MICROSCOPIAELECTRONICĂ

• Înțelegereaprincipiuluidefuncționareamicroscopuluielectronicşicumneajutăînstudiulcelulei

• Recunoaştereauneiimaginiobţinuteprinmicroscopieelectronică

• Întelegereaprincipalelordiferenţefaţădemicroscopuloptic

• Descriereatipurilordemicroscoapeelectronice,precumşiaaltortipuridetehnici,înruditecumicroscopia,carepermitobţinereadedetaliipânălanivelatomic

OBIECTIVELELUCRĂRIIPRACTICE

0,1mm

0,2μm

OCHIULUMAN

MO

ME

0,002nm

REZOLU

ȚIE

2 µm

10 µm

10 nm https://www.fei.com/image-gallery/80S-Ribosome/

https://www.diag2tec.com/plasmos/

Ochiulumandetecteazălungimideundă între~ 400-800nm.

Microscopulopticpoatedetectaolungimedeundade200nm.

Microscopulelectronicpoateajungelaorezolutiede2pm

MICROSCOPULELECTRONIC

Foloseșteunfasciculdeelectroniînloculunuifasciculdelumină.StudiulcelulelorcuajutorulMEapermis,înanii1950-1970,identificareaorganizăriicelulelorșiaorganitelorcelulare

Poateficaracterizatfolosindu-seaceiașiparametricașipentruMO:• Putereademărire→aproximativ1.000.000x• Rezoluție∼ 0,002nm(variabilădependentădetensiuneade

accelerareaelectronilor,devitezăacestora)

MICROSCOPULELECTRONIC- PRINCIPIUDEFUNCŢIONARE

• FormareaimaginiiînMEdepindedeinteracțiuneaelectronilordinfluxcunucleeleșielectroniiatomilordinpreparat(probă)

• Celuleleșițesuturilenuaucontrast,motivpentrucaresefolosescpentrupregătireaprobeisăruridemetalegrele,careseleagăselectivdediversemolecule(fosfolipide,proteine,etc)pentruacreștecontrastulînpreparat

• Cuajutorulmicroscopuluielectronicputemexaminastructuricelularedemicidimensiuni,denumiteultrastructuri (complexemacromoleculareșiorganite)

Interacțiuneaelectronilorcuprobainfluențeazăcomportamentulelectronilor

TRANSMISIE REFLEXIEREFRACȚIE

DIFRACȚIE ABSORBȚIE ÎMPRĂȘTIERE

• Microscop electronicdetransmisie – detectează electroniitransmiși prin probă• Furnizează detalii derezoluție înaltă (∼ 0,2nm)

• Microscop electronicdebaleiaj (scanning)– detectează electronireflectați deprobă• Furnizează detalii alesuprafeței probei analizate (∼ 50nm)

TIPURIDEMICROSCOAPEELECTRONICE

PRINCIPIULDEFUNCȚIONAREALME

MEconstădintr-uncilindruvidatîncaresuntaccelerațielectroniiextrașidintr-unfilament (deregulădetungsten) prinaplicareauneitensiunideacceleraredeordinulsutelordemiidevolți.Oseriedelentileopto-electronicefocalizeazăfascicululdeelectronicaretreceprinprobășiestevizualizatpeunecranfluorescentsauestecaptatdeundetectorelectronic.

MICROSCOPULELECTRONICDETRANSMISIE

FoloseșteunfasciculdeelectroniînloculunuifasciculdeluminăPentrufocalizareaelectronilorîntr-unfasciculcoerentsefolosesc lentileelectromagneticeamplasateîntr-oincintă vidată

PutereademărireșirezoluțiasuntdependentedevitezadeaccelerareaelectronilorînincintavidatăaME.

LENTILĂ CONDENSOR

FILAMENT –sursă de electroni

LENTILĂ OBIECTIV

LENTILĂ PROIECTOR

Ecran fosforescent/Detector electronic

Secțiuni prin celulepe o grilă (ø 3mm)

Fascicululdeelectroni,controlatdelentileelectromagnetice,treceprintr-ofeliefoartesubţiredeţesut• electroniicaretrec(„transmiși”)suntproiectați

peunecranfluorescent(sauînregistrațidecameredigitalespeciale),generândpuncteluminoase

• ultrastructurilecelularecareau„respins”electroniidatoritănucleelordemetalegrelelegați,vorcreaumbrepeecranulcaptator

