UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ “ION IONESCU DE LA BRAD” IAŞI FACULTATEA DE ZOOTEHNIE

ELEONORA GUGUIANU

MICROBIOLOGIE

ANUL II, SEMESTRUL I

MATERIAL DE STUDIU I.D.

IAŞI, 2013

1

CUPRINS CAPITOLUL I NO ŢIUNI INTRODUCTINE 1.1 DEFINIŢIA ŞI OBIECTUL DE STUDIU AL MICROBIOLOGIEI 1.2. SISTEMATICA MICROORGANISMELOR 1.3. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI CAPITOLUL II

VIRUSOLOGIE GENERALĂ 2.1. CARACTERELE GENERALE ALE VIRUSURILOR 2.2.FORMELE DE EXISTENŢĂ A VIRUSURILOR ÎN NATURĂ 2.3. MORFOLOGIA şi STRUCTURA VIRUSURILOR

2.3.1. FORMA şi DIMENSIUNILE 2.3.2. STRUCTURA VIRIONULUI

2.3.2.1. Genomul viral 2.3.2.2. Învelişul

2.4. RELAŢIA VIRUS – GAZDĂ. 2.4.1. TROPISMUL VIRUSURILOR 2.4.2. MULTIPLICAREA VIRUSURILOR 2.4.3. MODIFICĂRILE MORFOFIZIOLOGICE ALE CELULELOR

INFECTATE CU VIRUS 2.4.4. TIPURILE DE INFECŢIE VIRALĂ

2.5. ACŢIUNEA UNOR AGENŢI FIZICI şi CHIMICI ASUPRA VIRUSURILOR 2.6. CLASIFICAREA VIRUSURILOR CAPITOLUL III

BACTERIOLOGIE GENERALĂ 3.1. CONCEPTUL DE BACTERIE 3.2. NOŢIUNI DE TAXONOMIE şi NOMENCLATURĂ BACTERIANĂ

3.2.1. TAXONOMIA BACTERIILOR 3.2.1.1. Categorii de taxoni

3.2.2. NOMENCLATURA BACTERIILOR 3.3. MORFOLOGIA SI BIOLOGIA BACTERIILOR

3.3.1. MORFOLOGIA CELULEI VEGETATIVE 3.3.1.1. Forma si modul de grupare a bacteriilor 3.2.1.2. Constantele fizice 3.2.1.3. Structura celulei bacteriene

3.3.2. FIZIOLOGIA BACTERIILOR 3.3.2.1. COMPOZIŢIA CHIMICĂ A CELULEI BACTERIENE 3.3.2.1.1. Compuşii anorganici

3.3.2.1.2. Compuşii organici 3.3.2.2. NUTRIŢIA LA BACTERII 3.3.2.3. METABOLISMUL BACTERIAN 3.3.2.3.1. Catabolismul 3.3.2.3.2. Respiraţia 3.3.2.3.3. Anabolismul 3.3.2..4. CRESTEREA SI MULTIPLICAREA BACTERIILOR

3.3.2.4.1 Creşterea bacteriilor 3.3.2.4.2. Multiplicarea bacteriilor

3.3.2.4.2.1 Dinamica multiplicării bacteriilor CAPITOLUL IV

MICOLOGIE GENERALĂ

2

4.1. MORFOLOGIA CIUPERCILOR MICROSCOPICE 4.2. MODALITĂŢILE DE ÎNMULŢIRE ALE CIUPERCILOR MICROSCOPICE 4.3. PARTICULARITĂŢI ECO-FIZIOLOGICE şi IMPLICAŢII CAPITOLUL V

NOŢIUNI DE GENETICĂ MICROBIANĂ 5.1. EREDITATEA LA MICROORGANISME şi MECANISMELE EI 5.2 VARIABILITATEA LA MICROORGANISME şi MECANISMELE EI

5.2.1. VARIAŢIILE FENOTIPICE 5.2.2. VARIAŢIILE GENOTIPICE

5.2.2.1. Mutaţiile 5.2.2.2.Recombinările genetice

CAPITOLUL VI NOŢIUNI DE ECOLOGIE MICROBIANĂ

6.1. RĂSPÂNDIREA MICROORGANISMELOR ÎN NATURĂ 6.2.MICROBIOTA APELOR 6.3. MICROBIOTA SOLULUI 6.4. MICROBIOTA AERULUI 6.5. MICROBIOTA UNOR ALIMENTE DE ORIGINE ANIMALĂ 6.5.1. Microbiota laptelui 6.5.2. Microbiota cărnii 6.5.3. Microbiota ouălor 6.6. MICROBIOTA ORGANISMULUI ANIMAL 6.6.1. Microbiota gastrică 6.6.2. Microbiota intestinului subţire 6.6.3. Microbiota intestinului gros 6.6.4. Microbiota rumenului 6.7. RELAŢIILE ECOLOGICE ALE BACTERIILOR

6.7.1. RELAŢIILE ECOLOGICE INTERBACTERIENE şi ALE BACTERIILOR CU ALTE CATEGORII DE MICROORGANISME

6.7.1.1. INTERRELAŢII MICROBIENE DE TIP BENEFICIAL 6.7.1.1.1. Comensalismul 6.7.1.1.2. Simbioza 6.7.1.1.3. Mutualismul 6.7.1.1.4. Sinergismul

6.7.1.2. INTERRELAŢII MICROBIENE DE TIP ANTAGONIC 6.7.1.2.1. Parazitismul 6.7.1.2.2. Competiţia 6.7.1.2.3. Antagonismul propriu-zis

6.7.2. RELAŢII ECOLOGICE ÎNTRE BACTERII şi MACROORGANISME

6.7.2. 1. RELAŢII DE TIP BENEFICIAL 6.7.2. 1.1. Comensalismul

6.7.2. 1.2. Simbioza 6.7.2. 2. RELAŢII DE TIP ANTAGONIC

6.7.2. 2.1. Patogenitatea bacteriilor şi mecanismele ei 6.7.2. 2.1. 1. Virulenţa şi factorii de virulenţă 6.7.2. 2.1. 2. Toxicitatea bacteriilor 6.7.2. 2.1. 3. Factorii de sensibilizare

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE TEST

3

CAPITOLUL 1

NOŢIUNI INTRODUCTIVE

1.1. DEFINIŢIA ŞI OBIECTUL DE STUDIU AL MICROBIOLOGIEI

Microbiologia reuneşte ştiinţele biologice care au ca obiect studiul vieţuitoarelor invizibile cu ochiul liber.

Acestea au purtat denumiri diferite de-a lungul timpului, în raport cu nivelul cunoştinţelor asupra lor: miasme (HIPPOCRATE- 460-377 a. Chr.), germeni (,,seminaria morbi,, în concepţia medicului italian FRACASTORO- 1468-1553 ), animaliculi (ANTONIUS van LEEUWENHOEK -1632-1723), fermenţi, microbi. Termenul de ,,microb" a fost inventat de Charles Sedillot în 1878 şi îşi are originea în cuvintele greceşti micros – mic şi bios - viaţă. Deşi nu este considerat academic, el rămâne de uz comun, la fel ca şi sintagma ,,germeni microbieni".Termenul ştiinţific este cel de ,,microorganism".

Lumea microorganismelor este imensă şi extrem de variată ca urmare a evoluţiei pe parcursul a aproximativ 3 miliarde de ani cu succesiuni de ordinul minutelor între generaţii, justificând opinia potrivit căreia trăim într-o lume a microorganismelor şi nu într-o lume cu microbi.

Multă vreme, oamenii au fost tentaţi sa creadă că lumea vie se rezumă numai la ceea ce le relevau organele de simţ, deşi, încă din preistorie, sesizaseră o serie de efecte ale activităţii acestora, unele favorabile pe care, pragmatici, căutau să le obţină (dospirea pâinii, fermentaţiile alcoolice, lactice, acetice, etc.), altele extrem de dăunătoare (bolile infecţioase).

Doar medicii, filozofii, chiar şi unii poeţi ai acelor timpuri reflectau asupra cauzelor posibile ale acestor fenomene fără a putea depăşi însă stadiul de simple ipoteze.

Descoperirea microorganismelor a fost posibilă abia în doua jumătate a sec. XVII datorită inventării aparatelor de amplificare optică. Studiul microcosmosului viu cu ajutorul microscoapelor din ce în ce mai performante a relevat existenţa de microorganisme cu o structură celulară şi subcelulară (acelulară).

Microorganismele cel ulare sunt algele microscopice, protozoarele, fungii (miceţii, ciupercile microscopice) şi bacteriile. Ele au, în general, toate cele trei atribute ale vieţii: flux material, flux energetic şi flux informaţional.

În categoria microorganismele acelulare sunt incluse virusurile , viroizii, - care dispun doar de flux informaţional - şi prionii (proteinele infecţioase transmisibile) - agenţi patogeni neconvenţionali lipsiţi de atributele vieţii, pentru a căror descoperire PRUSINER a primit premiul Nobel în 1997.

4

Principalele caractere distinctive ale microorganismelor sunt redate în tabelul 1.

Tabelul 1

Caracterele diferenţiale între principalele categorii de microorganisme Caracterul diferenţial Prioni V iroizi Virusuri Bacterii Ciuperci

microscopice Tipul de organizare

acelular acelular acelular. Celular procariot

Celular eucariot

Numărul tipurilor de acid nucleic

- 1 (ARN) 1 (ADN sau ARN) niciodată ambii

2 (ADN şi ARN)

2 (ADN şi ARN

Organizarea materialului genetic

- ARN de talie mică

Genom viral Un singur cromozom şi plasmide

Mai mulţi cromozomi

Echipament enzimatic şi activitate metabolică proprie

Absente Absente Absente Prezente Prezente

Creştere Absentă Absentă Absentă Prezentă Prezentă Mod de reproducere

Sinteză amplificată prin conversie

Sunt sintetizaţi de celula gazdă

Sunt sintetizate de celula gazdă

Independent, sciziparitate

Independent, sexuat sau asexuat

Capacitate de diferenţiere celulară

Nu este cazul Nu este cazul

Nu este cazul Absentă Prezentă

Parazitism absolut

Constant obligat

Constant obligat

Constant, obligat

Absent Absent

Forme biologice de existenţă în natură

P.P.C.=proteină prionică celulară normală P.P.S.=proteină prionică patologică scrapie

ARN mic intranuclear

Virion infecţios, temporar extracelular Virus vegetativ, intracelular, în curs de sinteză Virus integrat, fixat în genomul celulei gazdă

-Celulă vegetativă, capabilă de diviziune Spor (formă de conservare )

Miceliu sau pseudomi celiu Spori de înmulţire Spori de rezistenţă

Poziţia pe scara filogenetică

La graniţa dintre viu şi neviu

La graniţa dintre viu şi neviu

La graniţa dintre viu şi neviu

Organisme vii cu organizare simplă (protiste )

Organisme vii cu diverse grade de complexitate.

Pe măsura perfecţionării metodelor de studiu şi implicit a acumulării de noi cunoştinţe despre microorganisme, în cadrul microbiologiei s-au conturat numeroase discipline distincte, cu un caracter fundamental (algologia, protozoologia, micologia, bacteriologia, virusologia, genetica şi taxonomia microbiană, ecologia microbiană ş,a.) şi aplicativ (microbiologia medicală, veterinară, alimentară, microbiologia solului, microbiologia petrolului, microbiologia cosmosului etc.)

Microbiologia are numeroase conexiuni interdisciplinare. Ea facilitează aprofundarea cunoştinţelor de morfopatologie, boli infecţioase, imunologie, biologie moleculară şi reclamă pentru a putea fi înţeleasă şi însuşită, temeinice cunoştinţe de biochimie necesare înţelegerii metabolisului bacterian, noţiuni de biofizică pentru înţelegerea funcţionării unor structuri anatomice ale celulei

5

bacteriene (membrana citoplasmatică, membrana externă a peretelui bacterian etc.), noţiuni de anatomie şi histologie pentru înţelegerea funcţionării unor bariere antimicrobiene mecanice (epiteliul cutanat şi cel al mucoaselor, ţesutul conjunctiv dens, spălarea mucoaselor prin secreţii şi excrete, transportul mucociliar) ş.a.

1.2. SISTEMATICA MICROORGANISMELOR

Stabilirea poziţiei microorganismelor în sistematica biologică a întâmpinat în decursul anilor dificultăţi obiective, generate de criteriile care au stat la baza împărţirii lumii vii în două, trei, patru sau chiar cinci regnuri, de marea diversitate a acestor vieţuitoare, cât şi de faptul că unele categorii de microorganisme se apropie prin unele caracteristici de regnul animal (protozoarele) iar altele de regnul vegetal (algele, ciupercile microscopice, bacteriile). Privite în ansamblu, aceste vieţuitoare au însă trăsături distinctive de restul lumii vii, fiind situate de fapt pe o treaptă inferioară de evoluţie şi organizare. Luându-se drept criteriu de bază nivelul de organizare biologică (subcelular, unicelular, sau pluricelular; eucariot sau procariot), la propunerea lui H a e c k e l (1866), reluată de S t a n i e r (1964 ), microorganismele au fost incluse într-un al treilea regn, alături de cel vegetal şi animal - regnul Protista - divizat în protiste superioare care grupează microorganismele eucariote (algele, protozoarele, micromiceţii) şi protiste inferioare, reprezentate de microorganismele procariote (algele albastre-verzi şi bacteriile). In 1968, M u r r a y încadrează bacteriile şi algele albastre-verzi în regnul Procaryotae, taxon însuşit de Determinatorul Bergey (1984) – lucrare de o înaltă probitate ştiinţifică, unanim acceptată de către bacteriologii din întreaga lume. Un an mai târziu (1969), W h i t t a k e r creează un nou regn-regnul Fungi - care grupează ciupercile microscopice. Virusurile, deoarece se deosebesc de celelalte microorganisme prin cel puţin două trăsături esenţiale – structura subcelulară şi lipsa metabolismului propriu – au fost încadrate într-un regn de sine stătător, regnul Vira.

1.3. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI

Existenţa fiinţelor microscopice a fost intuită de foarte multă vreme dar, din lipsa mijloacelor tehnice, descrierea acestora a fost posibilă abia după ce inventarea microscopului a permis extinderea simţurilor umane dincolo de capacitatea lor normală de percepţie. Dacă din acest motiv studiul microorganismelor a început foarte târziu, diferitele procese produse de microorganisme - în special bolile care decimau populaţii de oameni şi animale, – au fost în atenţia oamenilor de ştiinţă din cele mai vechi timpuri.

Până la HIPOCRATE (460-375 îHr) se considera că ele sunt cauzate de intervenţia unor forţe supranaturale. Hipocrate, fondatorul medicinei raţionale, afirma că toate bolile sunt naturale, adică produse de factori naturali şi nu de zeităţi, iar în ceea ce priveşte bolile molipsitoare, el le considera ca fiind rezultatul pătrunderii în organism a unor particule prezente şi vehiculate de aer. Aceste

6

particule au fost numite “miasme”, iar teoria care le admitea existenţa, “teoria miasmatică”.

Trei sute de ani mai târziu, un scriitor şi filozof roman, Varro (116-23 îH) identifica miasmele cu nişte animale mici – animalia minuta – invizibile cu ochiul liber. El corelează apariţia unor îmbolnăviri cu particularităţile zonale ale locului respectiv, cum ar fi existenţa mlaştinilor. În lucrarea sa “Rerum rusticarum de agricultura”, Varro afirma:

“ Dacă într-un loc sunt mlaştini, acolo cresc animale aşa de mici, că ochii nu pot să le vadă şi acestea ajungând în corp, cu aerul, pe gură sau pe nas, produc boli grele”

Implicaţia practică a teoriei miasmatice a fost considerabilă pentru acele vremuri, deoarece recomanda măsuri esenţiale de prevenire a răspândirii bolilor molipsitoare, care constau în fierberea apei şi fumigaţii cu sulf în spaţiile considerate contaminate.

Cu toate acestea, până acum un secol şi jumătate epidemiile evoluau nestânjenite; ciuma, holera şi variola decimau uneori 80% din populaţia arealelor geografice afectate (oraşe, ţări, continente) , iar difteria, tifosul exantematic, febra tifoidă făceau ca mortalitatea prin boli contagioase să depăşească cu mult pierderile de vieţi omeneşti determinate de toate celelalte calamităţi naturale şi războaie. Istoria evului-mijlociu poate fi considerată, aşadar, istoria marilor epidemii, a căror apariţie şi recrudescenţă erau favorizate de pauperitatea măsurilor profilactice de care dispunea omenirea la acea dată şi de empirismul aplicării lor.

Măsurile antiepidemice nu au putut fi înţelese până când, în sprijinul ipotezelor privind existenţa microorganismelor, au fost aduse dovezi clare, indubitabile.

Se poate afirma că istoria microbiologiei şi progresul ei sunt strâns legate de curiozitaea ştiinţifică a lui Leeuwenhoeck şi de geniul lui Pasteur.

LEEUWENHOECK (1632-1723), cercetător olandez înnăscut, portar de meserie, dar care avea pasiunea şlefuirii lentilelor, a reuşit să evidenţieze cu ajutorul unui microscop construit de el însuşi, în salivă, urină, puroi, apă de canal şi alte materiale , organisme minuscule pe care le-a denumit “animalicule”.

Descrierile lui Leeuwenhoeck sunt însoţite de desene surprinzător de exacte, care au fost reproduse în lucrarea “Arcana naturae ope microspiorum detecta” prezentată în anul 1675 Societăţii Regale de Biologie din Londra şi tipărită la Delf în 1695. Deoarece lucrarea reprezintă primul studiu de microbiologie din lume, este considerată certificatul de naştere al microbiologiei.

Constatările lui Leeuwenhoeck nu au fost urmate de un progres rapid al cunoştinţelor, aşa cum ar fi fost de aşteptat. În schimb, ele au devenit obiectul unor polemici înverşunate cu privire la originea microorganismelor, între preoţi, partizani ai concepţiei creaţioniste şi oamenii de ştiinţă, susţinători ai teoriei generaţiei spontane. Această teorie, fondată încă din antichitate de marii filozofi materialişti Anaximandru, Democrit, Aristotel, Teofrast şi alţii, încerca să explice apariţia unor vieţuitoare în alt mod decât prin actul creaţiei divine. Aşa s-a ajuns la acreditarea unor idei, cel puţin bizare, potrivit cărora broaştele se nasc spontan din

7

nămol, peştii din frunzele copacilor căzute în apă, şoarecii din rufe murdare, viermii din brânză sau carne alterată, puricii din praf etc.

Teoria generaţiei spontane a fost susţinută de numeroşi adepţi până târziu, în cursul secolului XIX. Chiar şi astăzi, ca o expresie a ignoranţei, unii oameni continuă să creadă că puricii pot să apară din praf.

Utilizarea microscopului în secolul XVII a relevat organizarea anatomică foarte complexă a acestor vieţuitoare, semănând îndoială în convingerile partizanilor acestei teorii, în sensul că structuri atât de complexe nu ar putea să apară dintr-o dată din praf sau din nămol..

Mai mult, în 1668 biologul englez FRANCESCO REDI a demonstrat printr-o experienţă simplă că larvele se nasc din părinţi, acoperind cu tifon, pentru a evita depunerea ouălor de muscă, vasele în care au fost introduse fragmente de carne. Cu toate aceste dovezi ştiinţifice, partizanii generaţiei spontane susţineau că “dacă muştele se nasc din ouă, apoi fiinţele invizibile se nasc de la sine”.

Secolul al XVIII-lea a marcat puţine progrese în cunoaşterea lumii microbiene descoperite de Leeuwenhoeck. Această perioadă se caracterizează, în principal, prin acumulări de date privind morfologia microorganismelor, pe măsura perfecţionării aparatelor optice şi prin încercări de sistematizare a cunoştinţelor

LINNÉ (1707-1778), în celebra lucrare apărută în 1735 “Systema naturae”, încadrează organismele microscopice în genul “Chaos”, înzestrându-le cu puteri infernale (“furia infernalis”) care aveau semnificaţia unei activităţi patogene.

În 1854, FERDINAND COHN crează termenul de “bacterie” şi împreună cu EHRENBERG propune desprinderea acestui grup de microorganisme din regnul animal, argumentând încadrarea lui în regnul vegetal pe baza prezenţei peretelui celular.

În istoria microbiologiei, secolul al XVIII-lea se încheie cu o realizare empirică genială în domeniul imunologiei. În 1789 EDWARD JENNER (1749-1823), bazându-se pe o îndelungată experienţă populară, obţine prima imunizare artificială a oamenilor împotriva variolei utilizând o suspensie de cruste recoltate de pe ugerul vacilor bolnave.

Toate aceste descoperiri şi experienţe empirice au constituit paşi importanţi în cucerirea microcosmosului invizibil, prefigurând trecerea la etapa constituirii microbiologiei ca ştiinţă independentă.

Această etapă cuprinde a doua jumătate a secolului XIX şi este indisolubil legată de numele marelui savant LOUIS PASTEUR (1822-1895), considerat în unanimitate părintele microbiologiei.

Plecând de la observaţia că fermentaţiile alcoolică, lactică şi butirică sunt rezultatul acţiunii unor microbi, Pasteur fundamentează între anii 1857-1856 teoria microbiană a infecţiilor. El demonstrează experimental relaţia cauzală dintre micobi şi infecţie bazându-se pe rezultatele cercetărilor efectuate asupra agentului etiologic al antraxului. Deşi numeroşi autori (Delafond, 1838; Pollender, 1849; Rayer şi Davaine, 1850) au observat în sângele animalelor moarte de dalac

8

(antrax) formaţiuni bacilare cu lungimea de două ori mai mare decât diametrul globulelor roşii, iar Davaine le-a intuit rolul etiologic, Pasteur a fost acela care a demonstrat practic că prezenţa acestor germeni în organele oilor moarte reprezintă cauza reală a morţii şi nu consecinţe ale bolii.

Bazat pe descoperirile sale privind mecanismele fermentaţiilor şi a infecţiei, Pasteur demonstrează fără echivoc că microorganismele nu apar spontan în substraturile în care se multiplică, ci prin contaminare, de vreme ce un mediu nutritiv sterilizat într-un recipient închis etanş rămâne steril la infinit. Flacoanele sale cu lichide sterile se păstrează şi astăzi la fel de limpezi ca în ziua în care au fost sterilizate El a pus astfel bazele sterilizării, oferind şi mijloacele adecvate: pupinelul sau cuptorul lui Pasteur, autoclavul lui Chamberland..

În paralel cu elucidarea cauzelor bolilor contagioase, eminentul cercetător a făcut descoperirea epocală a vaccinurilor microbiene, care a revoluţionat medicina şi gândirea biologică.

Vaccinul contra holerei aviare a fost primul vaccin atibacterian bazat pe atenuarea patogenităţii microbilor în condiţii de laborator. Descoperirea principiului atenuării s-a datorat unei întâmplări, mai precis unei neglijenţe; colaboratorul său, Chamberland, a uitat la termostat un timp mai îndelungat o cultură de Pasteurella multocida- agentul etiologic al holerei aviare. Inoculată la găinile sănătoase, aceasta nu a mai produs infecţia iar păsările respective au devenit rezistente la tulpina virulentă ce le-a fost administrată ulterior.

Inspirat de această întâmplare, trei ani mai târziu, în 1881, a procedat la atenuarea unei tulpini de Bacillus anthracis izolată de la oi moarte de antrax, pe care a inoculat-o apoi unor oi sănătoase. Rezultatul a fost acelaşi, în sensul că după reinocularea cu o cultură virulentă oile au supravieţuit deoarece deveniseră imune.

La 28 februarie 1881 Pasteur a comunicat această descoperire Academiei de Ştiinţe. Răspunzând neîncrederii cu care a fost primită de adversarii săi, savantul a procedat la efectuarea unei demonstraţii la o fermă din apropierea Parisului, în faţa unei asistenţe compusă din medici umani şi veterinari, farmacişti, agricultori, politicieni şi alte categorii de cetăţeni.

Experienţa a constat din împărţirea unui lot de oi în două grupe: una formată din oi ce urmau a fi vaccinate, iar cealaltă, din oi cărora nu li s-a administrat nici un vaccin, constituind martorul. După 15 zile, întregul efectiv a fost inoculat cu o suspensie de bacili cărbunoşi virulenţi. Experimentul a fost încununat de succes, spulberând scepticismul inamicilor vaccinării.

Ca urmare a aplicării vaccinării preconizate de Pasteur, incidenţa antraxului s-a redus considerabil, ceea ce a făcut ca utilizarea lui să se extindă cu repeziciune în întreaga lume.

Geniul lui Pasteur este şi mai pregnant ilustrat prin prepararea vaccinului antirabic. Fără a cunoaşte natura agentului etiologic al turbării, de a cărui existenţă nu s-a îndoit nici un moment, Pasteur reuşeşte să obţină prin treceri succesive pe creier de iepure, virusul rabic fix. Acesta este incapabil să reproducă turbarea inoculat subcutanat, în schimb conferă imunitate faţă de infecţia cu virus “sălbatic” (“de stradă”).

9

Practica imunizării antirabice cu virusuri fixe s-a păstrat până în zilele noastre.

Lui Pasteur îi revine şi meritul de a fi izolat şi descris numeroşi agenţi etiologici ai unor infecţii ale omului şi animalelor: Clostridium septicum (vibrionul septic al lui Pasteur), stafilococii, streptococii, etc.

Pasteur a avut numeroşi discipoli, în jurul său constituindu-se o adevărată şcoală la care s-au format o serie de eminenţi microbiologi.

Dintre aceştia, lui EMILE ROUX şi ALEXANDRE YERSIN li se datorează studiul toxinelor microbiene, ultimul fiind şi descoperitorul agentului etiologic al ciumei (Yersinia pestis), iar Edmond Nocard împreună cu Roux au izolat şi identifica tmai mulţi germeni microbieni cunoscuţi astăzi sub denumirea de micoplasme.

CHARLES EDUARD CHAMBERLAND este autorul unor inovaţii tehnice deosebit de utile activităţii curente de laborator, ca de exemplu primul filtru bacteriologic şi autoclavul.

Pintre discipolii lui Pasteur se numără şi Victor Babeş, fondatorul şcolii româneşti de microbiologie.

Marile descoperiri ale lui Pasteur n-au întârziat să-şi găsească laturi aplicative şi în alte domenii ale medicinei. Aşa a fost cazul introducerii antisepsiei în chirurgie de către JOSEPH LISTER (1827-1917), cel mai convins şi activ susţinător al teoriei biologice a lui Pasteur, căruia îi scria: “Dacă veţi veni vreodată la Edinburg, veţi găsi, cred, cea mai bogată răsplată văzând în spitalul nostru ce binefaceri pentru umanitate produce opera dumneavoastră”. Este vorba despre considerabila scădere a mortalităţii prin infecţia de spital, ca urmare a folosirii fenolului în dezinfecţie.

Un alt fondator al microbiologiei, ROBERT KOCH (1843-1910), inspirându-se din lucrările lui Pasteur, va completa conceptul de infecţie, introducând criterii stricte de stabilire a responsabilităţii etiologice a unui microorganism, care au rămas în literatura de specialitate sub numele de “postulatele sau triada lui Koch”.

Numele său mai este legat de descoperirea agentului etiologic al tuberculozei, introducerea mediilor de cultură solide în practica bacteriologică, semnalarea fenomenului de alergie şi prepararea primei substanţe revelatoare: tuberculina.

În perioada marilor descoperiri ale lui Pasteur şi Koch au fost identificaţi şi descrişi agenţii etiologici a numeroase boli, cum ar fi: Clostridium tetani de către NICOLAER şi KITASATO(1884), Salmonella de către EBERTH (1884), SALMON şi SMITH (1886), Escherichia coli de către ESCHERICH (1885), ş.a.

Secolului XX, a marcat o nouă perioadă de importante descoperiri şi aprofundare a unor aspecte până atunci incomplet elucidate, precum: introducerea substanţelor chimioterapice şi a antibioticelor în terapia infecţiilor, relevarea unor aspecte morfofiziologice de fineţe ale microorganismelor, descoperirea virusurilor şi a mecanismului infecţei virale, efectuarea primelor studii de genetică moleculară, dezvoltarea imunologiei şi afirmarea ei ca ramură independentă a ştiinţelor biologice.

10

În jurul anului 1910 PAUL ERLICH introduce în practica medicală primul chimioterapic – salvarsanul -, folosit cu succes în tratamentul sifilisului.

Antibioticele au intrat în patrimoniul terapiei antimicrobiene în anul 1941, când Ernst Chain şi Howard Florey tratează primii pacienţi cu penicilină. Efectul antibacterian al acestei substanţe a fost descoperit încă din 1929 de către ALEXANDER FLEMING, în urma sesizării antagonismului exercitat de o ciupercă din genul Penicillium faţă de o cultură de stafilococ.

Aprofundarea cunoaşterii morfologiei şi fiziologiei microorganismelor este tributară progreselor înregistrate în domeniul opticii, electronicii şi chimiei.

Astfel, vizualizarea virusurilor şi cunoaşterea ultrastructurii microorganismelor au devenit posibile după inventarea microscopului electronic (1930-1940), iar determinarea structurii chimice a acestora şi a activităţii enzimelor bacteriene, prin folosirea izotopilor radioactivi.

În cadrul etapei contemporane de evoluţie a microbiologiei, a debutat şi s-a dezvoltat genetica microbiană, ştiinţa care are ca obiect ereditatea şi variabilitatea microorganismelor.

Având un aparat genetic mai redus, virusurile şi bacteriile au constituit obiectul de studiu al cercetărilor fundamentale de genetică.

Primele observaţii care au contribuit la stabilirea sediului informaţiei genetice la microorganisme şi macroorganisme au fost efectuate de către GRFFITH în 1928 pe bacteria Diplococcus pneumoniae (pneumococul). El a constatat că în contact cu pneumococi virulenţi, omorâţi prin căldură, pneumococii nevirulenţi devin virulenţi.

În 1944, AVERY şi colaboratorii săi au reuşit transformarea genetică a unor pneumococi nevirulenţi în tipul virulent cu ajutorul AND extras de la pneumococii virulenţi, demonstrând astfel, că acidul dezoxiribonucleic (ADN) este suportul material al eredităţii.

F. IACOB şi J. MONOD lansează în 1961 ipoteza existenţei unui ARN mesager prin intermediul căruia informaţia genetică este transferată de la ADN la ribozomi. Tot ei elaborează teoria reglajului genetic al activităţii celulare (teoria operonului), pentru care au primit premiul Nobel.

Lui GEORGE PALADE, A. CLAUDE şi C. DUVE – laureaţi ai premiului Nobel în 1974, le datorăm descoperirea rolului ribozomilor în sinteza proteinelor.

DEZVOLTAREA MICROBIOLOGIEI ÎN ROMÂNIA

Începuturile cercetării şi practicii microbiologice în România se situează spre sfârşitul secolului al XIX-lea.

VICTOR BABEŞ (1854-1925) a fost fondatorul şcolii româneşti de microbiologie. Marele savant român s-a format lucrând în perioada 1881-1884 în laboratorul lui PASTEUR şi în 1885 în laboratorul lui KOCH. BABEŞ a desfăşurat o prodigioasă activitate ştiinţifică elaborând peste 1.000 lucrări, 25 monografii şi primul tratat de bacteriologie în colaborare cu VICTOR CORNIL în 1883. Descoperirea în

11

1887 a incluziilor produse de virusul turbării în celulele piramidale din cornul lui Ammon, cunoscute sub numele “incluziile lui Babeş-Negri”, a serurilor imune (împreună cu LEPP în 1889), a paraziţilor din hematiile unor specii de animale, paternitatea acestei descoperiri fiind recunoscută prin crearea genului Babesia în care au fost încadrate microorganismele respective, reprezintă contribuţiile cele mai importante cu care VICTOR BABEŞ a îmbogăţit tezaurul ştiinţei româneşti şi universale. Alături de acestea trebuie menţionate şi numeroasele sale cercetări asupra antagonismului bacterian şi descrierea granulelor metacromatice din citoplasma bacilului difteriei (corpusculii Babeş-Ernst).

Paralel cu activitatea ştiinţifică, VICTOR BABEŞ a dezvoltat şi o bogată activitate didactică, organizatorică şi obştească, conturându-se ca o figură luminoasă de savant patriot.

Savanţii care ulterior au dezvoltat în mod strălucit şcoala de microbiologie medicală românească au fost: IOAN CANTACUZINO (1863-1934), CONSTANTIN IONESCU-MIHĂESTI (1883-1962), MIHAI CIUCA (1883-1969), DUMITRU COMBIESCU (1887-1961), iar în domeniul virusologiei CONSTANTIN LEVADITI (1874-1953) şi ŞTEFAN S. NICOLAU (1896-1967).

PAUL RIEGLER (1867-1938) a fost fondatorul şcolii româneşti de microbiologie veterinară. Elev al lui VICTOR BABEŞ, el a introdus la noi în ţară practica diagnosticului bacteriologic în medicina veterinară. În 1911 a fondat institutul de seruri şi vaccinuri de uz veterinar (în acea perioadă, al treilea de acest fel în lume), care în 1922 primeşte numele lui PASTEUR.. A desfăşurat o susţinută activitate ştiinţifică, remarcându-se prin lucrările sale privind bacilul morvei..

ALEXANDRU VECHIU (1890-1954) s-a remarcat printr-o activitate multilaterală. El a condus, după RIGLER, Institutul Pasteur şi Catedra de Microbiologie. VECHIU a fost printre primii cercetători care au reuşit adaptarea virusului pestei porcine pe iepure.

ALEXANDRU CIUCĂ (1880-1972) a fost profesor de Boli Infecţioase la Facultatea de Medicină Veterinară din Bucureşti. Prin activitatea sa ştiinţifică a adus contribuţii importante în probleme ca: infecţia experimentală cu bacilul morvei la taurine, tipizarea virusului febrei aftoase prin RFC, tratamentul durinei cu neosalvarsan etc.

ILIE POPOVICI (1902-1982), personalitate fecundă şi multilaterală, a adus printre altele contribuţii deosebite în problema preparării de noi vaccinuri contra febrei aftoase, turbării, agalaxiei contagioase a oilor şi caprelor şi holerei aviare.

NICOLAE MUNŢIU (1909-1977), după o serie de lucrări inedite privind bacilul morvei, a iniţiat şi organizat cercetarea şi producţia de biopreparate în domeniul febrei aftoase.

NICOLAE STAMATIN, profesor de Microbiologie la Facultatea de Medicină Veterinară din Bucureşti, continuând tradiţia inaugurată de PAUL RIGLER contribuie la înflorirea şcolii româneşti de Microbiologie Veterinară.

