Lp Imuno 3

REACTII Ag-Ac DE PRECIPITARE

Principiu: precipitarea implica interactiunea intre Ag si Ac in concentratii echivalente, rezultand un precipitat vizibil.Ag folosite = Ag solubile cu minim 2 determinanti antigeni (identici sau diferiti) astfel incat sa poata fi legati de macar 2 molecule de Ac.Ac folositi = seruri monoclonale/policlonale cu minimum 2 situsuri de legare (IgG) pentru Ag sau mai multe (IgA, IgM)Din punctul de vedere al concentratiilor relative Ag/Ac putem avea urmatoarele situatii:

EXCES DE Ac (efect prozone) probabilitatea ca o molecula de

Ac sa lege mai mult de un Ag scade astfel incat probabilitatea de a forma o retea mare scade.

ZONA DE ECHIVALENTA concentratii optime de Ac si Ag pentru formarea unei

“matrici”(retele), formata din legaturi intre un Ag si mai multi (minim 2 molecule de) Ac si respectiv intre

un Ac si doua sau mai multe molecule de Ag care determina formarea unui precipitat vizibil.

EXCES DE Agprobabilitatea ca un Ag sa fie legat de mai multi Ac este scazuta, astfel incat

probabilitatea de a forma o retea mare scade.

Curba de precipitare: Se folosesc mai multe eprubete in care se pune serul cu o cantitate fixa de Ac – si apoi cantitati de Ag cunoscute, variabile, din ce in ce mai mari. Dupa formarea precipitatului eprubetele se centrifugheaza, si concentratul obtinut din precipitat (supernatantul este scos) este masurat. Se face o curba cantitate de precipitat functie de cantitate de Ag = curba de precipitare

Reactiile de precipitare se pot realiza in mediu lichid sau semisolid (gel de agar).

Exces Ac

Zona de echiva-lenta

Exces Ag

A. Reactii de precipitare in mediu lichid

1. Reactia de precipitare inelara - pentru determinarea Ag (metoda calitativa)Intr-un tub se introduce serul imun; apoi se adauga incet solutia de Ag, ca sa nu se amestece cu serul. Daca Ac din ser este specific Ag, in zona de separare a celor doua lichide se formeaza un inel alb, ceea ce semnifica precipitarea complexului Ag-Ac.Aplicatii practice: identificarea petelor de sange, depistarea antigenului polizaharidic al antraxului (reactia Ascoli).

2. Imunonefelometria - pentru determinarea Ag (metoda cantitativa)Reactie de precipitare in mediu lichid in care se masoara numarul de complexe Ag-Ac prin evaluarea luminii dispersate de acestea.Se evidentiaza cantitativ Ag (de obicei proteine) din serul pacientului prin folosirea unor seruri imune specifice (Ac).Peste serul pacientului in care se gaseste proteina de dozat se adauga serul specific anti-Ag; se formeaza complexe imune. Prin cuva in care se desfasoara reactia trece o raza laser cu lungime de unda cunoscuta; lumina este dispersata de complexele imune formate (de precipitat); aceasta dispersie este citita de un nefelometru si, prin comparatie cu valori ale unor probe standard, se cuantifica cantitatea de Ag din proba de ser. Exista 2 tipuri de metode:

nefelometrie fixa (end point) = care masoara lumina dispersata la un moment fix pentru toate reactiile; rate nephelometry in care se masoara lumina dispersata in momentul ratei celei mai mari de formare a CI;

Aplicatii practice: dozarea proteine serice (α1 anti-tripsina, CRP, ceruloplasmina), Ig (IgG,M,A,FR), complement (C3,C4)

1

B. Reactii de precipitare in gel

Sistem de difuzie semisolid (gel) in care Ag si/sau Ac difuzeaza in functie de greutate moleculara si concentratie (cantitate).