MICROSCOPULELECTRONICDETRANSMISIE

ETAPELEOBŢINERIIPREPARATULUIPENTRUMEDETRANSMISIECLASICĂ

MO MERecoltare(biopsie,necropsie) Recoltare(doarbiopsie)

Fixare(fizică,chimică) Fixare(fizică/chimică)

Includere(parafină) Includere (răşini epoxidice)

Secționare(microtom) Secționare(ultramicrotom)

Montare(lamă,lamelă) Montare(grilădecupru)

Colorare(coloranți) Contrastare(săruridemetalegrele)

RECOLTAREA

• Biopsie – prelevare dețesut viu

•Culturi celulare

FIXARE

• esteobligatoriepentruME(nusepotexaminacelulevii)• trebuiefăcutăînainte(înculturacelulară)sauimediatdupărecoltareațesutuluiprinbiopsie

• trebuiefăcutăfoarterapiddupărecoltare- oricedegradarelanivelmolecular/celularvafiredatădemicroscop

FIXAREA

• FIZICĂ – prin înghețare rapidă - vitrificare (azot lichid, la - 190°C)• CHIMICĂ

• Glutaraldehidă (timp de fixare rapid – 5 secunde, putere depenetrare scăzută în țesut – 0,5mm)

• Tetraoxid de osmiu (OsO4) – numită postfixare, permiteconservarea fosfolipidelor (vizualizarea membranelor)

• aldehidele și agenții oxidanți (OsO4) acționează prinformarea de legături covalente cu grupările funcționale alemacromoleculor din celule/țesuturi

INCLUDEREA

• Includerea încorporează piesa de țesut într-o materie solidă,potrivită pentru a obține secțiuni cât mai subțiri (50-100 nm),care pot fi examinate la microscop (electronii o pot străbate)

• Este precedată de deshidratare pentru a înlocui apa și a permitematerialului de includere, o rășină hidrofobă epoxidică, săpătrundă în probă

Țesut

SECȚIONAREA

• Secționarea serealizează cuunaparat special(ultramicrotom)pentru aobține secțiuni subțiri de0,04– 0,1µm

Piesadețesutesteinclusăînepon Secționareasefacelaultramicrotom Pieseleserecolteazăpeapașiapoisemonteazăpeogrilă

SECȚIONAREA- CONTRASTARE

grilă

CONTRASTAREA(ME)

• EsteechivalentăcolorăriipentruMO;estenecesarăpentruaputeadiscriminadiferitecomponentealepreparatului

• Sefacecusăruridemetalegrele(citratdeplumb,acetatdeuranil,etc),alecărornucleeseleagădeanumitecomponentedinpreparat,blocândtrecereaelectronilor

• Depunereametalelorgrelenuestespecificădarestereproductibilăastfelîncâtcreștereacontrastuluiserealizeazăconsecventpeanumitestructuri

• secțiunenecontrastată

CONTRASTAREA(ME)

• secțiunecontrastată

IMAGINILEDEMICROSCOPIEELECTRONICĂAPARÎNALB,NEGRUŞITONURI DEGRI

• moleculele careleagă mulținucleigrei (deosmiu,uraniu,plumb,fier ș.a.)vor producedispersia e- – zoneelectronodense (întunecate)

• moleculele carenuleagănucleigrei vor permitetrecerea e- – zoneelectronoclare

INTERPRETAREAIMAGINILOR

INTERPRETAREAIMAGINILOR

Cromatinăcondensată

Nucleu

ImaginedeMETaunorcelule(încercuitecuroșu,laputeredemărirescăzută(veziscarademărire)

Cromatinăcondensată

Detaliualimaginiiprecedente(veziscarademărire).Insertulroșuestemărit înimagineaurmătoare

Detaliualuneizonedecitoplasmădinimagineaprecedentă.Încentruseobservăuncentriol

Centriol

PUTEREMAREDEMĂRIRE

ME– PUTEREMAREDEMĂRIRE

Nano Lett., 2012, 12 (12), pp 6453–6458

molecula de ADN

Pasde2,4nmalspiraleideADN- A

CONTRASTARENEGATIVĂ

• Contrastareanegativăsefolsoseșteinspecialpentrustucturiproteice(peretecelular,filamente,complexemacromoleculare)pestecareseadaugăunvolumfoartemicdesoluțiedecontrastarecareseusucă.Electroniivortreceprinstructurileproteicecarenuleagăsoluțiadecontrastaresivorfireflectațiacoloundeeaseacumuleaza-lamargineapreparatului

Contrastare pozitivă Contrastare negativă

CONTRASTARENEGATIVĂ

100 nm

E. coli negatively stained with 1% Uranyl acetateCourtesy of Alexander MironovTaken by Tecnai microscopehttps://www.fei.com/image-gallery/

• Escherichia coli -imagine MET obținutăprin contrastarenegativă

CONTRASTARENEGATIVĂ

100 nm

Alberts B at al. Molecular biology of the cell / 6th ed. 2015

• Imagine MET obținutăprin contrastarenegativă a filamentelor de actină

CONTRASTARENEGATIVĂ

• Ce tehnică demicroscopieelectronică afost folosită pentruaobține această imagine?