Practica veterinară îi datorează, printre altele, două vaccinuri cu mare valoare profilactică: vaccinul anticărbunos preparat din tulpina acapsulogenă 1190

12

R şi vaccinul antirujetic preparat din tulpina VR2 - vaccinuri adoptate ulterior şi în alte ţări. Totodată, cercetările fundamentale întreprinse în domeniul biologiei sporogenezei, a antagonismului microbian, a bacteriofagilor speciilor din genul Bacillus, contribuţiile aduse în domeniul clasificării stafilococilor şi pasteurelelor, completează palmaresul care îl situează pe NICOLAE STAMATIN printre reprezentanţii de frunte ai bacteriologiei veterinare româneşti.

ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE CAPITOLUL I

1. Care este obiectul de studiu al microbiologiei ? 2. Care sunt caracterele distinctive între principalele categorii de

microorganisme? 3. Care este poziţia microorganismelor în sistematica biologică? 4. Cine este considerat fondatorul medicinei raţionale şi de ce? 5. Cine a efectuat primele obsrvaţii şi descrieri ale microorganismelor, bazate

pe examenul microscopic? 6. Care sunt meritele savanţilor Louis Pasteur şi Robert Koch în constituirea

microbiologiei ca ştiinţă şi progresul ei? 7. Cine este fondatorul şcolii româneşti de microbiologie şi în ce constă

aportul său la dezvoltarea microbiologiei? 1. Care sunt mecanismele patogenităţii la bacterii?

13

CAPITOLUL 2

VIRUSOLOGIE GENERALĂ

Din lumea atât de diversificată a microorganismelor, cele mai mici şi cu structura cea mai rudimentară sunt virusurile.

Virusurile sunt definite ca forme acelulare sau subcelulare de viaţă, metabolic inerte şi lipsite de capacitatea de creştere şi multiplicare înafara organismelor vii, parazite obligatoriu intracelular {tiinţa care se ocupă cu studiul virusurilor se numeşte virusologie. Ea. constituie un domeniu particular al microbiologiei prin specificitatea metodelor de cercetare care constau în cultivarea virusurilor pe ţesuturi vii, microscopia electronică, metode chimice şi imunologice proprii.

2.1. CARACTERELE GENERALE ALE VIRUSURILOR

Virusurile prezintă unele particularităţi care le diferenţiază de celelalte microorganisme, şi anume:

1.- dimensiuni foarte reduse, cuprinse între 10 şi 300 nanometri (nm), care le conferă următoarele proprietăţi:

- nu sunt vizibile la microscopul optic, ci numai la microscopul electronic;

- traversează fitrele obişnuite care reţin bacteriile şi filtrele de colodiu, fiind deci filtrabile şi ultrafiltrabile;

- nu sedimentează spontan sau prin centrifugare la 3000-6000 turaţii /minut; sedimentarea are loc numai prin ultracentrifugare (10000 t/m) 2.- nu au un metabolism propriu deoarece sunt lipsite de enzime

metabolice şi prin urmare: -nu cresc; -nu se divid ci sunt multiplicate de celulele în care pătrund ;

-sunt paraziţi obligatorii ai celulelor vii (animală, vegetală, bacteriană) cărora le deviază metabolismul în sensul sintezei de noi particule virale.

2.2.FORMELE DE EXISTENŢĂ A VIRUSURILOR ÎN NATURĂ

Virusurile pot exista în natură sub trei forme biologice, fiecare dintre ele reprezentând, în acelaşi timp, un stadiu al ciclului ontogenetic.

14

Virusul complet (virion ul) constituie forma matură care posedă toate componenetele caracteristice virusului şi toate atributele speciei din care face parte. El are capacitatea de a rezista un timp limitat înafara celulei sensibile şi este dotat cu infecţiozitate (posibilitatea de a pătrunde într-o celulă gazdă receptivă, capabilă să-l reproducă) şi patogenitate (capacitatea de a determina modificări morfologice şi funcţionale echivalente cu starea de boală).

Virusul vegetativ reprezintă o formă de existenţă intracelulară a virusului, sub formă de elemente structurale dispersate în citoplasma celulei.

Conform informaţiei genetice conţinute în acidul nucleic viral, celula cu aparatul ei enzimatic sintetizează componentele virale care, în urma ansamblării, formează noi virioni. Eliberaţi din celula parazitată, aceştia vor pătrunde în alte celule receptive, reluând circuitul care asigură conservarea virusului în natură. În faza de virus vegetativ, dependenţa virusului de celulă este totală, el fiind incapabil de a supravieţui înafara acesteia.

Virusul integrat sau provirusul este tot o formă de existenţă intracelulară total dependentă de celula gazdă, ca şi virusul vegetativ, deosebirea constând în faptul că celula parazitată nu sintetizează material viral. Acidul nucleic viral se integrează în genomul celulei receptive, unde rămâne în stare ocultă un timp nelimitat, comportându-se ca un fragment de material genetic propriu celulei.

Această formă de existenţă este bine cunoscută la bacteriofagi (virusuri care parazitează bacteriile) şi la virusurile tumorale. Virusul integrat se poate transforma în virus vegetativ, de obicei sub acţiunea unor factori stresanţi pentru celulă, în care caz genomul viral se desprinde de cromozomul celulei şi începe să codifice sinteza de material viral, trecând în stadiul de virus vegetativ

2.3. MORFOLOGIA şi STRUCTURA VIRUSURILOR

2.3.1. FORMA şi DIMENSIUNILE

Morfologia virusurilor poate fi examinată numai prin microscopie electronică din cauza dimensiunilor reduse, de ordinul nanometrilor, a particulelor virale. Ele se prezintă într-o gamă foarte variată de forme, în funcţie de specie (fig.1.): bastonaş drept, filament pliat, icosaedru, corpuscul sferic, cărămidă cu colţurile rotunjite, ghiulea, spermatozoid, etc.

În general: - forma rotunjită (corpusculară) este specifică virusurilor patogene pentru

animale (zoovirusuri); - forma alungită, virusurilor patogene pentru plante (fitovirusuri) şi

insecte; - forma spermatozoidică, virusurilor patogene pentru bacterii (virusurile

bacteriofage). Dimensiunile virusurilor diferă de la o specie la alta şi sunt cuprinse între

10-20 nanometri la virusurile mici (ex. virusul febrei aftoase) şi 300-350 nanometri la virusurile mari (ex. virusurile variolice).

15

Fig. 1 Reprezentarea schematică a formelor şi dimensiunilor comparative ale principalelor grupe (familii) de virusuri în raport cu Escherichia coli:

1.Picornavirus; 2.Parvovirus; 3.Papovavirus; 4.Togavirus; 5.Leucovirus; 6.Adenovirus; 7.Reovirus; 8.Coronavirus; 9.Orthomixovirus; 10.Arenavirus;

11.Colifagul T; 12.Rhabdovirus; 13.Herpesvirus; 14.Iridovirus; 15.Paramyxovirus; 16.Poxvirus; 17.Escherichia coli.

2.3.2. STRUCTURA VIRUSURILOR

Virusurile complete (virionii) sunt formate dintr-un acid nucleic – ADN sau ARN -,care constituie genomul viral şi un înveliş proteic în contact direct cu acidul nucleic, numit capsidă , formând împreună nucleocapsida..La unele virusuri, nucleocapsida este înconjutată de un înveliş suplimentar numit pericapsidă (anvelopă, peplos), prevăzut cu cu o serie de emergenţe numite spiculi.(fig.2).

Fig.2 Structura generală a virusurilor. De la interior spre exterior: mov - genomul viral, galben- capsida alcătuită din capsomere, verde- pericapsida prin

care proemină spiculii (sferele de culoare verde şi maro)

2.3.2.1 Genomul viral

Genomul viral este reprezenrat de acidul nucleic viral şi în funcţie de natura acestuia, virusurile se împart în ribovirusuri cu ARN şi dezoxiribovirusuri

16

cu ADN. La virusurile fitopatogene (patogene pentru plante) acidul nucleic este întotdeauna ARN, în timp ce la virusurile zoopatogene şi la bacteriofagi, poate fi unul sau altul. Structura acidului nucleic poate fi, în funcţie de numărul lanţurilor din care este constituită molecula, monocatenar sau dublu catenar. De regulă, dezoxiribovirusurile au AND dublu catenar, iar ribovirusurile au ARN monocatenar. Genomul viral conţine între 3 şi 250 de gene şi este componenta esenţială a virusului, deoarece poartă informaţia genetică necesară devierii metabolismului celulei gazdă, în sensul sintezei constituienţilor virali. Ribovirusurile constituie un unicat în biologie, în ce priveşte posibilitatea păstrării informaţiei genetice de către ARN. 2.3.2.2. Învelişul

Învelişul extern, prezent la toate virusurile, se numeşte capsidă (gr. kapsa=cutie) şi este format din mai multe subunităţi rotunde de natură proteică, numite capsomere(gr. kapsa+meros=părţi ale cutiei). La unele virusuri, exterior capsidei se găseşte un al doilea strat al învelişului, nimit pericapsidă (anvelopă, peplos), care la unele specii (ex. virusul pseudopestei aviare) prezintă nişte emergenţe (spiculi, hemaglutinine) cu rol de adsorbţie pe diferite substraturi celulare şi de aglutinare a globulelor roşii (hemaglutinare). La virusurile gripale, pericapsida conţine nişte enzime numite neuraminidaze care favorizează pătrunderea virusului în celula receptivă. Virusurile lipsite de pericapsidă se numesc virusuri nude. Capsomerele care alcătuiesc capsida sunt riguros aranjate, conform unei arhitecturi cristalografice, numărul şi simetria lor fiind bine definite pentru fiecare virus în parte. Se cunosc trei tipuri principale de simetrie a capsidei virale şi anume:

- capsidă cu simetrie icozaedrală sau cubică, de tipul 5, 3, sau 2 (fig.2) dispusă în jurul genomului (acidul nucleic viral) pliat sub formă de ghem;

- capsidă helicoidală, de forma unui tub cilindric care rezultă din dispunerea capsomerelor în formă de spirală, asemănător unui resort în stare comprimată Spirala capsomerelor delimitează pe faţa internă a tubului un şanţ în care este aşezat tot helicoidal, într-un perfect paralelism cu capsida, genomul (fig. 3)..

- capsida cu simetrie binară sau dublă este caracteristică bacteriofagilor cu cap şi coadă. Capsida capului este de tip icozaedral, iar capsida cozii este structurată după tipul de simetrie helicoidal (fig. 4.).

Fig. 2 Schema tipurilor structurale de capsomere:

1 şi 2 = lanţuri peptidice; 3 = monomeră;

4 şi 5 = oligomere; 4 = hexameră (hexon);

5 = pentameră (pepton).

17

Capsida împreună cu pericapsida protejează genomul viral de acţiunea factorilor de mediu şi asigură fixarea virionului de receptorii celulei gazdă.

Fig. 4 Tipuri structurale de bacteriofagi (după Bradley, 1971): 1.fagi cu coada contractilă; 2.fagi cu coada lungă necontractilă; 3.fagi cu coada

scurtă; 4.fag fără coadă, cu capsomere mari la colţuri; 5.fag fără coadă, cu capsomere mici la colţuri; 6.fag filamentos.

2.4. RELAŢIA VIRUS – GAZDĂ

2.4.1. TROPISMUL VIRUSURILOR

Deoarece genomul viral este extrem de simplu, virusurile nu deţin informaţia genetică necesară sintezei enzimelor metabolice (de ex. enzimele necesare catabolizării glucidelor, enzimele care catalizează reacţiile de biosinteză a proteinelor, etc.).Prin urmare, fiind lipsite de metabolism propriu, ele sunt obligate să paraziteze diverse gazde celulare (celula animală, vegetală, bacteriană), pentru ca, folosind “maşinăria biochimică” a acestora să poată supravieţui şi prolifera. Virusurile animale pătrund în organism pe diverse căi: digestivă, respiratorie, cutanată, pielea şi mucoasele lezionate sau prin înţepături produse de artropode (arbovirusurile). Unele virusuri rămân cantonate la acest nivel iar altele sunt diseminate în organism pe două căi: calea sanguină (diseminare hematogenă) sau calea nervoasă (diseminare neurogenă).

Diseminarea hematogenă sau viremia constă în trecerea virusurilor în sânge la nivelul capilarelor şi vehicularea lor prin intermediul leucocitelor polimorfonucleare neutrofile.

Diseminarea neurogenă (septinevrita) se realizează de-a lungul axonilor neuronali şi poate fi centrifugă (ex. virusul herpetic) sau centripetă (ex. virusul turbării). Virionii diseminaţi în întreg organismul se localizează în anumite ţesuturi faţă de care prezintă un tropism special (histotropism) sau numai în anumite

Fig. 3 Schema structurii

capsidei helicoidalea virusului mozaicului

tutunului.

18

celule (citotropism). Virusurile manifestă, de asemenea, genotropism sau afinitate pentru specia biologică pe care o parazitează. Genotropismul a permis împărţirea virusurilor în monopatogene (patogene pentru o specie) şi polipatogene (patogene pentru două, trei, sau mai multe specii), în zoovirusuri, fitovirusuri şi bacteriofagi. În funcţie de histotropism, virusurile pot fi grupate în :

- virusuri epiteliotrope (dermatotrope), care au afinitate pentru piele şi mucoase (ex. virusurile variolice , virusul febrei aftoase, virusurile herpetice);

- virusuri neurotrope, cu afinitate pentru ţesutul nervos (ex. virusul rabic, virusul poliomielitei);

- virusuri organotrope (viscerotrope), cu afinitate pentru anumite organe interne, care, la rândul lor, pot fi clasificate în: pneumotrope (ex. virusurile gripale, virusul jigodiei), enterotrope (ex. virusul diareei virale–bolii mucoaselor); hepatotrope (virusurile hepatitelor);

- virusurile pantrope (mezenchimotrope), cu afinitate pentru toate celulele şi organele bogate în celule mezenchimale.(ex. virusurile pestelor la diferite specii animale.

Citotropismul reprezintă afinitatea virusurilor pentru anumite celule din cadrul aceluiaşi ţesut. De exemplu, virusul rabic (v. turbării) se multiplică de preferinţă în neuronii piramidali din cornul lui Amon, iar virusul poliomielitei, în neuronii motori din coarnele anterioare ale măduvei spinării.

2.4.2. MULTIPLICAREA VIRUSURILOR

Virusurile nu se multiplică singure ci ele sunt sintetizate de celula gazdă prin activitatea metabolică a acesteia, deviată de la normal în urma substituirii informaţiei genetice a celulei cu cea a virusului.. Atât proteinele virale, cât şi noii acizi nucleici, se constituie pe seama rezervelor energetice şi nutritive (aminoacizi, nucleotide) ale celulei parazitate. Multiplicarea virusurilor implică patru etape succesive.

1. Adsorbţia sau fixarea virionului pe receptorul celular Adsorbţia virionului se face numai pe anumite puncte de pe suprafaţa

membranei celulelor gazdă. Responsabilitatea fixării o poartă complementarităţile de natură stereochimică, electrostatică şi geometrică dintre capsida sau pericapsida virionului şi membrana celulară. Adsorbţia poate fi oprită prin blocarea receptorilor în urma acţiunii unor factori fizici, chimici sau biologici. Virionul rămas extracelular este repede distrus de factorii de apărare ai organismului.

2. Pătrunderea virionului în celulă. Pătrunderea virionului prin membrană se realizează printr-un proces activ de încorporaredin partea celulei, numit viropexie. Membrana celulară se invaginează şi se adânceşte progresiv în dreptul virionului până când acesta este complet înglobat în celulă. Virusul pătruns în celulă este inclus într-o vacuolă delimitată de membrana celulară invaginată, care se dezintegrează treptat.

19

În cazul virusurilor zoopatogene şi fitopatogene, virionul pătrunde în întregime în celula sensibilă, inclusiv capsida, iar la bacteriofagi, numai acidul nucleic după o prealabilă decapsidare.

3. Multiplicarea propriu-zisă După pătrunderea în celulă are loc mai întâi decapsidarea virusurilor zoo-

şi fitopatogene sub acţiunea enzimelor produse de celula gazdă, numite decapsidaze.

Multiplicarea virusurilor implică totdeauna trei procese: - Replicarea genomului viral.

La scurt timp după pătrunderea în celulă, acidul nucleic viral îşi preia atributele de material gemetic autonom, programând şi dirijând sinteza componentelor virale: în prima fază, a acidului nucleic, iar apoi a proteinelor capsidale.

Replicarea genomului are loc în mod diferit în funcţie de structura mono- sau dublu catenară a acidului nucleic: replicare semiconservativă la ADN şi ARN dublu catenar şi replicare mai întâi complementară şi apoi semiconservativă când acizii nucleici sunt monocatenari.

- Biosinteza proteinelor capsidale Paralel cu replicarea genomului viral , la nivelul ribozomilor celulari

începe biosinteza moleculelor de proteine specifice capsidei, coordonată de acidul nucleic viral. Prin mecanisme încă neelucidate, genomul viral scoate din funcţie AND celular în momentul copierii informaţiei de pe AND pe ARNm . În celulă va apare un ARNm transcris de pe genomul viral, care va transmite la nivelul ribozomilor un mesaj genetic nou, obligând celula să sintetizeze material viral în locul enzimelor şi a celorlalte proteine proprii. Sub această formă, de subunităţi dispersate în citoplasmă şi lipsite de identitate morfologică, virusurile nu pot fi puse în evidenţă prin mijloace electronooptice, motiv pentru care această fază se numeşte “ faza de eclipsă”.

- Ansamblarea sau morfogeneza noilor virioni La sfârşitul fazei de biosinteză,după ce în celulă s-au acumulat cantităţi

mari de acid nucleic şi proteine virale, are loc asamblarea noilor virioni. La virusurile mici, aşezarea capsomerelor în jurul genomurilor virale, fenomen numit încapsidare, se petrece spontan printr-un proces de autoansamblare. La cele mai multe virusuri, asamblarea implică însă intervenţia unor enzime. Între sinteza proteinelor capsidale şi apariţia lor în structura virionilor nou formaţi există un interval de aproximativ 20 de minute.

Morfogeneza, ca regulă generală, are loc pentru virusurile ARN în citoplasmă, iar pentru virusurile AND, intranuclear, după migrarea materialului viral din citoplasmă în nucleul celulei gazdă.

- Eliberarea virionilor din celulă Virionii nou formaţi pot fi eliberaţi din celulă prin mai multe mecanisme 1. Înmugurirea sau burjeonarea este modul cel mai frecvent de eliberare

a virusurilor din celulă. :

20

Într-o primă fază, virionii nou asamblaţi sunt incluşi în nişte vezicule (cisterne) care se ataşează de faţa internă a membranei celulare pe care o bombează, proeminând asemănător unor muguri. Ulterior, virusurile se detaşează de celulă prin mici aperturi care apar în membrană.

2. Liza celulei gazdă sub acţiunea unor enzime sintetizate în celulă în ultima fază a morfogenezei.. Acest mecanism, caracteristic bacteriofagilor, se întâlneşte rar la virusurile animale.

3.Eliberarea virionilor consecutiv morţii celulei şi dezintegrării acesteia. Aceste virusuri apar cel mai târziu, iar punerea lor în libertate se caracterizează printr-o frecvenţă moderată.

4. Trecerea virionilor direct la celula adiacentă celei în care a avut loc multiplicarea, prin porii membranei celulare.

2.4.3. MODIFICĂRILE MORFOFIZIOLOGICE ALE CELULELOR

INFECTATE CU VIRUSURI Efetele multiplicării ‘in vivo” a virusurilor zoopatogene diferă în funcţie

de specia de virus şi se traduc prin trei categorii de modificări morfologice şi fiziologice ale celulei parazitate:

- degenerarea şi moartea celulară (efect citopatic); - transformarea neoplazică (efect citocinetic); - supravieţuirea, cu prezenţa incluziilor (efect incluziogen). Efectul citopatic constă într-o serie de modificări morfologice ale celulelor

infectate de virusuri şi anume: - ratatinarea celulelor (arbovirusurile); - mărirea şi fuzionarea celulelor (paramixovirusurile); - vacuolizarea citoplasmei (virusurile vacuolizante); - distrugerea celulei prin liză (enterovirusurile). Efectul citocinetic sau transformarea neoplazică - vezi cap. 2.4.4. Efectul incluziogen. În celulele în care se multiplică virusul, apar frecvent structuri

corpusculare de dimensiuni variabile, numite incluzii virale. Ele au fost descrise cu mult înainte de descoperirea virusurilor şi poartă numele autorilor care le-au observat şi descris pentru prima oară. De exemplu, incluziile Babeş-Negri în turbare; incluziile Bollinger, în variola aviară; incluziile Guarnieri, în infecţiile cu virus vaccinal, etc.

Mecanismul de formare, locul şi natura lor este diferită în funcţie de virus. Evidenţiere lor prin coloraţii speciale reprezintă o metodă frecvent utilizată în diagnosticul unor viroze. Specificitatea lor pentru un anumit virus este dată de prezenţa lor în ţesutul pentru care manifestă tropism şi de poziţia lor: în citoplasmă sau în nucleu. La noi în ţară, la nivelul laboratoarelor veterinare judeţene, evidenţierea incluziilor Babeş-Negri în neuronii piramidali din cornul lui Ammon, constituie o metodă curentă pentru diagnosticul turbării.

21

2.4.4. TIPURILE DE INFECŢIE VIRALĂ

Multiplicarea virusurilor în organismul animalelor poate declanşa trei tipuri diferite de răspuns din partea acestuia.

1. Infecţia virală acută (boala clinică) apare atunci când multiplicarea virusului determină modificări care produc o alterare a stării normale a organismului şi apariţia stării de boală cu semne clinice evidente.

Gravitatea bolii virale clinice este condiţionată de o serie de factori ca: numărul de virioni infectanţi, rezistenţa generală a organismului, vârsta, sexul, alimentaţia, igiena, etc.

2. Infecţia virală inaparentă sau ocultă se caracterizează prin lipsa semnelor clinice ca urmare a stabilirii unui echilibru între organism şi virus. Acest tip de infecţie se întâlneşte în anemia infecţioasă a calului şi în leucozele aviare şi mamifere. Unii factori de mediu ca iradiaţiile, temperatura, umezeala, sau factori interni ca infecţiile intercurente, stimului endocrini, etc.pot determina ruperea echilibrului dintre organism şi virus şi implicit la instalarea bolii clinice.

3. Transformarea neoplazică este o modificare determinată de virusurile oncogene sau citochinetice, caracterizată printr-o multiplicare anarhică a celulelor infectate cu aceste virusuri.

Ipoteza originii virale a unor tumori este veche (Metchnikov şi Borrel, 1903) iar capacitatea unor virusuri de a produce tumori în condiţii naturale şi experimentale a fost evidenţiată în anul 1908 de Ellerman şi Bang , care au demonstrat că leucozele aviare pot fi transmise în serie prin filtrate acelulare.

Din 600 de virusuri identificate până în prezent la animale, la aproximativ ¼ (150) s-a demonstrat un potenţial oncogen.

Mecanismul oncogenezei produse de virusuri nu este pe deplin cunoscut dar se pare că în genomul celulei gazdă se produc modificări de ordin molecular prin integrarea unor gene virale. Această adiţie genetică determină transformări profunde ale celulei normale care, în final, duc la pierderea controlului reglator asupra multiplicării celulare şi la apariţia de tumori benigne şi maligne.

2.5. ACŢIUNEA UNOR AGENŢI FIZICI şi CHIMICI ASUPRA VIRUSURILOR

Cunoaşterea comportamentului virusurilor faţă de factorii fizici şi chimici are implicaţii practice atât pentru identificarea unui virus, cât şi pentru măsurile de profilaxie nespecifică a bolilor virale.

Temperatura În general, virusurile sunt sensibile la căldură, unele inactivându-se în mediul extern la temperatura de 20-22ºC, în decurs de câteva ore. Inactivarea virusurilor are loc în majoritatea cazurilor la 56ºC în 30 minute, iar la 100ºC în câteva secunde. Temperatura optimă pentru multiplicarea virusurilor coincide, în marea majoritate a cazurilor, cu temperatura optimă pentru celula gazdă. De aceea

22

reacţia febrilă a organismului în cursul infecţiei trebuie privită ca un mijloc de apărare antivirală, avându-se în vedere că temperatura corporală realizată prin hipertermie este de cele mai multe ori nefavorabilă multiplicării virusului, fără a fi nocivă pentru celula gazdă. Temperaturile scăzute au proprietăţi conservante, metoda folosită pentru păstrarea virusurilor în colecţii, luni sau chiar ani de zile, fiind congelarea la – 40 până la – 196ºC .

Variaţiile de pH Limitele de pH în care virusurile îşi menţin viabilitatea se situează între 5-

9, cu unele excepţii cum ar fi enterovirusurile care îşi păstrează infecţiozitatea şi la pH 2,2 (după Buxton şi col. citaţi de Carp-Cărare M., 2001).

Energia radiantă Radiaţiile cele mai active faţă de virusuri sunt ultravioletele în doze mari.

Efectul acestora este însă diminuat proporţional cu protecţia pe care o exercită asupra virusurilor materia organică în care sunt incluse (secreţii, excreţii, cadavre).

Substanţele chimice Diversele substanţe dezinfectante şi antiseptice ca formolul, soda caustică,

sublimatul de mercur, soluţiile de iod, soluţiile sărurilor de argint, etc., distrug virusurile, viteza de acţiune fiind în funcţie de durata de contact şi de concentraţia soluţiei. Hidroxidul de sodiu (soda caustică) exercită un puternic efect virulicid mai ales în soluţie ferbinte.

Formaldehida este activă dar acţiunea ei antivirală este mai lentă. Ea se utilizează însă în mod curent la prepararea vaccinurilor inactivate (omorâte), deoarece nu modifică structura antigenică a virusurilor.

Eterul şi cloroformul au o acţiune electivă, în sensul că sunt inactivante pentru unele virusuri şi inofensive pentru altele, astfel încât sensibilitatea la cele două substanţe reprezintă pentru virusuri, un criteriu taxonomic.

Glicerina în soluţie salină 50% constituie un bun conservant pentru majoritatea virusurilor, asigurându-le infecţiozitatea luni şi chiar ani de zile. Antibioticele şi chimioterapicele , substanţe de uz curent în terapia antibacteriană (penicilina, streptomicina, tetraciclinele, sulfamidele, etc.), sunt inactive faţă de virusuri.

2.6. CLASIFICAREA VIRUSURILOR

Problema clasificării virusurilor este încă nerezolvată; ea formează obiectul de studiu al unui comitet internaţional. Principalele criterii care stau la baza clasificării virusurilor sunt:

- natura chimică a acidului nucleic (ADN sau ARN); - simetria nucleocapsidei (cubică, helicoidală, binară); - prezenţa sau absenţa unui înveliş pericapsidal;

23

- numărul de capsomere pentru virusurile cu simetrie cubică sau diametrul nucleocapsidei pentru virusurile cu simetrie helicoidală.

Pe baza acestor criterii, virusurile au fost încadrate în phylum ‘VIRA” împărţit în două subphyla pe baza naturii chimice a genomului viral:

- DEZOXIVIRA, - RIBOVIRA În funcţie de simetria capsidei – helicoidală sau cubică - , virusurile se

grupează în clase: - dezoxihelica şi dezoxicubica; - ribohelica şi ribocubica.

Ordinele se bazează pe prezenţa sau absenţa unui înveliş pericapsidal, iar familiile, în principal, pe numărul de capsomere şi diametrul nucleocapsidei.

Pe baza unor criterii suplimentare, în cadrul familiilor au fost individualizate subfamilii şi genuri virale, iar în cadrul fiecărui gen, una sau mai multe specii.

Virusurile au o nomenclatură latină cu terminaţiile: - viridae, pentru familii; - virus, pentru gen . Exemple: familia Coronaviridae genul Coronavirus; familia Parvoviridae,

genul Parvovirus.

ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE CAPITOLUL II

1. Care sunt formele de existenţă a virusurilor în natură şi caracteristicile lor? 2. Ce forme şi ce dimensiuni pot avea particulele virale? 3. Care sunt părţile componente ale unui virus? 4. Pe ce căi pătrund şi diseminează virusurile în organism? 5. În ce constă tropismul virusurilor şi cum se clasifică virusurile în funcţie

de tropism? 6. Care sunt etapele multiplicării particulelor virale? 7. Care sunt efectele multiplicării intracelulare a virusurilor ? 8. Care sunt tipurile de infecţie virală? 9. Cum se comportă virusurile faţă de temperatură, pH, radiaţii şi substanţele

dezinfectante?

24

CAPITOLUL 3

BACTERIOLOGIE GENERALĂ

3.1. CONCEPTUL DE BACTERIE

Bacteriologia este ramura microbiologiei care se ocupă cu studiul bacteriilor. Termenul de bacterie a fost creat de F e r d i n a n d C o h n în 1872, odată cu încercarea de a elabora una dintre primele clasificări ale acestor microorganisme. Bacteriile sunt microorganisme unicelulare cu structură procariotă - tip de organizare caracterizat prin lipsa membranelor intracelulare, spre deosebire de tipul eucariot, la care nucleul şi unele organite (cloroplastele, mitocondriile) posedă membrane proprii. Materialul genetic sau genomul bacterian este reprezentat de un cromozom format dintr-o moleculă mare de ADN şi de unităţi ereditare extracromozomale numite plasmide, constituite din molecule de ADN mult mai mici (aproximativ 1% din masa cromozomului). Bacteriile sunt lipsite de mitocondrii, aparat Golgi şi reticul endoplasmatic propriu-zis. Funcţiile acestor structuri, caracteristice celulei eucariote, sunt suplinite de alte componente celulare, mai ales de membrana citoplasmatică. Bacteriile sunt metabolic active, deoarece dispun de un echipament enzimatic propriu care realizează reacţiile celulare de degradare şi biosinteză. Nutriţia este de tip absorbtiv, din punct de vedere al accesului substanţelor nutritive în celulă şi de tip chimiotrof sau fototrof, după modul de obţinere a energiei necesare proceselor nutritive. Principala modalitate de multiplicare a bacteriilor este diviziunea simplă binară sau sciziparitatea.

Unele specii bacteriene pot exista în natură sub două forme biologice alternative: forma vegetativă care reprezintă celula bacteriană propriu-zisă, dotată cu toate însuşirile caracteristice speciei din care face parte şi forma sporulată, care este o formă de rezistenţă şi de conservare a speciei în condiţii ostile, improprii vieţii. Spre deosebire de celula vegetativă biologic activă, sporul bacterian este o formă dormandă, caracterizată prin absenţa funcţiilor de multiplicare şi a celor biosintetice şi cu o foarte redusă intensitate a celorlalte activităţi vitale.

Bacteriile se diferenţiază de celelalte grupe de microorganisme prin caracterele prezentate în tabelul 1.

25

3.2. NOŢIUNI DE TAXONOMIE şi NOMENCLATURĂ BACTERIANĂ

3.2.1. TAXONOMIA BACTERIILOR

Taxonomia (gr. taxon = grup) sau sistematica biologică este ştiinţa clasificării.

Un taxon biologic reuneşte o sumă de indivizi asemănători între ei în virtutea descendenţei dintr-un strămoş comun, deci posesori ai unei informaţii genetice comune. Prin urmare, clasificarea organismelor vii este o clasificare naturală sau filogenetică.

Comparativ cu celelalte regnuri, clasificarea organismelor procariote pe baza acestui criteriu a întâmpinat numeroase dificultăţi, generate de cauze obiective cum ar fi imposibilitatea studierii bacteriilor ca indivizi ci doar ca populaţii, din cauza dificultăţilor de manipulare a unei singure celule.

În consecinţă, clasificarea bacteriilor s-a sprijinit deseori pe criterii fenotipice discutabile , din care derivă gradul mult mai mare de convenţional şi arbitrar al taxonomiei bacteriene, în comparaţie cu cel al plantelor şi animalelor.

Gruparea bacteriilor în categorii taxonomice pe criterii filogenetice a devenit posibilă relativ recent, prin aplicarea tehnologiilor moderne de biologie moleculară şi biochimie în studiile de genetică bacteriană.

3.2.1.1. Categorii de taxoni Conceptul de specie bacteriană. Unitatea taxonomică de bază a lumii vii

este specia. În cazul organismelor superioare, din regnul vegetal sau animal, există

criterii bine stabilite de delimitare a speciilor, cel mai important fiind capacitatea de încrucişare.

Luând în considerare acest criteriu de bază , specia poate fi definită ca o comunitate reproductivă formată din populaţii care habitează un anumit areal şi ai căror indivizi se încrucişează liber în natură cu orice individ de sex opus, dând naştere la descendenţi fertili care menţin relativ omogen fondul de gene al populaţiei (Buiuc G., 1999).

Spre deosebire de reproducerea organismelor superioare, diviziunea celulară a bacteriilor este o înmulţire vegetativă, iar schimbul de material genetic prin conjugare (vezi cap. Genetică) este rar şi nu reprezintă un caracter de specie.

Aceste diferenţe, la care se adaugă deosebirile fenotipice mai puţin tranşante ale bacteriilor şi capacitatea mult mai mare de a suferi variaţii fenotipice şi genotipice, sporesc gradul de dificultate în delimitarea speciilor bacteriene şi găsirea unui punct de vedere unitar asupra conceptului de specie bacteriană.

Din cele câteva încercări de definire, cărora literatura ultimelor decenii le-a acordat mai multă atenţie ( S t a m a t i n- 1958; C o w a n- 1975; G o r d o n – 1978; S t a l e y şi K r i e g – 1984; citaţi de Răducănescu şi col., 1986) rezultă că speciile bacteriene ar putea fi privite ca populaţii de celule cu caractere fenotipice comune, prin care diferă semnificativ de alte populaţii. Fiecare populaţie care

26

aparţine unei specii poartă numele de tulpină bacteriană (clonă sau suşă). Ea este o cultură pură care îşi are originea într-o singură izolare dintr-un mediu natural.

Pentru practica bacteriologică, tulpina bacteriană are, prin analogie cu organismele superioare, valoarea unui individ. Toate examenele necesare identificării bacteriilor şi încadrării lor taxonomice se execută pe tulpini şi nu pe celule izolate, plecând de la premiza că o populaţie care constituie o tulpină provine din descendenţa uneia sau a unui număr restrâns de celule şi că este genetic omogenă.

