsului final in a carui formula de conditionare sunt incluse principiile active de interes. Acest protocol include urmatoarele etape generale:

1. Determinarea cantitativa si identificarea principiilor active de interes (care pot avea rol antioxidant, anti-inflamator, antifungic, antiproliferativ, de stimulare a imunitatii etc) din materialul vegetal/din sursa de principii active.

2. Evaluarea in vitro (ex vivo) a eficacitatii acestor principii active. Intrucat principiile active care fac obiectul proiectului HIVEGRES, pe langa alte efecte specifice fiecarei clase de compusi, au in comun proprietatile antioxidante, toate exemplificarile privind diferite modalitati de evaluare se vor face in legatura cu caracterul antioxidant al principiilor active, produsilor, extractelor etc. Evaluarea ex vivo in cazul unor principii active cu potential antioxidant implica, in mod specific, determinarea potentialului redox formal precum si a capacitatii compusului analizat de a elimina din sistem radicali liberi.

3. Evaluarea eficacitatii specifice a acestor principii active in raport cu markeri biologic relevanti din punct de vedere al patologiilor asociate. Revenind la acelasi exemplu, al antioxidantilor, evaluarea capacitatii antioxidante trebuie facuta intr-un sistem relevant din punct de vedere fiziologic.

Ca urmare, pentru caracterizarea materialului vegetal care este utilizat pentru obtinerea principiilor active de tip antociani, xantofile si carotenoide, s-a pornit de la evaluarea continutului de principii active din materialul vegetal, pe clase de compusi, flavonoide si, respectiv carotenoide, xantofile si derivati. Dupa cum am mentionat anterior, principalele grupe de principii active urmarite au fost carotenoidele (ß caroten si lycopen) - specifice pentru majoritatea materialelor vegetale: morcov, maces, rosii si merisor; antocianii - specifici pentru merisor si afine, dar, tinand seama de caracteristicile materialului vegetal, precum si si zaharurile si carbohidratii specifici - pentru merisor, afine si morcov; aminoacizii (proteine) - specifici pentru afine, merisor, morcov si maces precum si flavone si acizi polifenolcarboxilici specifici pentru merisor, afine si maces. Identificarea principiilor active a fost realizata prin analiza calitativa in timp ce cuantificarea lor a implicat dezvoltarea unor metode de analiza cantitativa cu o sensibilitate ridicata, utilizand tehnici analitice de tip cromatografie de lichide de inalta performanta cuplata cu detectie specifica, tandem camp de diode-spectrometru de masa. Evaluarea proprietatilor antioxidante ale extractelor din diversele surse vegetale luate in lucru a fost realizata utilizand mai multe metode intrucat s-a urmarit atat determinarea activitatii antiradicalice fata de radicali cu viata lunga cum este de exemplu cation radicalul ABTS+. (metoda TEAC), fata de radicali HO. (chemiluminescenta) si, respectiv, fata de radicali peroxil (metoda ORAC). 1.1.1 Identificarea prin metode de analiza calitativa a principiilor active din materialele vegetale de

interes Partenerul P2, Plantavorel SA, principalul furnizor al materialului vegetal a efectuat analiza calitativa a principiilor active din toate sursele de interes.

Pentru aceasta s-a utilizat metoda cromatografica pe strat subtire (CSS/TLC) care este o metoda de analiza specifica pentru determinarea calitativa a principiilor active din plantele medicinale si aromatice, metoda fiind indicata de referentiale de baza: Farmacopeea Romana, ed.X, Farmacopeea Europeana, ed. V cu adendumurile de la 1la 8, si ed.VI. Pentru aceste determinari s-a utilizat sistemul de cromatografie pe strat subtire CAMAG format dintr-un aplicator LINOMAT IV si sistemul de documentare CAMAG cu camera video digitala Canon, softului winCATS cu program Image Comparision Viewer care permite compararea vizuala a unui numar mare de probe simultan cu referinta si posibilitatea de a prezenta rezultatele cantitative direct pe imagini. Varianta de tehnica analitica de tip CSS utilizata in studiu este de tip cromatografie in strat subtire de inalta performanta (HPTLC) 1.1.1.1 Identificarea carotenoidelor din rosii, morcov, maces si merisor

Fig 1.1 Identificarea CSS a ß carotenului din rosii, morcov, maces si merisor Trackuri : R1- rosii; R2- rosii; Mo- morcov; E1 -ß caroten; Ma -maces; Me - merisor

Fig 1.2 Identificarea CSS a lycopenului din rosii, morcov, maces si merisor Trackuri : R1- rosii; R2- rosii; Mo- morcov; E1 –ß caroten; Ma maces; Me - merisor

Imaginea HPTLC indica separarea ß carotenului din probele analizate si prezenta lui la acelasi Rf~1 cu a substantei de referinta. Din imaginea HPTLC se poate observa ca ß carotenul din solutiile de proba si din solutia de referinta ramane in baza, neseparat de eluent, si la Rf -0,2 , pe trackul corespunzator probei R2-rosii, apare un spot portocaliu specific pentru lycopen. Din analiza celor doua imagini HPTLC (Fig 1.1 si 1.2) se poate observa ca utilizand aceleasi probe de analizat dar eluenti diferiti se pot separa cele doua tipuri de carotenoide (ß caroten si lycopen). 1.1.1.2. Identificarea antocianilor din fructe de afin, merisor si maces

Fig. 1.3 Identificarea CSS a antocianilor din fructele de afin si merisor Track-uri: 1 – Merisor; 2- E1 cianidin; 3 – E2 malvidin; 4 – E3 delfinidin; 5 – Afine

Imaginea HPTLC indica separarea substantelor de referinta si a constituentilor din probele analizate. Substantele de referinta au fost identificate la urmatoarele valori Rf: cianidin – 0,37; malvidin -0,34 si delfinidin 0,27. Prin raportarea la substantele de referinta, au fost identificati constituentii specifici produselor vegetale analizate, in urma vizualizarii in domeniul vizibil, si anume: a) in proba de fructe de merisor se observa prezenta cianidinului la acelasi Rf ca a substantei de referinta.