CRIO-ELECTRONO-MICROSCOPIE/TOMOGRAFIE

Probelebiologiceaflateînsoluțiesuntpusedirectpeogrilășiscufundateînazotsauetanlichid.Seformeazăastfelopeliculăde apăvitrificată(fărăcristale)careconțineproba.AcestegrilesuntvizualizateînMET cudispozitivespecialedemenținereconstantăatemperaturiila-190⁰C.

Contrastulînacesteprobeestescăzutfiindgeneratdoardeatomiicomponențiaiprobelorbiologice.Imaginilesuntachiziționateautomatșiprelucrateșianalizate cuajutorulunorsofturispeciale.

Aceastătehnicăa primitpremiulNobelptChimiein2017

CRIO-ELECTRONO-MICROSCOPIE/TOMOGRAFIE

https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2017/press-release/

• Probele biologice suntvitrificate directpe grilăși vizualizate în condițiidetemperatură scăzută(-190°C)în MET

CRIO-ELECTRONO-MICROSCOPIE/TOMOGRAFIE

ER - galbencis C - verdecis V - verde deschismedial C - magentamedial V - roztrans C - albastru trans V - albastru deschisTGN - violetAlte membrane și ribozomi - gri

eLife 2017;6:e32493 DOI: 10.7554/eLife.32493

MICROSCOPIAELECTRONICĂDEBALEIAJ

• Oferăimaginitridimensionalealesuprafețelorcelulelor,țesuturilor,organisme

• Acelașiprincipiualinteracțiuniiunuifasciculdeelectronicuoprobăcaretrebuieacoperităcuunstratsubțiremetalic(pentrustabilitateșicontrast)

• Imagineaesteformatădeelectroniireflectațidepesuprafațapreparatuluișicolectațideundetector

REFLECTAȚI (SEM)

MICROSCOPIAELECTRONICĂDEBALEIAJ

Fire de păr

stereocili

Cili și mivrovilihttps://microscopy.stanford.edu/

Alberts B at al. Molecular biology of the cell. 6th ed. 2015

http://www2.optics.rochester.edu/

MICROSCOPIAELECTRONICĂDEBALEIAJ

https://www.fei.com/image-gallery/

CourtesyofDr.MarkMcClendon,NorthwesternUniversityTakenbyQuantaSEMmicroscopeMagnification:8,000XSample:EmbryonicNerveCellDetector:SEVoltage:3kVVacuum:2e-3PaHorizontalFieldWidth:20umWorkingDistance:6Spot:3

• Celule nervoase crescuteîn cultură

https://www. fei.com

MICROSCOPIAELECTRONICĂDEBALEIAJorganismmicroscopicdinapetermale acarian colorat digital

ÎNGHEŢARE- FRACTURARE

• Permite vizualizarea suprafețelor rezultate prin clivajulanumitor structuri (ex:clivajul membranei celulare)• Seîngheață celulele• Seintroduc într-ocameră vidată și selovesc cuuncuțit• Celulele sefracturează inzonele hidrofobe (unde gheațanus-aformat)

• Serealizează unmulaj metalic (Au,C)alsuprafeței expuse înurma clivajului – serealizează oreplică asuprafeței

• Seexaminează această replică metalică laMET

ÎNGHEŢARE- FRACTURARE

Startul extracelular

Startul citoplasmaticMembrana plasmatică

Cuțitproteine Fața internă a stratului extracelular (fața E)

Fața externă a stratului citoplasmatic (fața P)

http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/proceuc/c8.7x4.freeze.fracture.jpg

TEHNICĂ REZULTAT

PRINCIPIIC

ONSTRU

CTIVE

COLORAREVS.CONTRASTARE

• Cusubstanţe chimice,deobicei acizisau baze

- Coloranţii acizi seleagă desubstratacidofil (sarcini +)- Ex.EOZINĂ – uncolorantroz,decisubstratul bazic careîl leagă vaapărea colorat în roz