Taxonii de rang superior speciei, în succesiunea lor ascendentă, sunt: genul, familia, ordinul, clasa şi diviziunea (încrengătura sau phylum).

Genul reprezintă un grup taxonomic alcătuit din mai multe specii înrudite cu specia tip. El poate fi format dintr-o singură specie (gen monotipic), sau, obişnuit,din mai multe specii. Toate bacteriile îşi au locul în cadrul unui gen, iar identificarea genului stă la baza diagnosticului bacteriologic curent.

Familia grupează mai multe genuri înrudite, dintre care unul este considerat genul tip. Numeroase genuri nu au fost încadrate încă în familii.

Ordinul este un taxon format din familii înrudite, mai rar utilizat, puţine grupe de bacterii fiind încadrate în ordine.

Clasa este un taxon superior, care grupează mai multe ordine înrudite. Diviziunea reprezintă o grupare de clase înrudite.

3.2.2. NOMENCLATURA BACTERIILOR

Conform normelor generale de nomenclatură în biologie, fiecare bacterie este denumită, după sistemul binominal al lui L i n n é, prin două cuvinte latinizate (de exemplu, Bacillus anthracis), care caracterizează foarte sintetic bacteria respectivă.

Primul cuvânt indică genul şi este un substantiv la singular de origine latină, greacă, sau de altă origine, dar latinizat. Numele genurilor sunt inspirate , de regulă, de :

- unele caractere morfologice, frecvent forma şi modul de grupare (Bacillus = baston mic; Staphylococcus = ciorchine de strugure; Sarcina = pachet, etc.), asociate uneori cu habitatul natural al bacteriei (Lactobacillus = bastonaş din lapte);

- numele bacteriologului care a izolat primul bacteria respectivă sau a avut merite deosebite în studiul ei : Brucella (Bruce), Pasteurella (Pasteur), Escherichia (Escherich), etc.

Numele genului se scrie cu iniţială majusculă, întreg sau, în cazul unor enumerări şi numai atunci când precede numele speciei, prescurtat : B. anthracis, E. coli, S. aureus.

Cel de-al doilea cuvânt denumeşte specia şi este descriptiv pentru substantivul care reprezintă genul.

Numele speciei se scrie întotdeauna cu literă mică. El se poate referi la : - un caracter morfologic, cultural sau biochimic (Staphylococcus aureus,

Lactobacillus acidophilus, etc.); - gazda receptivă la care produce infecţii (Brucella suis, Streptococcus

equi, Mycoplasma gallinarum, etc.);

27

- boala, un simptom sau o leziune caracteristică (Clostridium tetani, Bacillus anthracis, Mycoplasma agalactiae, Listeria monocytogenes, etc.);

- numele bacteriologului care a descris primul bacteria (Actinobacillus lignieresii, Clostridium chauvoei, Coxiella burneti, etc.).

Numeroase specii bacteriene au şi nume comune, folosite deseori în vorbirea curentă, ca de exemplu : bacilul piocianic sau bacilul puroiului albastru , pentru Pseudomonas aeruginosa; bacilul lui Koch sau B.K., pentru Mycobacterium tuberculosis; bacilul tetanosului, pentru Clostridium tetani, etc Ordinul şi familia sunt denumite cu numele genului celui mai reprezentativ pentru gruparea taxonomică respectivă, la care se adaugă sufixele ,,ales” pentru ordin şi ,,aceae” pentru familie (ex. genul reprezentativ Rickettsia, ordinul Rickettsiales, familia Rickettsiaceae).

3.3. MORFOLOGIA SI BIOLOGIA BACTERIILOR

3.3.1. MORFOLOGIA CELULEI VEGETATIVE

Cunoaşterea caracteristicilor morfologice (formă, dimensiuni, mod de grupare, afinităţi tinctoriale, particularităţi morfologice) are o importanţă deosebită în cercetarea şi identificarea bacteriilor, deoarece acestea constituie criterii taxonomice de bază.

3.3.1.1. Forma si modul de grupare a bacteriilor

Forma celulelor bacteriene este greu de apreciat în probele prelevate din mediile naturale, motiv pentru care morfologia bacteriilor se studiază pe celulele cultivate în condiţii artificiale de laborator pe medii de cultură adecvate.

Forma bacteriilor este controlată genetic, dar este influenţată într-o mare măsură de factorii de mediu (temperatură, pH, compoziţia mediului de cultură, etc.) şi de vârsta culturii. Deoarece condiţiile de cultură se modifică în timp putând cauza apariţia unor forme aberante, morfologia bacteriilor se apreciază numai pe culturi tinere (proaspete).

După forma celulei, bacteriile pot fi grupate în patru categorii distincte: sferice, cilindrice, spiralate sau helicoidale şi pătrate (fig.5.).

Fig.5. Forme posibile la bacterii

1.coc sferic; 2.coc oval; 3.coc asimetric cu un pol ascuţit şi unul rotunjit; 4.coc asimetric reniform; 5.formă cocoidă; 6.cocobacil; 7.bacil fin; 8.bacil asimetric în formă de măciucă; 9.bacil cu capetele retezate; 10.bacil cu capetele rotunjite; 11.vibrion; 12.spirochetă cu spire mari; 13.spirochetă cu spire mici.

28

La cele mai multe specii bacteriene, celulele – fiice rezultate în urma diviziunii se separă şi rămân independente datorită mişcării browniene, activităţii flagelilor în cazul bacteriilor mobile, curenţilor de convecţie din mediu, etc. La unele specii însă, majoritatea celulelor-fiice nu se despart timp de una sau mai multe generaţii, formând constant grupări caracteristice cu valoare taxonomică .

Modul de grupare a bacteriilor este determinat de raportul geometric dintre planurile succesive de diviziune şi de tendinţa celulelor-fiice de a rămâne unite.

Bacteriile sferice In terminologia curentă aceste bacterii poartă denumirea de coci. Ele pot avea

formă sferică, ovală, lanceolată sau reniformă, diametrele celulei fiind aproximativ egale. In funcţie de raporturile care se stabilesc între celulele-fiice după diviziune, cocii pot fi izolaţi sau grupaţi. Principalele moduri de grupare sunt (fig. 6):

- diplococul, care rezultă prin diviziunea celulelor în planuri succesive paralele, celulele fiice rămânând grupate câte două;

- streptococul, constituit din coci înlănţuiţi ca urmare a diviziunilor succesive în planuri paralele şi a persistenţei legăturilor între celulele-fiice pe parcursul mai multor generaţii;

Fig.6. Modalităţile de grupare a cocilor în funcţie de orientarea planurilor de diviziune celulară

- tetrada sau tetracocul - o grupare de patru celule rezultată din două

diviziuni succesive în planuri perpendiculare; - sarcina - o grupare de opt coci sub forma a două tetrade suprapuse, care

rezultă în urma a trei diviziuni în planuri perpendiculare: al doilea pe primul şi al treilea pe primele două;

- stafilococul, la care planurile succesive de diviziune sunt dispuse în direcţii diferite, astfel încât celulele rezultate formează grămezi neregulate asemănătoare ciorchinilor de struguri

Bacteriile cilindrice cunoscute sub denumirea comună de bacili, au formă de bastonaşe. Raportul dintre cele două axe variază însă foarte mult, încât,

29

unii bacili au un aspect filamentos, uneori ramificat, iar alţii se apropie de forma sferic-ovală, fiind numiţi din acest motiv cocobacili.

Bacilii pot fi drepţi sau uşor încurbaţi la mijloc sau la una din extremităţi, cu capetele tăiate drept ca la Bacillus anthracis, rotunjite ca la majoritatea speciilor, ascuţite ca la Fusobacterium fusiformis, sau dilatate în formă de pişcot sau de haltere - caracteristică a genului Corynebacterium

Diviziunea bacililor are loc după un singur plan transversal pe axul longitudinal. După diviziune, bacilii pot rămâne izolaţi sau grupaţi câte doi (diplobcili), în lanţuri cu lungimi variabile (streptobacili), în palisadă (asemănător dinţilor unui pieptene), sau sub formă de idiograme chinezeşti (fig. 7).

Fig.7. Modalit ăţile de grup are a bac ililor: 1.diplobacil; 2.grupare în forma literei V; 3.streptobacil; 4.filament; 5.filament cu citoplasmă granulară; 6.formă ramificată; 7.grupare în palisadă; grupare în ideograme chinezeşti.

Filamentul este considerat de unii autori o formă iar de alţii, un mod de grupare. Se pare că ultimul punct de vedere este mai corect întrucât filamentul reprezintă în realitate un plasmodiu, multiplicarea citoplasmei şi a materialului nuclear nefiind urmată şi de constituirea pereţilor celulari şi a membranelor citoplasmatice separatoare între celule.

Formele ramificate sunt o excepţie la bacterii. Ele reprezintă tot plasmodii şi sunt caracteristice actinomicetelor - grup de bacterii limitrofe, din punct de vedere morfologic şi al poziţiei taxonomice, ciupercilor.

Bacteriile spiralate sau helicoidale In funcţie de numărul de spire şi flexibilitatea peretelui celular, există trei

subtipuri morfologice de bacterii spiralate : - vibrionul, cu aspect de virgulă sau asemănător literei ,,S”; - spirilul, cu mai multe spire şi un perete celular rigid, care îi conferă

stabilitate morfologică şi dimensională.; - spirocheta, alcătuită de asemenea din mai multe spire, dar care sunt

flexibile (se pot strânge sau relaxa) datorită elasticităţii peretelui celular . Bacteriile p ătrate au fost puse în evidenţă în probele de apă hipersalină

prelevate din bălţile Peninsulei Sinai. Ele formează adesea placarde de 4-16 celule

30

rezultate din mai multe diviziuni succesive, la care se disting cu multă claritate planurile de diviziune. Forma pătrată a acestor bacterii şi faptul că sunt mult aplatizate (0,1 – 0,5 µm grosime) se explică prin lipsa presiunii interne a celulelor în mediu hiperosmotic, situaţie în care, teoretic,bacteriile pot lua orice formă.

3.2.1.2. Constantele fizice

Dimensiunile bacteriilor variază în funcţie de specie, între 0,1 –15 micrometri (µm) lungime (bacteriile filamentoase ajunând până la 500 µm) şi 0,02 – 2 µm, diametru transversal. Din acest punct de vedere, bacteriile pot fi grupate în trei categorii : mici 0,3 –1,5/0,1 –0,5 µm (ex. Brucella spp.) ; mijlocii 2 – 3/0,5 – 1 µm (ex.Escherichia spp.); mari 10 - 15/1 - 2 µm (ex. Bacillus spp., Clostridium spp. ).

In general, există o corelaţie între lungimea şi diametrul transversal al celulelor bacteriene, fără ca aceasta să constituie o regulă. Astfel, germenii din genurile Bacillus şi Clostridium, care sunt cei mai lungi (cu excepţia celor filamentoşi) , sunt în acelaşi timp şi cei mai groşi, pe când bacilul rujetului (Erysipelothrix rhusiopathiae), a cărui lungime poate ajunge la 3 – 4 µm, este foarte subţire (0,2 – 0,4µm, diametru transversal ).

Volumul bacteriilor oscilează între 0,oo3 x 10-12 (ex. Mycoplasma spp. ) şi 7,068 x 10-12 (Bacillus megatherium ).

Densitatea sau greutatea specifică a celulelor bacteriene este ceva mai mare decât a apei , situându-se între 1,07 şi 1,032. Datorită densităţii apropiate de cea a apei, bacteriile plutesc în mediile lichide, din care pot fi separate prin centrifugare.

3.2.1.3. Structura celulei bacteriene

Celula bacterină este constituită dintr-un înveliş şi un conţinut. Unele specii bacteriene sunt prevăzute în plus cu organite de mişcare (cilii sau flagelii) şi/sau cu organite de aderenţă ( pilii sau fimbriile). In figura numărul 8 este reprezentată schematic structura unei bacterii ipotetice, cu toate componentele menţionate.

Fig.8. Structura unei celule bacteriene tipice (după Măzăreanu C, 1999)

31

ÎNVELIŞUL

Principalele componente ale învelişului celulei bacteriene sunt : - membrana citoplasmatică, prezentă la toate bacteriile în contact intim cu

citoplasma; - peretele celular situat la exteriorul membranei, prezent la toate bacteriile

cu excepţia micoplasmelor; - capsula şi glicocalixul – structuri extraparietale prezente numai la un

număr restrâns de specii bacteriene şi numai în anumite condiţii de mediu.

Membrana citoplasmatică

Numită şi membrană plasmatică sau membrană celulară, această componentă esenţială a tuturor bacteriilor acoperă de jur împrejur citoplasma, separând-o de faţa internă a peretelui celular.

Examinată la microscopul electronic, membrana citoplasmatică apare ca o formaţiune triplu stratificată, cu o grosime de 7,5–10 nanometri, constituită dintr-un strat subţire electronotransparent, delimitat de ambele părţi de câte un strat mai gros, electronoopac.

Scheletul biochimic al membranei este constituit dintr-un strat dublu de fosfolipide amfipatice cu o orientare polară a regiunilor hidrofile, spre exterior şi respectiv spre interior şi a celor hidrofobe, faţă în faţă (fig.9).

Acest strat bimolecular fosfolipidic conferă membranei rolul de barieră osmotică şi oferă un sediu numeroaselor proteine enzimatice care se deplasează spre exteriorul sau interiorul celulei.

Fig. 9 Membrana citoplasmatică - reprezentare schematică a unui model

tridimensional (după Lodish şi Rothman,1979; cit.de Zarnea G., 1983). Membrana citoplasmatică serveşte drept filtru selectiv, permiţând accesul

substanţelor nutritive în celulă şi eliminarea cataboliţilor - procese reglate enzimatic de către sistemele de transport şi permeaze. Ea este implicată, de asemenea, în reglarea proceselor de diviziune celulară şi sporogeneză.

Prin invaginarea şi plierea membranei spre interiorul celulei bacteriene iau naştere nişte formaţiuni numite mezozomi, care se leagă de genomul bacterian.

32

Peretele celular

Peretele cellular este situat la exteriorul membranei citoplasmatice fiind mai gros decât aceasta (15 – 30 nanometri), rigid şi poros.

Structura morfochimică a peretelui celular este determinantă pentru grosimea, gradul de rigiditate şi afinitatea sa faţă de anumite substanţe colorante (afinitate tinctorială). In funcţie de modul în care se colorează prin metoda Gram, bacteriile se împart în Gram pozitive (colorate în violet) şi Gram negative (colorate în roşu), iar prin metoda Ziehl – Neelsen, în acidorezistente şi neacidorezistente. La bacteriile Gram pozitive peretele este gros şi rigid , iar la cele Gram negative este mai subţire şi mai elastic.

Peretele celular este format dintr-un strat bazal care aderă la membrana citoplasmatică, similar ca şi compoziţie chimică la toate bacteriile şi un strat superficial cu o structură diferită la cele trei categorii tinctoriale (Gram pozitive, Gram negative, acidorezistente), numit stratul structurilor speciale.

Stratul bazal este un polimer glicopeptidic numit peptidoglican sau mureină (lat. murus=zid). El este format din macromolecule lungi de zaharide (N-acetilglucozamină şi acid N-acetilmuramic) dispuse paralel şi legate între ele prin punţi polipeptidice, realizând astfel o reţea care încorsetează celula şi îi conferă rezistenţă mecanică.

La bacteriile Gram pozitive, stratul structurilor speciale conţine polizaharide şi proteine iar la numeroase specii, acizi teichoici, lipoteichoici şi teichuronici, care conferă peretelui rigiditate.

Peretele bacteriilor Gram negative, deşi mai subţire, are o structură mai complexă. Stratul bazal este format dintr-un complex peptidoglican-lipoproteină, iar stratul structurilor speciale este constituit dintr-o membrană externă în care predomină liopopolizaharidele (LPS). Complexul LPS are funcţia de endotoxină.

Intre peretele celular şi membrana citoplasmatică a bacteriilor Gram negative se găseşte un spaţiu periplasmatic, care conţine proteine de legare cu rol în chimiotaxie şi numeroase enzime (fosfatază alcalină, enzime hidrolitice, deoxiribonucleaze, etc.) cu rol în pregătirea substanţele care au traversat peretele, pentru trecerea lor prin membrana citoplasmatică. Stratul structurilor speciale este mai bine reprezentat cantitativ la speciile Gram negative, în comparaţie cu cel bazal, raport inversat la speciile Gram pozitive (fig. 10 a, b).

La bacteriile acidorezistente, structurile speciale sunt foarte bogate în complexe formate din acid micolic şi ceruri, fapt care explică rezistenţa acestora la decolorarea cu acizi (coloraţia Ziehl – Neelsen). Peretele celulelor bacteriene are o semnificaţie biologică multiplă : - prin rigiditatea sa, asigură menţinerea formei celulelor bacteriene; - îndeplineşte rol protector faţă de factorii nocivi de mediu, în special faţă de şocul osmotic, având în vedere că mediile de viaţă ale bacteriilor sunt hipotonice în raport cu conţinutul celulei bacteriene; - prin porii săi, mediază schimbul de substanţe între mediu şi celulă;

33

- participă la procesul de creştere şi diviziune celulară, urmând membrana citoplasmatică în formarea septurilor transversale care separă celula-mamă în cele două celule-fiice; - conţine receptori pentru bacteriofagi şi bacteriocine; - conţine enzime autolitice care se activează în momentul sporulării eliberând sporul prin liza sporangiului şi în momentul germinării determinând liza învelişurilor sporale.

Fig.10 a. Structura peretelui bacterian la bacteriile Gram pozitive (după Hart T. şi Shears P., 1997)

Orice factor care alterează sau inhibă sinteza peptidoglicanului (fermenţi

litici, antibiotice, carenţe nutritive , etc.) determină, atât ,,in vitro” cât şi ,,in. vivo”, apariţia unor bacterii cu morfologie modificată, cunoscute sub denumirile de protoplaşti şi sferoplaşti.

Fig.10.b. Structura peretelui bacterian la bacteriile Gram negative (după Hart T. şi Shears P., 1997)

Capsula

Capsula este o formaţiune extraparietală, prezentă numai la anumite specii

bacteriene şi numai în anumite condiţii de mediu. Speciile patogene capsulează de regulă în organism sau în cazul prezenţei în mediul de cultură a unui lichid organic (ser sanguin, plasmă, lichid ascitic, etc.)

34

Bacteriile capsulogene care interesează patologia veterinară sunt: Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae , Clostridium perfringens, Pasteurella multocida. Capsulele acestor specii se deosebesc prin gradul de aderenţă la peretele celular, grosime, consistenţă şi structură chimică.

Din punct de vedere chimic, capsula este formată din 98% apă, restul fiind reprezentat de polizaharide sau polipeptide, în funcţie de specie.

Funcţia biologică a capsulei este de a proteja celula bacteriană faţă de acţiunea unor factori nocivi. In cazul speciilor patogene, capsula are un rol important în evitarea procesului de fagocitoză, constituind un important factor de agresivitate. Inafara organismului, prin conţinutul crescut de apă, capsula protejează bacteriile de efectele desicaţiei.

CONŢINUTUL

Conţinutul celulei bacteriene se compune din citoplasmă şi genom

bacterian. Citoplasma

Citoplasma celulei bacteriene are consistenţă de gel, nu prezintă curenţi

citoplasmatici şi în consecinţă, nici deplasări evidente ale elementelor componente.

La celulele tinere şi în condiţii normale de dezvoltare, citoplasma aderă la membrană şi se prezintă ca o masă densă, omogenă şi intens colorabilă. La celulele îmbătrânite, citoplasma îşi pierde treptat afinitatea tinctorială, se retractează centripet şi capătă o structură granulară cu numeroase vacuole .

Citoplasma reprezintă sediul materialului genetic şi al unor structuri cu caracter de granule, incluzii şi vacuole. Spre deosebire de celulele eucariote, in citoplasma celulelor bacteriene lipsesc mitocondriile, aparatul Golgi şi reticulul endoplasmatic propriu-zis.

Ribozomii sau granulele lui Palade reprezintă elementele de bază ale citoplasmei, în care apar ca mici granule relativ sferice, cu un diametru de 10-20 nanometri, numărul lor fiind de ordinul zecilor de mii.

Din punct de vedere chimic, ribozomii sunt alcătuiţi din acid ribonucleic (65%) şi proteine (30-35%).

Sub raport funcţional, ribozomii constituie sediul sintezei proteinelor structurale şi enzimatice, pe baza informaţiei genetice preluate de la ADN prin intermediul ARN-ului mesager.

Activitatea ribozomilor bacterieni poate fi inhibată de unele antibiotice cum sunt streptomicina, neomicina şi tetraciclinele. La organismele eucariote, ribozomii sunt insensibili faţă de antibiotice, fapt care permite utilizarea acestora în terapia bolilor infecţioase, fără afectarea organismului.

Incluziile sunt structuri inerte, prezente inconstant în citoplasma bacteriilor. Ele reprezintă materiale de rezervă care se acumulează în celulă direct

35

proporţional cu vârsta şi conţinutul mediului în substanţe nutritive. Din punct de vedere chimic, incluziile sunt formate din polimeri organici (amidon, glicogen, acid poli-β-hidroxibutiric), cristale de substanţe anorganice (sulf, carbonat de calciu) şi polimeri anorganici.

Cromatoforii, prezenţi la bacteriile fotosintetizante, sunt organite specializate în procesele de biosinteză prin mecanisme analoage fotosintezei plantelor.

Vacuolele sunt variabile ca mărime (0,3 – 0,5 µm) şi număr (6-20/celulă), fiind mai frecvent întâlnite la celulele tinere. Ele pot conţine lichide cu rol în reglarea presiunii osmotice, sau gaze. Vacuolele cu gaze sunt prezente în citoplasma unor bacterii din sol, capabile să capteze azotul atmosferic şi la bacteriile acvatice aerobe pe care le antrenează la suprafaţa apei, asigurându-le contactul cu oxigenul atmosferic.

In citoplasma celulelor bacteriene se găseşte cea mai importantă parte din echipamentul enzimatic răspunzător de metabolismul celulei, precum şi diferite tipuri de ARN (mesager, ribozomal şi solubil).

Pigmenţii sunt substanţe colorate prezente în citoplasma bacteriilor cromogene. Speciile patogene pentru om şi animale, producătoare de pigmenţi sunt: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus equi, Mycobacterium tuberculosis..

Semnificaţia biologică a pigmenţilor bacterieni diferă în funcţie de natura chimică a pigmentului, fără a fi complet elucidată.

Rolul clorofilelor în fotosinteză este bine stabilit, însă asupra funcţiei celorlalţi pigmenţi, părerile emise au valoare ipotetică.

În practica identificării bacteriilor, prezenţa pigmenţilor este un criteriu taxonomic valoros şi uşor decelabil.

Citoplasma constituie sediul metabolismului bacterian unde se desfăşoară procesele de asimilaţie şi dezasimilaţie, precum şi alte funcţii vitale ale celulei bacteriene cum sunt reproducerea şi sporogeneza.

Materialul genetic

Materialul genetic al bacteriilor este constituit din material genetic nuclear şi din plasmide .

Materialul genetic nuclear este format dintr-un singur cromozom şi nu este delimitat de o membrană proprie. Pentru a marca aceste diferenţe faţă de nucleul celulelor eucariote, termenul de ,,nucleu” a fost înlocuit cu termenii de ,,nucleoid”, ,,genom bacterian”, ,,cromozom bacterian” sau ,,nucleozom”.

Cromozomul este constituit dintr-o macromoleculă de ADN bicatenar care conţine 4 . 106 perechi de nucleotide şi are o lungime de aproximativ 1 mm. Macromolecula de ADN se află însă într-o stare compactă, condensată, prin pliere şi superspiralare, astfel încât ocupă doar 5-16% din volumul celulei.

Nucleoidul are o formă asemănătoare cu a celulei bacteriene: sferică în cazul cocilor şi alungită în cazul bacililor. Pe lângă AND, cromozomul bacterian mai conţine cantităţi reduse de proteine, lipide şi ARN.

36

Plasmidele sunt molecule mici de ADN dublu catenar, independente de cromozom, caracteristice pentru celula procariotă. Pentru desemnarea lor se utilizează deseori termenii de material genetic auxiliar sau extracromozomal.

Plasmidele reprezintă aproximativ 1% din mărimea şi masa moleculară a cromozomului şi sunt, în majoritatea lor, transferabile de la o celulă bacteriană la alta în cadrul fenomenului de conjugare.

Atât cromozomul cât şi plasmidele au posibilitatea de autoreplicare. Replicarea plasmidelor are loc independent de cea a cromozomului.

Funcţia biologică a materialului genetic constă în determinarea caracterelor care definesc fiecare specie bacteriană şi transmiterea lor ereditară. Având în vedere posibilitatea de transfer a plasmidelor, se poate aprecia că ele au un rol major în procesul de circulaţie a informaţiei genetice în cadrul populaţiilor bacteriene, care are ca rezultat o mai bună adaptare a acestora la condiţiile de mediu.

ORGANITELE CELULARE

Organitele celulare (cilii sau flagelii şi pilii sau fimbriile) sunt formaţiuni

extraparietale, prezente numai la unele specii bacteriene, cu rol în procesele de adaptare la mediu.

Cilii (flagelii )

Cilii sunt organite de formă cilindrică, cu diametrul de 12-25 nanometri şi

lungimea de 25-30 micrometri, întâlnite mai ales la bacteriile alungite – bacili, vibrioni, spirili – şi mai rar la formele cocoide. Au rol în mişcare, bacteriile ciliate fiind mobile.

Intre speciile bacteriene ciliate există diferenţe sub aspectul numărului şi al modului de dispunere a cililor pe suprafaţa celulei bacteriene, distingându-se următoarele categorii de bacterii: atricha (neciliate), monotricha (un singur cil dispus polar), amfitricha (câte un cil la ambii poli), lofotricha (un smoc de cili la unul din poli) şi peritricha (numeroşi cili amplasaţi pe toată suprafaţa celulei) – fig. 11.

Fig. 11. Numărul şi modalităţile de dispunere a cililor pe suprafaţa celulei bacteriene: 1. atricha; 2, 3. monotricha;4.amfiticha; 5. lofotricha; 6. peritricha.

Cu ajutorul cililor, bacteriile se pot deplasa cu viteza de 20-80 micrometri

pe secundă, echivalând cu de 40 de ori lungimea celulei bacteriene. Pentru

37

comparaţie, menţionăm faptul că ghepardul, considerat cel mai rapid dintre animale, aleargă cu o viteză care nu depăşeşte de trei ori lungimea corpului pe secundă.

Bacteriile realizează o mişcare de rostogolire când cilii se rotesc în sensul acelor de ceasornic şi o deplasare în linie dreaptă când aceştia se rotesc în sens antiorar. In determinarea direcţiei de deplasare intervin mecanismele de tip chimiotactic. Substanţele utile metabolismului bacterian (glucidele, aminoacizii, ionii de calciu şi de magneziu, oxigenul pentru bacteriile aerobe ,etc) sunt atractante, exercitând un chimiotactism pozitiv asupra bacteriilor ciliate, iar cele nocive (alcoolii, ionii de hidrogen, ionii hidroxil, metalele grele, etc.) au un efect repelant (de respingere) printr-un chimiotactism negativ.

Analog capsulogenezei, sinteza cililor este dirijată de factori genetici a căror represare şi depresare este realizată de factorii mediului ambiant. Factorii de mediu capabili să inducă variaţii fenotipice în geneza şi motilitatea cililor sunt temperatura şi diverse substanţe chimice. Astfel, Yersinia enterocolitica şi Listeria monocytogenes sunt mobile numai la 20-22 ºC (nu şi la 37ºC), serurile hiperimune specifice inhibă mobilitatea salmonelelor şi a altor specii ciliate, iar acidul boric şi sulfatiazolul inhibă mobilitatea speciei Proteus vulgaris.

Pilii (fimbriile)

Pilii sunt apendici filamentoşi mult mai subţiri şi mai scurţi decât cilii dar mult mai numeroşi, aşezaţi peritrich pe suprafaţa bacteriilor şi vizibili numai la microscopul electronic. Denumirile prin care sunt desemnate aceste structuri sugerează caracteristicile lor morfologice: fimbrii (lat. fimbria = franjuri), pili (lat. pilus = păr).

In funcţie de unele caractere morfologice, de număr şi de funcţia biologică pe care o îndeplinesc, se deosebesc 6 tipuri de pili, notate cu cifre romane de la I la V şi cu litera F (pilul sexual sau donor).

In ultimii ani există tendinţa de a departaja, din punct de vedere semantic, cei doi termeni - ,,fimbrii” şi ,,pili” - în sensul utilizării primului pentru desemnarea tipurilor I-V şi a celui de-al doilea, numai pentru pilii de sex.

Fimbriile sunt formaţiuni tubulare compacte, fără canal axial, cu dimensiuni cuprinse între 1-20 µm lungime şi 3-14 nm diametru. Ele sunt dispuse pericelular, uneori polar sau bipolar, numărul lor variind între 1 şi 1000 per celulă.

Fimbriile conferă bacteriilor capacitatea de a adera la suprafaţa epiteliilor şi a altor substraturi, fiind considerate factori de patogenitate. Pilii de tip F, denumiţi şi pili sexuali, sunt structuri tubulare străbătute de canal axial, în structura cărora intră o fosfoglicoproteină (pilina), ale cărei molecule sunt ansamblate după o simetrie helicoidală. Ei sunt codificaţi de o plasmidă numit factorul ,,F” (de fertilitate sau de sex), care conferă celulei purtătoare proprietatea de donor de material genetic sau celulă - mascul F+.

Rolul pililor ,,F” este analog organului copulator, deoarece prin lumenul lor are loc transferul de ADN de la o celulă bacteriană F+ la una F- în cadrul procesului de conjugare - o formă primitivă de sexualitate, singura posibilă la bacterii.

38

3.3.2. FIZIOLOGIA BACTERIILOR

3.3.2.1. COMPOZIŢIA CHIMICĂ A CELULEI BACTERIENE

Compoziţia chimică elementară a bacteriilor, sub aspectul conţinutului în elemente biogene, nu diferă de a celorlalte organisme vii.

Compoziţia moleculară se diferenţiază însă de cea a organismelor vegetale şi animale prin prezenţa unor constituenţi moleculari specifici bacteriilor.

O celulă bacteriană conţine aproximativ 3000-6000 tipuri de molecule diferite, dintre care aproximativ jumătate aparţin compuşilor anorganici cu masă moleculară mică (apa şi sărurile minerale), iar cealaltă jumătate, compuşilor organici cu diverse grade de complexitate structurală.

3.3.2.1.1. Compuşii anorganici

Apa reprezintă aproximativ 75-80 % din greutatea umedă a celulei bacteriene, în care se găseşte sub formă liberă sau legată inseparabil de alte structuri chimice.

Ea constituie mediul care asigură vehicularea substanţelor nutritive şi a metaboliţilor, precum şi desfăşurarea reacţiilor chimice care stau la baza proceselor vitale.

Sărurile minerale reprezintă 2 – 30% din greutatea bacteriilor uscate. Elementele care intră în compoziţia lor sunt : P, K, Na, Cl, S, O, H, Fe şi

în proporţii mai reduse, Mg, Cu, şi Zn. Sărurile minerale îndeplinesc următoarele funcţii biologice: - asigură reglarea presiunii osmotice la nivelul membranei citoplasmatice ; - realizează sistemul tampon adecvat menţinerii pH-ului optim al mediului

celular; - activează unele sisteme enzimatice, rol pe care îl îndeplinesc mai ales

ionii de Cu şi de Mg ; - intră în structura unui important număr de constituienţi celulari (rol

plastic).

3.3.2.1.2. Compuşii organici

Glucidele totalizează 4 – 25% din greutatea celulelor bacteriene uscate, proporţia lor variind în funcţie de specia bacteriană, vârsta culturii şi compoziţia chimică a substratului nutritiv. Ele au rol plastic, energetic sau de material de rezervă.

Lipidele, prezente în celula bacteriană în proporţie de 1 – 20 % din greutatea uscată a bacteriilor, pot fi din punct de vedere chimic, gliceride, fosfatide, steride şi ceruri. Alături de glucide, lipidele constituie rezervele nutritive ale celulei bacteriene cu un potenţial energetic crescut.

Acizii nucleici . Spre deosebire de virusuri, care conţin un singur tip de acid nucleic, în celula bacteriană sunt prezenţi ambii acizi nucleici.

Acidul dezoxiribonucleic (ADN) reprezintă aproximativ 1/5 din conţinutul celulei, fiind constituientul nucleoidului, respectiv al cromozomului bacterian şi al plasmidelor.

39

Acidul ribonucleic (ARN), se găseşte în citoplasmă sub cele trei forme diferite sub aspectul mărimii moleculei şi al funcţiei biologice pe care o îndeplinesc în mecanismul sintezei proteinelor: ARN mesager, ARN de transport sau solubil şi ARN ribozomal.

ARN-ul total constituie 10 – 20 % din greutatea uscată a celulei. Proteinele reprezintă aproximativ 60% din greutatea uscată a bacteriilor şi

constituie componentele esenţiale pentru viaţa celulei bacteriene. Ele se găsesc atât în stare pură cât şi sub formă de complexe lipo- sau glicoproteice.

Din punct de vedere al rolului pe care îl îndeplinesc, proteinele bacteriene pot fi grupate în :

- proteine constitutive, care fac parte din structura diferitelor componente celulare, şi

- proteine enzimatice (enzimele), care constituie biocatalizatorii întregii activităţi metabolice a celulei bacteriene. Enzimele constituie, în ansamblul lor, aparatul sau echipamentul enzimatic al celulei bacteriene. El este caracteristic pentru fiecare specie bacteriană şi reprezintă, prin urmare, un important criteriu taxonomic. Punerea în evidenţă a enzimelor bacteriene prin reacţii sau teste biochimice face parte din conduita curentă a identificării bacteriilor.

3.3.2.2. NUTRIŢIA LA BACTERII

Microorganismele, ca şi celelalte organisme vii, sunt caracterizate printr-o activitate fiziologică neîntreruptă, mai mult sau mai puţin intensă, în cursul căreia cresc, se divid ,îşi modifică structura, compoziţia chimică şi poziţia în mediu, etc.

Exercitarea acestor activităţi presupune prezenţa în mediile lor de viaţă a unor substanţe nutritive utilizabile în sinteza constituienţilor celulari (surse plastice) şi a unor surse de energie .