b) in proba de fructe de afin se observa prezenta cianidinului si a delfinidinului la acelasi Rf ca a substantelor de referinta. De asemenea se poate observa ca intre Rf-ul specific cianidinului si delfinidinului apare o “perdea” de culoare specifica care poate fi asociata prezentei altor antociani, nedecelati la developare, inclusiv a malvidinului. 1.1.1.3. Identificarea flavonoidelor si a acizilor polifenolcarboxilici- din fructe de merisor, afin si

maces

a) 254 nm, inainte de derivatizare

b) 366 nm, inainte de derivatizare

c) 366 nm, dupa derivatizare cu PEG, NP

Fig 1.4. (a-c) Identificarea CSS a compusilor flavonoidici si a acizi polifenolcarboxilici din fructe de merisor, afin si maces. Track-uri: 1- merisor; 2- afin; 3- maces; 4- E1 (acid galic); E2 (rutin, ac.clorogenic, hiperozida ac.cafeic); E3 (quercetin) Imaginile HPTLC indica separarea substantelor de referinta si a constituentilor din probele analizate: a) aparitia spoturilor de culoare gri-inchis in probele examinate pe cromatograma vizualizata la 254 nm inainte de stropirea cu reactivul de identificare, indica prezenta compusilor flavonoidici si a acizilor polifenolcarboxilici (Figura 1.4a). b) aparitia spoturilor albastre indica prezenta acizilor polifenolcarboxilici, si a celor de culoare neagra, a compusilor flavonoidici, pe cromatograma vizualizata la 366 nm inainte de stropirea cu reactivul de identificare (Figura 1.4b). c) substantele de referinta au fost identificate la urmatoarele valori Rf: rutin – 0,43; acid clorogenic – 0,54; hiperozida – 0,67; acid cafeic – 0,96; acid galic – 0,92 si quercetin- 0,97. Prin raportarea la substantele de referinta, au fost identificati constituentii specifici produselor vegetale analizate, in urma vizualizarii la 366 nm dupa stropirea cu reactivul de identificare (Figura 1.4c): - in fructele de merisor se constata prezenta a trei spoturi de aceeasi culoare si la aceleasi Rf-uri cu a substantelor de referinta - acid clorogenic, ac cafeic si hiperozida. Apar si alte spoturi galbene specifice compusilor flavonoidici (quercetina si la Rf ~ 0,72 posibil izoquercetina); - in fructele de afin se constata prezenta a doua spoturi intense de aceeasi culoare si la aceleasi Rf-uri cu a substantelor de referinta - acid clorogenic si hiperozida si spoturi de mai mica intesitate specifice acidului galic si cafeic. Apar si alte spoturi galbene specifice compusilor flavonoidici (la Rf ~ 0,72 posibil izoquercetina, s.a); - in maces se constata prezenta mai multor spoturi intense de aceeasi culoare si la aceleasi Rf-uri cu a substantelor de referinta - acid clorogenic, hiperozida, acid galic si cafeic. Apar si alte spoturi galbene, specifice compusilor flavonoidici (quercetina si la Rf ~ 0,72 posibil izoquercetina).

1.1.1.4. Identificarea mono-, di-, tri- si polizaharidelor din fructe de merisor si afin si radacina de morcov

Fig 1.5 Identificarea CSS pentru mono-,di-,tri- si polizaharide din fructe de merisor si afin si radacina de morcov Trackuri: 1- merisor, 2- E1 (d-glucoza si sucroza), 3- morcov, 4 – E2( fructoza si rafinoza), 4 - afine

Imaginea HPTLC indica separarea substantelor de referinta si a constituentilor din probele analizate. Substantele de referinta au fost identificate la urmatoarele valori Rf: E1( d-glucoza – 0,49; sucroza – 0,58); E2 ( fructoza – 0,32 si rafinoza – 0,56). Prin raportarea la substantele de referinta, au fost identificati constituentii specifici produselor vegetale analizate, in urma vizualizarii in domeniul vizibil, fara stropire cu reactiv de identificare, si anume: - in proba de merisor se identifica un spot cu intensitate mare la acelasi Rf cu sucroza si rafinoza si alte spoturi de intensitate mai mica specifice altor polizaharide; - in proba de morcov se identifica doua spoturi cu intensitate mare la aceleasi Rf-uri cu sucroza, rafinoza si d- glucoza; - in proba de afin se identifica un spot cu intensitate mare la acelasi Rf cu sucroza si rafinoza, si alte spoturi de intensitate mai mica specifice altor polizaharide; 1.1.1.5. Identificarea cromatografica a aminoacizilor din fructe de merisor, afin, maces si radacina de

morcov Fig 1.6 Identificarea CSS pentru aminoacizi din fructe de merisor, afin, maces si radacina de morcov Track-uri: 1 - Merisor; 2 – Afine; 3 – E1 (L-serina, alanina, tirozina); 4 – E2 (treonina, leucina); 5 – E3 (asparagina, valina, triptofan); 6 - Maces; 7 – Morcov

Imaginea HPTLC indica separarea substantelor de referinta si a constituentilor

din probele analizate. Substantele de referinta au fost identificate la urmatoarele valori Rf: E1 (L-serina - 0,26, alanina - 0,33, tirozina – 0,51; E2 (treonina – 0,32, leucina – 0,55); E3 (asparagina – 0,20; valina -0,46, triptofan – 0,56). Prin raportarea la substantele de referinta, au fost identificati constituentii specifici produselor vegetale analizate, in urma vizualizarii in domeniul vizibil, dupa stropirea cu reactivul de identificare, si anume: - in proba de merisor, spoturi ce corespund substantelor de referinta L- serina si posibil alanina dar si alte spoturi de culoare specifica aminoacizilor, altii decat cei luati ca substante de referinta; - in proba de afin, spoturi ce indica prezenta aminoacizilor, altii decat cei luati ca substante de referinta; - in proba de maces spoturi ce indica posibila prezenta a alaninei, treoninei si valinei si alte spoturi de culoare specifica aminoacizilor, altii decat cei luati ca substante de referinta; - in proba de morcov spoturi ce indica posibila prezenta a alaninei, treoninei, triptofanului si leucinei dar si alte spoturi de culoare specifica aminoacizilor, altii decat cei luati ca substante de referinta.

1.1.2 Determinarea continutului in principii active de tip antociani, carotenoide si xantofile din materialele vegetale de interes

Antocianii sunt flavonoidele cele mai frecvent intalnite in fructele de padure (afin, maces, merisor) atat sub forma glicolizata cat si ca agliconi (antocianidine), evaluarea continutului in antociani din materialul vegetal furnizat de catre PLANTAVOREL SA facandu-se de catre coordonator, INCDSB Bucuresti, dupa o extractie a principiilor active care sa asigure randamentul optim din punct de vedere analitic. Aceasta inseamna ca pentru a face evaluarea din punct de vedere al continutului in substanta activa s-au realizat extractii ale antocianilor utilizand metode si solventi care nu au tinut neaparat seama de normele de securitate din punct de vedere al cerintelor standard privind produsele nutritionale si/sau farmaceutice ci de caracteristicile de solubilitate ale principiilor active si de constantele de partitie intre solventi, pentru a asigura un randament maxim de extractie, astfel incat sa se obtina o prima informatie privind continutul maxim de principiu activ/gram de material vegetal luat in lucru. Intrucat o caracterizare analitica din punctul de vedere al continutului implica si hidroliza formelor glicozilate, s-au folosit doua amestecuri de solventi de extractie, atat un amestec clasic care vizeaza extractia hidro-alcoolica a antocianilor, cat si un solvent organic acidulat (pentru a asigura conditii de hidroliza acida a glicozidelor). Extractele obtinute au fost apoi supuse analizei pentru identificarea principiilor active, determinarea lor cantitativa (raportata la gram de material vegetal luat in lucru) si evaluarea capacitatii antioxidante a acestor extracte, sa le spunem primare, evaluarea efectuata prin mai multe metode pentru a avea o imagine cat mai completa a eficientei antioxidante potentiale pe care o au principiile active proaspat extrase din sursele vegetale. 1.1.2. 1. Determinarea profilului compozitional si al continutului de antociani din materialele vegetale

de interes Metoda de extractie utilizata pentru caracterizarea analitica a continutului in antociani este: Materialul vegetal (Merisor, Afine, Maces) este supus macinarii si apoi se aplica urmatoarele tipuri de extractie: a. 25 g material vegetal + 25 mL solvent de extractie (metanol acidulat HCl 0,5%); sonicare la intuneric 30

minute in baie de sonicare in care se adauga gheata pentru mentinerea unei temperaturi sub 25°C, atmosfera inerta;

b. 25 g material vegetal + 25 mL solvent de extractie (metanol:H2O); 70:30(v:v) sonicare la intuneric 30 minute in baie de sonicare in care se adauga gheata pentru mentinerea unei temperaturi sub 25°C, atmosfera inerta.

