2

11Substane prebiotice, surse de obinere i metode de obinere

2. PRINCIPALELE SUBSTANE PREBIOTICE

2.1. FRUCTOOLIGOZAHARIDE

2.1.1. Fructooligozaharide naturale

Fructooligozaharidele naturale sunt alctuite dintr-o molecul de glucoz (G) i 1-4 molecule de fructoz (F) legate prin legturi glicozidice. Ele se mpart n urmtoarele grupe (fig. 1):

GF fructooligozaharide alctuite dintr-o molecul de glucoz i o molecul de fructoz i sunt reprezentate de : turanoz, malturoz, leucroz i izomalturoz;

GF2 fructooligozaharide reprezentate de 1-kestoza, 6-kestoza i neokestoza;

GF3 - fructooligozaharide care includ nistoza, bicurcoza i neobifurcoza;

GF4 fructooligozaharide care includ fructozilnistoza i bifurcoza.

n general, fructooligozaharidele sunt larg rspndite n natur. Ele se gsesc n concentraii mari n plante, sub form de carbohidrai de rezerv. n tabelele 1 i 2 sunt prezentate principalele grupe de fructooligozaharide i sursele din care se pot obine.

Tabelul 1

Tabelul 2

Cantiti mari de fructooligozaharide se gsesc n cicoare (73,6%, raportat la s.u.), ceap (72% raportat la s.u.), dalie (70% raportat la s.u.) i usturoi (50% raportat la s.u.) (tabelul 3). n tuberculi de truf alb Helianthus tuberosus, de asemenea, se gsesc cantiti mari de fructooligozaharide.

Tabelul 3

Enzimele responsabile pentru formarea polimerilor i oligomerilor de fructoz sunt fructoziltransferazele iar substratul pe care acioneaz este zaharoza. Allen i Bacon (1956) au obinut 2 kestoze (1-kestoza i neokestoza) cu o fructoziltransferaz obinut din frunze de sfecl de zahr. Din tuberculii de truf alb (Helianthus tuberosus) au fit izolate 2 tipuri de enzime implicate n biosinteza FOS: astfel trizaharidele (GF2) au fost obinute sub aciunea enzimei zaharoza: zaharoza 1F fructoziltransferaze ( SSF) iar apoi oligozaharide cu mas molecular mai mare(GF2) au fost obinute cu ajutorul enzimelor fructan 1F fructozil transferaza (FFT). Ceapa i sparanghelul sunt, de asemenea, importante surse de fructoziltransferaz.

Shiomi i alii 1980) au studiat, n detaliu, fructoziltransferazele izolate din rdcin de sparanghel (Asparagus officinalis L.). Cu aceste enzime au sintetizat 11FOS, care au fost identice cu cele izolate. Autorii au mai observat c oligozaharidele din sparanghel sunt obinute prin aciunea combinat a trei tipuri de fructoziltransferaze i anume: zaharoza: zaharoza 1F fructoziltransferaza, 6G fructoziltransferaza i 1F fructoziltransferaza. Ulterior, dup purificarea i caracterizarea individual a acestor fructoziltransferaze autorii au observat c proprietile lor generale sunt asemntoare cu cele ale enzimelor din truf alb dar specificitatea lor pentru substrat difer.

Un cercettor indian, Satyanarayana (1976) a studiat enzimele implicate n formarea oligomerilor i polimerilor de fructoz din agave (Agave vera cruz). El a izolat diferite oligozaharide pe care le-a sintetizat in vitro i a propus un mecanism de aciune pentru enzima respectiv. Autorul a observat c spre deosebire de alte fructoziltransferaze, enzima din agave este capabil s sintetizeze inulotrioz din inulobioz. Autorul mai menioneaz c oligozaharidele care apar natural n Agave vera cruz (1-kestoz, 6-kestoz, neokestoz) nu provin numai din reacii de transfructozilare ci i din diferite trepte de hidroliz a oligozaharidelor cu mas molecular mai mare sau a polimerilor de fructoz sub aciunea enzimelor cu activitate hidrolitic (hidrolaze). n tabelul 4 sunt prezentate principalele plante din care s-au obinut fructoziltransferaze i autorii care le-au izolat.

Fructooligozaharidele pot fi sintetizate i cu ajutorul enzimelor de origine microbian. Pazur ( 1952) a izolat o fructoziltransferaz din Asp. oryzae. Cu aceast enzim el a obinut 2 oligozaharide pe care le-a numit provizoriu 1-inulobiozil-D-glucoza i inulotrizol-D-glucoza care, mai trziu s-au dovedit a fi 1-kestoza i nistoza. Enzima se deosebete de celelalte fructoziltransferaze prin specificitate de substrat, ea putnd utiliza numai zaharoza sau rafinoza ca substrat.

Utiliznd un substrat de zaharoz cu ajutorul fructoziltransferazei din Claviceps purpurea au fost obinute mai multe fructoziltransferaze prin care sunt menionate i 1-kestoza i neokestoza.