Exigenţe şi tipuri nutritive la bacterii

Posibilităţile bacteriilor de a folosi diverse surse plastice şi energetice sunt

extrem de variate. Considerate în ansamblu, microorganismele sunt cele mai omnivore organisme cunoscute, deoarece îşi realizează metabolismul folosind cele mai diverse surse de substanţe nutritive : de la N molecular, CO2 şi S, până la substanţele organice complexe.

In raport cu sursa de energia pe care o utilizează în procesul de nutriţie, bacteriile se încadrează în două tipuri principale :

- tipul fototrof care utilizează energia luminoasă transformând-o în energie de legare chimică cu ajutorul unor pigmenţi asemănători clorofilei;

- tipul chimiotrof, lipsit de pigmenţi fotosintetizanţi, pentru care unica sursă de energie o reprezintă reacţiile biochimice de oxidoreducere.

40

Pe baza capacităţii de a utiliza substanţele anorganice şi organice ca surse de material de sinteză şi energie se diferenţiază :

- tipul litotrof ( lith = piatră ) sau autotrof ( în sensul de independent , liber) căruia îi aparţin bacteriile capabile să-şi sintetizeze toţi constituenţii celulari pornind de la surse simple anorganice de C şi de N ca : CO2 , NH3, NO2, NO3, etc.;

- tipul organotrof sau heterotrof în care se încadrează bacteriile dependente de materia organică, care nu se pot dezvolta decât în prezenţa substanţelor organice ca surse de energie, C şi N . Deci, în timp ce autotrofele prin sintezele lor generează substanţe organice, heterotrofele le descompun.

Ansamblând cele două criterii, bacteriile fototrofe pot fi împărţite în fotoautotrofe ( fotolitotrofe ) şi fotoorganotrofe ( fotoheterotrofe ), iar bacteriile chimiotrofe se pot clasifica , de asemenea, în chimioautotrofe ( chimiolitotrofe ) şi chimioorganotrofe ( chimioheterotrofe ). In rândul bacteriilor chimiotrofe se pot însă diferenţia tipuri intermediare capabile să utilizeze atât compuşi organici cât şi anorganici. Astfel, există bacterii capabile să utilizeze carbonul organic sau anorganic şi azotul anorganic constituind un subtip numit mezotrof. Altele pot metaboliza carbonul organic şi azotul anorganic fiind încadrate în subtipul prototrof.

Deoarece bacteriile autotrofe nu interesează bacteriologia medicală şi medical-veterinară, în continuare vor fi menţionate numai sursele de substanţe organice pentru cele mai importante elemente biogene necesare bacteriilor chimioheterotrofe, categorie în care se încadrează majoritatea bacteriilor patogene.

Principala sursă de carbon pentru aceste bacterii o reprezintă glucidele şi polialcoolii şi într-o proporţie mai redusă diferiţi acizi organici, cetonele, lipidele, acizii graşi, etc. Sursele de azot organic sunt reprezentate în primul rând de aminoacizi, urmaţi în cazul a numeroase specii, de alte substanţe cu azot diferite ca grad de complexitate: uree, peptone, proteine . Unele bacterii patogene pot folosi şi surse de azot anorganic, cum este amoniacul rezultat din hidroliza ureei sau din reducerea nitraţilor în nitriţi şi a nitriţilor în amoniac.

Inafară de carbon şi azot, toate bacteriile au nevoie de macroelemente (P, S,, O, H, K, Mg, Fe, Ca,Mn, etc. ) şi microelemente ( Cu, Zn, Mo, etc.), acestea din urmă fiind indispensabile activităţii catalitice a unor enzime.

3.3.2.3. METABOLISMUL BACTERIAN

Prin analogie cu celula vegetală şi animală, metabolismul bacterian implică totalitatea reacţiilor biochimice catalizate enzimatic care permit bacteriilor să obţină din nutrienţi, atât compuşi necesari pentru sinteza constituienţilor celulari, cât şi energia necesară pentru aceste sinteze şi pentru alte activităţi care necesită consum de energie. Activitatea metabolică a bacteriilor poate fi diferenţiată în metabolism energetic care include catabolismul şi respiraţia şi metabolism de sinteză sau anabolism.

41

3.3.2.3. 1. Catabolismul

Substraturile exogene care pot constitui surse energetice şi plastice pentru bacteriile heterotrofe sunt reprezentate în majoritatea cazurilor de compuşi organici cu structură complexă : proteine, glucide, lipide. Eliberarea energiei prin procesele de catabolism se realizează treptat, în trei faze distincte.

Faza I . Macromoleculele sunt dezansamblate în unităţile lor de construcţie:

proteinele în aminoacizi, polizaharidele în monozaharide, iar lipidele în glicerol şi acizi graşi. In această primă fază se eliberează de obicei mai puţin de 1% din energia totală a macromoleculelor care se pierde în bună parte sub formă de căldură.

Faza II. Aminoacizii, monozaharidele şi acizii graşi rezultaţi în prima etapă suferă

o degradare incompletă cu formarea de produşi intermediari - amoniac, acid piruvic, acizi graşi inferiori, etc.- bioxid de carbon şi apă. Energia eliberată reprezintă aproximativ o treime din energia totală a substraturilor iniţiale.

In această fază, hexozele pot fi metabolizate pe căi diferite - calea glicolizei, calea Entner-Doudoroff sau calea hexozomonofosfatului - dar produşii finali nu sunt foarte diferiţi. In mod similar, aminoacizii pot fi catabolizaţi pe căi diferite , dar, indiferent de calea utilizată, rezultatul constă în formarea de acetil-Co A sau de intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici ( ciclul Krebs ) .

Faza III In cursul acestei faze, produşii intermediari sunt descompuşi în CO2 şi

H2O pe calea acizilor tricarboxilici, rezultând, de regulă, cantitatea maximă de energie. Nu toate substraturile ajung însă la această ultimă fază. In multe cazuri, degradarea se opreşte la produşii intermediari care sunt deseori preluaţi sub formă de precursori şi introduşi în filiera reacţiilor anabolice sub acţiunea enzimelor biosintetizante.

Pentru produşii finali rezultaţi din activitatea catabolică, celula bacteriană dispune de multiple căi de utilizare, şi anume :

-hidrogenul rezultat din procesele de oxidare este introdus în circuitul respirator pentru reacţiile de reducere cu cedare către alţi acceptori.

-oxigenul rezultat în urma reacţiilor de reducere este valorificat în procesele de oxidare;

-energia rezultată în diferitele etape ale degradării catabolice este utilizată în procesele endergonice (consumatoare de energie) ale biosintezelor celulare.

3.3.2.3. 2. Respiraţia

Bacteriile, ca toate celelalte vieţuitoare, respiră, ceea ce în sensul obişnuit al cuvântului înseamnă că ele consumă oxigen pentru a produce cu ajutorul lui reacţii chimice exoterme eliberatoare de energie. Pasteur a observat cel dintâi că unele specii bacteriene trăiesc şi se înmulţesc în absenţa oxigenului mai bine chiar decât în prezenţa lui, deci respiră fără oxigen. Această constatare, pe lângă altele, a dus la o lărgire a conţinutului noţiunii de respiraţie, în sensul că se numeşte

42

proces respirator orice reacţie chimică eliberatoare de energie care se petrece in vivo în prezenţa sau în absenţa oxigenului.

Bacteriile chimiotrofe îşi procură cea mai importantă parte a energiei prin procesul de respiraţie celulară care constă într-o succesiune de reacţii de oxido-reducere biologică ce pot avea loc în aerobioză sau anaerobioză*.

Prin oxido-reducere biologică se înţelege pierderea atomilor de H ( e¯ şi H +) din molecula unei substanţe chimice ( S ) care se oxidează eliberând energie şi transferul lor către o substanţă acceptoare ( A ) care se reduce, conform ecuaţiei:

SH2 + A< => S + AH2 + energie Respiraţia la bacterii se rezumă în esenţă, la preluarea hidrogenului rezultat

din reacţiile catabolice prin intermediul unor enzime numite dehidrogenaze şi cedarea lui către un acceptor final care poate fi oxigenul sau altă substanţă.

După natura acceptorului final de electroni de H, respiraţia bacteriană este de trei tipuri :

- respiraţia aerobă ( oxibiotică ), un proces de de oxidare completă a substraturilor cu ajutorul oxigenului molecular ca acceptor final de H şi eliberarea unei cantităţi mari de energie ;

- respiraţia anaerobă ( anoxibiotică ) în care acceptorul final de H poate fi orice substanţă anorganică, exceptând oxigenul;

- fermentaţia , un proces de oxido-reducere biologică care are loc în condiţii de anaerobioză sau în prezenţa oxigenului dar fără intervenţia lui şi în care energia este obţinută prin utilizarea compuşilor organici atât ca donatori cât şi ca acceptori de electroni. Spre deosebire de respiraţia aerobă, în cursul fermentaţiei se eliberează o mică parte din energia conţinută în substrat, rezultând numeroşi produşi de degradare parţială. Aceştia variază foarte mult în raport cu substratul şi calea metabolică * * .

Deoarece eliberarea bruscă a energiei din substraturile oxidate - într-o singură treaptă ( aşa cum arată reacţia de mai sus ) - ar fi dăunătoare pentru celulă, transferul hidrogenului către acceptor se realizează în mai multe etape, cu participarea unui întreg arsenal de enzime respiratorii care servesc ca acceptori tranzitorii de hidrogen. Ele se reduc şi se oxidează succesiv prin preluarea şi respectiv cedarea hidrogenului de la una la alta către acceptorul final, constituind sistemul transportor de electroni sau catena de respiraţie celulară .

3.3.2.3.3. Anabolismul

Anabolismul constă în secvenţe de reacţii enzimatice, desfăşurate în trepte, prin care se efectuează sinteza constituienţilor celulari pornind de la precursori reprezentaţi de produşii intermediari ai catabolismului sau de substanţele preluate din mediu.

Ca şi procesele de catabolism, reacţiile de biosinteză se realizează tot în trei faze care se succed în sens invers :

- producerea de subunităţi care vor intra în componenţa macromoleculelor specifice fiecărui constituient celular;

43

- activarea subunităţilor cu ajutorul energiei eliberate prin descompunerea compuşilor macroergici de tip ATP ( adenozin-trifosfat ) în care a fost stocată pe parcursul degradării diferiţilor compuşi ;

- formarea de macromolecule prin polimerizarea sau condensarea subunităţilor activate.

Totuşi, căile catabolice şi anabolice pentru un anumit substrat nu sunt complet reversibile. Astfel, reacţiile anabolice au ca punct de plecare, de cele mai multe ori, compuşi intermediari foarte diferiţi de cei care rezultă din catabolismul compusului respectiv iar enzimele implicate sunt parţial diferite . De exemplu, catabolismul serinei duce la formarea de piruvat, în timp ce sinteza ei începe de la 3-fosfoglicerat; histidina este catabolizată la α-cetoglutarat, iar sinteza ei este iniţiată de la ribozo-5-fosfat; degradarea glicogenului la acid lactic este catalizată de 12 enzime, dintre care numai 9 catalizează reacţii reversibile .

3.3.2.4. CRESTEREA SI MULTIPLICAREA BACTERIILOR

3.3.2.4.1 Creşterea bacteriilor

Celula bacteriană creşte pe seama depunerii de substanţă celulară rezultată din metabolismul de biosinteză şi a sporirii conţinutului în apă. Creşterea se poate realiza uni- sau multidimensional, în funcţie de locul şi modalitatea de dispunere a substanţei nou elaborate.

După L a m a n n a ( cit. de Z a r n e a , 1984 ), există următoarele posibilităţi teoretice de creştere a celulei bacteriene:

- creşterea la una din extremităţi ; - creştera la ambele extremităţi ; - creşterea în vecinătatea constituirii viitorului sept de diviziune ; -creşterea prin intususcepţiune (depunerea de substanţă nouă diseminat şi

intercalat printre constituienţii celulari preexistenţi ); - creştere prin depunerea materialului nou în zona periferică a celulei

(limitrof învelişului). In cursul creşterii celulei bacteriene, raportul suprafaţă / volum se

micşorează treptat datorită faptului că în timp ce suprafaţa bacteriilor creşte cu o raţie pătratică, volumul lor se măreşte cu o raţie cubică. Ori, activitatea normală a bacteriilor este condiţionată de existenţa unui raport optim între volumul celulei, care consumă şi suprafaţa ei, prin care se face absorbţia substanţelor nutritive şi eliminarea cataboliţilor. In consecinţă, pe parcursul creşterii, aportul de substanţe nutritive din mediu satisface din ce în ce mai puţin exigenţele metabolice ale celulei iar echilibrul ei chimic se alterează deoarece circulaţia substanţelor prin difuzie în ambele sensuri devine mai dificilă. Din cauza acestor perturbări, atunci când disproporţia dintre suprafaţă şi volum atinge un anumit punct critic, raportul lor adecvat se restabileşte prin diviziunea celulei. Astfel, diviziunea celulară este prin ea însăşi o formă necesară de reglare a activităţii celulei bacteriene.

44

3.3.2.4.2. Multiplicarea bacteriilor

Spre deosebire de organismele pluricelulare, la care multiplicarea celulelor duce la mărirea taliei individului, la bacterii şi la toate celelalte organisme unicelulare, ea are ca rezultat creşterea numărului de indivizi şi implicit a populaţiei respective.

Majoritatea speciilor bacteriene se multiplică prin diviziune directă (diviziune simplă, sciziparitate ) iar un număr redus de grupuri taxonomice se poate multiplica pe alte căi : prin corpi elementari, ramificare , înmugurire, spori.

Multiplicarea prin diviziune directă constă în scindarea unei celule bacteriene care a atins punctul critic de creştere în două celule-fiice, cel mai frecvent identice. La bacteriile de formă alungită ( bacili, spirochete ), diviziunea se face transversal după un plan perpendicular pe marele ax al celulei, în centrul acesteia şi rareori excentric. La coci, diviziunea se poate realiza după unul, două sau trei planuri perpendiculare succesive.

In urma diviziunii, celulele rezultate se pot separa sau, la numeroase specii, pot să rămână unite una sau mai multe generaţii realizând grupări caracteristice cu valoare taxonomică.

Diviziunea celulei bacteriene este precedată şi iniţiată de replicarea semiconservativă a AND-ului cromozomial, în momentul în care corpii nucleari nou formaţi sunt disponibili pentru segregare, astfel încât cele două celule –surori să fie înzestrate cu o copie exactă a genomului celulei parentale

Multiplicarea prin corpi elementari a fost descrisă la chlamidii, la care, pe lângă diviziunea directă, există posibilitatea desfăşurării unui ciclu vital. Punctul de plecare al acestui ciclu este reprezentat de structuri mici corpusculare, electronoopace, cu un diametru de aproximativ de 0,2 – 0,5 micrometri, numite corpi elementari. In celula gazdă, fiecare corp elementar creşte transformându-se în corp iniţial sau reticulat, ajungând la 0,8 – 1,5 micrometri. In continuare, corpii reticulaţi se multiplică prin diviziune iar celulele-fiice se reorganizează în sensul transformării lor în corpi elementari.

Multiplicarea prin ramificare, înmugurire şi spori - proprie ciupercilor microscopice ( miceţi filamentoşi şi levuri ) – este întâlnită doar la actinomicete şi unele bacterii fotosintetizante.

3.3.2.4.2.1 Dinamica multiplicării bacteriilor

Deoarece examinarea directă a bacteriilor în diferite medii naturale este foarte dificilă, se cunosc puţine date referitoare la multiplicarea populaţiilor bacteriene în natură (Z a r n e a, 1994).

Cultivarea bacteriilor în laborator a permis însă un studiu detaliat al dinamicii procesului de multiplicare în condiţii experimentale şi al relaţiilor dintre multiplicare şi factorii de mediu.

S-a constatat astfel că o cultură bacteriană prezintă în cursul existenţei sale patru faze, distincte prin viteza de multiplicare a germenilor şi prin numărul de celule vii pe unitatea de volum.

45

Aceste faze sunt: faza iniţială de adaptare ,de latenţă sau de lag1, faza de multiplicare exponenţială sau logaritmică, faza staţionară şi faza de declin. Multiplicarea în mediile lichide

Faza de latenţă este cuprinsă între momentul introducerii celulelor bacteriene în mediu, prin însămânţare sau transplantare şi momentul când ele încep să se multiplice (în medie, 2 ore), perioadă în care cultura nu este vizibilă macroscopic.

Faza de multiplicare exponenţială sau logaritmică se caracterizează prin multiplicarea celulelor bacteriene, la debut cu o viteză progresiv mărită, apoi într-un ritm constant şi caracteristic pentru fiecare specie bacterian. La majoritatea bacteriilor patogene, în condiţii optime , diviziunile se succed la intervale de 20-30 de minute, timp care reprezintă vârsta unei generaţii şi care este urmat de dublarea populaţiei bacteriene.

Durata fazei de multiplicare logaritmică este în medie de 6-24 de ore Faza staţionară urmează unei scurte perioade (aproximativ 2 ore) în care

multiplicarea nu se mai produce în progresie geometrică ci într-un ritm care scade progresiv. Incetinirea multiplicării este determinată de modificarea mediului de cultură ( scăderea concentraţiei nutrienţilor, acumularea metaboliţilor toxici în concentraţii inhibitorii, reducerea conţinutului în oxigen , etc. ), dar mai ales de realizarea unei concentraţii maxime de celule bacteriene pe unitatea de volum (3×107 - 3×109 pe ml ).

O dovadă a faptului că principala cauză este o problemă de spaţiu, o constituie multiplicarea de înlocuire care caracterizează această perioadă, în care rata de creştere a populaţiei bacteriene este nulă. Practic, diviziunile continuă numai în limita disponibilităţilor de spaţiu create prin moartea unor celule.

Această fază durează de la câteva ore până la 7-8 zile, în funcţie de specie. Faza de declin se caracterizează prin absenţa diviziunilor şi moartea

logaritmică a celulelor bacteriene până la sterilizarea mediului. Cauzele care duc la moartea bacteriilor sunt multiple şi sunt legate în special de epuizarea substanţe nutritive, diminuarea rezervelor respiratorii şi acţiunea toxică exercitată de cataboliţii acumulaţi în mediu .

Uneori un număr mic de bacterii poate supravieţui câteva săptămâni sau luni pe seama substanţelor nutritive eliberate prin autoliza celulelor moarte. Fenomenul este cunoscut sub denumirile de reluarea creşterii, creştere criptică sau canibalism. S-a estimat că pentru un supravieţuitor sunt necesare substanţele provenite de la aproximativ 50 de celule moarte ( G r e c i a n u A., 1986 ).

In faza de declin, bacteriile prezintă un polimorfism accentuat determinat de prezenţa celulelor îmbătrânite, cu forme atipice ( celule sferice, mici sau gigante, deformate, filamentoase, ramificate, etc. ) şi cu afinitate tinctorială scăzută. Evitarea erorilor generate de aceste modificări reclamă efectuarea examenelor pentru încadrarea taxonomică, testarea patogenităţii, testarea sensibilităţii bacteriilor ş.a., numai pe culturi în faza exponenţială.

1 (engl. to lag =a întârzia, a rămâne în urmă)

46

Multiplicarea bacteriilor pe mediile solide Particularităţile multiplicării pe mediile solide se datorează în primul rând

absenţei mişcărilor browniene care asigură dispersarea bacteriilor în masa mediilor lichide şi accesul nediscriminatoriu al celulelor la resursele nutritive. Prin urmare, atât pe suprafaţa cât şi în profunzimea mediilor solide, în urma multiplicării rezultă aglomerări de milioane de bacterii care, în funcţie de abundenţa inoculului şi activitatea aparatului ciliar, pot îmbrăca macroscopic două forme : colonia izolată şi gazonul bacterian.

Colonia reprezintă o masă compactă de celule rezultate, de regulă, din multiplicarea unei singure celule bacteriene.

După declanşarea fazei logaritmice, diviziunile se distanţează treptat pe măsură ce colonia creşte, deoarece între celulele bacteriene care o compun se creează diferenţe privind posibilităţile de acces la substanţele nutritive din mediu sau la oxigen ( în cazul speciilor aerobe ) în funcţie de poziţia lor: limitrofă mediului sau în centrul coloniei. Celulele de la periferia coloniilor, deoarece beneficiază de un aport optim de oxigen şi de nutrienţi, se multiplică activ în timp ce bacteriile din centrul coloniei pot fi moarte.

Dezvoltare unei colonii bacteriene este condiţionată nu numai de interacţiunile celulelor individuale ci şi de influenţa coloniilor vecine; cu cât coloniile sunt mai numeroase şi mai dese, cu atât sunt mai mici, din cauză că se jenează reciproc prin eliminarea de metaboliţi toxici şi prin diminuarea concentraţiei nutrienţilor. Gazonul reprezintă cultura care rezultă prin confluarea coloniilor în cazul unui inocul abundent, sau prin invazia mediului de către bacteriile ciliate peritrich,- fenomen numit roire sau căţărare.

ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE 1. Care sunt formele de existenţă a bacteriilor în natură? 2. Ce semnificaţie are conceptul de specie bacteriană? 3. Ce forme pot avea bacteriile şi cum se grupeză celulele bacteriene la unele specii? 4. Între ce limite variază dimensiunile celulelor bacteriene? 5. Care sunt părţile componente ale celulei bacteriene? 6. Care sunt structura şi funcţiile membranei citoplasmatice? 7. Ce elemente morfochimice ale peretelui celular condiţionează modul de

colorare a bacteriilor prin metodele Gram şI Ziehl-Neelsen? 8. Care este semnificaţia biologică (rolul) peretelui celular? 9. Ce rol îndeplineşte capsula bacteriană ? 10. Ce structuri conţine citoplasma celulei bacteriene şi care este rolul lor? 11. Din ce se compune materialul genetic al bacteriilor? 12. Ce sunt cilii (flagelii) bacterieni şi ce rol îndeplinesc? 13. Ce sunt pilii bacterieni, de câte feluri sunt şi care este semnificaţia lor

biologică? 14. Câte tipuri de bacterii există în raport cu sursa de energie şi de carbon pe care

le utilizează? 15. În ce constau catabolismul, respiraţia şi anabolismul la bacterii? 16. Pe ce cale se multiplică majoritatea speciilor bacteriene? 17. Care sunt fazele multiplicării bacteriilor în mediile de cultură şi

particularităţile generate de starea de agregare a mediului (lichidă, solidă)? 18. Care sunt mecanismele patogenităţii la bacterii?

47

CAPITOLUL 4

MICOLOGIE GENERALĂ

Micologia este ştiinţa care se ocupă cu studiul ciupercilor microscopice - un grup heterogen de microorganisme cu răspândire ubicvitară. Ciupercile microscopice (micromiceţii, fungii, mucegaiurile) au un tip de organizare eucariot, sunt constituite din ansambluri celulare (micelii, pseudomicelii) deseori specializate pe funcţii şi se multiplică printr-o mare diversitate de forme sexuate şi asexuate.

Se apreciază că există aproximativ 3000-4000 de genuri de miceţi cu peste 200000 de specii.

4.1. MORFOLOGIA CIUPERCILOR MICROSCOPICE

Pe baza însuşirilor morfologice şi fiziologice, ciupercile microscopice au fost împărţite în două grupe mari: levuri (drojdii) şi fungi fi lamentoşi (mucegaiuri). Între aceste două forme distincte se plasează fungii dimorfi care, în raport de condiţiile de mediu (organism, mediu de cultură, temperatură, etc.), pot creşte fie ca levuri, fie ca fungi filamentoşi.

Indiferent de morfologie, unitatea funcţională a ciupercilor microscopice este celula, alcătuită din următoarele structuri:

- perete e xtern relativ rigid (la levuri, cu o structură mai densă spre interior şi una mai laxă la periferie), cu funcţii protectoare, în structura căruia intră substanţe proteice, polizaharide (hemiceluloză, glucan, manan, chitină), acizi organici superiori; structura şi grosimea prezintă diferenţe de la o specie la alta dar şi în funcţie de vârsta celulelor şi de condiţiile de cultivare;

- membrană citoplasmatică lipoproteică ce conţine steroli (compuşi care la bacterii sunt prezenţi numai la micoplasme);

- citoplasmă, în care se găsesc organite (mitocondrii, reticul endoplasmatic, aparat Golgi) şi structuri granulare (ribozomi, substanţe de rezervă);

- nucleu, delimitat de membrană nucleară şi alcătuit din carioplasmă, 2-4 cromozomi şi nucleol.

Levurile

Levurile au, de regulă, o organizare unicelulară asemănătoare bacteriilor. Celulele levurice au formă sferică sau ovală şi pot forma ansambluri celulare numite pseudomicelii (fig.12.).

48

Fig.12 Aspectul morfologic al levurilor cu forme

pseudomiceliene

Ciupercile filamentoase

Ciupercile filamentoase reprezintă grupul de fungi situaţi pe o treaptă filogenetică superioară levurilor, deoarece la ele apare diferenţierea ansamblurilor celulare pe principalele funcţii vitale: de nutriţie şi de reproducere.

Ele sunt constituite din filamente lungi şi subţiri numite hife, care formează în ansamblul lor un miceliu adevărat numit şi tal.

Miceliul majorităţii ciupercilor filamentoase este format din două părţi distincte morfologic şi fiziologic: aparatul vegetativ şi cel reproducător.

Aparatul veg etativ este constituit din hife ramificate care pot fi septate (caz în care ciupercile sunt numite generic septomicete) delimitând celule cilindrice, sau neseptate (caz în care ciupercile poarta denumirea de sife) ( fig.13)

Fig.13 Tipuri de micelii fungice: A- miceliu neseptat B- miceliu septat Septurile prezintă pori prin care citoplasma şi chiar nucleii trec dintr-o

celulă în alta, sub influenţa curenţilor intracitoplasmatici (Zarnea, G., 1970). Ele conferă hifelor un grad crescut de rezistenţă şi rigiditate.

Hifele neseptate sunt alcătuite dintr-o celulă unică, alungită, multinucleată (conţine uneori sute de nuclei într-o citoplasmă comună), numită sifonoplast sau aparat vegetativ cenocitic. Indiferent de tipul de miceliu (septat sau neseptat), numărul nucleilor este relativ constant pentru o anumită specie şi pentru speciile înrudite. Hifele miceliene se formează prin germinarea elementelor reproductive (vezi cap. 4.3).

Sub aspectul raportului cu mediul pe care se dezvoltă, la un miceliul se pot deosebi două porţiuni:

49

- miceliul rizoidal constituit din hife fine, ramificate şi bine implantate în mediu;

- miceliul aerian format din hife care se detaşează din sistemul rizoidal şi care sunt mai puţin ramificate şi mai rezistente.

Aparatul re producător este constituit din hife aeriene specializate pe care se formează organele de înmulţire numite în mod curent “corpi fructificanţi”, deoarece conţin spori în interiorul sau pe suprafaţa lor (endo-, respectiv ectospori).

Morfologia corpilor fructificanţi se caracterizează printr-o mare diversitate, constituind un important criteriu de diferenţiere a numeroaselor specii de fungi (criteriu taxonomic).

4.2. MODALITĂŢILE DE ÎNMULŢIRE LA CIUPERCILE MIC ROSCOPICE

Înmulţirea micromiceţilor se poate face asexuat şi sexuat. Înmulţirea as exuată se realizează prin sciziparitate (la levuri) şi prin

spori de vegetaţie apăruţi consecutiv mitozei. Sporii asexu aţi (mit otici, v egetativi, imperfecţi) iau naştere prin

transformarea în spor a unor celule constituiente ale miceliului sau pseudomiceliului şi poartă denumirea generică de talospori, sau printr-un proces de morfogeneză în interiorul sau pe suprafaţa corpilor fructificanţi. Din categoria talosporilor fac parte blastosporii, clamidosporii, artrosporii şi aleuriile, iar sporii asexuaţi derivaţi din corpii fructificanţi sunt sporangiosporii şi conidiosporii.

Blastosporii iau naştere printr-un proces de burjeonare sau înmugurire. întâlnit mai frecvent la levuri. Procesul constă în formarea unui “mugure”,

reprezentând o celulă-fiică, prin evaginarea peretelui celular al celulei-mamă. Pe celula de origine, mugurii pot fi dispuşi polar, bipolar sau multilateral. Atunci când celulele-fiice nu se transformă în spori separându-se de celula-mamă ci continuă formarea de muguri adiţionali, rezultă, în cazul levurilor, pseudomicelii arborescente.

Fig. 14 Segmentarea hifelor terminale pentru a forma artrospori (A) si modul de formare al clamidosporilor (C); B- artrospor pe cale de germinare (Zarnea G., 1970) Clamidosporii (fig.14)se formează în interiorul unor celule hifale într-un mod asemănător sporilor bacterieni (endospori). Ei au peretele îngroşat şi citoplasma condensată, fiind deosebit de rezistenţi la căldură şi uscăciune. Forma clamidosporilor este globuloasă având un diametru mult mai mare decât celelalte celule din cadrul filamentului respectiv (Ileana Nichita, 2007). Clamidosporii sunt

50

spori de rezistenţă programaţi genetic să asigure, prin structura lor, persistenţa speciei în condiţii nefavorabile, ca şi sporii bacterieni. Prin comparaţie cu aceştia, ceilalţi spori vegetativi şi sporii sexuaţi (meiotici) sunt doar spori de înmulţire deoarece nu rezistă mult timp în mediul ambiant. Ei sunt programaţi genetic să germineze rapid şi să regenereze aparatul micelian, asigurând înmulţirea ciupercilor microscopice în condiţii favorabile de mediu. Artrosporii sau oidiile se formează la mucegaiurile septate prin fragmentarea în celulele componente a unor hife vegetative terminale. Aleuriile (fig.15), sunt sporii unor ciuperci dermatofite ce se dezvoltă pe filamentul micelian, de care rămân ataşaţi; pot avea diferite mărimi (macroaleurii, microaleurii) şi diverse moduri de dispunere.

Fig.15 Corpi fructificanti la

ciuperci dermatofite:

1.Tricophyton; 2-Microsporum

Sporangiosporii sunt caracteristici fungilor neseptaţi din genurile Mucor, Absidia şi Rhizopus (fig.16). Ei se formează în interiorul unui corp fructificant cu aspect globulos numiţi sporangiu sau sporocist, rezultat prin dilatarea extremităţii unor hife fertile (sporangiofori) şi formarea unui perete transversal care realizează disjuncţia între hifă şi sporange. Uneori, filamentul sporangiofor pe care se edifică sporocistul poate prezenta o dilataţie terminală numită columelă

În interiorul sporangelui au loc mitoze repetate, după care nucleii-nou formaţi se înconjoară de o masă de citoplasmă proprie prin formarea unui perete celular, transformându-se în spori. Conidiosporii (conidiile) sunt spori externi care iau naştere pe vârful dilatat al hifei specializate numite conidiofor, printr-un proces asemănător înmuguririi, formând şiraguri.

Fig.16 Rhizopus nigricans: A-miceliu reproducator: a-sporange imatur:b-columela, c- sporange matur plin cu spori, d-sporange rupt, f-spori; B- miceliu vegetativ: g-rizoizi

51

Între hifă şi şiragurile de conidii se interpun nişte piese intermediare numite metule şi sterigme (fialide). Forma corpilor fructificanţi conidiogeni variază în funcţie de gen sau specie; la Aspergilus spp., de exemplu, au aspect de măciucă, iar la Penicillium spp., aspect de penson (fig. 17)

Fig. 17 Aspecte de micelii aeriene cu corpi fructificanti: 1-Rhizopus, 2- Aspergillus, 3-Penicillium

Înmultirea sex uată se realizează prin spori meiotici (sexuaţi, p erfecţi)

rezultaţi din fuzionarea a două celule-gameţi, cu potenţial ereditar diferit, situate pe aceeaşi hifă sau pe hife distincte dar apropiate. Cu excepţia unor particularităţi de detaliu, corelate cu nivelul evolutiv al miceţilor, procesul de fuzionare a celor două celule se realizează în două faze succesive. În prima fază are loc fuzionarea citoplasmei (plasmogamia) iar în etapa următoare, fuzionarea nucleilor (cariogamia), rezultând astfel un zigot cu nucleu unic diploid (set dublu de cromozomi). După un anumit interval de timp, nucleul suferă o diviziune reducţională (meiotică) reveninindu-se la haploidie.

Se deosebesc următoarele tipuri de spori sexuaţi: zigosporii, oosporii, ascosporii şi bazidiosporii.

Zigosporii rezultă din gameţi identici ca structură, formă şi dimensiuni (izogameţi sau gametangi) care apar sub forma unor protuberanţe pe două hife apropiate din acelaşi miceliu sau aparţinând unor micelii diferite. Ajungând la un moment dat în contact, membranele celulare se rezorb la acel nivel iar conţinutul lor protoplasmatic se contopeşte rezultând un zigospor (fig.18)

Fig. 18 Etapele succesive ale procesului de formare a unui zigospor. Două celule din acelaşi miceliu sau din micelii diferite se întâlnesc (A,B) produc celule sexuale speciale (C) care fuzionează (D) şi formează un zigospor acoperit cu un perete protector, negru (E) care rămâne în stare latenţă până la germinare, când formează un corp fructificant de tip asexuat (F)

52

Oosporii rezultă din gameţi diferenţiaţi morfofiziologic (heterogameţi): unul mai mare (oogonul), de sex feminin şi altul mai mic, de sex masculin (anteridia). Oogonul fecundat se transformă în oospor. Atât zigosporii cât şi oosporii sunt întâlniţi la ciupercile inferioare şi reprezintă faza diploidă a ciclului de dezvoltare al acestora. Prin germinarea sporilor se revine la faza haploidă reprezentată atât prin aparatul vegetativ cât şi prin sporii asexuaţi (fig18) Ascosporii şi bazidiosporii sunt caracteristici ciupercilor microscopice superioare, la care cariogamia nu are loc imediat după contopirea celor doi gameţi: ascogonul şi anteridia. În urma acestui proces va rezulta mai întâi un miceliu special care va da naştere unor corpi fructificanţi diferiţi ca formă, numiţi asce (aspect saciform) la micromiceţii din subîncrengătura Ascomycotina şi bazidii (aspect de mânuşă cu degete), la cei din subîncrengătura Bazidiomycotina. În interiorul acestor formaţiuni are loc cariogamia prin fuzionarea celor doi nuclei. După un interval de timp, nucleul diploid suferă una sau mai multe diviziuni reducţionale. La ascomicete diviziunea reducţională va conduce la formarea a doi, patru sau opt nuclei haploizi care, la rândul lor, înconjurându-se de un strat de plasmă condensată şi un perete celular, vor genera un număr echivalent de ascospori (fig.19). Eliberarea ascosporilor se face prin ruperea ascelor. Bazidia este întrucâtva similară unei asce, dar, spre deosebire de aceasta, îşi poartă sporii nu în interiorul, ci la exteriorul ei.