Determinarea profilului compozitional si al continutului de antociani din sursele vegetale de interes s-a facut prin cromatografie de lichide de inalta performanta cu detectie specifica camp de diode cuplata cu spectrometrie de masa.

Pentru afin au fost utilizate doua surse, materialul vegetal furnizat de catre Plantavorel si, respectiv, fructe de afin de cultura comercializat intr-o retea de hipermarket-uri.

Masurarile cromatografice au fost realizate folosind un sistem complet HPLC SHIMADZU si utilizand o coloana C18. Sistemul HPLC-PDA a fost cuplat cu un detector MS, LCMS-2010 detector, utilizand o interfata de ionizare de tip electrospray ESI si folosind, datorita specificitatii compusilor de interes, modul de ionizare pozitiv. Faza mobila folosita a fost compusa din 5% acid formic in apa (solvent A) si 5% acid formic in metanol (solvent B). Pentru separarea compusilor a fost utilizat o elutie in gradient cu un debit de flux de 0,15 mL/min. Experimentele au fost realizate la o temperatura constanta a coloanei de 40°C iar timpul necesar efectuarii unei analize este de 47 de minute.

Pentru optimizarea metodei s-au testat diferite conditii de separare utilizand mai multe faze mobile (diferite concentratii de acid formic in solventi; solventul B compus din ACN sau din metanol), debite de flux (0,1; 0,15 si respectiv 0,2) si gradiente de elutie diferite. De asemenea au fost incercate 2 coloane C18 Nucleosil 100-3,5; 100×2,1 mm, KROMASIL respectiv Kinetex 2,6 C18 100A, 50×4,6 mm, iar cea din urma a fost aleasa pentru realizarea analizelor.

Folosind conditiile cromatografice optime s-a observat ca picurile celor 6 antociani au fost rezolvate din punct de vedere al timpilor de retentie (fig 1.7) iar picurile corespunzatoare fragmentelor de ioni folosind modul de achizitie a datelor SIM (detectorul MS) au fost obtinute in perfecta concordanta cu datele obtinute din cromatogramele HPLC-PDA.

Fig. 1.7 Cromatogramele HPLC-MS obtinute pentru amestecul de standarde (peonidin-verde, delfinidin-negru, genistein-gri, cianidin-roz, pelargonidin-maro si malvidin-albastru, concentratia standardelor 40µg/mL)

In continuare, intrucat determinarea continutului in substanta activa implica o calibrare a raspunsului cu concentratia, pentru stabilirea domeniului de liniaritate a raspunsului s-au stabilit ecuatia curbei de etalonare precum si calculul coeficientului de corelatie si al limitei de detectie. Curbele de calibrare au fost obtinute pentru 7 puncte diferite masuratorile fiind realizate in triplicat. Din ecuatiile dreptelor de calibrare se observa o buna liniaritate intre aria picului si concentratia analitului, pe un domeniu de concentratii de o decada si jumatate. Au fost stabilite caracteristicile de performanta ale metodei HPLC-PDA-MS pentru 6 antociani rezultatele obtinute fiind prezentate in tabelul 1.1

Tabel 1.1. Caracteristicile de performanta ale metodei HPLC. HPLC-PDA

Analit tR min.

Maximul de

absorbtie (λ)

Ecuatia curbei de etalonare

A:arie; C: conc (µg/mL) R

Limita de detectie (µg/mL)

Domeniul de liniaritate a raspunsului

(µg/mL) Delfinidin 19,50 532 nm A=177582,5xC-178139,6 0,9991 0,40

1-50

Peonidin 3-O-glucosida 19,14 518 nm A=361608,8xC-678290,7 0,9968 0,75

Pelargonidin 25,11 515 nm A=420717,6xC-422762,2 0,9994 0,40 Malvidin 26,65 537 nm A=111799,7xC-82015,66 0,9996 0,30

Cianidin 22,20 526 nm A=262141,8xC -184229,1 0,9998 0,28

Genistin 21,03 248 nm A=358515,9xC-170970,3 0,9997 0,20 HPLC-MS

Analit tR min.

[M+H]+

Ecuatia curbei de etalonare A:arie; C: conc (µg/mL) R

Limita de detectie (µg/mL)

Domeniul de liniaritate a raspunsului

(µg/mL) Delfinidin 19,79 303 A=552610,3xC-328315 0,9989 0,24

1-50

Peonidin 3-O-glucosida 19,38 463 A=749868,5xC-159194,9 0,9982 0,74

Pelargonidin 25,42 271 A=2030934xC+1125109 0,9941 0,11 Malvidin 26,94 331 A=970912,1xC-203550,3 0,9986 0,83 Cianidin 22,49 287 A=1075267xC+250397,3 0,9972 0,46 Genistin 21,23 433 A=255711,6xC+9823,1 0,9964 0,76

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

(x1,000,000)

433.00 (4.02)301.00 (9.18)463.00 (1.35)271.00 (1.00)331.00 (1.22)287.00 (1.00)303.00 (1.66)

Metoda HPLC-PDA-MS a fost aplicata pentru analiza calitativa si cantitativa a antocianilor din 7 extracte diferite (fig.1.8) iar valorile obtinute sunt prezentate in tabelul 1.2.

Fig.1.8. Cromatogramele HPLC-PDA-MS ale extractului de afin (extract alcoolic, A), maces (extract alcoolic, B) si merisor (extract alcoolic, C) (inset-cromatogramele obtinute pe MS).

Tabel 1.2. Continutul de principii active, antociani obtinut in prin analiza HPLC-PDA-MS pentru cele doua tipuri de extracte

Dupa cum se observa in urma determinarii cantitative a principiilor active antociani din maces, afin si merisor, datele obtinute sunt in conformitate cu tendinta pe care determinarea calitativa efectuata de catre furnizor a sugerat-o, in plus reusindu-se identificarea si cuantificarea altor antociani.

Este evident ca afinul reprezinta sursa vegetala cea mai bogata in antociani, afinul din flora spontana conducand la cresterea randamentului de obtinere a antocianilor de 200%. Componenta majoritara in toate materialele vegetale este delfinidinul.