1. Imunodifuzia simpla radiala (Mancini) - pentru determinarea Ag (metoda cantitativa)Ac este incorporat in gel iar Ag de determinat este lasat sa difuzeze in mediu; In gel (cu Ac) se fac mici godeuri in care se pun probele biologice in care se gaseste Ag de determinat. Ag din proba incepe sa difuzeze in mediu. Acolo unde concentratia Ag atinge nivelul de echivalenta cu Ac se formeaza un inel de precipitare. Distanta parcursa de Ag depinde de concentratie, marimea moleculei dar si de concentratia Ac din gelul de agar.Raza inelului de precipitatie este direct proportionala cu concentratia Ag. Concentratia Ag se calculeaza in functie de aria inelului de precipitare si se evalueaza comparativ cu standardul pentru Ag respectiv. Dezavantaj: durata mare de formare a arcurilor de precipitare: 1 – 3 zileAplicatii practice: dozarea de proteine (α1FP, CRP, transferina), de Ig (G, A, M); C3, C4, C1 INH;

2. Dubla difuzie (metoda Ouchterlony) - metoda calitativa/semicantitativa de determinare a unui Ac sau AgIn gelul de agar se stanteaza godeuri in care se pun Ag respectiv Ac specific. Ac si Ag incep sa difuzeze iar in zona de echivalenta se va forma un arc de precipitare, perpendicular pe axa dintre godeuri.

pentru determinarea Ac: metoda calitativa metoda semicantitativa- metoda calitativa: Ag cunoscut + ser pacient : arc de precipitare =>

test pozitiv (exista Ac specific in ser)- metoda semicantitativa: Ag cunoscut (central) + dilutii succesive

din serul pacientului in jur => titrul Ac = inversul celei mai mari dilutii care a format arc de precipitare

pentru determinarea Ag Identitate Non-identitate Identitate partiala- se foloseste un Ac cunoscut (ser imun) si Ag de

determinat (produsul biologic al pacientului)- prin aceasta metoda se evalueaza de obicei in

paralel 2 Ag (de investigat + un martor) pentru a evalua daca sunt similare sau nu;

Aplicatii practice: determinarea Ac in serul pacientului: autoAc asociati cu : PR, sd. Sjorgen, LES, sclerodermie, vasculite - Ac anti Ag nucleare ENA = extractable nuclear antigens cum ar fi: Sm [Smith], ANDdc, U1RNP [ribonucleoprotein], SS-A, SS-B; SCL70, centromere.

: determinarea Ag in serul pacientului: AgHBs (a fost prima metoda prin care a evaluat AgHBs in hepatita viralaB)

1. Imunoelectroforeza - pentru determinarea Ag (metoda calitativa)Combina electroforeza proteinelor cu dubla difuzie. Serul de testat (al pacientului) si un ser de referinta se supun electroforezei in gel, care separa proteinele in functie de incarcatura electrica si marimea moleculei. Se face un sant in gel, paralel cu directia de migrare electroforetica, in care se pune Ac monoclonali sau policlonali. Ag si Ac migreaza in gel (dubla difuzie) si la locul de intalnire + echivalenta se formeaza un arc de precipitare. In functie de aspectul arcului de precipitare (intensitatii, formei si pozitiei) se evalueaza proteina de investigat.Aplicatii practice:

- Proteina poate fi deficitara sau absenta: ex. deficit de α1 anti-tripsina, ceruloplasmina , an-albuminemiei- Proteina anormala/in exces: lanturi usoare libere λ sau κ; exces de IgG – de ex intr-un mielom multiplu

2. Electroforeza-rocket - pentru determinarea Ag (metoda cantitativa)Combina imunodifuzia simpla cu migrarea in camp electric; pentru Ag incarcate negativ. Mediul contine (pe langa gerul de agar) Ac specifici pentru Ag de dozat. Se pune proba biologica de evaluat intr-un godeu care se face in gel. E plasat apoi in camp electric. Ag difuzeaza in gel, difuzie care e accelerata de campul electric. La locul de echivalenta se formeaza un arc de precipitare in forma de racheta.

Inaltimea maxima a acestei “rachete” este proportionala cu concentratia Ag in proba de evaluat si e comparata cu o proba standard.Limitele probei: nu poate fi folosita pentru dozarea imunoglobulinelor; nu poate fi masurat decat un singur Ag/proba.