Fig.19 Formarea a scosporului la mucegaiuri. În celula binucleară (A) produsă prin fuzionarea a două celule din acelaşi miceliu sau din micelii diferite, nucleii se unesc (B), se divid repetat (C şi D) formând 8 nuclei sporali (E) conţinuţi într-o celulă numită ască(F). Nucleul diploid al bazidiei se divide de două ori rezultând patru nuclei haploizi. În partea apicală a bazidiei se formează apoi patru mici excrescenţe, numite sterigme, în care vor migra cei patru bazidiospori (fig.20). Pentru eliberarea acestora, la baza sterigmelor apare câte o picătură de lichid care creşte treptat şi care, prin presiunea pe care o exercită, determină deschiderea sterigmelor şi proiectarea sporilor în aer (Zarnea G., 1970).

53

Fig. 20 Etapele succesive ale formării unei bazidii şi eliberarea baz idiosporilor: A- celula binucleată, B- fuziunea nucleilor, C- şi D – diviziunea nucleilor, E- formarea bazidiosporilor, F şi G – eliberarea lor (după Stanier, cit.Zarnea,G. 1970)

4.3. NUTRIŢIA ŞI CREŞTERE FUNGILOR

Fungii au o nutriţie chimioheterotrofă (utilizează substanţele organice ca sursă de carbon şi energie) de tip absorbtiv, asemănătoare cu cea a bacteriilor, dezvoltându-se pe materia organică moartă (fungii saprofiţi) sau pe seama organismelor vii (fungii paraziţi). Substanţele cu moleculă mică (monozaharidele, aminoacizii) străbat peretele celulelor hifale şi levurice prin difuzie simplă. Substanţele macromoleculele sunt supuse mai întâi unui proces de digestie extracelulară sub acţiunea enzimelor fungice glicolitice, proteolitice, lipolitice, fiind transformate astfel în nutrienţi ce pot fi preluaţi ulterior prin absorbţie transparietală. La fungii patogeni, aceste enzime constituie factori de virulenţă cu ajutorul cărora străbat barierele naturale ale organismelor vii pe care s-au adaptat să trăiască.

Fungii se pot dezvolta la o gamă largă a valorilor de pH (2,0 – 9,0), fiind în general acidofili (preferă pH-ul =5,0 – 6,0). Temperatura optimă de dezvoltare este de 22-32o C, limitele extreme situându-se între 5 oC şi 45 oC. Umiditatea crescută influenţează favorabil metabolismul, creşterea şi multiplicarea ciupercilor filamentoase (mucegaiurile) - activităţi stopate când umiditatea mediului se reduce la 20%. Majoritatea mucegaiurilor sunt aerobe, dezvoltându-se în special la suprafaţa substraturilor nutritive, iar drojdiile sunt facultativ anaerobe: ele desfăşoară un metabolism oxidativ, descompunând carbohidraţii până la bioxid de carbon şi apă, dar sunt active metabolic şi în lipsa oxigenului, când recurg la un metabolism fermentativ cu producere de etanol şi bioxid de carbon. Datorită structurii peretelui celular, fungii sunt mai rezistenţi la presiunea osmotică în comparaţie cu bacteriile, fiind capabili să crească şi în medii cu o concentraţie ridicată de zahăr sau săruri. Datorită echipamentului enzimatic complex, fungii sunt capabili să utilizeze zaharuri complexe, cum ar fi lignina, inaccesibilă pentru majoritatea

54

bacteriilor. Ei se remarcă, de asemenea, prin posibilitatea de a obţine nutrienţi din substraturi cu umiditate redusă.

Creşterea fungilor se realizează la extremităţile libere ale hifelor, pe baza substanţelor rezultate din metabolismul de biosinteză,. Celula terminală se alungeşte apoi se formează un sept transversal care o împarte în două celule-fiice.

Totdeauna, celula terminală continuă procesul de creştere şi diviziune în timp ce celula subterminală participă doar facultativ, atunci când produce o ramnificaţie laterală, dotată la rândul ei cu capacitatea de creştere apicală. În dinamica procesului de creştere ,,in vitr o” se pot distinge 3 faze şi anume: faza de lag, faza de creştere liniară şi faza de învechire.

- Faza de lag, în care procesul propriu-zis de creştere, este absent. Această fază se caracterizează prin regenerearea hifelor care au survenit la însămânţare sau germinarea sporilor.

- Faza de creştere lineară, corespunde cu apariţia pe suprafaţa mediului de cultură, a coloniei circulare. Această colonie are o creştere mai rapidă la periferie, în timp ce zona centrală se caracterizează printr-o creştere mai lentă sau chiar prin absenţa creşterii. Pe medii sărace în principii nutritvi, creşterea are loc în suprafaţă, sub forma unei reţele fine de hife. Pe medii bogate creşterea se face mai lent în diametru transversal, în schimb, miceliul este mai gros.

- Faza de învechire, se traduce prin încetinirea vitezei de creştere, pe măsură ce marginile coloniei se apropie de bariera mecanică reprezentată de marginea plăcii Petri, în care se cultivă respectivul mucegai. Această încetinire este determinată de acumularea produşilor de catabolism, care se face cu atât mai rapid cu cât condiţiile nutritive, de temperatură şi aeraţie sunt mai aproape de exigenţele optime ale speciei cultivate.

4.4. PARTICULARITĂŢILE ECO-FIZIOLOGICE ALE

CIUPERCILOR MICROSCOPICE şi IMPLICAŢIILE ÎN ACTIVITATEA OMULUI

Ciupercile microscopice sunt omniprezente. Majoritatea lor sunt saprobiote utilizând în scop trofic substanţele organice din materia în descompunere. Acestea sunt prezente în mediile naturale (sol, apă, aer) intervenind activ în procesele de autopurificare a solului şi a apelor prin degradarea şi mineralizarea materiei organice moarte (cadavre animale şi vegetale). Unele specii, deşi nu atât de numeroase ca cele saprobiote, sunt parazite ale organismele vii – plante, insecte, peşti, reptile, păsări, mamifere, om – provocând boli a căror gravitate depăşeşete uneori pe aceea cauzată de bacterii şi virusuri. Numeroase specii de ciuperci pot trăi în anumite faze ale dezvoltării lor ca saprobiote, iar în anumite condiţii ca parazite. Din această categorie fac parte ciupercile facultativ parazite, care se dezvoltă obişnuit pe substraturi lipsite de viaţă dar pot să se adapteze pentru o perioadă scurtă de timp pe ţesuturi vii şi ciupercile facultativ saprobiote, care sunt adaptate la parazitism dar pot avea şi o existenţă saprobiotă (Ileana Nichita, 2007).

55

Capacitatea miceţilor de a popula un anumit biotop este condiţionată de posibilităţile de a exploata resursele nutritive şi energetice ale acestuia prin intermediul echipamentului enzimatic de care dispun şi care diferă de la o specie la alta. Din acest punct de vedere, ciupercile microscopice pot fi clasificate în trei categorii: monofage, oligofage şi polifage (Coman I., Mareş M., 2000). Ciupercile monofage şi oligofage dispun de un sistem enzimatic redus, limitat uneori la compoziţia chimică a ţesuturilor unei singure specii vegetale sau animale, ca o consecinţă a adaptării lor la un mod de viaţă strict parazit. În categoria ciupercilor polifage intră majoritatea speciilor saprobiote, dar şi cele facultativ parazite şi facultativ saprobiote – specii dotate cu un echipament enzimatic complex.

În raport cu activitatea omului, efectul miceţilor poate fi favorabil sau nefavorabil. Efectul favorabil constă în activităţile enzimatice valorificate în diferite ramuri ale industriei.

• Industria alimentară: - obţinerea alcoolului, berii şi cidrului prin fermentaţia alcoolică a unui

substrat glucidic (amidon, suc de fructe), produsă de levuri aparţinând genurilor Saccharomyces, Kluiveromyces, Candida;

- fermentarea dirijată a laptelui cu ajutorul unor specii de miceţi din genul Penicillium (P. roqueforti, P. camemberti, P. candidum) pentru obţinerea brânzeturilor din sortimentele “Roquefort”,’’Camembert’’, “Brie”ş.a., ;

• Industria farmaceutică: - obţinerea de antibiotice naturale din categoria penicilinelor şi a

cefalosporinelor din culturi de miceţi din genul Penicillium respectiv, Cephalosporium;

- sinteza unor hormoni (ex., micetul Rhizopus arrhizus, datorită capacităţii de a hidroliza progesteronul - intermediar în procesul de sinteză a cortizonului - reduce considerabil numărul etapelor de sinteză chimică a acestui hormon);

- sinteza de interferoni (în 1981 genele interferonului au fost transferate prin inginerie genetică în celulele levurei Sacharomyces cerevisiae, fiecare celulă fiind capabilă să sintetizeze până la 106 molecule de interferon);

- sinteza de proteine virale imunogene (antigenul HbsAg) utilizate la prepararea vaccinurilor contra hepatitei B, cu ajutorul levurilor modificate genetic (Sasson A., 1993);

- sinteza unor enzime: amilaze (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae), proteaze (Aspergillus spp., Mucor pusillus), lipaze (Saccharomycopsis lipolytica), etc.

-industria producerii de biomasă şi proteine neconvenţionale. Efectul nociv al miceţilor poate fi exercitat prin prezenţa şi multiplicarea lor în diferite ţesuturi sau prin efectul nociv al toxinelor (micotoxinelor) ingerate cu alimentele sau furajele în care au fost în prealabil elaborate de speciile toxigene (Carp-Cărare M., 1991). Bolile produse de ciuperci pot fi clasificate pe baza mai multor criterii.

56

În funcţie de categoria în care se încadrează micetul ele pot fi grupate în levuroze şi micoze propriu-zise.

După mecanismul patogenităţii micetului-agent etiologic, aceste boli se clasifică în micoze şi micotoxicoze.

Micozele se caracterizează prin prezenţa şi multiplicarea miceţilor în organe şi ţesuturi. Pe baza afinităţii şi a localizării lor în organe şi ţesuturi, micozele se clasifică în: dermatomicoze (micoze externe) şi micoze viscerale sau interne (endomicoze). Micotoxicozele se caracterizează prin leziuni şi tulburări produse de micotoxinele elaborate de ciuperci în alimente sau în furaje. Ele sunt de fapt, intoxicaţii cu origine micotică.

4.5. ÎNCADRAREA TAXONOMICĂ ŞI NOMENCLATURA CIUPERCILOR MICROSCOPICE

În prezent ciupercile microscopice sunt incluse într-un regn de sine stătător, regnul FUNGI cu două încrengături: PSEUDOMYCOTA şi EUMYCOTA. Încrengătura Pseudomycota include miceţi lipsiţi de importanţă medicală, cu excepţia speciei Rhinosporidium seeberi (Nichita Ileana, 2007). Fungii de importanţă medicală sunt plasaţi în încrengătura Eumycota care se subdivide în patru subîncrengături: Zygomycotina, Ascomycotina, Bazidiomycotina, Deuteriomycotina. Principalele caractere discriminatorii pentru subdiviziunile taxonomice sunt structura miceliului (septată, neseptată), posibilitatea de reproducerea sexuată şi caracteristicele formelor sexuate . Nomenclatura ciupercilor microscopice este cea binară – latină, conformă cu normele Codului Internaţional al Nomenclaturii Botanice (International Cod of Botanical Nomenclature – ICBN).

ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE CAPITOLUL IV

1. Care sunt particularităţile structurale ale celulei micotice, raportate la structura celulei bacteriene?

2. Care este structura fungilor filamentoşi şi care sunt părţile distincte din punct de vedere morfo-fiziologic?

3. Prin ce se deosebesc levurile de fungii filamentoşi? 4. Care sunt modalităţile de multiplicare ale ciupercilor microscopice? 5. Ce rol îndeplinesc în natură miceţii saprobioţi? 6. Cum se clasifică bolile produse de miceţi?

57

CAPITOLUL 5

NOŢIUNI DE GENETICĂ MICROBIANĂ

Genetica este ramura biologiei care studiază două fenomene biologice fundamentale: ereditatea şi variabilitatea speciilor. . Ereditatea este însuşirea biologică generală a vieţuitoarelor de a conserva proprietăţile structurale şi funcţionale ce caracterizează specia şi de a le transmite nemodificate din generaţie în generaţie. Variabilitatea reprezintă latura opusă stabilităţii ereditare, care duce la apariţia unor diferenţe între descendenţi şi genitori, asigurând evoluţia speciilor. Având un aparat genetic mai simplu, virusurile şi bacteriile au constituit şi constituie principalul obiect de studiu al cercetării fundamentale în genetică. S-a demonstrat astfel, prin experienţele începute în 1928 de englezul Griffith asupra bacteriei Streptococcus (Diplococcus) pneumoniae şi continuate în 1944 de americanul Avery şi colaboratorii săi, că informaţia genetică este deţinută de acidul dezoxiribonucleic (ADN), care reprezintă suportul material al eredităţii.

5.1. EREDITATEA LA MICROORGANISME şi MECANISMELE EI

Ca la toate organismele vii, materialul genetic al microbilor îndeplineşte două funcţii: autocatalitică (capacitatea genomului de a se autoreproduce cu mare fidelitate) şi heterocatalitică (însuşirea de a induce şi de a controla sinteza de proteine sau alte biomolecule). Mecanismele prin care se realizează cele două funcţii (autoreplicarea, respectiv transcrierea, translaţia) şi procesele ce determină variabilitatea genetică (mutaţia şi recombinarea genetică) au fost descifrate în cea mai mare măsură prin studiile efectuate asupra sistemului fag-bacterie gazdă, ambele microorganisme având câte un singur cromozom.

Funcţia autocatalitică a materialului genetic

Multiplicarea propriuzisă a microorganismelor (virusuri, bacterii, miceţi) este precedată de un proces de autoreplicare a genomului ADN sau ARN (în cazul ribovirusurilor), mediat de enzime. Autoreplicarea ADN dublu catenar este de tip semiconservativ. Cele două catene care alcătuiesc macromolecula de ADN se separă mai întâi după modelul clasic al fermoarului prin ruperea punţilor de hidrogen care le unesc, începând dintr-o anumită zonă numită punct de iniţiere.

58

Fiecare catenă îşi reface apoi congenera din nucleotidele libere aflate în citoplasmă, prin complementaritate: o bază azotată purinică (adenină, guanină) se leagă întotdeauna de o bază pirimidinică (timină, citozină) de pe catena veche şi invers. Rezultă astfel patru tipuri de legături posibile: A –T; T –A; G –C şi C –G. În acest mod, fiecare catenă veche refăcându-şi duplexul, se ajunge la dublarea cantităţii iniţiale de ADN.

Replicarea genomului viral se realizează în mod diferit în funcţie de structura mono- sau dublu catenară a acidului nucleic:o replicare semiconservativă la ADN şi ARN dublu catenar şi o replicare , mai întâi complementară şi apoi semiconservativă, la ADN şi ARN monocatenar. Microorganismele sunt supuse aceloraşi legi ale eredităţii, unitare întregii lumi vii, cu aspecte particulare dictate de gradul lor de organizare.

Astfel, dacă nici un accident genetic nu are loc, toţi descendenţii unui microb sunt identici între ei şi identici cu genitorul. Acest fenomen poartă numele de “descendenţă verticală” şi are ca rezultat formarea de “clone”, populaţii de indivizi identici. Această stabilitate, întâlnită în condiţii naturale numai la procariote şi virusuri, este asigurată de organizarea de tip haploid (set unic de gene, provenit de la un singur genitor) şi înmulţirea asexuată (replicarea identică a cromozomului unic).

Funcţia heterocatalitică a materialului genetic

Informaţia genetică înscrisă în molecula de ADN este determinată de succesiunea bazelor azotate transcrisă pe ARN mesager (ARNm), iar combinaţiile de câte trei baze de pe traseul lanţului de ARNm, sunt responsabile de poziţia aminoacizilor în structura polipeptidelor. Secvenţa a trei baze care codifică un aminoacid poartă denumirea de tripletă sau codon. În afară de codonii purtători de informaţie genetică, există şi triplete care nu codifică aminoacizi (triplete non sens), ci intervin în mecanismele de stopare a sintezei lanţurilor peptidice. Acelaşi aminoacid este codificat de acelaşi (aceiaşi) codon(i) indiferent dacă el intră în structura fiinţelor unicelulare sau a macroorganismelor - corelaţie care poartă numele de cod genetic.

Transmiterea informaţiei de la ADN la locul de sintezeă a proteinelor (ribozomii) se numeşte translaţie, deoarece comportă “traducerea” limbajului de patru litere al ADN-ului (A=adenină; C=citozină; G=guanină; T=timină), în limbajul de 20 de litere (aminoacizi) al proteinelor. Informaţia genetică nu este transmisă direct la ribozomi, ci prin intermediul ARN m. Deci, molecula de ADN este o matriţă pentru ARNm, care trece în citoplasmă la locul de sinteză a proteinelor. În cursul sintezei ARNm, timina (T) este înlocuită însă cu o altă bază pirimidinică, uracilul (U).

Aşadar, o matriţă ADN pe care scrie: TTTTGCTCGTAATACTT,

va fi transcrisă mai întâi în molecula de ARNm, sub forma: UUUUGCUCGUAAUACUU.

59

Translaţia (traducerea) este un mecanism complex prin care mesajul genetic transmis de la ADN prin ARNm, este recepţionat şi citit la nivelul ribozomilor, în vederea constituirii lanţurilor peptidice. La traducerea mesajului ARNm participă o colecţie de molecule de ARN de transport (ARNt), molecule capabile să recunoască şi să lege specific un anumit aminoacid din citoplasmă, pe care-l transportă la nivelul codonului corespunzător din molecula de ARNm ataşată de ribozomi. Virusurile ARN determină biosinteza materialului viral de către celula gazdă folosind trei strategii (Carp-Cărare M.,2001):

- ARN viral transmite informaţia genetică la nivelul ribozomilor în mod direct, şi nu prin intermediul ARNm, substituind ARNm celular;

- informaţia genetică este transmisă la nivelul ribozomilor prin ARNm copiat de pe genomul viral cu ajutorul enzimei ARNm polimeraza ARN dependentă;

- ARN viral, printr-un proces de transcriere inversă (fenomen unic în biologie) cu ajutorul unor enzime numite reverstranscriptaze, determină formarea unui ADN proviral care preia conducerea sintezelor celulare.

5.2 VARIABILITATEA LA MICROORGANISME şi

MECANISMELE EI

În cursul multiplicării microorganismelor, la fel ca la celelalte grupe de vieţuitoare, poate avea loc fenomenul de variabilitate. Acesta constă în apariţia unui număr redus de descendenţi-variante (celule bacteriene, celule micotice, particule virale) care exprimă un fenotip ce diferă de al populaţiei microbiene în care au apărut, prin unul sau mai multe caractere. Spre deosebire de plante şi animale, la microorganisme variabilitatea este mult mai accentuată datorită simplităţii tipului de organizare şi a succesiunii rapide a generaţiilor. În funcţie de mecanismul de producere şi de caracteristicile lor, variaţiile pot fi grupate în două categorii: fenotipice şi genotipice (tabelul 2).

Tabelul 2 Caracterele distinctive între variaţiile fenotipice şi genotipice

Variaţii Caracterul considerat Fenotipice Genotipice

Se realizează prin Acţiunea mediului Mutaţii şi recombinări genetice

Starea genomului Nu comportă modificări

Comportă modificări structurale

Rolul factorilor de mediu Inductori al variaţiei prin actualizarea unei posibilităţi genetice

Selectivi ai variantelor

Proporţia celulelor afectate dintr-o populaţie microbiană

Toate sau majoritatea Foarte mică (1/108 - 109 )

Stabilitatea Dispar odată cu factorul inductor

Stabile

Transmiterea variaţiei la descendenţi

Nu Da; descendenţii formează o clonă variantă

60

5.2.1. VARIAŢIILE FENOTIPICE

Variaţiile fenotipice (negenetice sau fiziologice) sunt induse de factorii de mediu (fizici, chimici, biologici), faţă de care constituie fenomene de adaptare. Variaţiile fenotipice afectează o întreagă populaţie microbiană simultan, sunt instabile (în sensul că dispar odată cu factorul inductor) şi nu se transmit ereditar, deoarece nu implică nici o modificare în structura genomului. Variabilitatea fenotipică poate interesa toate caracterele microorganismelor: morfologice, fiziologice, de patogenitate, etc. Redăm în continuare câteva exemple de variaţii fenotipice întâlnite la bacterii. 1.Variaţii ale capsulogenezei. Speciile bacteriene capsulate Bacillus anthracis şi Diplococcus pneumoniae îşi sintetizează capsula numai în organismul animalului infectat sau pe mediile de cultură care conţin lichide organice (ser sanguin, sânge 5-10%). Pe mediile simple, în absenţa substanţelor necesare capsulogenezei, ele formează culturi de variante acapsulogene. Pierderea capsulogenezei poate deveni şi un caracter ereditar. 2.Variaţii privind sporogeneza. Cultivarea speciilor sporogene pe medii cu antiseptice sau pe medii bogate în ioni de calciu poate induce apariţia de variante asporogene. Acelaşi efect represor asupra genelor responsabile de sporogeneză îl exercită anumite valori termice. La Bacillus anthracis, de exemplu, sporogeneza are loc numai în intervalul 12–42,50 C.

3. Variaţii ale caracterelor biochimice. Variaţiile fenotipice ale caracterelor biochimice constau în sinteza enzimelor adaptative, indusă de substrat, care exercită o acţiune de derepresare a genelor respective. La E. coli, de exemplu, sinteza beta-galactozidazei şi a celorlalte enzime codificate de operonul ,,lac” este condiţionată de prezenţa lactozei în mediul de cultură. Gama caracterelor supuse variaţiilor fenotipice este extrem de largă şi numărul exemplelor de felul celor prezentate mai sus este nelimitat pentru lumea microorganismelor.

5.2.2. VARIAŢIILE GENOTIPICE Genotipul reprezintă complexul de gene care determină realizarea unui anumit fenotip (caracter, însuşire). Variaţiile genotipice sau genetice se produc ca o consecinţă a unor modificări în structura materialului genetic, prin urmare ele sunt stabile şi se transmit ereditar. În funcţie de caracterul fenotipic afectat, variaţiile genotipice pot fi:

a) morfologice, care privesc capsulogeneza, cilogeneza, sporogeneza, etc.;

61

b) metabolice sau biochimice , care constau în dobândirea sau pierderea capacităţii de sinteză a unei enzime şi implicit, obţinerea variantelor auxotrofe;

c) de p atogenitate, generatoare de mutante apatogene, cu patogenitate atenuată sau exacerbată;

d) de re zistenţa l a agenţii inh ibitori fizici, chimici s au b iologici, cum este cazul variantelor antibiorezistente Mecanismele de producere a variaţiilor genotipice sunt mutaţiile şi recombinările genetice.

5.2.2.1. Mutaţiile

Mutaţiile reprezintă modificări ale numărului sau secvenţei bazelor azotate din structura moleculei de ADN (sau ARN, în cazul ribovirusurilor). Ele survin brusc şi se exprimă fenotipic prin apariţia în sânul unei populaţii omogene, a unei ,,mutante”, adică a unui individ capabil de a transmite descendenţilor caractere noi, prin care se deosebeşte de populaţia omogenă în care a apărut. Una din teoriile cele mai pertinente asupra mecanismelor moleculare ale mutaţiilor este teoria ,,copierii greşite” a informaţiei genetice de pe catena complementară în cursul autoreplicării acizilor nucleici.(W a t s o n şi C r i c k, 1953). Aceste erori de transcriere pot consta în:

- substituţia unei baze azotate cu alta; - deleţia sau suprimarea unei baze sau a unui bloc de baze; - inserţia sau adiţia unei baze sau a unui bloc de baze suplimentare; -inversarea succesiunii bazelor, care în cursul copierii îşi schimbă poziţia.

Mutaţiile pot fi favorabile organismului la care apar sau nefavorabile, mergând până la incompabilitatea cu viaţa. Clasificarea mutaţiilor se poate efectua după mai multe criterii.

1. După modul de apariţie, mutaţiile se împart în induse şi spontane.

Mutaţiile induse sunt consecinţa acţiunii dirijate, în scop experimental, a unor factori de mediu numiţi agenţi mutageni deoarece sunt capabili să determine modificări în structura ADN. (Răducănescu H. şi col., 1986; Zarnea G.,1986). Agenţii mutageni mai frecvent utilizaţi sunt factori fizici (radiaţiile ultraviolete, radiaţiile ionizante, temperaturile disgenetice, etc.) şi chimici (5-bromuracilul, 2-aminopurina, hidroxilamina, acidul nitros, coloranţii de acridină, agenţi alchilanţi, etc.), care acţionează asupra ADN în diferite moduri. Unii agenţi mutageni, cum sunt analogii bazelor azotate, induc erori de replicare a ADN prin substituirea unor baze normale (ex. 5-bromuracilul se substituie timinei, determinând încorporarea în catena complementară, a guaninei în locul adeninei, rezultatul fiind înlocuirea perechii de baze originare T-A cu G-C), alţii prin modificarea structurii chimice a bazelor azotate (ex. guanina metilată formează legături de hidrogen cu timina şi nu cu citozina), iar alţii acţionând asupra enzimelor implicate în sinteza AND (AND-polimerazele).

62

Mutaţiile induse sunt utilizate în practică în scopul obţinerii unor tulpini microbiene cu însuşiri dorite, utile în diverse domenii de activitate. Astfel, există preocupări privind obţinerea de mutante bacteriene capabile să determine calităţi gustative deosebite unor produse alimentare, mutante bune producătoare de antibiotice şi vitamine, mutante auxotrofe∗ utilizate în experienţele de inginerie genetică, mutante nepatogene sau cu patogenitate atenuată utilizate la prepararea vaccinurilor, etc. În scopul obţinerii de tulpini vaccinale, reducerea patogenităţii bacteriilor se poate realiza utilizând mijloace fizice şi chimice . Dintre mijloacele fizice, în mod curent se utilizează temperaturile disgenetice, superioare confortului termic al speciei supuse atenuării. Factorii chimici atenuanţi sunt reprezentaţi de diverse substanţe care, introduse în mediul de cultură, frânează dezvoltarea normală a germenilor. Apelând la cel de-al doilea mijloc, C a l m e t t e şi G u é r i n au obţinut în 11 ani (1908 – 1919) atenuarea unei tulpini de Mycobacterium bovis în urma a 198 de treceri pe cartof glicerinat cu bilă de bou. Vaccinul B.C.G., preparat din această variantă atenuată (bacilul C a l m e t t e - G u é r i n ), este utilizat şi astăzi pe scară largă în medicina umană pentru vaccinarea antituberculoasă a copiilor. Un alt exemplu îl constituie tulpinile de Bacillus anthracis acapsulogene obţinute prin cultivarea pe sânge defibrinat de cal (tulpina 1190 R – Stamatin, 1936) şi pe ser de cal, în atmosferă de bioxid de carbon (tulpina 34 F2 - Sterne, 1937). Ambele tulpini şi-au pierdut definitiv capacitatea de a-şi sintetiza capsula şi implicit patogenitatea, deoarece capsula conferă bacteriilor protecţie antifagocitară. În cazul virusurilor, pentru obţinerea unor variante nepatogene sau cu patogenitate atenuată, utilizate la prepararea vaccinurilor, se utilizează mijloacele biologice de atenuare. Acestea constau în:

- inocularea repetată a virusului pe o specie animală care, în mod natural, este rezistentă la infecţia respectivă, obţinându-se consecutiv acestor pasagii o reducere a patogenităţii faţă de specia sau speciile natural sensibile; astfel, prin lapinizare (adaptarea la organismul iepurelui) au fost obţinute variantele nepatogene de virus pestos porcin (varianta chinezească “C” şi varianta “Koprowsky – Rovac”), iar prin avianizare (adaptarea pe embrioni de găină), o variantă de virus jigodios nepatogenă pentru câine, mai multe variante de virus rabic ( variantele Flury LEP, Flury HEP, Kelev), o variantă atenuată a virusului bolii lui Aujeszky, ş.a.;

- inocularea animalelor receptive pe altă cale decât calea naturală de pătrundere a virusului. Virusurile rabice fixe clasice, de exemplu,se obţin prin treceri intracerebrale repetate pe iepure.Aceste variante nu şi-au atenuat patogenitatea (ele sunt chiar mai virulente în special pentru specia pe care au fost obţinute) însă au pierdut capacitatea de a se propaga pe calea nervilor periferici ∗ Mutantele (variantele) auxotrofe rezultă din bacteriile prototrofe (tulpini sălbatice, izolate din natură), prin pierderea sau dobândirea capacităţii de a metaboliza diferiţi compuşi chimici. Mutantele auxotrofe au permis descoperirea recombinârii la bacterii.

63

(neuroprobazia), fiind patogene numai inoculate intracerebral, când produc infecţii grave. Inoculate pe alte căi, sub formă de vaccin, sunt lipsite de patogenitate, determinând imunizarea organismului vaccinat. Mutaţiile spontane sunt cele care apar în natură datorită unor cauze necunoscute, în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil. Indiferent de tip, mutaţiile au următoarele caracteristici comune: spontaneitatea, discontinuitatea, raritatea, stabilitatea şi specificitatea. Spontaneitatea. Modificările produse de factorii mutageni apar într-un moment imprevizibil, iar faptul că interesează o anumită genă este un fenomen întâmplător. Mutaţia are deci un caracter spontan, fenomenul mutaţional fiind distribuit aleator în timp şi spaţiu genetic. Caracterul spontan mai rezidă şi în faptul că mutaţia se produce în lipsa factorului de mediu faţă de care celula bacteriană cu genom modificat manifestă un comportament mutant. L u r i a şi D e l b r ü k (cit.de Răducănescu H. şi col., 1986) au fost primii care au demonstrat în 1943 că mutantele streptomicinorezistente de E.coli apar în absenţa antibioticului. Punerea în evidenţă a mutantelor este posibilă însă numai pe agar cu streptomicină, care permite dezvoltarea mutantelor, inhibând restul celulelor bacteriene sensibile. Deci, mediul cu antibiotic nu induce mutaţia, ci o relevă. Discontinuitatea se referă la faptul că, o mutantă poate să apară brusc sau trecând prin etape succesive. Raritatea . Probabilitatea ca o bacterie să sufere o mutaţie într-o unitate definită de timp, de obicei egală cu timpul unei generaţii, este foarte mică. În majoritatea cazurilor, ea se situează în jurul valorii de 1 dintr-o populaţie de 105-109 celule bacteriene. Stabilitatea. Spre deosebire de variaţiile negenetice, proprietăţile noi obţinute prin mutaţie persistă în absenţa agentului care a servit la selecţie şi se transmit ereditar. Specificitatea. Fiecare caracter poate suferi o mutaţie, independent de celelalte caractere. Rezistenţa la penicilină, de exemplu, este independentă de rezistenţa la sterptomicină. Probabilitatea ca o bacterie să devină, prin mutaţie, rezistentă la ambele antibiotice este egală cu produsul probabilităţilor individuale ale celor două mutaţii.

5.2.2.2. Recombinările genetice

Recombinările genetice se realizează pe căi specifice diferitelor categorii de microbi.

La BACT ERII, recombinările genetice se realizează consecutiv transferului de material genetic cromozomal sau plasmidic de la o celulă donatoare la o celulă receptoare. Transferul are loc prin: transformare, transducţie şi conjugare.

64

Transformarea

Transformarea rezidă din transferul unidirecţional al unui fragment de ADN cromozomal de la bacteria donatoare la bacteria receptoare şi integrarea lui în cromozomul celulei receptoare prin crossing-over. Fragmentul de ADN care pătrunde în bactera receptoare poate proveni de la bacterii moarte, aşa cum au demonstrat experienţele pe pneumococi efectuate de Griffith (1928) şi Avery (1944) (fig.21). Injectând la şoareci două tipuri de pneumococi distincţi antigenic, tipul S III capsulogen şi virulent sub formă de suspensie de germeni omorâţi şi tipul R II acapsulogen şi nevirulent sub formă de suspensie de germeni vii, G r i f f i t h a izolat de la şoarecii morţi, pneumococi aparţinând tipului virulent. El nu a putut să explice atunci, cum a fost posibilă transformarea pneumococilor nevirulenţi sub influenţa germenilor virulenţi omorâţi. Natura agentului transformant care opera în experienţele lui G r i f f i t h a fost cunoscută abia după 16 ani, când A v e r y, Mc C a r t y şi Mac L e o d au arătat că fragmente de ADN, eliberate prin liza bacteriilor moarte sau prin extracţie chimică, pătrund în celulele pneumococul viu, înzestrându-l cu determinanţii genetici ai sintezei polizaharidelor capsulare de tip S III. În mod similar pot fi transmişi determinanţii genetici ai rezistenţei la antibiotice, ai sintezei enzimelor implicate în catabolismul sau anabolismul celular, etc. Fenomenul de transformare se realizează în mai multe etape şi depinde de unele condiţii pe care trebuie să le îndeplinească materialul genetic transferabil şi celula receptoare.

Fig. 21.Experienţa de transformare a pneumococilor efectuată de Griffith

Transducţia Transducţia constă în transferul unui fragment de cromozom bacterian de la o celulă bacteriană la alta prin intermediul bacteriofagilor. În funcţie de ciclul evolutiv al bacteriofagului transductor şi de materialul genetic transferat prin fag, transducţia poate fi împărţită în două tipuri distincte: transducţie generalizată şi specializată.