Intrucat in urma determinarii capacitatii antioxidante a extractelor formulate s-au obtinut valori a caror corelatie cu continutul de principii active necesita si cunoasterea cantitatii de vitamin C din materialul vegetal studiat, avand in vedere ca este unul dintre compusii raportati ca fiind majoritari in aceste surse vegetale s-a efectuat si o determinarea vitaminei C din extracte.

Compus

Afina cultura Extract hidro-

alcoolic

Afina Extract

alcoholic acidulat

Afina Extract hidro-

alcoolic

Maces Extract

alcoholic acidulat

Maces Extract hidro-

alcoolic

Merisor Extract

alcoholic acidulat

Merisor Extract hidro-

alcoolic

µg/100g mat vegetal Delfinidin 472,00 946,32 732,52 nd nd 122,68 361,20

Peonidin 3-O-glucosida 203,92 408,52 227,32 15,28 15,92 9,16 5,36 Pelargonidin nd nd nd 24,56 24,64 12,68 13,04

Malvidin 15,56 4,52 10,36 10,08 6,40 3,92 4,00 Cianidin 7,68 35,32 171,76 13,44 13,84 24,64 26,48 Genistin 85,88 295,40 168,12 5,28 7,52 33,96 22,88

5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

0

250

500

750

1000

1250

mAU532nm,4nm (1.00)

2.5 5 .0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0(x100,000)

TIC

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

(x10,000)TIC

0 10 20 30 40 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175mAU

537nm,4nm (1.00)

5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

-100

-50

0

50

100

150

200

250

mAU532nm,4nm (1.00)

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

0. 0

2. 5

5. 0

(x1 00,00 0)TIC

B

C

A

1.2.1.1. a. Determinarea HPLC-PDA a vitaminei C din maces, merisor si afin Masurarile cromatografice au fost realizate folosind un sistem complet HPLC-PDA si o coloana C18

Nucleosil 100-5C18, KROMASIL, 250×4,6 mm. Faza mobila a constat din 5 mmol L-1 acid heptansulfonic in metanol (solvent A) si 1% acid acetic (solvent B) in raport de 30:70. Debitul fazei mobile utilizat a fost de 1 mL/minut si analizele au fost realizate la temperatura camerei.

Dupa stabilirea unor caracteristici de performanta ale metodei (tabelul 1.3) au fost realizate analizele pentru determinarea vitaminei C din 6 extracte valorile obtinute fiind date in tabelul 1.4.

Tabel 1.3 Unele caracteristici de performanta ale metodei HPLC-PDA

Analit tR

minute Maximul de absorbtie (λ)

Ecuatia curbei de etalonare A:arie; C: conc (µg/mL)

R

Domeniul de liniaritate a raspunsului

(µg/mL) Vitamina C 2,7 243 nm A=52630,11xC-460854,4 0,9974 10-125

Tabel 1.4 Valorile obtinute pentru vitamina C in urma analizei HPLC-PDA

1.1.2.2. Determinarea profilului compozitional si al continutului de carotenoide si xantofile din materialele vegetale de interes: morcovi, rosii, maces Analizele s-au realizat in laboratoarele INCDSB, utilizand un sistem UFLC Prominence Shimadzu cu urmatoarele componente: pompe LC-20AD SP Shimadzu, degazor Shimadzu DGU-20A5-Degasser, detector Shimadzu SPD-M20A Diode Array Detector, CTO-20AC Column Oven, software LCMS solution, coloana Kromasil C18, 5 μm, 25×46mm. Faza a fost filtrata printr-o membrana CHROMAFIL® 0-20/25 PTFE 0,22 μm si sonicata cu ajutorul unei bai de ultrasunete TRANSSONIC 460/H pentru eliminarea aerului dizolvat in solutie. Probele au fost filtrate prin filtre Millex Syringe Driven Filter Unit, 0,22μm (Millipore) inainte de a fi injectate in aparat. Alte echipamente utilizate pentru prepararea solutiilor stoc au fost balanta analitica Mettler Toledo, vortex Heidolph REAX, Concentrator Plus EppendorfAG si centrifuga Hettich Universal 320 R. Elaborarea metodei a presupus mai intai stabilirea conditiilor optime de separare. S-au testat mai multe faze mobile, modificandu-se compozitia acestora, gradientul, fluxul, etc. Avand in vedere caracteristicile de solubilitate ale compusilor ca si faptul ca se urmareste o detectie simultana, s-a modificat compozitia fazei mobile pentru a se asigura conditii optime de separare. In urma tuturor testelor efectuate, conditiile optime de faza mobila si debit folosite in final pentru analiza probelor reale sunt:

• faza mobila alcatuita din doua componente A: ACN si B: MeOH: CH2Cl2 (50:50, v:v) • mod izocratic de elutie avand compozitia fazei mobile A:B (40:60, v:v) • debitul fazei mobile de 0,8 mL/min.

Inainte de inceperea analizelor coloana a fost echilibrata timp de o ora cu faza mobila iar la sfarsitul fiecarei injectii coloana a fost spalata timp de 10 minute cu faza mobila folosind acelasi debit de curgere. Dupa o serie completa de analize, sistemul HPLC a fost curatat cu ACN: H2O (95:5, v/v) timp de o ora. Experimentele au fost realizate la temperatura ambientala pentru autosampler si coloana si temperatura constanta de 30°C in celula detectorului.

Compus

Afina Extract

alcoholic acidulat

Afina Extract hidro-

alcoolic

Maces Extract

alcoholic acidulat

Maces Extract hidro-

alcoolic

Merisor Extract

alcoholic acidulat

Merisor Extract hidro-

alcoolic µg/100g mat vegetal

Vitamina C 771 594,32 5170,72 6171,68 898,64 992,92

Volumul de injectie folosit a fost de 20 µL iar detectia specifica a analitilor de interes s-a realizat la urmatoarele lungimi de unda: λmax= 449 nm – luteina, λmax= 456 nm – β-caroten, λmax= 476 nm – licopen. Metoda de extractie utilizata pentru caracterizarea analitica a continutului in carotenoide si xantofile este urmatoarea: Se cantareste si se macina o masa cunoscuta de material vegetal (aprox. 25 g) sub diferite forme (morcov ras, rosii, maces macinat). Extractia intr-un amestec de solventi ce contine: tetrahidrofuran: alcool metilic: hexan (THF:MeOH:Hexan) in raport 25:15:15 (v:v:v) si amestecul de macerare astfel obtinuteste sonicat timp de 20 minute (adaugand gheata in baia de sonicare) sub vid, si lasat la macerat 24h, la temperaturi de 4-8° C , ferit de lumina. Solutia rezultata este apoi filtrata pe hartie de filtru pentru indepartarea reziduului solid si centrifugata pentru separarea celor doua faze organice timp de 10 minute, 5000 rpm la temperatura de 4° C. Dupa colectarea stratului superior fractiile de hexan sunt evaporate la sec sub vid. Reziduul obtinut este reluat intr-un mililitru MeOH: CH2Cl2 (50:50, v:v) si injectat pentru analiza HPLC. Probele de morcov, rosie si maces au fost filtrate, diluate de 5 (morcov) respectiv 10 ori (maces, rosie) si analizate prin cromatografie de lichide (HPLC-PDA) prin metoda descrisa mai sus, timpul total de analiza fiind de 20 de minute. Metoda de analiza a fost intial stabilita pentru compusi standard.