- Coloranţii bazici seleagă desubstratbazofil (sarcini -)- Ex.HEMALAUN – uncolorantviolet,deci substratul acidcareîl leagă va ficolorat violet

• Componentelecelularecareleagăsăruridemetalegrelevorblocatrecereaelectronilor,apărândîntunecate peimagini

• Restulcomponentelorvorfimaimultsaumaipuţinpermeabilepentrufluxuldeelectroni,carevortraversapreparatulşivorajungelaecranuldecaptură,producândunzonemailuminoase

ColorareaMO ContrastareaME

CARESUNTNIVELURILEDEDETALIEREALEUNEICELULE?

(MICROŞINANO)

• MOoferădetaliidespreformageneralăacelulelor,nucleuşicâtevadetaliidespreorganite(folosindmetodespecifice).

• MEoferădetaliidespreorganite,membranacelularăsaumoleculelecomponente(pânălanivelatomic)

• Putem“vedea”structurachimicaauneimolecule?- cristalografiacurazeX- spectroscopiaderezonanțămagneticănucleară- microscopuldeforțăatomică(MFA)- măsoarăinteracțiuneadintreunsenzorșiatomiidinpreparat

Metode de vizualizare a (macro)moleculelorTehnică Rezultat InterpretareCristalografiacurazeX(radiațieelectromagneticăculungimedeundă0,01-10nm)

-model de difracție

https://www.jic.ac.uk/staff/david-lawson/xtallog/summary.htm

un model de structură terțiară/cuaternară

modelare bioinformatică

Spectroscopiaderezonanțămagneticănucleară (radiațieelectromagneticăîndomeniulundelorradio)

spectru de rezonanță al atomilor de C, H sau al grupelor funcționale

https://www.exova.com/sectors/pharmaceuticals/material-sciences-testing/nmr-spectroscopy/

Microscopiadeforțăatomică

-”harta”interacțiunilordintreatomiimoleculeloruneisuprafețeșiunscanner

www.creative-biolabs.com/drug-discovery/therapeutics/atomic-force-microscopy.htm

Microscopie opticaSecțiune de 1µm

Microscopie electronicaSecțiune de 100 nm

MO ME40x

www.intechopen.com

5000x

Ob. 20x 20.000x

http://www.drjastrow.de/EMAtlasE.html

MO ME

REZUMAT• PregătireapreparatuluipentruMOşiME(detransmisie)treceprinetapeasemănătoare

• CuajutorulMOputemvizualizastructura componentelordinpreparat- organizareaţesuturilorînfragmentuldeorgan,componentetisulare(cepermitidentificareatipuluideţesut),tipuricelulare

• CuajutorulMEputemvizualizaultrastructura componentelordinpreparat- detaliilanivelcelular:organitecelulare,organizareamembranelor

• Existămetodecarenepermitidentificareaatomilorșiaranjamentullorînstructuriterțiare/complexemacromoleculare

CARACTERISTICĂ MICROSCOPULOPTIC

MICROSCOPULELECTRONIC

Spectrulelectromagnetic

FOTONI ELECTRONI

spectrulvizibil760nm÷ 390nm

electroni~0,004nm

Lentile(sistemedemodulareaundelor)

sticlă electromagnetice

Putereaderezoluție 0,2µm (200nm) 0,002nm (2pm)

Putereademăriremaximă x2.000 x10.000.000

Imagineaesteprodusădeosursăderadiații

sursădeluminăalbă/UV/LASER sursădeelectroni

Mediuldeexaminare aer vid

Proiecțiaimaginii directăochiuluman/filmfotografic/camerevideodeînaltărezoluție

indirectăecranfluorescent/film/camerevideodeînaltă

rezoluție

Imaginicolorate decelemaimulteori nu

Anexa 1

CARACTERISTICĂ MICROSCOPUL OPTIC MICROSCOPUL ELECTRONIC

Preparatulexaminat

celule fixate sau vii doar celule fixate

Fixarea diverse substanțe(uzual formaldehidă)

*

crio-fixare

GlutaraldehidăOsO4

*

crio-fixare

Includere (consitență)

parafină / înghețare rășini (plastic) / vitrificare

Grosimea secțiunii ~ 5 µm ~ 50 nm

Obținerea contrastului

coloranți / fluorocromi metale grele

Suport pentru preparat

lama de sticlă grilă de cupru