2

3. Contracurent imunoelectroforeza - pentru determinarea Ac/Ag (metoda calitativa - screening rapid)Este o dubla difuzie accelerata de punerea placii cu mediul de difuzie si a reactivilor intr-un camp electric care accelereaza difuzia;In functie de Ag analizat se ajusteaza pH-ul mediului ( de obicei > 8).se foloseste pentru Ag care migreaza spre anod (A+) si Ac spre catod (C-).In zona de echivalenta se formeaza un arc de precipitare.Aplicatii practice: determinarea Ac in serul pacientului: autoAc asociati cu: LES, sd. Sjorgen, sclerodermie, vasculite - Ac anti Ag nucleare ENA = extractable nuclear antigens cum ar fi: Sm [Smith], RNP [ribonucleoprotein], SS-A, SS-B, SCL 70, centromer.

determinarea Ag in serul pacientului: AgHBs, AFP

REACTII Ag-Ac CU MOLECULE MARCATE

Exista multiple metode de marcare a moleculelor folosind: enzime, substante radioactive, fluorescente, luxogene, putand fi marcati fie Ac, fie Ag, fie alte molecule care reactioneaza cu Ac.

1. Radioimmunoassay - RIA Foloseste fie Ac, fie Ag marcate cu radioizotopi (ex. ¹²⁵ I – emite radiatii gamma; ³H – emite radiatii beta). Se pot doza Ac sau Ag prezente in serul pacientului. RIA competitiv se bazeaza pe competitivitatea dintre reactivul nemarcat radioactiv (de dozat) si reactivul marcat

radioactiv exogen.

Avantaje: sensibilitate mare, se folosesc cantitati mici de reactivi, rapida.Dezavantaje: folosirea izotopilor radioactivi.

a. Pentru dozarea unui Ag in serul pacientului se folosesc cantitati cunoscute de Ac specifici si Ag*exogen marcat radioactiv.

se folosesc Ac specifici (ser imun) + serul pacientului (cu Ag de dozat) + Ag* exogen marcat radioactiv cele 2 Ag competitioneaza pentru situsurile de legare ale Ac si se formeaza complexe imune Ag-Ac si Ag*-Ac complexele imune sunt apoi izolate de restul reactantilor prin precipitare nonimuna si se masoara radioactivitatea radioactivitatea precipitatului este invers proportionala cu cantitatea de Ag din serul pacientului radioactivitatea complexelor imune se compara cu o curba obtinuta din preparate standard – si se afla concentratia Ag din

ser. aceasta a fost metoda initiala folosita pentru dozarea insulinei plasmatice ( 1960 Berson and Yalow - Nobel in 1977).

Aplicatii practice: dozarea insulinei; dozarea Ag HBs - screening-ul rapid al probelor de sange de la donatori.

b. Pentru dozarea unui Ac din serul pacientului se folosesc cantitati cunoscute de Ag specific si Ac* marcat radioactiv . se folosesc Ac din serul pacientului + Ag specifice + Ac*exogeni marcati radioactivi; cu cat cantitatea de Ac din serul pacientului este mai mare, cu atat probabilitatea ca acesta sa disloce legatura intre Ag si

Ac* marcat radioactiv este mai mare; radioactivitatea precipitatului este invers proportionala cu cantitatea de Ac din serul pacientului radioactivitatea complexelor imune se compara cu o curba obtinuta din preparate standard – si se afla concentratia Ac din

ser

Aplicatii practice: dozarea IgE-alergen-specifici.

2. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - ELISA

Se realizeaza prin marcarea unui Ac cu o enzima (peroxidaza, fosfataza alcalina) care reactioneaza cu un substrat necolorat, generand un produs de reactie colorat. Intensitatea culorii este evaluata de un spectrofotometru, in functie de aceasta calculandu-se concentratia substantei in proba de evaluat.Metoda se apropie de sensibilitatea RIA si are mai putine riscuri decat o metoda care implica folosirea unor radioizotopi.Exista numeroase variante de ELISA care permit dozarea fie a Ac, fie a Ag.

a. ELISA indirect - pentru dozarea Ac.

3

Pe o microplaca se gaseste fixat Ag specific Ac pe care vrem sa il dozam. Peste placa se adauga serul pacientului, in care se gaseste o concentratie necunoscuta de

Ac. Ac se va fixa de Ag. Placa se spala pentru a indeparta ce nu s-a legat de Ag. Se adauga apoi Ac marcat enzimatic si care este specific anti-Ac; Acmarcat se va fixa de Ac fixat la randul lui de placa prin intermediul Ag. Se spala placa pentru a inlatura excesul de Ac marcat enzimatic care nu s-a fixat. Se adauga substratul enzimei si se obtine produsul de reactie colorat.Cu cat concentratia de Ac din ser este mai mare cu atat cantitatea de produs de reactie va fi mai mare si deci culoarea mai intensa. Un spectrofotometru specializat pentru microplaci masoara intensitatea culoarii care apoi se compara cu o curba standard si se calculeaza concentratia Ac.Aplicatii practice: determinarea Ac serici anti-HIV folosind Ag din anvelopa si din miezul viral; se pot detecta Ac la < 6 saptamani de la infectie; sensibilitate crescuta > 99,5%; pot exista insa teste fals(+); trebuie confirmat printr-un alt test (Western-Blot);

b. ELISA sandwich - pentru dozarea Ag.