Deoarece indiferent de tipul de coloana utilizat (atat C18 cat si C30-Develosil 5 µ Combi-RP C30 140A, 50×4.6 mm), de amestecul de solventi si de gradientul specific pentru amestecul de faze mobile nu s-a reusit inca rezolvarea semnalelor luteina-zeaxantina, si tinand seama ca luteina si zeaxantina sunt izomeri de structura a caror unica specificitate este faptul ca pozitia dublelor legaturi in molecula de luteina determina gruparea hidoxi-alilica sa fie mai reactiva in cazul luteinei, s-a luat decizia de compromis de a se exprima continutul total de xantofile (luteina si zeaxantina) utilizand ca si standard amestecul de xantofile pe care il furnizeaza Sigma-Aldrich si care contine atat lutena cat si zeaxantina si alti izomeri structurali ai acestora. Datele de literatura prezinta rezultate obtinute folosind aceeasi solutie de compromis.

Luteina Zeaxantina

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

uV(x100,000)

Fig. 1.9. Cromatogramele obtinute pentru un amestec de standarde de concentratie 5ug/mL (linia neagra) si o proba de extract de rosie ( linia roz) diluata 1:10 (1-luteina, 2-licopen, 3-β-caroten).

1

2

3

Dupa cum se observa din cromatogramele prezentate in figura 1.9 s-a reusit rezolvarea picurilor beta-carotenului, licopenului si luteinei, definindu-se urmatorii timpi de retentie: β-caroten tr = 11,54 min, licopen tr = 8,01 min., luteina tr = 3,15 min. Acesti timpi de retentie permit ca toti compusii sa fie determinati cu acuratete din aceeasi matrice, putand fi separati cu o rezolutie buna. In continuare s-au stabilit caracteristicile de performanta ale metodei de analiza a carotenoidelor si xantofilelor. Au fost realizate masurari la concentratii diferite (9 concentratii diferite pentru licopen si β-caroten si 5 concentratii diferite pentru luteina, masurarile fiind realizate in triplicat) si s-au trasat curbele de etalonare, care au prezentat o excelenta liniaritate intre aria si concentratia analitului injectat, coeficientii de corelatie fiind R> 0,99 (pentru toti compusii) (tabelul 1.5). Tabel 1.5. Unele caracteristici de performanta ale metodei HPLC-PDA de determinare a carotenoidelor si xantofilelor

Analit tr min Ecuatia curbei de etalonare A:arie; C: conc (µg/mL) R

Limita de detectie (µg/mL)

Domeniul de liniaritate a raspunsului

(µg/mL) β-

caroten 11,54 A = 274748XC -348118 R = 0,9990

5,0 10-100

Licopen 8,01 A = 249092XC -238212 R = 0,9995

3,8 10-100

Luteina 3,15 A = 468198XC -115499 R = 0,9956

0,1 1-100

Concentratiile in licopen, luteina sau beta-caroten pentru extractele de morcov, rosie si maces analizate s-au calculat pornind de la ecuatia dreaptei de etalonare, fiind exprimate in continut pe 100 g material vegetal, tinand cont de dilutiile efectuate.

Trebuie mentionat ca nefiind inca finalizata validarea metodei de analiza, pentru a asigura acuratetea determinarilor amalizele s-au realizat si din probe fortificate cu beta-caroten, licopen si luteina (figurile 1.10 si 1.11 ).

Tabelul 1.6. Concentratia de carotenoizi (µg/100g) obtinuta in extractele de rosie, morcov si maces

Proba Analit Conc. µg/100g Morcov β- Caroten 2693

Licopen 126 Luteina 140

Maces β- Caroten 2091 Licopen 2266 Luteina 105

Rosii β- Caroten 623 Licopen 1669 Luteina 141

Distributia continutului de carotenoide si xantofile in functie de materialul vegetal sursa este prezentata in figura 1.12.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

uV(x100,000)

Fig.1.10. Cromatograme obtinute pentru extractele de rosie (negru), morcov (magenta) si maces (albastru); analitii de interes: 1-luteina, 2-licopen, 3-β-caroten.

2

3

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

uV(x100,000)

Fig.1.11. Cromatograme obtinute pentru extractul de morcov initial (neagru) si cu aditie de standarde la o concentratie de 5µg/mL (magenta); analitii de interes: 1-luteina, 2-licopen, 3-β-caroten.

3

1

1

2

Fig 1.12. Continutul de principiu activ de tip carotenoid/xantofila per gram material vegetal

1.1.3. Determinarea capacitatii antioxidante a extractelor formulate care contin antociani, respectiv xantofile si carotenoide. 1.1.3. 1. Determinarea capacitatii antioxidante a extractelor care contin antociani.

La ora actuala cele mai utilizate metode pentru determinarea capacitatii antioxidante sunt metoda DPPH (masurarea scaderii maximului de absorbtie al radicalului liber DPPH de la 516 nm in prezenta compusilor cu activitate presupus antioxidanta), metoda ORAC (capacitatea de absorbtie a radicalilor de oxigen) si metoda TEAC (capacitatea antioxidanta exprimata in echivalenti Trolox). Avand in vedere faptul ca pentru DPPH reactia specifica se urmareste la o lungime de unda, 516nm, la care interfera antocianii care prezinta maxime de absorbtie specifica intre 420 nm si 540 nm, activitatea antiradicalica a extractelor obtinute din materialele vegetale de interes a fost determinata prin metodele TEAC si, respectiv, ORAC. Probele luate in lucru de catre coordonatorul INCDSB, care au fost trimise si partenerului academic P1-Universitatea din Bucuresti, au fost extractele formulate pentru caracterizarea analitica a profilului de compozitie al afinelor, merisorului, maceselor si, respectiv morcov si rosii. 1.1.3.1.1. Determinarea capacitatii antioxidante utilizand metoda TEAC Calculul capacitatii antioxidante a extractelor s-a facut utilizand urmatoarea formula

blankTrolox

blankprobaTroloxproba AA

AAxfxCTEAC

−

−=

unde - Ablank reprezinta maximul absorbantei, citita la 3 minute dupa adaugarea a 2,5 mL ABTS, intr-o celula continand 0,5 mL apa distilata; - ATrolox reprezinta maximul absorbantei, citita la 3 minute dupa adugarea a 0,1 mL Trolox (10-3 M), intr-o celula continand 2,5 mL ABTS si 0,4 mL apa distilata; - Asample reprezinta maximul absorbantei, citita la 3 minute dupa adugarea a 0,1 mL proba (aproximativ 2 mg/mL), intr-o celula continand 2,5 mL ABTS si 0,4 mL apa distilata; - f reprezinta factorul de dilutie al probei; - CTrolox reprezinta concentratia efectiva de Trolox, in µmol L-1. Rezultatele obtinute la determinarea capacitatii antioxidante a extractelor de afin, maces si merisor sunt date in tabelul 2.1. Tabelul 2.1. Capacitatea antioxidanta exprimata in echivalent moli Trolox per g material vegetal pentru materialele vegetale de interes ca surse de antociani –metoda TEAC