Fusarium oxysporum este un alt furnizor important de enzime cu activitate transfructozilazic, care a fost studiat de muli cercettori. Maruyama i Onodera (1979) au izolat dou tipuri de fructoziltransferaze iar Gupta i Bhatia (1982) au obinut mai multe fructozoligozaharide prin cultivarea lui F. oxysporum pe un mediu de zaharoz.

Principalele microorganisme productoare de fructooligozaharide i autorii care le-au studiat sunt prezentai n tabelul 5.

ncepnd cu anul 1990, datorit tehnicilor mai avansate de izolare i purificare s-au obinut enzime care pot realiza producii mari de FOS i care au fost propuse pentru utilizare la scar industrial. Astfel Hidaka i alii (1989) au izolat fructoziltransferaze din tulpini de Aspergillus niger, pe care, dup ce le-au caracterizat din toate punctele de vedere, le-au propus spre utuilizare la scar industrial n vederea obinerii de siropuri de FOS. Autorii au observat c prin utilizarea enzimelor din Aspergillus niger se pot obine siropuri cu concentraii > 50-60% FOS.

Hayashi i alii (1991,1993)au studiat enzimele productoare de FOS din specii de Aureobasidium. Aceast enzim poate fi utilizat cu succes la obinerea de FOS datorit faptului c are activitate enzimatic ridicat. Jung i colaboratorii ( 1987) i Smith i colaboratorii (1991) au obinut un preparat de fructoziltransferaz cu activitate enzimatic mare, utiliznd o drojdie neagr, Aureobasidium pullulans.

Balken i alii (1991) a obinut un preparat de fructoziltransferaz cu activitate enzimatic mare din Aspergillus phoenicis, cu care ei au obinut un sirop cu o concentraie de 60% FOS. ( raportat la s.u.). Este de remarcat c spre deosebire de enzime din Aureobasidium pullulans, aceasta nu produce 1F-fructozilnistoza (GF4) i este inhibat att de glucoz ct i 1-kestoz i nistoz.

Fujita i alii (1990) au izolat o fructoziltransferaz din Arthrobacter care are specificitate mare pentru acceptor. Astfel, autorii au observat care are specificitate mare pentru acceptor. Astfel, autorii au observat c maltoza, izomaltoza, lactoza i xiloza dar nu i 1-kestoza i 1F-frucotizilnistoza au fost acceptori eficace pentru aceast enzim, deosebindu-se astfel de alte enzime productoare de FOS.

Takeda i colab. (1994) a izolat o fructoziltransferaz dintr-o tulpin de Scopulariopsis brevicanlis. Aceast tulpin are capacitatea de a produce selectiv 1-kestoza, un component major al FOS. De altfel, activitatea acestei enzime a fost gsit ca fiind localizat intracelular spre deosebire de situaia ntlnit la alte microorganisme care produc FOS att intra ct i extracelular.

Este important de menionat c enzimele din Aspergillus niger i Aureobasidium pullulans au o regiospecificitate ridicat n sensul c transfer unitatea de fructoz din molecula unei zaharoze carbonului C1 al fructozei din cea de-a doua molecul de zaharoz (se formeaz o legtur 2(1 glicozidic)

Din materiile prime de origine vegetal fructooligozaharidele pot fi obinute prin extracii n baterii de extracie, ce funcioneaz n contracurent.

2.1.2. Fructoolihgozaharidele obinute din zaharoz

n general, fructooligozaharidele de sintez sunt constituite dintr-un lan liniar de uniti (-D-fructofuranoz, legate prin legturi ( (2(1) - glicozidice, avnd la extremitatea nereductoare o unitate de D-glucopiranoz (glucidul terminal este zaharoza). Aceste oligozaharide au formula structural prezentat n fig.2

1. Prin hidroliza enzimatic controlat a inulinei, care este un polimer de fructoz obinut din rdcin de cicoare (fig. 3).

Principalul utilizator ala cestui tip de procedeu este firma belgian Orafti, iar produsul obinut are denumire comercial de Raftilose, fiind comercializat n form lichid sau pulverulent, cu diferite grade de puritate. Fructooligozaharidele din Raftilose pot avea ntre 2 i 9 monozaharide dar, n general, predomin cele care au 4 uniti de monozaharuri pe lan.

2. Prin sintez enzimatic cu fructoziltransferaze, utiliznd un substrat de zaharoz. Mecanismul de aciune al fructoziltransferazei depinde de sursa din care este obinut enzima. N general, n plante i unele microorganisme sinteza fructooligozaharidelor are loc sub aciunea combinat a mai multor tipuri de fructoziltransferaze, n schimb la cele mai multe microorgaanisme sinteza are loc sub aciunea unui singur tip de enzim. De exemplu, sinteza fructooligozaharidelor din trufa alb ( Helianthus tuberosus) are loc sub aciunea a dou enzime: zaharoza: zaharoza 1-fructoziltransferaza SST) i (-(2(1)fructan:((2(1) fructan 1-fructoziltransferaza FFT). n prima faz sub aciunea enzimei SST din 2 molecule de zaharoz se formeaz o molecul de glucoz i un oligofructozid, enzima fiind incapabil s realizeze polimerizarea peste nivelul de trizaharid. Ulterior sub aciunea enzimei FFT sunt sintetizai succesiv succesiv oligomeri de fructoz mai mari. Reaciile enzimatice care au loc sunt:

unde: GF este molecula de zaharoz;

n numr de resturi de fructoz fr cea prezent n zaharoz.