65

Trasducţia generalizată presupune transducerea oricărei gene cromozomale, indiferent de poziţia ei în cromozom. Ea se realizată în majoritatea cazurilor atunci când infecţia fagică evoluează sub forma ciclului litic (productiv), care presupune replicarea ADN-ului viral şi traducerea informaţiei genetice virale, concretizată în formarea de noi virioni. Fagii de transducţie generalizată se formează printr-o greşeală de ansamblare, când unele capside fagice încorporează ADN bacterian în loc de ADN fagic, sau ADN bacterian şi o cantitate mică de ADN fagic. Mărimea fragmentului cromozomal încorporat este proporţională cu cea a genomului fagic normal, astfel încât ei nu se deosebesc ca dimensiuni şi formă de fagii normali, alături de care se formează (Zarnea G., 1986). După liza celulei în care s-au format, bacteriofagii vor infecta alte celule în care transduc genele bacteriene incorporate. Fagii de transducţie generalizată sunt întotdeauna defectivi, în sensul că nu se mai replică şi nu lizează noua celulă gazdă, deoarece sunt lipsiţi de genele virale esenţiale. Transducţia specializată, cunoscută şi sub denumirea de transducţie restrictivă sau localizată, presupune integrarea fagului în cromozomul bacteriei gazdă, situaţie în care genomul viral nu se replică şi nu codifică sinteza de proteine virale. Sub această formă, de virus integrat (profag), bacteriofagii poartă denumirea de “fagi temperaţi” deoarece nu distrug celula bacteriană mai multe generaţii, comportându-se ca material genetic propriu celulei bacteriene. Evoluţia intracelulară a fagului în acest mod este denumită curent, ciclu reductiv sau lizogenizant. Din când în când, sub acţiunea unor factori inductori (radiaţii UV sau X, diferiţi agenţi chimici, etc.), bacteriile lizogene (purtătoare de profag) produc bacteriofagi ca rezultat al trecerii profagului în starea de fag vegetativ Odată cu excizia genomului viral din cel bacterian, de genomul viral vor rămâne ataşate genele adiacente acestuia, care vor fi transferate de fag într-o altă celulă bacteriană.. Astfel, s-a stabilit că fagul λ (lambda), care infectează celulele de Escherichia coli, se integrează în mod constant într-o regiune a cromozomului situată între operonii “gal” şi “bio”,pe care îi transduce în mod obişnuit. Genele transduse sunt încorporate în genomul celulei receptoare, care dobândeşte astfel caractere noi.

Conjugarea Conjugarea este o modalitate de transfer de material genetic printr-un pil sexual, în urma contactului direct dintre celula donatoare şi cea receptoare, opuse ca sexualitate . Descoperirea fenomenului de conjugare s-a datorat cercetărilor efectuate de L e d e r b e r g şi T a t u m în 1946, pe trei tulpini de Escherichia coli, diferite din punct de vedere al exigenţelor nutritive: - o tulpină sălbatică (prototrofă) de E. coli K12, capabilă să sintetizeze singură 4 aminoacizi (biotina, metionina, treonina şi leucina) şi

66

- două tulpini auxotrofe, din care una capabilă să sintetizeze doar biotina şi metionina, iar cealaltă, treonina şi leucina. Autorii au cultivat cele trei tulpini pe medii de cultură minimale (uzuale), care nu conţineau cei 4 aminoacizi menţionaţi mai sus. Tulpina sălbatică s-a dezvoltat bine pe acest mediu, deoarece şi-a sintetizat cei 4 aminoacizi necesari, în timp ce nici una din mutantele auxotrofe n-a crescut, ele nefiind capabile să-şi sintetizeze câte 2 din cei 4 aminoacizi necesari. Însămânţând însă pe acelaşi mediu minimal un amestec din ambele mutante auxotrofe, s-au dezvoltat aproximativ 20 de colonii. Deci, împreună ele au fost capabile să sintetizeze cei 4 aminoacizi. Căutându-se explicaţia acestui fenomen, s-a avut în vedere faptul că, utilizarea unor tulpini dublu mutante, deficiente în ceea ce priveşte sinteza a câte doi factori de creştere, exclude posibilitatea unei retromutaţii spontane la condiţia prototrofă, deoarece probabilitatea acestui fenomen este extrem de redusă. Rămânea ca plauzibilă ipoteza unui transfer genetic între cele două tulpini diferite genotipic, însămânţate împreună pe mediul minimal. Cultivarea lor într-un mediu lichid, în câte una din ramurile unui tub în formă de ,,U”, separate printr-un filtru poros, nu a mai avut ca efect apariţia de celule prototrofe, ceea ce a confirmat presupunerea că dezvoltarea de colonii prototrofe pe mediul solid era rezultatul unui transfer genetic, realizabil numai în condiţiile unui contact direct între celulele celor două tulpini. Faptul că deplasarea repetată, sub presiune, a lichidului de cultură dintr-o parte în alta a filtrului separator, era ineficientă pentru reconstituirea prototrofiei, excludea intervenţia ca agent transformant a ADN- ului eliberat din celulele lizate şi sugera necesitatea unui contact obligatoriu între celulele intacte, vii. Ulterior, studii de microscopie electronică şi analiza genetică au confirmat această ipoteză, dovedind realizarea transferului de material genetic printr-un proces de conjugare între celulele bacteriene (Zarnea G.,1986). Capacitate bacteriilor de a transfera material genetic prin conjugare este determinată de prezenţa în celulă a plasmidelor F, care controlează sinteza pililor sexuali. În funcţie de starea autonomă (plasmidică) sau integrată în cromozom (epizomală) în care se găseşte factorul F în celula donatoare, receptorul fiind în toate cazurile o celulă F- , există mai multe tipuri de conjugare.

Conjugarea dintre bacteriile F+ şi F −

Este forma cea mai frecventă şi mai simplă, care presupune prezenţa factorului F în starea lui plasmidică. După sinteza pilului sexual şi formarea cuplurilor, celulele F+(mascule) transferă o copie a plasmidei F, celulelor F − (femele). Transferul se caracterizează printr-o eficienţă mare, de până la 100%, astfel încât în populaţiile bacteriene în care are loc această formă de conjugare, proporţia celulelor F+ creşte considerabil, în relaţie directă cu scăderea celulelor F-. În urma conjugării, fiecare celulă F- care primeşte factorul F, devine F+.

67

Conjugarea între bacterii Hfr (High frequency of recombinants) şi F-, numită recombinare de înaltă frecvenţă, presupune integrarea prealabilă a factorului F în cromozomul celulei , în regiuni ale acestuia în care există similitudini de secvenţă a bazelor azotate (trecerea lui în faza epizomală) – fig. 22.

Fig.22 Reprezentarea schematică a procesului de conjugare la E. coli între o celulă Hfr şi una F- : sus – transferul integral al cromozomului, inclusiv factorul

F; jos – transferul parţial (un singur marker genetic) datorită întreruperii procesului.

Prezenţa în cromozom a factorului F conferă acestuia capacitatea de a fi transferat parţial sau total prin conjugare şi este determinantă pentru calitatea de Hfr sau de ,,supermascul” a celulei bacteriene. În stare integrată, factorul F se comportă diferit de forma sa plasmidică, în sensul că încetează să se mai replice autonom şi nu mai este transferabil decât excepţional de rar, deoarece el constituie întotdeauna fragmentul terminal al cromozomului angajat în transfer. În plus, replicarea factorului F integrat, sincronă cu cea a cromozomului, nu mai poate fi inhibată de acridinorange. Recombinarea de înaltă frecvenţă se desfăşoară în următoarele faze: I. deschiderea inelului cromozmic în zona de inserţie a factorului F şi trecerea lui de la configuraţia ciclică, la cea lineară; II. transferul cromozomului către celula F-, începând cu extremitatea opusă factorului F; III. încheierea procesului de conjugare, care poate avea loc fie ca urmare a transferării cromozomului în întregime, fie ca urmare a întreruperii transferului pe parcurs.

În prima situaţie, care presupune transferul factorului F, procesul durează 90 – 100 minute, iar celula receptoare devine F+ . În a doua situaţie, factorul F rămâne în celula donatoare (având în vedere poziţia sa terminală), motiv pentru care celula receptoare, deşi a primit prin transfer material genetic, rămâne F-.

68

Durata conjugării depinde în cazul transferului parţial de mărimea segmentului transferat, ţinând seama că viteza de conjugare este de aproximativ 105 perechi de baze pe minut. Conjugarea de înaltă frecvenţă nu duce la sărăcirea materialului cromozomic în celula donatoare, fapt care se explică prin replicarea ADN-ului cromozomal în timpul conjugării, materialul transferat fiind, de fapt, o copie.

Conjugarea între bacterii F’ şi F − (sexducţia sau F-ducţia) – fig. 23. Tulpinile Hfr au uneori tendinţa să redevină F+ , prin reversia factorului F

din starea epizomală în starea plasmidică. În acest caz, factorul F poate conţine un număr variabil de gene cromozomale pe care le-a încorporat în momentul reversiei din regiunile adiacente locului său de inserţie, devenind factor F’.

Consecutiv transferului unui factor F’, celula receptoare F- dobândeşte calitatea de F+ prin primirea factorului de sex, caracterele codificate de genele cromozomice integrate în structura sa, precum şi calităţi Hfr.

Transferul factorului F’ poate fi comparat cu transducţia, rolul fagului transductor fiind suplinit în acest caz de factorul F’, care vehiculează genele cromozomice către celula receptoare.

Fig.23 Fenomenul de sexducţie la bacterii (după Zarnea G.,1970). ◆ La CIU PERCILE MICROSCOPICE, se pot întâlni, de asemenea, mai multe posibilităţi de recombinare genetică: intercromozomială, intracromozomială şi conversia.

Recombinarea intercromozomială este combinaţia probabilistică a cromozomilor proveniţi de la cei doi parentali, în timpul diviziunii meiotice.

69

Recombinarea intracromozomială constă în schimbul reciproc de gene între cromozomii pereche, unul provenind de la mamă, celălalt, de la tată (crossing-over).

Conversia este un proces de recombinare genetică nereciprocă constând din transferul de pe o cromatidă pe alta a unui segment de ADN format din 100-200 nucleotide.

◆ La VIRUSURI, recombinarea este posibilă numai în celula gazdă şi are loc în cazurile unei infecţii concomitente cu două virusuri, între care se produce recombinarea.

În fenomenele de recombinare pot fi angajate nu numai virusurile

complete sau active, capabile să se multiplice în celula infectată, dar şi virusuri inactivate sau defective (care nu pot realiza decât parţial ciclul de multiplicare). Mecanismele recombinării genetice la virusuri sunt (fig.24). - copierea alternativă (copy-choice), în care genomul recombinat conţine secvenţe de nucleotide de la cei doi parentali ca urmare a replicării după matriţa catenei ADN sau ARN a unui virus, până la un punct, apoi după a celuilalt virus; - reasortarea genică produsă ca urmare a încapsidării în acelaşi virion a unor segmente din genomurile ambelor virusuri; - reactivarea încrucişată în care gene ale unui virus inactivat pătrund în genomul unui virus activ, exprimându-se fenotipic la virionii recombinaţi;

Fig.24. Interactiune genetice şi

negenetice virusuri. A. reasortare genică: sunt

prezentate două posibilităţi. Sunt marcate fragmentele genomului şi antigenele de suprafaţă.Săgeţile interioare arată corespondenţa genă-proteină.

B. Heteroploidie si amestec fenotipic.

C. Amestec fenotipic şi transcapisidare la virusuri icosaedrice. (dupa Ivanof A. şi col., 1982)

70

- reactivarea de multiplicitate, în care virioni ai aceluiaşi virus, inactivaţi în gene diferite, se recombină într-un genom complet.

În infecţiile virale concomitente, pot rezulta virusuri recombinate şi ca urmare a unor interacţiuni negenetice, prin: - mixaj fenotipic şi transcapsidare – proteine capsidale sau din peplos ale celor două virusuri se amestecă în acelaşi virion, genomul aparţinând numai unuia dintre ele; dacă toată capsida este a unui virus şi genomul al altui virus , procesul se numeşte transcapsidare; - mixaj genotipic (heteroploidie) - includerea acizilor nucleici a celor două virusuri în aceeaşi capsidă.

Recombinările prin mixaj nu sunt stabile genetic.

ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE CAPITOLUL V

1. Care sunt caracterele distinctive între variaţiile fenotipice şi variaţiile genotipice?

2. Ce reprezintă mutaţiile, de câte feluri sunt şi care sunt caracteristicile lor comune?

3. Care sunt mecanismele recombinărilor genetice la bacterii, ciupercile microscopice şi virusuri?

71

CAPITOLUL 6

NOŢIUNI DE ECOLOGIE MICROBIANĂ

Ecologia microorganismelor este unul dintre cele mai noi domenii ale microbiologiei, care studiază relaţiile biologice dintre microorganismele prezente într-un habitat comun şi interacţiunile care apar între componenţii biotici şi abiotici ai acestuia (Zarnea G., 1999).

Pentru a caracteriza poziţia unei populaţii de microorganisme într-o comunitate se utilizează în mod curent termenii de ,,habitat”, ,,nişă ecologică” sau ,,biotop”, deşi semnificaţia lor nu este în întregime superpozabilă.

Habitatul unui microorganism reprezintă locul în care acesta trăieşte, se reproduce sau, cel puţin, supravieţuieşte.

Dimensiunile habitatelor variază de la foarte mari (oceane, mări), la foarte mici (intestinul unei insecte) iar numărul lor este imens, deoarece, puţine regiuni de pe suprafaţa planetei sunt lipsite de microorganisme.

Natura habitatelor este de asemenea foarte variată incluzând solul, apele dulci şi marine, aerul, animalele, plantele, etc.

Atunci când în perimetrul unui habitat parametrii factorilor fizico-chimici sunt neuniformi, se crează regiuni, uneori foarte apropiate, care oferă condiţii favorabile pentru anumite specii şi intolerabile pentru altele, numite microhabitate. Tractusul intestinal al mamiferelor, de exemplu, nu reprezintă un habitat unic ci un mozaic de microhabitate, situate în lumenul diferitelor segmente anatomice, pe suprafaţa epiteliilor şi în criptele mucoaselor care căptuşesc aceste segmente. Conceptul de ,,biotop” şi cel de ,,nişă ecologică” au o semnificaţie mai largă, deoarece se referă nu numai la spaţiul ocupat de un microorganism ci şi la funcţia lui în habitat.

Ansamblul de microorganisme care populează un biotop constituie microbiocenoza sau microbiota biotopului respectiv.

6.1. RĂSPÂNDIREA MICROORGANISMELOR ÎN NATURĂ

Microorganismele sunt prezente, din abundenţă, în toate mediile în care au fost căutate: sol, ape, aer, corpul fiinţelor vii (om, animale, plante), materia organică moartă, etc. Această ubicvitate decurge din capacitatea de a coloniza şi de a supravieţui în habitatele cele mai puţin adecvate vieţii (fundul oceanelor, gheţurile polare, zăcămintele de ţiţei, izvoarele hidrotermale, etc.) şi de a

72

metaboliza cele mai neobişnuite substraturi anorganice (N2, S, CO, CO2) şi organice (hidrocarburi, fenoli, crezoli, lemn, asfalt, etc.).

În ceea ce priveşte răspândirea pe verticală a microorganismelor, ea este de asemenea neobişnuit de extinsă în raport cu a celorlalte vieţuitoare. Cu ajutorul unor sonde speciale, bacteriile au putut fi detectate în atmosferă la înălţimea de 12.000 m, la 4000 m adâncime în pământ şi la 11000 m în adâncul mărilor şi al oceanelor.

Practic, nu există mediu natural la nivelul căruia să fie posibilă viaţa şi din care microorganismele să lipsească.

Distribuţia microorganismelor în natură, aspectele calitative şi cantitative ale microflorei sunt determinate în cea mai mare parte de particularităţile biotopului.

De exemplu, în lacurile sărate predomină bacteriile halofile, în apele termale se găsesc microorganisme termofile şi termotolerante, care lipsesc în izvoarele reci, iar în regiunile polare şi în adâncul oceanelor, unde temperatura rămâne tot timpul coborâtă, trăiesc numai bacterii psichrofile.

În mediile naturale obişnuite, mai puţin selective, microflora este mult mai heterogenă şi mai uniform răspândită, astfel încât graniţele comunităţilor de microorganisme sunt greu, sau uneori chiar imposibil de delimitat.

Cu toate acestea, pe baza unor criterii cum sunt prezenţa constantă şi în număr mare, microorganismele din fiecare biotop pot fi grupate în două categorii:

- microorganisme adaptate filogenetic la condiţiile fizico– chimice oferite de biotop, care alcătuiesc o comunitate de populaţii (specii) relativ stabilă, formând microbiota autohtonă ( normală sau rezidentă ) şi

- microorganisme provenite din alte medii, a căror prezenţă este în mod obişnuit tranzitorie deoarece sunt mai puţin adaptate la noile condiţii. Ele constituie microbiota alohtonă sau străină a biotopului respectiv. Eliminarea alohtonilor este determinată de incapacitatea lor de a competiţiona cu microorganismele autohtone, mai numeroase şi mai bine adaptate, sau cu factorii abiotici diferiţi.

Studiul comunităţilor de microorganisme care ocupă constant un biotop a arătat că structura lor evoluează în timp şi că stabilitatea finală a acesteia este condiţionată de înlocuirea unor populaţii cu altele mai bine adaptate şi care, prin interacţiuni de tip cooperant, asigură cea mai bună exploatare a habitatului.

Fenomenul este cunoscut sub denumirea de succesiune ecologică, iar ecosistemul terminal stabilizat este numit climax.

6.2. MICROBIOTA APELOR Micobiota autohtonă a apelor variază, sub aspectul structurii populaţiilor

de microorganisme, în funcţie de caracteristicile fizico-chimice ale mediului acvatic şi este corelată cantitativ cu bogăţia în nutrienţi.

Cea mai redusă încărcătură microbiană o are apa de izvor în apropiere de sursă, datorită suportului nutritiv foarte redus. Microorganismele prezente sunt cele antrenate din straturile subterane în cursul trecerii spre suprafaţă.

73

În cazul izvoarelor minerale, apa conţine o microbiotă autotrofă specifică, capabilă să metabolizeze Fe, S, sau alte minerale şi compuşii lor anorganici.

Cea mai abundentă şi mai variată microfloră se găseşte în apele de suprafaţă (râuri, lacuri), deoarece conţin cantităţi relativ mari de substanţe organice provenite din flora şi fauna proprie. În plus, ele sunt expuse contaminării cu microorganisme din sol şi din apele reziduale deversate de centrele urbane şi marile complexe zootehnice.

Pe lângă bacteriile provenite din sol, (Azotobacter spp, bacterii nitrificatoare, etc.), râurile conţin comunităţi bacteriene ce se diversifică pe măsura îndepărtării de izvoare. Microbiota normală, cu un caracter permanent, este compusă din bacterii aprţinând genurilor Achromobacter, Acinetobacter, Caulobacter, Flavobacterium, Hyphomicrobium, Moraxella, Pseudomonas, Aeromonas, etc., din cianobacterii, levuri şi microfungi.

Lacurile şi alte ape stătătoare au o microbiotă extrem de variată, care include practic toate categoriile de microorganisme: bacterii, microfungi, microalge şi protozoare.

Microbiota mărilor şi a oceanelor este alcătuită din microorganisme psichrofile, barofile şi halofile - însuşiri care constituie adaptări la particularităţile acestui biotop. Ele prezintă şi un pleomorfism accentuat, determinat probabil de efectele presiunilor hidrostatice mari (Zarnea G., 1999).

Majoritatea microorganismelor al căror habitat natural îl constituie apele nu trăiesc liber ci sunt asociate cu planctonul şi cu detritusurile organice, având un rol major în mineralizarea acestora.

Dintre bacteriile asociate zooplanctonului, unele prezintă potenţial patogen pentru peşti, fiind capabile să producă infecţii cu evoluţie endemico-epidemică şi pierderi economice apreciabile (Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum, etc.), iar altele, prezente la diverse specii din fauna marină (peşti, crabi, scoici, etc.), sunt agenţi ai toxiinfecţiilor alimentare (Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Aeromonas hydrophila, Clostridium botulinum tip E, etc.).

Microbiota alohtonă, contaminantă, a apelor de suprafaţă se compune deseori din bacterii patogene pentru om şi pentru animale, apa reprezentând sursa de infecţie pentru un număr mare de boli infecto-contagioase (leptospiroza, salmoneloza, tuberculoza, febra aftoasă, etc.). Infecţiile pentru care sursa principală de contaminare este apa, sunt cunoscute sub denumirea generică de infecţii hidrice.

Bacteriile patogene, ajunse accidental în mediul acvatic, au o existenţă temporară din cauza următorilor factori inhibanţi :

- diluţia mare a substanţelor nutritive şi temperatura relativ scăzută a apei; - competiţia cu populaţiile microbiene acvatice rezidente, mult mai

numeroase şi mai adaptate la condiţiile oferite de acest mediu; - prezenţa în apă a bacteriofagilor, care le distrug prin bacterioliză; - acţiunea bactericidă a razelor solare, care sunt eficiente, dacă apa este

limpede, până la 1 m adâncime.

74

Datorită factorilor menţionaţi, apele de suprafaţă suferă un proces de autopurificare, graţie căruia, la aproximativ 10-20 km în aval de sursa contaminantă, apele râurilor sunt în general lipsite de germeni patogeni.

Apele subterane rezultă din ploi, topirea zăpezilor şi infiltrarea apei din lacuri şi râuri până la nivelul unor straturi impermeabile. Încărcătura microbiană a acestor ape este invers proporţională cu adâncimea şi dependentă de natura subsolului străbătut, care acţionează ca un filtru mai mult sau mai puţin sterilizant.

Rocile nisipoase au proprietatea de a reduce numărul germenilor din apă, reţinându-i în cursul fitrării, în timp ce rocile calcaroase, care sunt parţial dizolvate, permit trecerea microorganismelor. O l s o n şi colaboratorii (cit. de Zarnea G.,1999) au evidenţiat prezenţa bacteriilor sulfito-reducătoare la adâncimea de 1264 – 1752 m.

6.3. MICROBIOTA SOLULUI

Solul conţine un număr imens de virusuri bacteriofage, bacterii, microfungi, protozoare şi alge, de o diversitate mai mare decât alte medii naturale.

Microorganismele autohtone sunt cele mai numeroase şi sunt caracteristice pentru un anumit tip de sol. Majoritatea sunt autotrofe, astfel încât dezvoltarea lor nu este condiţionată de nutrienţii din afara solului şi nu sunt expuse la fluctuaţii numerice semnificative (Zarnea G., 1999). Rolul lor este imens pentru nutriţia plantelor şi asigurarea fertilităţii solului, deoarece sunt singurele organisme capabile să îmbogăţească solul în azot prin fixarea azotului molecular din marele rezervor atmosferic.

Unele dintre ele – microorganismele zimogene, sau de fermentaţie - sunt heterotrofe, fiind dependente de substanţele organice provenite din exterior (resturi vegetale, excrete, cadavre animale, etc.). Prin activitatea lor metabolică, aceste bacterii realizează mineralizarea rezidurilor organice, având un rol esenţial în circuitul natural al carbonului şi azotului. Ele sunt puţin numeroase şi au o activitate periodică, dezvoltându-se luxuriant după adăugarea substanţelor organice exogene, pentru a reveni la normal când concentraţia nutrienţilor accesibili a diminuat.

Microbiota alohtonă a solului se compune din patogenii pentru plante, animale şi om, care ajung în sol odată cu ţesuturile vegetale infectate, apele reziduale, dejecţiile, secreţiile şi cadavrele animalelor bolnave. Solurile cele mai contaminate se află în perimetrul spitalelor, fermelor zootehnice, staţiunilor de ecarisaj, cimitirelor de animale, etc.

Aceste microorganisme au un caracter tranzitoriu, deoarece în sol nu găsesc condiţii de multiplicare ci numai de supravieţuire temporară, condiţionată de factorii de mediu şi de eventualitatea întâlnirii cu specia-gazdă.

Cea mai mare longevitate o au bacteriile patogene sporogene (genurile Bacillus şi Clostridium), care rezistă în sol zeci sau chiar sute de ani.

Infecţiile pentru care sursa primară de contaminare este solul, poartă denumire de infecţii telurice (antraxul, tetanosul, cărbunele emfizematos).

75

Concentraţia microorganismelor în sol este maximă în straturile superioare ale acestuia (primii 5 cm; rareori până la 150 cm), exceptând stratul extern cu o grosime de câţiva milimetri, unde numărul de germeni este mai redus din cauza factorilor de mediu care acţionează direct asupra lor (razele ultraviolete, căldura, variaţiile bruşte de temperatură şi umiditate, etc).

Straturile profunde ale solului, cu excepţia celor care prezintă fisuri, sunt lipsite de microorganisme, din cauza rolului de filtru pe care îl joacă straturile succesive.

6.4. MICROBIOTA AERULUI

Aerul nu poate fi considerat un biotop în sensul strict al cuvântului deoarece, fiind lipsite de un suport nutritiv, microorganismele nu se pot multiplica. În acest mediu, ele găsesc doar condiţii de supravieţuire temporară, cel mai adesea în stare latentă (sub formă de spori). De aceea, ideea mai veche a existenţei unei microbiote specifice aerului, a fost abandonată (Zarnea G., 1999). Aerul reprezintă însă cel mai important mijloc de dispersare a microorganismelor, curenţii de aer putând să le vehiculeze, atât pe orizontală cât şi pe verticală, la distanţe apreciabile. Antrenate de curenţii de aer şi protejate de picăturile mici de apă sau praf, bacteriile ajung până la înălţimea de 500 m, dar s-au putut izola şi la 12.000 m, unde au însă o supravieţuire redusă din cauza efectului bactericid al razelor ultraviolete, temperaturilor scăzute şi variaţiilor mari ale umidităţii relative. Spaţiul cosmic explorat până în prezent este microbiologic steril. Principalele surse de contaminare microbiologică a aerului sunt solul (prin particulele de praf, secreţii şi excreţii uscate, care sunt antrenate în atmosferă de curenţii de aer) şi aerosolii fini, microscopici, numiţi picături Pflüge, expulzaţi din căile respiratorii ale omului şi animalelor, prin expiraţie, tuse şi strănut.

Fig.25 Hotă cu flux de aer laminar

pentru siguranţă microbiologică

76

Cele mai importante implicaţii ale prezenţei microorganismelor în aer sunt transmiterea pe cale aerogenă a unor boli infecţioase (tuberculoza, difteria, micoplasmoza, gripa, etc.) şi contaminarea culturilor microbiene în timpul operaţiunilor de însămânţare şi transplantare. Cel de-al doilea neajuns poate fi evitat prin efectuarea manoperelor microbiologice în hote (boxe) cu aer laminar pentru siguranţă microbiologică (fig. 25). Spaţiul de lucru din aceste boxe este scăldat de aer sterilizat prin filtrare, cu ajutorul filtrelor HEPA (High Efficienty Particulate Air Filtres ).

6.5. MICROBIOTA UNOR ALIMENTE DE ORIGINE ANIMALĂ

Prin nutrienţii din compoziţia lor, alimentele constituie un mediu de cultură optim pentru multiplicarea unui număr mare de specii bacteriene şi microfungi şi asigură supravieţuirea pentru un timp limitat a microorganismelor strict parazite (rickettsii, chlamidii, virusuri).

Microbiota autohtonă a alimentelor este constituită din microorganismele saprofite pe care fiecare aliment le întâlneşte în circuitul său, de la obţinere până la consumator. Prezenţa acestor microorganisme în număr mare reprezintă un indicator al condiţiilor de igienă necorespunzătoare şi influenţează negativ sănătatea consumatorului prin produşii rezultaţi din degradarea enzimatică a alimentelor (alterare).

De asemenea, prin microorganismele patogene pe care le vehiculează şi prin metaboliţii lor toxici, alimentele pot genera toxiinfecţii alimentare şi boli infecţioase grave cu poartă de intrare digestivă ( tuberculoza, antraxul, hepatitele virale, etc. ).

6.5.1. MICROBIOTA LAPTELUI

Laptele provenit de la animalele sănătoase şi recoltat în condiţii igienice conţine de obicei un număr redus de microorganisme (300 – 500/ml). Încărcătura microbiană a laptelui este mai mare în primele jeturi, deoarece antrenează microflora existentă pe mucoasa canalelor galactofore, apoi scade treptat.

În laptele provenit de la animalele cu infecţii ale glandei mamare, cazate în adăposturi insalubre, sau la care mulsul se efectuează în condiţii necorespunzătoare (recipiente sau instalaţii de muls neigienizate, mulgători cu mâinile murdare, uger murdar, etc.), numărul microorganismelor pe mililitru poate fi de ordinul sutelor de mii sau chiar mai mult ( Grecianu Al. şi col., 1973) Imediat după muls, microorganismele sunt repartizate uniform în masa laptelui. În timpul păstrării însă, odată cu ridicarea grăsimilor, ele sunt antrenate către suprafaţă, concentrându-se în stratul de smântână.

Microbiota normală a unui lapte igienic se compune în cea mai mare parte din bacterii aparţinând genurilor Lactobacillus (L. acidophilus, L.casei, ş.a. ) şi Streptococcus ( S. lactis, S. cremoris, S. thermophilus, etc.) - bacterii care prin activitatea lor fermentativă imprimă produselor lactate gustul specific.

77

Mirobiota de contaminare a laptelui este dependentă calitativ şi cantitativ de condiţiile de recoltare şi de păstrare. Ea poate însuma specii bacteriene aparţinând genurilor: Pseudomonas, Achromobacter, Leuconostoc, Micrococcus, Propionibacterium, Proteus, Escherichia, Enterobacter, Clostridium, etc. (Mănescu S., 1989).

Dată fiind originea intestinală a unora dintre aceste bacterii (Escherichia coli, Proteus spp., Clostridium perfringens), prezenţa lor denotă o poluare de origine fecală şi constituie un indicator al condiţiilor sanitare pe circuitul laptelui. Speciile patogene care pot contamina laptele şi care produc infecţii la om în urma consumului de lapte nefiert sunt: Mycobacterium bovis, Brucella abortus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes etc.

6.5.2. MICROBIOTA CARNII

Carnea conţine o floră microbiană foarte variată, dependentă de posibilităţile de contaminare în timpul vieţii animalului (în cursul infecţiilor septicemice) şi după sacrificare. Condiţiile de mediu, în special temperatura crescută şi umiditatea, permit microflorei existente să se multiplice şi să producă, într-un timp relativ scurt, alterarea (putrefacţia) cărnii prin proteoliză enzimatică.

Microorganismele care iau parte la procesul de putrefacţie se succed în funcţie de condiţiile favorabile multiplicării, existente la un moment dat. Astfel, bacteriile aerobe şi anaerobe facultativ, cum sunt micrococii, streptococii, speciile aparţinând genurilor Pseudomonas, Proteus, Achromobacter, bacilii sporulaţi aerobi (Bacillus subtilis, Bacillus mycoides) intervin primele, consumând oxigenul de la suprafaţă şi creând condiţii favorabile dezvoltării bacteriilor anaerobe din genul Clostridium. Putrefacţia cărnii poate avea loc şi la temperaturi scăzute, când intervin bacteriile criofile şi mucegaiurile din genurile Mucor, Penicilium, Aspergillus, Cladosporium, etc. Prin intermediul cărnii contaminate se pot transmite la om numeroase boli infecţioase ca antraxul, tuberculoza, salmoneloza, rujetul, bruceloza, tularemia, morva şi altele. Din acest considerent, carnea constitiuie unul din obiectivele principale ale expertizei sanitar-veterinare.

6.5.3. MICROFLORA OUALOR

La depunere, ouăle păsărilor sănătoase sunt sterile. Ele se contaminează ulterior cu microorganismele din cuibare sau de pe grătare şi în timpul manipulării. De pe coaja ouălor proaspete se izolează frecvent bacterii din genurile Proteus, Pseudomonas, Achromobacter, Aeromonas, Escherichia, etc. Ca o consecinţă a învechirii ouălor, aceste bacterii pătrund în interior determinând alterarea conţinutului prin putrefacţie (Grecianu Al., 1986; Mănescu S., 1989). Alterarea prin mucegăire apare sub formă de pete colorate pe faţa internă a cojii şi pe gălbenuş. Mai frecvent implicate în mucegăirea ouălor sunt genurile: Cladosporium, Penicillium, Sporotrichum şi Mucor.

78

În albuşul ouălui proaspăt, microorganismele sunt absente sau în număr foarte redus, datorită acţiunii bactericide a lizozimului (ferment glucidolitic activ faţă de bacteriile Gram pozitive), care se găseşte în cantitate apreciabilă. Dintre bacteriile patogene pentru om, mai frecvent vehiculate prin ou sunt salmonelele, deoarece pot fi transmise pe cale verticală de păsările purtătoare.

Consumul de ouă contaminate cu salmonele, ca atare, sau sub formă de preparate neprelucrate sau insuficient prelucrate termic, constituie o cauză frecventă a toxiinfecţiilor alimentare.

6.6. MICROBIOTA ORGANISMULUI ANIMAL

Corpul animalelor şi al omului oferă condiţii favorabile de dezvoltare pentru numeroase microorganisme: bacterii, microfungi şi protozoare. Ele găsesc pe şi în corpul animalelor, suport nutritiv, condiţii constante de pH şi presiune osmotică, iar în cazul homeotermelor, şi condiţii de temperatură constante. În cursul vieţii intrauterine, organismele animale sunt sterile. Popularea cu microorganisme începe la naştere, în timpul trecerii prin vagin şi continuă prin contactul cu indivizii şi obiectele din jur, prin inspiraţie, alimentaţie, etc., pe tot parcursul vieţii. Ele colonizează pielea şi mucoasele care căptuşesc diferite regiuni şi cavităţi ce comunică cu mediul extern: nazofaringele, conjunctiva, tubul digestiv şi căile genitourinare inferioare. Microorganismele asociate cu organismele animale se constituie în cele două tipuri de microbiotă deja cunoscute: microbiota autohtonă şi microbiota alohtonă. Microbiota autohtonă este reprezentată de comunităţi de microorganisme a căror asociere cu organismul animal a fost stabilită filogenetic, în cursul evoluţiei comune şi a căror structură diferă în cursul evoluţiei ontogenetice a fiecărui individ. Imediat după naştere, colonizarea tegumentelor şi a mucoaselor aparente este fortuită şi dependentă de primele microorganisme întâlnite, un rol important revenind microbiotei organismului matern. După câteva săptămâni însă, ca urmare a contactului cu alţi indivizi şi cu diverse medii naturale, organismul nou-născutului este populat de o microbiotă asemănătoare celei a adultului sănătos.

Deoarece fiecare regiune a corpului animal diferă din punct de vedere fizico-chimic de celelalte regiuni, organismul animal constituie în ansamblul său un mozaic de microhabitate.

Pentru a le coloniza, microorganismele trebuie să învingă numeroase obstacole, care diferă în funcţie de natura habitatelor respective. Printre acestea se numără sistemele de eliminare mucociliare şi peristaltismul intestinal (care îndepărtează bacteriile nelegate de epitelii), procesul periodic de îndepărtare a celulelor epiteliale senescente, imunitatea locală, variaţiile de Ph, competiţia cu alte microorganisme, etc.

