microbiologie lp subiecte

8/13/2019 Microbiologie Lp Subiecte

1/11

5. Antibiograma difuzimetrica principiu, interpretare1. Antibiograma difuzimetric comunDin punct de vedere tehnic nsmnm germenul de testat pe mediul solid(ex. agar Mueller-Hinton) turnat n plci Petri. nsmnarea se poate reali!a deexemplu prin "inundarea# plcii urmat de aspirarea$ aseptic$ a excesului deinocul sau cu a%utorul unui tampon (exist &i alte variante tehnice). Dup circa

' minute (timp n care placa Petri se las cu capacul ntredeschis nvecintatea ecului de ga!$ aprins) se aplic microcomprimatele n care suntncorporate antiiotice n concentraie standardi!at. *plicareamicrocomprimatelor se poate +ace cu a%utorul unei pense$ n condiii aseptice$sau cu a%utorul unui aplicator "automat# (la minim , mm distan ntre ele &iminim mm de marginea plcii/ vom utili!a antiiotice di+erite pentru oplac Petri cu diametrul de 0 cm).Microcomprimatele treuie s vin n contact per+ect cu mediul$ motiv pentrucare$ cu a%utorul unei pense le presm u&or (dup ca!). Dup nc -'minute$ incum plcile peste noapte n termostat$ la '1 sau ,-,234$ n+uncie de temperatura optim de multiplicare a microorganismului testat.*ntiioticul elierat din microcomprimat di+u!ea! n mediu$ reali!nd !one deinhiiie n care coloniile microiene nu se de!volt (5igura nr. ,).4u ct !ona de inhiiie este mai larg$ cu att germenul va +i considerat maisensiil. Dac n interiorul !onei de inhiiie (chiar dac diametrul nregistrateste +oarte mare) se de!volt colonii$ "mutani re!isteni#$ germenul va +iconsiderat re!istent (5igura nr. 6).*ceast metod$ cu toate c este +olosit pe scar larg n laoratoare$permite de +apt numai eliminarea antiioticelor complet inactive &i eventualselecionarea antiioticelor +oarte active$ pentru c tehnica nu estestandardi!at.

2. Antibiograma difuzimetric comparativ (Stokes, Ba!"7e e+ectuea! pentru microorganismul de testat n paralel cu un microorganism de re+erin$din aceea&i specie (sau o specie asemntoare). 7pre exemplu$ pentru cocii 8ram-po!itiviputem alege pentru comparaie o tulpin de Staphylococcus spp. 9ulpina de re+erin are osensiilitate cunoscut la di+eritele antiiotice pe care le utili!m.Prin aceast metod se nltur o parte din +actorii de eroare ai metodei precedente$ spre ex.calitatea mediului$ calitatea discurilor de antiiotice$ care vor +i identice pentrumicroorganismul de re+erin &i pentru microorganismul testat. :e!ultatele se exprim cutermenii; "sensiil#$ "intermediar#$ "re!istent#$ n +uncie de diametrul !onelor de inhiiie amultiplicrii celor doi germeni$ +a de acela&i antiiotic (%umtile de cerc se examinea!comparativ). n ca!ul n care cunoa&tem 4M< (concentraia minim inhiitorie) amicroorganismului de re+erin$ putem +ace aprecieri cu privire la 4M< pentru microorganismul

testat.Din punct de vedere tehnic$ pe o plac de +orma unui ptrat ("mprit# n , !one egalemarcnd pe partea extern a plcii liniile de demarcaie) se inoculea! n treimea mediemicroorganismul de re+erin iar n treimile exterioare ' microorganisme di+erite$ pentru caredorim s reali!m testarea.


2/11

o exist elemente minerale care treuie adugate n ca!ul testrii anumitor microorganisme(ex. Mg'?&i 4a'?$ pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa$ atunci cnd este testatsensiilitatea la aminoglico!ide)/o se va veri+ica pH-ul mediului (de oicei cuprins ntre 2$' &i 2$6)/o exist suplimente nutritive care treuie adugate n ca!ul testrii unor microorganismepretenioase/o grosimea mediului treuie s +ie de 6 mm (' ml de mediu@plac de 0 cm)/

> inoculul$ care se oine de pre+erat din colonii i!olate (cultur pur) &i treuie s ai oturiditate corespun!toare standardului turidimetric $ Mc5arland (circa 1uniti+ormatoare de colonii@ml) n ma%oritatea ca!urilor/> timpul de incuare (n ma%oritatea ca!urilor A-1 ore la ,-,234$ nu mai mult de '-,plci suprapuse)$ atmos+era de incuare$ umiditatea atmos+erei de incuare/> concentraia sustanelor antimicroiene din microcomprimate &i dimensiuneamicrocomprimatelor (A mm diametru)/> alegerea sustanelor antimicroiene pentru care se +ace testarea/> pstrarea plcilor cu mediu pn n momentul utili!rii (maxim 2 !ile$ n pungi depolietilen$ la ?634)/> utili!area tulpinilor de re+erin pentru controlul de calitate/> interpretarea re!ultatelor (se msoar diametrul !onei de inhiiie &i se comparre!ultatele cu cele din taelele puse la dispo!iie de productori &i@sau centrele de re+erin).