Enzima izolat din agave sintetizeaz fructooligozaharidele cu mas molecular mai mare. Mecanismul de aciune al acestei fructoziltransferaze este:

GF + fructoziltransferaz ( F fructoziltransferaza + G

F fructoziltransferaza + GF ( GF2 + fructoziltransferaza

Se menioneaz cu glucoza, nu fructoza, din cea de-a doua molecul de zaharoz acioneaz ca acceptor pentru unitile de fructoz transferate de enzim. Iar fructooligozidele GF, GF3 i GF4 care se formeaz nu pot aciona ca donori de resturi de fructoz ci numai ca acceptori n vederea obinerii de oligozaharide mai mari (cu mas molecular mai mare).

Acest mecanism este identic cu cel al fructoziltransferazei din cicoare dup cum menioneaz Singh i Bhatia (1971).

Dickerson (1972) propune un mecanism de reacie pentru enzimele din Claviceps purpurea care produce, n principal, oligozaharide de tipul neokestozei. Reaciile care au loc sunt:

unde numerele indic poziia atomilor de carbon care particip la formarea legturilor glicozidice, iar sgeile reprezint direcia legturii ( F2(1G este zaharoza). n plus cele dou reacii de sintez de mai sus sunt nsoite de reacii de hidroliz, fiind hidrolizat, n special legtura F2 (6G. Astfel, produsul primei reacii acioneaz att ca donor ct i ca acceptor pentru modul de aciune al fructoziltransferazei obinut din Aureobasidium pullulans. Mecanismul de aciune al enzimei este prezentat mai jos ( fig. 4):

Conform acestui mecanism enzima acioneaz asupra zaharozei cataliznd o reacie de disproporionalitate unde o molecul de zaharoz servete ca donor iar alta are rol de acceptor.

Enzimele izolate din sp. Aureobasidium i Asp. niger au o regiospecificitate ridicat, explicaia constnd n faptul c ele realizeaz transferul selectiv al restului fructozil de la o molecul de zaharoz la carbonul C1 al unitii de fructoz din cealalt molecul de zaharoz, obinndu-se FOS de tipul 1-kestoz.

n concluzie, cele mai multe dintre fructoziltransferazele microbiene pot cataliza reacii de tipul: o treapt principal reversibil i o treapt ulterioar ireversibil, dup cum se arat mai jos:

unde: Fru fructoza;

enz furctoziltransferaza;

R glucoza

Cu privire la caracteristicile enzimelor prezentate mai sus se menioneaz c, n general, cele microbiene sunt mai termostabile dect cele de origine vegetal. Fructoziltransferazele microbiene au activitate optim la pH = 5-6,5 i temperaturi cuprinse ntre 50 i 60(C. Aceste enzime sunt convenabile pentru utilizare la scar industrial datorit faptului c pot cataliza reacii de transfer chiar i la concentraii ridicate ale substratului ( 700-850g/hl)

Pn acum inhibitorii i activatorii fructoziltransferazelor izolate din diferite surse, au fost stabilii numai pentru unele dintre acestea. Astfel, fructoziltransferaza din Agave america este activat de ioni de Ca, Mg, Co i Li i inhibat de Ag, Pb, Hg, Al, Sn, pe cnd enzima din Aureobasidium sp. este inhibat de Hg, Cu i Pb iar activatorii ei nu se cunosc.

Specificitatea fructoziltransferazelor microbiene depinde, n primul rnd, de restul (-D-fructofuranozic al zaharozei. Unele oligozaharide care au uniti terminale de fructoz ( rafinoza, inulibioza) pot fi utilizate ca substraturi n sinteza fructooligozaharidelor. De altfel, unele fructooligozaharide ca 1-kestoza, nistoza i 1F-fructozilnistoza pot aciona att ca donori ct i ca acceptori de uniti fructozil.

Din considerentele menionate mai sus, fructooligozaharidele sunt obinute industrial numai cu fructoziltransferaze de origine microbian. Cele mai utilizate dintre acestea sunt fructoziltransferaza din Aspergillus oryzae care este folosit de firma japonez Meiji Seika Co (prima firm care a produs i comercializat fructooligozaharide, cu denumirea comercial de Neosugar, n anul 1984 i fructoziltransferaza din Aureobasidium pullulans utilizat de societatea coreean Cheil Food and Chemical.

Fructooligozaharidele pot fi obinute printr-un procedeu discontinuu n care caz enzima este sub form solubil sau printr-un procedeu continuu n care enzima este utilizat sub form imobilizat n gel de alginat de Ca (sau alginat de Na). Conversia zaharozei are lor n reactoare cu pat fix, la o temperatur de 50(C. Se recomand ca soluia de zaharoz s aib o concentraie de 600-850 g/l.

n prezent, cele mai utilizate sunt procedeele continue de obinere a fructooligozaharidelor. n fig. 5 este prezentat schema tehnologic de obinere a fructooligozaharidelor.