Dupa cum se observa, capacitatea antioxidanta cea mai mare o au extractele de maces, fapt datorat nu continutului de antociani, care este unul am putea spune modest (vezi tabelul 1.2) ci continutului ridicat de vitamina C (vezi tabelul 1.4), dupa cum am mentionat anterior valorile ridicate ale capacitatii antioxidante fiind cele care au determinat si analiza continutului de vitamina C din materialele vegetale luate in lucru, intrucat trebuie tinut seama de aceasta in realizarea formulelor de suplimenti nutritionali. De asemenea cantitatea de vitamina C per gram de material vegetal poate fi un index de masurare a randamentului de extractie atunci cand se stabilesc parametrii operationali pentru metoda optima de extractie. De asemenea se poate observa ca extractele acidulate obtinute din afin si din merisor au o capacitate antioxidanta mai mare. Structura fenolica a antocianilor este cea care determina activitatea antioxidanta a acestora, deci capacitatea lor de a elimina specii reactive ale oxigenului precum superoxidul (O2.−), oxigen singlet (‘O2), peroxid (ROO−), apa oxigenta (H2O2), si radicalii hidroxil (OH.). Activitatea antioxidanta a antocianilor este datorata in mare masura prezentei gruparilor hidroxilice in pozitia 3 a celui de al treilea ciclu aromatic precum si in pozitiile 3′, 4′ si 5′ din ciclul B al moleculei. Prezenta acidului asigura un pH la care antocianii sunt intr-o forma mezomera pentru care prezinta un maxim al activitatii antiradicalice bazate pe transferul e- si H+.

De asemenea, trebuie mentionat ca in extractele acidulate eficacitatea antioxidanta se datoreaza nu doar continutului in antociani cat si datorita faptului ca prin hidroliza acida se reduce numarul de grupari glicozidice grefate pe structura de baza. In general activitatea antiradicalica a antocianidinelor (adica a agliconilor) fiind superioara antocianinelor (structurilor glicolizate), aceasta activitate scazand pe masura ce creste numarul de grupari glicozidice. 1.1.3.1.2. Determinarea capacitatii antioxidante utilizand metoda ORAC Metoda ORAC masoara degradarea oxidativa a unei probe fluorescente (ficoeritrina sau fluoresceina) dupa amestecarea cu un compus ce genereaza radicali liberi, de tipul azo-initiatorilor. Azo-initiatorii sunt compusi ce produc prin incalzire radicali liberi de tip peroxil ce deterioreaza markerul fluorescent (molecula fluorescenta), determinand astfel o modificare a intensitatii de emisie fluorescenta. Antioxidantul este capabil sa protejeze molecula fluorescenta de degradarea oxidativa. In prezenta antioxidantilor, degradarea (sau descompunerea) probei fluorescente masurata ca o stingere a fluorescentei este mai redusa sau chiar absenta. Se inregistreaza curbele corespunzatoare de tip intensitate de fluorescenta in functie de timp si se calculeaza aria corespunzatoare curbei in prezenta si in absenta antioxidantului. Rezultatul este exprimat in μmoli echivalent trolox/ gram de produs (µmolTE/g). Activitatea antioxidanta se calculeaza in conformitate cu ecuatiile:

Proba

Afin Extract

alcoholic acidulat

Afin Extract hidro-

alcoolic

Maces Extract

alcoholic acidulat

Maces Extract hidro-

alcoolic

Merisor Extract

alcoholic acidulat

Merisor Extract hidro-

alcoolic

TEAC µmol

TE/gmaterial vegetal

745,316 698,101 1227,579 1467,024 661,004 622,530

∆�������� = �������� - ��������

���� = ∆��������

��������� − ��������∗ �������

Unde AUCproba reprezinta aria de sub curba obtinuta in urma inregistrarii spectrului de fluorescenta al probei, AUCblank reprezinta aria de sub curba obtinuta in urma inregistrarii spectrului de fluorescenta al blankului, iar Atrolox reprezinta aria de sub curba obtinuta in urma inregistrarii spectrului de fluorescenta al troloxului, iar Ctrolox reprezinta concentratia molara a Troloxului. Rezultatele obtinute la determinarea capacitatii antioxidante a extractelor de afin, maces si merisor sunt date in tabelul 2.2. Tabelul 2.2.Activitatea antioxidanta exprimata in echivalent moli Trolox per g material vegetal pentru materialele vegetale de interes ca surse de antociani -metoda ORAC

Si in acest caz tot macesul este mai activ, din nou datorita cantitatii de vitamina C continuta, variatia tendintei capacitatii antioxidante in raport cu ceea ce s-a obtinut prin metoda TEAC tinand de specificitatea reactiei in raport cu substratul. 1.1. 3.1.3. Determinarea capacitatii antioxidante totale (TAC) utilizand metoda chemiluminescenta

Determinarea capacitatii antioxidante totale, relizata de catre partenerul P1-Universitatea din Bucuresti, are la baza o metoda chemiluminiometrica “in batch” care utilizeaza sistemul luminol-H2O2-Co(II)-EDTA. Reactia generala de chemiluminescenta (CL) in acest caz este (1).

(1)

Ionii de Co(II) sunt complexati cu EDTA (care este in mic exces fata de cantitatea stoechiometrica

necesara) ssi sunt eliberati din complexul Co(II)/EDTA in mediul de reactie, continuu si in cantitati foarte mici. Acesti ioni reactioneaza cu apa oxigenata, generand radicali hidroxil HO. printr-o reactie de tip Fenton (2). Ionii de Co(II) sunt regenerati in sistem prin reactia (3). Radicalul superoxid este produs in mediu prin reactia unei specii oxidate a luminolului cu oxigenul dizolvat.

(2) Co2+ + H2O2 Co3+ + HO. + HO-

Proba

Afin Extract alcoolic acidulat

Afin Extract hidro-

alcoolic

Maces Extract alcoolic acidulat

Maces Extract hidro-

alcoolic

Merisor Extract alcoolic acidulat

Merisor Extract hidro-

alcoolic

Capacitate Antioxidanta

µmol /g material vegetal

36,00 87,43 171,56 194,82 138,10 152,40

(3)

Radicalii HO. generati, fiind extrem de reactivi, reactioneaza cu luminolul, generand o emisie de CL,

conform reactiei (1). In absenta unui antioxidant in mediul de reactie, se obtine un semnal de CL care pentru o anumita perioada de timp are o valoare practic constanta (platou). Valoarea semnalului de CL pe platou este notata cu I0 . La introducerea unui antioxidant in mediul de reactie, acesta va reactiona cu radicalii prezenti in mediu si va produce o descrestere brusca a semnalului de CL. Valoarea semnalului de CL inregistrat (semnalul initial de CL fiind pe platou) este notata cu I. Prin reprezentarea raportului I0/I in functie de concentratia unui antioxidant etalon (s-a ales troloxul) s-a trasat o dreapta de calibrare. In acest scop s-au analizat șase soluții de trolox cu concentrații cuprinse între 10-6 M și 10-3 M și o probă de metanol 70% (v/v), care reprezintă proba de referință. Pentru fiecare probă s-au efectat 4 determinări. Ecuatia dreptei de calibrare este:

y = 0,4082xC -1,569 unde y reprezintă raportul I0/I calculat pentru probele analizate din care s-a scăzut valoarea I0/I pentru

proba de comparație (metanol: apă, 70: 30 (v/v)) şi C este concentraţia de trolox (µM). Coeficientul de determinare al regresiei liniare a fost r2 = 0,999. Domeniul de liniaritate s-a situat între

3x10-6 - 10-3 M trolox. Analizele s-au efectuat pe extracte furnizate de catre INCDSB.