Metodele di+u!imetrice au de!avanta%ul c nu permit aprecierea concentraiilor e+icace aleantiioticului la nivelul +ocarului in+ecios

*. +eactia Aso principiu, interpretare

*ceast reacie poate +i utili!at n diagnosticul retrospectiv al unei in+eciistreptococice sau pentru con+irmarea etiologiei unei oli poststreptococice (mpreuncu criteriile minore &i ma%ore de diagnostic). :eacia *7BC determin titrul *c antistreptoli!in C (7BC).Principiu;

9itrarea *c anti-7BC se a!ea! pe +aptul c 7BC are e+ect hemolitic asupra hematiilorde iepure sau de erec. n ca!ul n care n serul de cercetat exist *c anti-7BC$aciunea hemolitic a 7BC este neutrali!at. 4ominnd diluii din serul de cercetat cuo cantitate constant de 7BC vom putea determina titrul *7BC.Materiale &i reactivi necesari;- ser de cercetat (sau seruri "pereche#$ recoltate la interval de ' sptmni)/- 7BC lio+ili!at (standardi!at de ctre productor)/- snge de+irinat de iepure @ erec/- soluie salin i!oton$ soluie de rivanol $,/- epruete$ pipete gradate +oarte curate/- aie de ap$ centri+ug etc

9ehnica de lucru;

9reuie urmate toate indicaiile din protocolul de lucru$ respectiv- se omogeni!ea! suspensia de hematii/- se ndeprtea! inhitorii 7BC din serul de cercetat (utili!m soluie de rivanol &isuspensie de crune activ$ reali!m o diluie de @ a serului care se va menine ,minute la A34)/- se reali!ea! diluiile de ser &i se reparti!ea! n tuurile de reacie (ser n diluiisuccesive) mpreun cu 7BC (n cantitate constant$ cte $ ml @ tu)/ cominareaserului de cercetat cu 7BC repre!int prima etap a reaciei/- se agit tuurile pentru omogeni!are &i se menin timp de minute la ,234/- urmea! a doua etap a reaciei *7BC$ respectiv adugarea suspensie de hematii()$ cte $ ml n +iecare tu/

- se agit pentru omogeni!are &i se incuea! timp de 6 minute la ,234/- se centri+ughea! tuurile timp de minut (. rotaii @ minut) &i se menin pn adoua !i la 634 (temperatura +rigiderului).


3/11

Pornind de la o diluie iniial a serului de @$ dup adugarea tuturor reactivilortitrul (numrul de uniti *7BC) va +i '$ n tuul urmtor$ $ '$ AA$ '$ ,,,etc n tuurile urmtoare. 9itrul reaciei *7BC este dat de cea mai mare diluie de serla care lipse&te complet hemoli!a. Pentru !ona noastr geogra+ic se accept canormal un titru de ' (maxim ') uniti *7BC. =xist teste serologice &i pentruevidenierea pre!enei &i titrului anticorpilor +a de alte structuri antigenice (deexemplu streptodorna!$ hialuronida!$ streptoEina!).4ontrol de calitate;Fltimele ' tuuri sunt repre!entate de tuul martor pentru hematii$ n care se veri+icre!istena hematiilor &i respectiv tuul martor pentru 7BC n care se pun 7BC &isuspensia de hematii.=xist &i posiilitatea de a reali!a o micrometod *7BC$ reacia e+ectundu-se n plcide material plastic cu godeuri.

. -estu ek principiu, interpretareDula di+u!ie =leE*ceast metod permite depistarea capacitii toxigene a unei tulpinideCorynebacteriumdiphteriae. n ca!ul n care tulpina este toxigen$ toxina vadi+u!a n mediu iar dup unirea cu *c anti-toxin$ complexele *g-*c vor dana&tere unor linii de precipitare.ntr-o cutie Petri turnm mediul =leE &i dup ce mediul s-a ntrit$ decupm un&an pe unul din diametre. n &anul respectiv pipetm $ ml ser antidi+teric$ser care conine *c anti-toxin di+teric n concentraie de . F< @ ml. *c

anti-toxin di+teric vor di+u!a n mediu. Dup circa ' ore nsmnmperpendicular pe &anul cu *c anti-toxin$ de +iecare parte a &anului$ o tulpinde Corynebacteriumdiphteriaetoxigen (martor po!itiv)$ o tulpindeCorynebacteriumdiphteriaene-toxigen (martor negativ) &i tulpini decercetat$ cte un striu (de +iecare parte a &anului) pentru +iecare tulpin.