Microorganismele sub form de cultur pur n eprubete cu mediu nclinat sunt multiplicate, mai nti, n vase de laborator, iar apoi ntr-un laborator care conine un mediu nutritiv pentru stimularea producerii de fructoziltransferaz. n continuare, enzima separat de miceliu este imobilizat pe un suport de alginat de sodiu.

Soluia de zaharoz, cu o concentraie de 50-60%, preparat n prealabil, este trecut prin coloan cu enzim imobilizat. Amestecul de zaharuri obinut este supus purificrii (prin decolorare pe crbune activ i trecere pe o coloan de schimbtori de ioni) i se obine Neozahrul G cu compoziia prezentat n tabelul 6, iar n figura 6 este artat structura chimic a fructooligozaharidelor prezente.

Tabelul 6

Neozahrul P este un produs alctuit exclusiv din fructooligozaharide i a fost obinut din neozahrul G prin separarea glucozei, fructozei i zaharozei reziduale prin metode cromatografice.

n procedeul industrial de obinere a fructooligozaharidelor, o problem care apare este produsul de reacie glucoza care are efect inhibitor asupra fructoziltransferazei. Din acest motiv, n general, se obin amestecuri care conin 55-60% FOS (n raport cu s.u.), glucoz, fructoz i zaharoz.

Pentru obinerea unor siropuri cu concentraii ridicate de FOS, deci pentru realizarea unei conversii mai eficiente a zaharozei n FOS s-a propus utilizarea, n proces a glucozoxidazei. n tabelul 7 sunt prezentate compoziiile amestecurilor obinute utiliznd fructoziltransferaza singur ct i n combinaie cu glucozoxidaza.

Tabelul 7

Sinteza chimic este un procedeu ieftin de obinere a fructooligozaharidelor. n acest caz, zaharoza amorf, anhidr, nclzit n mediu acid, n condiii controlate, este transformat ntr-un cation fructozil i un anion glucozil, conform reaciei din fig. 7.

Cationul fructozil este foarte reactiv i sufer un atac nucleofil sub aciunea oxigenulul gruprii hidroxilice prezente n mediul de reacie. Astfel, cnd cationul fructozil este generat n prezena unei molecule polihidroxilate, cum este zaharoza, se produce un derivat de zaharoz fructozilat. De exemplu, la evaporarea unui amestec format din 60 g zaharoz, 60 mg acid citric i 4 ml ap deionizat, sub vid i la temperatura camerei, se obine un amestec amorf, anhidru, acid zaharoz ( AAAS) care se transform ntr-un produs spongios dup ce 80-85% din ap a fost evaporat.

Prin termoliza AAAS la 100(C (60 min) se produc trei kestoze ( 1-kestoza, 6-kestoza i neokestoza). Punctele de substituire la molecula de zaharoz sunt artate n fig. 8.

Dac termoliza are loc la 120(C/80 min, se obine un fructoglucan din zaharoza care nu a reacionat n etapa precedent i kestozele formate n timpul echilibrrii reaciilor, ca mai jos :

Fructoglucanul obinut are masa molecular 4100 i gradul de polimerizare ( 25. Circa 85% din fructoglucan nu este colorat, asemnndu-se cu polidextroza. Aceste produse obinute prin termoliz sunt denumite Sucrose Thermal Oligosaccharide (STO). Dintre proprietile fiziologice i funcionale ale FOS se pot meniona:

au grad de dulce sczut 0,3 din gradul de dulce al zaharozei) putnd fi utilizate n diferite tipuri de alimente unde utilizarea zaharozei este limitat de gradul su de dulce ridicat;

nu sunt hidrolizate de enzimele digestive deci nu sunt utilizate ca surs de energie n organism (sunt acalorice), putnd fi folosite, fr probleme, de diabetici;

nu sunt cariogene, ceea ce se explic prin faptul c nu sunt utilizate de Streptococcus mutans care produce acizi i glucani insolubili, care sunt principalii vinovai de apariia cariilor dentare;

accelereaz proliferarea bifidobacteriilor n colon i mpiedic creterea microorganismelor putrefactive care produc diaree;

reduc nivelul colesterolului seric, fosfolipidelor i trigliceridelor.

2.3. GALACTOOLIGOZAHARIDE

2.3.1. GALACTOOLIGOZAHARIDE NATURALE

Aceste oligozide se gsesc n produse de origine vegetal sub form de mono-, di- i tri (-galactozil-zaharoza, cunoscute sub denumirea de rafinoz, stachioz i verbacoz. Structura chimic as acestor (-galactooligozide este prezentat n fig. 9.

Galactooligozidele menionate mai sus pot fi extrase din boabe de soia, prin nmuierea acestora n apa alcalinizant. De asemenea, ele se gsesc n apele de splare acidulate care rezult la obinerea concentratelor proteice din fin de soia sau n zerul obinut dup precipitarea proteinelor din extractul alcalin al finii de soia, n vederea obinerii izolatelor proteice ( fig. 10)

Datorit faptului c bifidobacteriile au o activitate (-galactozidazic mai mare dect alte bacterii intestinale, oligozaharidele menionate permit proliferarea selectiv a acestor bacterii benefice n tractul intestinal uman. n situaia n care bifidobacteriile sunt n numr mic sau lipsesc, datorit faptului c organismul uman nu dispune de (-galactozidaz, (-galactozidele ajung n colon unde sunt fermentate de bacterii gazogene i astfel apar simptome ca dureri abdominale, flatulen i chiar diaree, atunci cnd sunt ingerate n cantiti mari.