Pe microplaca este fixat un Ac specific Ag de evaluat. Proba biologica in care se presupune ca se gaseste Ag se adauga peste placa. Ac vor fixa Ag din proba biologica. Placa se spala. Se adauga un al-2lea Ac specific pentru alt determinant antigenic al Ag si este lasat

sa se fixeze. Acest Ac este in prealabil conjugat cu o enzima sau se mai adauga un Ac anti Ac conjugat cu o enzima (dublu sandwich – vezi foto)

Dupa ce al-2lea Ac s-a legat se spala placa pentru a indeparta excesul de Ac nelegat. Se adauga substratul enzimei si se obtine reactia de culoare in functie de care se

calculeaza concentratia Ag in proba biologica. determinarea de alergene in alimente, toxice/droguri (in toxicologie)

c. ELISA competitiv - pentru dozarea Ag (ELISA indirect pentru Ag)

Proba biologica in care se gaseste Ag de dozat se amesteca cu o cantitate cunoscuta de Ac specifici si se incubeaza. Acest amestec se adauga apoi pe o microplaca unde exista fixata o cantitate cunoscuta de Ag’. Ac cu situsuri libere se vor fixa de Ag de pe placa. Se spala pentru a se indeparta Ac nelegati de placa. Se adauga un al-2lea anticorp Ac marcat enzimatic, specific anti-Ac. Se asteapta ca Ac marcat sa se fixeze de Ac si apoi se spala placa. Se adauga substratul enzimei si se obtine reactia de culoare.In acest tip de ELISA intensitate culorii este invers proportionala cu cantitatea de Ag din proba biologica.

3. Testul Western - Blot

Se foloseste pentru identificarea unei proteine (Ag) intr-un amestec (**testul Southern-Blot – ADN, Northern-Blot – ARNm).1. Proteinele din produsul biologic al pacientului (ser, urina, LCR) sunt initial separate prin electroforeza: SDS-PAGE 2. Benzile proteice sunt apoi transferaterate pe o membrana de nitroceluloza /PVDF prin electroforeza transversa3. a. Peste membrana nitrocelulozica se adauga Ac monoclonali sau policlonali marcati fie enzimatic, radioactiv, fluorescent

b. Peste membrana celulozica se adauga Ac specifici nemarcati, mono-/policlonali. In acest caz urmeaza adaugarea unui al-2lea Ac anti-Ac marcat cu o enzima sau cu un radioizotop, care recunoaste si leaga primul Ac.

*** electroforeza proteinelor in SDS poate denatura unele proteine - epitopi; e preferabil a folosi Ac policlonali monospecifici care cresc sensibilitatea metodei ( daca un epitop a fost modificat el nu va mai fi recunoscuti de serul monoclonal)

Se foloseste si pentru determinarea Ac dintr-o proba biologica. In acest caz:1. Prin SDS-PAGE se separa electroforetic un amestec de Ag cunoscute, specifice Ac pe care il cautam.2. Se transfera pe o membrana de nitroceluloza/PVDF3. Se adauga serul pacientului in care cautam Ac specific dupa care se spala.4. Se adauga un al-2lea Ac, marcat enzimatic sau radioactiv, specific anti-Ac de determinat.

In cazul marcarii enzimatice se adauga substratul enzimei si se produce o reactie de culoare.In cazul reactivilor marcati radioactiv membrana nitrocelulozica se expune pe un film radiologic si se obtine o ‘autoradiografie’.

Aplicatii practice: utilizat pentru diagnosticul si confirmarea infectiei in HIV, test de confirmare pentru infectia cu HBV dg. encefalopatiei spongiforme bovine, Lyme disease

pentru screeningul probelor de sange pentru transfuzii; pentru testarea unor noi vaccinuri.

4