Tabel 2.3.Capacitatea antioxidanta totala exprimata in echivalent moli Trolox per g material vegetal pentru materialele vegetale de interes ca surse de antociani -metoda chemiluminescenta

Dupa cum se poate observa din datele prezentate in tabelul 2.3, se mentine activitatea antiradicalica si fata de radicalii HO., cel mai activ extract fiind extractul organic acidulat obtinut din afin. 1.1.3. 2. Determinarea capacitatii antioxidante a extractelor care contin carotenoide De asemenea metoda TEAC a fost utilizata si pentru extractele de carotenoide si xantofile din maces, morcov si rosie, rezultatele obtinute fiind prezentate in tabelul 2.4. Tabel 2.4. Activitatea antioxidanta exprimata in echivalent moli Trolox per g material vegetal pentru materialele vegetale de interes ca surse de xantofile-metoda TEAC

Rezultatele obtinute demonstreaza ca, din punct de vedere al activitatii antiradicalice extractele cu un continut ridicat de beta-caroten si luteina sunt mult mai eficiente decat cele care au ca si component majoritar licopenul, pe cand in raport cu substratele lipidice este de asteptat ca toate sa demonstreze o buna eficacitate. Ca si un comentariu privind rezultatele obtinute in aceasta activitate de evaluare a eficacitatii antioxidante extractelor care contin principiile activ de interes -antociani, carotenoide si xantofile - trebuie mentionat ca atat continutul de zaharuri, care este variabil de la sursa vegetala la sursa vegetala, cat si continutului de

\

Co2+ + O2 Co3+ + O2. -

Proba

Afin Extract alcoolic acidulat

Afin Extract hidro-

alcoolic

Maces Extract alcoolic acidulat

Maces Extract hidro-

alcoolic

Merisor Extract

alcoholic acidulat

Merisor Extract hidro-

alcoolic

Capacitate Antioxidanta Totala (TAC)

µmol /g material vegetal

897,2 510,1 1090,0 1036,0 130,1 124,3

Proba Maces Extract carotenoide

Rosii Extract carotenoide

Morcov Extract carotenoide

TEAC µmol TE/g

material vegetal 218,88 14,69 322,53

vitamina C diferit pot explica diferentele obtinute intre cele trei metode de determinare a capacitatii antiradicalice / antioxidante. De asemenea faptul ca principiile active au afinitati diferite fata de radicalii liberi ca si fata de substraturile oxidabile pe care le protejeaza de degradarea oxidativa explica diferentele obtinute in valorile capacitatii antioxidante echivalente. A1.2. Dezvoltarea de metode de extractie a principiilor active (beta- carotenoide, antociani) In dezvoltarea metodelor de extractie care sa conduca la un randament de extractie imbunatatit s-a pronit de la urmatoarele teste, in etapa ulterioara de realizare a proiectului urmand a fi definitivate sistemele optime care vor sta la baza dezvoltarii demonstratorului MAE-extractie specifica. 1.2.1. Extractii pentru obtinerea carotenoidelor din rosii, morcov, maces si merisor 1.2.1.1. ß caroten, licopen, xantofile a. O cantitate de 140 g rosii/reziduuri tocate inghetate se agita cu 200 mL metanol timp de 20 minute. Se filtreaza si filtratul se indeparteaza. Reziduul de pe hartia de filtru se amesteca cu cate 100 mL de diclormetan si metanol. Amestecul se aduce intr-o palnie de separare si se agita puternic timp de 5 minute. Se separa si extractul lichid se spala de cate 2 ori cu cate 40 mL apa. Faza organica se amesteca cu sulfat de sodiu pentru 5 minute si apoi se filtreaza. Filtratul constituie proba specifica-betacaroten. b. 250 g rosii tocate inghetate se agita 10 minute cu 500 mL alcool etilic 96% si se filtreaza. Filtratul se indeparteaza si reziduul se reia cu 500 mL diclormetan, se agita 15 minute si se filtreaza. Filtratul 2 constituie compusul de interes. c. Mo, Ma, Me – morcovul, macesul si merisorul se paseaza (separat) si se ingheata 24 ore inainte de extractie. Cate 125 g pasta, din fiecare material vegetal, inghetata se extrage cu cate 100 mL alcool izopropilic la reflux, pe baia de apa la 50°C, timp de 3 ore. Dupa extractie proba se filtreaza. Din filtrat se iau 50 mL si se amesteca cu 200 mL eter de petrol. Se adauga apoi 75 mL apa pentru separarea fazei organice, care se reia avand continutul maxim de carotenoide. d. Se cantareste si se macina o masa cunoscuta de material vegetal (aprox. 25 g) sub diferite forme (morcov ras, rosii, maces macinat). Extractia se face intr-un amestec de solventi ce contine: tetrahidrofuran: alcool metilic: hexan (THF:MeOH:Hexan) in raport 25:15:15 (v:v:v) si amestecul de macerare astfel obtinut este sonicat timp de 20 minute (adaugand gheata in baia de sonicare) sub vid, si lasat la macerat 24h, la temperaturi de 4-80°C, ferit de lumina. Solutia rezultata este apoi filtrata pe hartie de filtru pentru indepartarea reziduului solid si centrifugata pentru separarea celor doua faze organice timp de 10 minute, 5000 rpm la temperatura de 40°C. Dupa colectarea stratului superior fractiile de hexan sunt evaporate la sec sub vid. Reziduul obtinut contine carotenoidele si xantofilele de interes. Randamentul de extractie obtinut pentru metoda d variaza intre 0.1µg principiu activ extras per g material vegetal si, respectiv 26.93 µg principiu activ extras per g material vegetal. Aceasta variatie depinde de principiul activ si de materialul vegetal sursa, de exemplu licopenul este extras cu un randament mai redus din morcov si mai mare din rosii, in timp ce beta-carotenul are un randamment de extractie mai bun in cazul morcovului. 1.2.1.2. Extractii pentru obtinerea antocianilor din afin, maces si merisor a. Merisor, afin si maces-materialul vegetal corespunzator fiecarei surse este catarit si se face extractia intr-un volum de metanol acidulat 0.5% HCl care sa respecte raportul m :v de 1 :10. Extractia se face la temperatura de 50°C, timp de 12 ore. Dupa extractie probele se filtreaza. Filtratul contine antocianii de interes. b. Materialul vegetal (Merisor, Afine, Maces) este supus macinarii si apoi se aplica urmatoarele tipuri de extractie : b1. 25 g material vegetal + 25 mL solvent de extractie (metanol acidulat HCl 0.5%); sonicare la intuneric 30 minute in baie de sonicare in care se adauga gheata pentru mentinerea unei temperaturi sub 25°C, atmosfera inerta. Filtratul contine analitii de interes.