2.3.2. Galactooligozaharide obinute din lactoz

Galactooligozaharidele pot fi obinute prin procedee enzimatice i anume:

sintez prin reversia hidrolizei;

sintez prin transgalactozilare.

Reacia de reversie a hidrolizei este posibil prin controlul termodinamic al poziiei de echilibru a reaciei de hidroliz:

Condiii adecvate de lucru implic un mediu concentrat, o activitate a apei sczut, eliminarea produsului de reacie. Plecnd de la soluii concentrate de galactoz (25%), n prezena (-galactozidazei se poate obine un amestec de galactozide dup 5 zile de reacii la temperatura camerei (Stephen i colab., 1962).

Dezavantajul producerii de oligozaharide prin reversia hidrolizei este acela c se obine un amestec de galactooligozaharide datorit lipsei de regiospecificitate a enzimelor folosite.

Sinteza galactooligozaharidelor prin transgalactozilare are loc tot sub aciunea galactozidazelor, care realizeaz transferul radicalului galactozil de la un donor la un acceptor eficace ( fig. 11).

n acest caz, reacia este subcontrolul cinetic, nu termodinamic i prin urmare produsul de sintez poate deveni la rndul su substrat pentru enzim.

n situaia n care sinteza galactooligazaharidelor are loc plecnd de la lactoz, aceasta poate juca simultan att rol de donor ct i de acceptor de D-galactozili. Acest fenomen a fost observat la hidroliza unei soluii concentrate de lactoz cu ajutorul lactazei din Saccharomyces lactis ( Burvall, 1980). Galactooligozaharidele obinute din lactoz au structura chimic prezentat n fig. 12.

Toate galactooligozaharidele obinute din lactoz, dar, n special, trizaharidul (-D-galactozil (1(6) lactoza, stimuleaz creterea bifidobacteriilor (Yazawa i Tamura, 1982). De altfel, instalarea unei populaii bifidice numeroas n tractul gastrintestinal al sugarilor alptai natural este atribuit prezenei unor oligozaharide ce conin galactoz n laptele uman (Matsumoto, 1993, Smart, 1993).

Oligozaharidele care pot fi obinute din lactoz sunt prezentate n schema din fig. 13.

Lactuloza este un dizaharid alctuit dintr-o molecul de (-D-galactopiranoz i o molecul de (-D-fructofuranoz legate (1(4(glicozidic i are structura prezentat n fig. 14.

Ea se gsete n cantiti mici n produsele lactate prelucrate termic lapte condensat, lapte concentrat, lapte tratat UHT .a.), cantiti care nu sunt satisfctoare pentru dezvoltarea bifidobacteriilor n tractul intestinal (Andrews, 1984).

Industrial, lactuloza este obinut din lactoz prin izomerizare alcalin (lactoza este nclzit n prezena boratului utilizat drept catalizator), proces prin care din structura lactozei este transformat n fructoz ( Mizota, 1987).

Lactuloza este inclus n categoria factorilor bifidogeni, deoarece nu este hidrolizat sau absorbit n partea superioar a tractului gastrointestinal, iar n colon este metabolizat preferenial de bifidobacterii. Acest compus are, ns, multe alte aplicaii medicale fiind utilizat sub form de preparate farmaceutice (Duphalac, Bifiteeral, Chronulac, Cephulac) pentru controlul constipaiei i encefalopatiei portosistemice ( Broklehurst, 193) i, de asemenea, pentru prevenirea endotonemiei ( Pain i Bailey, 1986).

Prin fermentarea lactulozei de ctre bifidobacterii, crete producia de acid acetic i lactic n colon i se reduc cantitile de NH3 ( Vinee i Buridge, 1990), acizi biliari secundari (Thornton i Heaton, 1981) i acizi toxici ( butiric i valeric) ( Mortensen, 1990).

Lactosucroza este un trizaharid format dintr-o molecul de lactoz de care, prin intermediul glucozei, este legat ( (2(1)glicozidic o molecul de fructoz.

Industrial, lactosucroza se obine dintr-un amestec de lactoz i zaharoz folosind (-fructofuranozidaza ca enzim de transfructozilare.

Acest oligozaharid a fost utilizat iniial n combinaie cu sulfat de neomicin, sulfat de paramomicin, acid nalidixic i LiCl la prepararea unui mediu selectiv pentru izolarea bifidobacteriilor.

Lactitolul este un factor bifidogen obinut tot din lactoz. Astfel, prin hidrogenarea unei soluii de lactoz cu concentraii de 30-40% la 100(C i n prezena unui catalizator de Ni se poate obine lactitol, care are structura prezentat n fig. 15.