4/11

de +ixarea $ care se va activa pe calea clasic &i nu va mai +i Idisponiil#pentru a se +ixa pe sistemul hemolitic indicator (hematii ? *c-antihematie).n ca!ul n care serul de cercetat nu conine *c speci+ici +a de *g cunoscut$nu va avea loc +ormarea unui complex *g-*c n prima etap a :54. Dupintroducerea n reacie a sistemului hemolitic indicator$ hematiile &i *c-antihematie se vor cupla$ vor +orma un complex imun iar Ilier# se va +ixa

pe acesta. Dup +ixare va urma activarea &i respectiv li!a hematiilor$hemoli!a putnd +i examinat cu ochiul lier.

Tehnica de lucru:*&a cum am menionat$ tehnica de lucru este laorioas &i nu va +i pre!entatn totalitate$ n cele ce urmea!.> serul de cercetat se va menine , minute la A34$ n aia de ap$pentru inactivarea propriu> principial$ :54 are loc n ' etape> n prima etap se pun n reacie $ serul de cercetat &i *g cunoscut/exist ' posiiliti; a. n serul de cercetat eist Ac specifici$ re!ultnd uncomplex *g-*c pe care se va +ixa .n serul de cercetat nu eist Acspecifici$ nu se +ormea! complex *g-*c$ rmne lier> n a doua etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator(hematii ? *c anti-hematie)/ exist ' posiiliti; a. nu este lier$ nu are lochemoli!a$ . se +ixea! pe sistemul hemolitic$ li!ea! hematiile &i oservmapariia hemoli!ei> toi reactivii utili!ai treuie standardi!ai$ respectiv se vor reali!a> omogeni!area suspensiei de hematii cu eventual etalonare prinspectro+otometrie> titrarea serului hemolitic

> titrarea n pre!ena *g> titrarea idimensional a *g &i a serului de re+erin> n :54 +inal se va proceda ast+el> se diluea! con+orm indicaiilor din protocolul de lucru reactivii utili!ai(serul hemolitic$ serurile de cercetat$ *g$ serurile de re+erin$ )> se reparti!ea! n godeurile corespun!toare serurile de cercetat$ *g &i > pe o plac separat se prepar martorii (martor pentru sistemulhemolitic$ martor pentru $ martor pentru *g$ ' martori pentru serul dere+erin$ martor sigur negativ)> plcile se introduc pn a doua !i la 634

> a doua !i$ plcile se menin la ,23 4 timp de , minute> se adaug n toate godeurile sistem hemolitic> plcile se menin la ,234 timp de , minute> se pun plcile la 634$ pn la sedimentarea hematiilor> exist anumite di+erene ntre tehnicile cantitative &i cele calitative$ darprincipiile sunt acelea&i


5/11

cte una pentru +iecare din ceilali martori$ respectiv martor pentru serulde cercetat$ martor pentru *g$ martor pentru $ martor pentru serulhemolitic)

Interpretare:


6/11

grup$ *c monovaleni de tip$ dup ca!)$ lame de microscop curate$ paharGer!elius cu amestec de!in+ectant etc.


7/11

aceast se utili!a n diagnostic$ o reacie po!itiv pe lam treuia s +iecon+irmat prin aglutinare n tuuri.9ehnica de aglutinare indirect poate +i utili!at n diagnosticul serologic alin+eciilor produse de Helicobacter pylori$ Treponema pallidum(hemaglutinarepasiv) etc.

12. udatu faringian mod de recotare, transport se recoltea! pre+erail dimineaa nainte ca pacientul s mnnce &i +r s

se +i splat pe dini$ +r s +i utili!at gargarisme cu di+erite soluii (iar dacaceste condiii nu au +ost respectate$ recoltarea se va +ace dup minim 6ore)

pacientul st pe scaun$ cu +aa spre sursa de lumin &i gtul n u&oarextensie

ne a&e!m puin lateral +a de pacient pentru a evita contaminarea cupicturi eliminate n cursul unui eventual acces de tuse (de pre+erin vom

purta masc &i ochelari) deprimm a!a limii cu a%utorul unui apstor de lim steril &i n condiii