O condiţie esenţială a colonizării este complementaritatea care terbuie să existe între adezinele bacteriene şi receptorii de pe suprafaţa celulelor epiteliale

79

ale gazdei. Cel mai frecvent, adezinele sunt reprezentate de fimbrii, care se leagă de receptori de natură glicoproteică.

În ultimii ani s-a semnalat existenţa unei înrudiri imunologice între microorganismele şi mucusul sau mucoasa intestinală în care acestea ocupă în mod normal un habitat (Zarnea G., 1999).

Prin urmare, faptul că aceste microorganisme sunt recunoscute ca proprii (,,self”) de sistemul imunitar al gazdei, constituie un alt factor favorizant al colonizării habitatelor respective.

Între diferitele specii de microorganisme care alcătuiesc microbiota normală a microhabitatelor organismului animal există un echilibru dinamic, care poartă denumirea de eubioză.

Ruperea acestui echilibru din diverse cauze (frecvent, antibioterapia de lungă durată pe cale orală şi modificările de Ph) se numeşte disbioză şi favorizează apariţia îmbolnăvirilor prin multiplicarea în exces a unor specii rezidente, sau prin implantarea microorganismelor străine patogene.

Microbiota alohtonă sau străină a organismului animal se compune din microorganismele provenite din mediul extern (aer, apă, sol, alimente) sau de la alte animale. Comparativ cu microbiota autohonă, ea are un caracter tranzitoriu deoarece este incapabilă să se adapteze la noile condiţii şi implică posibilitatea de a conţine specii patogene.

Microorganismul străin poate ocupa doar o nişă eliberată de un autohton, atunci când aceasta este perturbată şi adusă la o condiţie anormală. Când sistemul revine la normal, microorganismul autohton îşi va reocupa nişa, eliminând specia alohtonă.

Capacitatea microorganismelor alohtone de a coloniza un anumit habitat şi de a se multiplica în el numai în circumstanţe anormale reprezintă, după Savage, 1997 (citat de Zarnea G., 1999), distincţia fundamentală dintre microbiota alohtonă şi cea autohtonă.

Cele mai studiate dintre microhabitatele organismului animal sunt cele oferite de segmentele anatomice ale tubului digestiv.

Menţionăm faptul că la acest nivel, un microorganism poate fi autohton pentru un anumit segment şi alohton pentru altul, pe care-l tranzitează după ce s-a desprins din habitatul său natural. De exemplu, un microorganism din colon poate fi alohton dacă provine din segmentele superioare (cavitatea bucală, stomac, intestin subţire) sau chiar de la nivelele inferioare colonului (în cazul animalelor coprofage).

6.6.1. MICROBIOTA GASTRICA

Microorganismele ajung în stomac odată cu alimentele ingerate şi apa. Acestă contaminare este foarte accentuată în cazul animalelor coprofage (iepure, porc), care pot ingera zilnic cantităţi imense de microorganisme alohtone provenite din fecale.

80

Deoarece, odată ajunse în stomac, majoritatea microorganismelor sunt distruse de aciditatea sucului gastric (Ph = 1,7 –2,2) şi de enzime, multă vreme stomacul a fost considerat steril.

Totuşi, din conţinutul gastric se izolează frecvent specii acido-tolerante aparţinând genurilor Lactobacillus, Candida şi Torulopsis. În număr mai mic au mai fost semnalate: Bifidobacterium spp., Clostridium spp., Streptococcus spp., Veillonella spp., Peptostreptococcus spp., Bacteroides spp., Helicobacter spp., ş.a.

Pentru a fi considerate ca semnificativ prezente în stomac, microorganismele trebuie să fie prezente la mai mulţi indivizi investigaţi şi să depăşească densitatea de 103 celule/ ml.

6.6.2. MICROBIOTA INTESTINULUI SUBTIRE

Acest segment al tubului digestiv cuprinde cel puţin trei habitate diferite sub aspectul gradientului de Ph: duodenul (Ph apropiat de cel al stomacului), jejunul (Ph = 5,9 – 6,6) şi ileonul (Ph = 7 – 7,3).

În duoden şi jejun, din cauza acidităţii încă destul de crescute, este prezent un număr redus de specii (Streptococcus spp., Lactobacillus spp. şi Candida albicans), unele dintre ele fiind derivate în mod cert din cavitatea bucofaringiană.

Numărul acestora poate creşte însă, în aclorhidrie şi în alte stări patologice.

Ileonul, datorită Ph-ului uşor alcalin, constituie un habitat optim. Dintre speciile prezente în densităţi semnificative sunt de menţionat cele aparţinând genurilor: Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Clostridium, Bacteroides, Veillonella, Staphylococcus, Actinobacillus, cărora li se alătură bacteriile coliforme şi bacilii anaerobi Gram pozitivi.

Alţi factorii care limitează prezenţa şi multiplicarea bacteriilor în intestinul subţire, înafară de aciditate, sunt peristaltismul rapid şi existenţa unor substanţe care inhibă multiplicarea acestora.

6.6.3. MICROBIOTA INTESTINULUI GROS

Rezervor major de microorganisme, intestinul gros conţine o comunitate microbiană exterm de complexă. Ea este alcătuită, la cele mai multe mamifere, inclusiv la om, din câteva sute de specii bacteriene, dintre care numai puţine au fost cultivate in vitro şi identificate. Majoritatea aparţine genurilor: Escherichia, Proteus, Aerobacter, Fusobacterium, Bacteroides, Enterococcus, Clostridium, ş.a.

Din numărul total al bacteriilor, contrar statisticilor mai vechi, coliformii reprezintă doar 0,1 - 1% (Zarnea G., 1999).

Microbiota intestinului gros include şi microorganisme alohtone provenite din alimente sau din segmentele superioare ale tubului digestiv. Aflate în tranzit, ele sunt nesemnificative numeric şi funcţional comparativ cu populaţiile microbiene stabile.

Din cauza tranzitului lent, care permite multiplicarea bacteriilor, în ultimul segment al intestinului gros (rectum) numărul acestora atinge densităţi enorme:

81

aproximativ 1010 celule bacteriene/gram, ceea ce reprezintă 10% din greutatea conţinutului total al colonului sau 25% din greutatea uscată a fecalelor.

Această microfloră desfăşoară o activitate metabolică considerabilă, în cea mai mare parte benefică pentru organism:

- la ierbivore fermentează celuloza, punând la dispoziţia organismului o sursă suplimentară de energie;

- sintetizează cantităţi importante de vitamine din grupul B, vitamina K, vitamina PP, acid pantotenic, acid folic, etc., acoperind o parte din necesarul organismului;

Aspectele negative legate de prezenţa microbiotei intestinale constau în eliberarea de produşi toxici (indol, scatol, amoniac, etc.) prin hidroliza enzimatică a unor proteine şi aminoacizi. Deoarece membranele celulare ale epiteliului intestinal sunt extrem de permeabile faţă de amoniac şi din cauza toxicităţii cronice a acestui catabolit, se consideră că microbiota colonului ar avea rol în geneza unor boli, printre care şi cancerul de colon (Zarnea G., 1999).

6.6.4. MICROBIOTA RUMENULUI

Sucurile digestive la ierbivore, ca şi la celelalte mamifere, sunt lipsite de enzime digestive pentru celuloză şi alte polizaharide complexe (pectine, amidon, etc.), deşi acestea reprezintă substratul de bază al nutriţiei lor vegetale.

Din această cauză, ierbivorele folosesc microorganismele celulozolitice prezente în tubul digestiv pentru a asigura transformarea substanţelor polizaharidice complexe în forme solubile şi asimilabile. Contribuţia microorganismelor la nutriţia gazdei este diferită în funcţie de compartimentul în care îşi desfăşoară activitatea.

La erbivorele nerumegătoare, degradarea ţesuturilor vegetale are loc, după digestia în stomac şi intestinul subţire, într-un cecum lărgit şi uneori foarte lung, unde gradul de digerare a celulozei şi a altor polizaharide este de 20 – 30 %. La iepuri şi la cobai această ineficienţă este parţial compensată prin coprofagie.

La rumegătoare, digestia acestor substanţe se realizează în rumen cu participarea unor microorganisme – bacterii anaerobe şi protozoare – mult mai eficiente.

Sub acţiunea enzimelor bacteriene (celulazele), celuloza este scindată în glucoză, care prin fermentaţie se transformă în acizi graşi volatili şi gaze ( H2 , CH4 , CO2 , etc. ). Acizii graşi rezultaţi (acetic, propionic, butiric) se absorb în sânge, reprezentând o importantă sursă energetică.

Se apreciază că, din cele câteva sute de specii bacteriene prezente în rumen, numai 17 – 30 domină numeric şi au o activitate metabolică semnificativă, fapt sugerat de prezenţa lor constantă la diferite specii de rumegătoare, din diferite regiuni geografice. Printre acestea se numără: Bacteroides spp., Methanobacterium spp., Peptostreptococcus spp., Ruminococcus albus, Veillonella gazogenes şi alte specii anaerobe.

82

Protozoarele prezente în rumen aparţin, asemenea bacteriilor, unui număr însemnat de genuri şi specii. Pe lângă faptul că participă efectiv, lături de bacterii, la procesul de digestie, protozoarele consumă oxigenul, realizând anaerobioza necesară dezvoltării microflorei bacteriene şi intervin în reglarea numărului de bacterii prin competiţie pentru nutrienţi.

6.7. RELAŢIILE ECOLOGICE ALE BACTERIILOR

Între speciile bacteriene componente ale microbiocenozelor, între acestea şi alte categorii de microorganisme care colonizează un habitat sau se găsesc în tranzit (virusuri, micromiceţi, protozoare), precum şi între microorganisme şi macroorganisme, apar interacţiuni care pot fi grupate în trei categorii: indiferente (neutralism), de tip beneficial sau cooperant şi de tip antagonic.

6.7.1. RELAŢIILE ECOLOGICE INTERBACTERIENE şi ALE BACTERIILOR CU ALTE CATEGORII DE MICROORGANISME

Neutralismul, care presupune lipsa unor influenţe reciproce între două sau mai multe specii, este considerat de mulţi cercetători ca o relaţie puţin probabilă în natură sau, în orice caz, cu o importanţă minimă. El este întâlnit atunci când populaţiile microbiene sunt destul de îndepărtate unele de altele şi în cazul microorganismelor foarte diferite sub raportul exigenţelor nutritive, care nu competiţionează pentru aceiaşi nutrienţi.

6.7.1.1. Interrelaţii microbiene de tip beneficial

Relaţiile de tip beneficial sau cooperant presupun ca cel puţin una dintre speciile care interacţionează să aibă un beneficiu. În funcţie de gradul de reciprocitate al beneficiului, de gradul de dependenţă care se crează între speciile partenere şi de efectele acţiunii cooperante a bacteriilor asupra substratului, relaţiile beneficiale pot fi de mai multe feluri.

6.7.1.1.1. Comensalismul

Comensalismul sau metaboliz a este un tip de relaţie în care una dintre specii profită de asociere, iar cealaltă, în aparenţă, nici nu profită şi nici nu este influenţată negativ. Relaţiile comensale, la rândul lor, îmbracă mai multe aspecte.

- Relaţii în care beneficiul constă în punerea la dispoziţia bacteriei care profită, a unei substanţe nutritive necesare activităţii ei vitale, care este un metabolit produs de cealaltă bacterie. Pe baza unui asemenea tip de relaţie se realizează circulaţia în natură a principalelor elemente biogene (N, C, S), unele specii bacteriene producând substratul necesar celorlalte. Un exemplu în acest sens îl constituie bacteriile din sol care oxidează nitriţii în nitraţi (Nitrobacter, Nitrocystis) şi care nu se pot dezvolta decât în prezenţa bacteriilor care oxidează în prealabil amoniacul în nitriţi (Nitrosomonas, Nitrosocystis), furnizându-le subsatanţa azotată absolut necesară nutriţiei.

83

- Relaţii în care una dintre bacteriile asociate furnizează celeilalte un factor de creştere esenţial. Un exemplu tipic pentru acest gen de relaţie este asocirea dintre hemofili - bacterii care reclamă prezenţa în mediul de cultură a factorului V (NAD sau NADP ) - şi unele specii capabile să-l sintetizeze, desemnate din acest considerent cu termenul de “doică”: stafilococi albi, Bacillus spp., Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Sarcina lutea, levuri (Buiuc G., 1999 ). Coloniile de Haemophilus se dezvoltă cu precădere limitrof coloniilor-doici, datorită concentraţiei mari de factor V în această zonă, fenomen ce poartă denumirea de ,,satelitism”.

- Relaţii în care beneficiul rezultă din degradarea sau neutralizarea unei substanţe cu efect nociv pentru partener. Astfel, Escherichia coli şi alţi Gram negativi produc penicilinază - enzimă cu ajutorul căreia degradează penicilina, creând condiţii de multiplicare bacteriilor penicilinosensibile .

- Relaţii bazate pe modificarea mediului, astfel încât acesta devine favorabil pentru comensal, sub raport fiziologic. Microorganismele aerobe şi facultativ anaerobe, consumând oxigenul, diminuează potenţialul redox al mediului şi crează condiţii favorabile pentru anaerobii stricţi. Un exemplu caracteristic este cel al gangrenei gazoase, în care bacteriile contaminante crează condiţiile necesare pentru dezvoltarea agenţilor patogeni specifici (Clostridium perfringens, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, etc.).

6.7.1.1.2. Simbioza

Simbioza este o relaţie cu caracter specific şi permanent (se crează o dependenţă complementară între parteneri), în care beneficiul este bilateral. Acest tip de relaţie este întâlnit mai frecvent la cianobacterii, licheni şi protozoare.

6.7.1.1.3. Mutualismul

Mutualismul sau simbioza nutriţională reprezintă o relaţie între două specii de microorganisme, care au nevoie una de alta pentru dobândirea anumitor metaboliţi esenţiali. Spre deosebire de simbioza propriu-zisă, în cadrul relaţiilor mutuale asocierea nu este permanentă şi nu constituie o condiţie sine qua non a existenţei celor doi parteneri. Relaţia poate fi pusă în evidenţă pe medii de cultură deficiente, în care nici unul dintre microorganisme nu poate creşte separat. Speciile Haemophilus canis şi Haemophilus parainfluenzae, de exemplu, nu cresc atunci când sunt însămânţate separat în apă peptonată, dar, dacă sunt asociate formează pe acelaşi mediu culturi abundente. Analiza activităţii lor metabolice a arătat că fiecare dintre ele realizează sinteza unui factor de creştere absolut indispensabil celeilalte, care însă nu are capacitatea de a-l elabora: H. canis sintetizează factorul V, iar H. parainfluenzae, factorul X (hematina).

Un alt exemplu îl constituie asocierea Mucor – Rhodotorula, două ciuperci microscopice care nu cresc pe medii lipsite de tiamină (vitamina B1). Cultivate împreună, ele nu mai necesită aport exogen de tiamină, deoarece Mocor

84

sintetizează o parte din molecula vitaminei (nucleul tiazolic) iar Rodothorula, cealaltă parte (nucleul pirimidinic).

6.7.1.1.4. Sinergismul

Sinergismul este o relaţie facultativă, în care două bacterii care se multiplică la nivelul aceluiaşi biotop produc un efect (degradare, sinteză, leziune, etc.) pe care nici una dintre ele nu este capabilă să-l producă singură.

Relaţia este întâlnită în mediile naturale, în cadrul microbiocenozelor organismului animal şi chiar în etiopatogeneza unor infecţii. Astfel, arginina este descompusă până la stadiul de putresceină numai prin acţiunea sinergică a speciilor Escherichia coli şi Streptococcus faecalis; pigmentul prodigiosina poate fi sintetizat uneori de tulpini apigmentogene de Serratia marcescens cultivate împreună; în pododermatita infecţioasă a bovinelor şi ovinelor, specia Bacteroides nodosus declanşează procesul patologic, iar Fusobacterium necrophorum şi alte specii asociate în mod constant (stafilococi, actinomicete, treponeme, etc.) poartă responsabilitatea tabloului lezional.

Relaţiile sinergice dintre microorganisme au găsit aplicaţie în diverse domenii de activitate, printre care şi industria laptelui. Maelele obţinute din asocierea unor bacterii lactice (Streptococcus lactis, S. cremoris, Lactobacillus acidophylus, etc.), din bacterii şi levuri, sunt utilizate la prepararea diferitelor produse lactate, pentru a le conferi calităţi gustative specifice.

6.7.1.2. Interrelaţii microbiene de tip antagonic

Relaţiile de tip anatagonist presupun un efect nefavorabil sau nociv al unuia dintre parteneri pentru celălalt. În funcţie de mecanismul de acţiune, relaţiile antagonice pot fi, la rândul lor, de mai multe feluri.

6.7.1.2.1. Parazitismul

Parazitismul este un tip de relaţie în care un microorganism se multiplică pe seama celuilalt, distrugându-l.

O relaţie tipică de parazitism în lumea microorganismelor este bacteriofagia - fenomenul de parazitism al virusurilor bacteriene, numite şi bacteriofagi sau fagi, în celula bacteriană. Efectul multiplicării bacteriofagilor de către celula bacteriană este liza celulei gazdă (bacterioliza). El este vizibil în gazonul bacterian pe medii solide, sub forma unor discontinuităţi circulare numite “plaje”.

Specificitatea de gazdă a bacteriofagilor a permis valorificarea fenomenului de bacteriofagie în scopul identificării unor genuri şi specii bacteriene prin test fagic (Salmonella spp., Brucella abortus, Bacillus anthracis, etc.), şi al creării de subdiviziuni în cadrul unor specii (fagovariante, fagotipuri sau lizotipuri). Fagotipizarea este utilă mai ales în stabilirea filierelor epidemiologice a unor infecţii bacteriene cum sunt cele produse de Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, ş.a.

85

Parazitarea unei bacterii de către o altă bacterie este un fenomen mai rar întâlnit decât bacteriofagia, dar care are acelaşi rezultat : bacterioliza.

Un caz foarte cunoscut este endoparazitismul speciei Bdellovibrio bacteriovorus la numeroase bacterii din genurile Escherichia, Salmonella, Serratia, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, etc. Datele de microscopie electronică arată că, după un atac mecanic direct asupra peretelui celular, foarte probabil asociat cu acţiunea unei exoenzime, parazitul pătrunde în celula – gazdă determinând dezorganizarea şi digestia conţinutului celular pe seama căruia creşte şi se multiplică, producând în cele din urmă liza celulei parazitate.

6.7.1.2.2. Competiţia

Competiţia este o interacţiune cu importanţă fundamentală pentru toate organismele şi probabil cea mai importantă ca mecanism selectiv. Ea este observată frecvent în cazul microorganismelor stabilite în acelaşi habitat, care au nevoie de aceiaşi nutrienţi, iar aceştia se găsesc în cantităţi limitante, adică prea mici pentru a le satisface cerinţele.

Unii cercetători extind conceptul de competiţie, de la nutrienţi, la spaţiu, lumină, oxigen şi oricare altă necesitate comună faţă de o sursă limitată a biotopului comun. Spre deosebire de parazitism, în competiţie influenţele adverse se realizează indirect, prin luptă bilaterală pentru satisfacerea unor necesităţi comune. Specia privilegiată este aceea care se multiplică mai repede, eliminând din biotop specia sau speciile competitoare care au un ritm de multiplicare mai lent.

Un exemplu în acest sens îl constituie evoluţia în culturi mixte a speciilor E. coli şi S. aureus. fig. 26 prezintă curbele de creştere, practic identice, în culturi monospecifice şi efectul cultivării lor asociate.

Fig.26 Competiţia dintre Escherichia coli şi

Staphylococcus aureus (după Oberhofer şi Frazier,

1961, citat de Zarnea G., 1994)

Se observă diminuarea netă a numărului de celule bacteriene aparţinând

speciei S. aureus, determinată de ritmul mai rapid de multiplicare a E. coli, care, consumând nutrienţii, limitează creşterea speciei asociate.

Un alt avantaj pentru o specie aflată în competiţie, pe lângă viteza mai mare de multiplicare, este mobilitatea. Bacteriile invadante, care roiesc de obicei

86

pe suprafaţa mediilor solide, sunt capabile să ocupe un habitat înaintea celor imobile şi a celor cu un aparat ciliar mai puţin activ.

Competiţia este observată frecvent in vitro pe plăcile Petri: coloniile foarte apropiate între ele, care competiţionează pentru spaţiu şi nutrienţi, sunt mult mai mici comparativ cu cele distanţate. De asemenea, în culturile mixte nu se ajunge niciodată la densitatea maximă observată în culturile monospecifice, deoarece, în majoritatea cazurilor, există o specie avantajată prin viteza de multiplicare şi/sau mobilitate, care va inhiba multiplicarea celorlalte prin spolierea mediului în nutrienţi esenţiali.

În condiţii naturale, competiţia dintre microorganisme este influenţată şi de o serie de parametri abiotici ai mediului (Ph, temperatură, concentraţia oxigenului sau a sărurilor, etc.), care pot afecta viteza de creştere a populaţiilor de microorganisme.

Acest fenomen este evident în cazul populaţiilor de bacterii psichrofile şi psichrotrofe, care, prezente asociat, competiţionează pentru aceiaşi nutrienţi. La temperaturi joase sunt avantajate microorganismele psichrofile, care se multiplică cu viteze mai mari, putând exclude psichrotrofele. La temperaturi mai ridicate, situaţia se inversează, fiind avantajate psichrotrofele. În habitatele cu variaţii periodice de temperatură, avantajele evoluează când într-un sens, când într-altul, determinând predominanţa uneia sau alteia din cele două populaţii.

6.7.1.2.3. Antagonismul propriu-zis

Antagonismul propriu-zis sau a ntibioza se realizează prin intermediul unor substanţe sintetizate şi eliminate în mediu de unele specii microbiene, care exercită un efect nociv asupra altor specii.

În funcţie de natura acestor substanţe şi de modalitatea de acţiune, antagonismul microbian poate fi specific şi nespecific.

Antagonismul specific se realizează pe baza unor substanţe sintetizate de unele specii de bacterii şi fungi, denumite antibiotice.

În funcţie de toxicitatea pentru celula animală şi de spectrul antibacterian, antibioticele se împart în două categorii: antibiotice propriu-zise şi bacteriocine.

Primul antibiotic a fost descoperit de A l e x a n d e r F l e m i n g în 1929, în urma sesizării antagonismului exercitat de o ciupercă din genul Penicillium faţă de stafilococ. Plecând de la observaţia lui F l e m i n g, o echipă de cercetători de la Universitatea din Oxford, condusă de C h a i n şi F l o r y, a reuşit în 1940 să extragă din culturile de Penicillium şi să purifice substanţa activă cu efect antibiotic (penicilina), introducând-o pe scară largă în terapia infecţiilor.

În anii următori au fost identificate şi extrase numeroase alte antibiotice. Cele mai multe se obţin din actinomicete aparţinând genului Streptomyces (streptromicina, cloramfenicolul, tetraciclina, eritromicina, etc.), din bacterii aparţinând genului Bacillus (polimixina, bacitracina, etc.) şi din ciuperci microscopice, cum este cazul genurilor Penicillium şi Cephalosporium (penicilina, cefalosporina, etc.).

87

Pe lângă antibioticele de biosinteză, există numeroase antibiotice obţinute prin sinteză chimică şi semisinteză. Antibioticele acţionează selectiv, numai asupra celulei bacteriene (majoritatea având un efect bacteriostatic), fiind lipsite de nocivitate pentru celula animală.

Ele pot fi clasificate după mai multe criterii: compoziţia chimică, spectrul antibacterian, mecanismul de acţiune, etc. Pe baza spectrului antibacterian, antibioticele se împart în :

- antibiotice de tip penicilinic, predominant active faţă de bacteriile Gram pozitive (penicilina, eritromicina, novobiocina, etc.);

- antibiotice de tip streptomicinic, predominant active faţă de bacteriile Gram negative (streptomicina, neomicina, kanamicina, polimixina B, etc.);

- antibiotice cu spectru larg, active faţă de bacteriile Gram pozitive şi Gram negative (tetraciclinele, cloramfenicolul, cefalosporinele, etc).

Pe baza mecanismului de acţiune, antibioticele pot fi grupate astfel : - antibiotice cu efect inhibitor asupra sintezei peretelui celular, care

blochează diferite faze ale sintezei peptidoglicanului (penicilina, cefalosporinele ş.a.); - antibiotice care alterează ireversibil structura membranei

citoplasmatice şi implicit funcţia de barieră osmotică a acesteia, astfel încât celula pierde ioni esenţiali pentru desfăşurarea normală a metabolismului (polimixina B, nistatina, colistina, ş.a.);

- antibiotice cu efect dereglator asupra transcrierii sau traducerii informaţiei genetice, care acţionează prin blocarea replicării ADN, blocarea fazei de iniţiere a transcrierii informaţiei genetice de pe ADN pe ARN mesager, modificarea secvenţei aminoacizilor în cursul sintezei lanţurilor peptidice prin schimbarea conformaţiei ribozomilor, etc.

Fiecare specie bacteriană se caracterizează printr-un spectru de sensibilitate şi de rezistenţă naturală la antibiotice, controlat genetic de gene cromozomale sau plasmidice. Acest spectru se poate modifica datorită posibilităţii dobândirii antibiorezistenţei prin diferite mecanisme genetice şi biochimice. Mecanismele genetice de dobândire a rezistenţei la antibiotice sunt mutaţiile la nivel cromozomal (cu o rata de 10-5 - 10-11) şi recombinările genetice consecutive primirii de material genetic exogen prin transformare, transducţie, conjugare. Rolul cel mai important în dobândirea antibiorezistenţei îl are, însă, transferul plasmidelor R.

Mecanismele biochimice de rezistenţă la antibiotice constau în: - inactivarea antibioticului în afara celulei bacteriene cu ajutorul unor

exoenzime; - stoparea accesului în celulă; - alterarea sediului-ţintă al antibioticului.

Practica medicală şi cea veterinară trebuie să urmărească limitarea posibilităţilor de dobândire a antibiorezistenţei de către bacterii, prin utilizarea cât mai raţională a antibioticelor în scopuri terapeutice şi folosirea cât mai limitată şi mai atent supravegheată a deşeurilor rezultate de la fabricarea antibioticelor, ca

88

biostimulatori în zootehnie. Tendinţa actuală este de înlocuire a acestora într-o proporţie cât mai mare, mai ales în reţetele furajere, cu probioticele. Bacteriocinele reprezintă o clasă specială de substanţe antibiotice cu acţiune bactericidă, sintetizate de un număr mare de specii bacteriene purtătoare de informaţie genetică specifică, conţinută în plasmidele ,,col”.

Primele bacteriocine au fost identificate şi descrise la specia Escherichia coli de A n d r é G r a t i a (1925), care le-a dat denumirea generică de “colicine”. Ulterior, deoarece s-au identificat substanţe asemănătoare la numeroase alte specii bacteriene, s-a creat termenul mai general de “bacteriocine”, iar în funcţie de specia bacteriană care le produce, ele au primit denumiri inspirate din epitetul de gen (listeriocine, vibriocine, etc.) sau de specie (colicine, piocine welchicine, etc.). Din punct de vedere al structurii, bacteriocinele se împart în două categorii: bacteriocine cu nivel de organizare molecular şi bacteriocine cu structură corpusculară, vizibile electronooptic, asemănătoare cu bacteriofagii sau cu fragmente din particula fagică (capete, dar mai ales cozi). Bacteriocinele produse de bacteriile Gram-negative au un spectru îngust de activitate, limitat, în cele mai multe cazuri, la tulpini bacteriene din aceeaşi specie sau aparţinând unor specii înrudite taxonomic. Bacteriocinele Gram-pozitivilor sunt lipsite de specificitate, fiind active faţă de unele bacterii Gram-pozitive îndepărtate taxonomic de specia producătoare.

Mecanismele prin care aceste substanţe îşi exercită efectul bactericid sunt elucidate doar în câteva cazuri. În general, bacteriocinele se leagă iniţial de celulele sensibile prin intermediul unor receptori specifici de pe suprafaţa acestora (asemănător bacteriofagilor), apoi pătrund în interior şi acţionează dereglator asupra unor ,,ţinte” vitale (metabolism energetic, biosinteza de ADN şi ARN, etc.). Caracteristica principală a bacteriocinelor, care le deosebeşte fundamental de antibioticele propriu-zise, constă în faptul că biosinteza lor are efect letal asupra celulelor producătoare. În acest caz, perpetuarea proprietăţii de bacteriocinogeneză în rândul populaţiilor bacteriene se explică prin numărul redus de celule în care acest caracter letal potenţial devine actual şi prin faptul că restul celulelor bacteriene purtătoare de factor ,,col” sunt imune la acţiunea colicinei exogene omologe. Prin urmare, odată elaborată în mediu, o anumită colicină are efect antibiotic numai asupra celulelor aparţinând aceleeaşi specii, dar care nu o pot elabora, fiind lipsite de factorul ,,col” respectiv.

Avându-se în vedere acţiunea bactericidă a tulpinilor purtătoare de plasmide ,,col”, centrată în jurul speciei omologe, se poate presupune că fenomenul de bacteriocinogeneză are un rol de reglare a populaţiilor bacteriene în diferite ecosisteme naturale (Buiuc G., 1999). În practica diagnosticului bacteriologic, bacteriocinogeneza şi bacteriocinosensibilitatea sunt acceptate uneori ca markeri ai patogenităţii. S-a

89

constatat, de exemplu, că în cadrul speciei Escherichia coli tulpinile colicinogene sunt de regulă şi patogene, iar cele bacteriocinosensibile, nepatogene.

O altă aplicaţie a bacteriocinelor în practica de laborator este bacteriocinotipia. Bacteriocinotipul (bacteriocinovarianta) este o subdiviziune a speciei bacteriene care grupează toate tulpinile sensibile la aceleaşi bacteriocine. Bacteriocinotipia are implicaţii asemănătoare cu fago(lizo)tipia, în urmărirea unor filiere epidemiologice, sau în evidenţierea altor proprietăţi corelate în mod constant cu bacteriocinotipul.

Antagonismul ne specific este impus de speciile bacteriene capabile să producă substanţe nocive pentru alte specii, asupra cărora acţionează neselectiv (Duca Eugenia şi col., 1979 ).

Un exemplu îl constituie bacteriile acido-lactice componenete ale microbiotei normale a intestinului, mucoasei bucale, mucoasei vaginale, care inhibă dezvoltarea bacteriilor patogene prin acidifierea mediului.

Pe baza acestui considerent, în tratamentul unor infecţii intestinale se recomandă înlocuirea antibioticelor cu preparatele probiotice.

Majoritatea cercetătorilor definesc drept probiotice, produsele ce conţin bacterii vii, în stare vegetativă sau sub formă de spori, care administrate la om şi animale împiedică înmulţirea bacteriilor potenţial patogene.

Probioticele conţin culturi pure sau mixte de tulpini bacteriene aparţinând genurilor Lactobacillus (L. acidophilus, L. casei, L. helveticus, L. lactis, L. bulgaricus), Bifidobacterium, Streptococcus (S. thermophilus), Enterococcus ( E. hirae), etc., levuri, sau amestecuri de bacterii şi levuri (de exemplu, Lactobacillus spp. şi Sacharomyces spp.).

Administrarea de suspensii sau preparate comerciale de Lactobacillus acidophilus este considerată astăzi indispensabilă pentru ameliorarea echilibrului microbiotei normale a intestinului, compromis în cursul administrărilor orale de antibiotice cu spectru larg.

I l i a Me c i n i c o v – laureat al premiului Nobel - a fost primul cercetător care a avut ideea înlocuirii terapeutice a microflorei patogene a tubului digestiv, cu o microfloră ,,impusă“ formată din lactobacili şi streptococi, prin consum de iaurt şi lapte bătut (Duca Eugenia şi col., 1979; Carp-Cărare M., 1991).

Caracteristicile unui bun probiotic însumează: - lipsa de patogenitate şi toxicitate pentru organismul animal; - capacitatea de a supravieţui şi de a fi metabolic activ în mediul gastro-

intestinal; - efectele benefice asupra organismului; - accesibilitatea din punct de vedere economic. Efectele produselor probiotice sunt, în principal, următoarele: - reducerea numărului unor grupe de microorganisme cu potenţial patogen,

prin producerea de metaboliţi cu efect toxic (acizi organici, H2O2, antibiotice) şi/sau prin competiţie pentru nutrienţi sau pentru situsurile de adeziune de pe suprafaţa epiteliilor intestinale (experimental, s-a demonstrat că Lactobacillus spp.

90

aderă la peretele intestinal, rezistând la cel puţin patru spălări succesive cu soluţie tampon);

- stimularea creşterii animalelor prin stimularea apetitului, îmbunătăţirea conversiei hranei şi protecţia oferită faţă de infecţiile intestinale;

- efect anticancerigen (în special, Lactobacillus spp.) prin inhibarea creşterii celulelor tumorale sau supresia bacteriilor care produc enzime (beta-glucuronidază, nitroreductază) răspunzătoare de eliberarea unor substanţe cancerigene din compuşi inofensivi;

- stimularea imunităţii prin creşterea activităţii macrofagelor sau a concentraţiei imunoglobulinelor anticorp - efect condiţionat de trecerea probioticelor în circulaţia generală (B e a l m e r şi col. citaţi de Zarnea G., 1994).

După cum s-a demonstrat, lactobacilii pot străbate mucoasa intestinală, supravieţuind câteva zile în splină, ficat şi pulmon.

6.7.2. RELAŢII ECOLOGICE ÎNTRE BACTERII şi MA CROORGANISME

Între bacteriile componente ale microbiotei rezidente (autohtone) şi tranzitorii (alohtone) a organismelor animale şi vegetale şi gazdă se stabilesc relaţii de tip cooperant sau antagonic, asemănătoare celor existente între microorganismele care interacţionează.

6.7.2.1. Relaţiile de tip beneficial

6.7.2.1.1. Comensalismul

Comensalismul este relaţia dintre organismul animal şi majoritatea bacteriilor rezidente pe tegumente şi mucoase, unde găsesc surse de hrană (celule descuamate, mucus) şi condiţii de multiplicare, de care beneficiază fără a prejudicia gazdei.