Utilizarea lactitolului ca factor bifidogen a fost propus datorit faptului c este hidrolizat foarte lent n intestinul subire, cea mai mare parte din cantitatea ingerat ajungnd n colon, unde sub aciunea microbiotei intestinale se formeaz acizi care scad pH-ul colonului.

n afar de proprietatea de a funciona ca substan bifidogen, lactitolul mai are i proprieti fiziologice, cum ar fi: reduce nivelul colesterolului seric (Sugimoto, 1976), modific metabolismul acizilor colici n intestin (Booy, 1987), poate fi utilizat n tratamentul encefalopatiei hepatice i a constipaiei, are grad de cariogenitate foarte sczut.

2.4. GLUCOOLIGOZAHARIDELE

n categoria glucooligozaharideloir prebiotice sunt incluse izomaltooligozaharidele i geniooligozaharidele care se pot obine prin diferite metode enzimatice din amidon ( fig. 16).

2.4.1.Izomaltooligozaharidele sunt alctuite din resturi de (-D-glucoz legate ((1,6) glicozidic. Ele sunt obinute din amidon care, n prealabil, este hidrolizat cu ( i (-amilaz obinndu-se un sirop bogat n maltoz. Acest sirop este tratat cu o (-transglucozidaz obinut din Aspergillus niger (Koper i Koch, 1988). Oligozaharidele formate joac simultan att rol de donor ct i de acceptor de resturi D-glucoz. Astfel, n general, se obin amestecuri ce conin att izomaltooligozaharide ct i oligozaharide care au resturile de D-glucoz legate (1,6 sau (1,4 glicozidic.

Procedeul cu (-transglucozidaz din Asp. niger a fost pus la punct de societatea japonez Haya Shibare.

Societatea Showa Sangyo Co a pus la punct un alt procedeu de sintez a izomaltooligozaharidelor, utiliznd ca substrat o soluie concentrat de maltodextrine, iar ca enzime un amestec de glucoamilaz i pullulanaz. n mod obinuit, aceste enzime sunt utilizate la hidroliza maltodextrinelor n vederea obinerii de D-glucoz. Acionnd ns asupra soluiilor concentrate de maltodextrine, cele dou enzime sintetizeaz oligozaharide care conin legturi (1,6 glicozidice, datorit reactivitii ridicate a gruprii hidroxil de la C6 al resturilor D-glucopiranozice ( Amarakone, 1984).

Sinteza izomaltooligozaharidelor poate fi realizat i printr-o reacie de transglucozilare catalizat de o neopullulanaz obinut din Bacillus stearothermophilus modificat prin mutageneza dirijat ( Kuriki, 1993).

2.4.2. Geniooligozaharidele sunt alctuite din resturi de glucoz legate (1,6 glicozidic. Ele se obin din sirop de glucoz prin transglucozilare. Nu sunt hidrolizate n stomac i intestinul subire i astfel ajung intacte n colon, unde sunt metabolizate n principal de bifidobacterii i lactobacili.

Sigurul productor de geniooligozaharide, cu denumire comercial de Gentose este firma japonez Nihon Shokuhin kako.

2.5. XILOOLIGOZAHARIDELE

Aceste oligozaharide sunt obinute din xilani prin hidroliz enzimatic cu endo 1,4(-xilanazp (fig. 17). Pentru a produce xilooligozaharide de nalt puritate, din amestecul obinut la hidroliz, se ndeprteaz att monozaharidele ( xiloza) ct i glucidele cu mas molecular foarte mare, utiliznd tehnici de membran ultrafiltrare i osmoz invers).

Aciunea bifidogen cea mai important o are xilobioza (4-0-(-xilopiranozil-D-xilopiranoza), care se i utilizeaz n preparatele prebiotice lichide.

Principalele oligozaharide prebiotice comercializate pe plan mondial sunt prezentate n tabelul 8.

Tabelul 8

3. METABOLISMUL FACTORILOR BIFIDOGENI

Cu privire la modul n care bifidobacteriile utilizeaz diferii factori bifidogeni, rezultate concludente au fost obinute pe baza experimentelor realizate in vitro. Studiile in vivo nu furnizeaz informaii exacte datorit faptului c nu se tie cu exactitate ce se ntmpl cu factorii bifidogeni n organismul uman, rezultatele obinute fiind contradictorii.

3.1. STUDII IN VITRO

Bifidobacteriile de origine uman se comport diferit pe mediile n care fructooligozaharidele sunt utilizate ca singur surs de carbon. Astfel, Bifidobacterium bifidum nu se dezvolt pe aceste medii, Bifidobacterium longum utilizeaz numai unele fructooligozaharide (1-kestoza, nistoza), n schimb Bifidobacterium adolescentis i Bifidobacterium infantis se dezvolt bine n prezena acestor oligozaharide. Bacterii intestinale nedorite cum sunt Bacteroides melaninogenicus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli i speciile de Clostridium nu pot metaboliza fructooligozaharidele ( Hidaka, 1986; Mitsucka, 1987).

Mitsuoka i Hidaka 1987) au observat c bifidobacteriile i bacteriile lactice (Lactobacillus acidophilus i Lb. casei) se dezvolt mult mai bine n medii cu lactuloz dect n cele cu fructooligozaharide, ns bacterii nedorite cum sunt clostridiile pot utiliza, la fel de bine, acest izomer al lactozei. De asemenea, lactuloza poate fi metabolizat uor i de unele tulpini de Escherichia coli.