de iluminare adecvat examinm +aringele posterior$ pilierii$ amigdalelepentru a sesi!a care sunt !onele in+lamate (ro&ii$ cu depo!ite$ ulceraii etc) &ieventualele depo!ite purulente

utili!m utili!m tampoane cu vat oi&nuite> un tampon va +i utili!at pentru examen microscopic direct> un tampon va +i utili!at pentru nsmnare pe medii de cultur> n ca!ul suspicionrii di+teriei se vor utili!a , tampoane solicitm pacientului s pronune vocala I*# &i printr-o mi&care de &tergere$

circular$ +erm$ recoltm secreia de la nivel +aringian$ amigdalian insistndn !onele unde exist ulceraii$ depo!ite (n ca!ul n care se remarcpre!ena unei +alse memrane o deta&m cu gri% nspre peri+erie &irecoltm secreia care exist su aceast structur)

treuie s evitm atingerea a!ei limii sau a palatului moale este de pre+erat utili!area imediat a p.p.$ sau n cel mult -, ore/ n ca!ul n

care acest lucru nu este posiil$ tamponul va +i trimis ctre laorator nmediu de transport

1#. 3rocutura mod de recotare, transport, interpretare9ractul urinar este n mod normal necontaminat$ n schim uretra distal poate

pre!enta o +lor microian +oarte variat$ +iind contaminatcumicroorganisme provenind din !ona genital sau de la nivelul colonului. Dintreaceste microorganisme putem i!ola de la nivelul uretrei distale sta+ilococicoagula!o-negativi$ E. coli$ !lebsiella spp.$ Proteus spp.$ acili di+teromor+i$enterococi$ streptococi$ neisserii sapro+ite$ "ycoplasma spp.$#replasma spp.sau $usobacterium spp. Ba acela&i nivel ar putea +i identi+icate &i tulpinide Candida spp.$ Clostridium spp.$ di+erii coci gram po!itivi sau gram negativianaeroi$ lactoaili$ mNcoacterii netuerculoase$ sta+ilococi aurii etc.4oloni!area microian a uretrei distale explic motivul pentru care n mareama%oritate a ca!urilor vom reali!a urocutura cantitativ.4u toate c indi+erent de gri%a cu care vom recolta p.p. (urina) acesta va +icontaminat$ prin aprecierea cantitativ a numrului de uniti +ormatoare decolonii n urina proaspt recoltat$ Idin mi%locul %etului#$ putem s preci!mdac pacientul are sau nu in+ecie urinar. Mai multe studii au artat c atunci


8/11

cnd se demonstrea! pre!ena a acterii @ ml$ aceasta indic o in+ecie atractului urinar (


9/11

+eaizarea urocuturii+ecotarea !i transportu produsuui patoogicn n ca!ul n care nu se poate recolta prima urin de diminea$ treuiea&teptat pentru recoltare ,-6 ore dup miciune> :ecoltarea se reali!ea! dup splarea cu ap &i spun a organelorgenitale &i a perineului/ exist recomandri speci+ice pentru sexul +eminin &imasculin &i respectiv pentru copilul mic> =ste pre+erail ca recoltarea s ai loc ntr-un spaiu corespun!tor napropiere de laorator iar personalul medical treuie s explice &i eventual sasiste recoltarea> =ste contraindicat recoltarea urinei la domiciliu (pot exista erori derecoltare iar prelungirea timpului de transport va conduce la multiplicareaacteriilor$ a&a cum am menionat mai sus)/ dup recoltare$ n ca!ul n careurina nu este prelucrat imediat (sau n cel mult , de minute dup recoltare)$p.p. treuie meninut la temperatura +rigiderului iar transportul treuie reali!atla ?63 4> De regul se recoltea! urina Idin mi%locul %etului#/ dup splareaorganelor genitale &i a perineului$ prin miciune se elimin circa ml urin(ndeprtnd ast+el o parte a germenilor de la nivelul uretrei distale) &i aiaapoi se recoltea! '- ml (pre+erail ml) urin n recipientul steril$ dupcare miciunea continu> =xist &i alte tehnici de recoltare$ neinva!ive sau inva!ive (puncie &iaspiraie suprapuian$ cateteri!are uretral$ cu riscurile respective).

