Microscopia optic prin contrast de faz

Microscopia optic prin contrast de faz (descris pentru prima dat n 1934 de fizicianul olandez Frits Zernike) este o tehnic optic de mbuntire a contrastului care poate fi utilizat pentru obinerea de imagini cu contrast nalt ale unor probe transparente cum ar fi: celule vii (de obicei, n culturi biologice), microorganisme, probe subiri de esuturi, profile litografice, fibre, dispersii, particule subcelulare (inclusiv nuclee i alte organite). n esen, tehnica contrastului de faz folosete un mecanism optic pentru a transforma variaiile de faz ale undei luminoase dup ce a trecut prin prob, n variaii ale amplitudinii acesteia. Variaiile de amplitudine pot fi vizualizate ca diferene ale contrastului imaginii. Unul din avantajele majore ale microscopiei prin contrast de faz este acela c celulele vii pot fi examinate n starea lor natural, fr ca, n prealabil, s fie omorte, marcate cu colorani i fixate n prob. Ca rezultat, dinamica proceselor biologice aflate n desfurare poate fi observat i nregistrat n condiii foarte bune de claritate i contrast. Anterior inventrii tehnicii contrastului de faz, unul din cele mai frecvente moduri de observare n microscopia optic era folosirea luminii transmise n condiii de fond strlucitor (brightfield). Metoda este util n special pentru probe fixate, marcate cu colorani sau pentru probe care prezint absorbie natural n domeniul vizibil. n general, probele observate n tehnica brightfield se numesc obiecte de amplitudine deoarece amplitudinea sau intensitatea luminii scade atunci cnd lumina strbate proba. Este important s amintim c obiectivele moderne cu contrast de faz pot fi folosite n combinaie cu alte tehnici auxiliare de cretere a contrastului cum sunt: contrastul prin interferen diferenial (DIC), fluorescena i lumina polarizat. Aceste obiective sunt prevzute cu defazori interni avnd diferite nivele de absorbie i de defazare a luminii directe (nedifractate) n scopul de a obine diferite grade ale contrastului i ale intensitii de fond. Interacia undelor luminoase cu obiectele de faz La trecerea prin prob o und luminoas incident se mparte n dou componente: i) o und plan nedeviat (nedifractat) numit unda de ordin zero sau lumina ambiant care trece prin sau pe lng prob, dar nu interacioneaz cu aceasta; ii) o und sferic difractat care se mprtie n multe direcii (pe un arc larg ce trece prin toat apertura obiectivului). Dup strbaterea probei, lumina ambiant i cea difractat sunt focalizate de sistemul de lentile frontal n planul imaginii intermediare i interfer avnd ca rezultat unda de particul, Este evident relaia: Detectarea imaginii probei depinde de diferenele relative dintre intensitile (deci dintre amplitudinile) undelor ambiant i de particul. Dac amplitudinile acestor unde difer n mod semnificativ n planul imaginii intermediare, atunci proba acumuleaz un contrast considerabil i devine uor de vizualizat. n caz contrar, proba rmne transparent i apare ca n tehnica brightfield (adic fr contrast de faz). n microscopia prin contrast de faz, intensitatea imaginii nu are o dependen simpl, liniar, n funcie de diferena de drum optic produs de o prob pe ntreaga grosime a acesteia i pentru tot domeniul de valori al indicelui de refracie. n schimb, intensitatea depinde de mai muli factori: absorbia n defazor, defazajul introdus de defazor i semnul acestuia. Relaia dintre undele individuale n microscopia brightfield i n cea cu contrast de faz poate fi descris vectorial folosind un sistem de coordonate polare. n acest sistem lungimea vectorului reprezint amplitudinea undei, iar unghiul dintre acesta i un vector de referin (fixat) constituie defazajul Pentru microscopia prin contrast de faz defazajele n urm sunt redate prin rotaii n sensul acelor de ceasornic (avnd ca referin un azimut arbitrar), iar cele nainte prin rotaii n sens contrar acelor de ceasornicAcest mod de abordare permite o vizualizare rapid a defazajelor luminii difractate i a felului n care acestea afecteaz faza undei rezultante. . Pentru probele care prezint o diferen de drum optic neglijabil (i, deci, un defazaj aproape nul) rezult . O und difractat avnd o amplitudine foarte mic i un defazaj aproape nul va produce o und de particul cu o amplitudine aprox. egal cu cea a luminii ambiante, si n aceast situaie nu se va obine niciun contrast i proba rmne invizibil pe fondul strlucitor. Folosind defazori cu configuraii speciale se pot realiza imagini cu contrast de faz pozitiv sau negativ.