Un studiu cu privire la influena factorilor bifidogeni (flactuloza i fructooligozaharidele) asupra creterii bifidobacteriilor a fost realizat de Dubey i Mistry ( 1996). n studiul pe care l-au realizat Dubey i Mistry susin c lactuloza i fructooligozaharidele nu influeneaz dezvoltarea bifidobacteriilor in vitro. Pentru aceasta autorii au adugat factori bifidogeni, n concentraie de 0,5% n mediul de cultur reprezentat de formule de hrnire pentru copii, pe baz de soia sau hidrolizat de cazein. Apoi formulele au fost inoculate cu 2,5% cultur pur sau mixt de bifidobacterii i termostatate la 37(C, timp de 24 ore. Tulpinile de bifidobacterii testate au fost Bifidobacterium bifidum (ATCC 15696); Bifidobacterium breve (ATCC 15700), Bifidobacterium infantis ( ATCC 15697) i Bifidobacterium longum ( ATCC 15708).

Dup cum se poate observa din tabelul 9 influena factorilor bifidogeni asupra creterii bifidobacteriilor este specific speciei. S-a observat c n fiecare formul, dup 8 ore postinoculare, creterea lui Bifidobacterium infantis a fost inhibat de lactuloz (fig. 18), iar a lui Bifidobacterium breve de fructooligozaharide (fig. 19).

Tabelul 9

n concluzie, autorii consider c factorii bifidogeni pot stimula creterea bifidobacteriilor in vitro numai n situaia n care n mediul de cultur nu exist alt surs de carbon.

Mizota (197) a realizat un studiu cu privire la modul n care este utilizat lactuloza de diferite microorganisme i a observat c unele specii Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, Staphylococcus aureus i Escherichia coli) necesit o perioad de adaptare pe mediile cu acest dizaharid, dar nu produc gaze prin metabolizarea ei. Culturile pure de Clostridium perfringens se dezvolt bine n medii cu lactuloz dar produc gaze, n schimb Escherichia coli necesit 3 zile de adaptare pe astfel de medii i, de asemenea, produc gaze prin metabolizarea acestui dizaharid.

Mizota (1987) a observat c, spre deosebire de lactuloz, lactitolul este utilizat foarte puin de bifidobacterii. Similar, bacteriile lactice (Lactobacillus acidophilus, Lb. fermentum i Lb. helveticus) metabolizeasz lactitolul (Haryu, 1991).

Bifidobacteriile (Bif. infantis, Bif. longum, Bif. adolescentis) pot metaboliza di i trizaharide ce conin galactoz (n principal galactooligozaharide obinute prin transgalactozilare) fr a necesita o perioad de adaptare. De asemenea, tulpini de Escherichia coli i Klebsiella pot metaboliza aceste galactooligozaharide, ns Lb. acidophilus i Str. faecalis nu se dezvolt pe mediile cu aceste surse de carbon ( Minami, 1983).

Alte studii au artat c stachioza i rafinoza sunt utilizate de bifidobacterii ca surs de energie. Aceste zaharuri pot fi metabolizate de Bif. infantis ns nu sunt utilizate de E. coli i Str. faecalis. Rafinoza poate fi metabolizat de bifidobacterii fr precultivare, dar n cazul stachiozei este necesar o perioad de adaptare ( Yazzuwa i Tamura, 1982).

3.2. STUDII IN VIVO

Testele cu factori bifidogeni realizate in vivo au fost concentrate, n primul rnd, asupra fructooligozaharidelor i mai puin asupra lactulozei, galactooligozaharidelor i xilooligozaharidelor.

Introducerea fructooligozaharidelor n alimentaia uman ( 15g/zi) conduce la o cretere a numrului de bifidobacterii de 10 ori (Mitsuoka, 1987). n acelai timp pH-ul intestinal se reduce cu 0,3 uniti, iar numrul enterobacteriilor descrete de la 108 la 107,6. Hidaka ( 1986) a realizat un studiu similar i a observat o cretere a produciei de acizi acetic i lactic cnd numai 8 g fructooligozaharide au fost administrate zilnic.

Tamura 1992) a realizat un studiu cu copii care au primit formule de hrnire coninnd 2% lactuloz i a observat o cretere a bifidobacteriilor de la 20 la 67% (n raport cu microbiota colonului). Teste suplimentare, realizate de acelai autor au artat c atunci cnd numai 3g lactuloz au fost ingerate de aduli, numrul bifidobacteriilor crete de la 8,3% la 47,4%, dar descrete dup ntreruperea administrrii.

Yoneyama (1992) a suplimentat raiile cobailor testai cu 0,1 i 10% lactosucroz i a observat c n ambele cazuri are loc o descretere semnificativ a pH-ului intestinal. De asemenea, autorul a observat o cretere semnificativ a numrului de lactobacili, bifidobacterii, enterobacterii n cazul raiilor cu 10% lactosucroz, dup 2 sptmni de la administrare. Dup 4 sptmni numrul lactobacililor i bifidobacteriilor continu s creasc ns cel al enterobacteriilor descrete. n cazul raiilor cu 1% lactosucroz, dup 2 sptmni, nu apare nici o schimbare n populaia de lactobacili i bifidobacterii.