6.7.2.1.2. Simbioza

Simbioza reprezintă tipul de interacţiune al bacteriilor din tubul digestiv al ierbivorelor cu animalul-gazdă. Prin activitatea lor biologică, aceste bacterii degradează unele polizaharide inaccesibile enzimelor digestive (celuloza, hemicelulozele, lignina, etc.), transformându-le în produşi absorbabili cu un potenţial energetic de obicei considerabil. Totodată, bacteriile intestinale şi cele ruminale sintetizează majoritatea vitaminelor complexului B. Alte activităţi biosintetice de natură bacteriană au ca rezultat convertirea unor compuşi simpli care conţin în molecula lor azot, în proteine microbiene, digerabile prin acţiunea unor enzime proteolitice prezente în segmentele posterioare ale tubului digestiv. Relaţiile de tip simbiotic între bacterii şi plante sunt cunoscute îndeosebi la leguminoase, care preiau azotul atmosferic prin intermediul bacteriilor fixatoare de azot din genul Rhizobium, prezente în nodozităţile de pe traiectul rădăcinilor. În categoria interacţiunilor cooperante micro-macroorganism se situează şi antagonismul impus microorganismelor alohtone patogene de către microbiota

91

normală, prin ocuparea nişelor anatomice, elaborarea de substanţe antibiotice, competenţă mai mare în utilizarea nutrienţilor şi a altor resurese din habitat, etc.

6.7.2.2. Relaţiile de tip antagonic

Principala relaţie conflictuală macro-microorganism este infecţia (lat. inficere = a otrăvi, a deteriora). În sens larg, prin infecţie se înţelege pătrunderea şi multiplicarea microorganismelor patogene în organismele cu organizare superioară, precum şi reacţia de răspuns pe care o provoacă acestora. Ea poate îmbrăca forma unei stări potenţiale (infecţie inaparentă clinic sau latentă), însoţită doar de restructurarea imunologică a organismului, sau poate avea o evoluţie asociată cu perturbarea stării normale de sănătate a organismului-gazdă şi cu fenomene de disconfort caracteristice stării de boală (boala infecţioasă). Infecţia este o interrelaţie ecologică dinamică, la apariţia şi evoluţia căreia participă activ ambii parteneri: microorganismul prin mecanismele sale de patogenitate şi organismul-gazdă prin factorii apărării antiinfecţioase (genetici, fiziologici, imunologici). Numeroşi factori endogeni şi de mediu pot influenţa această relaţie de tip conflictual în favoarea unuia sau a celuilalt partener.

6.7.2.2.1. Patogenitatea bacteriilor şi mecanismele ei

Termen discutabil din punct de vedere semantic, patogenitatea defineşte în sensul cel mai larg, aptitudinea unui microb de a determina, în mod natural sau în condiţii experimentale, un efect nociv asupra organismului-gazdă. Patogenitatea bacteriilor este legată în general de parazitismul lor, deşi cele două proprietăţi nu sunt superpozabile. Principalele însuşiri care condiţionează patogenitatea intrinsecă a bacteriilor sunt virulenţa şi toxicitatea, la care se adaugă uneori capacitatea de sensibilizare alergică a organismului.

6.7.2.2.1.1. Virulenţa şi factorii de virulenţă

Virulenţa reprezintă capacitatea bacteriilor de a coloniza la poarta de intrare (de a se adapta şi de a se înmulţi) şi, eventual, de a invada umorile şi ţesuturile, evitând sau neutralizând mecanismele de apărare nespecifică ale gazdei. Factorii care conferă bacteriilor virulenţă sunt reprezentaţi de structuri ale celulei bacteriene şi enzime. Ei pot fi grupaţi în funcţie de modalitatea de acţiune în două categorii: factori de colonizare şi pătrundere în organism şi factori de invazie .

1. Factorii de colonizare şi pătrundere

Fimbriile (pilii) de a derenţă şi alte adezine (acizii lipoteichoici, proteinele membranei externe a bacteriilor Gram-negative, etc.), asigură legarea bacteriilor de epiteliile mucoaselor dar şi de celulele epiteliale cheratinizate,

92

endotelii, dinţi, etc., împiedicând astfel eliminarea lor prin fluxul diferitelor secreţii, tuse, mişcarea cililor, peristaltism. Totodată, se crează posibilitatea de acces a bacteriilor patogene la nutrienţi, temperatură favorabilă, protecţie faţă de anticorpi şi lizozim, etc. Ca dovadă, celulele de Escherichia coli aderente la epiteliul intestinal, după o perioadă de lag mai scurtă, se multiplică mult mai intens decât celulele neaderente.

Legarea este condiţionată de existenţa unor receptori celulari specifici adezinelor bacteriene, având uneori un important grad de selectivitate. Astfel, fimbriile de tip - 1 permit aderarea la mucoasa intestinului gros, iar fimbriile P sau Pap (Pyelonephritis associated pili) şi adezina 075X favorizează colonizarea căilor urinare (Zarnea G.,1994).

În baza acestei specificităţi, Streptococcus pyogenes şi Corynebacterium diphteriae aderă la epiteliul faringian, Escherichia coli enteropatogenă şi Vibrio cholerare aderă la mucoasa jejun-ileonului, iar Neisseria gonorrhoeae aderă în mod special la epiteliul uretral şi cervical (Duca Eugenia şi col., 1979). Cele mai multe bacterii au însă două sau mai multe tipuri de adezine cu specificităţi de legare diferite.

Rolul receptorilor celulari în producerea infecţiilor a fost demonstrat fără echivoc de S e l l w o o d şi colaboratorii (citaţi de Zarnea G., 1994) în 1975.

Porcii foarte rezistenţi la infecţia cu tulpini de Escherichia coli K88, producătoare de enterite severe, nu au receptori pentru această bacterie, spre deosebire de animalele foarte sensibile, care poartă numeroşi receptori de adezine.

În mod asemănător, sensibilitatea omului la pielonefrita cu Escherichia coli este corelată cu numărul receptorilor de pe membrana uroepiteliului, foarte variabil de la o persoană la alta.

Se pare că în infecţiile urinare ascendente cu E. coli uropatogenă, colonizarea se datorează şi flagelilor (cililor), cu ajutorul cărora bacteria se deplasează contra curentului de scurgere a urinei.

Ig A proteazele reprezintă un factor important de colonizare, deoarece permite bacteriilor patogene să supravieţuiască pe suprafaţa mucoaselor, prin clivarea moleculei anticorpilor de tip Ig A.

Ele au fost evidenţiate la Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenze, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, etc.

Pătrunderea în organism a bacteriilor se realizează prin mecanisme incomplet elucidate.

La majoritatea speciilor, ea este condiţionată de apariţia unor discontinuităţi accidentale (plăgi, microleziuni) sau disfuncţii la nivelul barierelor naturale antiinfecţioase.

Bacteriile foarte mobile şi foarte subţiri aparţinând genurilor Leptospira, Borrelia şi Treponema sunt capabile să pătrundă prin mucoase şi chiar prin tegumentele intacte. Mobilitatea acestor bacterii se datorează flagelilor periplasmatici numiţi şi filamente axiale.

93

Unele bacterii (ca de exemplu, Corynebacterium diphteriae) sunt dotate cu fimbrii şi cu enzime de alterare, prin care produc leziuni locale, creându-şi porţi de intrare şi colonizând în mucoasă.

La bacteriile parazite intracelular, mecanismul cel mai frecvent de pătrundere în celula-gazdă este endocitoza facilitată de parazit prin intermediul unor lipopolizaharide şi proteine membranare (procedeu descris la Shigella flexneri, Escherichia coli enteroinvazivă (EIEC), Neisseria gonorrhoeae) şi prin mecanisme încă necunoscute (Duca Eugenia şi col., 1979; Zarnea G., 1994).

Bacteriile endocitate sunt incluse în vacuole delimitate de o membrană derivată din membrana celulei-gazdă, în interiorul cărora se multiplică şi supravieţuiesc, rezistând la fagocitoză.

2. Factorii de invazie

Invadarea organismului este condiţionată, în principal, de factorii bacterieni antifagocitari şi de enzimele care facilitează difuzarea bacteriilor în ţesuturi.

a. Factorii antifagocitari de inhibare a înglobării în fagocit

Capsula reprezintă pentru speciile capsulate (Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringens) un important factor de virulenţă, deoarece bacteriile dotate cu acest înveliş vâscos nu sunt înglobate de leucocitele polimorfonucleare neutrofile, prin neaderarea acestora la suprafaţa bacteriei. Ca exemplu clasic de patogenitate datorată în exclusivitate prezenţei capsulei, poate fi citat pneumococul; tulpinile de tip S (smooth) capsulate sunt patogene, iar cele de tip R (rough) necapsulate sunt lipsite de patogenitate (vezi experienţa lui Griffith, cap. de Genetică bacteriană).

Compuşii parietali ce fac parte din structurile speciale ale peretelui bacterian prezintă proprietăţi antifagocitare bine demonstrate pentru proteina ,,M” a streptococilor beta-hemolitici grup A, antigenul ,,Vi” prezent la unele specii de Salmonella (S. typhi, S. paratyphi C, S. dublin), antigenul K prezent la Escherichia coli, etc. Unii autori identifică aceşti factori cu fimbriile de virulenţă, care asigură aderenţa specifică la ţesutul parazitat şi implicit rezistenţa la fagocitoză.

Rolul antifagocitar al acestor factori este demonstrat experimental prin anularea virulenţei consecutiv tratării bacteriilor cu ser imun specific factorului respectiv: ser anticapsular, antiproteină M, anti-Vi.

Coagulaza liberă, o enzimă elaborată de Staphylococcus aureus, este din punct de vedere chimic şi funcţional asemănătoare cu protrombina. Ea coagulează plasma sanguină în jurul celulelor bacteriene, formând un manşon cu rol antichimiotactic pentru fagocite. Având la suprafaţă acest strat protector, bacteriile nu mai sunt recunoscute ca non-self, fiind vorba deci, de un mimetism la scară celulară.

94

Mobilitatea, după B r u b a k e r, 1985 (citat de Zarnea G., 1994), ar constitui un factor important pentru virulenţă. Astfel, prin capacitatea lor de a se deplasa rapid în mediile vâscoase, cum sunt cele din organism, spirichetele (Leptospira, Borrelia, Treponema) se sustrag procesului de fagocitoză, încât leucocitele le capturează cu mare dificultate.

b. Factorii antifagocitari de inhibare a digestiei în fagocit

Unele bacterii, numite bacterii parazite facultativ intracelular, supravieţuiesc în interiorul fagocitelor, iar unele reuşesc chiar să se multiplice, transformând aceste celule în factori de diseminare a infecţiei în organism. Rezistenţa la digestia în fagocit se realizează prin mecanisme incomplet elucidate, ce diferă de la o specie bacteriană la alta (Zarnea G., 1994).

1.Împiedicarea fuziunii fagolizozomale este un mecanism comun, întâlnit la Mycobacterium spp., Chlamydia spp., Legionella pneumophila, etc., dar care are baze moleculare diferite. Astfel, la Mycobacterium tuberculosis, fuziunea este blocată de ,,cord-factor”- o glicolipidă (6,6-dimycoltrehaloza) din structura peretelui celular; la Mycobacterium microti, prin creşterea concentraţiei intracelulare a AMP; la Chlamidia psittaci, prin modificarea structurii membranei fagozomului în care este conţinută.

2.Evadarea din fagozomi la scurt timp după pătrunderea în celule a fost descrisă la rickettsii (Rickettsia mooseri, Rickettsia tsutsugamushi). Un rol esenţial în acest proces îl are fosfolipaza A, care atacă membrana fagozomului.

3.Rezistenţa la acţiunea enzimelor lizozomale în macrofagele din organismul neimunizat este întâlnită la unele bacterii Gram-pozitive (Listeria monocytogenes, Erysipelothrix insidiosa), la numeroase genuri Gram-negative (Salmonella, Brucella, Yersinia, Shigella, Coxiella, Francisella, Haemophilus) şi la bacteriile acidorezistente (Mycobacterium spp.).

Mecanismele rezistenţei sunt incomplet cunoscute. La unele specii, se pare că factorul care opune rezistenţă enzimelor lizozomale îl constituie lipidele de perete (factorul cord, lipopolizaharidele Gram-negativilor).

c. Agresinele - enzime care favorizează difuzarea în ţesuturi

Hialuronidazele sunt exoenzime care clivează acidul hialuronic din structura substanţei fundamentale a ţesutului conjunctiv, realizând astfel permeabilizarea barierelor fiziologice (epiteliale, mucoase, tisulare), favorabilă difuzării bacteriilor în organism. Ele sunt sintetizate de streptococii beta-hemolitici, stafilococi, clostridii, etc.

Fibrinolizinele produc liza barierei de fibrină pe care organismul o formează în jurul focarelor inflamatorii pentru a limita diseminarea germenilor în ţesuturi. Prin intermediul acestor agresine, unii stafilococi şi streptococi determină infecţii septicemice.

95

Colagenaza, enzimă puternic proteolitică elaborată de Clostridium perfringens, hidrolizează colagenul din structura ţesutului conjunctiv, creând astfel breşe adânci pe care apoi le invadează.

Alte enzime bacteriene, ca proteazele, lipazele, dezoxiribonucleaza, ureaza, fosfataza acidă, etc., fără a avea o valoare deosebită în determinarea patogenităţii, o potenţează.

6.7.2.2.1.2. Toxicitatea bacteriilor

Toxicitatea este proprietatea unor bacterii de a exercita un efect alterativ sau dereglator asupra unui organism neimunizat, prin componente structurale sau prin secreţii celulare, numite toxine. Ele sunt neutralizate în organismul imunizat (Carp-Cărare M., 1991; Duca Eugenia, 1974).

Ideea că unele manifestări patologice sunt produse de anumite substanţe chimice (,,sepsine”) a fost formulată pentru prima dată de K l e s s (1872), referindu-se la leziunile produse de stafilococi.

L ö f f l e r (1880) a demonstrat faptul că specia Corynebacterium diphteriae rămâne localizată în nazofaringe, fiind absentă in organele interne (miocard, rinichi, ficat, sistem nervos, etc.), care sunt cele mai afectate de leziunile produse la distanţă de locul infecţiei.

K o c h (1884) a descris holera ca pe o toxicoză, pe baza observaţiilor că agentul patogen rămâne în intestin, fără să invadeze structurile acestuia şi ţesuturile învecinate. În plus, administrarea orală a filtratului de cultură reproduce boala, în timp ce, pe cale parenterală este inofensiv.

R o u x şi Y e r s i n (1888) au folosit primii termenul de ,,toxină”, pe care o considerau ,,un fel de enzimă”.

În prezent, termenul defineşte orice substanţă toxică de provenienţă biologică, sintetizată de bacterii, fungi (micotoxine), celule vegetale sau animale (Zarnea G., 1994).

Termenul de ,,otravă” este rezervat substanţelor chimice organice sau anorganice (stricnină, săruri de argint, arseniu, etc.) care, introduse într-un organism pe diverse căi, produc leziuni celulare sau tisulare, perturbarea sau suspendarea unor activităţi fiziologice normale şi, în funcţie de doză, chiar moartea organismului.

Clasificarea toxinelor bacteriene

Au fost propuse mai multe sisteme de clasificare a toxinelor. Probabil, faptul că nici unul nu satisface exigenţele unei clasificări riguros ştiinţifice, explică utilizarea curentă (cu toată ambiguitatea sa) a conceptului dualist de împărţire în exotoxine (toxine extracelulare) şi endotoxine (legate de corpul bacterian sau reţinute în celulă). Principalele diferenţe între cele două categorii de toxine sunt sintetizate în tabelul numărul 3.

96

Tabelul 3 Caractere distinctive între exo- şi endoenzimele bacteriene

Caracterul diferenţial

Exotoxine E ndotoxine

Bacterii producătoare

Gram-pozitive Gram-negative

Compoziţia chimică

Proteine 1.Lipopolizaharide (LPS prezente în membrana externă a peretelui celular la toate bacteriile Gram-negative); 2.Proteine (toxina holerică şi toxina shiga)

Mecanismul eliberării din celulă

Sunt eliminate pe parcursul sintezei. Concentraţia intracelulară este neglijabilă.

Dezintegrarea celulei

Sensibilitatea la 600 C şi la enzi-mele proteolitice

Sensibile Relativ rezistente

Efectul toxic Specific şi puternic în doze mici

Nespecific şi slab

Modul de separare Prin filtrarea sau centrifugarea culturilor

Dezintegrarea celulelor bacteriene prin metode: fizice (ultrasonare, îngheţ-dezgheţ); chimice (tripsină, acid tricloracetic); biologice (bacteriofagi)

Răspunsul la acţiunea formo-lului 0,4% şi a căldurii (400 C)

Se transformă în anatoxine (toxoizi) netoxice dar antigenice

Nu se transformă în anatoxine

Imunogenitate Puternică (induc formarea unor cantităţi mari de anti-corpi antitoxici neutra-lizanţi)

Slabă

În funcţie de ţesutul sau celula ţintă asupra cărora acţionează şi efectul pe

care-l produc, se cunoaşte o mare varietate de toxine: hemolizine, leucocidine, neurotoxine, toxine cu efect necrotic, enterotoxine, etc.

Hemolizinele sunt enzime bacteriene care determină în principal liza globulelor roşii dar şi a altor categorii de celule (leucocite, trombocite, celule tisulare). Ele au fost puse în evidenţă la numeroase specii bacteriene: Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium septicum, stafilococi, streptococi, enterobacteriacee, etc.

Leucocidinele sunt factori eliberaţi de unele bacterii după înglobarea lor în fagocite, determinând moartea acestora.

Bacteriile producătoare de leucocidine, ca stafilococii şi streptococii, sunt denumite bacterii ,,piogene”, deoarece leucocitele moarte se acumulează în focarul inflamator, contribuind la formarea puroiului.

Neurotoxinele sunt exotoxine cu tropism pentru ţesutul nervos, determinând tulburări în transmiterea influxului nervos către organele efectoare. Principalele specii producătoare de neurotoxine sunt Clostridium tetani (toxina

97

tetanică), Clostridium botulinum (toxina botulinică) şi Shigella dysenteriae (toxina shiga).

Toxinele cu efect necrotic acţionează asupra ţesuturilor, determinând moarte locală prin citoliză sau citotoxicitate. Reprezentative pentru această categorie sunt toxina difterică şi lecitinaza.

Toxina difterică (Corynebacterium diphteriae) acţionează atât local, la nivelul mucoasei faringiene, cât şi la distanţă, ca urmare a difuzării pe cale sanguină şi a fixării mediate de receptori, pe diverse ţesuturi şi organe (miocard, ţesutul nervos, ficat, rinichi,etc.).

Lecitinaza este o toxină-enzimă produsă de Clostridium perfringens şi de unele tulpini de Staphylococcus aureus, care scindează lecitina (lipid ce constituie o importantă substanţă de cimentare a membranelor celulare şi a mitocondriilor) şi produce liza rapidă a globulelor roşii, leucocitelor şi a unor celule tisulare.

Enterotoxinele constituie un grup particular de exotoxine, implicate în majoritatea toxiinfecţiilor alimentare (Bârzoi B., Meica S., Neguţ S., 1999). Ele sunt elaborate de specii bacteriene Gram-pozitive (Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium sordellii), dar mai ales de bacterii Gram-negative: Escherichia coli enterotoxigenă (ETEC) şi enterohemoragică (EHEC), Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp., Shigella dysenteriae, Aeromonas hydrophila, Campylobacter jejuni, etc.

În general, enterotoxinele acţionează direct asupra mucoasei intestinale, determinând fenomene citotoxice şi distructive (liza şi descuamarea enterocitelor) sau tulburări funcţionale, care modifică fluxul apei şi ionilor prin bariera epitelială.

Dereglările funcţionale sunt cauzate de activarea enzimelor adenilat-ciclaza sau guanilat-ciclaza din membrana celulară, urmată de creşterea cantităţilor de AMPc (adenozin-monofosfat ciclic), respectiv GMPc intracelular.

Consecinţa acestei acumulări este inversarea polarităţii funcţionale a enterocitului, care, din celulă absorbantă devine celulă excretoare de apă şi electroliţi (Na+, Cl-). Alterările histologice şi funcţionale produse de enterotoxine se traduc, din punct de vedere clinic, printr-o diaree abundentă.

Un alt mecanism de acţiune, specific enterotoxinelor stafilococice, ar consta (după Răducănescu H., Bica-Popii Valeria, 1986; Bârzoi D. şi col. 1999) în stimularea terminaţiilor nervului vag la nivelul stomacului, stimuli care, ajungând la centrul vomitiv din creier, declanşează contracţii peristaltice şi antiperistaltice şi, consecutiv acestora, descărcări diareice şi vomismente după o perioadă scurtă de incubaţie (1-6 ore). Tulburările se accentuează până la stare de şoc după trecerea toxinei în circulaţia sanguină, unde interacţionează cu macrofagele şi limfocitele T, determinând eliberarea în exces a citokinelor.

6.7.2.2.1.3. Factorii de sensibilizare

Factorii de sensibilizare sau factorii de alterare secundară sunt substanţe bacteriene corpusculare sau excretate (enzime, toxine), puternic antigenice, care complică boala infecţioasă după apariţia anticorpilor, prin cuplare cu aceştia.

98

Nu toate reacţiile antigen-anticorp care au loc în organism sunt favorabile acestuia. Uneori, alterări grave pot fi produse de prezenţa concomitentă a antigenului (bacterie, produs microbian, antigene tisulare similare antigenelor bacteriene) şi a anticorpilor corespunzători.

În principiu, orice microorganism care a produs o infecţie, dacă nu a fost repede eliminat din organism, poate – cu condiţia întrunirii anumitor proporţii şi cantităţi antigen-anticorp – să determine fenomene de sensibilizare mediate de anticorpi şi/sau limfocitele T.

Bacteriile care determină frecvent complicaţii prin fenomene de sensibilizare sunt prezentate în tabelul numărul 4.

Tabelul 4

Factori bacterieni de sensibilizare Bacteria producătoare Natura

chimică Denumirea

Mycobacterium spp. Proteină Tuberculină Bulkholderia mallei Proteină Maleină Brucella spp. Proteină Brucelină Treponema pallidum Proteină Luetină Francisella tularensis Proteină Tularină Streptococcus pyogenes serogrup A

Factor ,,reumatogen” Factor ,,nefritogen”

Bacterii Gram-negative LPS Endotoxine

ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE 1. Ce reprezintă habitatul, biotopul sau nişa ecologică a unui microorganism? 2. Cum se clasifică microorganismele dintr-un habitat luând drept criteriu

prezenţa constantă şi numărul lor? 3. Care sunt repartiţia, particularităţile morfo-fiziologice, şi rolul microbiotei

mediilor naturale (sol, apă, aer) ? 4. Cum se numesc infecţiile pentru care sursa primară de contaminare sunt solul

şi apa? 5. Care este provenienţa microorganismelor din lapte, carne şi ouă şi care sunt

implicaţiile de ordin igienico-sanitar ale contaminării microbiene a alimentelor? 6. Care sunt nişele anatomice ale organismului animal populate de

microorganisme ? 7. Ce rol îndeplineşte microbiota normală a intestinului gros şi a rumenului? 8. Ce fel de relaţii se stabilesc între microorganismele care populează acelaşi

habitat şi prin ce se caracterizează fiecare tip de relaţie? 9. Care sunt relaţiile de tip beneficial şi relaţiile de tip antagonic dintre micro – şi

macroorganisme? 10. Care sunt mecanismele patogenităţii la bacterii?

99

TEST

1. Teoria miasmatică a infecţiilor a fost elaborată de:

a.Hipocrat b.Leeuwenhoeck c.Linee

2. Demonstrează natura microbiană a fermentaţiilor şi a infecţiilor; a. Eduard Jenner b. Louis Pasteur c. Joseph Lister

3. Fondatorul şcolii româneşti de microbiologie a fost: a. Ioan Cantacuzino b. Nicolae Stamatin c. Victor Babeş

4. Virusurile au dimensiuni de ordinul: a. micrometrilor b. nanometrilor c. milimetrilor

5. Formele de existenţă a virusurilor în natură sunt: 1……………………………… 2……………………………… 3……………………………… 6. Părţile componente ale unui virus sunt:

a. citoplasma b. capsida c. membrana citoplasmatică d. genomul ADN sau ARN

7. Virusurile: a. dispun de echipament enzimatic şi metabolism propriu b. nu dispun de enzime metabolice, din care cauză sunt parazite obligatoriu

într-o celulă vie 8. În funcţie de histotropism, virusurile pot fi grupate astfel: 1………………………………….. 2………………………………….. 3…………………………………... 4…………………………………... 9. Virusurile :

a. se multiplică prin diviziune directă (sciziparitate) b. sunt multiplicate de celulele în care parazitează

100

10. Multiplicarea virusurilor parcurge următoarele 4 etape: 1………………………….. 2………………………….. 3………………………….. 4…………………………... 11. Efectul citopatic al multiplicării virusurilor în celule constă în :

a. degenerare şi moarte celululară b. multiplicarea anarhică a celulelor infectate c. apariţia unor incluzii intracitoplasmatice sau intranucleare

12. Incluziile Babeş - Negri din neuronii piramidali situaţi în cornul lui a. Amon apar în:

a. turbare b. gripă c. variola aviară

13. Substanţele care acţionează distructiv asupra virusurilor sunt: a. hidroxidul de sodiu b. formaldehida c. glicerina d. majoritatea antibioticelor

14. Bacteriile sunt microorganisme: a. unicelulare b. pluricelulare c. eucariote d. procariote

15. Nucleul celulei bacteriene este format: a. dintr-un singur cromozom b. 2-4 cromozomi

16. Capsula protejează bacteriile faţă de: a. fagocitoză b. radiaţiile ultraviolete c. desicaţie (uscăciune)

17. Mobilitatea bacteriilor se datorează: a. cililor b. pililor c. plasmidelor

18. Sediul sintezei proteinelor în celula bacteriană îl constituie: a. vacuolele b. ribozomii c. nucleul

19.Bacteriile autotrofe (litotrofe) utilizează ca sursă de carbon: a. compuşii organici ai carbonului b. compuşii anorganici ai carbonului

101

20. Bacteriile chimioorganotrofe utilizează: a. energia luminoasă b. energia rezultată din reacţiile de oxidoreducere

21.Respiraţia la bacterii constă în: a. sinteza structurilor celulei bacteriene b. reacţii de oxidoreducere prin care bacteriile îşi procură energia c. preluarea oxigenului din aer şi eliminarea bioxidului de carbon

22. În funcţie de natura chimică a ultimului acceptor de hidrogen, respiraţia la bacterii este de trei tipuri: 1…………………………. 2…………………………. 3…………………………. 23. Majoritatea speciilor bacteriene se multiplică prin:

a. diviziune directă (sciziparitate) b. înmugurire c. spori

24. Fazele multiplicării bacteriilor în mediile de cultură sunt: 1……………………………….. 2………………………………... 3…………………………………. 4………………………………… 25. În faza staţionară a multiplicării bacteriilor are loc:

a. o multiplicare activă la fiecare 15-20 minute b. moartea logaritmică a bacteriilor c. o multiplicare de înlocuire

26. Sunt alcătuiţi din celule care prin înmugurire generază pseudomicelii: a. fungii levuriformi b. fungii filamentoşi

27. Ciupercile microscopice se inmulţesc prin: a. spori sexuaţi b. spori asexuaţi c. porţiuni de miceliu

28. Sunt spori asexuaţi: a. bazidiosporii b. ascosporii c. blastosporii d. artrosporii e. conidiosporii

29. Asigură conservarea miceţilor în condiţii de mediu nefavorabile: a. ascosporii b. clamidosporii

30.Bolile produse de miceţi poartă denumirea generică de ……………………iar cele produse de toxinele acestora ,……………………….

102

31. Se realizează prin mutaţii şI recombinări genetice: a. variaţiile fenotipice b. variaţiile genotipice

32. Variaţiile fenotipice: a. sunt induse de factorii de mediu b. apar ca o consecinţă a modificării genomului c. nu se transmit ereditar

33. Transducţia de material genetic de la o celulă bacteriană la alta se realizează prin intermediul:

a. plasmidelor F b. bacteriofagilor

34. Sunt mecanisme de recombinare genetică la virusuri : a. copierea alternativă b. mixajul fenotipic şi transcapsidarea c. reasortarea genică

35. Recombinările virusurilor prin mixaj: a. sunt stabile genetic b. nu sunt stabile genetic

36. Microorganismele care populează în mod constant un biotop (habitat) constituie:

a. microbiota autohtonă a biotopului b. microbiota alohtonă a biotopului

37. Cea mai mare şi diversificată încărcătură microbiană o are: a. apa de izvor b. apa râurilor şI a lacurilor c. apa subterană

38. Concentraţia microorganismelor din sol este maximă în: a. stratul extern cu o grosime de câţiva milimetri b. primii 5-150 cm c. straturile profunde

39. Aerul reprezintă pentru microorganisme: a. un biotop propriuzis b. un mijloc de dispersare pe orizontală şi pe verticală

40. Încărcătura microbiană a laptelui este mai mare: a. în primele jeturi de lapte b. în ultimele jeturi de lapte

41. Alterarea (putrefacţia) cărnii determinată de microorganisme poate avea loc: a. numai la temperaturi crescute şi umiditate b. la temperaturi scăzute

42. Ouăle proaspete conţin microorganisme: a. la suprafaţa cojii b. în albuş c. în gălbenuş

103

43. Dintre bacteriile patogene pentru om, prin ou se transmit mai frecvent: a. bacilul antraxului b. bacilii tuberculozei c. salmonelele

44. Microbiota normală a organismului animal populează: a. pielea b. musculatura c. tubul digestiv d. sângele şi limfa

45. Echilibrul existent între diferitele specii de microorganisme care alcătuiesc microbiota normală a organismului se numeşte ………………. Ruperea acestui echilibru poartă denumirea de ………………….. 46. Care dintre proprietăţi constituie un avantaj pentru speciile bacteriene aflate în competiţie pentru nutrienţi şi spaţiu:

a. sporogeneza b. mobilitatea c. viteza mare de multiplicare d. capsulogeneza

47. Antagonismul bacterian specific (antibioza) se realizează prin intermediul unor substanţe numite …………………. 48. Probioticele sunt :

a. antibiotice utilizate în terapia bolilor infecţoase b. culturi de microorganisme nepatogene

49. MenţionaţI două dintre efectele produselor probiotice: 1…………………………………………………………………………… 2……………………………………………………………………………. 50.Relaţia dintre microbiota rumenului şi animalul-gazdă este:

a. simbioza b. comensalismul c. competiţia

51. Capsula conferă bacteriilor virulenţă prin: a. inhibarea înglobării bacteriilor capsulate de către fagocite; b. inhibarea digestiei în interiorul fagocitelor după ce bacteriile au fost

înglobate; 52. Sunt enzime care favorizează difuzarea bacteriilor în ţesuturi şi se numesc agresine:

a. hialuronidazele b. hemolizinele c. leucocidinele d. fibrinolizinele

53. Sunt sensibile la temperatura de 60 C: a. exotoxinele bacteriene b. endotoxinele bacteriene

104

54. Enterotoxinele bacteriene: a. sunt implicate în majoritatea toxiinfecţiilor alimentare b. acţionează direct asupra mucoasei intestinale c. determină tulburări nervoase.

55. Se transformă în anatoxine (toxoizi): a. exotoxinele bacteriene b. endotoxinele bacteriene

105

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

BÂRZOI D., MEIC A S., NEGUŢ M., 1999 – Toxiinfecţiile alimentare. Editura Diacon Coresi, Bucureşti.

BUIUC D.,NEGU Ţ M., 1999 – Tratat de microbiologie clinică. Editura Medicală.

CARP-CĂRARE M.,1991 – Microbiologie. Curs. Institutul Agronomic ,,Ion Ionescu de la Brad” Iaşi.

CARP-CĂRARE M., 2001 – Microbiologie veterinară. Virusologie. Casa de Editură Venus. Iaşi.

COMAN I. , MA RE˜ M., 2000 – Micologie medicală aplicată. Editura Junimea, Iaşi.

COMAN I.,BÂR HALĂ HELEN A-MARIA, FLORES CU RODICA, 1997– Decontaminarea. Vol.I. Editura Satya. Iaşi.

DUCA EUGENIA, 1974 – Microbiologie medicală. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti.

DUCA EUGENIA, DU CA M., FU RTUNESCU G., 1979 – Microbiologie medicală. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti.

GRECIANU Al., 1986 – Microbiologie generală şi imunologie. Curs. Institutul Agronomic ,,Ion Ionescu de la Brad” Iaşi.

HART T., SHEARS P., 1997 – Atlas de poche de microbiologie. Médicine – Sciences. Flamarion. Paris.

IVANOF A., C IUPE M., SAŞCĂ C., VAN CEA DO INA, 1982 – Microbiologie. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti.

LARPENT J. P., 20 00 – Listeria. Technique & Documentation – Lavoisier. Paris.

LARPENT J. P. , LARPENT GOURGAUD M., 1990 Mémento –technique de microbiologie. Technique & Documentation – Lavoisier. Paris.

MĂNESCU S., 1989 – Microbiologie sanitară. Editura Medicală. Bucureşti.

MĂZĂREANU C., 1999, - Microbiologie generală. Editura Alma Mater. Bacău.

NICHITA ILEANA, 2007 – Micologie. Editura MIRTON , Timişoara. RAICU P., STOIAN V., 1989 – Gene şi cromozomi. Editura ştiinţifică şi

enciclopedică. Bucureşti. RĂPUNTEAN GH., R ĂPUNTEAN S ., 199 9 – Bacteriologie specială

veterinară. Tipo Agronomia Cluj-Napoca. STAMATIN N., 1965 – Microbiologie şi imunologie veterinară. Editura

Didactică şi Pedagogică. Bucureşti. TĂMAŞ V., ŞERBAN M., COTRUŢ M ARIA, 1981 – Biochimie

medicală veterinară. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti. TOPALĂ D. N., 197 8 – Microbiologie generală. Vol.II. Universitatea

,,Al. I. Cuza” Iaşi. TORTORA J.,G., FU NKE R ., B., C ASE L. CHRISTINE, 1997 –

Microbiology. An introduction. Sixth edition. Benjamin/ Cummings Publishing Company. California.

106

ZARNEA G ., 1963 – Microbiologie. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti.

ZARNEA G., 1970 – Microbiologie generală. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti.

ZARNEA G., 1983 – Tratat de microbiologie generală. Vol.I. Editura Academiei Republicii Socialiste România.

ZARNEA G., 1984 – Tratat de microbiologie generală. Vol.II. Editura Academiei Republicii Socialiste România.

ZARNEA G ., 1986 – Tratat de microbiologie generală. Vol.III. Editura Academiei Republicii Socialiste România.

ZARNEA G., 1994 – Tratat de microbiologie generală. Vol. V. Editura Academiei Române.