b.2 25 g material vegetal + 25 mL solvent de extractie (metanol:H2O) (70:30 v:v); sonicare la intuneric 30 minute in baie de sonicare in care se adauga gheata pentru mentinerea unei temperaturi sub 25°C, atmosfera inerta. Filtratul contine analitii de interes. Randamentele de extractie obtinute pentru metoda de extractie, ambele variante, variaza intre 0.06 µg principiu activ extras din 1 g material vegetal si 94.63 µ principiu activ extras din 1 g material vegetal, variatia fiind, de asemenea, in functie de principiul activ si de materialul vegetal sursa. 1.2.1.3. Dezvoltare de metode de extractie sigure pentru obtinerea carotenoidelor Unul dintre obiectivele majore ale HIVEGRES este imbunatatirea randamentelor de extractie astfel incat sa se ajunga la o valorificare superioara a resurselor naturale/materialului vegetal. Ca urmare, pornind de la experiența acumulata in cadrul COSFEL SA privind folosirea microundelor pentru imbunatatirea randamentelor de extractie si a eficientei procesului (scaderea timpului de reactie, reducerea consumului de solventi etc) s-a realizat in aceasta prima etapa un model initial al unui reactor de extractie asistata de microunde aplicabil la extractia principiilor active din materiale vegetale. Materialele vegetale testate in aceasta prima etapa au fost morcovul si macesul. Schema de principiu pentru reactorul de extractie asistata de microunde Sistemul de extractie este alcatuit dintr-un vas de reacție cu capac, incalzit de un magnetron dispus pe fundul vasului. Aceasta soluție constructiva permite un control eficient al incalzirii. Aparatul este prevazut cu un sistem de siguranța la incalzire a magnetronului, atat in in caz de oprire normala cat si forțata. Masurarea temperaturii sistemului se face printr-un senzor de temperatura tip bimetal poziționat la baza reactorului si conectat la magnetron. Temperatura este controlata printr-un sistem de termostatare care este comandat de la panoul de control. Agitarea cu viteza variabila permite omogenizarea masei de reacție in funcție de vascozitatea inițiala si cea dezvoltata pe durata reacției. Caracteristicile tehnice ale reactorului staționar sunt urmatoarele: tensiune de alimentare 220V/50Hz; putere max. absorbita 3 KW; putere in microunde 2 KW; frecvența in microunde 2450 MHz; capacitate max. 9 litri; capacitate de procesare 3 litri; dimensiuni de gabarit LxlxH 0,4x0,4x1,2 m (cu condensator)

Schema echipamentului experimental este prezentata in figura 2.1 si reprezinta suportul tehnic pentru conceperea echipamentului industrial de dimensiuni mai mari.

Fig. 2.1. Schema reactorului static: 1 – vas de reacție, 2 –ghiduri de unda, 3 – motor cu reductor, 4 – agitator, 5 – termocuplu, 6 – intrare materii prime, 7 – golire vas reacție, 8 – condensator de reflux, 9 – azot, 10 - panou de control

S-au utilizat doua sisteme de solventi de extractie: a. Extractie in hexan, material vegetal (morcov): solvent 1:1 (m:v), temperatura de extractie 45oC,

parametrii de lucru ai reactorului stationar – conform caracteristicilor tehnice prezentate mai sus, timp de extractie 90 de minute.

b. Extractie direct in lanolina raport de masa In cazul extrcatiei in hexan asiatata de microunde determinarea continutului de β-caroten extras s-a facut prin HPLC-PDA conform metodei prezentate in paragraful 1.1.2.2., obtinandu-se un continut de 2363 µg/gram material vegetal. Aceasta inseamna ca in 90 de minute de extractie, fara alte etape de prelucrare a probei, se obtine deja 87,6% din cantitatea existenta in morcov determinata dupa extractiile cantitative efectuate prin metoda clasica,

prezentata in paragraful 1.2.1.1.d.

Fig.2.2. Cromatograme obtinute pentru extractul de morcov obtinut prin MAE, dilutie 1:10 (magenta) si un standard de concentratie 5 ug/mL (negru)

In etapele ulterioare de implementare a proiectului se vor optimiza parametrii operationali si tehnici folositi in procesul de extractie.

CONCLUZII In aceasta prima etapa a fost evaluata calitatea materialelor vegetale de interes din punct de vedere al identificarii principiilor active existente, al determinarii continutului de princpiu activ per gram (respectiv 100 grame) material vegetal luat in lucru precum si din punct de vedere al eficientei antioxidante in raport cu trei tipuri de radicali liberi. Prin metoda calitativa de cromatografie pe strat subtire, HPTLC, au fost identificate principalele clase de principii active din materialul vegetal studiat. Prin metode de analiza cantitativa HPLC-PDA-MS au fost determinate cantitativ, continut exprimat in microgram per gram material vegetal luat in lucru, toate principiile active de interes. Aceste metode au fost dezvoltate de catre INCDSB (CO), si constituie subiectul unei validari in house care va fi raportata in etapele ulterioare de implementare a proiectului. S-a determinat eficacitatea antioxidanta a extractelor obtinute din urmatoarele surse vegetale: afin, maces, merisor, morcov si rosii. S-au dezvoltat mai multe metode de extractie pentru principiile active de interes urmand a fi optimizate si a se alege varianta cea mai buna care sa stea la baza dezvoltarii demonstratorului MAE. S-a stabilit schema de principiu, s-a construit un model de reactor MAE si au fost determinate caracteristicile tehnice de operare ale reactorului de extractie asistat de microunde utilizand ca si material vegetal de testare morcovul, reusindu-se in urma acestor incercari obtinerea unui randament de extractie de cca 87,6% reducandu-se timpul de extractie la 7% din cel necesar in metodele clasice de extractie, lichid-lichid. Aceste prime determinari au permis cunoasterea surselor vegetale cu cel mai mare potential de furnizare de antociani cu eficacitate ridicata (merisor si afin), sau de carotenoide si xantofile (macesul si rosia). In plus, datorita continutului ridicat in vitamina C macesul poate potenta eficienta oricarui eventual produs formulat prin asigurarea efectului sinergetic. In etapa urmatoare de implementare a proiectului se vor continua studiile privind reciclarea reziduurilor si subproduselor vegetale si imbunatatirea randamentelor de extractie, dezvoltarea de tehnologii "safe-extraction" si evaluarea si stabilizarea produsilor de extractie, si se va incepe dezvolatrea de noi instrumente analitice, biosenzori, precum si dezvoltarea de protocoale pentru evaluarea calitatii materialelor biologice si a produselor. Unul dintre livrabilele etapei urmatoare de realizare a proiectului este modelul demonstratorului pentru extractia MAE.

Director de Proiect Dr. Simona Carmen Litescu, CSI

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

uV(x100,000)