Yoneyama (1992) a realizat apoi mai multe teste cu subieci umani i a observat c lactosucroza administrat acestora n doze de 2,5 i 10g/zi, timp de 14 zile, nu are nici un efect asupra greutii fecalelor, pH-ului sau concentraiei de acizi. Totui numrul bifidobacteriilor crete semnificativ dup 7 zile de la administrarea primei doze, n ambele cazuri 5g/zi i respectiv 100g/zi. n cazul ingestiei de 2g/zi lactosucroz, modificri semnificative au loc n cazul populaiilor de clostridii i enterobacterii, iar numrul bifidobacteriilor crete foarte puin.

Xilooligozaharidele au capacitatea de a stimula creterea bifidobacteriilor cnd sunt administrate subiecilor umani. Okazaki a realizat un studiu cu 10 subieci umani i a observat c populaia bifidic crete semnificativ cnd 1g sau 2 g de xilooligozaharide au fost administrate subiecilor sntoi o perioad mai mare de 3 sptmni. n cazul unui alt grup de subieci testai s-a observat c bifidobacteriile reprezint 9,3% din numrul total de bacterii intestinale naintea ingestiei de xilooligozaharide, ajungnd la un procent de 33,1%, 22,5% i 37,4% dup 1, 2 i respectiv 3 sptmni. n momentul n care este sistat ingestia de xilooligozaharide, numrul de bifidobacterii scade pn la nivelul dinaintea ingestiei. De asemenea, numrul bacteroidelor se reduce de la 55% naintea ingestiei la 4,7% n cazul administrrii xilooligozaharidelor, numrul de bacteroide i clostridii rmne nemodificat dup 6 sptmni i egal cu cel din perioada administrrii.

4. BENEFICIILE INGESTIEI DE OLIGOZAHARIDE

Ingestia de oligozaharide este considerat benefic pentru organism din urmtoarele considerente:

favorizeaz dezvoltarea bifidobacteriilor n colon i, n consecin, reducerea numrului bacteriilor duntoare. Hidaka (1986), Masai (1987), Ito (1990) i Wada (1991) ca urmare a studiilor pe care le-au realizat cu subieci umani, au constatat c ingestia a 2-10g/zi oligozaharide, timp de cteva sptmni, conduce la creterea numrului de bifidobacterii de 7,5 ori i de lactobacili de 2-3 ori, iar numrul clostridiilor (n principal Clostridium perfringens) se reduce cu 81%;

contribuie la reducerea metaboliilor toxici i a enzimelor duntoare produse de microbiota de putrefacie i patogen (aciune indirect).

Astfel la ingestia de 3-6g/zi oligozaharide se reduce cantitatea de metabolii toxici cu 4,6% iar activitatea enzimelor duntoare cu 40,9% n circa 3 sptmni de utilizare a oligozaharidelor;

previne diareea patogenic. La ingestia de 8g/zi fructooligozasharide scaunul persoanelor cu diaree revine la normal dup circa 8 zile;

protejeaz funciile ficatului. Prin ingestia de oligozaharide i creterea numrului de bifidobacterii are loc o reducere a cantitii de produi toxici formai, ceea ce are rolul de a proteja funciile ficatului. Ingestia de 3g/zi oligozaharide din soia se recomand n cazul tratamentului unor boli hepatice. S-a constatat c la persoanele n vrst ( ( 69 ani), cu ciroz la ficat ( non A i nonB) care prezint cromatoz hepatic i constipaie, simptomele se reduc n circa 5 zile (Taka Soye, 1990);

reduce nivelul colesterolului seric. La o ingestie de 6-12g/zi oligozaharide, timp de 2 sptmni - 3 luni, nivelul colesterolului seric i al colesterolului LDL se reduce, avnd loc o cretere a raportului colesterol HDL/colesterol total. Reducerea colesterolului seric este datorat, n principal, creterii numrului de bifidobacterii i lactobacili, n microbiota intestinal, dintre care unele ( Lb. acidophilus) au capacitatea de a asimila colesterol ( Gilliland i Walker, 1990);

reduce presiunea sanguin. Administrarea de 11,5g/zi fructooligozaharide timp de 5 sptmni, la persoane hiperlipidemice, conduce la reducerea presiunii diastolice cu 6 mmHg.

Dozele de oligozaharide recomandate sunt:

- fructooligozaharide

3g/zi;

- galactooligozaharide2-2,5g/zi;

- oligozaharide din soia2g/zi;

- xilooligozaharide

0,7g/zi

Pentru a se preveni apariia diareei, indus de consumul de oligozaharide din soia nu trebuie s se depeasc urmtoarele doze: 0,64g/kcorp la brbai i 0,96g/kcorp la femei ( Hata, 1989). n cazul fructooligozaharidelor, dozele minime care pot induce diaree sunt 44 g pentru brbai i 49 g pentru femei ( Spiegel, 1994).