aminarea macroscopic !i microscopic a urinei:eali!m iniial examenul macroscopic/ p.p. poate +i tulure$ opalescent$ poatepre!enta un anumit miros etc. n vederea examenului microscopic al urineiomogeni!m urina prin Irsturnare#$ de '-, ori. Punem o pictur de urin pelam$ acoperim cu o lamel &i examinm cu microscopul cu imersie (saumicroscopul cu contrast de +a!). n ca!ul n care identi+icm pre!ena a celpuin unei acterii pe +iecare cmp$ n +iecare dintre cmpuri succesive$putem cu o un aproximaie s considerm c avem o acteriurie deacterii @ ml. *lternativ se poate utili!a preparatul colorat 8ram. =stenecesar s apreciem concomitent &i pre!ena piuriei (peste leucocite @mm,de urin). *u +ost imaginate o serie de alte teste pentru aprecierea piuriei

&i acteriuriei$ spre exemplu testul 8riess (detectarea nitriilor n urin)$detectarea estera!ei leucocitare$ teste ioluminiscente etc. Piuria &i acteriuriatreuie interpretate n contextul clinic.=xamenul sedimentului urinar permite vi!uali!area de celule epiteliale(malpighiene$ ve!icale$ uretrale etc)$ celule sanguine (leucocite$ hematii)$cilindrii urinari (hialini$ leucocitari$ eritrocitari$ epiteliali$ granulari etc)$ cristaleurinare$ levuri (eventual nmugurite$ cu lastoconidii)$ Trichomonas'aginalisetc/ examenul sedimentului urinar este +oarte util &i treuie reali!at de+iecare dat.utivarea urinein mod oi&nuit$ pentru cultivare putem utili!a ,-6 medii di+erite. Din motive deeconomie am putea nsmna o %umtate de plac cu mediu Mac4onEeN (+rcristal violet)$ o %umtate de plac cu gelo!-snge &i cte un sector de placcu mediu agar telurit &i respectiv agar cu eo!in &i alastru de metilen (=MG) n


10/11

ca!ul n care examenul microscopic al urinei este po!itiv. Dac examenulmicroscopic este negativ$ nsmnm doar o %umtate de plac Petri cu mediuMac4onEeN.C variant de nsmnare pentru mediile Mac4onEeN &i gelo!-snge esteutili!area unei anse calirate de Ql cu a%utorul creia prelevm urin prinatingerea supra+eei p.p. dup omogeni!are. nsmnm iniial un striu pe

centrul %umtii de plac dup care ntindem p.p. n striuri paralele$perpendiculare pe primul striu. n +inal +r sterili!m ansa ntindem p.p nstriuri paralele n unghi de 63 +a de striurile precedente. Dup o incuare de1-'6 ore la ,-,23 4$ nmulind cu numrul de F54 de!voltate$ putemaprecia care este numrul de acterii @ ml de urin.5recvent este utili!at nsmnarea urinei dup diluare (ex. @) cu a%utorulpipetei gradate. nsmnm de ex. pe o plac cu mediu Mac4onEeN $ ml deurin diluat @$ incum n condiiile cunoscute &i dup apariia coloniilorcalculm numrul de acterii @ ml prin nmulirea numrului de F54R inversuldiluie R inversul volumului nsmnat.nterpretarea rezutateor urocuturii cantitative

>

extrem de proail este vora de o contaminare sau de un p.p. recoltat cu maimult timp n urm &i meninut la temperatura camerei &i nu la +rigider> Bipsa multiplicrii acteriene sau de!voltarea de F54 n concentraie de,@ ml de urin repre!int o urocultur negativ> Dorim s suliniem din nou c re!ultatul microiologic treuie s +ieanali!at n contextul clinic &i corelat cu re!ultatul microscopiei iar n ca!ul

anumitor acterii (ex. Salmonella typhi) re!ultatul este po!itiv indi+erent deconcentraia F54 @ ml de urin.n ca!ul unei uroculturi po!itive$ acteria i!olat se identi+ic (pe a!acaracterelor mor+otinctoriale$ de cultur$ iochimice$ alte caractere) &i setestea! sensiilitatea la antiiotice &i chimioterapice$ de regul prin metodadi+u!imetric (ve!i capitolul 6).=xist o serie de ncercri pentru optimi!area diagnosticului


11/11

Mediul 4B=D de pe prima parte a lamei (4Nsteine - Bactose - =lectrolNteDe+icient agar) are culoare verde &i permite numrarea coloniilor acteriene(indirect a numrului de F54 @ ml urin) &i identi+icarea pre!umtiv.4oncentraia sc!ut de electrolii inhi inva!ia Proteus spp. MediulMac4onEeN +r cristal violet de pe a doua parte a lamei are culoare ro!/ inhima%oritatea acteriilor gram po!itive.

9ehnica de lucru;De&urum capacul &i extragem lama +r s atingem supra+aa agarului. Staphylococcus aureus*944 '0',> Escherichia coli*944 '0''> Proteus mirabilis*944 '6,>

microbiologie lp subiecte

Documents